Hatur nuhun parantos nganjang ka Nature.com. Versi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan CSS anu terbatas. Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun anjeun nganggo browser anu diénggalan (atanapi mareuman Modeu Kompatibilitas dina Internet Explorer). Samentawis waktos, pikeun mastikeun dukungan anu terus-terusan, kami bakal ngarender situs tanpa gaya sareng JavaScript.
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) nyaéta tutuwuhan legum anu dianggo pikeun produksi pangan sareng perbaikan taneuh. Ékspansi global NLL salaku pepelakan parantos narik seueur jamur patogén, kalebet lupin antraknosa, anu nyababkeun panyakit antraknosa anu dahsyat. Dua alel, Lanr1 sareng AnMan, anu masihan paningkatan résistansi, parantos dianggo dina beternak NLL, tapi mékanisme molekuler anu mendasari tetep teu dipikanyaho. Dina panilitian ieu, spidol Lanr1 sareng AnMan dianggo pikeun nyaring sampel NLL Éropa. Tés vaksin dina lingkungan anu dikontrol mastikeun éféktivitas duanana donor anu tahan. Profil éksprési gén diferensial dilakukeun dina galur anu tahan sareng rentan anu representatif. Résistansi antraknosa aya hubunganana sareng overéksprési istilah ontologi gén "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process", sareng "GO:0015979 Photosynthesis". Salian ti éta, galur Lanr1(83A:476) némbongkeun réprogramming transkriptom anu signifikan gancang saatos inokulasi, sedengkeun galur anu sanésna némbongkeun reureuh dina réspon ieu sakitar 42 jam. Réspon pertahanan aya hubunganana sareng gén TIR-NBS, CC-NBS-LRR sareng NBS-LRR, 10 protéin anu kalibet dina patogenesis, protéin transfer lipid, endoglucan-1,3-β-glukosidase, protéin témbok sél anu beunghar glisin, sareng gén tina jalur réaktif oksigén. Réspon awal kana 83A:476, kalebet panyabutan ati-ati gén anu aya hubunganana sareng fotosintésis, pas sareng panyalindungan anu suksés salami fase pertumbuhan vegetatif biologi jamur, nunjukkeun yén éféktor micu imunitas. Réaksi Mandeloop dilambatkeun, sapertos hambatan horizontal sacara umum.
Lupin daun heureut (NLL, Lupinus angustifolius L.) nyaéta sereal protéin luhur anu asalna ti daérah Mediterania kulon1,2. Ayeuna dipelak salaku pepelakan pangan pikeun sasatoan sareng manusa. Éta ogé dianggap pupuk héjo dina sistem rotasi pepelakan kusabab fiksasi nitrogén ku baktéri simbiotik anu ngiket nitrogén sareng perbaikan struktur taneuh sacara umum. NLL parantos ngalaman prosés domestikasi anu gancang dina abad ka tukang sareng masih aya dina tekanan beternak anu luhur3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Kalayan budidaya NLL anu nyebar, runtuyan jamur patogén ngembangkeun ceruk tatanén énggal sareng nyababkeun panyakit anu ngancurkeun pepelakan énggal. Anu paling luar biasa pikeun patani sareng peternak lupin nyaéta munculna antraknosa, anu disababkeun ku jamur patogén, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Anu paling luar biasa pikeun patani sareng peternak lupin nyaéta munculna antraknosa, anu disababkeun ku jamur patogén, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного памонгрикиного памонгриком (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Anu paling kasohor ku patani sareng peternak lupin nyaéta munculna antraknosa anu disababkeun ku jamur patogén Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真由病原真由病原真菌&otric Hagedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌菌病真菌 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемогего прикмто прикмто lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Anu paling narik perhatian para patani sareng peternak lupin nyaéta munculna antraknosa anu disababkeun ku jamur patogén Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Laporan pangheubeulna ngeunaan panyakit ieu asalna ti Brazil sareng Amérika Serikat, kalayan gejala has muncul dina taun 1912 sareng 1929 masing-masing. Nanging, saatos sakitar 30 taun, patogén ieu ditunjuk salaku Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., téléomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld dina Morfologi anu Disasarkeun. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .sareng H. Schrenk. & H.施伦克，. & H.施伦克，.sareng H. Schlenk,.Fenotipe panyakit awal anu dilakukeun dina pertengahan abad ka-20 nunjukkeun sababaraha résistansi dina aksési NLL sareng lupin konéng (L. luteus L.), tapi sadaya aksési lupin bodas (L. albus L.) anu diuji rentan pisan15,16. Panilitian nunjukkeun yén kamekaran antraknosa aya hubunganana sareng ningkatna présipitasi (kalembaban hawa) sareng suhu (dina kisaran 12-28°C), anu nyababkeun palanggaran résistansi dina suhu anu langkung luhur17, 18. Nyatana, waktos anu diperyogikeun pikeun konidia berkecambah sareng panyakit dimimitian, opat kali langkung pondok dina 24°C (4 jam) tibatan dina 12°C (16 jam) dina kaayaan kalembaban anu luhur19. Ku kituna, pemanasan global anu lumangsung parantos nyababkeun panyebaran antraknosa. Nanging, panyakit ieu dititénan di Perancis (1982) sareng Ukraina (1983) salaku pertanda ancaman anu bakal datang, tapi sigana teu dipaliré ku industri lupin dina waktos éta20,21. Sababaraha taun ti harita, panyakit anu dahsyat ieu nyebar ka sakumna dunya sareng ogé mangaruhan nagara-nagara penghasil lupin utama sapertos Australia, Polandia sareng Jerman22,23,24. Saatos wabah antraknosa dina pertengahan taun 1990-an, panyaringan anu éksténsif ngahasilkeun idéntifikasi sababaraha donor anu tahan dina sampel NLL19. Résistansi NLL kana antraknosa dikontrol ku dua alel dominan anu misah anu aya dina sumber plasma nutfah anu béda: Lanr1 dina kultivar Tanjil sareng Wonga sareng AnMan dina kultivar. Mandalay 25, 26. Alel ieu ngalengkepan spidol molekuler anu ngadukung pamilihan plasma nutfah anu tahan dina program pemuliaan25,26,27,28,29,30. Garis beternak anu tahan 83A:476 anu mawa alel Lanr1 disilangkan sareng garis liar anu rentan P27255 pikeun kéngingkeun populasi RIL anu misahkeun pikeun résistansi antraknosa, anu ngamungkinkeun pikeun nangtukeun lokus Lanr1 ka kromosom NLL-1131, 32, 33. Ngajajarkeun spidol peta tautan tina lokus résistansi anu ngapit ka antraknosa kalayan kerangka génomik, NLL ngungkabkeun lokasi sadaya tilu alel dina kromosom anu sami (NLL-11), tapi dina posisi anu béda29,34,35. Nanging, kusabab jumlah RIL anu sakedik sareng jarak genetik anu ageung antara spidol sareng alel anu saluyu, teu aya kacindekan anu tiasa dipercaya anu tiasa dicandak ngeunaan gén anu aya di handapeunna. Di sisi anu sanés, panggunaan genetika tibalik dina lupin hésé kusabab poténsi regenerasi anu handap pisan, anu ngajantenkeun manipulasi genetik rumit37.
Kamekaran plasma nutfah anu dijinakkan anu mawa alel anu dipikahoyong dina kaayaan homozigot, sapertos 83A:476 (Lanr1) sareng Mandelup (AnMan), parantos muka panto pikeun nalungtik résistansi antraknosa dina nyanghareupan ayana kombinasi alel anu saling bertentangan dina populasi liar. Kamungkinan mékanisme molekuler. Bandingkeun réspon pertahanan anu dihasilkeun ku genotip khusus. Panilitian ieu meunteun réspon transkriptom awal NLL kana vaksinasi C. lupini. Mimitina, panel plasma nutfah NLL Éropa anu ngandung 215 garis disaring nganggo spidol molekuler anu nandakeun alel Lanr1 sareng AnMan. Fenotipe antraknosa teras dilakukeun dina 50 garis NLL, anu sateuacanna dipilih pikeun spidol molekuler, dina kaayaan anu dikontrol. Dumasar kana ékspérimén ieu, opat garis anu béda dina résistansi antraknosa sareng komposisi alel Lanr1/AnMan dipilih pikeun profil éksprési gén pertahanan diferensial nganggo dua pendekatan anu saling ngalengkepan: sekuensing RNA throughput tinggi sareng kuantifikasi PCR waktos nyata.
Panyaringan sakumpulan plasma nutfah NLL (N = 215) nganggo spidol Lanr1 (Anseq3 sareng Anseq4) sareng AnMan (Anseq4) sareng AnMan (AnManM1) nunjukkeun yén ngan hiji garis (95726, caket Salamanca-b) anu nguatkeun alel "résisténsi" pikeun sadaya spidol, sedengkeun "Ayana alel 'rentan'" mendakan proporsi sadaya spidol dina 158 garis (~73,5%). Tilu belas garis ngahasilkeun dua alel "tahan" tina spidol Lanr1, sareng 8 garis ngahasilkeun alel "tahan" tina Lanr1. spidol. Alel "résisténsi" tina spidol AnMan (Tabel Tambahan S1). Dua garis hétérozigot pikeun spidol Anseq3 sareng hiji hétérozigot pikeun spidol AnManM1. 42 galur (19,5%) mawa fase anu sabalikna tina alel Anseq3 sareng Anseq4, nunjukkeun frékuénsi rekombinasi anu luhur antara dua lokus ieu. Fenotipe antraknosa dina kaayaan anu dikontrol (Tabel Tambahan S2) ngungkabkeun variabilitas dina résistansi genotipe anu diuji, anu katingali dina parahna antraknosa. Bédana dina skor rata-rata mimitian ti 1,8 (tahan sedeng) dugi ka 6,9 (rentan) sareng bédana beurat pepelakan mimitian ti 0,62 (rentan) dugi ka 4,45 g (tahan). Aya korélasi anu signifikan antara nilai anu dititénan dina dua ulangan ékspérimén (0,51 pikeun skor parahna panyakit, P = 0,00017 sareng 0,61 pikeun beurat pepelakan, P < 0,0001) ogé antara dua parameter ieu (− 0,59 sareng − 0,77, P < 0,0001). Aya korélasi anu signifikan antara nilai anu dititénan dina dua ulangan ékspérimén (0,51 pikeun skor parahna panyakit, P = 0,00017 sareng 0,61 pikeun beurat pepelakan, P < 0,0001) ogé antara dua parameter ieu (− 0,59 sareng − 0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для тлиба = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P <0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, 01 < 0,0). Korélasi anu signifikan kapanggih antara nilai anu dititénan dina dua pangulangan ékspérimén (0,51 pikeun skor parahna panyakit, P = 0,00017 sareng 0,61 pikeun beurat pepelakan, P < 0,0001), ogé antara dua parameter ieu (- 0,59 sareng -0,77, P < 0,0001) 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为 =0. 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77，P <0,0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 了了了了0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（ 和 9–5. 0.59 和– 0.59 和- 0.77, P < 0.0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести видео, 0,0,0,0,0,0,0 и масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001. Aya korélasi anu signifikan antara nilai anu dititénan dina duplikat (skor parahna panyakit 0,51, P = 0,00017 sareng beurat pepelakan 0,61, P < 0,0001) sareng antara dua parameter ieu (-0,59 sareng -0 .0001) 0,77, P<0,0001. ).Gejala umum anu katingali dina pepelakan anu rentan kalebet bengkok sareng muterna gagang anu mirip struktur "busur angon", dituturkeun ku lési oval kalayan sporozoit oranyeu/pink (Gambar Tambahan 1). Aksesi Australia anu mawa gén Lanr1 (83A:476 sareng Tanjil) sareng AnMan (Mandelup) rada tahan, 0,0331 sareng 0,0036). Sababaraha galur anu ogé mawa alel Lanr1 sareng/atanapi AnMan anu "tahan" nunjukkeun gejala panyakit.
Anu pikaresepeun nyaéta, sababaraha galur NLL anu teu gaduh alel pananda "tahan" nunjukkeun tingkat résistansi antraknosa anu luhur (sarua atanapi langkung luhur tibatan genotipe Lanr1 atanapi AnMan), sapertos Boregine (nilai P < 0,0001 pikeun duanana parameter), Bojar (nilai P < 0,0001 pikeun skor sareng 0,001 pikeun beurat pepelakan) sareng Populasi B-549/79b (nilai P < 0,0001 pikeun skor sareng henteu signifikan pikeun beurat). Anu pikaresepeun nyaéta, sababaraha galur NLL anu teu gaduh alel pananda "tahan" nunjukkeun tingkat résistansi antraknosa anu luhur (sarua atanapi langkung luhur tibatan genotipe Lanr1 atanapi AnMan), sapertos Boregine (nilai P < 0,0001 pikeun duanana parameter), Bojar (nilai P < 0,0001 pikeun skor sareng 0,001 pikeun beurat pepelakan) sareng Populasi B-549/79b (nilai P < 0,0001 pikeun skor sareng henteu signifikan pikeun beurat). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий урость антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0.0001 для проба), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) jeung популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Anu pikaresepeun, sababaraha galur NLL anu teu gaduh alel pananda 'tahan' nunjukkeun tingkat résistansi anu luhur kana antraknosa (sarua atanapi langkung luhur tibatan genotipe Lanr1 atanapi AnMan), sapertos Boregine (nilai P < 0,0001 pikeun duanana parameter), Bojar (nilai P < 0,0001 pikeun évaluasi sareng 0,001 pikeun beurat pepelakan) sareng populasi B-549/79b (nilai P < 0,0001 pikeun évaluasi sareng henteu signifikan pikeun beurat).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗他他们一私基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显。 Anu pikaresepeun nyaéta sababaraha sistem NLL anu teu gaduh spidol "antigenik" nunjukkeun résistansi horizontal anu luhur (sarua jeung gén Lanr1 atawa AnMan atawa leuwih luhur), saperti Boregine (duanana parameter P < 0,0001), Bojar (nilai P < 0,0001, beurat tutuwuhan 0,001) jeung galur B-549/79b (nilai P < 0,0001, beurat teu signifikan). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уроистики антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001, Bojar <0,0001), Boregine масса растения 0,001) jeung популяция B-549/79b (оценка P-значение <0.0001, масса незначительна). Anu pikaresepeun, sababaraha galur NLL anu teu gaduh alel pananda 'résisténsi' nunjukkeun tingkat résistansi antraknosa anu luhur (sarua atanapi langkung luhur tibatan genotipe Lanr1 atanapi AnMan), sapertos Boregine (nilai P pikeun duanana parameter <0,0001), Bojar (nilai-P <0,0001, beurat pepelakan 0,001) sareng populasi B-549/79b (nilai-P <0,0001, beurat henteu signifikan).Fenomena ieu nunjukkeun kamungkinan aya sumber résistansi genetik anyar, anu ngajelaskeun kurangna korélasi antara génotip pananda sareng fenotipe panyakit (nilai P ti ~0,42 dugi ka ~0,98). Ku kituna, uji Kolmogorov-Smirnov nunjukkeun yén data ngeunaan résistansi antraknosa ampir kasebar normal pikeun skor (nilai-P 0,25 sareng 0,11) sareng massa pepelakan (nilai-P 0,47 sareng 0,55), nunjukkeun yén kuring ngahipotésis yén langkung seueur alel tibatan Lanr1 sareng AnMan anu kalibet.
Dumasar kana hasil panyaringan résistansi antraknosa, 4 galur dipilih pikeun analisis transkriptom: 83A:476, Boregine, Mandelup, sareng Populasi 22660. Galur-galur ieu diuji deui pikeun résistansi antraks dina ékspérimén inokulasi ku sekuensing RNA, salami sami sareng dina tés sateuacanna. Nilai skorna nyaéta sapertos kieu: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) sareng populasi 22660 (6,11 ± 1,29).
Protokol Illumina NovaSeq 6000 ngahontal rata-rata 40,5 pasangan Mread per sampel (29,7 dugi ka 54,4 Mreads) (Tabel Tambahan S3). Skor alignment dina runtuyan rujukan mimitian ti 75,5% dugi ka 88,6%. Korélasi rata-rata data cacah bacaan antara varian ékspériméntal antara réplikasi biologis mimitian ti 0,812 dugi ka 0,997 (rata-rata 0,959). Tina 35.170 gén anu dianalisis, 2917 henteu némbongkeun éksprési, sareng 4785 gén anu sanésna diékspresikeun dina tingkat anu tiasa diabaikan (rata-rata dasar < 5). Tina 35.170 gén anu dianalisis, 2917 henteu némbongkeun éksprési, sareng 4785 gén anu sanésna diékspresikeun dina tingkat anu tiasa diabaikan (rata-rata dasar < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, jeung остальные 4785 генов экспрессировались темировались (Bазовое среднее <5). Tina 35.170 gén anu dianalisis, 2917 henteu némbongkeun éksprési, sareng 4785 gén sésana diéksprésikeun dina tingkat anu tiasa diabaikan (rata-rata dasar <5).在分析的35.170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以忽略不基5).35.170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительнсубю среднее значение <5). Tina 35.170 gén anu dianalisis, 2917 teu diekspresikeun sareng 4785 gén sésana gaduh éksprési anu tiasa diabaikan (rata-rata dasar <5).Ku kituna, jumlah gén anu dipertimbangkeun diekspresikan (rata-rata dasar ≥ 5) salami ékspérimén nyaéta 27.468 (78,1%) (Tabel Tambahan S4).
Ti titik waktu kahiji, sadaya galur NLL ngaréspon kana inokulasi C. lupini (galur Col-08) ku cara ngaprogram ulang transkriptom (Tabel 1), kumaha oge, béda anu signifikan katingali antara galur. Ku kituna, galur résistansi 83A:476 (anu mawa gén Lanr1) nunjukkeun reprogramming transkriptom anu signifikan dina titik waktu kahiji (6 hpi) kalayan paningkatan 31-69 kali lipat dina jumlah gén ka luhur sareng ka handap anu diisolasi dibandingkeun sareng titik waktu anu sanés dina titik waktu ieu. Salaku tambahan, puncak ieu umurna pondok, sabab éksprési ngan ukur sababaraha gén anu tetep robih sacara signifikan dina titik waktu kadua (12 hpi). Anu pikaresepeun, Boregine, anu ogé nunjukkeun tingkat résistansi anu luhur dina tés cangkok, henteu ngalaman reprogramming transkripsi anu ageung sapertos kitu salami ékspérimén. Nanging, jumlah gén anu diekspresikeun sacara béda (DEG) sami pikeun Boregine sareng 83A:476 dina 12 HPI. Boh Mandelup sareng populasi 22660 nunjukkeun puncak DEG dina titik waktos terakhir (48 l/dtk), nunjukkeun reureuh relatif dina réspon pertahanan.
Kusabab 83A:476 ngalaman reprogramming transkriptom masif salaku réspon kana C. lupini dina 6 HPI dibandingkeun sareng sadaya galur anu sanés, ~91% DEG anu dititénan dina waktos ieu spésifik garis keturunan (Gambar 1). Nanging, aya sababaraha tumpang tindih dina réspon awal antara galur panilitian, sabab 68,5%, 50,9%, sareng 52,6% DEG di Boregine, Mandelup, sareng populasi 22660, masing-masing, tumpang tindih sareng anu kapanggih dina 83A:476 dina titik-titik waktos anu tangtu. Nanging, DEG ieu ngan ukur nyumbang sabagian alit (0,97–1,70%) tina sadaya DEG anu ayeuna dideteksi nganggo 83A:476. Salian ti éta, 11 DEG ti sadaya galur koheren dina waktos ieu (Tabel Tambahan S4-S6), kalebet komponén umum tina réspon pertahanan pepelakan: protéin transfer lipid (TanjilG_32225), énzim endoglucan-1,3-β-glukosida (TanjilG_23384), dua protéin anu tiasa diinduksi setrés sapertos SAM22 (TanjilG_31528 sareng TanjilG_31531), protéin lateks dasar (TanjilG_32352), sareng dua protéin témbok sél struktural anu beunghar glisin (TanjilG_19701 sareng TanjilG_19702). Aya ogé tumpang tindih anu kawilang luhur dina réspon transkriptom antara 83A:476 sareng Boregine dina 24 HPI (total 16-38% DEG) sareng antara Mandelup sareng Populasi 22660 dina 48 HPI (total 14-20% DEG).
Diagram Venn nu némbongkeun jumlah gén nu diekspresikeun sacara béda (DEG) dina galur lupin daun sempit (NLL) nu diinokulasi ku Colletotrichum lupini (galur Col-08 nu diala ti kebon lupin di Wierzhenice, Polandia, 1999). Galur NLL nu dianalisis nyaéta: 83A:476 (tahan, mawa alel Lanr1), Boregine (tahan, latar genetik teu dipikanyaho), Mandelup (tahan sedeng, mawa alel AnMan) jeung populasi 22660 (sangat rentan). Singgetan hpi nangtung pikeun sababaraha jam saatos vaksinasi. Nilai nol geus dihapus pikeun ngagampangkeun grafik.
Sakumpulan gén anu diekspresikeun kaleuleuwihi dina 6 hpi dianalisis pikeun ayana domain gén R kanonik (Tabel Tambahan S7). Panilitian ieu ngungkabkeun induksi transkriptom gén résistansi panyakit klasik kalayan domain NBS-LRR ngan ukur dina 83A:476. Sakumpulan ieu diwangun ku hiji gén TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), lima gén CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, sareng tanjilg_16162), sareng Opat NBS-LR, Tanjilg_16162), sareng Opat NBS-LRRE (tanjilg_16162) ogé Opat NBS-Lrr (tanjilg_16162) sareng Opat NBS-LRR (TANJILG_16162). Sadaya gén ieu gaduh domain kanonik anu disusun dina runtuyan anu dilestarikan. Salian ti gén domain NBS-LRR, sababaraha kinase RLL diaktipkeun dina 6 hpi, nyaéta hiji di Boregine (TanjilG_19877), dua di Mandelup (TanjilG_07141 sareng TanjilG_19877) sareng dina populasi 22660 (TanjilG_09014 sareng TanjilG_10361) sareng dua di 83A 27:476.
Gén-gén anu éksprésina robah sacara signifikan salaku réspon kana inokulasi ku C. lupini (galur Col-08) diuji pikeun analisis pangayaan Ontologi Gén (GO) (Tabel Tambahan S8). Istilah prosés biologis anu paling sering diwakilan nyaéta "réspon pertahanan GO:0006952" anu muncul dina 6 tina 16 kombinasi (waktos × garis) kalayan signifikansi anu luhur (nilai P < 0,001) (Gambar 2). Istilah prosés biologis anu paling sering diwakilan nyaéta "réspon pertahanan GO:0006952" anu muncul dina 6 tina 16 kombinasi (waktos × garis) kalayan signifikansi anu luhur (nilai P < 0,001) (Gambar 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный отверт» 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0.001) (рис. 2). Istilah prosés biologis anu paling sering diwakilan sacara kaleuleuwihi nyaéta 'réspon pertahanan GO:0006952', anu muncul dina 6 tina 16 kombinasi (waktos × garis keturunan) kalayan signifikansi anu luhur (nilai P < 0,001) (Gambar 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（时间（时间筐一们一们一一一么一一一不个中，具有高显着性（P ‼< 0.001）（Gambar 2）. Istilah prosés biologis anu paling ngagambarkeun nyaéta "GO:0006952 réspon pertahanan", anu muncul dina 6 tina 16 kombinasi (时间 ×线), kalayan signifikansi anu luhur (nilai P < 0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», которылыл 6 поского процесса был комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Istilah prosés biologis anu paling sering diwakilan nyaéta 'GO:0006952 Defense Response', anu muncul dina 6 tina 16 kombinasi (waktu × garis) kalayan signifikansi anu luhur (nilai P < 0,001) (Gambar 2).Istilah ieu kaleuleuwihi diwakilan dina dua titik waktu dina 83A: 476 sareng Boregine (6 sareng 24 hpi) sareng dina hiji titik waktu dina Mandelup sareng Populasi 22660 (masing-masing 12 sareng 6 hpi). Ieu mangrupikeun hasil anu dipiharep, anu nyorot réspon antijamur tina garis anu tahan. Salaku tambahan, 83A:476 ngaréspon ka C. lupini ku cara ngainduksi gén anu gancang anu aya hubunganana sareng ledakan oksidatif anu diwakilan ku istilah "GO: 0055114 prosés rédoks", nunjukkeun réspon pertahanan khusus, sedengkeun Boregine ngungkabkeun réspon pertahanan khusus, anu aya hubunganana sareng istilah 'GO'. :0006950 Réspon setrés”. Populasi 22660 ngaktipkeun réspon résistansi horizontal anu ngalibatkeun metabolit sékundér, nyorot jumlah istilah anu kaleuleuwihi "GO:0016104 Prosés biosintésis triterpén" sareng "GO:0006722 Prosés métabolisme triterpén" (duanana istilah kagolong kana sét gén anu sami), kalayan merhatikeun hasil analisis pangayaan istilah GO, stabilitas réaksi Mandelup aya antara Boregine sareng Populasi 22660. Salian ti éta, réaksi awal 83A:476 (6 hpi) sareng réaksi anu telat Mandelup sareng Populasi 22660 kalebet istilah GO:0015979 'fotosintésis' sareng prosés biologis anu aya hubunganana.
Istilah ontologi gén bioprosés anu dipilih dina anotasi gén anu diekspresikeun sacara béda salami réspon transkriptom lupin daun sempit (NLL) anu diinokulasi ku antraks lupin (galur Col-08 anu diala ti kebon lupin di Wierzhenice, Polandia, dina taun 1999) dilebih-lebihkeun pisan. Garis NLL anu dianalisis nyaéta: 83A:476 (tahan, mawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar genetik anu teu dipikanyaho), Mandelup (tahan sedeng, mawa alel AnMan homozigot) sareng populasi 22660 (rentan).
Kusabab ieu panilitian boga tujuan pikeun ngaidentipikasi gén anu nyumbang kana résistansi antraknosa, gén anu ditugaskeun kana istilah GO "GO: 0006952 Réspon pertahanan" sareng "GO: 0055114 Prosés rédoks" dianalisis nganggo cut-off sabab rata-rata dasar ≥ 30 kalayan sahenteuna hiji garis. × titik dina waktos anu ngagabungkeun nilai log2 anu signifikan sacara statistik (parobahan lipatan). Jumlah gén anu nyumponan kriteria ieu nyaéta 65 pikeun GO:0006952 sareng 524 pikeun GO:0055114.
83A:476 ngungkabkeun dua puncak DEG anu dibéré anotasi ku istilah GO:0006952, anu kahiji dina 6 gén per inci (64 gén, pangaturan luhur sareng handap) sareng anu kadua dina 24 gén per inci (15 gén, pangaturan luhur hungkul). Boregine ogé nunjukkeun yén GO:0006952 ngahontal puncakna dina titik waktos anu sami, tapi kalayan DEG anu langkung sakedik (11 sareng 8) sareng aktivasi préférensial. Mandeloop nunjukkeun dua puncak GO:0006952 dina 12 sareng 48 HPI, duanana mawa 12 gén (anu kahiji kalayan gén pangaktif, sareng anu kadua kalayan ngan ukur gén supresif), sedengkeun populasi 22660 dina 6 HPI (13 gén) ngagaduhan dominasi anu langkung ageung dina pangaturan puncak. Perlu dicatet yén 96,4% tina GO:0006952 DEG dina puncak ieu ngagaduhan jinis réspon anu sami (naék atanapi turun), nunjukkeun tumpang tindih anu signifikan dina réspon pertahanan sanaos aya bédana dina jumlah gén anu kalibet. Grup sekuen panggedéna anu aya hubunganana sareng istilah GO:0006952 ngodekeun Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-like), anu kagolong kana klad protéin patogenesis-associated protein (PR-10) kelas 10 sareng protéin inti lateks. protéin anu sami (MLP-like) (Gambar 3). Dua grup béda dina sifat éksprési sareng arah réspon. Gén anu ngodekeun protéin sapertos SAM22 nunjukkeun induksi anu konsisten sareng signifikan dina titik waktos awal (6 atanapi 12 hpi) sareng umumna henteu responsif dina ahir ékspérimén (48 hpi), sedengkeun protéin sapertos MLP nunjukkeun koordinasi dina 6 hpi. hpi. 83A:476 sareng Mandelup dina 48 hp/in, ampir sadaya titik data sanésna henteu responsif. Salaku tambahan, bédana dina profil éksprési gén protéin sapertos SAM22 nuturkeun variabilitas anu dititénan dina résistansi antraknosa, sabab garis anu langkung tahan gaduh langkung seueur titik waktos anu sacara signifikan ngainduksi gén ieu tibatan gén anu langkung rentan. Gén PR-10 anu sanés sapertos LlR18A/B nunjukkeun pola éksprési anu sami pisan sareng gén protéin sapertos SAM22.
Komponén utama tina istilah prosés biologis "GO:0006952 Defense Response" sareng pola éksprési gén calon alel Lanr1 sareng AnMan parantos diidéntifikasi. Skala Log2 ngagambarkeun nilai log2 (parobahan lipatan) antara pepelakan anu diinokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, anu diala tina kebon lupin, Wizhenica, Polandia, 1999) sareng kontrol (inokulasi palsu) dina titik waktos anu sami. Galur lupin daun sempit ieu dianalisis: 83A:476 (tahan, mawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar genetik teu dipikanyaho), Mandelup (tahan sedeng, mawa alel AnMan homozigot), sareng Populasi 22660 (rentan).
Salian ti éta, profil éksprési gén calon RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) sareng AnMan (TanjilG_12861) dievaluasi (Gambar 3). Gén TanjilG_05042 nunjukkeun réspon anu signifikan (aktivasi) dina 83A:476 ngan ukur dina titik waktos anu munggaran (6 hpi), sedengkeun TanjilG_12861 signifikan dina Mandeloop ngan ukur dina dua titik waktos: 6 hpi (régulasi turun) sareng 24 hpi (6 hpi). Kalayan.). tiasa disaluyukeun) ).
Gén anu paling diekspresikeun sacara kaleuleuwihi dina istilah "prosés rédoks" GO:0055114 nyaéta gén anu ngode protéin sitokrom P450 sareng peroksidase (Gambar 4). Pikeun sampel anu diisolasi tina 83A:476 dina 6 HPI, nilai log2 maksimum atanapi minimum (parobahan lipatan) (pikeun 86,6% gén) sacara umum dititénan antara pepelakan anu diinokulasi sareng kontrol, anu nunjukkeun réspon anu luhur tina génotipe ieu kana séks inokulasi. 83A:476 nunjukkeun GO: 0055114 DEG anu paling signifikan dina 6 hpi (503 gén), sedengkeun sésana galur dina 48 hpi (Boregine, 31 gén; Mandelup, 85 gén; sareng Populasi 22660, 78 gén)). Dina kalolobaan gén kulawarga GO:0055114, dua jinis réspon kana vaksinasi (aktivasi sareng inhibisi) dititénan. Anu pikaresepeun, dugi ka 97,6% tina DEG anu diidentipikasi pikeun istilah GO: 0055114 dina Mandelupe dina 48 hp. Observasi ieu nunjukkeun yén, sanaos skala anu langkung alit (nyaéta, jumlah gén rédoks anu dimutasi, 85 dibandingkeun 503), pola réspon transkriptom mandeloup anu telat ka antraknosa sami sareng réspon awal 83A:476. Dina Boregine sareng Population 22660, konvergénsi ieu langkung handap dina 51,6% sareng 75,6%, masing-masing.
Pola éksprési komponén utama tina istilah prosés biologis "GO:0055114 Prosés Rédoks" parantos diungkabkeun. Skala Log2 ngagambarkeun nilai log2 (parobahan lipatan) antara pepelakan anu diinokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, anu diala tina kebon lupin, Wizhenica, Polandia, 1999) sareng kontrol (inokulasi palsu) dina titik waktos anu sami. Galur lupin daun sempit ieu dianalisis: 83A:476 (tahan, mawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar genetik teu dipikanyaho), Mandelup (tahan sedeng, mawa alel AnMan homozigot), sareng Populasi 22660 (rentan).
83A:476 Réspon transkriptomik kana inokulasi ku C. lupini (galur Col-08) ogé kalebet panyabutan gén anu dikoordinasikeun anu disababkeun ku istilah GO:0015979 "fotosintésis" sareng prosés biologis anu aya hubunganana (Gambar 5). Set DEG GO:0015979 ieu ngandung 105 gén anu sacara signifikan direpresi dina 6 hpi dina 83A:476. Dina subkumpulan ieu, 37 gén ogé dikirangan dina Mandelup dina 48 HPI sareng 35 dina titik waktos anu sami dina populasi 22660, kalebet 19 DEG anu umum pikeun duanana génotipe. Teu aya DEG anu aya hubunganana sareng istilah GO: 0015979 anu diaktipkeun sacara signifikan dina kombinasi naon waé (garis x waktos).
Pola éksprési komponén utama tina istilah prosés biologis "GO:0015979 Fotosintésis" parantos diungkabkeun. Skala Log2 ngagambarkeun nilai log2 (parobahan lipatan) antara pepelakan anu diinokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, anu diala tina kebon lupin, Wizhenica, Polandia, 1999) sareng kontrol (inokulasi palsu) dina titik waktos anu sami. Galur lupin daun sempit ieu dianalisis: 83A:476 (tahan, mawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar genetik teu dipikanyaho), Mandelup (tahan sedeng, mawa alel AnMan homozigot), sareng Populasi 22660 (rentan).
Dumasar kana hasil analisis éksprési diferensial sareng sigana kalibet dina réspon pertahanan ngalawan jamur patogén, sét tujuh gén ieu dipilih pikeun kuantifikasi profil éksprési ku PCR waktos nyata (Tabel Tambahan S9).
Gén protéin putatif TanjilG_10657 diinduksi sacara signifikan dina sadaya galur sareng titik waktos anu ditalungtik dibandingkeun sareng pepelakan kontrol (mimik) (Tabel Tambahan S10, S11). Salian ti éta, profil éksprési TanjilG_10657 nunjukkeun tren anu ningkat salami ékspérimén pikeun sadaya galur. Populasi 22660 nunjukkeun sensitivitas TanjilG_10657 pangluhurna kana inokulasi kalayan aktivasi 114 kali lipat sareng tingkat éksprési relatif pangluhurna (4,4 ± 0,4) dina 24 HPI (Gambar 6a). Gén protéin PR10 LlR18A TanjilG_27015 ogé nunjukkeun aktivasi di sadaya galur sareng titik waktos, kalayan signifikansi statistik dina kalolobaan titik data (Gambar 6b). Sarupa sareng TanjilG_10657, tingkat éksprési relatif pangluhurna TanjilG_27015 dititénan dina 22660 populasi anu diinokulasi dina 24 HPI (19,5 ± 2,4). Gén éndokitinase asam TanjilG_04706 ningkat sacara signifikan dina sadaya galur sareng dina sadaya titik waktos kecuali Boregine 6 hpi (Gambar 6c). Éta diinduksi sacara kuat dina titik waktos munggaran (6 HPI) dina 83A:476 (ku 10,5 kali) sareng ningkat sacara sedeng dina galur sanés (ku 6,6-7,5 kali). Salila ékspérimén, éksprési TanjilG_04706 tetep dina tingkat anu sami dina 83A:476 sareng Boregine, sedengkeun dina Mandelup sareng Populasi 22660 ningkat sacara signifikan, ngahontal nilai anu relatif luhur (masing-masing 5,9 ± 1,5 sareng 6,2 ± 1,5). Gén endoglucan-1,3-β-glukosidase TanjilG_23384 nunjukkeun aktivasi anu luhur dina dua titik waktos munggaran (6 sareng 12 hpi) dina sadaya galur kecuali populasi 22660 (Gambar 6d). Tingkat éksprési relatif pangluhurna tina TanjilG_23384 dititénan dina titik waktu kadua (12 hpi) di Mandelup (2,7 ± 0,3) sareng 83A:476 (1,5 ± 0,1). Dina 24 HPI, éksprési TanjilG_23384 relatif handap dina sadaya garis anu ditalungtik (ti 0,04 ± 0,009 dugi ka 0,44 ± 0,12).
Profil éksprési gén anu dipilih (ag) anu diungkabkeun ku PCR kuantitatif. Angka 6, 12 sareng 24 ngagambarkeun sababaraha jam saatos vaksinasi. Gén LanDExH7 sareng LanTUB6 dianggo pikeun normalisasi sareng LanTUB6 dianggo pikeun kalibrasi antar-séri. Batang kasalahan ngagambarkeun standar deviasi dumasar kana tilu réplikasi biologis, anu masing-masing mangrupikeun rata-rata tina tilu réplikasi téknis. Signifikansi statistik tina bédana dina tingkat éksprési antara pepelakan anu diinokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, anu diala dina taun 1999 ti kebon lupin di Wierzenica, Polandia) sareng kontrol (inokulasi tiruan) ditandaan di luhur titik data (*Nilai P < 0,05, **Nilai P ≤ 0,01, ***Nilai P ≤ 0,001). Signifikansi statistik tina bédana dina tingkat éksprési antara pepelakan anu diinokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, anu diala dina taun 1999 ti kebon lupin di Wierzenica, Polandia) sareng kontrol (inokulasi tiruan) ditandaan di luhur titik data (*Nilai P < 0,05, **Nilai P ≤ 0,01, ***Nilai P ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспреспосии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен гля 1999 г. в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*знач0,нич 5, P. 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Béda anu signifikan sacara statistik dina tingkat éksprési antara pepelakan anu diinokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, anu diala dina taun 1999 ti kebon lupin di Wierzhenice, Polandia) sareng kontrol (anu diinokulasi palsu) dicatet di luhur titik data (*Nilai P < 0,05, **Nilai P ≤ 0,01, ***Nilai P ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据為0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （ 接秗水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001). Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученлый спо Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками (*, 0,000 * * * * * * * * * * * * P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Béda anu signifikan sacara statistik dina tingkat éksprési antara pepelakan anu diinokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, anu diala tina kebon lupin di Verzhenice, Polandia, taun 1999) sareng kontrol (anu diinokulasi palsu) dicatet di luhur titik data (*Nilai P < 0,05, **Nilai-P ≤ 0,01, ***Nilai-P ≤ 0,001).Garis NLL anu dianalisis nyaéta: 83A:476 (tahan, mawa alel Lanr1 homozigot), Mandelup (tahan sedeng, mawa alel AnMan homozigot), Boregine (tahan, latar genetik teu dipikanyaho) sareng populasi 22660 (rentan).
Gén calon TanjilG_05042 dina lokus Lanr1 némbongkeun pola éksprési anu béda pisan ti profil anu diala tina studi RNA-seq (Gambar 6e). Aktivasi anu signifikan tina gén ieu dititénan dina Mandelup sareng populasi 22660 (dugi ka 39,7 sareng 11,7 kali, masing-masing), ngahasilkeun tingkat éksprési anu relatif luhur (dugi ka 1,4 ± 0,14 sareng 7,2 ± 1,3, masing-masing). 83A:476 ogé ngungkabkeun sababaraha paningkatan gén TanjilG_05042 (dugi ka 3,8 kali lipat), kumaha ogé, tingkat éksprési relatif anu kahontal (0,044 ± 0,002) langkung ti 30 kali langkung handap tibatan anu dititénan dina Mandelup sareng populasi 22660. anu dianalisis ku qPCR nunjukkeun béda anu signifikan dina tingkat éksprési antara génotip dina varian anu divaksinasi tiruan (kontrol), ngahontal bédana 58 kali lipat antara populasi 22660 sareng 83A:476, ogé antara populasi 22660 sareng 22660. Béda dua kali lipat kahontal antara Boregine sareng Mandalup.
Gén calon dina lokus AnMan, TanjilG_12861, diaktipkeun salaku réspon kana vaksinasi dina 83A:476 sareng Mandelup, nétral dina populasi 22660, sareng dirégulasi handap dina Boregine (Gambar 6f). Éksprési relatif gén TanjilG_12861 nyaéta anu pangluhurna dina 83A: 476 anu diinokulasi (0,14 ± 0,01). Gén protéin kejut panas kelas I 17,4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 nunjukkeun tingkat éksprési relatif anu langkung handap dina sadaya galur sareng titik waktos anu ditalungtik (Gambar 6g). Nilai pangluhurna dititénan dina 24 HPI dina populasi 22660 (0,14 ± 0,02, paningkatan dalapan kali lipat dina réspon kana vaksinasi).
Babandingan profil éksprési gén (Gambar 7) ngungkabkeun korélasi anu luhur antara TanjilG_10657 sareng opat gén anu sanés: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80), sareng TanjilG_04706 (r = 0,79). Hasil sapertos kitu tiasa nunjukkeun ko-régulasi gén ieu nalika réspon pertahanan. Gén TanjilG_12861 sareng TanjilG_23384 nunjukkeun profil éksprési anu béda kalayan nilai koéfisién korélasi Pearson anu langkung handap (ti 0,08 dugi ka 0,43 sareng -0,19 dugi ka 0,28, masing-masing) dibandingkeun sareng gén anu sanés.
Korélasi antara profil éksprési gén dideteksi nganggo PCR kuantitatif. Galur lupin daun sempit ieu dianalisis: 83A:476 (tahan, mawa alel Lanr1 homozigot), Mandelup (tahan sedeng, mawa alel AnMan homozigot), Boregine (tahan, latar genetik teu dipikanyaho), sareng Populasi 22660 (rentan). Tilu titik waktu diitung (6, 12 sareng 24 jam saatos inokulasi), kalebet pepelakan anu diinokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, anu diala tina kebon lupin di Wierzhenice, Polandia, taun 1999) sareng kontrol (inokulasi palsu). Skala nunjukkeun nilai koéfisién korélasi Pearson.
Dumasar kana data anu diala dina 6 tenaga kuda per inci, WGCNA dilaksanakeun dina 9981 DEG anu diidentipikasi ku cara ngabandingkeun pepelakan anu diinokulasi sareng kontrol pikeun fokus kana réspon pertahanan awal (Tabel Tambahan S12). Dua puluh dua modul gén (klaster) kapanggih kalayan profil éksprési anu berkorelasi (positip atanapi négatip) antara génotip sareng varian ékspériméntal. Rata-rata, tingkat éksprési gén turun dina urutan 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (nanging, dina dua varian ieu tren langkung kuat dina pepelakan kontrol). Rata-rata, tingkat éksprési gén turun dina urutan 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (nanging, dina dua varian ieu tren langkung kuat dina pepelakan kontrol). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (в обоих вариантах, онтанакон, бел сильнее у контрольных растений). Rata-rata, tingkat éksprési gén nurun dina urutan 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (nanging, dina dua varian ieu tren langkung kuat dina pepelakan kontrol).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）.平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> populasi 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 在 种 中植物 中 更） . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 контрольных растений). Rata-rata, tingkat éksprési gén nurun dina séri 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (nanging, dina dua varian, tren ieu langkung kuat dina pepelakan kontrol).Vaksinasi nyababkeun paningkatan éksprési gén, khususna dina modul 18, 19, 14, 6 sareng 1 (dina urutan pangaruh anu turun), pangaturan négatif (contona modul 9 sareng 20) atanapi kalayan pangaruh nétral (contona modul 11, 22, 8 sareng 13). Analisis pangayaan istilah GO (Tabel Tambahan S13) ngungkabkeun "GO: 0006952 Réspon pelindung" pikeun modul anu diinokulasi (18) kalayan aktivasi maksimum, kalebet gén anu dianalisis ku qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 sareng TanjilG_27015), ogé seueur modul fotosintésis Inokulasi anu paling ditindas (9). Konsentrator Modul 18 (Gambar 8) diidéntifikasi salaku gén TanjilG_26536 anu ngodekeun protéin LlR18B anu siga PR-10, sareng konsentrator modul 9 diidéntifikasi salaku gén TanjilG_28955 anu ngodekeun protéin fotosistem II PsbQ. Calon gén résistansi antraknosa Lanr1, TanjilG_05042, kapanggih dina modul 22 (Gambar 9) sareng aya hubunganana sareng istilah "GO:0044260 Prosés métabolik makromolekul sélular" sareng "GO:0006355 Pangaturan transkripsi, templating DNA" anu mawa hub TanjilG_01212. gén éta ngodekeun faktor transkripsi setrés panas A-4a (HSFA4a).
Analisis jaringan tertimbang tina ko-éksprési gén modul kalayan istilah prosés biologis anu kaleuleuwihi "GO: 0006952 Réspon Pertahanan". Ligasi disederhanakeun pikeun nyorot opat gén anu dianalisis ku qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 sareng TanjilG_27015).
Analisis jaringan tertimbang tina ko-éksprési gén tina modul kalayan istilah prosés biologis anu kaleuleuwihi "GO: 0006355: Pangaturan transkripsi, témplat DNA" sareng mawa calon gén résistansi antraknosa Lanr1 TanjilG_05042. Ligasi disederhanakeun pikeun ngasingkeun gén TanjilG_05042 sareng gén pusat TanjilG_01212.
Panyaringan résistansi antraknosa anu dikumpulkeun di Australia nunjukkeun yén kalolobaan kultivar anu dileupaskeun awal rentan; Kalya, Coromup sareng Mandelup parantos digambarkeun salaku tahan sedeng, sedengkeun Wonga, Tanjil sareng 83A:476 parantos digambarkeun salaku tahan pisan26,27,31. ngagaduhan alel résistansi anu sami, ditunjuk Lanr1, sareng Coromup sareng Mandelup ngagaduhan alel anu béda, ditunjuk AnMan10, 26, 39, sedengkeun Kalya ngirimkeun alel anu béda., Lanr2. Panyaringan pikeun résistansi antraknosa di Jerman ngahasilkeun idéntifikasi garis tahan Bo7212 sareng alel calon anu sanés ti Lanr1, ditunjuk LanrBo36.
Panilitian kami ngungkabkeun frékuénsi anu handap pisan (sakitar 6%) tina alel Lanr1 dina plasma nutfah anu diuji. Observasi ieu saluyu sareng hasil panyaringan plasma nutfah Éropa Wétan nganggo spidol Anseq3 sareng Anseq4, anu nunjukkeun yén alel Lanr1 ngan ukur aya dina dua garis Bélarusia. Ieu nunjukkeun yén alel Lanr1 tacan seueur dianggo ku program pemuliaan lokal, teu sapertos di Australia, dimana éta mangrupikeun salah sahiji alel konci pikeun pemuliaan anu dibantuan ku spidol. Ieu tiasa disababkeun ku tingkat résistansi anu langkung handap anu disayogikeun ku alel Lanr1 dina kaayaan lapangan Éropa dibandingkeun sareng laporan Australia. Salaku tambahan, panilitian antraknosa di daérah curah hujan anu luhur di Australia parantos nunjukkeun yén réspon résistansi anu dimediasi ku alel Lanr1 panginten henteu efektif dina kaayaan cuaca anu ngadukung kamekaran sareng kamekaran gancang patogén19,42. Nyatana, dina panilitian ayeuna, sababaraha gejala antraknosa ogé dititénan dina génotipe anu mawa alel Lanr1, nunjukkeun yén résistansi tiasa ngaleungit dina kaayaan optimal pikeun kamekaran C. lupini. Salian ti éta, interpretasi positif palsu ngeunaan ayana spidol Anseq3 sareng Anseq4, anu jarakna sakitar 1 cM ti lokus Lanr1, tiasa waé 28,30,43.
Panilitian kami nunjukkeun yén 83A:476, anu mawa alel Lanr1, ngaréspon kana inokulasi C. lupini ku program ulang transkriptom skala ageung dina titik waktos anu dianalisis munggaran (6 hpi), sedengkeun di Mandelup, anu mawa alel AnMan, réspon transkriptomik dititénan langkung lami (ti 24 dugi ka 48 hp). Variasi temporal dina réspon pertahanan ieu aya hubunganana sareng bédana dina gejala panyakit, anu nyorot pentingna pangakuan patogén awal pikeun réspon anu suksés kana résistansi. Pikeun nginféksi jaringan pepelakan, spora antraks kedah ngalangkungan sababaraha tahapan perkembangan dina permukaan inang, kalebet pengecambahan, pembagian sél, sareng pembentukan appressorium. Apendase nyaéta struktur infektif anu napel kana permukaan inang sareng ngagampangkeun penetrasi kana jaringan inang. Ku kituna, spora C. gloeosporioides dina ekstrak kacang polong nunjukkeun pembagian inti anu munggaran saatos 75-90 menit inkubasi, pembentukan tabung kuman saatos 90-120 menit, sareng panurunan saatos 4 jam 45. Mangga C. gloeosporioides nunjukkeun langkung ti 40% pengecambahan konidia saatos 3 jam inkubasi sareng sakitar 20% formasi apresor saatos 4 jam. Gén CAP20 anu aya hubunganana sareng virulénsi tina C. gloeosporioides nunjukkeun aktivitas transkripsi dina konidia anu ngabentuk epifit saatos 3,5 jam inkubasi dina lilin permukaan alpukat kalayan konsentrasi protéin CAP20 anu luhur saatos 4 jam 46 menit. Sarua ogé, aktivitas gén biosintésis melanin dina C. trifolii diinduksi salami inkubasi 2 jam dituturkeun ku formasi appressorium saatos 1 jam. Panilitian jaringan daun nunjukkeun yén stroberi anu diinokulasi ku C. acutatum ngagaduhan suprési munggaran dina 8 hpi, sedengkeun tomat anu diinokulasi ku C. coccodes ngagaduhan suprési munggaran dina 4 hpi48,49. seueurna saluyu sareng skala waktos prosés inféksi Colletotrichum spp. Réspon pertahanan anu gancang ka 83A:476 nunjukkeun kalibetna résistansi tutuwuhan sareng gén imunitas anu dipicu ku éféktor (ETI) dina garis ieu, sedengkeun réspon anu ditunda Mandelup ngadukung hipotesis imunitas anu dipicu ku pola molekuler (MTI) anu aya hubunganana sareng mikro 50. Réspon awal ka 83A: 476 sareng Mandelup. Tumpang tindih parsial antara gén anu diatur ka luhur atanapi ka handap dina réspon anu ditunda ogé ngadukung konsép ieu, sabab ETI sering dianggap salaku réspon MTI anu dipercepat sareng ditingkatkeun anu puncakna dina maotna sél anu diprogram di tempat inféksi, katelah syok anafilaksis 51,52.
Kaseueuran gén anu disababkeun ku istilah Gene Ontology GO:0006952 "Respon Pertahanan" anu kaleuleuwihi nyaéta 11 homolog protéin pesen puasa 22 anu diinduksi setrés (sarupa sareng SAM22) sareng tujuh protéin lateks utama (MLP). Protéin sapertos 31, 34, 43 sareng 423 nunjukkeun kamiripan runtuyan. Gén sapertos SAM22 nunjukkeun aktivasi anu signifikan anu langkung lami, nunjukkeun paningkatan tingkat résistansi antraknosa (83A:476 sareng Boregine). Nanging, gén sapertos MLP ngan ukur dikirangan dina garis anu ngandung alel résistansi calon (83A:476/Lanr1 dina 6 hpi sareng Mandelup/AnMan dina 24 hpi). Perlu dicatet yén sadaya homolog sapertos SAM22 anu diidentipikasi asalna tina klaster gén anu ngawengku sakitar 105 kb, sedengkeun gén sapertos MLP asalna tina daérah génom anu misah. Aktivasi anu terkoordinasi tina gén-gén anu siga SAM22 sapertos kitu ogé kapanggih dina panilitian kami sateuacanna ngeunaan résistansi NLL kana inokulasi Diaporthetoxica, nunjukkeun yén aranjeunna kalibet dina komponén horizontal tina réspon pertahanan. Kacindekan ieu ogé dirojong ku laporan réspon positif tina gén-gén anu siga SAM22 kana tatu atanapi pangobatan nganggo asam salisilat, inducers jamur, atanapi hidrogén péroksida.
Gén anu siga MLP parantos dipidangkeun ngaréspon kana rupa-rupa setrés abiotik sareng biotik, kalebet inféksi jamur baktéri, virus sareng patogén dina seueur spésiés pepelakan55. Arah réspon kana interaksi anu tangtu antara pepelakan sareng patogén mimitian ti ningkat pisan (contona, nalika inféstasi kapas ku Verticillium dahliae) dugi ka turun sacara signifikan (contona, saatos inféksi tangkal apel ku Alternaria spp.)56,57. Panurunan anu signifikan tina gén 423 anu siga MLP parantos dititénan nalika pertahanan alpukat kana inféksi F. niger sareng nalika inféksi tangkal apel Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola sareng Alternaria alternata mangrupikeun patotipe apel58,59. Salaku tambahan, kalus apel anu ngébréhkeun gén 423 anu siga MLP ngagaduhan éksprési gén anu aya hubunganana sareng résistansi anu langkung handap sareng langkung rentan ka inféksi jamur59. Saatos Fusarium oxysporum f, gén 423 anu siga MLP ogé diteken dina plasma nutfah kacang umum anu tahan. cn. Inféksi kacang 60.
Anggota kulawarga PR-10 anu sanés anu diidentipikasi dina panilitian RNA-seq kami nyaéta gén LlR18A sareng LlR18B salaku réspon kana upregulasi, ogé gén anu upregulated (1 gén) atanapi downregulated (3 gén) pikeun protéin transfer lipid DIR1. . Salian ti éta, WGCNA nyorot gén LlR18B salaku puseur dina modul ieu, anu rentan pisan kana vaksinasi sareng mawa sababaraha gén réspon pelindung. Gén LlR18A sareng LlR18B diinduksi dina daun lupin konéng salaku réspon kana baktéri patogén, ogé dina batang NLL saatos inokulasi D. toxica, sedengkeun homolog béas tina gén ieu, RSOsPR10, gancang diinduksi ku inféksi jamur anu sigana kalibet dina jalur sinyal asam jasmonat 53,61, 62. Gén DIR1 ngodekeun protéin transportasi lipid nonspesifik anu diperyogikeun pikeun awal résistansi anu didapat sistemik (SAR). Kalayan kamekaran réaksi pelindung, protéin DIR1 diangkut ti fokus inféksi ngaliwatan floem pikeun ngainduksi SAR dina organ anu jauh. Anu pikaresepeun, gén TanjilG_02313 DIR1 diinduksi sacara signifikan dina titik waktos anu munggaran dina garis 84A:476 sareng Populasi 22660, tapi résistansi antraknosa ngan ukur hasil dimekarkeun dina garis 84A:476. Ieu tiasa nunjukkeun sababaraha subfungsionalisasi gén DIR1 dina NLL, kumargi tilu homolog sésana ngaréspon kana inokulasi ngan ukur dina garis 83A:476 dina 6 hpi, sareng réspon ieu diarahkeun ka handap.
Dina panilitian kami, komponén anu paling umum anu pakait sareng prosés biologis anu disebut "GO:0055114 Prosés Rédoks" nyaéta protéin sitokrom P450, péroksidase, asam linoleat 9S-/13S-lipoksigénase, sareng 1-aminosiklopropana-1-asam karboksilat oksidase. Salian ti éta, WGCNA kami ngahartikeun homolog HSFA4a salaku modul anu mawa hub sapertos calon gén résistansi Lanr1 TanjilG_05042. HSFA4a mangrupikeun komponén régulasi transkripsi nuklir anu gumantung kana rédoks dina pepelakan.
Protéin sitokrom P450 nyaéta oksidoreduktase anu ngatalisan réaksi hidroksilasi anu gumantung kana NADPH sareng/atanapi O2 dina métabolisme primér sareng sekundér, kalebet métabolisme xenobiotik, ogé hormon, asam lemak, stérol, komponén témbok sél, biopolimer, sareng biosintésis sanyawa pelindung 69. Dina hiji panilitian, variabilitas dina fungsi sitokrom P450 tutuwuhan dikirangan tina -10,6 log2 (parobahan lipatan) janten 5,7 kusabab seueurna homolog anu robih (37) sareng bédana dina pola réspon antara gén spésifik, anu ngagambarkeun révisi ka luhur. . Ngan ukur nganggo data RNA-seq pikeun ngajelaskeun fungsi biologis putatif tina gén NLL dina superfamili protéin anu ageung sapertos kitu bakal spekulatif pisan. Nanging, perlu dicatet yén sababaraha gén sitokrom P450 aya hubunganana sareng ningkatna résistansi kana jamur atanapi baktéri patogén, kalebet kontribusi kana réaksi alérgi 69,70,71.
Peroksidase Kelas III nyaéta énzim tutuwuhan multifungsi anu aub dina rupa-rupa prosés métabolik salami kamekaran sareng kamekaran pepelakan, ogé salaku réspon kana setrés lingkungan sapertos salinitas, halodo, inténsitas cahaya anu luhur, sareng serangan patogén72. Peroksidase aub dina interaksi sababaraha spésiés tutuwuhan sareng Anthracis, kalebet Stylosanthes humilis sareng C. gloeosporioides, Lens culinaris sareng C. truncatum, Phaseolus vulgaris sareng C. lindemuthianum, Cucumis sativus sareng C. lagenarium73,74,75,76. Résponna gancang pisan, sakapeung bahkan dina 4 HPI, sateuacan jamur nembus jaringan tutuwuhan73. Gén peroksidase ogé ngaréspon kana inokulasi D. toxica NLL. Salian ti fungsi hasna pikeun ngatur ledakan oksidatif atanapi ngaleungitkeun setrés oksidatif, peroksidase tiasa ngaganggu kamekaran patogén ku cara nyiptakeun halangan fisik dumasar kana panguatan témbok sél salami lignifikasi, subunit atanapi cross-linking sanyawa khusus. Fungsi ieu tiasa dikaitkeun sacara in silico sareng gén TanjilG_03329 anu ngodekeun anion peroksidase pembentuk lignin putatif anu ningkat sacara signifikan dina panilitian kami dina galur tahan 83A:476 dina 6 HPI, tapi henteu dina galur sareng titik waktos sanés anu henteu ngaréspon.
9S-/13S-lipoxygenase tina asam linoleat mangrupikeun léngkah munggaran dina jalur oksidatif biosintésis lipid78. Produk tina jalur ieu ngagaduhan sababaraha fungsi dina pertahanan pepelakan, kalebet nguatkeun témbok sél ngalangkungan formasi deposit callose sareng pektin, sareng ngatur setrés oksidatif ngalangkungan produksi spésiés oksigén réaktif79,80,81,82,83. Dina panilitian ayeuna, éksprési asam linoleat 9S-/13S-lipoxygenase robih dina sadaya galur, tapi dina populasi anu rentan 22660, upregulasi lumangsung dina titik waktos anu béda, sedengkeun dina galur anu mawa alel Lanr1 sareng AnMan anu tahan, éta nekenkeun diversifikasi lapisan oxylipin dina réaksi anthrax pelindung antara genotip ieu.
Homolog 1-aminosiklopropana-1-karboksilat oksidase (ACO) ningkat sacara signifikan (9 gén) atanapi turun (2 gén) nalika diinokulasi ku lupin. Kalayan dua pengecualian, sadaya réspon ieu lumangsung dina 6 hp. dina 83A:476. Réaksi énzimatik anu dimediasi ku protéin ACO mangrupikeun léngkah anu ngawatesan laju dina produksi etilen sareng ku kituna diatur pisan84. Etilen mangrupikeun hormon pepelakan anu maénkeun rupa-rupa peran dina ngatur kamekaran pepelakan sareng réspon kana kaayaan setrés abiotik sareng biotik. Induksi transkripsi ACO sareng aktivasi jalur sinyal etilen kalibet dina ningkatkeun résistansi béas ka jamur hemibiotropik oryzae oryzae ku cara ngatur produksi spésiés oksigén réaktif sareng fitoaleksin. Prosés inféksi daun anu sami pisan anu kapanggih antara M. oryzae sareng C. lupini88,89, kalayan latar tukang paningkatan homolog ACO anu signifikan dina garis 83A:476 anu dilaporkeun dina panilitian ieu, ngarobih kamungkinan pikeun masihan résistansi ka NLL antraknosa Etilena, léngkah sentral sinyal dina jalur molekuler.
Dina panilitian ayeuna, panurunan skala ageung tina seueur gén anu aya hubunganana sareng fotosintésis dititénan dina 6 hpi dina 83A:476 sareng dina 48 hpi di Mandeloop sareng populasi 22660. Tingkat sareng kamajuan parobahan ieu sabanding sareng tingkatna. Résistansi antraknosa dititénan dina ékspérimén ieu. Anyar-anyar ieu, panurunan anu kuat sareng awal tina transkrip anu aya hubunganana sareng fotosintésis parantos dilaporkeun dina sababaraha modél interaksi pepelakan-patogen, kalebet baktéri patogén sareng jamur. Gancang (tina 2 HPI dina sababaraha interaksi) sareng panurunan global gén anu aya hubunganana sareng fotosintésis dina réspon kana inféksi tiasa micu imunitas pepelakan dumasar kana panyebaran spésiés oksigén réaktif sareng interaksina sareng jalur asam salisilat pikeun ngamediasi réaksi alérgi 90,94.
Dina kacindekanana, mékanisme réspon pertahanan anu diusulkeun pikeun garis keturunan anu paling tahan (83A:476) kalebet pangakuan patogén gancang ku gén R (sigana TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) sareng sinyal asam salisilat sareng étilén anu dimediasi réspon alérgi, dituturkeun ku ngadegna SAR jarak jauh. Peta ieu dirojong ku protéin DIR-1. Perlu dicatet yén période biotropik pikeun inféksi C. lupini pondok pisan (sakitar 2 dinten), dituturkeun ku kamekaran nekrotik95. Transisi antara tahapan ieu tiasa aya hubunganana sareng nekrosis sareng éksprési protéin anu tiasa diinduksi étilén anu bertindak salaku pemicu réaksi hipersensitivitas dina pepelakan inang. Ku alatan éta, jandela waktos pikeun néwak C. lupini anu suksés dina tahap biotropik sempit pisan. Pemrograman ulang gén anu aya hubunganana sareng rédoks sareng fotosintésis anu dititénan dina 83A:476 dina 6 hpi saluyu sareng kamajuan hifa jamur sareng nunjukkeun kamekaran réspon pelindung anu suksés dina tahap biotropik. Réspon transkriptomik Mandelup sareng populasi 22660 panginten telat teuing pikeun néwak jamur sateuacan ngalih ka kamekaran nekrotik, nanging, Mandelup panginten langkung efektif tibatan populasi 22660 sabab régulasi protéin PR-10 anu kawilang gancang ningkatkeun résistansi horizontal.
ETI, anu didorong ku gén R kanonik, sigana mangrupikeun mékanisme umum pikeun résistansi kacang kana antraknosa. Ku kituna, dina modél legum Medicago truncatula, résistansi kana antraknosa dipasihkeun ku gén RCT1, anggota kelas gén R pepelakan TIR-NBS-LRR97. Gén ieu ogé masihan résistansi antraknosa spéktrum lega dina alfalfa nalika ditransfer ka pepelakan anu rentan. Dina kacang biasa (P. vulgaris), langkung ti dua lusin gén résistansi antraknosa parantos diidéntifikasi dugi ka ayeuna. Sababaraha gén ieu kapanggih di daérah anu teu gaduh gén R kanonik, nanging seueur anu sanésna ayana di sisi kromosom anu mawa gugusan gén NBS-LRR, kalebet TIR-NBS-LRRs99. Panilitian SSR sakumna génom ogé mastikeun hubungan gén NBS-LRR sareng résistansi antraknosa dina kacang biasa. Gén R kanonik ogé kapanggih di daérah génomik anu mawa lokus résistansi antraknosa utama dina lupin bodas 101.
Panalungtikan kami nunjukkeun yén réaksi résistansi langsung, anu diaktipkeun dina tahap awal inféksi pepelakan (langkung saé henteu langkung ti 12 hpi), sacara efektif ngajaga lupin daun sempit tina antraknosa anu disababkeun ku jamur patogén Collelotrichum lupini. Ngagunakeun sekuensing throughput anu luhur, kami nunjukkeun profil éksprési anu béda tina gén résistansi antraknosa dina pepelakan NLL anu dimediasi ku gén résistansi Lanr1 sareng AnMan. Pertahanan anu suksés ngalibatkeun ngarancang sacara saksama gén pikeun protéin anu aub dina rédoks, fotosintésis, sareng patogenesis dina sababaraha jam saatos kontak munggaran pepelakan sareng patogén. Réaksi pelindung anu sami, tapi telat dina waktosna, kirang efektif dina ngajaga pepelakan tina panyakit. Résistansi antraks anu dimediasi ku gén Lanr1 nyarupaan réspon gancang anu khas tina gén R (imunitas anu dipicu ku éféktor), sedengkeun gén AnMan kamungkinan nyayogikeun réspon horizontal (imunitas anu dipicu ku pola molekul anu aya hubunganana sareng mikroba), nyayogikeun tingkat keberlanjutan anu sedeng.
215 galur NLL anu dianggo pikeun nyaring pananda antraknosa diwangun ku 74 kultivar, 60 galur anu diala ku cara nyilangkeun atanapi beternak, 5 mutan, sareng 76 plasma nutfah liar atanapi asli. Galur-galur éta asalna ti 17 nagara, utamina ti Polandia (58), Spanyol (47), Jerman (27), Australia (26), Rusia (19), Bélarus (7), Italia (5) sareng galur-galur sanésna ti 10 nagara. Set éta ogé kalebet galur tahan rujukan: 83A:476, Tanjil, Wonga anu mawa alel Lanr1, sareng Mandelup anu mawa alel AnMan. Galur-galur éta diala tina Database Sumber Daya Genetik Lupin Éropa anu dijaga ku Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polandia (Tabel Tambahan S1).
Tutuwuhan dipelak dina kaayaan anu dikontrol (fotoperiode 16 jam, suhu 25°C beurang sareng 18°C ​​peuting). Dua réplika biologis dianalisis. DNA diisolasi tina daun anu umurna tilu minggu nganggo DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Jerman) numutkeun protokol. Kualitas sareng konsentrasi DNA anu diisolasi dipeunteun ku metode spektrofotometri (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Pananda AnManM1 anu nandakeun gén tahan antraknosa AnMan (asalna tina cv. Mandelup) sareng pananda Anseq3 sareng Anseq4 anu ngapit gén Lanr1 (asalna tina cv. Tanjil) dianalisis 11,26,28. Homozigot pikeun alel tahan dibéré skor "1", susceptible - "0", sareng heterozigot - 0,5.
Dumasar kana hasil panyaringan pikeun spidol AnManM1, AnSeq3 sareng AnSeq4 sareng kasadiaan siki pikeun ékspérimén susulan ahir, 50 galur NLL dipilih pikeun fenotipe résistansi antraknosa. Analisis dilaksanakeun dua kali lipat di rumah kaca anu dikontrol komputer kalayan fotoperiode 14 jam kalayan kisaran suhu 22°C siang sareng 19°C wengi. Siki dikerok (motong kulit siki di sisi sabalikna tina embrio ku bilah anu seukeut) sateuacan dipelak pikeun nyegah dormansi siki kusabab kulit siki anu teuas teuing sareng pikeun mastikeun pengecambahan anu seragam. Tutuwuhan dipelak dina pot (11 × 11 × 21 cm) kalayan taneuh steril (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warsawa, Polandia). Inokulasi dilaksanakeun nganggo galur Colletotrichum lupini Col-08, anu dipelak dina taun 1999 tina gagang pepelakan lupin daun heureut anu dipelak di kebon di Verzhenitsa, Polandia Raya (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Candak hiji daérah. Isolat dibudidayakeun dina média SNA dina suhu 20° C di handapeun lampu hideung salami 21 dinten pikeun ngainduksi sporulasi. Opat minggu saatos dipelak, nalika pepelakan parantos ngahontal tahap 4-6 daun, inokulasi dilaksanakeun ku cara nyemprot ku suspénsi konidia dina konsentrasi 0,5 x 106 konidia per ml. Saatos inokulasi, pepelakan disimpen dina tempat anu poék salami 24 jam dina kalembaban sakitar 98% sareng suhu 25°C pikeun ngagampangkeun pengecambahan konidia sareng prosés inféksi. Tutuwuhan-tutuwuhan éta teras dipelak dina fotoperiode 14 jam dina suhu 22°C beurang/19°C peuting sareng kalembaban 70%. Skor panyakit dilakukeun 22 dinten saatos inokulasi sareng mimitian ti 0 (imun) dugi ka 9 (sangat rentan) gumantung kana ayana atanapi henteuna lési nekrotik dina batang sareng daun. Salian ti éta, saatos dipeunteun, beurat pepelakan diukur. Hubungan antara génotip pananda sareng fenotipe panyakit diitung salaku korélasi titik dua runtuyan (henteuna pananda hétérozigot dina sét garis pikeun analisis fenotipe résistansi antraknosa).