Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümünün CSS desteği sınırlıdır. En iyi deneyim için, güncel bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz. Bu süre zarfında, desteğin devamlılığını sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan görüntüleyeceğiz.
Acı bakla (Lupinus angustifolius L.), gıda üretimi ve toprak iyileştirme için kullanılan bir baklagil bitkisidir. Acı baklanın bir ürün olarak küresel yayılımı, yıkıcı antraknoz hastalığına neden olan acı bakla antraknozu da dahil olmak üzere birçok patojenik mantarı kendine çekmiştir. Artan direnç sağlayan Lanr1 ve AnMan olmak üzere iki alel, acı bakla ıslahında kullanılmıştır, ancak altta yatan moleküler mekanizmalar bilinmemektedir. Bu çalışmada, Avrupa acı bakla örneklerini taramak için Lanr1 ve AnMan belirteçleri kullanılmıştır. Kontrollü bir ortamda aşının test edilmesi, her iki dirençli donörün de etkinliğini doğrulamıştır. Temsilci dirençli ve duyarlı hatlarda diferansiyel gen ekspresyon profillemesi yapılmıştır. Antraknoz direnci, "GO:0006952 Savunma Tepkisi", "GO:0055114 Redoks Süreci" ve "GO:0015979 Fotosentez" gen ontoloji terimlerinin aşırı ekspresyonu ile ilişkilendirilmiştir. Ek olarak, Lanr1(83A:476) hattı, aşılamadan hemen sonra önemli bir transkriptom yeniden programlaması gösterirken, diğer hatlar bu yanıtta yaklaşık 42 saatlik bir gecikme gösterdi. Savunma yanıtları, TIR-NBS, CC-NBS-LRR ve NBS-LRR genleri, patogenezde rol oynayan 10 protein, lipid transfer proteinleri, endoglukan-1,3-β-glukozidaz, glisin açısından zengin hücre duvarı proteinleri ve oksijenin reaktif yolundan gelen genlerle ilişkilidir. Fotosentezle ilişkili genlerin dikkatli bir şekilde baskılanması da dahil olmak üzere 83A:476'ya verilen erken yanıtlar, mantar biyolojisinin vejetatif büyüme evresinde başarılı bir koruma ile örtüşmektedir; bu da bir efektörün bağışıklığı tetiklediğini düşündürmektedir. Mandeloop reaksiyonu ve genel yatay sürüklenme yavaşlamıştır.
Dar yapraklı acı bakla (NLL, Lupinus angustifolius L.), Batı Akdeniz bölgesinden köken alan yüksek proteinli bir tahıldır1,2. Günümüzde hayvanlar ve insanlar için gıda ürünü olarak yetiştirilmektedir. Ayrıca, simbiyotik azot sabitleyici bakteriler tarafından azot fiksasyonu ve genel olarak toprak yapısının iyileştirilmesi nedeniyle ürün rotasyon sistemlerinde yeşil gübre olarak da kabul edilir. NLL, geçen yüzyılda hızlı bir evcilleştirme sürecinden geçmiştir ve hala yüksek ıslah baskısı altındadır3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. NLL'nin yaygın olarak yetiştirilmesiyle birlikte, patojenik mantarların ortaya çıkması yeni tarımsal nişler oluşturmuş ve yeni ürün tahrip edici hastalıklara neden olmuştur. Acı bakla yetiştiricileri ve ıslahçıları için en dikkat çekici olanı, patojenik mantar Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13'ün neden olduğu antraknoz hastalığının ortaya çıkmasıydı. Acı bakla yetiştiricileri ve ıslahçıları için en dikkat çekici olanı, patojenik mantar Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13'ün neden olduğu antraknoz hastalığının ortaya çıkmasıydı. Наиболее примечательным для фермеров ve селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Acı bakla yetiştiricileri ve ıslahçıları için en dikkat çekici olanı, patojenik mantar Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13'ün neden olduğu antraknoz hastalığının ortaya çıkmasıydı.Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Saçlı。1 Наиболее поразительным для фермеров ve селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Acı bakla yetiştiricileri ve ıslahçıları için en dikkat çekici olanı, patojenik mantar Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13'ün neden olduğu antraknoz hastalığının ortaya çıkmasıdır.Hastalığın ilk raporları Brezilya ve Amerika Birleşik Devletleri'nden gelmiş olup, tipik semptomlar sırasıyla 1912 ve 1929 yıllarında ortaya çıkmıştır. Ancak yaklaşık 30 yıl sonra patojen, Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. olarak adlandırılmıştır. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld'un teleomorfudur. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld'un fotoğrafı. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld'un fotoğrafı. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in Targeted Morphology. & H. Schrenk. & H. Schrenk, .ve H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。ve H. Schlenk, .20. yüzyılın ortalarında yapılan ön hastalık fenotiplemesi, NLL ve sarı acı bakla (L. luteus L.) çeşitlerinde bir miktar direnç gösterirken, test edilen tüm beyaz acı bakla (L. albus L.) çeşitlerinin oldukça duyarlı olduğunu ortaya koymuştur15,16. Çalışmalar, antraknozun gelişmesinin artan yağış (hava nemi) ve sıcaklık (12-28°C aralığında) ile ilişkili olduğunu ve daha yüksek sıcaklıklarda direncin bozulmasına yol açtığını göstermiştir17, 18. Aslında, konidilerin çimlenmesi ve hastalığın başlaması için gereken süre, yüksek nem koşullarında 24°C'de (4 saat) 12°C'ye (16 saat) göre dört kat daha kısadır19. Dolayısıyla, devam eden küresel ısınma antraknozun yayılmasına yol açmıştır. Bununla birlikte, hastalık Fransa'da (1982) ve Ukrayna'da (1983) yaklaşan bir tehdidin habercisi olarak gözlemlenmiş, ancak o dönemde acı bakla endüstrisi tarafından görünüşe göre göz ardı edilmiştir20,21. Birkaç yıl sonra, bu yıkıcı hastalık tüm dünyaya yayıldı ve Avustralya, Polonya ve Almanya gibi başlıca acı bakla üreten ülkeleri de etkiledi22,23,24. 1990'ların ortalarındaki bir antraknoz salgınından sonra, kapsamlı taramalar sonucunda NLL19 örneklerinde birkaç dirençli verici tespit edildi. NLL'nin antraknoza karşı direnci, farklı genetik kaynaklarda bulunan iki ayrı baskın alel tarafından kontrol edilir: Tanjil ve Wonga çeşitlerinde Lanr1 ve Mandalay çeşidinde AnMan25, 26. Bu aleller, ıslah programlarında dirençli genetik materyalin seçilmesini destekleyen moleküler belirteçleri tamamlar25,26,27,28,29,30. Lanr1 alelini taşıyan dirençli ıslah hattı 83A:476, duyarlı yabani hat P27255 ile çaprazlanarak antraknoz direncine göre ayrışan bir RIL popülasyonu elde edildi ve bu da Lanr1 lokusunun NLL-1131, 32, 33 kromozomuna atanmasını mümkün kıldı. Antraknoza karşı direnç lokuslarının çevresindeki bağlantı haritası işaretleyicilerinin genomik bir çerçeve olan NLL ile hizalanması, üç alelin de aynı kromozomda (NLL-11) ancak farklı pozisyonlarda bulunduğunu ortaya koydu29,34,35. Bununla birlikte, RIL'lerin az sayıda olması ve işaretleyiciler ile karşılık gelen aleller arasındaki büyük genetik mesafe nedeniyle, altta yatan genler hakkında güvenilir sonuçlar çıkarılamaz. Öte yandan, lupinlerde ters genetiğin kullanımı, çok düşük rejenerasyon potansiyelleri nedeniyle zordur ve bu da genetik manipülasyonu zahmetli hale getirir37.
İstenilen aleli homozigot durumda taşıyan evcilleştirilmiş genetik materyalin (örneğin 83A:476 (Lanr1) ve Mandelup (AnMan)) geliştirilmesi, yabani popülasyonlarda zıt alel kombinasyonlarının varlığı karşısında antraknoz direncini incelemenin yolunu açmıştır. Moleküler mekanizmaların olasılıkları. Belirli genotipler tarafından üretilen savunma yanıtlarını karşılaştırın. Bu çalışma, NLL'nin C. lupini aşısına karşı erken transkriptom yanıtını değerlendirdi. İlk olarak, 215 hat içeren bir Avrupa NLL genetik materyal paneli, Lanr1 ve AnMan alellerini işaretleyen moleküler belirteçler kullanılarak tarandı. Daha sonra, moleküler belirteçler için önceden seçilen 50 NLL hattında kontrollü koşullar altında antraknoz fenotiplemesi yapıldı. Bu deneylere dayanarak, antraknoz direnci ve Lanr1/AnMan alel bileşimi bakımından farklılık gösteren dört hat, iki tamamlayıcı yaklaşım kullanılarak farklı savunma geni ekspresyon profillemesi için seçildi: yüksek verimli RNA dizileme ve gerçek zamanlı PCR kantifikasyonu.
NLL genetik materyalinin (N = 215) Lanr1 (Anseq3 ve Anseq4), AnMan (Anseq4) ve AnMan (AnManM1) belirteçleriyle taranması, yalnızca bir hattın (95726, Salamanca-b yakınında) tüm belirteçler için "direnç" alelini çoğalttığını gösterirken, "Duyarlı" alellerin varlığı, tüm belirteçlerin oranının 158 (~%73,5) hatta bulunduğunu ortaya koydu. On üç hat, Lanr1 belirtecinin iki "dirençli" alelini, 8 hat ise Lanr1 belirtecinin "dirençli" alellerini üretti. AnMan belirtecinin "direnç" aleli (Ek Tablo S1). İki hat Anseq3 belirteci için heterozigot, bir hat ise AnManM1 belirteci için heterozigottu. 42 hat (%19,5), Anseq3 ve Anseq4 alellerinin zıt fazlarını taşıyordu; bu da bu iki lokus arasında yüksek bir rekombinasyon sıklığına işaret ediyordu. Kontrollü koşullar altında antraknoz fenotipleri (Ek Tablo S2), test edilen genotiplerin direncinde değişkenlik olduğunu ortaya koydu ve bu da antraknozun şiddetine yansıdı. Ortalama puanlardaki farklılıklar 1,8 (orta derecede dirençli) ile 6,9 ​​(hassas) arasında değişirken, bitki ağırlığı farklılıkları 0,62 (hassas) ile 4,45 g (dirençli) arasında değişti. Deneyin iki tekrarında gözlemlenen değerler arasında (hastalık şiddeti skorları için 0,51, P = 0,00017 ve bitki ağırlığı için 0,61, P < 0,0001) ve bu iki parametre arasında (− 0,59 ve − 0,77, P < 0,0001) anlamlı bir korelasyon vardı. Deneyin iki tekrarında gözlemlenen değerler arasında (hastalık şiddeti skorları için 0,51, P = 0,00017 ve bitki ağırlığı için 0,61, P < 0,0001) ve bu iki parametre arasında (− 0,59 ve − 0,77, P < 0,0001) anlamlı bir korelasyon vardı. Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для) баллов тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя раметрами (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Deneyin iki tekrarında gözlemlenen değerler arasında (hastalık şiddeti skorları için 0,51, P = 0,00017 ve bitki ağırlığı için 0,61, P < 0,0001) ve bu iki parametre arasında (-0,59 ve -0,77, P < 0,0001) anlamlı bir korelasyon bulunmuştur.在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为0,51,P = 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 ve- 0,77，P < 0,0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0,59 和– 0,59 ve 0,59 和– 0,59 和- 0,77，P < 0,0001)。 Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести) заболевания 0,51, P = 0,00017 ve масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001. Çift tekrarlı gözlemlerde elde edilen değerler arasında (hastalık şiddeti skoru 0,51, P = 0,00017 ve bitki ağırlığı 0,61, P < 0,0001) ve bu iki parametre arasında (-0,59 ve -0,0001) 0,77, P<0,0001 anlamlı bir korelasyon vardı. ).Hastalığa duyarlı bitkilerde görülen tipik belirtiler arasında, "çoban yayı" yapısına benzeyen gövde bükülmesi ve kıvrılması, ardından turuncu/pembe sporozoit içeren oval lezyonlar yer alır (Ek Şekil 1). Lanr1 (83A:476 ve Tanjil) ve AnMan (Mandelup) genlerini taşıyan Avustralya örnekleri orta derecede dirençlidir (sırasıyla 0,0331 ve 0,0036). Ayrıca "dirençli" Lanr1 ve/veya AnMan alellerini taşıyan bazı hatlar da hastalığın belirtilerini göstermektedir.
İlginç bir şekilde, herhangi bir "dirençli" işaretleyici alel içermeyen birkaç NLL hattı, yüksek düzeyde antraknoz direnci gösterdi (Lanr1 veya AnMan genotiplerine kıyasla benzer veya daha yüksek), örneğin Boregine (her iki parametre için de P değeri < 0,0001), Bojar (puan için P değeri < 0,0001 ve bitki ağırlığı için 0,001) ve Popülasyon B-549/79b (puan için P değeri < 0,0001 ve ağırlık için anlamlı değil). İlginç bir şekilde, herhangi bir "dirençli" işaretleyici alel içermeyen birkaç NLL hattı, yüksek düzeyde antraknoz direnci gösterdi (Lanr1 veya AnMan genotiplerine kıyasla benzer veya daha yüksek), örneğin Boregine (her iki parametre için de P değeri < 0,0001), Bojar (puan için P değeri < 0,0001 ve bitki ağırlığı için 0,001) ve Popülasyon B-549/79b (puan için P değeri < 0,0001 ve ağırlık için anlamlı değil). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 veya AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 оценки и 0,001 для массы растения) ve популяции B-549/79b (значение P <0,0001) çoğu zaman ve daha fazlası için). İlginç bir şekilde, herhangi bir 'dirençli' işaretleyici alel içermeyen birkaç NLL hattı, antraknoza karşı yüksek düzeyde direnç gösterdi (Lanr1 veya AnMan genotiplerine kıyasla veya onlardan daha yüksek), örneğin Boregine (her iki parametre için de P değeri < 0,0001), Bojar (değerlendirme için P değeri < 0,0001 ve bitki ağırlığı için 0,001) ve B-549/79b popülasyonu (değerlendirme için P değeri < 0,0001 ve ağırlık için anlamlı değil).Lanr1或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）。 İlginçtir ki, herhangi bir "antijenik" belirteç içermeyen bazı NLL sistemleri, Boregine (her iki parametre için de P < 0.0001), Bojar (P değeri < 0.0001, bitki ağırlığı 0.001) ve B-549/79b suşu (P değeri < 0.0001, ağırlık anlamlı değil) gibi yüksek yatay direnç (Lanr1 veya AnMan genlerine eşdeğer veya daha yüksek) göstermektedir. Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали уровни уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 veya AnMan), ve ayrıca Boregine (значение P) для обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P) <0,0001, масса растения 0,001) ve популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). İlginç bir şekilde, herhangi bir 'direnç' belirteç aleli içermeyen bazı NLL hatları, Boregine (her iki parametre için P değeri <0,0001), Bojar (P değeri < 0,0001, bitki ağırlığı 0,001) ve B-549/79b popülasyonu (P değeri < 0,0001, ağırlık anlamlı değil) gibi yüksek düzeyde antraknoz direnci gösterdi (Lanr1 veya AnMan genotiplerine kıyasla veya onlardan daha yüksek).Bu fenomen, direncin yeni bir genetik kaynağı olasılığını düşündürmekte ve işaretleyici genotipler ile hastalık fenotipleri arasındaki gözlemlenen korelasyon eksikliğini (P değerleri ~0,42 ile ~0,98 arasında) açıklamaktadır. Bu nedenle, Kolmogorov-Smirnov testi, antraknoz direncine ilişkin verilerin puanlar (P değerleri 0,25 ve 0,11) ve bitki kütlesi (P değerleri 0,47 ve 0,55) için yaklaşık olarak normal dağılıma sahip olduğunu göstermiştir; bu da Lanr1 ve AnMan'dan daha fazla alelin rol oynadığı hipotezini desteklemektedir.
Antraknoz direnci tarama sonuçlarına dayanarak, transkriptom analizi için 4 hat seçildi: 83A:476, Boregine, Mandelup ve Popülasyon 22660. Bu hatlar, önceki testtekiyle aynı olmaları koşuluyla, RNA dizilemesi ile aşılama deneylerinde şarbon direnci açısından yeniden test edildi. Puan değerleri şu şekildeydi: Boregine (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) ve Popülasyon 22660 (6,11 ± 1,29).
Illumina NovaSeq 6000 protokolü, örnek başına ortalama 40,5 Mread çifti (29,7 ila 54,4 Mread) elde etti (Ek Tablo S3). Referans dizideki hizalama puanları %75,5 ile %88,6 arasında değişti. Biyolojik tekrarlar arasındaki deneysel varyantlar arasındaki okuma sayısı verilerinin ortalama korelasyonu 0,812 ile 0,997 arasında değişti (ortalama 0,959). Analiz edilen 35.170 genin 2917'sinde hiçbir ifade saptanmazken, diğer 4785 genin ifadesi ihmal edilebilir düzeydeydi (bazal ortalama < 5). Analiz edilen 35.170 genin 2917'sinde hiçbir ifade saptanmazken, diğer 4785 genin ifadesi ihmal edilebilir düzeydeydi (bazal ortalama < 5). Из 35 170 генов 2917 hiçbir проявляли экспрессии, остальные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5). Analiz edilen 35.170 genin 2917'sinde hiçbir ifade gözlenmezken, geri kalan 4785 gen ihmal edilebilir düzeyde ifade edildi (bazal ortalama <5).在分析的35,170 个基因中,2917 个没有表达,其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35.170 Из 35 170 генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительную экспрессию (базовое среднее значение <5). Analiz edilen 35.170 genin 2917'si ifade edilmedi ve geri kalan 4785 genin ifadesi ihmal edilebilir düzeydeydi (bazal ortalama <5).Bu nedenle, deney sırasında ifade edildiği düşünülen gen sayısı (baz ortalama ≥ 5) 27.468 (%78,1) idi (Ek Tablo S4).
İlk zaman noktasından itibaren, tüm NLL hatları C. lupini (Col-08 suşu) aşılama işlemine transkriptomu yeniden programlayarak yanıt verdi (Tablo 1), ancak hatlar arasında önemli farklılıklar gözlemlendi. Bu nedenle, dirençli hat 83A:476 (Lanr1 genini taşıyan), ilk zaman noktasında (6 hpi) diğer zaman noktalarına kıyasla izole edilen yukarı ve aşağı gen sayısında 31-69 kat artışla önemli bir transkriptom yeniden programlaması gösterdi. Ek olarak, bu zirve kısa ömürlü oldu, çünkü ikinci zaman noktasında (12 hpi) sadece birkaç genin ifadesi önemli ölçüde değişmiş olarak kaldı. İlginç bir şekilde, aşılama testinde de yüksek düzeyde direnç gösteren Boregine, deney sırasında bu kadar büyük bir transkripsiyonel yeniden programlamaya uğramadı. Bununla birlikte, 12 HPI'da Boregine ve 83A:476 için farklı ifade edilen gen (DEG) sayısı aynıydı. Hem Mandelup hem de 22660 popülasyonu, son zaman noktasında (48 l/s) DEG zirveleri gösterdi; bu da savunma tepkilerinde göreceli bir gecikmeye işaret ediyor.
83A:476, diğer tüm hatlara kıyasla 6 HPI'da C. lupini'ye yanıt olarak büyük bir transkriptom yeniden programlaması geçirdiğinden, bu zaman noktasında gözlemlenen farklı ifade edilen genlerin (DEG'ler) yaklaşık %91'i soy hattına özgüydü (Şekil 1). Bununla birlikte, çalışma hatları arasında erken yanıtlarda bazı örtüşmeler vardı; Boregine, Mandelup ve 22660 popülasyonunda sırasıyla %68,5, %50,9 ve %52,6 oranındaki DEG'ler, belirli zaman noktalarında 83A:476'da bulunanlarla örtüşüyordu. Ancak, bu DEG'ler, 83A:476 kullanılarak şu anda tespit edilen tüm DEG'lerin yalnızca küçük bir bölümünü (%0,97-1,70) oluşturuyordu. Ek olarak, bu aşamada tüm hatlardan 11 farklı ifade edilen gen (DEG) tutarlıydı (Ek Tablolar S4-S6), bunlar arasında bitki savunma tepkilerinin ortak bileşenleri de yer alıyordu: lipid transfer proteini (TanjilG_32225), endoglukan-1,3-β-glukozit enzimi (TanjilG_23384), SAM22 gibi strese duyarlı iki protein (TanjilG_31528 ve TanjilG_31531), temel lateks proteini (TanjilG_32352) ve iki glisin açısından zengin yapısal hücre duvarı proteini (TanjilG_19701 ve TanjilG_19702). Ayrıca, 24 HPI'da 83A:476 ve Boregine arasında (toplam %16-38 DEG) ve 48 HPI'da Mandelup ve Popülasyon 22660 arasında (toplam %14-20 DEG) transkriptom yanıtlarında nispeten yüksek bir örtüşme vardı.
Colletotrichum lupini (1999 yılında Polonya'nın Wierzhenice kentindeki acı bakla tarlalarından elde edilen Col-08 suşu) ile aşılanmış dar yapraklı acı bakla (NLL) hatlarında farklı şekilde ifade edilen gen (DEG) sayısını gösteren Venn diyagramı. Analiz edilen NLL hatları şunlardır: 83A:476 (dirençli, Lanr1 allelini taşıyan), Boregine (dirençli, genetik arka planı bilinmeyen), Mandelup (orta derecede dirençli, AnMan allelini taşıyan) ve 22660 popülasyonu (çok duyarlı). hpi kısaltması, aşılamadan sonraki saatleri ifade eder. Grafiği basitleştirmek için sıfır değerleri kaldırılmıştır.
6 hpi'de aşırı ifade edilen gen seti, kanonik R gen alanlarının varlığı açısından analiz edildi (Ek Tablo S7). Bu çalışma, NBS-LRR alanlarına sahip klasik hastalık direnci genlerinin transkriptom indüksiyonunun yalnızca 83A:476'da gerçekleştiğini ortaya koydu. Bu set, bir TIR-NBS-LRR geni (tanjilg_05042), beş CC-NBS-LRR geni (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 ve tanjilg_16162) ve dört NBS-LR (tanjilg_16162), dört NBS-LRRE (tanjilg_16162), dört NBS-Lrr (tanjilg_16162) ve dört NBS-LRR (TANJILG_16162) geninden oluşuyordu. Bu genlerin tümü, korunmuş diziler halinde düzenlenmiş kanonik alanlara sahiptir. NBS-LRR alan genlerine ek olarak, 6 hpi'de birkaç RLL kinazı aktive edildi; bunlardan biri Boregine'de (TanjilG_19877), ikisi Mandelup'ta (TanjilG_07141 ve TanjilG_19877) ve 22660 popülasyonunda (TanjilG_09014 ve TanjilG_10361) ve ikisi de 83A 27:476'da aktive edildi.
C. lupini (Col-08 suşu) ile aşılama sonrasında ekspresyonu önemli ölçüde değişen genler, Gen Ontolojisi (GO) zenginleştirme analizine tabi tutuldu (Ek Tablo S8). En sık tekrarlanan biyolojik süreç terimi, 16 (zaman × satır) kombinasyonunun 6'sında yüksek anlamlılıkla (P değeri < 0,001) ortaya çıkan "GO:0006952 savunma yanıtı" idi (Şekil 2). En sık tekrarlanan biyolojik süreç terimi, 16 (zaman × satır) kombinasyonunun 6'sında yüksek anlamlılıkla (P değeri < 0,001) ortaya çıkan "GO:0006952 savunma yanıtı" idi (Şekil 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического proproцесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). En sık tekrarlanan biyolojik süreç terimi, 16 (zaman × soy) kombinasyonunun 6'sında yüksek anlamlılıkla (P değeri < 0,001) ortaya çıkan 'GO:0006952 savunma yanıtı' idi (Şekil 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”,它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 En temsili biyolojik süreç terimi, 16 (zaman×ağ) kombinasyonun 6'sında yüksek önemle (P değeri < 0,001) görünen “GO:0006952 savunma tepkisi”dir (Şekil 2). "GO: 0006952 Savunma Yanıtı", который появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). En sık tekrarlanan biyolojik süreç terimi, 16 kombinasyonun (zaman × satır) 6'sında yüksek anlamlılıkla (P değeri < 0,001) ortaya çıkan 'GO:0006952 Savunma Tepkisi' idi (Şekil 2).Bu terim, 83A:476 ve Boregine'de iki zaman noktasında (6 ve 24 saat sonra) ve Mandelup ve Popülasyon 22660'ta bir zaman noktasında (sırasıyla 12 ve 6 saat sonra) aşırı temsil edildi. Bu, dirençli hatların antifungal yanıtını vurgulayan beklenen bir sonuçtur. Ek olarak, 83A:476, "GO:0055114 redoks süreci" terimiyle temsil edilen oksidatif patlamayla ilgili genleri hızla indükleyerek C. lupini'ye yanıt verdi ve bu da spesifik bir savunma yanıtını gösterirken, Boregine 'GO' terimiyle ilgili spesifik savunma yanıtları ortaya koydu. :0006950 Stres tepkisi”. 22660 popülasyonu, ikincil metabolitleri içeren yatay direnç tepkisini aktive etti ve “GO:0016104 Triterpen biyosentezi süreci” ve “GO:0006722 Triterpen metabolizması süreci” terimlerinin aşırı sayısını vurguladı (her iki terim de aynı gen kümesine aittir). GO terim zenginleştirme analizinin sonuçları dikkate alındığında, Mandelup reaksiyonunun kararlılığı Boregine ve 22660 popülasyonu arasındaydı. Ek olarak, erken reaksiyon 83A:476 (6 hpi) ve gecikmiş reaksiyon Mandelup ve 22660 popülasyonu, GO:0015979 'fotosentez' terimini ve diğer ilgili biyolojik süreçleri içermektedir.
Dar yapraklı acı bakla (NLL) bitkisinin şarbonlu acı bakla (1999 yılında Polonya'nın Wierzhenice kentindeki acı bakla tarlalarından elde edilen Col-08 suşu) ile aşılanması sırasında transkriptom yanıtlarında farklı şekilde ifade edilen genlerin anotasyonunda seçilen biyoproses gen ontolojisi terimleri büyük ölçüde abartılıdır. Analiz edilen NLL hatları şunlardır: 83A:476 (dirençli, homozigot Lanr1 alelini taşıyan), Boregine (dirençli, genetik arka planı bilinmeyen), Mandelup (orta derecede dirençli, homozigot AnMan alelini taşıyan) ve 22660 popülasyonu (duyarlı).
Bu çalışma, antraknoz direncine katkıda bulunan genleri belirlemeyi amaçladığı için, GO "GO: 0006952 Savunma tepkileri" ve "GO: 0055114 Redoks süreçleri" terimlerine atanan genler, en az bir satırda istatistiksel olarak anlamlı log2 (kat değişim) değerlerini birleştiren, temel ortalama ≥ 30 kesme değerleri ile analiz edildi. Bu kriterleri karşılayan gen sayısı GO:0006952 için 65 ve GO:0055114 için 524 idi.
83A:476, GO:0006952 terimiyle etiketlenmiş iki DEG zirvesi ortaya çıkardı; birincisi inç başına 6 gen (64 gen, yukarı ve aşağı regülasyon) ve ikincisi inç başına 24 gen (15 gen, yalnızca yukarı regülasyon) idi. Boregine ayrıca GO:0006952'nin aynı zaman noktasında zirve yaptığını, ancak daha az DEG (11 ve 8) ve tercihli aktivasyonla olduğunu gösterdi. Mandeloop, GO:0006952'nin 12 ve 48 HPI'da iki zirvesini gösterdi; her ikisi de 12 gen taşıyordu (birincisi aktive edici genler, ikincisi yalnızca baskılayıcı genler), 6 HPI'daki 22660 popülasyonunda ise (13 gen) artış zirvesinin daha büyük bir baskınlığı vardı. Bu piklerdeki GO:0006952 DEG'lerin %96,4'ünün aynı türde yanıt (yukarı veya aşağı) gösterdiği, ilgili gen sayısındaki farklılıklara rağmen savunma yanıtlarında önemli bir örtüşme olduğunu gösterdiği belirtilmelidir. GO:0006952 terimiyle ilişkili en büyük sekans grubu, sınıf 10 patogenezle ilişkili protein (PR-10) protein kladına ve çekirdek protein lateksine ait olan Açlık Stresi İlişkili Mesaj Proteini 22'yi (SAM22 benzeri) kodlar (Şekil 3). İki grup, ifade biçimi ve yanıt yönü bakımından farklılık gösterdi. SAM22 benzeri proteinleri kodlayan genler, erken zaman noktalarında (6 veya 12 hpi) tutarlı ve önemli bir indüksiyon gösterdi ve deneyin sonunda (48 hpi) genellikle yanıtsız kaldı, oysa MLP benzeri proteinler 6 hpi'de koordinasyon gösterdi. 83A:476 ve Mandelup'ta 48 hp/in'de, diğer tüm veri noktaları neredeyse tepkisizdi. Ek olarak, SAM22 benzeri protein genlerinin ekspresyon profillerindeki farklılıklar, antraknoz direncindeki gözlemlenen değişkenliği takip etti; daha dirençli hatlar, daha duyarlı genlere göre bu genleri anlamlı şekilde indükleyen daha fazla zaman noktasına sahipti. Başka bir LlR18A/B benzeri PR-10 geni, SAM22 benzeri protein genine çok benzer bir ekspresyon paterni gösterdi.
“GO:0006952 Savunma Tepkisi” biyolojik süreç teriminin ana bileşenleri ve Lanr1 ve AnMan alellerinin aday genlerinin ifade kalıpları belirlendi. Log2 ölçeği, aynı zaman noktasında aşılanmış (Colletotrichum lupini, Col-08 suşu, 1999 yılında Polonya, Wizhenica'daki acı bakla tarlalarından elde edilmiştir) ve kontrol (sahte aşılanmış) bitkiler arasındaki log2 değerlerini (kat değişim) temsil eder. Aşağıdaki dar yapraklı acı bakla hatları analiz edildi: 83A:476 (dirençli, homozigot Lanr1 alelini taşıyan), Boregine (dirençli, genetik arka planı bilinmeyen), Mandelup (orta derecede dirençli, homozigot AnMan alelini taşıyan) ve Popülasyon 22660 (duyarlı).
Ek olarak, RNA-seq aday genleri Lanr1 (TanjilG_05042) ve AnMan'ın (TanjilG_12861) ekspresyon profilleri değerlendirildi (Şekil 3). TanjilG_05042 geni, 83A:476'da yalnızca ilk zaman noktasında (6 hpi) anlamlı bir yanıt (aktivasyon) gösterirken, TanjilG_12861 Mandeloop'ta yalnızca iki zaman noktasında anlamlıydı: 6 hpi (aşağı düzenleme) ve 24 hpi (6 hpi). (Ayarlanabilir).
GO:0055114 “redoks süreci” teriminde en çok aşırı ifade edilen genler, sitokrom P450 proteinlerini ve peroksidazı kodlayan genlerdi (Şekil 4). 6 HPI'da 83A:476'dan izole edilen örnekler için, aşılanmış ve kontrol bitkileri arasında genellikle maksimum veya minimum log2 (kat değişim) değerleri (genlerin %86,6'sı için) gözlemlendi ve bu da bu genotipin aşılama cinsiyetine yüksek yanıtını vurguladı. 83A:476, 6 hpi'da en önemli GO:0055114 DEG'yi (503 gen) gösterirken, diğer hatlar 48 hpi'da (Boregine, 31 gen; Mandelup, 85 gen; ve Popülasyon 22660, 78 gen) gösterdi. GO:0055114 ailesinin çoğu geninde, aşılamaya iki tür yanıt (aktivasyon ve inhibisyon) gözlemlendi. İlginç bir şekilde, 48 hp'de Mandelupe'de GO: 0055114 terimi için tanımlanan farklı ifade edilen genlerin %97,6'sına kadarı bu gözlemlerden elde edilmiştir. Bu gözlemler, önemli ölçüde daha küçük ölçeğe (yani, mutasyona uğramış redoks genlerinin sayısı, 85'e karşılık 503) rağmen, mandelupe'nin antraknoza karşı gecikmiş transkriptom yanıtlarının modelinin, 83A:476'nın erken yanıtına benzer olduğunu göstermektedir. Boregine ve Popülasyon 22660'ta bu yakınsama sırasıyla %51,6 ve %75,6 ile daha düşüktür.
“GO:0055114 Redoks süreci” biyolojik sürecinin ana bileşenlerinin ifade kalıpları ortaya çıkarıldı. Log2 ölçeği, aynı zaman noktasında aşılanmış (Colletotrichum lupini, Col-08 suşu, 1999 yılında Polonya, Wizhenica'daki acı bakla tarlalarından elde edilmiştir) ve kontrol (sahte aşılama yapılmış) bitkiler arasındaki log2 değerlerini (kat değişim) temsil eder. Aşağıdaki dar yapraklı acı bakla hatları analiz edildi: 83A:476 (dirençli, homozigot Lanr1 alelini taşıyan), Boregine (dirençli, genetik arka planı bilinmeyen), Mandelup (orta derecede dirençli, homozigot AnMan alelini taşıyan) ve Popülasyon 22660 (duyarlı).
83A:476 C. lupini (Col-08 suşu) ile aşılamaya verilen transkriptomik yanıtlar, GO:0015979 "fotosentez" terimine ve diğer ilgili biyolojik süreçlere atfedilen genlerin koordineli susturulmasını da içeriyordu (ŞEKİL 5). Bu GO:0015979 DEG kümesi, 83A:476'da 6 saat sonra önemli ölçüde baskılanan 105 gen içeriyordu. Bu alt kümede, 37 gen Mandelup'ta 48 saat sonra ve 22660 popülasyonunda aynı zaman noktasında aşağı regüle edilmişti; bunlardan 19'u her iki genotipte de ortak olan DEG'lerdi. GO:0015979 terimiyle ilgili hiçbir DEG, herhangi bir kombinasyonda (hat x zaman) önemli ölçüde aktive edilmedi.
“GO:0015979 Fotosentez” biyolojik sürecinin ana bileşenlerinin ifade kalıpları ortaya çıkarıldı. Log2 ölçeği, aynı zaman noktasında aşılanmış (Colletotrichum lupini, Col-08 suşu, 1999 yılında Polonya, Wizhenica'daki acı bakla tarlalarından elde edilmiştir) ve kontrol (sahte aşılama yapılmış) bitkiler arasındaki log2 değerlerini (kat değişim) temsil eder. Aşağıdaki dar yapraklı acı bakla hatları analiz edildi: 83A:476 (dirençli, homozigot Lanr1 alelini taşıyan), Boregine (dirençli, genetik arka planı bilinmeyen), Mandelup (orta derecede dirençli, homozigot AnMan alelini taşıyan) ve Popülasyon 22660 (duyarlı).
Diferansiyel ekspresyon analizi sonuçlarına dayanarak ve muhtemelen patojenik mantarlara karşı savunma tepkilerinde rol oynadığı düşünülen bu yedi gen seti, gerçek zamanlı PCR ile ekspresyon profillerinin nicelendirilmesi için seçilmiştir (Ek Tablo S9).
Tahmini protein geni TanjilG_10657, kontrol (taklit) bitkilerine kıyasla incelenen tüm hatlarda ve zaman noktalarında önemli ölçüde indüklenmiştir (Ek Tablolar S10, S11). Ayrıca, TanjilG_10657'nin ekspresyon profili, deney süresince tüm hatlarda artış eğilimi göstermiştir. 22660 popülasyonu, 114 kat aktivasyon ve 24 HPI'da en yüksek nispi ekspresyon seviyesi (4,4 ± 0,4) ile TanjilG_10657'nin aşılamaya karşı en yüksek duyarlılığını göstermiştir (Şekil 6a). PR10 LlR18A protein geni TanjilG_27015 de tüm hatlarda ve zaman noktalarında aktivasyon göstermiş ve çoğu veri noktasında istatistiksel olarak anlamlılık göstermiştir (Şekil 6b). TanjilG_10657'ye benzer şekilde, TanjilG_27015'in en yüksek nispi ekspresyon seviyesi, 24 HPI'da (19,5 ± 2,4) 22660 aşılanmış popülasyonda gözlemlendi. Asit endokitinaz geni TanjilG_04706, Boregine 6 hpi hariç tüm hatlarda ve tüm zaman noktalarında önemli ölçüde yukarı regüle edildi (Şekil 6c). İlk zaman noktasında (6 HPI) 83A:476'da güçlü bir şekilde indüklendi (10,5 kat) ve diğer hatlarda orta derecede arttı (6,6-7,5 kat). Deney süresince, TanjilG_04706'nın ekspresyonu 83A:476 ve Boregine'de benzer seviyelerde kalırken, Mandelup ve 22660 Popülasyonunda önemli ölçüde artarak nispeten yüksek değerlere ulaştı (sırasıyla 5,9 ± 1,5 ve 6,2 ± 1,5). Endoglukan-1,3-β-glukozidaz benzeri gen TanjilG_23384, 22660 popülasyonu hariç tüm hatlarda ilk iki zaman noktasında (6 ve 12 hpi) yüksek aktivasyon gösterdi (Şekil 6d). TanjilG_23384'ün en yüksek nispi ekspresyon seviyeleri, ikinci zaman noktasında (12 hpi) Mandelup'ta (2,7 ± 0,3) ve 83A:476'da (1,5 ± 0,1) gözlemlendi. 24 HPI'da, TanjilG_23384 ekspresyonu incelenen tüm hatlarda nispeten düşüktü (0,04 ± 0,009 ile 0,44 ± 0,12 arasında).
Kantitatif PCR ile ortaya çıkarılan seçilmiş genlerin (ag) ekspresyon profilleri. 6, 12 ve 24 sayıları aşılamadan sonraki saatleri temsil etmektedir. LanDExH7 ve LanTUB6 genleri normalizasyon için, LanTUB6 ise seriler arası kalibrasyon için kullanılmıştır. Hata çubukları, her biri üç teknik tekrarın ortalaması olan üç biyolojik tekrara dayalı standart sapmayı temsil etmektedir. Aşılanmış (Colletotrichum lupini, Col-08 suşu, 1999 yılında Polonya'nın Wierzenica kentindeki acı bakla tarlasından elde edilmiştir) ve kontrol (sahte aşılanmış) bitkiler arasındaki ifade düzeylerindeki farklılıkların istatistiksel anlamlılığı veri noktalarının üzerinde işaretlenmiştir (*P değeri < 0,05, **P değeri ≤ 0,01, ***P değeri ≤ 0,001). Aşılanmış (Colletotrichum lupini, Col-08 suşu, 1999 yılında Polonya'nın Wierzenica kentindeki acı bakla tarlasından elde edilmiştir) ve kontrol (sahte aşılanmış) bitkiler arasındaki ifade düzeylerindeki farklılıkların istatistiksel anlamlılığı veri noktalarının üzerinde işaretlenmiştir (*P değeri < 0,05, **P değeri ≤ 0,01, ***P değeri ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, 1999'da поля люпина в Верженице, Польша) ve контрольными (ложно инокулированными) растениями. отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Aşılanmış (Colletotrichum lupini, Col-08 suşu, 1999 yılında Polonya'nın Wierzhenice kentindeki bir acı bakla tarlasından elde edilmiştir) ve kontrol (sahte aşılama yapılmış) bitkiler arasındaki ifade düzeylerindeki istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar veri noktalarının üzerinde belirtilmiştir (*P değeri < 0,05, **P değeri ≤ 0,01, ***P değeri ≤ 0,001).接种（Colletotrichum Lupini, Col-08株,1999年从波兰Wierzenica,的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P = 0,01, ***P = 0,001)。接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) ve контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Aşılanmış (1999 yılında Polonya'nın Verzhenice kentindeki acı bakla tarlalarından elde edilen Colletotrichum lupini, Col-08 suşu) ve kontrol (sahte aşılama yapılmış) bitkiler arasındaki ifade düzeylerindeki istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar veri noktalarının üzerinde belirtilmiştir (*P değeri < 0,05, **P değeri ≤ 0,01, ***P değeri ≤ 0,001).Analiz edilen NLL hatları şunlardı: 83A:476 (dirençli, homozigot Lanr1 alelini taşıyan), Mandelup (orta derecede dirençli, homozigot AnMan alelini taşıyan), Boregine (dirençli, genetik arka planı bilinmeyen) ve 22660 popülasyonu (duyarlı).
Lanr1 lokusundaki aday gen TanjilG_05042, RNA-seq çalışmalarından elde edilen profillerden belirgin şekilde farklı bir ifade paterni gösterdi (Şekil 6e). Bu genin Mandelup ve 22660 popülasyonunda önemli ölçüde aktivasyonu gözlemlendi (sırasıyla 39,7 ve 11,7 kata kadar), bu da nispeten yüksek ifade seviyelerine yol açtı (sırasıyla 1,4 ± 0,14 ve 7,2 ± 1,3'e kadar). 83A:476 ayrıca TanjilG_05042 geninin bir miktar yukarı regülasyonunu da ortaya koydu (3,8 kata kadar), ancak elde edilen nispi ifade seviyeleri (0,044 ± 0,002), Mandelup ve 22660 popülasyonunda gözlemlenenlerden 30 kattan daha düşüktü. qPCR ile yapılan analiz, sahte aşılanmış (kontrol) varyantlardaki genotipler arasında ifade düzeylerinde önemli farklılıklar olduğunu gösterdi; 22660 ve 83A:476 popülasyonları arasında ve ayrıca 22660 ve 22660 popülasyonları arasında 58 katlık bir farka ulaşıldı. Boregine ve Mandalup arasında ise iki katlık bir fark elde edildi.
AnMan lokusundaki aday gen olan TanjilG_12861, 83A:476 ve Mandelup'ta aşılama yanıtı olarak aktive olmuş, 22660 popülasyonunda nötr kalmış ve Boregine'de baskılanmıştır (Şekil 6f). TanjilG_12861 geninin nispi ifadesi, aşılanmış 83A:476'da en yüksek seviyedeydi (0,14±0,01). 17,4 kDa sınıf I ısı şok proteini geni TanjilG_05080 HSP17.4, incelenen tüm suşlarda ve zaman noktalarında daha düşük nispi ifade seviyeleri göstermiştir (Şekil 6g). En yüksek değer, 22660 popülasyonunda 24 HPI'da gözlemlenmiştir (0,14 ± 0,02, aşılamaya yanıt olarak sekiz kat artış).
Gen ekspresyon profillerinin karşılaştırılması (Şekil 7), TanjilG_10657 ile dört diğer gen arasında yüksek bir korelasyon olduğunu ortaya koymuştur: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) ve TanjilG_04706 (r = 0,79). Bu sonuçlar, savunma tepkileri sırasında bu genlerin birlikte düzenlenmesini gösterebilir. TanjilG_12861 ve TanjilG_23384 genleri, diğer genlere kıyasla daha düşük Pearson korelasyon katsayısı değerleriyle (sırasıyla 0,08 ila 0,43 ve -0,19 ila 0,28) farklı ekspresyon profilleri göstermiştir.
Gen ekspresyon profilleri arasındaki korelasyonlar kantitatif PCR kullanılarak tespit edildi. Aşağıdaki dar yapraklı acı bakla hatları analiz edildi: 83A:476 (dirençli, homozigot Lanr1 allelini taşıyan), Mandelup (orta derecede dirençli, homozigot AnMan allelini taşıyan), Boregine (dirençli, genetik arka planı bilinmeyen) ve Popülasyon 22660 (duyarlı). Aşılama sonrası 6, 12 ve 24 saat olmak üzere üç zaman noktası hesaplandı; bunlar arasında aşılanmış (1999 yılında Polonya'nın Wierzhenice kentindeki acı bakla tarlalarından elde edilen Colletotrichum lupini, Col-08 suşu) ve kontrol (sahte aşılama yapılmış) bitkiler yer almaktadır. Ölçek, Pearson korelasyon katsayısının değerini göstermektedir.
İnç başına 6 beygir gücünde elde edilen verilere dayanarak, erken savunma tepkilerine odaklanmak için aşılanmış ve kontrol bitkileri karşılaştırılarak tanımlanan 9981 DEG üzerinde WGCNA gerçekleştirildi (Ek Tablo S12). Genotipler ve deneysel varyantlar arasında ilişkili (pozitif veya negatif) ifade profillerine sahip yirmi iki gen modülü (küme) bulundu. Ortalama olarak, gen ekspresyon seviyeleri 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 sırasıyla azalan bir seyir izledi (ancak bu eğilim kontrol bitkilerinde daha belirgindi). Ortalama olarak, gen ekspresyon seviyeleri 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 sırasıyla azalan bir seyir izledi (ancak bu eğilim kontrol bitkilerinde daha belirgindi). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Nüfus 22660 (в обоих вариантах, однако, эта) тенденция была сильнее у контрольных растений). Ortalama olarak, gen ekspresyon seviyeleri 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 sırasıyla azaldı (her iki varyantta da bu eğilim kontrol bitkilerinde daha belirgindi).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Nüfus 22660的顺序下降(然而,在两种变体中,这种趋势在对照植物中更强)。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> nüfus 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种Bu, bir başkasının adıdır. В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Nüfus 22660 (однако в обоих вариантах эта) тенденция была сильнее у контрольных растений). Ortalama olarak, gen ekspresyon seviyeleri 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 serisinde azaldı (ancak her iki varyantta da bu eğilim kontrol bitkilerinde daha güçlüydü).Aşılama, özellikle 18, 19, 14, 6 ve 1 numaralı modüllerde (etki sırasına göre azalan şekilde) gen ekspresyonunun yukarı yönlü düzenlenmesine, negatif düzenlemeye (örneğin 9 ve 20 numaralı modüller) veya nötr etkilere (örneğin 11, 22, 8 ve 13 numaralı modüller) neden oldu. GO terim zenginleştirme analizi (Ek Tablo S13), en yüksek aktivasyona sahip aşılanmış modül (18) için “GO: 0006952 Koruyucu yanıtlar”ı ortaya çıkardı; bu, qPCR ile analiz edilen genleri (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 ve TanjilG_27015) ve ayrıca fotosentezi en çok baskılayan birçok modülü (9) içeriyordu. Modül 18 yoğunlaştırıcı (Şekil 8), PR-10 benzeri LlR18B proteinini kodlayan TanjilG_26536 geni olarak tanımlandı ve modül 9 yoğunlaştırıcı, fotosistem II PsbQ proteinini kodlayan TanjilG_28955 geni olarak tanımlandı. Aday bir antraknoz direnç geni olan Lanr1, TanjilG_05042, modül 22'de (Şekil 9) bulundu ve "GO:0044260 Hücresel makromoleküler metabolik süreçler" ve "GO:0006355 Transkripsiyonel düzenleme, DNA şablonlama" terimleriyle ilişkilendirildi ve TanjilG_01212 merkezini taşıdı. Bu gen, ısı stresi transkripsiyon faktörü A-4a'yı (HSFA4a) kodlar.
Aşırı temsil edilen biyolojik süreç terimlerine sahip modüllerin gen eş ifadesinin ağırlıklı ağ analizi “GO: 0006952 Savunma tepkileri”. Ligasyon, qPCR ile analiz edilen dört geni (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 ve TanjilG_27015) vurgulamak için basitleştirildi.
Aşırı temsil edilen bir biyolojik süreç terimi olan “GO: 0006355: Transkripsiyonel düzenleme, DNA şablonlama” içeren ve aday bir antraknoz direnç geni Lanr1 TanjilG_05042 taşıyan bir modülün gen eş ifadesinin ağırlıklı ağ analizi. TanjilG_05042 geni ve merkezi TanjilG_01212 genini izole etmek için ligasyon basitleştirildi.
Avustralya'da toplanan antraknoz direnci taraması, erken piyasaya sürülen çeşitlerin çoğunun duyarlı olduğunu gösterdi; Kalya, Coromup ve Mandelup orta derecede dirençli olarak tanımlanırken, Wonga, Tanjil ve 83A:476 yüksek derecede dirençli olarak tanımlandı26,27,31. Aynı direnç aleline (Lanr1 olarak adlandırılan) sahipken, Coromup ve Mandelup farklı bir alele (AnMan10, 26, 39 olarak adlandırılan) sahipti, Kalya ise farklı bir alel (Lanr2) aktardı. Almanya'da antraknoz direnci taraması, Lanr1'den farklı bir aday alele sahip dirençli bir hat olan Bo7212'nin (LanrBo36 olarak adlandırılan) tanımlanmasıyla sonuçlandı.
Çalışmamız, test edilen genetik materyalde Lanr1 allelinin çok düşük bir sıklıkta (yaklaşık %6) bulunduğunu ortaya koymuştur. Bu gözlem, Anseq3 ve Anseq4 belirteçleri kullanılarak Doğu Avrupa genetik materyalinin taranması sonuçlarıyla tutarlıdır; bu tarama, Lanr1 allelinin yalnızca iki Belarus hattında bulunduğunu göstermiştir. Bu, Lanr1 allelinin, Avustralya'da olduğu gibi, yerel ıslah programlarında henüz yaygın olarak kullanılmadığını göstermektedir; Avustralya'da ise belirteç destekli ıslah için kilit allellerden biridir. Bu durum, Avrupa saha koşullarında Lanr1 allelinin sağladığı direnç seviyesinin Avustralya raporuna kıyasla daha düşük olmasından kaynaklanabilir. Ayrıca, Avustralya'da yüksek yağışlı bölgelerde antraknoz üzerine yapılan çalışmalar, Lanr1 alleli tarafından sağlanan direnç tepkilerinin, patojenin büyümesini ve hızlı gelişimini destekleyen hava koşullarında etkili olmayabileceğini göstermiştir19,42. Aslında, mevcut çalışmada, Lanr1 allelini taşıyan genotiplerde de antraknozun bazı belirtileri gözlemlenmiştir; bu da direncin C. lupini'nin gelişimi için optimal koşullar altında ortadan kalkabileceğini düşündürmektedir. Ek olarak, Lanr1 lokusundan yaklaşık 1 cM uzaklıkta bulunan Anseq3 ve Anseq4 işaretleyicilerinin varlığına ilişkin yanlış pozitif yorumlamalar da mümkündür 28,30,43.
Çalışmamız, Lanr1 alelini taşıyan 83A:476 suşunun, C. lupini aşılama işlemine ilk analiz edilen zaman noktasında (6 saat sonra) büyük ölçekli transkriptom yeniden programlamasıyla yanıt verdiğini, AnMan alelini taşıyan Mandelup suşunda ise transkriptomik yanıtların çok daha sonra (24 ila 48 saat sonra) gözlemlendiğini göstermiştir. Savunma yanıtlarındaki bu zamansal farklılıklar, hastalık semptomlarındaki farklılıklarla ilişkilidir ve direnç için başarılı bir yanıt için erken patojen tanınmasının önemini vurgulamaktadır. Bitki dokusunu enfekte etmek için, şarbon sporlarının konak yüzeyinde çimlenme, hücre bölünmesi ve apressoryum oluşumu da dahil olmak üzere çeşitli gelişim aşamalarından geçmesi gerekir. Apendiks, konak yüzeyine yapışan ve konak dokularına nüfuz etmeyi kolaylaştıran enfektif bir yapıdır. Böylece, bezelye özütündeki C. gloeosporioides sporları, 75-90 dakikalık inkübasyondan sonra çekirdeğin ilk bölünmesini, 90-120 dakika sonra çimlenme tüpünün oluşumunu ve 4 saat sonra baskılanmayı gösterdi. Mango C. gloeosporioides, 3 saatlik inkübasyondan sonra %40'tan fazla konidiyal çimlenme ve 4 saat sonra yaklaşık %20 apressoryum oluşumu gösterdi. C. gloeosporioides'in virülansla ilişkili CAP20 geni, yüksek konsantrasyonlarda CAP20 proteini içeren avokado yüzey mumunda 3,5 saatlik inkübasyondan sonra epifit oluşturan konidilerde transkripsiyonel aktivite gösterdi ve 4 saat 46 dakika sonra bu aktivite devam etti. Benzer şekilde, C. trifolii'deki melanin biyosentez genlerinin aktivitesi, 2 saatlik inkübasyon sırasında indüklendi ve ardından 1 saat sonra apressoryum oluşumu gözlendi. Yaprak dokuları üzerinde yapılan çalışmalar, C. acutatum ile aşılanan çileklerde ilk baskılanmanın 8 saat sonra, C. coccodes ile aşılanan domateslerde ise ilk baskılanmanın 4 saat sonra gerçekleştiğini göstermiştir48,49. Bu durum, Colletotrichum spp. enfeksiyon sürecinin zaman ölçeğiyle büyük ölçüde tutarlıdır. 83A:476'ya karşı hızlı savunma tepkileri, bu hatta bitki direnci ve efektör tetiklemeli bağışıklık (ETI) genlerinin rol oynadığını düşündürürken, Mandelup'un gecikmiş tepkileri mikro-ilişkili moleküler desen tetiklemeli bağışıklık (MTI) hipotezini desteklemektedir50. 83A:476 ve Mandelup'a karşı erken tepkiler. Gecikmiş tepkide yukarı veya aşağı regüle edilen genler arasındaki kısmi örtüşme de bu kavramı desteklemektedir, çünkü ETI genellikle enfeksiyon bölgesinde programlanmış hücre ölümüne (anafilaktik şok olarak bilinir) yol açan hızlandırılmış ve geliştirilmiş bir MTI tepkisi olarak kabul edilir51,52.
Aşırı temsil edilen "Savunma Yanıtı" terimine atfedilen genlerin çoğu, stres kaynaklı açlık mesajı 22 proteininin (SAM22'ye benzer) 11 homologu ve yedi ana lateks protein benzeri (MLP) proteindir. 31, 34, 43 ve 423 numaralı MLP benzeri proteinler dizi benzerliği göstermiştir. SAM22 benzeri genler, daha uzun süren önemli bir aktivasyon göstererek antraknoz direncinde artış göstermiştir (83A:476 ve Boregine). Bununla birlikte, MLP benzeri genler yalnızca aday direnç alelini taşıyan hatlarda (83A:476/Lanr1 6 hpi'de ve Mandelup/AnMan 24 hpi'de) aşağı regüle edilmiştir. Belirtmek gerekir ki, tanımlanan tüm SAM22 benzeri homologlar yaklaşık 105 kb'lık bir gen kümesinden kaynaklanırken, MLP benzeri genler genomun ayrı bölgelerinden kaynaklanmaktadır. Daha önceki NLL'nin Diaporthetoxica aşılama işlemine karşı direnci üzerine yaptığımız çalışmada da bu tür SAM22 benzeri genlerin koordineli aktivasyonu gözlemlenmişti; bu da bu genlerin savunma tepkisinin yatay bileşenlerinde rol oynadığını düşündürmektedir. Bu sonuç, SAM22 benzeri genlerin yaralanmaya veya salisilik asit, mantar uyarıcıları veya hidrojen peroksit ile tedaviye olumlu yanıt verdiğine dair raporlarla da desteklenmektedir.
MLP benzeri genlerin, birçok bitki türünde bakteriyel, viral ve patojenik mantar enfeksiyonları da dahil olmak üzere çeşitli abiyotik ve biyotik streslere yanıt verdiği gösterilmiştir55. Bitkiler ve patojenler arasındaki belirli etkileşimlere verilen yanıt yönleri, güçlü bir şekilde artmaktan (örneğin, pamuğun Verticillium dahliae ile istilası sırasında) önemli ölçüde azalmaya (örneğin, elma ağacının Alternaria spp. ile enfeksiyonundan sonra) kadar değişmektedir56,57. Avokadonun F. niger enfeksiyonuna karşı savunmasında ve elma ağacının Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola ve Alternaria alternata ile enfeksiyonu sırasında MLP benzeri 423 geninin önemli ölçüde aşağı regülasyonu gözlemlenmiştir. Ek olarak, MLP benzeri 423 genini aşırı ifade eden elma kalluslarında dirençle ilişkili genlerin ifadesi daha düşüktü ve mantar enfeksiyonuna daha duyarlıydı59. Fusarium oxysporum f'yi takiben, MLP benzeri 423 geni dirençli fasulye genetik materyalinde de baskılanmıştır. cn. Fasulye enfeksiyonu 60.
RNA-seq çalışmamızda tanımlanan PR-10 ailesinin diğer üyeleri, yukarı regülasyona yanıt olarak LlR18A ve LlR18B genleri ile lipid transfer proteini DIR1 için yukarı regüle edilmiş (1 gen) veya aşağı regüle edilmiş (3 gen) genlerdir. Ek olarak, WGCNA, aşılamaya son derece duyarlı olan ve çeşitli koruyucu yanıt genleri taşıyan bu modülde bir merkez olarak LlR18B genini vurgulamaktadır. LlR18A ve LlR18B genleri, patojenik bakterilere yanıt olarak sarı acı bakla yapraklarında ve D. toxica aşılamasından sonra NLL gövdelerinde indüklenirken, bu genlerin pirinç homologu olan RSOsPR10, muhtemelen jasmonik asit sinyal yolunda yer alan bir mantar enfeksiyonu tarafından hızla indüklenmiştir53,61, 62. DIR1 geni, sistemik kazanılmış direncin (SAR) başlangıcı için gerekli olan spesifik olmayan lipid taşıma proteinlerini kodlar. Koruyucu reaksiyonların gelişmesiyle birlikte, DIR1 proteini enfeksiyon odağından floem yoluyla uzak organlara taşınarak SAR'ı indükler. İlginç bir şekilde, TanjilG_02313 DIR1 geni, 84A:476 ve 22660 popülasyonlarında ilk zaman noktasında önemli ölçüde indüklenmiştir, ancak antraknoz direnci yalnızca 84A:476 hattında başarılı bir şekilde gelişmiştir. Bu, NLL'de DIR1 geninin bazı alt fonksiyonelleşmesini gösterebilir, çünkü kalan üç homolog yalnızca 83A:476 hattında 6 saat sonra aşılamaya yanıt vermiştir ve bu yanıt aşağı yönlüdür.
Çalışmamızda, “GO:0055114 Redoks süreci” olarak adlandırılan biyolojik sürece karşılık gelen en yaygın bileşenler sitokrom P450 proteini, peroksidaz, linoleik asit 9S-/13S-lipoksijenaz ve 1-aminosiklopropan-1-karboksilik asit oksidaz idi. Ek olarak, WGCNA'mız, HSFA4a homologunu, Lanr1 direnç geni adayı TanjilG_05042 gibi modülleri taşıyan bir merkez olarak tanımlamaktadır. HSFA4a, bitkilerde nükleer transkripsiyonun redoks bağımlı düzenlenmesinin bir bileşenidir.
Sitokrom P450 proteinleri, ksenobiyotiklerin yanı sıra hormonlar, yağ asitleri, steroller, hücre duvarı bileşenleri, biyopolimerler ve koruyucu bileşiklerin biyosentezi de dahil olmak üzere birincil ve ikincil metabolizmada NADPH ve/veya O2'ye bağımlı hidroksilasyon reaksiyonlarını katalize eden oksidoredüktazlardır 69. Bir çalışmamızda, bitki sitokrom P450 fonksiyonundaki değişkenlik, çok sayıda değiştirilmiş homolog (37) ve belirli genler arasındaki yanıt modellerindeki farklılıklar nedeniyle -10,6 log2'den (kat değişim) 5,7'ye düşürüldü ve bu da yukarı yönlü bir revizyonu yansıtmaktadır. Bu kadar büyük bir protein süper ailesindeki NLL genlerinin varsayımsal biyolojik fonksiyonunu aydınlatmak için yalnızca RNA-seq verilerini kullanmak oldukça spekülatif olacaktır. Bununla birlikte, bazı sitokrom P450 genlerinin, alerjik reaksiyonlara katkı da dahil olmak üzere, patojenik mantarlara veya bakterilere karşı artan dirençle ilişkili olduğunu belirtmekte fayda var69,70,71.
Sınıf III peroksidazlar, bitki büyümesi ve gelişmesi sırasında çok çeşitli metabolik süreçlerde ve ayrıca tuzluluk, kuraklık, yüksek ışık yoğunluğu ve patojen saldırısı gibi çevresel streslere yanıt olarak rol oynayan çok işlevli bitki enzimleridir.72 Peroksidazlar, Stylosanthes humilis ve C. gloeosporioides, Lens culinaris ve C. truncatum, Phaseolus vulgaris ve C. lindemuthianum, Cucumis sativus ve C. lagenarium dahil olmak üzere çeşitli bitki türlerinin Anthracis ile etkileşiminde rol oynar.73,74,75,76 Yanıt çok hızlıdır, bazen mantar bitki dokusuna nüfuz etmeden önce bile 4 saat sonra gerçekleşir.73 Peroksidaz geni ayrıca D. toxica NLL aşılama işlemine de yanıt verdi. Peroksidazlar, oksidatif patlamayı düzenleme veya oksidatif stresi ortadan kaldırma gibi tipik işlevlerine ek olarak, lignifikasyon sırasında hücre duvarı güçlendirmesi, alt birim veya belirli bileşiklerin çapraz bağlanması yoluyla fiziksel bariyerler oluşturarak patojen büyümesini engelleyebilirler. Bu işlev, çalışmamızda 83A:476 dirençli hattında 6 HPI'da önemli ölçüde yukarı regüle edilen, ancak yanıt vermeyen diğer suşlarda ve zaman noktalarında yukarı regüle edilmeyen, varsayımsal bir lignin oluşturan anyon peroksidazı kodlayan TanjilG_03329 genine in silico olarak atfedilebilir.
Linoleik asidin 9S-/13S-lipoksijenazı, lipid biyosentezinin oksidatif yolundaki ilk adımdır78. Bu yolun ürünleri, kalloz ve pektin birikintilerinin oluşumu yoluyla hücre duvarının güçlendirilmesi ve reaktif oksijen türlerinin üretimi yoluyla oksidatif stresin düzenlenmesi de dahil olmak üzere bitki savunmasında çoklu işlevlere sahiptir79,80,81,82,83. Bu çalışmada, linoleik asit 9S-/13S-lipoksijenazının ekspresyonu tüm suşlarda değişmiştir, ancak duyarlı popülasyon 22660'ta farklı zaman noktalarında yukarı yönlü düzenleme baskınken, dirençli Lanr1 ve AnMan alelini taşıyan suşlarda, bu genotipler arasında koruyucu şarbon reaksiyonlarında oksilipin tabakasının çeşitlenmesini vurgulamaktadır.
1-aminosiklopropan-1-karboksilat oksidaz (ACO) homologu, acı bakla ile aşılandığında önemli ölçüde yukarı (9 gen) veya aşağı (2 gen) düzenlendi. İki istisna dışında, bu yanıtların tümü 6 hp'de meydana geldi (83A:476). ACO proteinleri tarafından aracılık edilen enzimatik reaksiyon, etilen üretiminde hız sınırlayıcı adımdır ve bu nedenle yüksek oranda düzenlenir84. Etilen, bitki gelişimini ve abiyotik ve biyotik stres koşullarına yanıtı düzenlemede çeşitli roller oynayan bir bitki hormonudur. ACO transkripsiyonunun indüksiyonu ve etilen sinyal yolunun aktivasyonu, reaktif oksijen türlerinin ve fitoaleksinlerin üretimini düzenleyerek pirincin yarı biyotrofik mantar Oryzae oryzae'ye karşı direncini artırmada rol oynar. Bu çalışmada bildirilen 83A:476 hattında ACO homologlarının önemli ölçüde yukarı düzenlenmesinin arka planında, M. oryzae ve C. lupini88,89 arasında bulunan çok benzer bir yaprak enfeksiyon süreci, NLL antraknozuna direnç kazandırma olasılığını değiştiriyor. Etilen, moleküler yollarda merkezi bir sinyal adımıdır.
Bu çalışmada, 83A:476'da 6 saat sonra ve Mandeloop ile 22660 popülasyonunda 48 saat sonra fotosentezle ilişkili birçok genin büyük ölçekli baskılanması gözlemlenmiştir. Bu değişikliklerin kapsamı ve ilerlemesi, seviyeyle orantılıdır. Bu deneyde antraknoz direnci gözlemlenmiştir. Son zamanlarda, patojenik bakteriler ve mantarlar da dahil olmak üzere bitki-patojen etkileşimlerinin çeşitli modellerinde fotosentezle ilgili transkriptlerin güçlü ve erken baskılanması bildirilmiştir. Bazı etkileşimlerde 2 saat sonra başlayan hızlı reaksiyon ve enfeksiyona yanıt olarak fotosentezle ilişkili genlerin küresel baskılanması, reaktif oksijen türlerinin kullanımı ve bunların salisilik asit yoluyla etkileşimi yoluyla alerjik reaksiyonlara aracılık ederek bitki bağışıklığını tetikleyebilir 90,94.
Sonuç olarak, en dirençli soy için önerilen savunma tepkisi mekanizmaları (83A:476), R geni (muhtemelen TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) tarafından hızlı patojen tanıma ve alerjik tepki aracılı salisilik asit ve etilen sinyallemesi ile uzun menzilli SAR'ın kurulmasını içerir. Bu eylem, DIR-1 proteini tarafından desteklenmektedir. C. lupini enfeksiyonu için biyotrofik dönemin çok kısa (yaklaşık 2 gün) olduğu ve ardından nekrotik büyümenin geldiği belirtilmelidir95. Bu aşamalar arasındaki geçiş, nekroz ve konuk bitkilerde aşırı duyarlılık reaksiyonlarını tetikleyen etilenle indüklenebilir proteinlerin ekspresyonu ile ilişkili olabilir. Bu nedenle, C. lupini'nin biyotrofik aşamada başarılı bir şekilde yakalanması için zaman aralığı çok dardır. 83A:476'da 6 saat enfeksiyon sonrası gözlemlenen redoks ve fotosentezle ilişkili genlerin yeniden programlanması, mantar hiflerinin ilerlemesiyle tutarlıdır ve biyotrofik aşamada başarılı bir koruyucu yanıtın geliştiğini müjdelemektedir. Mandelup ve 22660 popülasyonunun transkriptomik yanıtları, mantarın nekrotik büyümeye geçmeden önce yakalanması için çok gecikmiş olabilir; ancak Mandelup, PR-10 proteininin nispeten hızlı düzenlenmesi yatay direnci teşvik ettiği için 22660 popülasyonundan daha etkili olabilir.
Kanonik R geni tarafından yönlendirilen ETI, fasulyede antraknoza karşı direnç için yaygın bir mekanizma gibi görünmektedir. Bu nedenle, model baklagil Medicago truncatula'da, antraknoza direnç, TIR-NBS-LRR97 bitki R gen sınıfının bir üyesi olan RCT1 geni tarafından sağlanmaktadır. Bu gen, duyarlı bitkilere aktarıldığında yoncada da geniş spektrumlu antraknoz direnci sağlamaktadır. Yaygın fasulyede (P. vulgaris), bugüne kadar yirmiyi aşkın antraknoz direnç geni tanımlanmıştır. Bu genlerin bazıları, herhangi bir kanonik R geninin bulunmadığı bölgelerde bulunurken, diğer birçoğu TIR-NBS-LRRs99 dahil olmak üzere NBS-LRR gen kümesini taşıyan kromozomların kenarlarında yer almaktadır. Genom çapındaki SSR çalışması da NBS-LRR geninin yaygın fasulyede antraknoz direnciyle olan ilişkisini doğrulamıştır. Kanonik R geni, beyaz acı bakla 101'deki ana antraknoz direnci lokusunu taşıyan genomik bölgede de bulunmuştur.
Çalışmamız, bitki enfeksiyonunun erken bir aşamasında (tercihen en geç 12 saat sonra) aktive olan ani bir direnç reaksiyonunun, dar yapraklı acı bakla bitkisini patojenik mantar Collelotrichum lupini'nin neden olduğu antraknozdan etkili bir şekilde koruduğunu göstermektedir. Yüksek verimli dizileme kullanarak, NLL bitkilerinde Lanr1 ve AnMan direnç genleri aracılığıyla antraknoz direnç genlerinin farklı ifade profillerini gösterdik. Başarılı savunma, bitkinin bir patojenle ilk temasından sonraki saatler içinde redoks, fotosentez ve patogenezde yer alan proteinler için genlerin dikkatlice tasarlanmasını içerir. Benzer koruyucu reaksiyonlar, ancak zaman içinde gecikmeli olarak, bitkileri hastalıklardan korumada çok daha az etkilidir. Lanr1 geni aracılığıyla sağlanan antraknoz direnci, R geninin tipik hızlı yanıtına (etken tarafından tetiklenen bağışıklık) benzerken, AnMan geni büyük olasılıkla yatay bir yanıt (mikropla ilişkili moleküler bir model tarafından tetiklenen bağışıklık) sağlayarak orta düzeyde bir sürdürülebilirlik sağlar.
Antraknoz belirteçlerini taramak için kullanılan 215 NLL hattı, 74 kültivar, çaprazlama veya ıslah yoluyla elde edilen 60 hat, 5 mutant ve 76 yabani veya orijinal genetik materyalden oluşmaktadır. Hatlar, çoğunlukla Polonya (58), İspanya (47), Almanya (27), Avustralya (26), Rusya (19), Belarus (7), İtalya (5) ve diğer 10 ülkeden olmak üzere 17 ülkeden gelmektedir. Set ayrıca referans dirençli hatları da içermektedir: 83A:476, Tanjil, Lanr1 alelini taşıyan Wonga ve AnMan alelini taşıyan Mandelup. Hatlar, Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polonya tarafından yönetilen Avrupa Acı Bakla Genetik Kaynak Veritabanından elde edilmiştir (Ek Tablo S1).
Bitkiler kontrollü koşullar altında yetiştirildi (fotoperiyot 16 saat, gündüz 25°C ve gece 18°C ​​sıcaklık). İki biyolojik tekrar analiz edildi. DNA, protokole göre DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Almanya) kullanılarak üç haftalık yapraklardan izole edildi. İzole edilen DNA'nın kalitesi ve konsantrasyonu spektrofotometrik yöntemlerle (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) değerlendirildi. Antraknoz direnç geni AnMan'ı (Mandelup çeşidinden türetilmiştir) işaretleyen AnManM1 belirteci ve Lanr1 genini (Tanjil çeşidinden türetilmiştir) çevreleyen Anseq3 ve Anseq4 belirteçleri analiz edildi 11,26,28. Dirençli alel için homozigotlar "1", duyarlı olanlar "0" ve heterozigotlar 0,5 olarak puanlandı.
AnManM1, AnSeq3 ve AnSeq4 belirteçleri için yapılan tarama sonuçlarına ve son takip deneyleri için tohumların mevcudiyetine dayanarak, antraknoz direnci fenotiplemesi için 50 NLL hattı seçildi. Analiz, gündüz 22°C ve gece 19°C sıcaklık aralığında, 14 saatlik fotoperiyotlu, bilgisayar kontrollü bir serada ikişerli olarak gerçekleştirildi. Tohum kabuğunun çok sert olmasından kaynaklanan tohum dormansisini önlemek ve düzgün çimlenmeyi sağlamak için ekimden önce tohumlar çizildi (embriyonun karşı tarafındaki tohum kabuğu keskin bir bıçakla kesildi). Bitkiler, steril toprak (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varşova, Polonya) içeren saksılarda (11 × 11 × 21 cm) yetiştirildi. Aşılama, 1999 yılında Polonya'nın Verzhenitsa bölgesinde (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E) bir tarlada yetiştirilen dar yapraklı acı bakla bitkilerinin gövdelerinden elde edilen Colletotrichum lupini Col-08 suşu ile gerçekleştirildi. İzolatlar, spor oluşumunu sağlamak için 21 gün boyunca 20°C'de siyah ışık altında SNA ortamında kültüre edildi. Ekimden dört hafta sonra, bitkiler 4-6 yaprak evresine ulaştığında, 0,5 x 10⁶ konidi/ml konsantrasyonunda konidi süspansiyonu püskürtülerek aşılama yapıldı. Aşılamadan sonra, konidilerin çimlenmesini ve enfeksiyon sürecini kolaylaştırmak için bitkiler 24 saat boyunca yaklaşık %98 nem ve 25°C sıcaklıkta karanlıkta tutuldu. Bitkiler daha sonra 22°C gündüz/19°C gece ve %70 nemde 14 saatlik fotoperiyot altında yetiştirildi. Hastalık skoru, aşılamadan 22 gün sonra yapıldı ve gövde ve yapraklarda nekrotik lezyonların varlığına veya yokluğuna bağlı olarak 0 (bağışık) ile 9 (çok duyarlı) arasında değişti. Ayrıca, skorlamadan sonra bitkilerin ağırlığı ölçüldü. İşaretleyici genotipleri ile hastalık fenotipleri arasındaki ilişkiler, nokta iki dizi korelasyonu olarak hesaplandı (antraknoz direnci fenotipinin analizi için hat setinde heterozigot işaretleyicilerin yokluğu).