Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümü sınırlı CSS desteğine sahiptir. En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz. Bu arada, sürekli desteği sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan sunacağız.
Angustifolius lupin (NLL, Lupinus angustifolius L.), gıda üretimi ve toprak iyileştirme için kullanılan bir baklagil bitkisidir. NLL'nin bir ürün olarak küresel olarak yayılması, yıkıcı antraknoz hastalığına neden olan lupin antraknozu da dahil olmak üzere birçok patojenik mantarı cezbetmiştir. Arttırılmış direnç sağlayan iki alel, Lanr1 ve AnMan, NLL ıslahında kullanılmıştır, ancak altta yatan moleküler mekanizmalar bilinmemektedir. Bu çalışmada, Lanr1 ve AnMan belirteçleri Avrupa NLL örneklerini taramak için kullanılmıştır. Aşının kontrollü bir ortamda test edilmesi, her iki dirençli donörün de etkinliğini doğrulamıştır. Temsili dirençli ve duyarlı hatlarda farklı gen ifadesi profili yapılmıştır. Antraknoz direnci, “GO:0006952 Savunma Tepkisi”, “GO:0055114 Redoks İşlemi” ve “GO:0015979 Fotosentez” gen ontolojisi terimlerinin aşırı ifadesiyle ilişkilendirilmiştir. Ek olarak, Lanr1(83A:476) hattı aşılamadan sonra hızla önemli transkriptom yeniden programlaması gösterirken, diğer hatlar bu yanıtta yaklaşık 42 saat gecikme gösterdi. Savunma yanıtları TIR-NBS, CC-NBS-LRR ve NBS-LRR genleri, patogenezde rol oynayan 10 protein, lipit transfer proteinleri, endoglukan-1,3-β-glukozidaz, glisin açısından zengin hücre duvarı proteinleri ve oksijenin reaktif yolundan gelen genlerle ilişkilidir. Fotosentezle ilişkili genlerin dikkatli bir şekilde bastırılması da dahil olmak üzere 83A:476'ya erken yanıtlar, mantar biyolojisinin vejetatif büyüme fazı sırasında başarılı koruma ile çakıştı ve bu da bir efektörün bağışıklığı tetiklediğini düşündürmektedir. Mandeloop reaksiyonu, genel yatay sürüklenme gibi yavaşlar.
Dar yapraklı acı bakla (NLL, Lupinus angustifolius L.), Batı Akdeniz bölgesinden kaynaklanan yüksek proteinli bir tahıldır1,2. Şu anda hayvanlar ve insanlar için bir gıda ürünü olarak yetiştirilmektedir. Ayrıca, simbiyotik azot sabitleyici bakteriler tarafından azot fiksasyonu ve toprak yapısının genel olarak iyileştirilmesi nedeniyle ürün rotasyonu sistemlerinde yeşil gübre olarak kabul edilir. NLL, son yüzyılda hızlı bir evcilleştirme sürecinden geçmiştir ve hala yüksek üreme baskısı altındadır3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. NLL'nin yaygın olarak yetiştirilmesiyle, patojenik mantarların ardışıklığı yeni tarımsal nişler geliştirdi ve yeni ürün yok edici hastalıklara neden oldu. Lupin yetiştiricileri ve yetiştiricileri için en dikkat çekici durum, patojenik mantar Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13'ün neden olduğu antraknoz hastalığının ortaya çıkmasıydı. Lupin yetiştiricileri ve yetiştiricileri için en dikkat çekici durum, patojenik mantar Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13'ün neden olduğu antraknoz hastalığının ortaya çıkmasıydı. Наиболее примечательным для фермеров ve селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Acı bakla yetiştiricileri ve yetiştiricileri için en dikkat çekici gelişme, patojenik mantar Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13'ün neden olduğu antraknoz hastalığının ortaya çıkmasıydı.Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Saçlı。1 Наиболее поразительным для фермеров ve селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Acı bakla yetiştiricileri ve yetiştiricileri için en dikkat çekici olan şey, patojenik mantar Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13'ün neden olduğu antraknozun ortaya çıkmasıdır.Hastalığın ilk raporları Brezilya ve Amerika Birleşik Devletleri'nden geldi ve tipik semptomlar sırasıyla 1912 ve 1929'da ortaya çıktı. Ancak, yaklaşık 30 yıl sonra patojen Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz olarak adlandırıldı. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld'un teleomorfu. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld'un fotoğrafı. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld'un fotoğrafı. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld'un Hedeflenen Morfolojideki Yeri. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .ve H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。ve H. Schlenk, .20. yüzyılın ortalarında yapılan ön hastalık fenotiplemesi, NLL ve sarı acı bakla (L. luteus L.) türlerinde bir miktar direnç gösterdi, ancak test edilen tüm beyaz acı bakla (L. albus L.) türleri oldukça duyarlıydı15,16. Çalışmalar, antraknoz gelişiminin artan yağış (hava nemi) ve sıcaklıkla (12-28 °C aralığında) ilişkili olduğunu ve daha yüksek sıcaklıklarda direncin ihlal edilmesine yol açtığını göstermiştir17, 18. Aslında, konidilerin çimlenmesi ve hastalığın başlaması için gereken süre, yüksek nem koşulları altında 24 °C'de (4 saat) 12 °C'dekinden (16 saat) dört kat daha kısaydı19. Dolayısıyla, devam eden küresel ısınma antraknozun yayılmasına yol açmıştır. Ancak hastalık Fransa'da (1982) ve Ukrayna'da (1983) yaklaşan bir tehdidin habercisi olarak gözlemlendi, ancak o dönemde acı bakla endüstrisi tarafından görünüşe göre göz ardı edildi20,21. Birkaç yıl sonra, bu yıkıcı hastalık tüm dünyaya yayıldı ve Avustralya, Polonya ve Almanya gibi başlıca acı bakla üreten ülkeleri de etkiledi22,23,24. 1990'ların ortalarındaki antraknoz salgınının ardından yapılan kapsamlı tarama, NLL19 örneklerinde birkaç dirençli donörün tanımlanmasıyla sonuçlandı. Antraknoza karşı NLL direnci, farklı germ plazma kaynaklarında bulunan iki ayrı baskın alel tarafından kontrol edilir: Tanjil ve Wonga kültivarındaki Lanr1 ve Mandalay kültivarındaki AnMan 25, 26. Bu aleller, ıslah programlarında dirençli germ plazmasının seçimini destekleyen moleküler belirteçleri tamamlar25,26,27,28,29,30. Lanr1 alelini taşıyan dirençli üreme hattı 83A:476, antraknoz direnci için ayrışan bir RIL popülasyonu elde etmek için duyarlı yabani hat P27255 ile çaprazlandı ve bu da Lanr1 lokusunun NLL-1131, 32, 33 kromozomuna atanmasını mümkün kıldı. Genomik bir çerçeve ile antraknoza direnç lokuslarından gelen bağlantı haritası belirteçlerinin hizalanması, NLL üç alelin de aynı kromozomda (NLL-11) ancak farklı pozisyonlarda olduğunu ortaya koydu29,34,35. Ancak, az sayıda RIL ve belirteçler ile karşılık gelen aleller arasındaki büyük genetik mesafe nedeniyle, bunların altında yatan genler hakkında güvenilir sonuçlar çıkarılamaz. Öte yandan, çok düşük rejenerasyon potansiyelleri nedeniyle lupinlerde ters genetiğin kullanımı zordur ve bu da genetik manipülasyonu zahmetli hale getirir37.
Homozigot durumda istenen aleli taşıyan evcilleştirilmiş germ plazmasının geliştirilmesi, örneğin 83A:476 (Lanr1) ve Mandelup (AnMan), yabani popülasyonlarda zıt alel kombinasyonlarının varlığı karşısında antraknoz direncini incelemenin kapısını açmıştır. Moleküler mekanizmaların olasılıkları. Belirli genotipler tarafından oluşturulan savunma yanıtlarını karşılaştırın. Bu çalışmada NLL'nin C. lupini aşılamasına karşı erken transkriptom yanıtı değerlendirilmiştir. İlk olarak, Lanr1 ve AnMan alellerini işaretleyen moleküler belirteçler kullanılarak 215 hat içeren bir Avrupa NLL germ plazması paneli tarandı. Daha sonra, daha önce moleküler belirteçler için seçilmiş 50 NLL hattında kontrollü koşullar altında antraknoz fenotiplemesi gerçekleştirildi. Bu deneylere dayanarak, antraknoz direnci ve Lanr1/AnMan alel bileşiminde farklılık gösteren dört hat, iki tamamlayıcı yaklaşım kullanılarak farklı savunma gen ifadesi profillemesi için seçildi: yüksek verimli RNA dizilemesi ve gerçek zamanlı PCR kantifikasyonu.
Lanr1 (Anseq3 ve Anseq4) ve AnMan (Anseq4) ve AnMan (AnManM1) belirteçleri ile bir dizi NLL germ plazmasının (N = 215) taranması, yalnızca bir hattın (95726, Salamanca-b yakınında) tüm belirteçler için "direnç" alelini çoğalttığını gösterirken, "'Duyarlı' alellerin varlığı" 158 (~%73,5) hatta tüm belirteçlerin oranını buldu. On üç hat, Lanr1 belirtecinin iki "dirençli" alelini üretti ve 8 hat Lanr1 belirtecinin "dirençli" alellerini üretti. AnMan belirtecinin "direnç" aleli (Ek Tablo S1). İki hat Anseq3 belirteci için heterozigot ve biri AnManM1 belirteci için heterozigottu. 42 hat (%19,5) Anseq3 ve Anseq4 alellerinin zıt fazlarını taşıdı ve bu iki lokus arasında yüksek rekombinasyon sıklığı olduğunu gösterdi. Kontrollü koşullar altında antraknoz fenotipleri (Ek Tablo S2), test edilen genotiplerin direncinde değişkenlik olduğunu ortaya koydu ve bu da antraknozun şiddetine yansıdı. Ortalama puanlardaki farklar 1,8 (orta derecede dirençli) ile 6,9 ​​(duyarlı) arasında değişiyordu ve bitki ağırlığı farkları 0,62 (duyarlı) ile 4,45 g (dirençli) arasında değişiyordu. Deneyin iki tekrarında gözlenen değerler arasında (hastalık şiddeti skorları için 0,51, P = 0,00017 ve bitki ağırlığı için 0,61, P < 0,0001) ve bu iki parametre arasında (- 0,59 ve - 0,77, P < 0,0001) önemli bir korelasyon vardı. Deneyin iki tekrarında gözlenen değerler arasında (hastalık şiddeti skorları için 0,51, P=0,00017 ve bitki ağırlığı için 0,61, P<0,0001) ve bu iki parametre arasında (-0,59 ve -0,77, P<0,0001) anlamlı bir korelasyon bulundu. Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для) баллов тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя раметрами (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Deneyin iki tekrarında gözlenen değerler arasında (hastalık şiddet skorları için 0,51, P=0,00017 ve bitki ağırlığı için 0,61, P<0,0001) ve bu iki parametre arasında (-0,59 ve -0,77, P<0,0001) 0,0001) anlamlı korelasyon bulunmuştur.在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为0,51,P = 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 ve- 0,77，P < 0,0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0,59 和– 0,59 ve– 0,59 ve 0,59 ve 0,77, P < 0,0001)。 Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести) заболевания 0,51, P = 0,00017 ve масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001. İkili denemede gözlenen değerler arasında (hastalık şiddet skoru 0,51, P=0,00017 ve bitki ağırlığı 0,61, P<0,0001) ve bu iki parametre arasında (-0,59 ve -0,0001) 0,77, P<0,0001 düzeyinde anlamlı korelasyon saptanmıştır. ).Duyarlı bitkilerde görülen tipik semptomlar arasında, "çoban yayı" yapısına benzeyen gövdenin kıvrılması ve bükülmesi, ardından turuncu/pembe sporozoitlerle oval lezyonlar yer alır (Ek Şekil 1). Lanr1 (83A:476 ve Tanjil) ve AnMan (Mandelup) genlerini taşıyan Avustralyalı örnekler orta derecede dirençlidir, 0,0331 ve 0,0036). "Dirençli" Lanr1 ve/veya AnMan alellerini de taşıyan bazı hatlar hastalığın semptomlarını gösterir.
İlginç bir şekilde, herhangi bir “dirençli” belirteç alelden yoksun birkaç NLL hattı, Boregine (her iki parametre için de P değeri < 0,0001), Bojar (puan için P değeri < 0,0001 ve bitki ağırlığı için 0,001) ve Popülasyon B-549/79b (puan için P değeri < 0,0001 ve ağırlık için önemsiz) gibi yüksek düzeyde antraknoz direnci ortaya koydu (Lanr1 veya AnMan genotiplerine benzer veya daha yüksek). İlginç bir şekilde, herhangi bir “dirençli” belirteç alelden yoksun birkaç NLL hattı, Boregine (her iki parametre için de P değeri < 0,0001), Bojar (puan için P değeri < 0,0001 ve bitki ağırlığı için 0,001) ve Popülasyon B-549/79b (puan için P değeri < 0,0001 ve ağırlık için önemsiz) gibi yüksek düzeyde antraknoz direnci ortaya koydu (Lanr1 veya AnMan genotiplerine benzer veya daha yüksek). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 veya AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 оценки и 0,001 для массы растения) ve популяции B-549/79b (значение P <0,0001) çoğu zaman ve daha fazlası için). İlginç bir şekilde, herhangi bir 'dirençli' belirteç alelden yoksun olan birkaç NLL hattı, antraknoza karşı yüksek seviyede direnç gösterdi (Lanr1 veya AnMan genotiplerine benzer veya daha yüksek), örneğin Boregine (her iki parametre için de P değeri < 0,0001), Bojar (değerlendirme için P değeri < 0,0001 ve bitki ağırlığı için 0,001) ve B-549/79b popülasyonu (değerlendirme için P değeri < 0,0001 ve ağırlık için önemli değil).Lanr1或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）。 Herhangi bir “antijenik” belirteç içermeyen bazı NLL sistemlerinin yüksek yatay direnç (Lanr1 veya AnMan genlerine eşdeğer veya daha yüksek) göstermesi ilginçtir; örneğin Boregine (her iki parametre de P < 0,0001), Bojar (P değeri < 0,0001, bitki ağırlığı 0,001) ve B-549/79b suşu (P değeri < 0,0001, ağırlık önemli değil). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали уровни уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 veya AnMan), ve ayrıca Boregine (значение P) для обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P) <0,0001, масса растения 0,001) ve популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). İlginç bir şekilde, herhangi bir 'direnç' belirteci alelden yoksun olan bazı NLL hatları, Boregine (her iki parametre için P değeri <0,0001), Bojar (P değeri <0,0001, bitki ağırlığı 0,001) ve B-549/79b popülasyonu (P değeri <0,0001, ağırlık önemli değil) gibi yüksek seviyelerde antraknoz direnci gösterdi (Lanr1 veya AnMan genotiplerine benzer veya daha yüksek).Bu olgu, belirteç genotipleri ile hastalık fenotipleri arasında gözlenen korelasyon eksikliğini açıklayan yeni bir genetik direnç kaynağı olasılığını öne sürmektedir (P değerleri ~0,42 ila ~0,98). Bu nedenle, Kolmogorov-Smirnov testi, antraknoz direncine ilişkin verilerin puanlar (P değerleri 0,25 ve 0,11) ve bitki kütlesi (P değerleri 0,47 ve 0,55) için yaklaşık olarak normal dağılım gösterdiğini göstererek, Lanr1 ve AnMan'dan daha fazla alelin dahil olduğunu varsayıyorum.
Antraknoz direnci taraması sonuçlarına göre transkriptom analizi için 4 hat seçildi: 83A:476, Boregine, Mandelup ve Popülasyon 22660. Bu hatlar, önceki testtekiyle aynı olmaları koşuluyla, RNA dizilemesi ile aşılama deneylerinde şarbon direnci açısından tekrar test edildi. Puan değerleri şu şekildeydi: Boregin (1.71 ± 1.39), 83A: 476 (2.09 ± 1.38), Mandelup (3.82 ± 1.42) ve popülasyon 22660 (6.11 ± 1.29).
Illumina NovaSeq 6000 protokolü, örnek başına ortalama 40,5 Mread çifti (29,7 ila 54,4 Mread) elde etti (Ek Tablo S3). Referans dizisindeki hizalama puanları %75,5 ila %88,6 arasında değişti. Biyolojik tekrarlar arasındaki deneysel varyantlar arasındaki okuma sayısı verilerinin ortalama korelasyonu 0,812 ila 0,997 (ortalama 0,959) arasında değişti. Analiz edilen 35.170 genden 2917'sinde hiçbir ifade saptanmazken, diğer 4785 genin ifadesi ihmal edilebilir düzeydeydi (baz ortalaması < 5). Analiz edilen 35.170 genden 2917'sinde hiçbir ifade saptanmazken, diğer 4785 genin ifadesi ihmal edilebilir düzeydeydi (baz ortalaması < 5). Из 35 170 генов 2917 hiçbir проявляли экспрессии, остальные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5). Analiz edilen 35.170 genden 2917'sinde hiçbir ifade görülmezken, kalan 4785 gen ihmal edilebilir düzeyde (baz ortalaması <5) ifade edildi.在分析的35,170 个基因中,2917 个没有表达,其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35.170 Из 35 170 генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительную экспрессию (базовое среднее значение <5). Analiz edilen 35.170 genden 2917'si ifade edilmiyordu ve kalan 4785 genin ifadesi ihmal edilebilir düzeydeydi (baz ortalaması <5).Bu nedenle, deney sırasında ifade edildiği düşünülen gen sayısı (baz ortalaması ≥ 5) 27.468 (%78,1) idi (Ek Tablo S4).
İlk zaman noktasından itibaren, tüm NLL hatları C. lupini (suş Col-08) aşılamasına transkriptomu yeniden programlayarak yanıt verdi (Tablo 1), ancak hatlar arasında önemli farklılıklar gözlendi. Bu nedenle, direnç hattı 83A:476 (Lanr1 genini taşıyan) ilk zaman noktasında (6 saat) önemli transkriptom yeniden programlaması gösterdi ve bu zaman noktasındaki diğer zaman noktalarına kıyasla izole edilmiş yukarı ve aşağı genlerin sayısında 31-69 kat artış oldu. Ek olarak, bu zirve kısa ömürlüydü, çünkü yalnızca birkaç genin ifadesi ikinci zaman noktasında (12 saat) önemli ölçüde değişmiş durumda kaldı. İlginç bir şekilde, greft testinde de yüksek düzeyde direnç gösteren Boregine, deney sırasında böylesine büyük bir transkripsiyonel yeniden programlamaya uğramadı. Ancak, farklı şekilde ifade edilen genlerin sayısı (DEG), Boregine ve 83A:476 için 12 saat 12 saat 12 saat 12 saatte aynıydı. Hem Mandelup hem de 22660 popülasyonu son zaman noktasında (48 l/s) DEG pikleri gösterdi ve bu da savunma tepkilerinde göreceli bir gecikme olduğunu gösteriyor.
Çünkü 83A:476, diğer tüm hatlara kıyasla 6 HPI'de C. lupini'ye yanıt olarak büyük transkriptom yeniden programlamasından geçtiğinden, bu zaman noktasında gözlemlenen DEG'lerin ~%91'i soy-spesifikti (Şekil 1). Ancak, çalışma hatları arasında erken yanıtlar arasında bir miktar örtüşme vardı, Boregine, Mandelup ve 22660 popülasyonunda sırasıyla %68,5, %50,9 ve %52,6 DEG, belirli zaman noktalarında 83A:476'da bulunanlarla örtüşüyordu. Ancak, bu DEG'ler şu anda 83A:476 kullanılarak tespit edilen tüm DEG'lerin yalnızca küçük bir kısmını (%0,97-1,70) oluşturuyordu. Ek olarak, tüm hatlardan 11 DEG bu zamanda tutarlıydı (Ek Tablolar S4-S6) ve bitki savunma tepkilerinin ortak bileşenlerini içeriyordu: lipit transfer proteini (TanjilG_32225), endoglukan-1,3-β-glukozit enzimi (TanjilG_23384), SAM22 gibi iki stresle indüklenebilir protein (TanjilG_31528 ve TanjilG_31531), bazik lateks proteini (TanjilG_32352) ve iki glisin açısından zengin yapısal hücre duvarı proteini (TanjilG_19701 ve TanjilG_19702). Ayrıca 83A:476 ile Boregine arasında 24 HPI'de (toplam %16-38 DEG) ve Mandelup ile Popülasyon 22660 arasında 48 HPI'de (toplam %14-20 DEG) transkriptom yanıtlarında nispeten yüksek bir örtüşme vardı.
Colletotrichum lupini (1999'da Polonya, Wierzhenice'deki lupin tarlalarından elde edilen Col-08 suşu) ile aşılanmış dar yapraklı lupin (NLL) hatlarında farklı şekilde ifade edilen genlerin (DEG) sayısını gösteren Venn diyagramı. Analiz edilen NLL hatları şunlardı: 83A:476 (dirençli, Lanr1 alelini taşıyan), Boregine (dirençli, genetik geçmişi bilinmeyen), Mandelup (orta derecede dirençli, AnMan alelini taşıyan) ve 22660. popülasyon (çok duyarlı). Hpi kısaltması aşılamadan sonraki saatleri ifade eder. Grafiği basitleştirmek için sıfır değerleri kaldırıldı.
6 hpi'de aşırı ifade edilen gen seti, kanonik R gen alanlarının varlığı açısından analiz edildi (Ek Tablo S7). Bu çalışma, yalnızca 83A:476'da NBS-LRR alanlarıyla klasik hastalık direnci genlerinin transkriptom indüksiyonunu ortaya koydu. Bu set, bir TIR-NBS-LRR geni (tanjilg_05042), beş CC-NBS-LRR geni (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 ve tanjilg_16162) ve Dört NBS-LR, Tanjilg_16162) ve Dört NBS-LRRE (tanjilg_16162) ile Dört NBS-Lrr (tanjilg_16162) ve Dört NBS-LRR'den (TANJILG_16162) oluşuyordu. Tüm bu genlerin korunan dizilerde düzenlenmiş kanonik alanları vardır. NBS-LRR alan genlerine ek olarak, birkaç RLL kinaz 6 hpi'de aktive edildi, yani Boregine'de (TanjilG_19877), Mandelup'ta (TanjilG_07141 ve TanjilG_19877) ve 22660 popülasyonunda (TanjilG_09014 ve TanjilG_10361) ve 83A 27:476'da iki tane.
C. lupini (Col-08 suşu) ile aşılamaya yanıt olarak ifadesi önemli ölçüde değişen genler, Gen Ontolojisi (GO) zenginleştirme analizine tabi tutuldu (Ek Tablo S8). En sık aşırı temsil edilen biyolojik süreç terimi, 16 (zaman × çizgi) kombinasyonun 6'sında yüksek önemle (P değeri < 0,001) görülen “GO:0006952 savunma tepkisi” idi (Şekil 2). En sık aşırı temsil edilen biyolojik süreç terimi, 16 (zaman × çizgi) kombinasyonun 6'sında yüksek önemle (P değeri < 0,001) görülen “GO:0006952 savunma tepkisi” idi (Şekil 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического proproцесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). En sık aşırı temsil edilen biyolojik süreç terimi, 16 (zaman × soy) kombinasyonundan 6'sında yüksek önemle görülen (P değeri < 0,001) 'GO:0006952 savunma tepkisi' idi (Şekil 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”,它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 En temsili biyolojik süreç terimi, 16 (时间×线) kombinasyonun 6'sında görülen ve yüksek öneme sahip olan “GO:0006952 savunma tepkisi”dir (P değeri < 0,001) (图2). "GO: 0006952 Savunma Yanıtı", который появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). En sık aşırı temsil edilen biyolojik süreç terimi, 16 kombinasyondan 6'sında (zaman × çizgi) yüksek önemle (P değeri < 0,001) görülen 'GO:0006952 Savunma Tepkisi' idi (Şekil 2).Bu terim 83A'da iki zaman noktasında aşırı temsil edildi: 476 ve Boregine (6 ve 24 hpi) ve Mandelup ve Popülasyon 22660'ta bir zaman noktasında (sırasıyla 12 ve 6 hpi). Bu beklenen bir sonuçtur ve dirençli hatların antifungal tepkisini vurgulamaktadır. Ek olarak, 83A:476, "GO:0055114 redoks süreci" terimiyle temsil edilen oksidatif patlamayla ilgili genleri hızla indükleyerek C. lupini'ye yanıt verdi ve bu, belirli bir savunma tepkisini gösterirken, Boregine, 'GO' terimiyle ilgili belirli savunma tepkilerini ortaya koydu. :0006950 Stres tepkisi”. Popülasyon 22660, “GO:0016104 Triterpen biyosentezi süreci” ve “GO:0006722 Triterpen metabolizması süreci” (her iki terim de aynı gen kümesine aittir) terimlerinin aşırı sayısını vurgulayarak, ikincil metabolitleri içeren yatay direnç tepkisini aktive etti, GO terimi zenginleştirme analizinin sonuçları dikkate alındığında, Mandelup reaksiyonu kararlılığı Boregine ve Popülasyon 22660 arasındaydı. Ek olarak, erken reaksiyon 83A:476 (6 hpi) ve gecikmeli reaksiyon Mandelup ve Popülasyon 22660, GO:0015979 'fotosentez' terimini ve diğer ilgili biyolojik süreçleri içerir.
Dar yapraklı acı bakla (NLL) şarbon acı baklası (1999'da Polonya, Wierzhenice'deki acı bakla tarlalarından elde edilen Col-08 suşu) ile aşılanmış transkriptom yanıtları sırasında farklı şekilde ifade edilen genlerin açıklamasında seçilen biyoproses gen ontolojisi terimleri büyük ölçüde abartılmıştır. Analiz edilen NLL hatları şunlardı: 83A:476 (dirençli, homozigot Lanr1 alelini taşıyan), Boregine (dirençli, bilinmeyen genetik arka plan), Mandelup (orta derecede dirençli, homozigot AnMan alelini taşıyan) ve popülasyon 22660 (duyarlı).
Bu çalışma antraknoz direncine katkıda bulunan genleri tanımlamayı amaçladığından, GO terimlerine atanan genler, en az bir çizgi × zaman noktası ile başlangıç ​​ortalamaları ≥ 30 ve log2'nin istatistiksel olarak anlamlı değerlerini (kat değişimi) birleştiren kesme değerleri ile analiz edildi. Bu kriterleri karşılayan gen sayısı GO:0006952 için 65 ve GO:0055114 için 524 idi.
83A:476, GO:0006952 terimiyle açıklanan iki DEG zirvesini ortaya koydu, ilki inç başına 6 gen (64 gen, yukarı ve aşağı düzenleme) ve ikincisi inç başına 24 gen (15 gen, yalnızca yukarı düzenleme). Boregine ayrıca GO:0006952'nin aynı zaman noktasında zirveye ulaştığını, ancak daha az DEG (11 ve 8) ve tercihli aktivasyonla olduğunu gösterdi. Mandeloop, 12 ve 48 HPI'de GO:0006952'nin iki zirvesini gösterdi, her ikisi de 12 gen taşıyordu (ilki aktive edici genlerle, ikincisi yalnızca baskılayıcı genlerle), 6 HPI'deki 22660 popülasyonu (13 gen) artış zirvesi düzenlemesinin daha büyük bir baskınlığına sahipti. Bu piklerdeki GO:0006952 DEG'nin %96,4'ünün aynı tipte yanıta (yukarı veya aşağı) sahip olduğu ve bunun da dahil olan gen sayısındaki farklılıklara rağmen savunma yanıtlarında önemli bir örtüşme olduğunu gösterdiği belirtilmelidir. GO:0006952 terimiyle ilişkili dizilerin en büyük grubu, sınıf 10 patogenezle ilişkili protein (PR-10) protein kladına ve çekirdek protein lateks'e ait olan Açlık Stresiyle İlişkili Mesaj Proteini 22'yi (SAM22 benzeri) kodlar. (benzer (MLP benzeri) protein) protein (Şekil 3). İki grup, ifadenin doğası ve yanıtın yönü bakımından farklılık gösterdi. SAM22 benzeri proteinleri kodlayan genler, erken zaman noktalarında (6 veya 12 saat) tutarlı ve önemli indüksiyon gösterdi ve genellikle deneyin sonunda (48 saat) tepkisizdi, MLP benzeri proteinler ise 6 saat 10 ... 83A:476 ve Mandelup'ta 48 hp/in'de, diğer veri noktalarının neredeyse tamamı tepkisizdi. Ek olarak, SAM22 benzeri protein genlerinin ifade profillerindeki farklılıklar, antraknoz direncindeki gözlemlenen değişkenliği takip etti, çünkü daha dirençli hatlar, daha duyarlı genlerden daha fazla zaman noktasına sahip olup bu genleri önemli ölçüde indükledi. Başka bir LlR18A/B benzeri PR-10 geni, SAM22 benzeri protein genine çok benzer bir ifade örüntüsü gösterdi.
Biyolojik süreç terimi olan “GO:0006952 Savunma Tepkisi”nin ana bileşenleri ve Lanr1 ve AnMan alellerinin aday genlerinin ifade desenleri tanımlandı. Log2 ölçeği, aynı zaman noktasında aşılanmış (Colletotrichum lupini, suş Col-08, acı bakla tarlalarından elde edilen, Wizhenica, Polonya, 1999) ve kontrol (sahte aşılanmış) bitkiler arasındaki log2 değerlerini (kat değişimi) temsil eder. Aşağıdaki dar yapraklı acı bakla hatları analiz edildi: 83A:476 (dayanıklı, homozigot Lanr1 alelini taşıyor), Boregine (dayanıklı, genetik geçmişi bilinmiyor), Mandelup (orta derecede dayanıklı, homozigot AnMan alelini taşıyor) ve Popülasyon 22660 (duyarlı).
Ek olarak, RNA-seq aday genleri Lanr1 (TanjilG_05042) ve AnMan'ın (TanjilG_12861) ifade profilleri değerlendirildi (Şekil 3). TanjilG_05042 geni yalnızca ilk zaman noktasında (6 hpi) 83A:476'da önemli bir yanıt (aktivasyon) gösterdi, TanjilG_12861 ise Mandeloop'ta yalnızca iki zaman noktasında önemliydi: 6 hpi (aşağı regülasyon) ve 24 hpi (6 hpi). İle.). ayarlanabilir).
GO:0055114 “redoks işlemi” teriminde en fazla aşırı ifade edilen genler, sitokrom P450 proteinleri ve peroksidaz kodlayan genlerdi (Şekil 4). 6 HPI'de 83A:476'dan izole edilen örnekler için, maksimum veya minimum log2 (kat değişimi) değerleri (genlerin %86,6'sı için) genellikle aşılanmış ve kontrol bitkileri arasında gözlemlendi ve bu genotipin aşılama cinsiyetine olan yüksek tepkisini vurguladı. 83A:476, 6 hpi'de (503 gen) en önemli GO: 0055114 DEG'yi gösterirken, hatların geri kalanı 48 hpi'de (Boregine, 31 gen; Mandelup, 85 gen; ve Popülasyon 22660, 78 gen)). GO:0055114 ailesinin çoğu geninde, aşılamaya iki tip yanıt (aktivasyon ve inhibisyon) gözlemlendi. İlginçtir ki, GO terimi için tanımlanan DEG'lerin %97,6'sına kadar Mandelupe'de 48 hp'de 0055114 Bu gözlemler, önemli ölçüde daha küçük ölçeğe (yani, mutasyona uğramış redoks genlerinin sayısı, 85'e karşı 503) rağmen, mandelupun antraknoza karşı gecikmiş transkriptom tepkilerinin örüntüsünün 83A:476'nın erken tepkisine benzer olduğunu göstermektedir. Boregine ve Popülasyon 22660'da, bu yakınsama sırasıyla %51,6 ve %75,6'da daha düşüktür.
Biyolojik süreç “GO:0055114 Redox süreci” teriminin ana bileşenlerinin ifade desenleri ortaya çıkarıldı. Log2 ölçeği, aynı zaman noktasında aşılanmış (Colletotrichum lupini, suş Col-08, acı bakla tarlalarından elde edilen, Wizhenica, Polonya, 1999) ve kontrol (sahte aşılanmış) bitkiler arasındaki log2 değerlerini (kat değişimi) temsil eder. Aşağıdaki dar yapraklı acı bakla hatları analiz edildi: 83A:476 (dayanıklı, homozigot Lanr1 alelini taşıyan), Boregine (dayanıklı, genetik geçmişi bilinmiyor), Mandelup (orta derecede dayanıklı, homozigot AnMan alelini taşıyan) ve Popülasyon 22660 (duyarlı).
83A:476 C. lupini (suş Col-08) ile aşılamaya verilen transkriptomik yanıtlar ayrıca GO:0015979 "fotosentez" terimine atfedilen genlerin ve diğer ilgili biyolojik süreçlerin koordineli susturulmasını da içeriyordu (ŞEKİL 5). Bu GO:0015979 DEG seti, 83A:476'da 6 hpi'de önemli ölçüde baskılanmış 105 gen içeriyordu. Bu alt kümede, 37 gen Mandelup'ta 48 HPI'de ve 35'i 22660 popülasyonunda aynı zaman noktasında aşağı düzenlendi; bunlara her iki genotipte de ortak olan 19 DEG dahildi. GO: 0015979 terimiyle ilgili hiçbir DEG, herhangi bir kombinasyonda (hat x zaman) önemli ölçüde aktive edilmedi.
Biyolojik süreç “GO:0015979 Fotosentez” teriminin ana bileşenlerinin ifade desenleri ortaya çıkarıldı. Log2 ölçeği, aynı zaman noktasında aşılanmış (Colletotrichum lupini, suş Col-08, acı bakla tarlalarından elde edilen, Wizhenica, Polonya, 1999) ve kontrol (sahte aşılanmış) bitkiler arasındaki log2 değerlerini (kat değişimi) temsil eder. Aşağıdaki dar yapraklı acı bakla hatları analiz edildi: 83A:476 (dayanıklı, homozigot Lanr1 alelini taşıyan), Boregine (dayanıklı, genetik geçmişi bilinmiyor), Mandelup (orta derecede dayanıklı, homozigot AnMan alelini taşıyan) ve Popülasyon 22660 (duyarlı).
Farklı ifade analizinin sonuçlarına dayanarak ve muhtemelen patojenik mantarlara karşı savunma tepkilerinde rol oynadığı varsayılarak, bu yedi gen seti gerçek zamanlı PCR ile ifade profillerinin kantifikasyonu için seçildi (Ek Tablo S9).
Varsayılan protein geni TanjilG_10657, kontrol (taklit) bitkilerine kıyasla tüm çalışılan hatlarda ve zaman noktalarında önemli ölçüde indüklendi (Ek Tablolar S10, S11). Ek olarak, TanjilG_10657'nin ifade profili, tüm hatlar için deney boyunca artan bir eğilim gösterdi. Popülasyon 22660, 114 kat aktivasyonla TanjilG_10657'nin aşılamaya karşı en yüksek duyarlılığını ve 24 HPI'de en yüksek bağıl ifade seviyesini (4,4 ± 0,4) gösterdi (Şekil 6a). PR10 LlR18A protein geni TanjilG_27015 de tüm hatlarda ve zaman noktalarında aktivasyon gösterdi ve çoğu veri noktasında istatistiksel öneme sahipti (Şekil 6b). TanjilG_10657'ye benzer şekilde, TanjilG_27015'in en yüksek bağıl ifade seviyesi 24 HPI'de (19,5 ± 2,4) 22660 aşılanmış popülasyonda gözlendi. Asit endokitinaz geni TanjilG_04706, Boregine 6 hpi hariç tüm hatlarda ve tüm zaman noktalarında önemli ölçüde yukarı düzenlendi (Şekil 6c). İlk zaman noktasında (6 HPI) 83A:476'da (10,5 kat) güçlü bir şekilde indüklendi ve diğer hatlarda orta derecede arttı (6,6-7,5 kat). Deney sırasında, TanjilG_04706'nın ifadesi 83A:476 ve Boregine'de benzer seviyelerde kalırken, Mandelup ve Popülasyon 22660'ta önemli ölçüde artarak nispeten yüksek değerlere ulaştı (sırasıyla 5,9 ± 1,5 ve 6,2 ± 1,5). Endoglukan-1,3-β-glukozidaz benzeri gen TanjilG_23384, 22660 popülasyonu hariç tüm hatlarda ilk iki zaman noktasında (6 ve 12 saat) yüksek aktivasyon gösterdi (Şekil 6d). TanjilG_23384'ün en yüksek bağıl ifade seviyeleri, Mandelup'ta (2,7 ± 0,3) ve 83A:476'da (1,5 ± 0,1) ikinci zaman noktasında (12 saat) gözlendi. 24 saat noktasında, TanjilG_23384 ifadesi incelenen tüm hatlarda nispeten düşüktü (0,04 ± 0,009'dan 0,44 ± 0,12'ye).
Kantitatif PCR ile ortaya çıkarılan seçili genlerin (ag) ifade profilleri. 6, 12 ve 24 sayıları aşılamadan sonraki saatleri temsil eder. LanDExH7 ve LanTUB6 genleri normalizasyon için kullanılırken LanTUB6 seriler arası kalibrasyon için kullanılır. Hata çubukları, her biri üç teknik tekrarın ortalaması olan üç biyolojik tekrara dayalı standart sapmayı temsil eder. Aşılanmış (Colletotrichum lupini, suş Col-08, 1999 yılında Polonya, Wierzenica'daki lupin tarlasından elde edilmiştir) ve kontrol (sahte aşılanmış) bitkiler arasındaki ifade seviyelerindeki farklılıkların istatistiksel önemi veri noktalarının üstünde işaretlenmiştir (*P değeri < 0,05, **P değeri ≤ 0,01, ***P değeri ≤ 0,001). Aşılanmış (Colletotrichum lupini, suş Col-08, 1999 yılında Polonya, Wierzenica'daki lupin tarlasından elde edilmiştir) ve kontrol (sahte aşılanmış) bitkiler arasındaki ifade seviyelerindeki farklılıkların istatistiksel önemi veri noktalarının üstünde işaretlenmiştir (*P değeri < 0,05, **P değeri ≤ 0,01, ***P değeri ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, 1999'da поля люпина в Верженице, Польша) ve контрольными (ложно инокулированными) растениями. отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Veri noktalarının üstünde aşılanmış (Colletotrichum lupini, suş Col-08, 1999 yılında Polonya, Wierzhenice'deki bir acı bakla tarlasından elde edilmiştir) ve kontrol (sahte aşılanmış) bitkiler arasındaki ifade düzeylerindeki istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar belirtilmiştir (*P değeri < 0,05, **P değeri ≤ 0,01, ***P değeri ≤ 0,001).接种（Colletotrichum Lupini, Col-08株,1999年从波兰Wierzenica,的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P = 0,01, ***P = 0,001)。接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) ve контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Veri noktalarının üstünde aşılanmış (Colletotrichum lupini, suş Col-08, 1999 yılında Polonya'nın Verzhenice kentindeki acı bakla tarlalarından elde edilmiştir) ve kontrol (sahte aşılanmış) bitkiler arasındaki ifade düzeylerindeki istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar belirtilmiştir (*P değeri < 0,05, **P değeri ≤ 0,01, ***P değeri ≤ 0,001).Analiz edilen NLL hatları şunlardı: 83A:476 (dirençli, homozigot Lanr1 alelini taşıyan), Mandelup (orta derecede dirençli, homozigot AnMan alelini taşıyan), Boregine (dirençli, genetik geçmişi bilinmeyen) ve popülasyon 22660 (duyarlı).
Lanr1 lokusundaki aday gen TanjilG_05042, RNA-seq çalışmalarından elde edilen profillerden belirgin şekilde farklı bir ifade örüntüsü gösterdi (Şekil 6e). Bu genin önemli aktivasyonu Mandelup ve 22660 popülasyonunda gözlemlendi (sırasıyla 39,7 ve 11,7 kata kadar), nispeten yüksek ifade seviyeleriyle sonuçlandı (sırasıyla 1,4 ± 0,14 ve 7,2 ± 1,3'e kadar). 83A:476 ayrıca TanjilG_05042 geninde bir miktar yukarı düzenlemeyi (3,8 kata kadar) ortaya koydu, ancak elde edilen göreceli ifade seviyeleri (0,044 ± 0,002) Mandelup ve 22660 popülasyonunda gözlemlenenlerden 30 kat daha düşüktü. qPCR ile analiz edilen sahte aşılanmış (kontrol) varyantlarda genotipler arasındaki ifade düzeylerinde anlamlı farklılıklar gösterdi; 22660 ve 83A:476 popülasyonları arasında ve 22660 ve 22660 popülasyonları arasında 58 katlık bir farka ulaştı. Boregine ve Mandalup arasında iki katlık bir fark elde edildi.
AnMan lokusundaki aday gen TanjilG_12861, 83A:476 ve Mandelup'ta aşılamaya yanıt olarak aktive edildi, 22660 popülasyonunda nötrdü ve Boregine'de aşağı düzenlendi (Şekil 6f). TanjilG_12861 geninin bağıl ifadesi aşılanmış 83A:476'da en yüksekti (0,14 ± 0,01). 17,4 kDa sınıf I ısı şoku proteini geni TanjilG_05080 HSP17.4, çalışılan tüm suşlarda ve zaman noktalarında daha düşük bağıl ifade seviyeleri gösterdi (Şekil 6g). En yüksek değer 22660 popülasyonunda 24 HPI'de gözlendi (0,14 ± 0,02, aşılamaya yanıtta sekiz kat artış).
Gen ekspresyon profillerinin karşılaştırılması (Şekil 7) TanjilG_10657 ile diğer dört gen arasında yüksek bir korelasyon olduğunu ortaya koydu: TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.80) ve TanjilG_04706 (r = 0.79). Bu tür sonuçlar, bu genlerin savunma tepkileri sırasında birlikte düzenlendiğini gösterebilir. TanjilG_12861 ve TanjilG_23384 genleri, diğer genlerle karşılaştırıldığında daha düşük Pearson korelasyon katsayısı değerlerine (sırasıyla 0,08 ila 0,43 ve -0,19 ila 0,28) sahip farklı ekspresyon profilleri gösterdi.
Gen ifadesi profilleri arasındaki korelasyonlar kantitatif PCR kullanılarak tespit edildi. Aşağıdaki dar yapraklı acı bakla hatları analiz edildi: 83A:476 (dirençli, homozigot Lanr1 alelini taşıyan), Mandelup (orta derecede dirençli, homozigot AnMan alelini taşıyan), Boregine (dirençli, genetik geçmişi bilinmeyen) ve Popülasyon 22660 (duyarlı). Aşılanmış (Colletotrichum lupini, Col-08 suşu, 1999'da Polonya, Wierzhenice'deki acı bakla tarlalarından elde edildi) ve kontrol (sahte aşılanmış) bitkiler dahil olmak üzere üç zaman noktası hesaplandı (aşılamadan 6, 12 ve 24 saat sonra). Ölçek, Pearson korelasyon katsayısının değerini gösterir.
İnç başına 6 beygir gücünde elde edilen verilere dayanarak, erken savunma tepkilerine odaklanmak için aşılanmış ve kontrol bitkilerini karşılaştırarak tanımlanan 9981 DEG üzerinde WGCNA gerçekleştirildi (Ek Tablo S12). Genotipler ve deneysel varyantlar arasında ilişkili (pozitif veya negatif) ifade profillerine sahip yirmi iki gen modülü (küme) bulundu. Ortalama olarak, gen ifadesi düzeyleri sırasıyla 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popülasyon 22660 (ancak her iki varyantta da bu eğilim kontrol bitkilerinde daha güçlüydü) şeklinde azalıyordu. Ortalama olarak, gen ifadesi düzeyleri sırasıyla 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popülasyon 22660 (ancak her iki varyantta da bu eğilim kontrol bitkilerinde daha güçlüydü) şeklinde azalıyordu. В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Nüfus 22660 (в обоих вариантах, однако, эта) тенденция была сильнее у контрольных растений). Ortalama olarak, gen ifadesi düzeyleri 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popülasyon 22660 sıralamasında azaldı (ancak her iki varyantta da bu eğilim kontrol bitkilerinde daha güçlüydü).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Nüfus 22660的顺序下降(然而,在两种变体中,这种趋势在对照植物中更强)。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> nüfus 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种Bu, bir başkasının adıdır. В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Nüfus 22660 (однако в обоих вариантах эта) тенденция была сильнее у контрольных растений). Ortalama olarak, gen ifadesi düzeyleri 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popülasyon 22660 serisinde azaldı (ancak her iki varyantta da bu eğilim kontrol bitkilerinde daha güçlüydü).Aşılama, özellikle 18, 19, 14, 6 ve 1 modüllerinde (etkiye göre azalan sırayla), negatif düzenlemede (örn. 9 ve 20 modüllerinde) veya nötr etkilerde (örn. 11, 22, 8 ve 13 modüllerinde) gen ifadesinin yukarı düzenlenmesine neden oldu. GO terimi zenginleştirme analizi (Ek Tablo S13), maksimum aktivasyona sahip aşılanmış modül için “GO: 0006952 Koruyucu tepkiler” ortaya koydu (18), buna qPCR ile analiz edilen genler (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 ve TanjilG_27015) ve birçok en fazla baskılanmış fotosentez modülü (9) de dahildir. Modül 18 konsantratörü (Şekil 8), PR-10 benzeri LlR18B proteinini kodlayan TanjilG_26536 geni olarak tanımlandı ve modül 9 konsantratörü, fotosistem II PsbQ proteinini kodlayan TanjilG_28955 geni olarak tanımlandı. Bir aday antraknoz direnç geni olan Lanr1, TanjilG_05042, modül 22'de (Şekil 9) bulundu ve TanjilG_01212 merkezini taşıyan “GO:0044260 Hücresel makromoleküler metabolik süreçler” ve “GO:0006355 Transkripsiyonel düzenleme, DNA şablonlama” terimleriyle ilişkilendirildi. Gen, ısı stresi transkripsiyon faktörü A-4a'yı (HSFA4a) kodlar.
Aşırı temsil edilen biyolojik süreç terimlerine sahip modüllerin gen eş ifadesinin ağırlıklı ağ analizi “GO: 0006952 Savunma tepkileri”. Ligasyon, qPCR ile analiz edilen dört geni (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 ve TanjilG_27015) vurgulamak için basitleştirildi.
Aşırı temsil edilen biyolojik süreç terimi “GO: 0006355: Transkripsiyonel düzenleme, DNA şablonlama” olan ve aday antraknoz direnç geni Lanr1 TanjilG_05042 taşıyan bir modülün gen eş ifadesinin ağırlıklı ağ analizi. TanjilG_05042 genini ve merkezi TanjilG_01212 genini izole etmek için ligasyon basitleştirildi.
Avustralya'da yapılan antraknoz direnci taraması, erken serbest bırakılan çeşitlerin çoğunun duyarlı olduğunu gösterdi; Kalya, Coromup ve Mandelup orta derecede dirençli olarak tanımlanırken, Wonga, Tanjil ve 83A:476 oldukça dirençli olarak tanımlanmıştır26,27,31. aynı direnç aleline sahipti, Lanr1 olarak adlandırıldı ve Coromup ile Mandelup'un AnMan olarak adlandırılan farklı bir aleli vardı10, 26, 39, Kalya ise farklı bir alel aktardı. , Lanr2. Almanya'da antraknoz direnci için yapılan tarama, Lanr1'den farklı bir aday alele sahip olan LanrBo36 olarak adlandırılan Bo7212 adlı dirençli bir hattın tanımlanmasıyla sonuçlandı.
Çalışmamız test edilen germ plazmasında Lanr1 alelinin çok düşük bir frekansta (yaklaşık %6) olduğunu ortaya koydu. Bu gözlem, Lanr1 alelinin yalnızca iki Belarus hattında bulunduğunu gösteren Anseq3 ve Anseq4 belirteçleri kullanılarak Doğu Avrupa germ plazmasının taranmasının sonuçlarıyla tutarlıdır. Bu, Lanr1 alelinin Avustralya'da belirteç destekli üreme için anahtar alellerden biri olmasının aksine, yerel üreme programları tarafından henüz yaygın olarak kullanılmadığını göstermektedir. Bu, Lanr1 alelinin Avrupa saha koşullarında Avustralya raporuna kıyasla daha düşük direnç seviyesinden kaynaklanıyor olabilir. Ayrıca, Avustralya'daki yüksek yağışlı bölgelerde antraknoz üzerine yapılan çalışmalar, Lanr1 aleli tarafından aracılık edilen direnç tepkilerinin patojenin büyümesini ve hızlı gelişimini destekleyen hava koşullarında etkili olmayabileceğini göstermiştir19,42. Aslında, mevcut çalışmada, Lanr1 alelini taşıyan genotiplerde de antraknozun bazı semptomları gözlemlendi ve bu da C. lupini'nin gelişimi için en uygun koşullar altında direncin ortadan kalkabileceğini düşündürmektedir. Ayrıca, Lanr1 lokusundan yaklaşık 1 cM uzaklıkta bulunan Anseq3 ve Anseq4 belirteçlerinin varlığına ilişkin yanlış pozitif yorumlar da mümkündür 28,30,43 .
Çalışmamız, Lanr1 alelini taşıyan 83A:476'nın C. lupini aşılamasına ilk analiz edilen zaman noktasında (6 saat) büyük ölçekli transkriptom yeniden programlamasıyla yanıt verdiğini, AnMan alelini taşıyan Mandelup'ta ise transkriptomik yanıtların çok daha sonra (24 ila 48 saat arasında) gözlemlendiğini gösterdi. Savunma yanıtlarındaki bu zamansal değişimler hastalık semptomlarındaki farklılıklarla ilişkilidir ve dirence karşı başarılı bir yanıt için erken patojen tanımanın önemini vurgular. Bitki dokusunu enfekte etmek için şarbon sporlarının çimlenme, hücre bölünmesi ve bir apressorium oluşumu dahil olmak üzere konak yüzeyinde çeşitli gelişim aşamalarından geçmesi gerekir. Bir uzantı, konak yüzeyine bağlanan ve konak dokularına penetrasyonu kolaylaştıran enfeksiyöz bir yapıdır. Böylece, bezelye özütündeki C. gloeosporioides sporları 75-90 dakikalık inkübasyondan sonra çekirdeğin ilk bölünmesini, 90-120 dakika sonra germ tüpünün oluşumunu ve 4 saat sonra baskılanmayı gösterdi 45. Mango C. gloeosporioides, 3 saatlik inkübasyondan sonra %40'tan fazla konidial çimlenme ve 4 saat sonra yaklaşık %20 apressör oluşumu gösterdi. C. gloeosporioides'in virülansla ilişkili CAP20 geni, yüksek CAP20 protein konsantrasyonlarına sahip avokado yüzey mumunda 3,5 saatlik inkübasyondan sonra epifit oluşturan konidialarda 4 saat 46 dakika sonra transkripsiyonel aktivite gösterdi. Benzer şekilde, C. trifolii'deki melanin biyosentez genlerinin aktivitesi, 2 saatlik bir inkübasyon sırasında ve ardından 1 saat sonra bir apressorium oluşumu sırasında indüklendi. Yaprak dokuları üzerinde yapılan çalışmalar, C. acutatum ile aşılanmış çileklerin ilk baskılanmanın 8 hpi'de olduğunu, C. coccodes ile aşılanmış domateslerin ise ilk baskılanmanın 4 hpi'de olduğunu göstermiştir48,49. Colletotrichum spp.'nin bulaşıcı sürecinin zaman ölçeğiyle büyük ölçüde tutarlıdır. 83A:476'ya verilen hızlı savunma tepkileri, bu hatta bitki direnci ve efektör tetiklemeli bağışıklık (ETI) genlerinin dahil olduğunu gösterirken, Mandelup'un gecikmiş tepkileri mikro ilişkili moleküler desen tetiklemeli bağışıklık (MTI) hipotezini desteklemektedir 50. 83A:476 ve Mandelup'a verilen erken tepkiler. Gecikmiş tepkide yukarı veya aşağı düzenlenmiş genler arasındaki kısmi örtüşme de bu kavramı desteklemektedir, çünkü ETI genellikle enfeksiyon bölgesinde anafilaktik şok olarak bilinen programlanmış hücre ölümüyle sonuçlanan hızlandırılmış ve geliştirilmiş bir MTI tepkisi olarak kabul edilir 51,52 .
Aşırı temsil edilen Gen Ontolojisi GO:0006952 “Savunma Tepkisi” terimine atfedilen genlerin çoğu, stres kaynaklı açlık mesajı 22 proteininin (SAM22'ye benzer) 11 homologu ve yedi ana lateks protein benzeridir (MLP). -benzeri proteinler 31, 34, 43 ve 423 dizi benzerliği gösterdi. SAM22 benzeri genler, daha uzun süren önemli bir aktivasyon göstererek antraknoz direncinin (83A:476 ve Boregine) artmış seviyelerini gösterdi. Bununla birlikte, MLP benzeri genler yalnızca aday direnç alelini taşıyan hatlarda aşağı düzenlendi (6 hpi'de 83A:476/Lanr1 ve 24 hpi'de Mandelup/AnMan). Tanımlanan tüm SAM22 benzeri homologların yaklaşık 105 kb'lik bir gen kümesinden kaynaklandığı, MLP benzeri genlerin ise genomun ayrı bölgelerinden kaynaklandığı belirtilmelidir. Bu tür SAM22 benzeri genlerin koordineli aktivasyonu, Diaporthetoxica aşılamasına karşı NLL direncine ilişkin önceki çalışmamızda da bulundu ve bu, bunların savunma yanıtının yatay bileşenlerinde yer aldığını düşündürmektedir. Bu sonuç, SAM22 benzeri genlerin yaralanmaya veya salisilik asit, mantar indükleyicileri veya hidrojen peroksit ile tedaviye olumlu yanıt verdiğine dair raporlarla da desteklenmektedir.
MLP benzeri genlerin, birçok bitki türünde bakteriyel, viral ve patojenik mantar enfeksiyonları da dahil olmak üzere çeşitli abiyotik ve biyotik streslere yanıt verdiği gösterilmiştir55. Bitkiler ve patojenler arasındaki belirli etkileşimlere yanıt yönleri, güçlü bir şekilde artıştan (yani, pamuğun Verticillium dahliae ile istila edilmesi sırasında) önemli ölçüde azalmaya (yani, elma ağacının Alternaria spp. ile enfeksiyonundan sonra) kadar değişmiştir56,57. MLP benzeri 423 geninin önemli ölçüde aşağı düzenlenmesi, F. niger enfeksiyonuna karşı avokado savunmaları sırasında ve elma ağacının enfeksiyonu sırasında gözlemlenmiştir Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola ve Alternaria alternata elma patotipleridir58,59. Ek olarak, MLP benzeri 423 genini aşırı ifade eden elma kallusları, dirençle ilişkili genlerin daha düşük ifadesi gösterdi ve mantar enfeksiyonuna daha duyarlıydı59. Fusarium oxysporum f'yi takiben, MLP benzeri 423 geni dirençli yaygın fasulye germ plazmasında da baskılandı. cn. Fasulye enfeksiyonu 60.
RNA-seq çalışmamızda tanımlanan PR-10 ailesinin diğer üyeleri, yukarı regülasyona yanıt olarak LlR18A ve LlR18B genleri ile lipid transfer proteini DIR1 için yukarı regüle edilmiş (1 gen) veya aşağı regüle edilmiş (3 gen) gendi. Ek olarak, WGCNA, aşılamaya karşı oldukça duyarlı olan ve birkaç koruyucu yanıt geni taşıyan LlR18B genini bu modülde bir merkez olarak vurgulamaktadır. LlR18A ve LlR18B genleri, patojenik bakterilere yanıt olarak sarı acı bakla yapraklarında ve D. toxica aşılamasından sonra NLL gövdelerinde indüklenirken, bu genlerin pirinç homologu RSOsPR10, muhtemelen jasmonik asit sinyal yolunda yer alan bir mantar enfeksiyonu tarafından hızla indüklenmiştir53,61, 62. DIR1 geni, sistemik edinilmiş direncin (SAR) başlangıcı için gerekli olan spesifik olmayan lipid taşıma proteinlerini kodlar. Koruyucu reaksiyonların gelişmesiyle, DIR1 proteini enfeksiyon odağından floem yoluyla taşınarak uzak organlarda SAR'ı indükler. İlginç bir şekilde, TanjilG_02313 DIR1 geni 84A:476 ve Popülasyon 22660 satırlarında ilk zaman noktasında önemli ölçüde indüklendi, ancak antraknoz direnci yalnızca 84A:476 satırında başarılı bir şekilde gelişti. Bu, NLL'de DIR1 geninin bir miktar alt işlevliliğini gösterebilir, çünkü kalan üç homolog yalnızca 83A:476 satırında 6 saat sonra aşılamaya yanıt verdi ve bu yanıt aşağı doğru yönlendirildi.
Çalışmamızda, “GO:0055114 Redoks süreci” olarak adlandırılan biyolojik sürece karşılık gelen en yaygın bileşenler sitokrom P450 proteini, peroksidaz, linoleik asit 9S-/13S-lipoksijenaz ve 1-aminosiklopropan-1-karboksilik asit oksidazdı. Ek olarak, WGCNA'mız HSFA4a homologunu Lanr1 direnç geni adayı TanjilG_05042 gibi modülleri taşıyan bir merkez olarak tanımlar. HSFA4a, bitkilerde nükleer transkripsiyonun redoks bağımlı regülasyonunun bir bileşenidir.
Sitokrom P450 proteinleri, ksenobiyotiklerin metabolizması, hormonlar, yağ asitleri, steroller, hücre duvarı bileşenleri, biyopolimerler ve koruyucu bileşiklerin biyosentezi de dahil olmak üzere birincil ve ikincil metabolizmada NADPH ve/veya O2'ye bağlı hidroksilasyon reaksiyonlarını katalize eden oksidoredüktazlardır 69. Bizim Bir çalışmada, bitki sitokrom P450 fonksiyonundaki değişkenlik, çok sayıda değişmiş homolog (37) ve spesifik genler arasındaki yanıt örüntülerindeki farklılıklar nedeniyle -10,6 log2'den (katlama değişimi) 5,7'ye düşürüldü ve yukarı doğru bir revizyonu yansıttı. . Böylesine büyük bir protein süperfamilyasındaki NLL genlerinin varsayılan biyolojik fonksiyonunu açıklamak için yalnızca RNA-seq verilerini kullanmak oldukça spekülatif olacaktır. Bununla birlikte, bazı sitokrom P450 genlerinin alerjik reaksiyonlara katkıda bulunmak da dahil olmak üzere patojenik mantarlara veya bakterilere karşı artan dirençle ilişkili olduğunu belirtmekte fayda var69,70,71.
Sınıf III peroksidazlar, bitki büyümesi ve gelişimi sırasında ve tuzluluk, kuraklık, yüksek ışık yoğunluğu ve patojen saldırısı gibi çevresel streslere yanıt olarak çok çeşitli metabolik süreçlerde yer alan çok işlevli bitki enzimleridir72. Peroksidazlar, Stylosanthes humilis ve C. gloeosporioides, Lens culinaris ve C. truncatum, Phaseolus vulgaris ve C. lindemuthianum, Cucumis sativus ve C. lagenarium73,74,75,76 dahil olmak üzere çeşitli bitki türlerinin Anthracis ile etkileşiminde yer alır. Mantar bitki dokusuna nüfuz etmeden önce yanıt çok hızlıdır, bazen 4 HPI'de bile73. Peroksidaz geni ayrıca D. toxica NLL aşılamasına da yanıt verdi. Peroksidazlar, oksidatif patlamayı düzenleme veya oksidatif stresi ortadan kaldırma gibi tipik işlevlerine ek olarak, lignifikasyon, alt birim veya spesifik bileşiklerin çapraz bağlanması sırasında hücre duvarı takviyesine dayalı fiziksel bariyerler oluşturarak patojen büyümesine müdahale edebilir. Bu işlev, çalışmamızda 6 HPI'de 83A:476 dirençli hattında önemli ölçüde yukarı düzenlenen, ancak yanıt vermeyen diğer suşlarda ve zaman noktalarında düzenlenmeyen, varsayımsal bir lignin oluşturan anyon peroksidazı kodlayan TanjilG_03329 genine in silico olarak atfedilebilir.
Linoleik asidin 9S-/13S-lipoksijenazı, lipid biyosentezinin oksidatif yolundaki ilk adımdır78. Bu yolun ürünleri, kalloz ve pektin birikintilerinin oluşumu yoluyla hücre duvarının güçlendirilmesi ve reaktif oksijen türlerinin üretimi yoluyla oksidatif stresin düzenlenmesi dahil olmak üzere bitki savunmasında birden fazla işleve sahiptir79,80,81,82,83. Mevcut çalışmada, linoleik asit 9S-/13S-lipoksijenazının ifadesi tüm suşlarda değişti, ancak duyarlı popülasyonda 22660, farklı zaman noktalarında yukarı regülasyon hakim oldu, buna karşın dirençli Lanr1 ve AnMan alelini taşıyan suşlarda, bu genotipler arasındaki koruyucu şarbon reaksiyonlarında oksilipin tabakasının çeşitlenmesini vurgular.
1-aminosiklopropan-1-karboksilat oksidaz (ACO) homologu, lupin ile aşılandığında önemli ölçüde yukarı düzenlendi (9 gen) veya aşağı düzenlendi (2 gen). İki istisna dışında, bu tepkilerin hepsi 6 hp'de meydana geldi. 83A:476'da. ACO proteinleri tarafından aracılık edilen enzimatik reaksiyon, etilen üretiminde hız sınırlayıcı adımdır ve bu nedenle oldukça düzenlenir84. Etilen, bitki gelişimini ve abiyotik ve biyotik stres koşullarına tepkisini düzenlemede çeşitli roller oynayan bir bitki hormonudur. ACO transkripsiyonunun indüksiyonu ve etilen sinyal yolunun aktivasyonu, reaktif oksijen türleri ve fitoaleksinlerin üretimini düzenleyerek pirincin hemibiyotrofik mantar oryzae oryzae'ye karşı direncini artırmada rol oynar. Bu çalışmada bildirilen 83A:476 hattında ACO homologlarının önemli ölçüde yukarı regülasyonunun arka planında, M. oryzae ve C. lupini88,89 arasında bulunan çok benzer bir yaprak enfeksiyonu süreci, NLL antraknoz Etilen'e karşı direncin moleküler yollarda merkezi bir sinyal adımı olma olasılığını değiştirmektedir.
Mevcut çalışmada, fotosentezle ilişkili birçok genin büyük ölçekli baskılanması 83A:476'da 6 hpi'de ve Mandeloop ve 22660 popülasyonunda 48 hpi'de gözlemlendi. Bu değişikliklerin kapsamı ve ilerlemesi seviyeyle orantılıdır. Bu deneyde antraknoz direnci gözlemlendi. Son zamanlarda, patojenik bakteriler ve mantarlar dahil olmak üzere bitki-patojen etkileşimlerinin çeşitli modellerinde fotosentezle ilişkili transkriptlerin güçlü ve erken baskılanması bildirilmiştir. Enfeksiyona yanıt olarak fotosentezle ilişkili genlerin acele (bazı etkileşimlerde 2 HPI'den) ve genel olarak baskılanması, reaktif oksijen türlerinin konuşlandırılmasına ve alerjik reaksiyonlara aracılık etmek için salisilik asit yoluyla etkileşimlerine dayanarak bitki bağışıklığını tetikleyebilir 90,94.
Sonuç olarak, en dirençli soy hattı için önerilen savunma tepki mekanizmaları (83A:476) arasında R geni tarafından hızlı patojen tanınması (muhtemelen TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) ve alerjik tepki aracılı salisilik asit ve etilen sinyallemesi, ardından uzun menzilli SAR'ın kurulması yer alır. eylem DIR-1 proteini tarafından desteklenir. C. lupini enfeksiyonu için biyotrofik dönemin çok kısa olduğu (yaklaşık 2 gün), ardından nekrotik büyümenin geldiği belirtilmelidir95. Bu aşamalar arasındaki geçiş, nekroz ve konuk bitkilerde aşırı duyarlılık reaksiyonlarının tetikleyicisi olarak hareket eden etilenle indüklenebilir proteinlerin ekspresyonu ile ilişkili olabilir. Bu nedenle, biyotrofik aşamada C. lupini'nin başarılı bir şekilde yakalanması için zaman penceresi çok dardır. 83A:476'da 6 saat sonra gözlemlenen redoks ve fotosentezle ilişkili genlerin yeniden programlanması, mantar hiflerinin ilerlemesiyle tutarlıdır ve biyotrofik aşamada başarılı bir koruyucu yanıtın gelişiminin habercisidir. Mandelup ve 22660 popülasyonunun transkriptomik yanıtları, nekrotik büyümeye geçmeden önce mantarı yakalamak için çok gecikmiş olabilir, ancak Mandelup, PR-10 proteininin nispeten hızlı düzenlenmesi yatay direnci teşvik ettiği için 22660 popülasyonundan daha etkili olabilir.
Kanonik R geni tarafından yönlendirilen ETI, fasulyenin antraknoza karşı direnci için yaygın bir mekanizma gibi görünmektedir. Bu nedenle, model baklagil Medicago truncatula'da, antraknoza karşı direnç, TIR-NBS-LRR97 bitki R gen sınıfının bir üyesi olan RCT1 geni tarafından verilir. Bu gen ayrıca, duyarlı bitkilere aktarıldığında alfalfa'da geniş spektrumlu antraknoz direnci de verir. Yaygın fasulyede (P. vulgaris), bugüne kadar iki düzineden fazla antraknoz direnci geni tanımlanmıştır. Bu genlerin bazıları, herhangi bir kanonik R geninin bulunmadığı bölgelerde bulunurken, diğer birçoğu TIR-NBS-LRRs99 dahil olmak üzere NBS-LRR gen kümesini taşıyan kromozomların kenarlarında yer almaktadır. Genom çapındaki SSR çalışması ayrıca, NBS-LRR geninin yaygın fasulyede antraknoz direnciyle ilişkisini doğrulamıştır. Beyaz acı bakla 101'de majör antraknoz direnç lokusunu taşıyan genomik bölgede kanonik R geni de bulundu.
Çalışmamız, bitki enfeksiyonunun erken bir aşamasında (tercihen en geç 12 saat sonra) aktive olan ani bir direnç reaksiyonunun, dar yapraklı acı baklayı patojenik mantar Collelotrichum lupini'nin neden olduğu antraknozdan etkili bir şekilde koruduğunu göstermektedir. Yüksek verimli dizileme kullanarak, Lanr1 ve AnMan direnç genleri tarafından aracılık edilen NLL bitkilerinde antraknoz direnç genlerinin farklı ifade profillerini gösterdik. Başarılı savunma, bitkinin bir patojenle ilk temasından itibaren saatler içinde redoks, fotosentez ve patojenezde yer alan proteinler için genleri dikkatlice tasarlamayı içerir. Benzer koruyucu reaksiyonlar, ancak zaman içinde gecikmiş olanlar, bitkileri hastalıklardan korumada çok daha az etkilidir. Lanr1 geni tarafından aracılık edilen şarbon direnci, R geninin tipik hızlı tepkisine (etkileyici tetiklemeli bağışıklık) benzerken, AnMan geni büyük olasılıkla yatay bir tepki (mikropla ilişkili bir moleküler desen tarafından tetiklenen bağışıklık) sağlayarak orta düzeyde sürdürülebilirlik sağlar.
Antraknoz belirteçlerini taramak için kullanılan 215 NLL hattı, 74 çeşit, 60 hat çaprazlama veya yetiştirme yoluyla elde edilmiş, 5 mutant ve 76 yabani veya orijinal germ plazmasından oluşuyordu. Hatlar 17 ülkeden, çoğunlukla Polonya'dan (58), İspanya'dan (47), Almanya'dan (27), Avustralya'dan (26), Rusya'dan (19), Belarus'tan (7), İtalya'dan (5) ve diğer hatlardan geldi. 10 ülkeden. Set ayrıca referans dirençli hatları da içerir: Lanr1 alelini taşıyan 83A:476, Tanjil, Wonga ve AnMan alelini taşıyan Mandelup. Hatlar, Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polonya tarafından tutulan Avrupa Lupin Genetik Kaynak Veritabanından elde edildi (Ek Tablo S1).
Bitkiler kontrollü koşullar altında yetiştirildi (fotoperiyot 16 saat, sıcaklık gündüz 25 °C ve gece 18 °C). İki biyolojik tekrar analiz edildi. DNA, protokole göre DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Almanya) kullanılarak üç haftalık yapraklardan izole edildi. İzole edilen DNA'nın kalitesi ve konsantrasyonu spektrofotometrik yöntemlerle (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) değerlendirildi. Antraknoz direnç geni AnMan'ı (cv. Mandelup'tan türetilmiştir) işaretleyen AnManM1 belirteci ve Lanr1 genini çevreleyen Anseq3 ve Anseq4 belirteçleri (cv. Tanjil'den türetilmiştir) analiz edildi (11,26,28). Dirençli alel için homozigotlar "1", duyarlı olanlar "0" ve heterozigotlar 0,5 olarak puanlandı.
AnManM1, AnSeq3 ve AnSeq4 belirteçleri için tarama sonuçlarına ve son takip deneyleri için tohumların mevcudiyetine dayanarak, antraknoz direnç fenotiplemesi için 50 NLL hattı seçildi. Analiz, gündüzleri 22°C ve geceleri 19°C sıcaklık aralığında, 14 saatlik fotoperiyotlu bilgisayar kontrollü bir serada iki kez gerçekleştirildi. Tohum kabuğunun çok sert olmasından kaynaklanan tohum uykuda kalmasını önlemek ve düzgün çimlenmeyi sağlamak için ekimden önce tohumlar çizilir (embrionun karşı tarafındaki tohum kabuğu keskin bir bıçakla kesilir). Bitkiler steril topraklı (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varşova, Polonya) saksılarda (11 × 11 × 21 cm) yetiştirildi. Aşılama, 1999 yılında Büyük Polonya'daki Verzhenitsa'da (52° 27′ 42″ K 17° 04′ 05″ D) bir tarlada yetiştirilen dar yapraklı acı bakla bitkilerinin gövdelerinden yetiştirilen Colletotrichum lupini Col-08 suşu ile gerçekleştirildi. Bir alan edinin. İzolatlar, sporulasyonu teşvik etmek için 21 gün boyunca siyah ışık altında 20° C'de SNA ortamında kültüre edildi. Ekimden dört hafta sonra, bitkiler 4-6 yapraklı aşamaya ulaştığında, aşılama, ml başına 0,5 x 106 konidia konsantrasyonunda bir konidia süspansiyonu püskürtülerek gerçekleştirildi. Aşılamadan sonra, konidiaların çimlenmesini ve enfeksiyon sürecini kolaylaştırmak için bitkiler yaklaşık %98 nem ve 25°C sıcaklıkta 24 saat boyunca karanlıkta tutuldu. Bitkiler daha sonra 22°C gündüz/19°C gece ve %70 nemde 14 saatlik bir fotoperiyotta yetiştirildi. Hastalık puanı aşılamadan 22 gün sonra yapıldı ve gövde ve yapraklarda nekrotik lezyonların varlığına veya yokluğuna bağlı olarak 0 (bağışık) ile 9 (çok hassas) arasında değişti. Ayrıca puanlamadan sonra bitkilerin ağırlığı ölçüldü. Belirteç genotipleri ile hastalık fenotipleri arasındaki ilişkiler nokta iki dizi korelasyonları (antraknoz direnç fenotipinin analizi için hat setinde heterozigot belirteçlerin yokluğu) olarak hesaplandı.