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एंगुस्टिफोलियस ल्यूपिन (NLL, ल्यूपिनस एंगुस्टिफोलियस एल.) एक फलीदार पौधा है जिसका उपयोग खाद्य उत्पादन और मृदा सुधार के लिए किया जाता है। फसल के रूप में NLL के वैश्विक विस्तार ने ल्यूपिन एंथ्रेक्नोज़ सहित कई रोगजनक कवकों को आकर्षित किया है, जो विनाशकारी एंथ्रेक्नोज़ रोग का कारण बनता है। दो एलील, Lanr1 और AnMan, जो प्रतिरोधक क्षमता बढ़ाते हैं, का उपयोग NLL प्रजनन में किया गया है, लेकिन अंतर्निहित आणविक क्रियाविधियाँ अभी भी अज्ञात हैं। इस अध्ययन में, यूरोपीय NLL नमूनों की जांच के लिए Lanr1 और AnMan मार्करों का उपयोग किया गया। नियंत्रित वातावरण में टीके के परीक्षण ने दोनों प्रतिरोधी दाताओं की प्रभावकारिता की पुष्टि की। प्रतिनिधि प्रतिरोधी और संवेदनशील किस्मों पर विभेदक जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग की गई। एंथ्रेक्नोज़ प्रतिरोध जीन ऑन्टोलॉजी शब्दों "GO:0006952 रक्षा प्रतिक्रिया", "GO:0055114 रेडॉक्स प्रक्रिया" और "GO:0015979 प्रकाश संश्लेषण" की अतिअभिव्यक्ति से जुड़ा था। इसके अतिरिक्त, Lanr1(83A:476) लाइन ने टीकाकरण के तुरंत बाद महत्वपूर्ण ट्रांसक्रिप्टोम रीप्रोग्रामिंग दिखाई, जबकि अन्य लाइनों में यह प्रतिक्रिया लगभग 42 घंटे विलंबित हुई। रक्षा प्रतिक्रियाएं TIR-NBS, CC-NBS-LRR और NBS-LRR जीन, रोगजनन में शामिल 10 प्रोटीन, लिपिड स्थानांतरण प्रोटीन, एंडोग्लूकन-1,3-β-ग्लूकोसिडेज़, ग्लाइसिन-समृद्ध कोशिका भित्ति प्रोटीन और ऑक्सीजन के प्रतिक्रियाशील पथ से संबंधित जीन से जुड़ी हैं। 83A:476 के प्रति प्रारंभिक प्रतिक्रियाएं, जिनमें प्रकाश संश्लेषण से जुड़े जीनों का सावधानीपूर्वक दमन शामिल है, कवक जीव विज्ञान के वानस्पतिक विकास चरण के दौरान सफल सुरक्षा के साथ मेल खाती हैं, जिससे पता चलता है कि एक प्रभावक प्रतिरक्षा को सक्रिय करता है। मैंडेलूप प्रतिक्रिया धीमी हो जाती है, साथ ही समग्र क्षैतिज खिंचाव भी।
संकीर्ण पत्ती वाला ल्यूपिन (एनएलएल, ल्यूपिनस एंगस्टिफोलियस एल.) पश्चिमी भूमध्यसागरीय क्षेत्र में उत्पन्न होने वाला एक उच्च प्रोटीन वाला अनाज है।1,2 वर्तमान में इसे पशुओं और मनुष्यों के लिए खाद्य फसल के रूप में उगाया जाता है। सहजीवी नाइट्रोजन स्थिरीकरण जीवाणुओं द्वारा नाइट्रोजन स्थिरीकरण और मृदा संरचना में समग्र सुधार के कारण इसे फसल चक्र प्रणालियों में हरी खाद के रूप में भी माना जाता है। एनएलएल ने पिछली शताब्दी में तेजी से पालतूकरण की प्रक्रिया से गुजरा है और अभी भी इस पर उच्च प्रजनन दबाव है।3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 एनएलएल की व्यापक खेती के साथ, रोगजनक कवकों के अनुक्रम ने नए कृषि क्षेत्र विकसित किए और फसल को नष्ट करने वाले नए रोगों को जन्म दिया। ल्यूपिन किसानों और प्रजनकों के लिए सबसे उल्लेखनीय बात यह थी कि रोगजनक कवक, कोलेटोट्रिचम ल्यूपिनी (बोंडर) निरेनबर्ग, फीलर और हेगेडोर्न13 के कारण एंथ्रेक्नोज का प्रकोप हुआ। ल्यूपिन किसानों और प्रजनकों के लिए सबसे उल्लेखनीय बात यह थी कि रोगजनक कवक, कोलेटोट्रिचम ल्यूपिनी (बोंडर) निरेनबर्ग, फीलर और हेगेडोर्न13 के कारण एंथ्रेक्नोज का प्रकोप हुआ। Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогенным грибком कोलेटोट्राइकम ल्यूपिनी (बॉन्डार) निरेनबर्ग, फीलर और हेगेडोर्न13. ल्यूपिन किसानों और प्रजनकों के लिए सबसे उल्लेखनीय रोगजनक कवक कोलेटोट्रिचम ल्यूपिनी (बोंडर) निरेनबर्ग, फीलर और हेगेडोर्न13 के कारण होने वाले एंथ्रेक्नोज़ का उद्भव था।अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए, कोलेटोट्राइकम ल्यूपिनी के बारे में अधिक जानकारी प्राप्त करें। (बॉन्डर) निरेनबर्ग, फीलर और हेजडोर्न13 वर्ष।अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए, कोलेटोट्राइकम ल्यूपिनी के बारे में अधिक जानकारी प्राप्त करें। (बोंडर)嵵बालों वाला。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (बोंडर) निरेनबर्ग, फीलर और हेगेडॉर्न13. ल्यूपिन किसानों और प्रजनकों के लिए सबसे चौंकाने वाली बात रोगजनक कवक कोलेटोट्रिचम ल्यूपिनी (बोंडर) निरेनबर्ग, फीलर और हेगेडॉर्न13 के कारण होने वाले एंथ्रेक्नोज़ का उभरना है।इस बीमारी की सबसे पहली रिपोर्ट ब्राजील और संयुक्त राज्य अमेरिका से आई थी, जिसके विशिष्ट लक्षण क्रमशः 1912 और 1929 में दिखाई दिए थे। हालांकि, लगभग 30 वर्षों के बाद, इस रोगजनक को Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. के रूप में नामित किया गया था। & Sacc., टेलीमॉर्फ Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., टेलीमॉर्फ Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. और सैक., टेलेमोमोरोप ग्लोमेरेला सिंगुलाटा (स्टोनमैन) स्पाउल्ड। & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld का टेलीमॉर्फ। और Sacc., मैं एक विशेषज्ञ के रूप में काम करता हूं ग्लोमेरेला सिंगुलाटा (स्टोनमैन) स्पाउल्ड。 और Sacc., मैं एक विशेषज्ञ के रूप में काम करता हूं ग्लोमेरेला सिंगुलाटा (स्टोनमैन) स्पाउल्ड。 और सैक., ग्लोमेरेला सिंगुलाटा (स्टोनमैन) स्पाउल्ड और सेलेनापोलोमोग्राफ़ी। & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in Targeted Morphology. और एच. श्रेन्क,. और एच. श्रेन्क, .और एच. श्रेन्क। और एच. 施伦克,。 और एच. 施伦克,。और एच. श्लेन्क, .20वीं शताब्दी के मध्य में किए गए प्रारंभिक रोग फेनोटाइपिंग से एनएलएल और पीले ल्यूपिन (एल. ल्यूटियस एल.) किस्मों में कुछ प्रतिरोधकता दिखाई दी, लेकिन परीक्षण की गई सभी सफेद ल्यूपिन (एल. एल्बस एल.) किस्में अत्यधिक संवेदनशील थीं15,16। अध्ययनों से पता चला है कि एंथ्रेक्नोज़ का विकास बढ़ी हुई वर्षा (वायु आर्द्रता) और तापमान (12-28 डिग्री सेल्सियस की सीमा में) से जुड़ा है, जिससे उच्च तापमान पर प्रतिरोधकता का उल्लंघन होता है17, 18। वास्तव में, उच्च आर्द्रता की स्थिति में 24 डिग्री सेल्सियस (4 घंटे) पर कोनिडिया के अंकुरण और रोग की शुरुआत के लिए आवश्यक समय 12 डिग्री सेल्सियस (16 घंटे) की तुलना में चार गुना कम था19। इस प्रकार, चल रहे वैश्विक तापवृद्धि ने एंथ्रेक्नोज़ के प्रसार को बढ़ावा दिया है। हालाँकि, फ्रांस (1982) और यूक्रेन (1983) में इस बीमारी को एक आसन्न खतरे के संकेत के रूप में देखा गया था, लेकिन उस समय ल्यूपिन उद्योग द्वारा इसे स्पष्ट रूप से अनदेखा कर दिया गया था20,21। कुछ वर्षों बाद, यह विनाशकारी बीमारी पूरी दुनिया में फैल गई और ऑस्ट्रेलिया, पोलैंड और जर्मनी जैसे प्रमुख ल्यूपिन उत्पादक देशों को भी प्रभावित किया22,23,24। 1990 के दशक के मध्य में एंथ्रेक्नोज़ के प्रकोप के बाद, व्यापक जांच के परिणामस्वरूप NLL19 नमूनों में कई प्रतिरोधी दाताओं की पहचान हुई। एंथ्रेक्नोज़ के प्रति NLL प्रतिरोध दो अलग-अलग प्रभावी एलील्स द्वारा नियंत्रित होता है जो विभिन्न जर्मप्लाज्म स्रोतों में पाए जाते हैं: कल्टीवार तंजिल और वोंगा में Lanr1 और कल्टीवार मंडले में AnMan25,26। ये एलील्स आणविक मार्करों के पूरक हैं जो प्रजनन कार्यक्रमों में प्रतिरोधी जर्मप्लाज्म के चयन में सहायता करते हैं25,26,27,28,29,30। Lanr1 एलील युक्त प्रतिरोधी प्रजनन लाइन 83A:476 को संवेदनशील जंगली लाइन P27255 के साथ संकरणित किया गया, जिससे एंथ्रेक्नोज़ प्रतिरोध के लिए पृथक RIL आबादी प्राप्त हुई। इससे Lanr1 लोकस को गुणसूत्र NLL-1131, 32, 33 पर निर्धारित करना संभव हुआ। एंथ्रेक्नोज़ के लिए आसन्न प्रतिरोध लोकस से लिंकेज मैप मार्करों का जीनोमिक फ्रेमवर्क, NLL के साथ संरेखण करने पर तीनों एलील्स एक ही गुणसूत्र (NLL-11) पर, लेकिन अलग-अलग स्थानों पर स्थित पाए गए29,34,35। हालांकि, RIL की कम संख्या और मार्करों और संबंधित एलील्स के बीच अधिक आनुवंशिक दूरी के कारण, उनके अंतर्निहित जीनों के बारे में कोई विश्वसनीय निष्कर्ष नहीं निकाला जा सकता है। दूसरी ओर, ल्यूपिन में रिवर्स जेनेटिक्स का उपयोग करना मुश्किल है क्योंकि उनकी पुनर्जनन क्षमता बहुत कम होती है, जिससे आनुवंशिक हेरफेर जटिल हो जाता है37।
समरूप अवस्था में वांछित एलील वाले पालतू जर्मप्लाज्म का विकास, जैसे कि 83A:476 (Lanr1) और Mandelup (AnMan), ने जंगली आबादी में एलील के विपरीत संयोजनों की उपस्थिति में एंथ्रेक्नोज प्रतिरोध के अध्ययन का द्वार खोल दिया है। आणविक तंत्र की संभावनाओं का पता लगाया गया है। विशिष्ट जीनोटाइप द्वारा उत्पन्न रक्षा प्रतिक्रियाओं की तुलना की गई है। इस अध्ययन में C. lupini टीकाकरण के प्रति NLL की प्रारंभिक ट्रांसक्रिप्टोम प्रतिक्रिया का मूल्यांकन किया गया। सबसे पहले, 215 लाइनों वाले एक यूरोपीय NLL जर्मप्लाज्म पैनल को Lanr1 और AnMan एलील को चिह्नित करने वाले आणविक मार्करों का उपयोग करके जांचा गया। इसके बाद, आणविक मार्करों के लिए पहले से चयनित 50 NLL लाइनों पर नियंत्रित परिस्थितियों में एंथ्रेक्नोज फेनोटाइपिंग की गई। इन प्रयोगों के आधार पर, एंथ्रेक्नोज प्रतिरोध और लैनर1/एनमैन एलीलिक संरचना में भिन्न चार लाइनों को दो पूरक दृष्टिकोणों का उपयोग करके विभेदक रक्षा जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग के लिए चुना गया: उच्च-थ्रूपुट आरएनए अनुक्रमण और वास्तविक समय पीसीआर मात्रा निर्धारण।
लैनर1 (एनसेक3 और एनसेक4) और एनमैन (एनसेक4) और एनमैन (एनमैनएम1) मार्करों के साथ एनएलएल जर्मप्लाज्म (एन = 215) के एक सेट की स्क्रीनिंग से पता चला कि केवल एक लाइन (95726, सलामांका-बी के पास) सभी मार्करों के लिए "प्रतिरोध" एलील को प्रवर्धित करती है, जबकि "संवेदनशील" एलील्स की उपस्थिति 158 (~73.5%) लाइनों में सभी मार्करों का अनुपात दर्शाती है। तेरह लाइनों ने लैनर1 मार्कर के दो "प्रतिरोधी" एलील्स उत्पन्न किए, और 8 लाइनों ने लैनर1 मार्कर के "प्रतिरोधी" एलील्स उत्पन्न किए। एनमैन मार्कर का "प्रतिरोध" एलील (पूरक तालिका S1)। दो लाइनें एनसेक3 मार्कर के लिए विषमयुग्मजी थीं और एक एनमैनएम1 मार्कर के लिए विषमयुग्मजी थी। 42 पंक्तियों (19.5%) में Anseq3 और Anseq4 एलील्स के विपरीत चरण पाए गए, जो इन दोनों लोकी के बीच पुनर्संयोजन की उच्च आवृत्ति को दर्शाते हैं। नियंत्रित परिस्थितियों में एंथ्रेक्नोज़ फेनोटाइप (पूरक तालिका S2) ने परीक्षण किए गए जीनोटाइपों के प्रतिरोध में भिन्नता प्रकट की, जो एंथ्रेक्नोज़ की गंभीरता में परिलक्षित हुई। औसत स्कोर में अंतर 1.8 (मध्यम रूप से प्रतिरोधी) से 6.9 (संवेदनशील) तक था और पौधे के वजन में अंतर 0.62 (संवेदनशील) से 4.45 ग्राम (प्रतिरोधी) तक था। प्रयोग के दो दोहरावों में देखे गए मूल्यों (रोग की गंभीरता स्कोर के लिए 0.51, P = 0.00017 और पौधे के वजन के लिए 0.61, P < 0.0001) के साथ-साथ इन दो मापदंडों (− 0.59 और − 0.77, P < 0.0001) के बीच एक महत्वपूर्ण सहसंबंध था। प्रयोग के दो दोहरावों में देखे गए मूल्यों के बीच (रोग की गंभीरता स्कोर के लिए 0.51, P = 0.00017 और पौधे के वजन के लिए 0.61, P < 0.0001) साथ ही इन दो मापदंडों के बीच (-0.59 और -0.77, P < 0.0001) एक महत्वपूर्ण सहसंबंध था। Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). प्रयोग के दो पुनरावृत्तियों में देखे गए मूल्यों के बीच (रोग की गंभीरता स्कोर के लिए 0.51, P = 0.00017 और पौधे के वजन के लिए 0.61, P < 0.0001) साथ ही इन दो मापदंडों के बीच (- 0.59 और -0.77, P < 0.0001) एक महत्वपूर्ण सहसंबंध पाया गया।0.51，पी = 0.00017，植物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P < 0.0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为0.51, पी = 0.00017, अधिकतम 0.61, पी <0.0001 0.59 और– 0.59 和– 0.59 和- 0.77，पी < 0.0001)。 Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 और масса растения 0,61, P <0,0001), और и между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001. दो बार देखे गए मूल्यों (रोग गंभीरता स्कोर 0.51, P = 0.00017 और पौधे का वजन 0.61, P < 0.0001) और इन दो मापदंडों (-0.59 और -0.0001) के बीच 0.77, P<0.0001 का महत्वपूर्ण सहसंबंध था। ).संवेदनशील पौधों में देखे जाने वाले विशिष्ट लक्षणों में तने का मुड़ना और टेढ़ा होना शामिल है, जो "चरवाहे के धनुष" जैसी संरचना का रूप धारण कर लेता है, जिसके बाद नारंगी/गुलाबी स्पोरोज़ोइट्स वाले अंडाकार घाव दिखाई देते हैं (पूरक चित्र 1)। ऑस्ट्रेलियाई किस्में जिनमें Lanr1 (83A:476 और तंजिल) और AnMan (मैंडेलुप) जीन मौजूद हैं, मध्यम रूप से प्रतिरोधी हैं (0.0331 और 0.0036)। कुछ किस्में जिनमें "प्रतिरोधी" Lanr1 और/या AnMan एलील भी मौजूद हैं, उनमें भी रोग के लक्षण दिखाई देते हैं।
दिलचस्प बात यह है कि कुछ एनएलएल लाइनें जिनमें कोई "प्रतिरोधी" मार्कर एलील नहीं था, उनमें एंथ्रेक्नोज प्रतिरोध का उच्च स्तर पाया गया (जो लैनर1 या एनमैन जीनोटाइप के बराबर या उससे अधिक था), जैसे कि बोरेगिन (दोनों मापदंडों के लिए पी मान < 0.0001), बोजार (स्कोर के लिए पी मान < 0.0001 और पौधे के वजन के लिए 0.001) और पॉपुलेशन बी-549/79बी (स्कोर के लिए पी मान < 0.0001 और वजन के लिए गैर-महत्वपूर्ण)। दिलचस्प बात यह है कि कुछ एनएलएल लाइनें जिनमें कोई "प्रतिरोधी" मार्कर एलील नहीं था, उनमें एंथ्रेक्नोज प्रतिरोध का उच्च स्तर पाया गया (जो लैनर1 या एनमैन जीनोटाइप के बराबर या उससे अधिक था), जैसे कि बोरेगिन (दोनों मापदंडों के लिए पी मान < 0.0001), बोजार (स्कोर के लिए पी मान < 0.0001 और पौधे के वजन के लिए 0.001) और पॉपुलेशन बी-549/79बी (स्कोर के लिए पी मान < 0.0001 और वजन के लिए गैर-महत्वपूर्ण)। अन्य, यह एनएलएल का एक छोटा सा टुकड़ा है, जो कि "резистентного" है маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P <0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). दिलचस्प बात यह है कि कई एनएलएल लाइनें जिनमें कोई 'प्रतिरोधी' मार्कर एलील नहीं था, उन्होंने एंथ्रेक्नोज के प्रति उच्च स्तर का प्रतिरोध दिखाया (जो लैनर1 या एनमैन जीनोटाइप के बराबर या उससे अधिक था), जैसे कि बोरेगिन (दोनों मापदंडों के लिए पी मान < 0.0001), बोजार (मूल्यांकन के लिए पी मान < 0.0001 और पौधे के वजन के लिए 0.001) और जनसंख्या बी-549/79बी (मूल्यांकन के लिए पी मान < 0.0001 और वजन के लिए महत्वपूर्ण नहीं)।अधिक पढ़ें或AnMan 基因型相当或更高）,例如Boregine（两个参数的P 值<0.0001）,Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值<0.0001，重量不显着）。 यह दिलचस्प है कि कुछ एनएलएल प्रणालियाँ जिनमें कोई "एंटीजेनिक" मार्कर नहीं होते हैं, उच्च क्षैतिज प्रतिरोध (लानर1 या एनमैन जीन के बराबर या उससे अधिक) दिखाती हैं, जैसे कि बोरेगिन (दोनों पैरामीटर पी < 0.0001), बोजार (पी मान < 0.0001, पौधे का वजन 0.001) और स्ट्रेन बी-549/79बी (पी मान < 0.0001, वजन महत्वपूर्ण नहीं)। अन्यथा, यह एनएलएल नहीं है, मुझे नहीं पता कि क्या हुआ алелей «резистентности», показали высокие уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 या AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), बोजर (значение P <0,0001, масса растения 0,001) और и популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). दिलचस्प बात यह है कि कुछ एनएलएल लाइनें जिनमें कोई 'प्रतिरोध' मार्कर एलील नहीं थे, उनमें एंथ्रेक्नोज प्रतिरोध का उच्च स्तर (लानर1 या एनमैन जीनोटाइप के बराबर या उससे अधिक) देखा गया, जैसे कि बोरेगिन (दोनों मापदंडों के लिए पी मान <0.0001), बोजार (पी-मान < 0.0001, पौधे का वजन 0.001) और जनसंख्या बी-549/79बी (पी-मान < 0.0001, वजन महत्वपूर्ण नहीं)।यह घटना प्रतिरोध के एक नए आनुवंशिक स्रोत की संभावना को दर्शाती है, जो मार्कर जीनोटाइप और रोग फेनोटाइप के बीच सहसंबंध की कमी (पी मान लगभग 0.42 से 0.98 तक) की व्याख्या करती है। इस प्रकार, कोल्मोगोरोव-स्मिरनोव परीक्षण से पता चला कि एंथ्रेक्नोज प्रतिरोध पर डेटा स्कोर (पी मान 0.25 और 0.11) और पौधे के द्रव्यमान (पी मान 0.47 और 0.55) के लिए लगभग सामान्य रूप से वितरित था, जिससे यह अनुमान लगाया जा सकता है कि Lanr1 और AnMan के अलावा अन्य एलील भी शामिल हैं।
एंथ्रेक्नोज़ प्रतिरोध स्क्रीनिंग के परिणामों के आधार पर, ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण के लिए 4 लाइनें चुनी गईं: 83A:476, बोरेगिन, मैंडेलुप और पॉपुलेशन 22660। इन लाइनों का आरएनए अनुक्रमण द्वारा टीकाकरण प्रयोगों में एंथ्रेक्स प्रतिरोध के लिए पुनः परीक्षण किया गया, बशर्ते कि वे पिछले परीक्षण के समान हों। स्कोर मान इस प्रकार थे: बोरेगिन (1.71 ± 1.39), 83A:476 (2.09 ± 1.38), मैंडेलुप (3.82 ± 1.42) और पॉपुलेशन 22660 (6.11 ± 1.29)।
इलुमिना नोवासेक 6000 प्रोटोकॉल ने प्रति नमूना औसतन 40.5 एमरीड जोड़े (29.7 से 54.4 एमरीड) प्राप्त किए (पूरक तालिका S3)। संदर्भ अनुक्रम में संरेखण स्कोर 75.5% से 88.6% तक रहा। जैविक प्रतिकृतियों के बीच प्रायोगिक वेरिएंट के रीड काउंट डेटा का औसत सहसंबंध 0.812 से 0.997 (औसत 0.959) तक रहा। विश्लेषण किए गए 35,170 जीनों में से 2917 में कोई अभिव्यक्ति नहीं पाई गई, और अन्य 4785 जीन नगण्य स्तर पर व्यक्त किए गए (आधार माध्य < 5)। विश्लेषण किए गए 35,170 जीनों में से 2917 में कोई अभिव्यक्ति नहीं पाई गई, और अन्य 4785 जीन नगण्य स्तर पर व्यक्त किए गए (आधार माध्य < 5)। Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5). विश्लेषण किए गए 35,170 जीनों में से 2917 में कोई अभिव्यक्ति नहीं दिखी, और शेष 4785 जीन नगण्य स्तर पर व्यक्त किए गए (आधार माध्य <5)।35,170 से अधिक लोग, 2917 से अधिक लोग, 4785 से अधिक लोग个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35,170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительную экспрессию (базовое среднее значение <5). विश्लेषण किए गए 35,170 जीनों में से 2917 जीन व्यक्त नहीं हुए और शेष 4785 जीनों की अभिव्यक्ति नगण्य थी (आधार माध्य <5)।इस प्रकार, प्रयोग के दौरान अभिव्यक्त माने जाने वाले जीनों की संख्या (आधार माध्य ≥ 5) 27,468 (78.1%) थी (पूरक तालिका S4)।
पहले समय बिंदु से ही, सभी NLL लाइनों ने C. lupini (स्ट्रेन Col-08) के इनोक्यूलेशन पर ट्रांसक्रिप्टोम रीप्रोग्रामिंग द्वारा प्रतिक्रिया दी (तालिका 1), हालांकि, लाइनों के बीच महत्वपूर्ण अंतर देखे गए। इस प्रकार, प्रतिरोधक लाइन 83A:476 (जिसमें Lanr1 जीन है) ने पहले समय बिंदु (6 hpi) पर महत्वपूर्ण ट्रांसक्रिप्टोम रीप्रोग्रामिंग दिखाई, जिसमें इस समय बिंदु पर अन्य समय बिंदुओं की तुलना में पृथक अप- और डाउन-जीन की संख्या में 31-69 गुना वृद्धि हुई। इसके अलावा, यह चरम अल्पकालिक था, क्योंकि दूसरे समय बिंदु (12 hpi) पर केवल कुछ जीनों की अभिव्यक्ति में ही महत्वपूर्ण परिवर्तन देखा गया। दिलचस्प बात यह है कि बोरेगिन, जिसने ग्राफ्ट परीक्षण में भी उच्च स्तर का प्रतिरोध दिखाया, प्रयोग के दौरान इस तरह की व्यापक ट्रांसक्रिप्शनल रीप्रोग्रामिंग से नहीं गुजरी। हालांकि, 12 hpi पर बोरेगिन और 83A:476 के लिए विभेदक रूप से व्यक्त जीनों (DEG) की संख्या समान थी। मैंडेलुप और जनसंख्या 22660 दोनों ने अंतिम समय बिंदु (48 एल/सेकंड) पर डीईजी शिखर दिखाया, जो रक्षा प्रतिक्रियाओं में सापेक्षिक देरी का संकेत देता है।
क्योंकि 83A:476 में अन्य सभी लाइनों की तुलना में 6 HPI पर C. lupini के प्रति प्रतिक्रिया में व्यापक ट्रांसक्रिप्टोम रीप्रोग्रामिंग हुई, इसलिए इस समय बिंदु पर देखे गए लगभग 91% DEGs वंश-विशिष्ट थे (चित्र 1)। हालांकि, अध्ययन लाइनों के बीच प्रारंभिक प्रतिक्रियाओं में कुछ ओवरलैप था, क्योंकि बोरेगिन, मैंडेलुप और जनसंख्या 22660 में क्रमशः 68.5%, 50.9% और 52.6% DEGs, 83A:476 में पाए गए DEGs के साथ कुछ समय बिंदुओं पर ओवरलैप करते थे। हालांकि, ये DEGs, 83A:476 का उपयोग करके वर्तमान में पता लगाए गए सभी DEGs का केवल एक छोटा सा अंश (0.97–1.70%) थे। इसके अतिरिक्त, सभी लाइनों से 11 डीईजी इस समय सुसंगत थे (पूरक सारणी एस4-एस6), जिनमें पादप रक्षा प्रतिक्रियाओं के सामान्य घटक शामिल हैं: लिपिड स्थानांतरण प्रोटीन (TanjilG_32225), एंडोग्लूकन-1,3-β-ग्लूकोसाइड एंजाइम (TanjilG_23384), दो तनाव-प्रेरित प्रोटीन जैसे SAM22 (TanjilG_31528 और TanjilG_31531), बेसिक लेटेक्स प्रोटीन (TanjilG_32352), और दो ग्लाइसिन-समृद्ध संरचनात्मक कोशिका भित्ति प्रोटीन (TanjilG_19701 और TanjilG_19702)। 24 HPI पर 83A:476 और बोरेगिन के बीच (कुल 16-38% DEG) और 48 HPI पर मैंडेलुप और पॉपुलेशन 22660 के बीच (कुल 14-20% DEG) ट्रांसक्रिप्टोम प्रतिक्रियाओं में अपेक्षाकृत उच्च ओवरलैप भी था।
यह वेन आरेख संकीर्ण पत्ती वाले ल्यूपिन (NLL) की उन किस्मों में विभेदक रूप से अभिव्यक्त जीनों (DEG) की संख्या को दर्शाता है जिन्हें कोलेटोट्रिचम ल्यूपिनी (स्ट्रेन Col-08, जो 1999 में पोलैंड के विएरज़ेनिस में ल्यूपिन के खेतों से प्राप्त किया गया था) से प्रतिरक्षित किया गया था। विश्लेषण की गई NLL किस्में थीं: 83A:476 (प्रतिरोधी, जिसमें Lanr1 एलील मौजूद है), बोरेगिन (प्रतिरोधी, आनुवंशिक पृष्ठभूमि अज्ञात), मैंडेलुप (मध्यम रूप से प्रतिरोधी, जिसमें AnMan एलील मौजूद है) और पॉपुलेशन 22660 (अत्यधिक संवेदनशील)। hpi का संक्षिप्त रूप टीकाकरण के बाद के घंटों को दर्शाता है। ग्राफ को सरल बनाने के लिए शून्य मानों को हटा दिया गया है।
6 एचपीआई पर अतिव्यक्त जीनों के समूह का विश्लेषण मानक आर जीन डोमेन की उपस्थिति के लिए किया गया (पूरक तालिका एस7)। इस अध्ययन से पता चला कि केवल 83ए:476 पर एनबीएस-एलआरआर डोमेन वाले क्लासिक रोग प्रतिरोधक जीनों का ट्रांसक्रिप्टोम प्रेरण होता है। इस समूह में एक टीआईआर-एनबीएस-एलआरआर जीन (tanjilg_05042), पांच सीसी-एनबीएस-एलआरआर जीन (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 और tanjilg_16162), और चार एनबीएस-एलआर (tanjilg_16162), चार एनबीएस-एलआरआरई (tanjilg_16162), साथ ही चार एनबीएस-एलआरआर (tanjilg_16162) और चार एनबीएस-एलआरआर (TANJILG_16162) शामिल थे। इन सभी जीनों में संरक्षित अनुक्रमों में व्यवस्थित मानक डोमेन होते हैं। एनबीएस-एलआरआर डोमेन जीनों के अलावा, कई आरएलएल किनेसेस 6 एचपीआई पर सक्रिय हुए, जिनमें से एक बोरेगिन (तंजिलजी_19877) में, दो मंडेलुप (तंजिलजी_07141 और तंजिलजी_19877) में, दो जनसंख्या 22660 (तंजिलजी_09014 और तंजिलजी_10361) में और दो 83ए 27:476 में पाए गए।
सी. लुपिनी (स्ट्रेन कोल-08) के साथ टीकाकरण के जवाब में अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित जीन को जीन ओन्टोलॉजी (जीओ) संवर्धन विश्लेषण के अधीन किया गया (पूरक तालिका एस8)। सबसे अधिक बार अतिप्रतिनिधित्व वाला जैविक प्रक्रिया शब्द "GO:0006952 रक्षा प्रतिक्रिया" था, जो उच्च महत्व (पी मान < 0.001) के साथ 16 (समय × लाइन) संयोजनों में से 6 में दिखाई दिया (चित्र 2)। सबसे अधिक बार अतिप्रतिनिधित्व वाला जैविक प्रक्रिया शब्द "GO:0006952 रक्षा प्रतिक्रिया" था, जो उच्च महत्व (पी मान < 0.001) के साथ 16 (समय × लाइन) संयोजनों में से 6 में दिखाई दिया (चित्र 2)। नया क्या है процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся в 6 वर्ष 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). सबसे अधिक बार अतिप्रतिनिधित्व वाला जैविक प्रक्रिया शब्द 'GO:0006952 रक्षा प्रतिक्रिया' था, जो उच्च महत्व (पी मान < 0.001) के साथ 16 (समय × वंश) संयोजनों में से 6 में दिखाई दिया (चित्र 2)।最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性(P 值< 0.001）（图2）). सबसे प्रतिनिधि जैविक प्रक्रिया शब्द “GO:0006952 रक्षा प्रतिक्रिया” है, जो 16 (समय × रेखा) संयोजनों में से 6 में उच्च महत्व (पी मान < 0.001) (चित्र 2) के साथ दिखाई देता है। नया क्या है "GO: 0006952 डिफेंस रिस्पांस", 6 से 16 जनवरी तक पोस्ट किया गया (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). सबसे अधिक बार अतिप्रतिनिधित्व वाला जैविक प्रक्रिया शब्द 'GO:0006952 रक्षा प्रतिक्रिया' था, जो उच्च महत्व (पी मान < 0.001) के साथ 16 संयोजनों (समय × रेखा) में से 6 में दिखाई दिया (चित्र 2)।यह शब्द 83A:476 और बोरेगिन (6 और 24 hpi) में दो समय बिंदुओं पर और मैंडेलुप और पॉपुलेशन 22660 (क्रमशः 12 और 6 hpi) में एक समय बिंदु पर अधिक मात्रा में पाया गया। यह एक अपेक्षित परिणाम है, जो प्रतिरोधी किस्मों की कवकरोधी प्रतिक्रिया को दर्शाता है। इसके अतिरिक्त, 83A:476 ने C. lupini के प्रति प्रतिक्रिया करते हुए "GO:0055114 रेडॉक्स प्रक्रिया" शब्द द्वारा दर्शाए गए ऑक्सीडेटिव बर्स्ट से संबंधित जीनों को तेजी से प्रेरित किया, जो एक विशिष्ट रक्षा प्रतिक्रिया को इंगित करता है, जबकि बोरेगिन ने 'GO' शब्द से संबंधित विशिष्ट रक्षा प्रतिक्रियाएं प्रदर्शित कीं। :0006950 तनाव प्रतिक्रिया”। जनसंख्या 22660 ने द्वितीयक मेटाबोलाइट्स से जुड़े क्षैतिज प्रतिरोध प्रतिक्रिया को सक्रिय किया, जिसमें “GO:0016104 ट्राइटरपीन जैवसंश्लेषण की प्रक्रिया” और “GO:0006722 ट्राइटरपीन चयापचय की प्रक्रिया” (दोनों शब्द जीन के एक ही समूह से संबंधित हैं) की अत्यधिक संख्या को उजागर किया गया। GO शब्द संवर्धन विश्लेषण के परिणामों को ध्यान में रखते हुए, मैंडेलुप प्रतिक्रिया स्थिरता बोरेगिन और जनसंख्या 22660 के बीच थी। इसके अतिरिक्त, प्रारंभिक प्रतिक्रिया 83A:476 (6 hpi) और विलंबित प्रतिक्रिया मैंडेलुप और जनसंख्या 22660 में GO:0015979 'प्रकाश संश्लेषण' और अन्य संबंधित जैविक प्रक्रियाएं शामिल हैं।
एंथ्रेक्स ल्यूपिन (1999 में पोलैंड के विएरज़ेनिस में ल्यूपिन के खेतों से प्राप्त कोल-08 स्ट्रेन) से संक्रमित संकीर्ण पत्ती वाले ल्यूपिन (एनएलएल) के ट्रांसक्रिप्टोम प्रतिक्रियाओं के दौरान विभेदक रूप से व्यक्त जीन के एनोटेशन में चयनित जैवप्रक्रिया जीन ऑन्टोलॉजी शब्द अत्यधिक अतिरंजित हैं। विश्लेषण की गई एनएलएल लाइनें थीं: 83ए:476 (प्रतिरोधी, समरूप लैनर1 एलील युक्त), बोरेगिन (प्रतिरोधी, अज्ञात आनुवंशिक पृष्ठभूमि), मंडेलुप (मध्यम रूप से प्रतिरोधी, समरूप एनमैन एलील युक्त) और जनसंख्या 22660 (संवेदनशील)।
क्योंकि इस अध्ययन का उद्देश्य एंथ्रेक्नोज़ प्रतिरोध में योगदान देने वाले जीनों की पहचान करना था, इसलिए "GO: 0006952 रक्षात्मक प्रतिक्रियाएँ" और "GO: 0055114 रेडॉक्स प्रक्रियाएँ" श्रेणियों में वर्गीकृत जीनों का विश्लेषण कट-ऑफ के आधार पर किया गया, जिसमें कम से कम एक पंक्ति में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण लॉग2 (फोल्ड परिवर्तन) मानों को मिलाकर ≥ 30 का औसत लिया गया। इन मानदंडों को पूरा करने वाले जीनों की संख्या GO:0006952 के लिए 65 और GO:0055114 के लिए 524 थी।
83A:476 ने GO:0006952 शब्द से चिह्नित दो DEG शिखरों का खुलासा किया, पहला 6 जीन प्रति इंच (64 जीन, अप और डाउन रेगुलेशन) पर और दूसरा 24 जीन प्रति इंच (15 जीन, केवल अप रेगुलेशन) पर। बोरेगिन ने यह भी दिखाया कि GO:0006952 उसी समय बिंदु पर चरम पर था, लेकिन कम DEG (11 और 8) और अधिमान्य सक्रियण के साथ। मैंडेलूप ने 12 और 48 HPI पर GO:0006952 के दो शिखर दिखाए, दोनों में 12 जीन थे (पहले में सक्रिय जीन और दूसरे में केवल दमनकारी जीन), जबकि 6 HPI (13 जीन) पर 22660 आबादी में वृद्धि शिखर की अधिक प्रधानता थी। यह ध्यान देने योग्य है कि इन पीक्स में GO:0006952 DEG के 96.4% में एक ही प्रकार की प्रतिक्रिया (ऊपर या नीचे) थी, जो शामिल जीनों की संख्या में अंतर के बावजूद रक्षा प्रतिक्रियाओं में महत्वपूर्ण ओवरलैप को दर्शाती है। GO:0006952 शब्द से संबंधित अनुक्रमों का सबसे बड़ा समूह स्टार्वेशन स्ट्रेस-एसोसिएटेड मैसेज प्रोटीन 22 (SAM22-लाइक) को एनकोड करता है, जो क्लास 10 पैथोजेनेसिस-एसोसिएटेड प्रोटीन (PR-10) प्रोटीन क्लेड और कोर प्रोटीन लेटेक्स (MLP-लाइक) प्रोटीन से संबंधित है (चित्र 3)। दोनों समूहों में अभिव्यक्ति की प्रकृति और प्रतिक्रिया की दिशा में अंतर था। SAM22-लाइक प्रोटीन को एनकोड करने वाले जीनों ने प्रारंभिक समय बिंदुओं (6 या 12 hpi) पर लगातार और महत्वपूर्ण प्रेरण दिखाया और प्रयोग के अंत (48 hpi) पर आम तौर पर अनुत्तरदायी थे, जबकि MLP-लाइक प्रोटीन ने 6 hpi पर समन्वय दिखाया। 83A:476 और मैंडेलुप में 48 hp/in पर, लगभग अन्य सभी डेटा बिंदु अनुक्रियाहीन थे। इसके अतिरिक्त, SAM22-जैसे प्रोटीन जीन के अभिव्यक्ति प्रोफाइल में अंतर एंथ्रेक्नोज़ प्रतिरोध में देखी गई परिवर्तनशीलता के अनुरूप थे, क्योंकि अधिक प्रतिरोधी लाइनों में अधिक संवेदनशील जीनों की तुलना में इन जीनों को महत्वपूर्ण रूप से प्रेरित करने वाले समय बिंदु अधिक थे। एक अन्य LlR18A/B-जैसे PR-10 जीन ने SAM22-जैसे प्रोटीन जीन के समान ही अभिव्यक्ति पैटर्न दिखाया।
जैविक प्रक्रिया "GO:0006952 रक्षा प्रतिक्रिया" के मुख्य घटकों और Lanr1 और AnMan एलील्स के उम्मीदवार जीनों के अभिव्यक्ति पैटर्न की पहचान की गई। लॉग2 स्केल एक ही समय बिंदु पर टीका लगाए गए (कोलेटोट्रिचम लुपिनी, स्ट्रेन Col-08, लुपिन के खेतों से प्राप्त, विज़ेनिका, पोलैंड, 1999) और नियंत्रण (नकली टीका लगाए गए) पौधों के बीच लॉग2 मान (फोल्ड परिवर्तन) को दर्शाता है। निम्नलिखित संकीर्ण पत्ती वाले लुपिन की किस्मों का विश्लेषण किया गया: 83A:476 (प्रतिरोधी, समरूप Lanr1 एलील युक्त), बोरेगिन (प्रतिरोधी, आनुवंशिक पृष्ठभूमि अज्ञात), मैंडेलुप (मध्यम प्रतिरोधी, समरूप AnMan एलील युक्त), और पॉपुलेशन 22660 (संवेदनशील)।
इसके अतिरिक्त, RNA-seq उम्मीदवार जीन Lanr1 (TanjilG_05042) और AnMan (TanjilG_12861) के अभिव्यक्ति प्रोफाइल का मूल्यांकन किया गया (चित्र 3)। TanjilG_05042 जीन ने केवल पहले समय बिंदु (6 hpi) पर 83A:476 पर महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया (सक्रियण) दिखाई, जबकि TanjilG_12861 केवल दो समय बिंदुओं पर ही Mandeloop में महत्वपूर्ण था: 6 hpi (डाउन रेगुलेशन) और 24 hpi (6 hpi)।
GO:0055114 “रेडॉक्स प्रक्रिया” श्रेणी में सबसे अधिक अतिव्यक्त जीन साइटोक्रोम P450 प्रोटीन और पेरोक्सीडेज़ को एन्कोड करने वाले जीन थे (चित्र 4)। 6 HPI पर 83A:476 से पृथक किए गए नमूनों के लिए, टीकाकृत और नियंत्रण पौधों के बीच अधिकतम या न्यूनतम लॉग2 (फोल्ड परिवर्तन) मान (86.6% जीनों के लिए) सामान्यतः देखे गए, जो इस जीनोटाइप की टीका लगाने के प्रति उच्च प्रतिक्रिया को उजागर करते हैं। 83A:476 ने 6 hpi पर सबसे महत्वपूर्ण GO:0055114 DEG (503 जीन) दिखाया, जबकि शेष लाइनें 48 hpi पर (बोरेगिन, 31 जीन; मैंडेलुप, 85 जीन; और पॉपुलेशन 22660, 78 जीन) थीं। GO:0055114 परिवार के अधिकांश जीनों में, टीकाकरण के प्रति दो प्रकार की प्रतिक्रियाएँ (सक्रियण और अवरोध) देखी गईं। दिलचस्प बात यह है कि 48 एचपी पर मैंडेलूप में GO: 0055114 शब्द के लिए पहचाने गए DEGs में से 97.6% तक 83A:476 की प्रारंभिक प्रतिक्रिया के समान हैं। ये अवलोकन बताते हैं कि, काफी छोटे पैमाने (अर्थात, उत्परिवर्तित रेडॉक्स जीनों की संख्या, 85 बनाम 503) के बावजूद, एंथ्रेक्नोज के प्रति मैंडेलूप की विलंबित ट्रांसक्रिप्टोम प्रतिक्रियाओं का पैटर्न 83A:476 की प्रारंभिक प्रतिक्रिया के समान है। बोरेगिन और पॉपुलेशन 22660 में, यह अभिसरण क्रमशः 51.6% और 75.6% कम है।
जैविक प्रक्रिया “GO:0055114 रेडॉक्स प्रक्रिया” के मुख्य घटकों की अभिव्यक्ति के पैटर्न का पता लगाया गया। लॉग2 स्केल, एक ही समय बिंदु पर टीका लगाए गए (कोलेटोट्रिचम लुपिनी, स्ट्रेन कोल-08, लुपिन के खेतों से प्राप्त, विज़ेनिका, पोलैंड, 1999) और नियंत्रण (नकली टीका लगाए गए) पौधों के बीच लॉग2 मान (गुना परिवर्तन) को दर्शाता है। निम्नलिखित संकीर्ण पत्ती वाले लुपिन की किस्मों का विश्लेषण किया गया: 83A:476 (प्रतिरोधी, समरूप Lanr1 एलील युक्त), बोरेगिन (प्रतिरोधी, आनुवंशिक पृष्ठभूमि अज्ञात), मैंडेलुप (मध्यम प्रतिरोधी, समरूप AnMan एलील युक्त), और पॉपुलेशन 22660 (संवेदनशील)।
83A:476 C. lupini (स्ट्रेन Col-08) के साथ टीकाकरण के लिए ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रतिक्रियाओं में GO:0015979 "प्रकाश संश्लेषण" और अन्य संबंधित जैविक प्रक्रियाओं से संबंधित जीनों का समन्वित साइलेंसिंग भी शामिल था (चित्र 5)। इस GO:0015979 DEG सेट में 105 जीन थे जो 83A:476 पर 6 hpi पर महत्वपूर्ण रूप से दमित थे। इस उपसमूह में, 37 जीन मैंडेलुप में 48 HPI पर और 35 जीन 22660 आबादी में उसी समय बिंदु पर डाउनरेगुलेटेड थे, जिनमें दोनों जीनोटाइप के लिए सामान्य 19 DEG शामिल थे। GO:0015979 शब्द से संबंधित कोई भी DEG किसी भी संयोजन (लाइन x समय) में महत्वपूर्ण रूप से सक्रिय नहीं हुआ।
जैविक प्रक्रिया “GO:0015979 प्रकाश संश्लेषण” के मुख्य घटकों की अभिव्यक्ति के पैटर्न का पता लगाया गया। लॉग2 स्केल, एक ही समय बिंदु पर टीका लगाए गए (कोलेटोट्रिचम लुपिनी, स्ट्रेन कोल-08, लुपिन के खेतों से प्राप्त, विज़ेनिका, पोलैंड, 1999) और नियंत्रण (नकली टीका लगाए गए) पौधों के बीच लॉग2 मान (गुना परिवर्तन) को दर्शाता है। निम्नलिखित संकीर्ण पत्ती वाले लुपिन की किस्मों का विश्लेषण किया गया: 83A:476 (प्रतिरोधी, समरूप Lanr1 एलील युक्त), बोरेगिन (प्रतिरोधी, आनुवंशिक पृष्ठभूमि अज्ञात), मैंडेलुप (मध्यम प्रतिरोधी, समरूप AnMan एलील युक्त), और पॉपुलेशन 22660 (संवेदनशील)।
विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण के परिणामों के आधार पर और संभवतः रोगजनक कवक के खिलाफ रक्षा प्रतिक्रियाओं में शामिल, सात जीनों के इस समूह को वास्तविक समय पीसीआर द्वारा अभिव्यक्ति प्रोफाइल के मात्रात्मक निर्धारण के लिए चुना गया था (पूरक तालिका एस9)।
नियंत्रण (नकल) पौधों की तुलना में, अध्ययन की गई सभी लाइनों और समय बिंदुओं पर संभाव्य प्रोटीन जीन TanjilG_10657 में महत्वपूर्ण वृद्धि देखी गई (पूरक सारणी S10, S11)। इसके अतिरिक्त, सभी लाइनों के लिए प्रयोग के दौरान TanjilG_10657 के अभिव्यक्ति प्रोफाइल में वृद्धि का रुझान दिखाई दिया। जनसंख्या 22660 ने 24 HPI पर 114 गुना सक्रियण और उच्चतम सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर (4.4 ± 0.4) के साथ TanjilG_10657 के प्रति उच्चतम संवेदनशीलता प्रदर्शित की (चित्र 6a)। PR10 LlR18A प्रोटीन जीन TanjilG_27015 ने भी सभी लाइनों और समय बिंदुओं पर सक्रियण दिखाया, जिसमें अधिकांश डेटा बिंदुओं पर सांख्यिकीय महत्व था (चित्र 6b)। TanjilG_10657 के समान, TanjilG_27015 का उच्चतम सापेक्षिक अभिव्यक्ति स्तर 22660 टीकाकृत आबादी में 24 HPI (19.5 ± 2.4) पर देखा गया। एसिड एंडोचिटिनेज जीन TanjilG_04706 सभी लाइनों में और सभी समय बिंदुओं पर महत्वपूर्ण रूप से अपग्रेड हुआ, सिवाय बोरेगिन 6 hpi (चित्र 6c) के। यह पहले समय बिंदु (6 HPI) पर 83A:476 में दृढ़ता से प्रेरित हुआ (10.5 गुना) और अन्य लाइनों में मध्यम रूप से बढ़ा (6.6-7.5 गुना)। प्रयोग के दौरान, TanjilG_04706 की अभिव्यक्ति 83A:476 और बोरेगिन में समान स्तर पर बनी रही, जबकि मंडेलुप और आबादी 22660 में यह महत्वपूर्ण रूप से बढ़ी, अपेक्षाकृत उच्च मानों (क्रमशः 5.9 ± 1.5 और 6.2 ± 1.5) तक पहुँच गई। एंडोग्लूकन-1,3-β-ग्लूकोसिडेज़-जैसे जीन TanjilG_23384 ने जनसंख्या 22660 को छोड़कर सभी लाइनों में पहले दो समय बिंदुओं (6 और 12 hpi) पर उच्च सक्रियता दिखाई (चित्र 6d)। TanjilG_23384 का उच्चतम सापेक्षिक अभिव्यक्ति स्तर दूसरे समय बिंदु (12 hpi) पर मंडेलुप (2.7 ± 0.3) और 83A:476 (1.5 ± 0.1) में देखा गया। 24 hpi पर, TanjilG_23384 की अभिव्यक्ति सभी अध्ययनित लाइनों में अपेक्षाकृत कम थी (0.04 ± 0.009 से 0.44 ± 0.12 तक)।
क्वांटिटेटिव पीसीआर द्वारा चयनित जीनों (ag) के एक्सप्रेशन प्रोफाइल को दर्शाया गया है। संख्याएँ 6, 12 और 24 टीकाकरण के बाद के घंटों को दर्शाती हैं। सामान्यीकरण के लिए LanDExH7 और LanTUB6 जीनों का उपयोग किया गया था, और अंतर-श्रृंखला अंशांकन के लिए LanTUB6 का उपयोग किया गया था। त्रुटि बार तीन जैविक प्रतिकृतियों पर आधारित मानक विचलन को दर्शाते हैं, जिनमें से प्रत्येक तीन तकनीकी प्रतिकृतियों का औसत है। टीका लगाए गए (कोलेटोट्रिचम लुपिनी, स्ट्रेन कोल-08, जो 1999 में पोलैंड के विएर्ज़ेनिका में लुपिन के खेत से प्राप्त किया गया था) और नियंत्रण (नकली टीका लगाए गए) पौधों के बीच अभिव्यक्ति स्तरों में अंतर की सांख्यिकीय सार्थकता को डेटा बिंदुओं के ऊपर चिह्नित किया गया है (*पी मान < 0.05, **पी मान ≤ 0.01, ***पी मान ≤ 0.001)। टीका लगाए गए (कोलेटोट्रिचम लुपिनी, स्ट्रेन कोल-08, जो 1999 में पोलैंड के विएर्ज़ेनिका में लुपिन के खेत से प्राप्त किया गया था) और नियंत्रण (नकली टीका लगाए गए) पौधों के बीच अभिव्यक्ति स्तरों में अंतर की सांख्यिकीय सार्थकता को डेटा बिंदुओं के ऊपर चिह्नित किया गया है (*पी मान < 0.05, **पी मान ≤ 0.01, ***पी मान ≤ 0.001)। Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (कोलेटोट्रिचम ल्यूपिनी, штамм Col-08, получен в 1999 г. с поля люпина в Верженице, Польша) और контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). टीका लगाए गए (कोलेटोट्रिचम लुपिनी, स्ट्रेन कोल-08, जो 1999 में पोलैंड के विएरज़ेनिस में एक लुपिन के खेत से प्राप्त किया गया था) और नियंत्रण (नकली टीका लगाए गए) पौधों के बीच अभिव्यक्ति स्तरों में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर डेटा बिंदुओं के ऊपर दर्शाए गए हैं (*पी मान < 0.05, **पी मान ≤ 0.01, ***पी मान ≤ 0.001)।接种（कोलेटोट्राइकम ल्यूपिनी, कर्नल-08, 1999, विएरज़ेनिका की तस्वीरें ）और पढ़ें 0.05, **पी 值≤ 0.01, ***पी 值≤ 0.001)。अधिक पढ़ें之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001)。 युरोप में Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (कोलेटोट्राइकम ल्यूपिनी, штамм Col-08, полученный с полей люпина в वैरायटी, Польша, 1999 में। отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***पी-значение ≤ 0,001). टीका लगाए गए (कोलेटोट्रिचम लुपिनी, स्ट्रेन कोल-08, जो 1999 में पोलैंड के वर्ज़ेनिस में लुपिन के खेतों से प्राप्त किया गया था) और नियंत्रण (नकली टीका लगाए गए) पौधों के बीच अभिव्यक्ति स्तरों में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर डेटा बिंदुओं के ऊपर दर्शाए गए हैं (*पी मान < 0.05, **पी मान ≤ 0.01, ***पी मान ≤ 0.001)।विश्लेषण की गई एनएलएल लाइनें थीं: 83ए:476 (प्रतिरोधी, समरूप लैनर1 एलील युक्त), मंडेलुप (मध्यम रूप से प्रतिरोधी, समरूप एनमैन एलील युक्त), बोरेगिन (प्रतिरोधी, अज्ञात आनुवंशिक पृष्ठभूमि) और जनसंख्या 22660 (संवेदनशील)।
Lanr1 लोकस पर स्थित उम्मीदवार जीन TanjilG_05042 ने RNA-seq अध्ययनों से प्राप्त प्रोफाइल से काफी भिन्न अभिव्यक्ति पैटर्न दिखाया (चित्र 6e)। इस जीन की महत्वपूर्ण सक्रियता मंडेलुप और 22660 आबादी में देखी गई (क्रमशः 39.7 और 11.7 गुना तक), जिसके परिणामस्वरूप अपेक्षाकृत उच्च अभिव्यक्ति स्तर प्राप्त हुए (क्रमशः 1.4 ± 0.14 और 7.2 ± 1.3 तक)। 83A:476 ने भी TanjilG_05042 जीन की कुछ वृद्धि (3.8 गुना तक) दर्शाई, हालांकि, प्राप्त सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर (0.044 ± 0.002) मंडेलुप और 22660 आबादी में देखे गए स्तरों से 30 गुना से अधिक कम थे। qPCR द्वारा किए गए विश्लेषण से नकली टीकाकरण (नियंत्रण) वेरिएंट में जीनोटाइप के बीच अभिव्यक्ति स्तरों में महत्वपूर्ण अंतर दिखाई दिया, जो आबादी 22660 और 83A:476 के बीच, साथ ही आबादी 22660 और 22660 के बीच 58 गुना अंतर तक पहुंच गया। बोरेगिन और मंडलुप के बीच दो गुना अंतर प्राप्त हुआ।
एनमैन लोकस पर स्थित उम्मीदवार जीन, तंजिलजी_12861, 83ए:476 और मंडेलुप में टीकाकरण के जवाब में सक्रिय हो गया, 22660 आबादी में तटस्थ रहा, और बोरेगिन में कम हो गया (चित्र 6f)। तंजिलजी_12861 जीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति टीका लगाए गए 83ए:476 में सबसे अधिक (0.14±0.01) थी। 17.4 kDa वर्ग I हीट शॉक प्रोटीन जीन तंजिलजी_05080 HSP17.4 ने सभी अध्ययन किए गए उपभेदों और समय बिंदुओं में कम सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर दिखाया (चित्र 6g)। 22660 आबादी में 24 HPI पर उच्चतम मान देखा गया (0.14 ± 0.02, टीकाकरण के जवाब में आठ गुना वृद्धि)।
जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल की तुलना (चित्र 7) से पता चला कि TanjilG_10657 और चार अन्य जीनों - TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.80) और TanjilG_04706 (r = 0.79) के बीच उच्च सहसंबंध है। ऐसे परिणाम रक्षा प्रतिक्रियाओं के दौरान इन जीनों के सह-नियमन का संकेत दे सकते हैं। TanjilG_12861 और TanjilG_23384 जीनों ने अन्य जीनों की तुलना में कम पियर्सन सहसंबंध गुणांक मानों (क्रमशः 0.08 से 0.43 और -0.19 से 0.28 तक) के साथ भिन्न अभिव्यक्ति प्रोफाइल प्रदर्शित किए।
जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल के बीच सहसंबंधों का पता लगाने के लिए मात्रात्मक पीसीआर का उपयोग किया गया। निम्नलिखित संकीर्ण पत्ती वाले ल्यूपिन की किस्मों का विश्लेषण किया गया: 83A:476 (प्रतिरोधी, समरूप Lanr1 एलील युक्त), मंडेलुप (मध्यम प्रतिरोधी, समरूप AnMan एलील युक्त), बोरेगिन (प्रतिरोधी, आनुवंशिक पृष्ठभूमि अज्ञात), और पॉपुलेशन 22660 (संवेदनशील)। तीन समय बिंदुओं (टीकाकरण के 6, 12 और 24 घंटे बाद) की गणना की गई, जिसमें टीकाकृत (कोलेटोट्रिचम ल्यूपिनी, स्ट्रेन Col-08, 1999 में पोलैंड के विर्ज़ेनिस में ल्यूपिन के खेतों से प्राप्त) और नियंत्रण (नकली टीकाकृत) पौधे शामिल थे। स्केल पियर्सन सहसंबंध गुणांक का मान दर्शाता है।
6 हॉर्सपावर प्रति इंच पर प्राप्त आंकड़ों के आधार पर, प्रारंभिक रक्षा प्रतिक्रियाओं पर ध्यान केंद्रित करने के लिए टीका लगाए गए और नियंत्रित पौधों की तुलना करके पहचाने गए 9981 डीईजी पर डब्ल्यूजीसीएनए किया गया (पूरक तालिका एस12)। जीनोटाइप और प्रायोगिक वेरिएंट के बीच सहसंबंधित (सकारात्मक या नकारात्मक) अभिव्यक्ति प्रोफाइल वाले बाईस जीन मॉड्यूल (समूह) पाए गए। औसतन, जीन अभिव्यक्ति का स्तर 83A:476 > मंडेलुप > बोरेगिन > पॉपुलेशन 22660 के क्रम में घट रहा था (हालांकि, दोनों वेरिएंट में, यह प्रवृत्ति नियंत्रण पौधों में अधिक मजबूत थी)। औसतन, जीन अभिव्यक्ति का स्तर 83A:476 > मंडेलुप > बोरेगिन > पॉपुलेशन 22660 के क्रम में घट रहा था (हालांकि, दोनों वेरिएंट में, यह प्रवृत्ति नियंत्रण पौधों में अधिक मजबूत थी)। В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > मांडेलप > बोरगिन > जनसंख्या 22660 (в обоих вариантах, однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). औसतन, जीन अभिव्यक्ति के स्तर में 83A:476 > मंडेलुप > बोरेगिन > पॉपुलेशन 22660 के क्रम में कमी आई (हालांकि, दोनों वेरिएंट में, यह प्रवृत्ति नियंत्रण पौधों में अधिक मजबूत थी)।平均而言,基因表达水平按83A:476 > मांडेलप > बोरगिन > जनसंख्या 22660的顺序下降（然而,在两种变体中,这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 , 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> बोरगिन> जनसंख्या 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 , 这 种在 और अधिक पढ़ें В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > मंडेलुप > बोरगिन > जनसंख्या 22660 (एक अन्य प्रश्न के उत्तर में आपको एक प्रश्न पूछना होगा) растений). औसतन, जीन अभिव्यक्ति का स्तर 83A:476 > मंडेलुप > बोरेगिन > जनसंख्या 22660 श्रृंखला में कम हो गया (हालांकि, दोनों वेरिएंट में, यह प्रवृत्ति नियंत्रण पौधों में अधिक मजबूत थी)।टीकाकरण के परिणामस्वरूप जीन अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई, विशेष रूप से मॉड्यूल 18, 19, 14, 6 और 1 में (प्रभाव के घटते क्रम में), नकारात्मक विनियमन (जैसे मॉड्यूल 9 और 20) या तटस्थ प्रभाव (जैसे मॉड्यूल 11, 22, 8 और 13)। GO टर्म संवर्धन विश्लेषण (पूरक तालिका S13) ने अधिकतम सक्रियण के साथ टीकाकृत मॉड्यूल (18) के लिए "GO: 0006952 सुरक्षात्मक प्रतिक्रियाएं" का खुलासा किया, जिसमें qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 और TanjilG_27015) द्वारा विश्लेषण किए गए जीन, साथ ही कई टीकाकृत सबसे दमित प्रकाश संश्लेषण मॉड्यूल (9) शामिल हैं। मॉड्यूल 18 कंसंट्रेटर (चित्र 8) को PR-10-जैसे LlR18B प्रोटीन को एनकोड करने वाले TanjilG_26536 जीन के रूप में पहचाना गया, और मॉड्यूल 9 कंसंट्रेटर को फोटोसिस्टम II PsbQ प्रोटीन को एनकोड करने वाले TanjilG_28955 जीन के रूप में पहचाना गया। मॉड्यूल 22 (चित्र 9) में एक संभावित एंथ्रेक्नोज प्रतिरोध जीन Lanr1, TanjilG_05042 पाया गया और यह TanjilG_01212 हब को ले जाने वाले "GO:0044260 सेलुलर मैक्रोमोलेक्यूलर मेटाबोलिक प्रक्रियाएं" और "GO:0006355 ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन, डीएनए टेम्पलेटिंग" शब्दों से जुड़ा है। यह जीन हीट स्ट्रेस ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर A-4a (HSFA4a) को एनकोड करता है।
अतिप्रतिनिधित्व वाले जैविक प्रक्रिया शब्दों वाले मॉड्यूल के जीन सह-अभिव्यक्ति का भारित नेटवर्क विश्लेषण “GO: 0006952 रक्षा प्रतिक्रियाएँ”। qPCR द्वारा विश्लेषण किए गए चार जीनों (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 और TanjilG_27015) को उजागर करने के लिए लिगेशन को सरल बनाया गया था।
अतिप्रतिनिधित्व वाले जैविक प्रक्रिया शब्द "GO: 0006355: ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन, डीएनए टेम्पलेटिंग" वाले मॉड्यूल के जीन सह-अभिव्यक्ति का भारित नेटवर्क विश्लेषण, जिसमें एक संभावित एंथ्रेक्नोज़ प्रतिरोध जीन Lanr1 TanjilG_05042 निहित है। TanjilG_05042 जीन और केंद्रीय TanjilG_01212 जीन को पृथक करने के लिए लिगेशन को सरलीकृत किया गया।
ऑस्ट्रेलिया में एकत्र किए गए एंथ्रेक्नोज़ प्रतिरोध परीक्षण से पता चला कि शुरुआती दौर में जारी की गई अधिकांश किस्में संवेदनशील थीं; काल्या, कोरोमप और मंडेलप को मध्यम रूप से प्रतिरोधी बताया गया है, जबकि वोंगा, तंजिल और 83A:476 को अत्यधिक प्रतिरोधी बताया गया है26,27,31। इनमें एक ही प्रतिरोध एलील था, जिसे Lanr1 नाम दिया गया, जबकि कोरोमप और मंडेलप में एक अलग एलील था, जिसे AnMan10 नाम दिया गया, 26, 39, और काल्या ने एक अलग एलील, Lanr2 को आगे बढ़ाया। जर्मनी में एंथ्रेक्नोज़ प्रतिरोध परीक्षण के परिणामस्वरूप Lanr1 के अलावा एक अन्य उम्मीदवार एलील, LanrBo36 के साथ एक प्रतिरोधी लाइन Bo7212 की पहचान हुई।
हमारे अध्ययन से परीक्षण किए गए जर्मप्लाज्म में Lanr1 एलील की आवृत्ति बहुत कम (लगभग 6%) पाई गई। यह अवलोकन Anseq3 और Anseq4 मार्करों का उपयोग करके पूर्वी यूरोपीय जर्मप्लाज्म की स्क्रीनिंग के परिणामों के अनुरूप है, जिसमें पाया गया कि Lanr1 एलील केवल दो बेलारूसी लाइनों में मौजूद है। इससे पता चलता है कि ऑस्ट्रेलिया के विपरीत, जहां यह मार्कर-सहायता प्राप्त प्रजनन के लिए प्रमुख एलील्स में से एक है, Lanr1 एलील का उपयोग अभी तक स्थानीय प्रजनन कार्यक्रमों द्वारा व्यापक रूप से नहीं किया जा रहा है। इसका कारण ऑस्ट्रेलियाई रिपोर्ट की तुलना में यूरोपीय क्षेत्र की परिस्थितियों में Lanr1 एलील द्वारा प्रदान किए गए प्रतिरोध का निम्न स्तर हो सकता है। इसके अतिरिक्त, ऑस्ट्रेलिया के उच्च वर्षा वाले क्षेत्रों में एंथ्रेक्नोज के अध्ययनों से पता चला है कि Lanr1 एलील द्वारा मध्यस्थता की गई प्रतिरोध प्रतिक्रियाएं उन मौसम स्थितियों में प्रभावी नहीं हो सकती हैं जो रोगजनक के विकास और तीव्र वृद्धि के लिए अनुकूल होती हैं19,42। वास्तव में, वर्तमान अध्ययन में, Lanr1 एलील वाले जीनोटाइप में भी एंथ्रेक्नोज के कुछ लक्षण देखे गए, जिससे पता चलता है कि C. lupini के विकास के लिए अनुकूलतम परिस्थितियों में प्रतिरोध समाप्त हो सकता है। इसके अलावा, एंसेक3 और एंसेक4 मार्करों की उपस्थिति की गलत सकारात्मक व्याख्याएं संभव हैं, जो लैनर1 लोकस से लगभग 1 सेमी दूर हैं 28,30,43।
हमारे अध्ययन से पता चला कि 83A:476, जिसमें Lanr1 एलील मौजूद है, ने C. lupini के संक्रमण के प्रति पहले विश्लेषण किए गए समय बिंदु (6 hpi) पर बड़े पैमाने पर ट्रांसक्रिप्टोम रीप्रोग्रामिंग के साथ प्रतिक्रिया दी, जबकि Mandelup में, जिसमें AnMan एलील मौजूद है, ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रतिक्रियाएं बहुत बाद में (24 से 48 hp तक) देखी गईं। रक्षा प्रतिक्रियाओं में ये अस्थायी भिन्नताएं रोग के लक्षणों में अंतर से जुड़ी हैं, जो प्रतिरोध के लिए सफल प्रतिक्रिया हेतु प्रारंभिक रोगजनक पहचान के महत्व को उजागर करती हैं। पौधे के ऊतकों को संक्रमित करने के लिए, एंथ्रेक्स बीजाणुओं को मेजबान की सतह पर कई विकासात्मक चरणों से गुजरना पड़ता है, जिसमें अंकुरण, कोशिका विभाजन और एप्रैसोरियम का निर्माण शामिल है। एप्रैसोरियम एक संक्रामक संरचना है जो मेजबान की सतह से जुड़ती है और मेजबान ऊतकों में प्रवेश को सुगम बनाती है। इस प्रकार, मटर के अर्क में C. gloeosporioides के बीजाणुओं ने 75-90 मिनट के ऊष्मायन के बाद केंद्रक का पहला विभाजन, 90-120 मिनट के बाद अंकुर नलिका का निर्माण और 4 घंटे के बाद दमन दिखाया। आम के C. gloeosporioides ने 3 घंटे के ऊष्मायन के बाद 40% से अधिक कोनिडियल अंकुरण और 4 घंटे के बाद लगभग 20% दमनकारी कोनिडियल का निर्माण दिखाया। C. gloeosporioides के विषाणु-संबंधी CAP20 जीन ने एवोकाडो की सतह के मोम में CAP20 प्रोटीन की उच्च सांद्रता के साथ 3.5 घंटे के ऊष्मायन के बाद उपभौतिकी बनाने वाले कोनिडिया में प्रतिलेखन गतिविधि दिखाई। इसी प्रकार, C. trifolii में मेलेनिन जैवसंश्लेषण जीन की गतिविधि 2 घंटे के ऊष्मायन के दौरान प्रेरित हुई, जिसके बाद 1 घंटे के बाद दमनकारी कोनिडियल का निर्माण हुआ। पत्ती के ऊतकों के अध्ययन से पता चला है कि C. acutatum से संक्रमित स्ट्रॉबेरी में संक्रमण के 8 दिन बाद पहला दमन होता है, जबकि C. coccodes से संक्रमित टमाटर में संक्रमण के 4 दिन बाद पहला दमन होता है48,49। यह Colletotrichum spp. की संक्रामक प्रक्रिया के समय पैमाने के अनुरूप है। 83A:476 के प्रति तीव्र रक्षा प्रतिक्रियाएं इस लाइन में पादप प्रतिरोध और प्रभावक-प्रेरित प्रतिरक्षा (ETI) जीन की भागीदारी का सुझाव देती हैं, जबकि मैंडेलुप की विलंबित प्रतिक्रियाएं सूक्ष्म-संबंधित आणविक पैटर्न-प्रेरित प्रतिरक्षा (MTI) परिकल्पना का समर्थन करती हैं50। 83A:476 और मैंडेलुप के प्रति प्रारंभिक प्रतिक्रियाएं। विलंबित प्रतिक्रिया में ऊपर या नीचे विनियमित जीन के बीच आंशिक ओवरलैप भी इस अवधारणा का समर्थन करता है, क्योंकि ETI को अक्सर एक त्वरित और उन्नत MTI प्रतिक्रिया माना जाता है जो संक्रमण स्थल पर प्रोग्राम्ड सेल डेथ में परिणत होती है, जिसे एनाफिलेक्टिक शॉक के रूप में जाना जाता है51,52।
जीन ओन्टोलॉजी GO:0006952 "रक्षा प्रतिक्रिया" नामक अतिप्रतिनिधित्व वाले शब्द से संबंधित अधिकांश जीन तनाव-प्रेरित उपवास संदेश 22 प्रोटीन (SAM22 के समान) के 11 समरूप और सात प्रमुख लेटेक्स प्रोटीन-जैसे (MLP) प्रोटीन 31, 34, 43 और 423 हैं। इनमें अनुक्रम समानता पाई गई। SAM22-जैसे जीनों ने महत्वपूर्ण सक्रियता दिखाई जो लंबे समय तक बनी रही, जिससे एंथ्रेक्नोज प्रतिरोध का स्तर बढ़ा (83A:476 और बोरेगिन)। हालांकि, MLP-जैसे जीन केवल उम्मीदवार प्रतिरोध एलील वाली लाइनों में ही कम हुए (6 hpi पर 83A:476/Lanr1 और 24 hpi पर Mandelup/AnMan)। यह ध्यान देने योग्य है कि सभी पहचाने गए SAM22-जैसे समरूप लगभग 105 kb में फैले एक जीन समूह से उत्पन्न होते हैं, जबकि MLP-जैसे जीन जीनोम के अलग-अलग क्षेत्रों से उत्पन्न होते हैं। डायपोर्टेटॉक्सिका संक्रमण के प्रति एनएलएल प्रतिरोध के हमारे पिछले अध्ययन में भी ऐसे एसएएम22-जैसे जीनों की समन्वित सक्रियता पाई गई थी, जो यह दर्शाती है कि वे रक्षा प्रतिक्रिया के क्षैतिज घटकों में शामिल हैं। यह निष्कर्ष सैलिसिलिक एसिड, फंगल प्रेरकों या हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ चोट या उपचार के प्रति एसएएम22-जैसे जीनों की सकारात्मक प्रतिक्रिया की रिपोर्टों द्वारा भी समर्थित है।
कई पौधों की प्रजातियों में जीवाणु, विषाणु और रोगजनक कवक संक्रमण सहित विभिन्न अजैविक और जैविक तनावों के प्रति MLP-जैसे जीन की प्रतिक्रिया देखी गई है।55 पौधों और रोगजनकों के बीच कुछ अंतःक्रियाओं के प्रति प्रतिक्रिया की दिशाएँ काफी बढ़ती हुई (जैसे, वर्टिसिलियम डाहलिया द्वारा कपास के संक्रमण के दौरान) से लेकर काफी घटती हुई (जैसे, अल्टरनेरिया एसपीपी द्वारा सेब के पेड़ के संक्रमण के बाद) तक थीं।56,57 एवोकाडो में एफ. नाइजर संक्रमण के प्रति सुरक्षा और सेब के पेड़ में बोट्रियोस्फेरिया बेरेनगेरियाना एफ. सीएन. पिरिकोला और अल्टरनेरिया अल्टरनाटा के संक्रमण के दौरान MLP-जैसे 423 जीन का महत्वपूर्ण डाउनरेगुलेशन देखा गया है।58,59 इसके अतिरिक्त, MLP-जैसे 423 जीन को अधिक मात्रा में व्यक्त करने वाले सेब के कैलस में प्रतिरोध-संबंधी जीन की अभिव्यक्ति कम थी और वे कवक संक्रमण के प्रति अधिक संवेदनशील थे।59 फ्यूजेरियम ऑक्सीस्पोरम एफ. के बाद, प्रतिरोधी सामान्य बीन जर्मप्लाज्म में भी MLP-जैसे 423 जीन को दबा दिया गया था। सीएन. बीन संक्रमण 60.
हमारे आरएनए-सीक्वेंसिंग अध्ययन में पहचाने गए पीआर-10 परिवार के अन्य सदस्य एलएलआर18ए और एलएलआर18बी जीन थे, जो अपरेगुलेशन के साथ-साथ लिपिड ट्रांसफर प्रोटीन डीआईआर1 के लिए अपरेगुलेटेड (1 जीन) या डाउनरेगुलेटेड (3 जीन) जीन थे। इसके अतिरिक्त, डब्ल्यूजीसीएनए इस मॉड्यूल में एलएलआर18बी जीन को एक हब के रूप में उजागर करता है, जो टीकाकरण के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है और इसमें कई सुरक्षात्मक प्रतिक्रिया जीन होते हैं। एलएलआर18ए और एलएलआर18बी जीन पीले ल्यूपिन की पत्तियों में रोगजनक बैक्टीरिया की प्रतिक्रिया में, साथ ही डी. टॉक्सिका के टीकाकरण के बाद एनएलएल तनों में प्रेरित हुए, जबकि इन जीनों का चावल समरूप, आरएसओएसआर10, फंगल संक्रमण द्वारा तेजी से प्रेरित हुआ, जो संभवतः जैस्मोनिक एसिड सिग्नलिंग मार्ग53,61, 62 में शामिल है। डीआईआर1 जीन गैर-विशिष्ट लिपिड परिवहन प्रोटीन को एनकोड करता है जो प्रणालीगत अधिग्रहित प्रतिरोध (एसएआर) की शुरुआत के लिए आवश्यक हैं। सुरक्षात्मक प्रतिक्रियाओं के विकास के साथ, DIR1 प्रोटीन संक्रमण के केंद्र से फ्लोएम के माध्यम से दूरस्थ अंगों में SAR को प्रेरित करने के लिए स्थानांतरित होता है। दिलचस्प बात यह है कि TanjilG_02313 DIR1 जीन को लाइन 84A:476 और Population 22660 में पहले समय बिंदु पर महत्वपूर्ण रूप से प्रेरित किया गया था, लेकिन एंथ्रेक्नोज प्रतिरोध केवल लाइन 84A:476 में सफलतापूर्वक विकसित हुआ। यह NLL में DIR1 जीन के कुछ उपकार्यात्मकता का संकेत दे सकता है, क्योंकि शेष तीन समरूपों ने 6 hpi पर केवल 83A:476 लाइन में ही टीकाकरण के प्रति प्रतिक्रिया दी, और यह प्रतिक्रिया नीचे की ओर निर्देशित थी।
हमारे अध्ययन में, "GO:0055114 रेडॉक्स प्रक्रिया" नामक जैविक प्रक्रिया से संबंधित सबसे सामान्य घटक साइटोक्रोम P450 प्रोटीन, परॉक्सीडेज़, लिनोलिक एसिड 9S-/13S-लिपोक्सीजिनेज़ और 1-एमिनोसाइक्लोप्रोपेन-1-कार्बोक्सिलिक एसिड ऑक्सीडेज़ थे। इसके अतिरिक्त, हमारे WGCNA ने HSFA4a समरूप को Lanr1 प्रतिरोध जीन उम्मीदवार TanjilG_05042 जैसे मॉड्यूल ले जाने वाले एक केंद्र के रूप में परिभाषित किया है। HSFA4a पौधों में नाभिकीय प्रतिलेखन के रेडॉक्स-निर्भर विनियमन का एक घटक है।
साइटोक्रोम P450 प्रोटीन ऑक्सीडोरडक्टेस होते हैं जो प्राथमिक और द्वितीयक चयापचय में NADPH और/या O2-निर्भर हाइड्रॉक्सिलेशन प्रतिक्रियाओं को उत्प्रेरित करते हैं, जिसमें ज़ेनोबायोटिक्स का चयापचय, साथ ही हार्मोन, फैटी एसिड, स्टेरोल, कोशिका भित्ति घटक, बायोपोलिमर और सुरक्षात्मक यौगिकों का जैवसंश्लेषण शामिल है। 69 हमारे एक अध्ययन में, पादप साइटोक्रोम P450 कार्य में परिवर्तनशीलता -10.6 लॉग2 (फोल्ड परिवर्तन) से घटकर 5.7 हो गई, जो बड़ी संख्या में परिवर्तित समरूपों (37) और विशिष्ट जीनों के बीच प्रतिक्रिया पैटर्न में अंतर के कारण है, जो एक ऊपर की ओर संशोधन को दर्शाता है। इतने बड़े प्रोटीन सुपरफैमिली में NLL जीनों के अनुमानित जैविक कार्य को स्पष्ट करने के लिए केवल RNA-seq डेटा का उपयोग करना अत्यधिक अनुमानित होगा। हालांकि, यह ध्यान देने योग्य है कि कुछ साइटोक्रोम P450 जीन रोगजनक कवक या जीवाणुओं के प्रति बढ़ी हुई प्रतिरोधकता से जुड़े हैं, जिसमें एलर्जी प्रतिक्रियाओं में योगदान भी शामिल है।69,70,71
क्लास III पेरोक्सीडेस बहुक्रियाशील पादप एंजाइम हैं जो पादप वृद्धि और विकास के दौरान कई प्रकार की चयापचय प्रक्रियाओं में शामिल होते हैं, साथ ही लवणता, सूखा, उच्च प्रकाश तीव्रता और रोगजनक आक्रमण जैसे पर्यावरणीय तनावों के प्रति प्रतिक्रिया में भी शामिल होते हैं।72 पेरोक्सीडेस कई पादप प्रजातियों की एंथ्रासिस के साथ परस्पर क्रिया में शामिल होते हैं, जिनमें स्टाइलोसैंथिस ह्यूमिलिस और सी. ग्लोस्पोरियोइड्स, लेंस कुलिनारिस और सी. ट्रंकेटम, फेजोलस वल्गारिस और सी. लिंडेमुथियानम, कुकुमिस सैटिवस और सी. लैगेनारियम शामिल हैं।73,74,75,76 प्रतिक्रिया बहुत तीव्र होती है, कभी-कभी कवक के पादप ऊतक में प्रवेश करने से पहले ही 4 एचपीआई पर भी।73 पेरोक्सीडेस जीन ने डी. टॉक्सिका एनएलएल इनोक्यूलेशन के प्रति भी प्रतिक्रिया दी। ऑक्सीडेटिव बर्स्ट को नियंत्रित करने या ऑक्सीडेटिव तनाव को समाप्त करने के अपने सामान्य कार्यों के अलावा, पेरोक्सीडेस लिग्निफिकेशन, सबयूनिट या विशिष्ट यौगिकों के क्रॉस-लिंकिंग के दौरान कोशिका भित्ति सुदृढ़ीकरण पर आधारित भौतिक अवरोध बनाकर रोगजनकों के विकास में बाधा उत्पन्न कर सकते हैं। इस कार्य को इन सिलिको में TanjilG_03329 जीन से जोड़ा जा सकता है, जो एक संभावित लिग्निन-निर्माण आयन पेरोक्सीडेस को एनकोड करता है। हमारे अध्ययन में 83A:476 प्रतिरोधी लाइन में 6 HPI पर यह जीन काफी अधिक मात्रा में पाया गया, लेकिन अन्य उपभेदों और समय बिंदुओं पर नहीं, जिन्होंने कोई प्रतिक्रिया नहीं दी।
लिनोलिक एसिड का 9S-/13S-लिपोक्सीजिनेज लिपिड जैवसंश्लेषण के ऑक्सीडेटिव मार्ग का पहला चरण है।78 इस मार्ग के उत्पादों के पादप रक्षा में कई कार्य होते हैं, जिनमें कैलोस और पेक्टिन जमाव के निर्माण के माध्यम से कोशिका भित्ति को मजबूत करना और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन के माध्यम से ऑक्सीडेटिव तनाव का नियमन शामिल है।79,80,81,82,83 वर्तमान अध्ययन में, सभी उपभेदों में लिनोलिक एसिड 9S-/13S-लिपोक्सीजिनेज की अभिव्यक्ति में परिवर्तन देखा गया, लेकिन संवेदनशील आबादी 22660 में, विभिन्न समय बिंदुओं पर वृद्धि देखी गई, जबकि प्रतिरोधी Lanr1 और AnMan एलील वाले उपभेदों में, यह इन जीनोटाइपों के बीच सुरक्षात्मक एंथ्रेक्स प्रतिक्रियाओं में ऑक्सीलिपिन परत के विविधीकरण पर जोर देता है।
ल्यूपिन से संक्रमित करने पर 1-एमिनोसाइक्लोप्रोपेन-1-कार्बोक्सिलेट ऑक्सीडेज (ACO) होमोलॉग में उल्लेखनीय वृद्धि (9 जीन) या कमी (2 जीन) देखी गई। दो अपवादों को छोड़कर, ये सभी प्रतिक्रियाएँ 6 hp पर 83A:476 पर हुईं। ACO प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता की जाने वाली एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया एथिलीन उत्पादन में दर-सीमित चरण है और इसलिए यह अत्यधिक विनियमित होती है84। एथिलीन एक पादप हार्मोन है जो पादप विकास और अजैविक और जैविक तनाव स्थितियों के प्रति प्रतिक्रिया को विनियमित करने में विभिन्न भूमिकाएँ निभाता है। ACO प्रतिलेखन का प्रेरण और एथिलीन सिग्नलिंग मार्ग का सक्रियण प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों और फाइटोएलेक्सिन के उत्पादन को विनियमित करके हेमिबायोट्रोफिक कवक ओरिज़ा ओरिज़ा के प्रति चावल के प्रतिरोध को बढ़ाने में शामिल हैं। एम. ओरिज़ा और सी. लुपिनी88,89 के बीच पाई जाने वाली एक बहुत ही समान पत्ती संक्रमण प्रक्रिया, इस अध्ययन में रिपोर्ट की गई 83ए:476 लाइन में एसीओ होमोलॉग्स के महत्वपूर्ण अपग्रेडेशन की पृष्ठभूमि में, एनएलएल एंथ्रेक्नोज़ एथिलीन के प्रतिरोध प्रदान करने की संभावना को आणविक मार्गों में एक सिग्नलिंग केंद्रीय चरण में बदल देती है।
वर्तमान अध्ययन में, 83A:476 में 6 hpi पर और मैंडेलूप और 22660 आबादी में 48 hpi पर प्रकाश संश्लेषण से जुड़े कई जीनों का बड़े पैमाने पर दमन देखा गया। इन परिवर्तनों की सीमा और प्रगति स्तर के समानुपाती है। इस प्रयोग में एंथ्रेक्नोज़ प्रतिरोध देखा गया। हाल ही में, रोगजनक बैक्टीरिया और कवक सहित पादप-रोगजनक अंतःक्रियाओं के कई मॉडलों में प्रकाश संश्लेषण से संबंधित प्रतिलेखों के प्रबल और प्रारंभिक दमन की सूचना दी गई है। संक्रमण के जवाब में प्रकाश संश्लेषण से जुड़े जीनों का शीघ्र (कुछ अंतःक्रियाओं में 2 hpi से) और वैश्विक दमन प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की तैनाती और एलर्जी प्रतिक्रियाओं को मध्यस्थ करने के लिए सैलिसिलिक एसिड मार्ग के साथ उनकी अंतःक्रिया के आधार पर पादप प्रतिरक्षा को ट्रिगर कर सकता है 90,94।
निष्कर्षतः, सबसे अधिक प्रतिरोधी वंश (83A:476) के लिए प्रस्तावित रक्षा प्रतिक्रिया तंत्रों में R जीन (संभवतः TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) द्वारा रोगजनक की तीव्र पहचान और एलर्जी प्रतिक्रिया-मध्यस्थता वाले सैलिसिलिक एसिड और एथिलीन सिग्नलिंग शामिल हैं, जिसके बाद लंबी दूरी की SAR क्रिया की स्थापना होती है। DIR-1 प्रोटीन द्वारा इस क्रिया को समर्थन मिलता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि C. lupini संक्रमण की जैवपोषी अवधि बहुत छोटी (लगभग 2 दिन) होती है, जिसके बाद परावैद्युत वृद्धि होती है95। इन चरणों के बीच का संक्रमण परावैद्युत और एथिलीन-प्रेरित प्रोटीन की अभिव्यक्ति से जुड़ा हो सकता है जो मेजबान पौधों में अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रियाओं के लिए ट्रिगर के रूप में कार्य करते हैं। इसलिए, जैवपोषी अवस्था में C. lupini को सफलतापूर्वक पकड़ने के लिए समय सीमा बहुत कम होती है। 83A:476 में 6 hpi पर देखे गए रेडॉक्स और प्रकाश संश्लेषण से जुड़े जीनों का पुनर्प्रोग्रामिंग कवक हाइफे की प्रगति के अनुरूप है और जैवपोषी अवस्था में एक सफल सुरक्षात्मक प्रतिक्रिया के विकास का संकेत देता है। मैंडेलुप और 22660 आबादी की ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रतिक्रियाएं कवक के नेक्रोटिक विकास में बदलने से पहले उसे पकड़ने के लिए बहुत विलंबित हो सकती हैं, हालांकि, मैंडेलुप 22660 आबादी की तुलना में अधिक प्रभावी हो सकता है क्योंकि PR-10 प्रोटीन का अपेक्षाकृत तेज़ विनियमन क्षैतिज प्रतिरोध को बढ़ावा देता है।
मानक R जीन द्वारा संचालित ETI, फलियों में एंथ्रेक्नोज़ के प्रति प्रतिरोधक क्षमता का एक सामान्य तंत्र प्रतीत होता है। इस प्रकार, मॉडल फलीदार पौधे मेडिकागो ट्रंकैटुला में, एंथ्रेक्नोज़ के प्रति प्रतिरोधक क्षमता RCT1 जीन द्वारा प्रदान की जाती है, जो TIR-NBS-LRR97 पादप R जीन वर्ग का एक सदस्य है। यह जीन संवेदनशील पौधों में स्थानांतरित होने पर अल्फाल्फा में भी व्यापक-स्पेक्ट्रम एंथ्रेक्नोज़ प्रतिरोधक क्षमता प्रदान करता है। सामान्य फली (P. vulgaris) में, अब तक दो दर्जन से अधिक एंथ्रेक्नोज़ प्रतिरोधक जीन की पहचान की जा चुकी है। इनमें से कुछ जीन उन क्षेत्रों में पाए जाते हैं जहाँ कोई मानक R जीन नहीं होता है, जबकि कई अन्य जीन NBS-LRR जीन समूह वाले गुणसूत्रों के किनारों पर स्थित होते हैं, जिनमें TIR-NBS-LRRs99 भी शामिल है। जीनोम-व्यापी SSR अध्ययन ने भी सामान्य फली में एंथ्रेक्नोज़ प्रतिरोधक क्षमता के साथ NBS-LRR जीन के संबंध की पुष्टि की है। सफेद ल्यूपिन 101 में प्रमुख एंथ्रेक्नोज प्रतिरोध लोकस वाले जीनोमिक क्षेत्र में कैनोनिकल आर जीन भी पाया गया।
हमारे शोध से पता चलता है कि पौधे में संक्रमण के शुरुआती चरण में (अधिमानतः संक्रमण के 12 घंटे बाद) सक्रिय होने वाली तत्काल प्रतिरोधक प्रतिक्रिया, संकीर्ण पत्ती वाले ल्यूपिन को रोगजनक कवक Collelotrichum lupini के कारण होने वाले एंथ्रेक्नोज़ रोग से प्रभावी ढंग से बचाती है। उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण का उपयोग करते हुए, हमने Lanr1 और AnMan प्रतिरोधक जीनों द्वारा मध्यस्थता किए गए NLL पौधों में एंथ्रेक्नोज़ प्रतिरोधक जीनों के विभेदक अभिव्यक्ति प्रोफाइल को प्रदर्शित किया। सफल रक्षा में, पौधे के रोगजनक के साथ पहले संपर्क के कुछ ही घंटों के भीतर रेडॉक्स, प्रकाश संश्लेषण और रोगजनन में शामिल प्रोटीन के लिए जीनों को सावधानीपूर्वक डिज़ाइन करना शामिल है। इसी तरह की सुरक्षात्मक प्रतिक्रियाएं, लेकिन समय में विलंबित होने पर, पौधों को रोगों से बचाने में बहुत कम प्रभावी होती हैं। Lanr1 जीन द्वारा मध्यस्थता की गई एंथ्रेक्स प्रतिरोधकता R जीन (प्रभावक-प्रेरित प्रतिरक्षा) की विशिष्ट तीव्र प्रतिक्रिया के समान है, जबकि AnMan जीन संभवतः एक क्षैतिज प्रतिक्रिया (सूक्ष्मजीव-संबंधित आणविक पैटर्न द्वारा प्रेरित प्रतिरक्षा) प्रदान करता है, जो स्थिरता का एक मध्यम स्तर प्रदान करता है।
एन्थ्रेक्नोज़ मार्करों की जांच के लिए उपयोग की गई 215 एनएलएल लाइनों में 74 किस्में, क्रॉसिंग या प्रजनन द्वारा प्राप्त 60 लाइनें, 5 उत्परिवर्ती और 76 जंगली या मूल जर्मप्लाज्म शामिल थे। ये लाइनें 17 देशों से प्राप्त की गईं, जिनमें मुख्य रूप से पोलैंड (58), स्पेन (47), जर्मनी (27), ऑस्ट्रेलिया (26), रूस (19), बेलारूस (7), इटली (5) और अन्य 10 देशों से थीं। इस सेट में संदर्भ प्रतिरोधी लाइनें भी शामिल हैं: 83A:476, तंजिल, वोंगा (जिसमें Lanr1 एलील है) और मंडेलुप (जिसमें AnMan एलील है)। ये लाइनें पोज़नान प्लांट ब्रीडिंग लिमिटेड, वियाट्रोवो, पोलैंड द्वारा बनाए गए यूरोपीय ल्यूपिन आनुवंशिक संसाधन डेटाबेस से प्राप्त की गईं (पूरक तालिका S1)।
पौधों को नियंत्रित परिस्थितियों में उगाया गया (प्रकाश अवधि 16 घंटे, दिन में तापमान 25°C और रात में 18°C)। दो जैविक प्रतिकृतियों का विश्लेषण किया गया। प्रोटोकॉल के अनुसार, DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, जर्मनी) का उपयोग करके तीन सप्ताह पुराने पत्तों से DNA को पृथक किया गया। पृथक किए गए DNA की गुणवत्ता और सांद्रता का आकलन स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विधियों (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) द्वारा किया गया। एंथ्रेक्नोज़ प्रतिरोध जीन AnMan (जो कि मंडेलुप किस्म से प्राप्त किया गया है) को चिह्नित करने वाले AnManM1 मार्कर और जीन Lanr1 (जो कि तंजिल किस्म से प्राप्त किया गया है) के दोनों ओर स्थित Anseq3 और Anseq4 मार्करों का विश्लेषण किया गया 11,26,28। प्रतिरोधी एलील के लिए समयुग्मजी को "1", संवेदनशील को "0", और विषमयुग्मजी को 0.5 अंक दिए गए।
AnManM1, AnSeq3 और AnSeq4 मार्करों की स्क्रीनिंग के परिणामों और अंतिम अनुवर्ती प्रयोगों के लिए बीजों की उपलब्धता के आधार पर, एंथ्रेक्नोज़ प्रतिरोध फेनोटाइपिंग के लिए 50 NLL लाइनें चुनी गईं। यह विश्लेषण कंप्यूटर नियंत्रित ग्रीनहाउस में दो बार किया गया, जिसमें 14 घंटे का फोटोपीरियड था और दिन का तापमान 22°C और रात का तापमान 19°C था। बीजों को बोने से पहले खरोंचा जाता है (भ्रूण के विपरीत तरफ के बीज के छिलके को तेज ब्लेड से काटकर), ताकि बीज का छिलका बहुत सख्त होने के कारण बीज निष्क्रिय न हो और एकसमान अंकुरण सुनिश्चित हो सके। पौधों को 11 × 11 × 21 सेमी के गमलों में रोगाणु रहित मिट्टी (TS-1 REC 085 मीडियम बेसिक, क्लासमैन-डीलमैन पोल्स्का, वारसॉ, पोलैंड) में उगाया गया। 1999 में ग्रेटर पोलैंड के वेरज़ेनित्सा (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E) के एक खेत में उगाए गए संकीर्ण पत्तियों वाले ल्यूपिन पौधों के तनों से विकसित कोलेटोट्रिचम ल्यूपिनी कोल-08 स्ट्रेन से इनोक्यूलेशन किया गया। स्पोरुलेशन को प्रेरित करने के लिए आइसोलेट्स को 20°C तापमान पर ब्लैक लाइट में 21 दिनों तक SNA माध्यम में कल्चर किया गया। बुवाई के चार सप्ताह बाद, जब पौधे 4-6 पत्ती अवस्था में पहुँच गए, तो 0.5 x 10⁶ कोनिडिया प्रति मिलीलीटर की सांद्रता पर कोनिडिया के सस्पेंशन का छिड़काव करके इनोक्यूलेशन किया गया। इनोक्यूलेशन के बाद, कोनिडिया के अंकुरण और संक्रमण प्रक्रिया को सुगम बनाने के लिए पौधों को लगभग 98% आर्द्रता और 25°C तापमान पर 24 घंटे के लिए अंधेरे में रखा गया। पौधों को 14 घंटे के प्रकाश चक्र में 22°C दिन/19°C रात के तापमान और 70% आर्द्रता में उगाया गया। रोग का आकलन 22 दिन बाद किया गया, जो तनों और पत्तियों पर गलने वाले घावों की उपस्थिति या अनुपस्थिति के आधार पर 0 (प्रतिरक्षित) से 9 (अत्यधिक संवेदनशील) तक था। इसके अतिरिक्त, आकलन के बाद पौधों का वजन मापा गया। मार्कर जीनोटाइप और रोग फेनोटाइप के बीच संबंधों की गणना बिंदु-दो-अनुक्रम सहसंबंधों (एंथ्रेक्नोज प्रतिरोध फेनोटाइप के विश्लेषण के लिए चुनी गई लाइनों के समूह में विषमयुग्मजी मार्करों की अनुपस्थिति) के रूप में की गई।