ขอบคุณที่เข้าชม Nature.com เบราว์เซอร์ที่คุณใช้อยู่มีการรองรับ CSS อย่างจำกัด เพื่อประสบการณ์การใช้งานที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันล่าสุด (หรือปิดโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าเว็บไซต์จะยังคงได้รับการสนับสนุนต่อไป เราจะแสดงผลเว็บไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
ลูปินแองกัสติโฟเลียส (NLL, Lupinus angustifolius L.) เป็นพืชตระกูลถั่วที่ใช้ในการผลิตอาหารและปรับปรุงดิน การขยายตัวของการปลูก NLL ทั่วโลกได้ดึงดูดเชื้อราก่อโรคหลายชนิด รวมถึงโรคแอนแทรคโนสในลูปิน ซึ่งเป็นโรคที่ร้ายแรง มีการใช้แอลลีลสองชนิดคือ Lanr1 และ AnMan ซึ่งให้ความต้านทานเพิ่มขึ้น ในการปรับปรุงพันธุ์ NLL แต่กลไกทางโมเลกุลที่อยู่เบื้องหลังยังคงไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด ในการศึกษาครั้งนี้ ได้ใช้เครื่องหมาย Lanr1 และ AnMan ในการคัดกรองตัวอย่าง NLL จากยุโรป การทดสอบวัคซีนในสภาพแวดล้อมที่มีการควบคุมยืนยันประสิทธิภาพของผู้ให้ความต้านทานทั้งสองชนิด มีการทำโปรไฟล์การแสดงออกของยีนที่แตกต่างกันในสายพันธุ์ที่ต้านทานและอ่อนแอที่เป็นตัวแทน ความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนสมีความสัมพันธ์กับการแสดงออกมากเกินไปของคำศัพท์ทางชีววิทยาของยีน “GO:0006952 การตอบสนองต่อการป้องกัน”, “GO:0055114 กระบวนการรีดอกซ์” และ “GO:0015979 การสังเคราะห์แสง” นอกจากนี้ สายพันธุ์ Lanr1(83A:476) แสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของยีนอย่างมีนัยสำคัญอย่างรวดเร็วหลังการฉีดเชื้อ ในขณะที่สายพันธุ์อื่นๆ แสดงการตอบสนองที่ล่าช้าประมาณ 42 ชั่วโมง การตอบสนองด้านการป้องกันเกี่ยวข้องกับยีน TIR-NBS, CC-NBS-LRR และ NBS-LRR โปรตีน 10 ชนิดที่เกี่ยวข้องกับการเกิดโรค โปรตีนถ่ายโอนไขมัน เอนโดกลูแคน-1,3-β-กลูโคซิเดส โปรตีนผนังเซลล์ที่อุดมด้วยไกลซีน และยีนจากเส้นทางปฏิกิริยาของออกซิเจน การตอบสนองในช่วงแรกต่อ 83A:476 รวมถึงการยับยั้งยีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์แสงอย่างระมัดระวัง สอดคล้องกับการป้องกันที่ประสบความสำเร็จในช่วงระยะการเจริญเติบโตของเชื้อรา แสดงให้เห็นว่าตัวกระตุ้นทำให้เกิดภูมิคุ้มกัน ปฏิกิริยา Mandeloop ช้าลง เช่นเดียวกับแรงต้านแนวนอนโดยรวม
ลูปินใบแคบ (NLL, Lupinus angustifolius L.) เป็นธัญพืชโปรตีนสูงที่มีถิ่นกำเนิดในแถบเมดิเตอร์เรเนียนตะวันตก1,2 ปัจจุบันปลูกเป็นพืชอาหารสำหรับสัตว์และมนุษย์ นอกจากนี้ยังถือเป็นปุ๋ยพืชสดในระบบการปลูกพืชหมุนเวียนเนื่องจากการตรึงไนโตรเจนโดยแบคทีเรียตรึงไนโตรเจนแบบพึ่งพาอาศัยกันและการปรับปรุงโครงสร้างดินโดยรวม ลูปินใบแคบได้ผ่านกระบวนการปรับปรุงพันธุ์อย่างรวดเร็วในศตวรรษที่ผ่านมาและยังคงอยู่ภายใต้แรงกดดันในการปรับปรุงพันธุ์สูง3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ด้วยการปลูกลูปินใบแคบอย่างแพร่หลาย เชื้อราก่อโรคได้พัฒนาแหล่งที่อยู่อาศัยทางการเกษตรใหม่และก่อให้เกิดโรคทำลายพืชผลชนิดใหม่ สิ่งที่โดดเด่นที่สุดสำหรับเกษตรกรและผู้เพาะพันธุ์ลูปินคือการปรากฏตัวของโรคแอนแทรคโนส ซึ่งเกิดจากเชื้อราก่อโรค Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 สิ่งที่โดดเด่นที่สุดสำหรับเกษตรกรและผู้เพาะพันธุ์ลูปินคือการปรากฏตัวของโรคแอนแทรคโนส ซึ่งเกิดจากเชื้อราก่อโรค Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. สิ่งที่โดดเด่นที่สุดสำหรับเกษตรกรและผู้เพาะพันธุ์ลูปินคือการเกิดโรคแอนแทรคโนสที่เกิดจากเชื้อราก่อโรค Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Haired。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. สิ่งที่น่าตกใจที่สุดสำหรับเกษตรกรและผู้เพาะพันธุ์ลูปินคือการเกิดโรคแอนแทรคโนสที่เกิดจากเชื้อราก่อโรค Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13รายงานแรกสุดเกี่ยวกับโรคนี้มาจากบราซิลและสหรัฐอเมริกา โดยมีอาการทั่วไปปรากฏขึ้นในปี 1912 และ 1929 ตามลำดับ อย่างไรก็ตาม หลังจากนั้นประมาณ 30 ปี เชื้อก่อโรคนี้จึงได้รับการกำหนดชื่ออย่างเป็นทางการว่า Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (สโตนแมน) สเปลด์ & Sacc., teleomorph ของ Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，มี目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，มี目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (สโตนแมน) Spauld в целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld ใน Targeted Morphology และ เอช. ชเรนค์ และ เอช. ชเรนค์, .และ เอช. ชเรนค์ & H.施伦克，。 & H.施伦克，。และ เอช. ชเลนค์, .การศึกษาลักษณะทางฟีโนไทป์ของโรคเบื้องต้นที่ดำเนินการในช่วงกลางศตวรรษที่ 20 แสดงให้เห็นถึงความต้านทานในสายพันธุ์ NLL และลูปินสีเหลือง (L. luteus L.) แต่สายพันธุ์ลูปินสีขาว (L. albus L.) ที่ทดสอบทั้งหมดมีความอ่อนแอต่อโรคสูงมาก15,16 การศึกษาต่างๆ แสดงให้เห็นว่าการเกิดโรคแอนแทรคโนสมีความสัมพันธ์กับปริมาณน้ำฝนที่เพิ่มขึ้น (ความชื้นในอากาศ) และอุณหภูมิ (ในช่วง 12-28°C) ซึ่งนำไปสู่การทำลายความต้านทานที่อุณหภูมิสูงขึ้น17, 18 ในความเป็นจริง เวลาที่จำเป็นสำหรับการงอกของสปอร์และการเริ่มต้นของโรคจะสั้นกว่าถึงสี่เท่าที่ 24°C (4 ชั่วโมง) เมื่อเทียบกับที่ 12°C (16 ชั่วโมง) ภายใต้สภาวะความชื้นสูง19 ดังนั้น ภาวะโลกร้อนที่กำลังดำเนินอยู่จึงนำไปสู่การแพร่กระจายของโรคแอนแทรคโนส อย่างไรก็ตาม โรคนี้ถูกพบในฝรั่งเศส (1982) และยูเครน (1983) ซึ่งเป็นลางบอกเหตุของภัยคุกคามที่กำลังจะเกิดขึ้น แต่ดูเหมือนว่าอุตสาหกรรมลูปินจะเพิกเฉยในขณะนั้น20,21 ไม่กี่ปีต่อมา โรคร้ายแรงนี้ได้แพร่กระจายไปทั่วโลกและส่งผลกระทบต่อประเทศผู้ผลิตลูปินรายใหญ่ เช่น ออสเตรเลีย โปแลนด์ และเยอรมนี22,23,24 หลังจากการระบาดของโรคแอนแทรคโนสในช่วงกลางทศวรรษ 1990 การคัดกรองอย่างกว้างขวางส่งผลให้มีการระบุผู้ให้กำเนิดที่ต้านทานหลายรายในตัวอย่าง NLL19 ความต้านทานของ NLL ต่อโรคแอนแทรคโนสถูกควบคุมโดยอัลลีลเด่นสองชนิดที่แยกจากกันซึ่งพบในแหล่งเชื้อพันธุ์ที่แตกต่างกัน ได้แก่ Lanr1 ในพันธุ์ Tanjil และ Wonga และ AnMan ในพันธุ์ Mandalay 25, 26 อัลลีลเหล่านี้เสริมกับเครื่องหมายโมเลกุลที่สนับสนุนการคัดเลือกเชื้อพันธุ์ที่ต้านทานในโครงการปรับปรุงพันธุ์25,26,27,28,29,30 สายพันธุ์ต้านทาน 83A:476 ที่มีอัลลีล Lanr1 ถูกผสมกับสายพันธุ์ป่าที่อ่อนแอ P27255 เพื่อให้ได้ประชากร RIL ที่มีการแยกตัวของความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนส ซึ่งทำให้สามารถกำหนดตำแหน่งของยีน Lanr1 บนโครโมโซม NLL-1131, 32, 33 ได้ การจัดเรียงเครื่องหมายแผนที่การเชื่อมโยงจากตำแหน่งต้านทานที่อยู่รอบข้างโรคแอนแทรคโนสด้วยกรอบจีโนม NLL เผยให้เห็นตำแหน่งของอัลลีลทั้งสามบนโครโมโซมเดียวกัน (NLL-11) แต่ในตำแหน่งที่แตกต่างกัน29,34,35 อย่างไรก็ตาม เนื่องจากจำนวน RIL น้อยและระยะห่างทางพันธุกรรมระหว่างเครื่องหมายและอัลลีลที่สอดคล้องกันมีมาก จึงไม่สามารถสรุปได้อย่างน่าเชื่อถือเกี่ยวกับยีนพื้นฐานของพวกมัน ในทางกลับกัน การใช้พันธุศาสตร์ย้อนกลับในลูปินนั้นทำได้ยากเนื่องจากศักยภาพในการสร้างใหม่ต่ำมาก ซึ่งทำให้การจัดการทางพันธุกรรมยุ่งยาก37
การพัฒนาเชื้อพันธุ์พืชที่ได้รับการปรับปรุงพันธุ์ซึ่งมีอัลลีลที่ต้องการในสภาวะโฮโมไซกัส เช่น 83A:476 (Lanr1) และ Mandelup (AnMan) ได้เปิดประตูสู่การศึกษาความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนสในสภาวะที่มีอัลลีลที่ตรงกันข้ามกันในประชากรป่า ความเป็นไปได้ของกลไกทางโมเลกุล การเปรียบเทียบการตอบสนองการป้องกันที่เกิดจากจีโนไทป์เฉพาะ การศึกษานี้ประเมินการตอบสนองของทรานสคริปโตมในระยะเริ่มต้นของ NLL ต่อการฉีดวัคซีน C. lupini ขั้นแรก แผงเชื้อพันธุ์ NLL จากยุโรปที่มี 215 สายพันธุ์ได้รับการคัดกรองโดยใช้เครื่องหมายโมเลกุลที่ระบุอัลลีล Lanr1 และ AnMan จากนั้นจึงทำการประเมินลักษณะทางฟีโนไทป์ของโรคแอนแทรคโนสใน 50 สายพันธุ์ NLL ที่คัดเลือกไว้ก่อนหน้านี้สำหรับเครื่องหมายโมเลกุล ภายใต้สภาวะควบคุม จากผลการทดลองเหล่านี้ ได้คัดเลือกสายพันธุ์พืช 4 สายพันธุ์ที่มีความแตกต่างกันในด้านความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนสและองค์ประกอบของอัลลีล Lanr1/AnMan เพื่อทำการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนป้องกันโดยใช้สองแนวทางที่เสริมกัน ได้แก่ การจัดลำดับ RNA แบบความละเอียดสูงและการหาปริมาณด้วย PCR แบบเรียลไทม์
จากการคัดกรองเชื้อพันธุ์ NLL จำนวน 215 สายพันธุ์ โดยใช้เครื่องหมาย Lanr1 (Anseq3 และ Anseq4) และ AnMan (Anseq4) และ AnMan (AnManM1) พบว่ามีเพียงสายพันธุ์เดียว (95726 ใกล้กับ Salamanca-b) ที่แสดงอัลลีล "ต้านทาน" สำหรับเครื่องหมายทั้งหมด ในขณะที่ "การมีอยู่ของอัลลีล 'อ่อนแอ'" พบสัดส่วนของเครื่องหมายทั้งหมดใน 158 สายพันธุ์ (~73.5%) มี 13 สายพันธุ์ที่สร้างอัลลีล "ต้านทาน" สองตัวของเครื่องหมาย Lanr1 และ 8 สายพันธุ์ที่สร้างอัลลีล "ต้านทาน" ของเครื่องหมาย AnMan (ตารางเสริม S1) พบว่ามีสองสายพันธุ์ที่เป็นเฮเทอโรไซกัสสำหรับเครื่องหมาย Anseq3 และหนึ่งสายพันธุ์เป็นเฮเทอโรไซกัสสำหรับเครื่องหมาย AnManM1 สายพันธุ์จำนวน 42 สายพันธุ์ (19.5%) มีอัลลีล Anseq3 และ Anseq4 ที่มีเฟสตรงข้ามกัน ซึ่งบ่งชี้ถึงความถี่สูงของการเกิดการรวมตัวใหม่ระหว่างสองตำแหน่งนี้ ลักษณะอาการของโรคแอนแทรคโนสภายใต้สภาวะควบคุม (ตารางเสริม S2) เผยให้เห็นความแปรปรวนในความต้านทานของสายพันธุ์ที่ทดสอบ ซึ่งสะท้อนให้เห็นในความรุนแรงของโรคแอนแทรคโนส ความแตกต่างของคะแนนเฉลี่ยมีตั้งแต่ 1.8 (ต้านทานปานกลาง) ถึง 6.9 (อ่อนแอ) และความแตกต่างของน้ำหนักต้นมีตั้งแต่ 0.62 (อ่อนแอ) ถึง 4.45 กรัม (ต้านทาน) มีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญระหว่างค่าที่สังเกตได้ในการทดลองซ้ำสองครั้ง (0.51 สำหรับคะแนนความรุนแรงของโรค, P = 0.00017 และ 0.61 สำหรับน้ำหนักของพืช, P < 0.0001) เช่นเดียวกับความสัมพันธ์ระหว่างพารามิเตอร์ทั้งสองนี้ (− 0.59 และ − 0.77, P < 0.0001) มีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญระหว่างค่าที่สังเกตได้ในการทดลองซ้ำสองครั้ง (0.51 สำหรับคะแนนความรุนแรงของโรค, P = 0.00017 และ 0.61 สำหรับน้ำหนักของพืช, P < 0.0001) เช่นเดียวกับความสัมพันธ์ระหว่างพารามิเตอร์ทั้งสองนี้ (− 0.59 และ − 0.77, P < 0.0001) Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 และ 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, ร< 0.0001) 0.0001) พบความสัมพันธ์ที่มีนัยสำคัญระหว่างค่าที่สังเกตได้ในการทดลองซ้ำสองครั้ง (0.51 สำหรับคะแนนความรุนแรงของโรค, P = 0.00017 และ 0.61 สำหรับน้ำหนักของพืช, P < 0.0001) เช่นเดียวกับระหว่างพารามิเตอร์ทั้งสองนี้ (-0.59 และ -0.77, P < 0.0001)在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为0.51,P = 0.00017，植物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P < 0.0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为 分为 0.51 , p = 0.00017 ， 植物 为 为 0.61 , p <0.0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0.59 和– 0.59 和– 0.59 和– 0.59 和- 0.77，P < 0.0001) Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 และ масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001. มีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญระหว่างค่าที่สังเกตได้ซ้ำกัน (คะแนนความรุนแรงของโรค 0.51, P = 0.00017 และน้ำหนักของพืช 0.61, P < 0.0001) และระหว่างพารามิเตอร์ทั้งสองนี้ (-0.59 และ -0.0001) 0.77, P < 0.0001 ).อาการทั่วไปที่พบในพืชที่อ่อนแอต่อโรค ได้แก่ ลำต้นบิดงอคล้ายคันธนูของคนเลี้ยงแกะ ตามด้วยแผลรูปไข่ที่มีสปอโรซอยต์สีส้ม/ชมพู (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 1) พันธุ์พืชจากออสเตรเลียที่มียีน Lanr1 (83A:476 และ Tanjil) และ AnMan (Mandelup) มีความต้านทานปานกลาง (0.0331 และ 0.0036) ตามลำดับ บางสายพันธุ์ที่มียีน Lanr1 และ/หรือ AnMan ที่ "ต้านทาน" ก็ยังแสดงอาการของโรคอยู่
ที่น่าสนใจคือ สายพันธุ์ NLL บางสายพันธุ์ที่ไม่มีอัลลีลเครื่องหมาย "ต้านทาน" ใดๆ กลับแสดงให้เห็นถึงระดับความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนสสูง (เทียบเท่าหรือสูงกว่าสายพันธุ์ Lanr1 หรือ AnMan) เช่น Boregine (ค่า P < 0.0001 สำหรับทั้งสองพารามิเตอร์), Bojar (ค่า P < 0.0001 สำหรับคะแนนและ 0.001 สำหรับน้ำหนักต้น) และ Population B-549/79b (ค่า P < 0.0001 สำหรับคะแนนและไม่มีนัยสำคัญสำหรับน้ำหนัก) ที่น่าสนใจคือ สายพันธุ์ NLL บางสายพันธุ์ที่ไม่มีอัลลีลเครื่องหมาย "ต้านทาน" ใดๆ กลับแสดงให้เห็นถึงระดับความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนสสูง (เทียบเท่าหรือสูงกว่าสายพันธุ์ Lanr1 หรือ AnMan) เช่น Boregine (ค่า P < 0.0001 สำหรับทั้งสองพารามิเตอร์), Bojar (ค่า P < 0.0001 สำหรับคะแนนและ 0.001 สำหรับน้ำหนักต้น) และ Population B-549/79b (ค่า P < 0.0001 สำหรับคะแนนและไม่มีนัยสำคัญสำหรับน้ำหนัก) Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 ดีเลีย обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы) ที่น่าสนใจคือ สายพันธุ์ NLL หลายสายพันธุ์ที่ไม่มีอัลลีลเครื่องหมาย 'ต้านทาน' ใดๆ กลับแสดงความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนสในระดับสูง (เทียบเท่าหรือสูงกว่าจีโนไทป์ Lanr1 หรือ AnMan) เช่น Boregine (ค่า P < 0.0001 สำหรับทั้งสองพารามิเตอร์), Bojar (ค่า P < 0.0001 สำหรับการประเมินและ 0.001 สำหรับน้ำหนักต้น) และประชากร B-549/79b (ค่า P < 0.0001 สำหรับการประเมินและไม่มีนัยสำคัญสำหรับน้ำหนัก)มี趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1 或AnMan基因型相当或更高),例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）。 เป็นที่น่าสนใจว่าระบบ NLL บางระบบที่ไม่มีเครื่องหมาย "แอนติเจน" ใดๆ กลับแสดงความต้านทานในแนวนอนสูง (เทียบเท่ากับยีน Lanr1 หรือ AnMan หรือสูงกว่า) เช่น Boregine (ทั้งสองพารามิเตอร์ P < 0.0001), Bojar (ค่า P < 0.0001, น้ำหนักต้น 0.001) และสายพันธุ์ B-549/79b (ค่า P < 0.0001, น้ำหนักไม่มีนัยสำคัญ) Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) и популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). ที่น่าสนใจคือ สายพันธุ์ NLL บางสายพันธุ์ที่ไม่มีอัลลีลเครื่องหมาย 'ความต้านทาน' ใดๆ กลับแสดงความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนสในระดับสูง (เทียบเท่าหรือสูงกว่าจีโนไทป์ Lanr1 หรือ AnMan) เช่น Boregine (ค่า P สำหรับทั้งสองพารามิเตอร์ <0.0001), Bojar (ค่า P < 0.0001, น้ำหนักต้น 0.001) และประชากร B-549/79b (ค่า P < 0.0001, น้ำหนักไม่มีนัยสำคัญ)ปรากฏการณ์นี้ชี้ให้เห็นถึงความเป็นไปได้ของแหล่งพันธุกรรมต้านทานแบบใหม่ ซึ่งอธิบายถึงการขาดความสัมพันธ์ที่สังเกตได้ระหว่างจีโนไทป์ของเครื่องหมายและฟีโนไทป์ของโรค (ค่า P ตั้งแต่ ~0.42 ถึง ~0.98) ดังนั้น การทดสอบ Kolmogorov-Smirnov แสดงให้เห็นว่าข้อมูลเกี่ยวกับการต้านทานโรคแอนแทรคโนสมีการกระจายแบบปกติโดยประมาณสำหรับคะแนน (ค่า P 0.25 และ 0.11) และมวลของพืช (ค่า P 0.47 และ 0.55) ซึ่งชี้ให้เห็นว่าสมมติฐานของฉันคือมีอัลลีลมากกว่า Lanr1 และ AnMan ที่เกี่ยวข้อง
จากผลการคัดกรองความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนส ได้คัดเลือกสายพันธุ์ 4 สายพันธุ์สำหรับการวิเคราะห์ทรานสคริปโตม ได้แก่ 83A:476, Boregine, Mandelup และ Population 22660 สายพันธุ์เหล่านี้ได้รับการทดสอบความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนสอีกครั้งในการทดลองฉีดเชื้อโดยใช้การจัดลำดับ RNA โดยมีเงื่อนไขว่าต้องเป็นสายพันธุ์เดียวกับในการทดสอบครั้งก่อน ค่าคะแนนที่ได้มีดังนี้: Boregine (1.71 ± 1.39), 83A:476 (2.09 ± 1.38), Mandelup (3.82 ± 1.42) และ Population 22660 (6.11 ± 1.29)
โปรโตคอล Illumina NovaSeq 6000 ให้ผลลัพธ์เฉลี่ย 40.5 ล้านคู่ลำดับอ่านต่อตัวอย่าง (29.7 ถึง 54.4 ล้านลำดับอ่าน) (ตารางเสริม S3) คะแนนการจัดเรียงลำดับในลำดับอ้างอิงอยู่ในช่วง 75.5% ถึง 88.6% ค่าสหสัมพันธ์เฉลี่ยของข้อมูลจำนวนลำดับอ่านระหว่างตัวแปรทดลองระหว่างตัวอย่างซ้ำทางชีวภาพอยู่ในช่วง 0.812 ถึง 0.997 (ค่าเฉลี่ย 0.959) จากยีนทั้งหมด 35,170 ยีนที่ได้รับการวิเคราะห์ พบว่า 2917 ยีนไม่มีการแสดงออก และอีก 4785 ยีนมีการแสดงออกในระดับที่น้อยมาก (ค่าเฉลี่ยพื้นฐาน < 5) จากยีนทั้งหมด 35,170 ยีนที่ได้รับการวิเคราะห์ พบว่า 2917 ยีนไม่มีการแสดงออก และอีก 4785 ยีนมีการแสดงออกในระดับที่น้อยมาก (ค่าเฉลี่ยพื้นฐาน < 5) ที่ตั้ง 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5). จากยีนทั้งหมด 35,170 ยีนที่ได้รับการวิเคราะห์ พบว่า 2917 ยีนไม่แสดงออก และอีก 4785 ยีนที่เหลือแสดงออกในระดับที่น้อยมาก (ค่าเฉลี่ยพื้นฐาน <5)在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35,170 ที่ตั้ง 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительную экспрессию (базовое среднее значение <5). จากยีนทั้งหมด 35,170 ยีนที่ได้รับการวิเคราะห์ พบว่า 2917 ยีนไม่แสดงออก และยีนที่เหลืออีก 4785 ยีนมีการแสดงออกในระดับน้อยมาก (ค่าเฉลี่ยฐาน <5)ดังนั้น จำนวนยีนที่ถือว่ามีการแสดงออก (ค่าเฉลี่ยฐาน ≥ 5) ในระหว่างการทดลองคือ 27,468 (78.1%) (ตารางเสริม S4)
ตั้งแต่จุดเวลาแรก สายพันธุ์ NLL ทั้งหมดตอบสนองต่อการปลูกเชื้อ C. lupini (สายพันธุ์ Col-08) โดยการปรับเปลี่ยนการแสดงออกของยีน (ตารางที่ 1) อย่างไรก็ตาม พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างสายพันธุ์ต่างๆ เช่น สายพันธุ์ต้านทาน 83A:476 (ที่มียีน Lanr1) แสดงการปรับเปลี่ยนการแสดงออกของยีนอย่างมีนัยสำคัญ ณ จุดเวลาแรก (6 ชั่วโมงหลังการปลูกเชื้อ) โดยมีจำนวนยีนที่แสดงออกเพิ่มขึ้นและลดลงเพิ่มขึ้น 31-69 เท่า เมื่อเทียบกับจุดเวลาอื่นๆ นอกจากนี้ จุดสูงสุดนี้มีอายุสั้น เนื่องจากมีการแสดงออกของยีนเพียงไม่กี่ตัวเท่านั้นที่ยังคงเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญ ณ จุดเวลาที่สอง (12 ชั่วโมงหลังการปลูกเชื้อ) ที่น่าสนใจคือ Boregine ซึ่งแสดงความต้านทานสูงในการทดสอบการปลูกถ่าย ไม่ได้มีการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของยีนอย่างมากในระหว่างการทดลอง อย่างไรก็ตาม จำนวนยีนที่แสดงออกแตกต่างกัน (DEG) เท่ากันสำหรับ Boregine และ 83A:476 ที่ 12 ชั่วโมงหลังการปลูกเชื้อ ทั้ง Mandelup และประชากร 22660 แสดงค่า DEG สูงสุดที่จุดเวลาสุดท้าย (48 ลิตร/วินาที) ซึ่งบ่งชี้ถึงความล่าช้าสัมพัทธ์ในการตอบสนองการป้องกัน
เนื่องจากสายพันธุ์ 83A:476 มีการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของยีนอย่างมากเมื่อตอบสนองต่อ C. lupini ในช่วง 6 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ เมื่อเทียบกับสายพันธุ์อื่นๆ ประมาณ 91% ของยีนที่แสดงออกแตกต่างกัน (DEG) ที่สังเกตได้ในช่วงเวลานี้จึงเป็นยีนเฉพาะสายพันธุ์ (รูปที่ 1) อย่างไรก็ตาม มีการทับซ้อนกันบ้างในการตอบสนองในช่วงแรกระหว่างสายพันธุ์ที่ศึกษา โดย 68.5%, 50.9% และ 52.6% ของ DEG ใน Boregine, Mandelup และประชากร 22660 ตามลำดับ ทับซ้อนกับ DEG ที่พบใน 83A:476 ในบางช่วงเวลา แต่ DEG เหล่านี้คิดเป็นเพียงส่วนน้อย (0.97–1.70%) ของ DEG ทั้งหมดที่ตรวจพบในปัจจุบันโดยใช้ 83A:476 นอกจากนี้ ยีนที่แสดงออกแตกต่างกัน 11 ยีนจากทุกสายพันธุ์มีความสอดคล้องกันในเวลานี้ (ตารางเสริม S4-S6) ซึ่งรวมถึงส่วนประกอบทั่วไปของการตอบสนองการป้องกันของพืช ได้แก่ โปรตีนถ่ายโอนไขมัน (TanjilG_32225), เอนไซม์เอนโดกลูแคน-1,3-β-กลูโคไซด์ (TanjilG_23384), โปรตีนที่เหนี่ยวนำโดยความเครียดสองชนิด เช่น SAM22 (TanjilG_31528 และ TanjilG_31531), โปรตีนน้ำยางพื้นฐาน (TanjilG_32352) และโปรตีนผนังเซลล์โครงสร้างที่อุดมด้วยไกลซีนสองชนิด (TanjilG_19701 และ TanjilG_19702) นอกจากนี้ ยังพบว่ามีการทับซ้อนกันค่อนข้างสูงในผลตอบสนองของทรานสคริปโตมระหว่าง 83A:476 และ Boregine ที่ 24 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ (รวม 16-38% ของยีนที่แสดงออกแตกต่างกัน) และระหว่าง Mandelup และ Population 22660 ที่ 48 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ (รวม 14-20% ของยีนที่แสดงออกแตกต่างกัน)
แผนภาพเวนน์แสดงจำนวนยีนที่แสดงออกแตกต่างกัน (DEG) ในสายพันธุ์ลูปินใบแคบ (NLL) ที่ได้รับการฉีดวัคซีนด้วยเชื้อรา Colletotrichum lupini (สายพันธุ์ Col-08 ที่ได้จากแปลงลูปินในเมืองเวียร์เซนิเซ ประเทศโปแลนด์ ปี 1999) สายพันธุ์ NLL ที่นำมาวิเคราะห์ ได้แก่ 83A:476 (ต้านทาน มีอัลลีล Lanr1), Boregine (ต้านทาน ไม่ทราบพื้นฐานทางพันธุกรรม), Mandelup (ต้านทานปานกลาง มีอัลลีล AnMan) และประชากร 22660 (อ่อนแอมาก) ตัวย่อ hpi หมายถึงชั่วโมงหลังการฉีดวัคซีน ค่าศูนย์ถูกลบออกเพื่อให้กราฟง่ายขึ้น
ชุดยีนที่มีการแสดงออกมากเกินไปที่ 6 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อได้รับการวิเคราะห์เพื่อตรวจสอบการมีอยู่ของโดเมนยีน R แบบดั้งเดิม (ตารางเสริม S7) การศึกษานี้เผยให้เห็นการเหนี่ยวนำทรานสคริปโตมของยีนต้านทานโรคแบบคลาสสิกที่มีโดเมน NBS-LRR เฉพาะที่ 83A:476 เท่านั้น ชุดนี้ประกอบด้วยยีน TIR-NBS-LRR หนึ่งยีน (tanjilg_05042), ยีน CC-NBS-LRR ห้ายีน (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 และ tanjilg_16162), และยีน NBS-LR สี่ยีน (tanjilg_16162), ยีน NBS-LRRE สี่ยีน (tanjilg_16162) รวมถึงยีน NBS-Lrr สี่ยีน (tanjilg_16162) และยีน NBS-LRR สี่ยีน (TANJILG_16162) ยีนทั้งหมดเหล่านี้มีโดเมนแบบดั้งเดิมที่จัดเรียงอยู่ในลำดับที่อนุรักษ์ไว้ นอกจากยีนโดเมน NBS-LRR แล้ว ยังมีการกระตุ้นไคเนส RLL หลายตัวที่ 6 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ ได้แก่ หนึ่งตัวใน Boregine (TanjilG_19877) สองตัวใน Mandelup (TanjilG_07141 และ TanjilG_19877) และในประชากร 22660 (TanjilG_09014 และ TanjilG_10361) และสองตัวใน 83A 27:476
ยีนที่มีการแสดงออกเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อตอบสนองต่อการฉีดเชื้อ C. lupini (สายพันธุ์ Col-08) จะถูกนำไปวิเคราะห์การเสริมคุณค่าทางชีววิทยาของยีน (Gene Ontology, GO) (ตารางเสริม S8) คำศัพท์กระบวนการทางชีวภาพที่ปรากฏบ่อยที่สุดคือ “GO:0006952 การตอบสนองการป้องกัน” ซึ่งปรากฏใน 6 จาก 16 ชุดค่าผสม (เวลา × สายพันธุ์) ที่มีนัยสำคัญสูง (ค่า P < 0.001) (รูปที่ 2) คำศัพท์กระบวนการทางชีวภาพที่ปรากฏบ่อยที่สุดคือ “GO:0006952 การตอบสนองการป้องกัน” ซึ่งปรากฏใน 6 จาก 16 ชุดค่าผสม (เวลา × สายพันธุ์) ที่มีนัยสำคัญสูง (ค่า P < 0.001) (รูปที่ 2) Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2) คำศัพท์กระบวนการทางชีวภาพที่ปรากฏบ่อยที่สุดคือ 'GO:0006952 การตอบสนองต่อการป้องกัน' ซึ่งปรากฏใน 6 จาก 16 ชุดค่าผสม (เวลา × สายพันธุ์) ที่มีนัยสำคัญสูง (ค่า P < 0.001) (รูปที่ 2)最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”,它出现在16 个（时间×线）组合中的6个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（จิน2）。 คำศัพท์กระบวนการทางชีวภาพที่เป็นตัวแทนมากที่สุดคือ “GO:0006952 การตอบสนองการป้องกัน” ซึ่งปรากฏใน 6 จาก 16 ชุด (เวลา×เส้น) โดยมีนัยสำคัญสูง (ค่า P < 0.001) (รูปที่ 2) Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», который появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2) คำศัพท์กระบวนการทางชีวภาพที่ปรากฏบ่อยที่สุดคือ 'GO:0006952 Defense Response' ซึ่งปรากฏใน 6 จาก 16 ชุดค่าผสม (เวลา × สายพันธุ์) ที่มีนัยสำคัญสูง (ค่า P < 0.001) (รูปที่ 2)คำนี้ปรากฏมากเกินไปในสองช่วงเวลาใน 83A:476 และ Boregine (6 และ 24 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ) และในหนึ่งช่วงเวลาใน Mandelup และ Population 22660 (12 และ 6 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ ตามลำดับ) นี่เป็นผลลัพธ์ที่คาดการณ์ไว้ ซึ่งเน้นให้เห็นถึงการตอบสนองต่อเชื้อราของสายพันธุ์ที่ต้านทาน นอกจากนี้ 83A:476 ตอบสนองต่อ C. lupini โดยการกระตุ้นยีนที่เกี่ยวข้องกับการระเบิดออกซิเดชันอย่างรวดเร็ว ซึ่งแสดงโดยคำว่า “GO:0055114 redox process” บ่งชี้ถึงการตอบสนองการป้องกันที่เฉพาะเจาะจง ในขณะที่ Boregine แสดงการตอบสนองการป้องกันที่เฉพาะเจาะจง ซึ่งเกี่ยวข้องกับคำว่า 'GO' :0006950 การตอบสนองต่อความเครียด” ประชากร 22660 กระตุ้นการตอบสนองต่อความต้านทานในแนวนอนที่เกี่ยวข้องกับเมตาโบไลต์รอง โดยเน้นจำนวนคำศัพท์ที่มากเกินไป “GO:0016104 กระบวนการสังเคราะห์ไตรเทอร์พีน” และ “GO:0006722 กระบวนการเผาผลาญไตรเทอร์พีน” (ทั้งสองคำศัพท์อยู่ในชุดยีนเดียวกัน) เมื่อพิจารณาจากผลการวิเคราะห์การเสริมคุณค่าของคำศัพท์ GO ความเสถียรของปฏิกิริยา Mandelup อยู่ระหว่าง Boregine และประชากร 22660 นอกจากนี้ ปฏิกิริยาในช่วงต้น 83A:476 (6 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ) และปฏิกิริยาที่ล่าช้าของ Mandelup และประชากร 22660 รวมถึงคำศัพท์ GO:0015979 'การสังเคราะห์แสง' และกระบวนการทางชีวภาพอื่นๆ ที่เกี่ยวข้อง
คำศัพท์ทางชีววิทยาของยีนที่เลือกใช้ในการระบุยีนที่แสดงออกแตกต่างกันระหว่างการตอบสนองของทรานสคริปโตมของลูปินใบแคบ (NLL) ที่ติดเชื้อโรคแอนแทรกซ์จากลูปิน (สายพันธุ์ Col-08 ที่ได้จากแปลงลูปินในเมืองเวียร์เซนิเซ ประเทศโปแลนด์ ในปี 1999) นั้นเกินจริงไปมาก สายพันธุ์ NLL ที่นำมาวิเคราะห์ ได้แก่: 83A:476 (ต้านทานโรค มีอัลลีล Lanr1 แบบโฮโมไซกัส), Boregine (ต้านทานโรค ไม่ทราบพื้นฐานทางพันธุกรรม), Mandelup (ต้านทานโรคปานกลาง มีอัลลีล AnMan แบบโฮโมไซกัส) และประชากร 22660 (อ่อนแอต่อโรค)
เนื่องจากงานวิจัยนี้มีเป้าหมายเพื่อระบุยีนที่มีส่วนช่วยในการต้านทานโรคแอนแทรคโนส ยีนที่ถูกกำหนดให้กับกลุ่ม GO “GO: 0006952 การตอบสนองเชิงป้องกัน” และ “GO: 0055114 กระบวนการรีดอกซ์” จึงได้รับการวิเคราะห์โดยใช้เกณฑ์การตัดที่ค่าเฉลี่ยพื้นฐาน ≥ 30 โดยมีอย่างน้อยหนึ่งบรรทัด × จุดเวลา โดยรวมค่า log2 (fold change) ที่มีนัยสำคัญทางสถิติ จำนวนยีนที่ตรงตามเกณฑ์เหล่านี้คือ 65 สำหรับ GO:0006952 และ 524 สำหรับ GO:0055114
83A:476 เผยให้เห็นจุดสูงสุดของ DEG สองจุดที่ระบุด้วยคำว่า GO:0006952 จุดแรกอยู่ที่ 6 ยีนต่อนิ้ว (64 ยีน การควบคุมขึ้นและลง) และจุดที่สองอยู่ที่ 24 ยีนต่อนิ้ว (15 ยีน การควบคุมขึ้นเท่านั้น) Boregine ยังแสดงให้เห็นว่า GO:0006952 มีจุดสูงสุดที่จุดเวลาเดียวกัน แต่มีจำนวน DEG น้อยกว่า (11 และ 8) และมีการกระตุ้นที่เด่นชัดกว่า Mandeloop แสดงให้เห็นจุดสูงสุดสองจุดของ GO:0006952 ที่ 12 และ 48 HPI โดยทั้งสองจุดมี 12 ยีน (จุดแรกมียีนกระตุ้น และจุดที่สองมีเฉพาะยีนยับยั้ง) ในขณะที่ประชากร 22660 ที่ 6 HPI (13 ยีน) มีความโดดเด่นของจุดสูงสุดของการควบคุมขึ้นมากกว่า ควรสังเกตว่า 96.4% ของ GO:0006952 DEG ในจุดสูงสุดเหล่านี้มีการตอบสนองประเภทเดียวกัน (เพิ่มขึ้นหรือลดลง) ซึ่งบ่งชี้ถึงการทับซ้อนอย่างมีนัยสำคัญในการตอบสนองการป้องกัน แม้จะมีความแตกต่างกันในจำนวนยีนที่เกี่ยวข้อง กลุ่มลำดับที่ใหญ่ที่สุดที่เกี่ยวข้องกับคำว่า GO:0006952 เข้ารหัสโปรตีน Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-like) ซึ่งอยู่ในกลุ่มโปรตีน pathogenesis-associated protein (PR-10) คลาส 10 และโปรตีนหลัก latex ที่คล้ายกัน (MLP-like) (รูปที่ 3) ทั้งสองกลุ่มแตกต่างกันในลักษณะของการแสดงออกและทิศทางของการตอบสนอง ยีนที่เข้ารหัสโปรตีน SAM22-like แสดงการเหนี่ยวนำที่สม่ำเสมอและมีนัยสำคัญในช่วงเวลาเริ่มต้น (6 หรือ 12 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ) และโดยทั่วไปจะไม่ตอบสนองเมื่อสิ้นสุดการทดลอง (48 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ) ในขณะที่โปรตีน MLP-like แสดงการประสานงานที่ 6 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ 83A:476 และ Mandelup ที่ 48 hp/in จุดข้อมูลอื่นๆ เกือบทั้งหมดไม่ตอบสนอง นอกจากนี้ ความแตกต่างในรูปแบบการแสดงออกของยีนโปรตีนที่คล้ายกับ SAM22 สอดคล้องกับความแปรปรวนที่สังเกตได้ในความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนส โดยสายพันธุ์ที่ต้านทานมากกว่าจะมีจุดเวลาที่กระตุ้นยีนเหล่านี้อย่างมีนัยสำคัญมากกว่าสายพันธุ์ที่อ่อนแอมากกว่า ยีน PR-10 ที่คล้ายกับ LlR18A/B อีกตัวหนึ่งแสดงรูปแบบการแสดงออกที่คล้ายคลึงกับยีนโปรตีนที่คล้ายกับ SAM22 มาก
ส่วนประกอบหลักของกระบวนการทางชีวภาพ “GO:0006952 การตอบสนองการป้องกัน” และรูปแบบการแสดงออกของยีนเป้าหมายของอัลลีล Lanr1 และ AnMan ได้รับการระบุแล้ว มาตราส่วน Log2 แสดงค่า log2 (การเปลี่ยนแปลงเท่าตัว) ระหว่างพืชที่ได้รับการปลูกเชื้อ (Colletotrichum lupini สายพันธุ์ Col-08 ได้จากแปลงลูปิน เมืองวิเชนิกา ประเทศโปแลนด์ ปี 1999) และพืชควบคุม (ปลูกเชื้อหลอก) ในช่วงเวลาเดียวกัน สายพันธุ์ลูปินใบแคบที่นำมาวิเคราะห์ ได้แก่ 83A:476 (ต้านทาน มีอัลลีล Lanr1 แบบโฮโมไซกัส), Boregine (ต้านทาน ไม่ทราบพื้นฐานทางพันธุกรรม), Mandelup (ต้านทานปานกลาง มีอัลลีล AnMan แบบโฮโมไซกัส) และ Population 22660 (อ่อนแอ)
นอกจากนี้ ยังได้ประเมินโปรไฟล์การแสดงออกของยีนเป้าหมาย RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) และ AnMan (TanjilG_12861) (รูปที่ 3) ยีน TanjilG_05042 แสดงการตอบสนอง (การกระตุ้น) อย่างมีนัยสำคัญที่ 83A:476 เฉพาะที่จุดเวลาแรก (6 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ) ในขณะที่ TanjilG_12861 มีนัยสำคัญใน Mandeloop เฉพาะที่สองจุดเวลา คือ 6 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ (การลดระดับการแสดงออก) และ 24 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ (6 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ) (ปรับได้)
ยีนที่มีการแสดงออกมากที่สุดในกลุ่ม GO:0055114 “กระบวนการรีดอกซ์” คือยีนที่เข้ารหัสโปรตีนไซโตโครม P450 และเพอร์ออกซิเดส (รูปที่ 4) สำหรับตัวอย่างที่แยกได้จาก 83A:476 ที่ 6 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ ค่า log2 (การเปลี่ยนแปลงเท่าตัว) สูงสุดหรือต่ำสุด (สำหรับ 86.6% ของยีน) โดยทั่วไปจะพบระหว่างพืชที่ได้รับเชื้อและพืชควบคุม ซึ่งเน้นให้เห็นถึงการตอบสนองสูงของจีโนไทป์นี้ต่อการฉีดเชื้อ 83A:476 แสดง GO: 0055114 DEG ที่มีนัยสำคัญที่สุดที่ 6 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ (503 ยีน) ในขณะที่สายพันธุ์อื่นๆ แสดงที่ 48 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ (Boregine, 31 ยีน; Mandelup, 85 ยีน; และ Population 22660, 78 ยีน)) ในยีนส่วนใหญ่ของกลุ่ม GO:0055114 พบการตอบสนองต่อการฉีดวัคซีนสองประเภท (การกระตุ้นและการยับยั้ง) ที่น่าสนใจคือ ยีนที่แสดงออกแตกต่างกัน (DEGs) มากถึง 97.6% ที่ระบุสำหรับคำว่า GO: 0055114 ใน Mandelupe ที่ 48 ชั่วโมงหลังการปฏิสนธิ ข้อสังเกตเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า แม้จะมีขนาดเล็กกว่าอย่างมาก (เช่น จำนวนยีนรีดอกซ์ที่กลายพันธุ์ 85 เทียบกับ 503) รูปแบบการตอบสนองของทรานสคริปโตมที่ล่าช้าของ Mandelupe ต่อโรคแอนแทรคโนสก็คล้ายคลึงกับการตอบสนองในช่วงต้นของ 83A:476 ใน Boregine และ Population 22660 การบรรจบกันนี้ต่ำกว่า โดยอยู่ที่ 51.6% และ 75.6% ตามลำดับ
ได้มีการเปิดเผยรูปแบบการแสดงออกของส่วนประกอบหลักของกระบวนการทางชีวภาพ “GO:0055114 กระบวนการรีดอกซ์” มาตราส่วน Log2 แสดงค่า log2 (การเปลี่ยนแปลงเท่าตัว) ระหว่างพืชที่ได้รับการปลูกเชื้อ (Colletotrichum lupini สายพันธุ์ Col-08 ได้จากแปลงลูปิน เมืองวิเชนิกา ประเทศโปแลนด์ ปี 1999) และพืชควบคุม (ปลูกเชื้อหลอก) ในช่วงเวลาเดียวกัน สายพันธุ์ลูปินใบแคบที่นำมาวิเคราะห์ ได้แก่ 83A:476 (ต้านทาน มีอัลลีล Lanr1 แบบโฮโมไซกัส), Boregine (ต้านทาน ไม่ทราบพื้นฐานทางพันธุกรรม), Mandelup (ต้านทานปานกลาง มีอัลลีล AnMan แบบโฮโมไซกัส) และ Population 22660 (อ่อนแอ)
83A:476 การตอบสนองทางทรานสคริปโตมิกต่อการฉีดเชื้อ C. lupini (สายพันธุ์ Col-08) ยังรวมถึงการปิดการทำงานของยีนที่เกี่ยวข้องกับคำว่า GO:0015979 “การสังเคราะห์แสง” และกระบวนการทางชีวภาพอื่นๆ ที่เกี่ยวข้อง (รูปที่ 5) ชุดยีนที่มีการแสดงออกแตกต่างกัน (DEG) ของ GO:0015979 นี้ประกอบด้วยยีน 105 ยีนที่ถูกยับยั้งอย่างมีนัยสำคัญที่ 6 ชั่วโมงหลังการฉีดเชื้อที่ 83A:476 ในชุดย่อยนี้ ยีน 37 ยีนยังถูกลดระดับการแสดงออกใน Mandelup ที่ 48 ชั่วโมงหลังการฉีดเชื้อ และ 35 ยีนที่จุดเวลาเดียวกันในประชากร 22660 รวมถึง DEG 19 ยีนที่พบได้ทั่วไปในทั้งสองจีโนไทป์ ไม่มี DEG ใดที่เกี่ยวข้องกับคำว่า GO: 0015979 ที่ถูกกระตุ้นอย่างมีนัยสำคัญในชุดค่าผสมใดๆ (สายพันธุ์ x เวลา)
ได้มีการเปิดเผยรูปแบบการแสดงออกขององค์ประกอบหลักของกระบวนการทางชีวภาพ “GO:0015979 การสังเคราะห์แสง” มาตราส่วน Log2 แสดงค่า log2 (การเปลี่ยนแปลงเท่าตัว) ระหว่างพืชที่ได้รับการปลูกเชื้อ (Colletotrichum lupini สายพันธุ์ Col-08 ได้จากแปลงลูปิน เมืองวิเชนิกา ประเทศโปแลนด์ ปี 1999) และพืชควบคุม (ไม่ได้รับการปลูกเชื้อ) ในช่วงเวลาเดียวกัน สายพันธุ์ลูปินใบแคบที่นำมาวิเคราะห์ ได้แก่ 83A:476 (ต้านทาน มีอัลลีล Lanr1 แบบโฮโมไซกัส), Boregine (ต้านทาน ไม่ทราบพื้นฐานทางพันธุกรรม), Mandelup (ต้านทานปานกลาง มีอัลลีล AnMan แบบโฮโมไซกัส) และ Population 22660 (อ่อนแอ)
จากผลการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนที่แตกต่างกัน และคาดว่ามีส่วนเกี่ยวข้องกับการตอบสนองในการป้องกันเชื้อราก่อโรค จึงได้คัดเลือกยีนทั้งเจ็ดชุดนี้มาเพื่อหาปริมาณการแสดงออกของยีนโดยใช้เทคนิค PCR แบบเรียลไทม์ (ตารางเสริม S9)
ยีนโปรตีนที่คาดว่าจะเป็น TanjilG_10657 ถูกกระตุ้นอย่างมีนัยสำคัญในทุกสายพันธุ์และทุกช่วงเวลาที่ศึกษา เมื่อเปรียบเทียบกับพืชควบคุม (เลียนแบบ) (ตารางเสริม S10, S11) นอกจากนี้ รูปแบบการแสดงออกของ TanjilG_10657 ยังแสดงแนวโน้มเพิ่มขึ้นตลอดการทดลองในทุกสายพันธุ์ ประชากร 22660 แสดงความไวต่อการปลูกเชื้อของ TanjilG_10657 สูงที่สุด โดยมีการกระตุ้นเพิ่มขึ้น 114 เท่า และมีระดับการแสดงออกสัมพัทธ์สูงสุด (4.4 ± 0.4) ที่ 24 ชั่วโมงหลังการปลูกเชื้อ (รูปที่ 6a) ยีนโปรตีน PR10 LlR18A TanjilG_27015 ก็แสดงการกระตุ้นในทุกสายพันธุ์และทุกช่วงเวลาเช่นกัน โดยมีนัยสำคัญทางสถิติในจุดข้อมูลส่วนใหญ่ (รูปที่ 6b) เช่นเดียวกับ TanjilG_10657 ระดับการแสดงออกสัมพัทธ์สูงสุดของ TanjilG_27015 พบในประชากรที่ติดเชื้อ 22660 ที่ 24 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ (19.5 ± 2.4) ยีนกรดเอนโดไคติเนส TanjilG_04706 มีการแสดงออกเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในทุกสายพันธุ์และทุกช่วงเวลา ยกเว้น Boregine ที่ 6 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ (รูปที่ 6c) มีการกระตุ้นอย่างมากในช่วงเวลาแรก (6 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ) ในสายพันธุ์ 83A:476 (เพิ่มขึ้น 10.5 เท่า) และเพิ่มขึ้นปานกลางในสายพันธุ์อื่นๆ (เพิ่มขึ้น 6.6-7.5 เท่า) ในระหว่างการทดลอง การแสดงออกของ TanjilG_04706 ยังคงอยู่ในระดับใกล้เคียงกันในสายพันธุ์ 83A:476 และ Boregine ในขณะที่ใน Mandelup และประชากร 22660 มีการแสดงออกเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ โดยมีค่าค่อนข้างสูง (5.9 ± 1.5 และ 6.2 ± 1.5 ตามลำดับ) ยีนคล้ายเอนโดกลูแคน-1,3-β-กลูโคซิเดส TanjilG_23384 แสดงการทำงานสูงในช่วงเวลาสองจุดแรก (6 และ 12 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ) ในทุกสายพันธุ์ยกเว้นประชากร 22660 (รูปที่ 6d) ระดับการแสดงออกสัมพัทธ์สูงสุดของ TanjilG_23384 พบในช่วงเวลาที่สอง (12 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ) ในสายพันธุ์ Mandelup (2.7 ± 0.3) และ 83A:476 (1.5 ± 0.1) ที่ 24 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ การแสดงออกของ TanjilG_23384 ค่อนข้างต่ำในทุกสายพันธุ์ที่ศึกษา (ตั้งแต่ 0.04 ± 0.009 ถึง 0.44 ± 0.12)
โปรไฟล์การแสดงออกของยีนที่เลือก (ag) ที่เปิดเผยโดย PCR เชิงปริมาณ ตัวเลข 6, 12 และ 24 แสดงถึงเวลาหลังการฉีดวัคซีน ยีน LanDExH7 และ LanTUB6 ถูกใช้สำหรับการปรับค่ามาตรฐาน และ LanTUB6 ถูกใช้สำหรับการสอบเทียบระหว่างชุดข้อมูล แถบแสดงข้อผิดพลาดแสดงถึงค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานโดยอิงจากตัวอย่างทางชีววิทยา 3 ตัวอย่าง ซึ่งแต่ละตัวอย่างเป็นค่าเฉลี่ยของตัวอย่างทางเทคนิค 3 ตัวอย่าง ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติในระดับการแสดงออกระหว่างพืชที่ได้รับการปลูกเชื้อ (Colletotrichum lupini สายพันธุ์ Col-08 ซึ่งได้มาในปี 1999 จากแปลงลูปินในเมืองเวียร์เซนิกา ประเทศโปแลนด์) และพืชควบคุม (ไม่ได้รับการปลูกเชื้อ) ถูกทำเครื่องหมายไว้เหนือจุดข้อมูล (*ค่า P < 0.05, **ค่า P ≤ 0.01, ***ค่า P ≤ 0.001) ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติในระดับการแสดงออกระหว่างพืชที่ได้รับการปลูกเชื้อ (Colletotrichum lupini สายพันธุ์ Col-08 ซึ่งได้มาในปี 1999 จากแปลงลูปินในเมืองเวียร์เซนิกา ประเทศโปแลนด์) และพืชควบคุม (ไม่ได้รับการปลูกเชื้อ) ถูกทำเครื่องหมายไว้เหนือจุดข้อมูล (*ค่า P < 0.05, **ค่า P ≤ 0.01, ***ค่า P ≤ 0.001) Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, шtaмм Col-08, получен в 1999) г. с поля люпина в Верженице, POльша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001) ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติในระดับการแสดงออกระหว่างพืชที่ได้รับการปลูกเชื้อ (Colletotrichum lupini สายพันธุ์ Col-08 ซึ่งได้มาในปี 1999 จากแปลงลูปินในเมืองเวียร์เชนิเซ ประเทศโปแลนด์) และพืชควบคุม (ไม่ได้รับการปลูกเชื้อ) แสดงไว้เหนือจุดข้อมูล (*ค่า P < 0.05, **ค่า P ≤ 0.01, ***ค่า P ≤ 0.001)接种(คอลเลโตตริชุม lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆unda获得（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0.05, **P 值≤ 0.01, ***P 值≤ 0.001)接种 （colletotrichum lupini , color-08 株 , 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对ภาพถ่าย （接种 植物 之间 水平差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина в Верженице, POльша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001) ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติในระดับการแสดงออกระหว่างพืชที่ได้รับการปลูกเชื้อ (Colletotrichum lupini สายพันธุ์ Col-08 ได้จากแปลงลูปินในเมือง Verzhenice ประเทศโปแลนด์ ในปี 1999) และพืชควบคุม (ไม่ได้รับการปลูกเชื้อ) แสดงไว้เหนือจุดข้อมูล (*ค่า P < 0.05 , **ค่า P ≤ 0.01, ***ค่า P ≤ 0.001)สายพันธุ์ NLL ที่นำมาวิเคราะห์ ได้แก่ 83A:476 (ต้านทานโรค มีอัลลีล Lanr1 แบบโฮโมไซกัส), Mandelup (ต้านทานโรคปานกลาง มีอัลลีล AnMan แบบโฮโมไซกัส), Boregine (ต้านทานโรค ไม่ทราบพื้นฐานทางพันธุกรรม) และประชากร 22660 (อ่อนแอต่อโรค)
ยีนเป้าหมาย TanjilG_05042 ที่ตำแหน่ง Lanr1 แสดงรูปแบบการแสดงออกที่แตกต่างอย่างเห็นได้ชัดจากข้อมูลที่ได้จากการศึกษา RNA-seq (รูปที่ 6e) พบการกระตุ้นการทำงานของยีนนี้อย่างมีนัยสำคัญในประชากร Mandelup และ 22660 (สูงถึง 39.7 และ 11.7 เท่า ตามลำดับ) ส่งผลให้ระดับการแสดงออกค่อนข้างสูง (สูงถึง 1.4 ± 0.14 และ 7.2 ± 1.3 ตามลำดับ) นอกจากนี้ 83A:476 ยังแสดงให้เห็นถึงการเพิ่มขึ้นของการแสดงออกของยีน TanjilG_05042 (สูงถึง 3.8 เท่า) อย่างไรก็ตาม ระดับการแสดงออกสัมพัทธ์ที่ได้ (0.044 ± 0.002) นั้นต่ำกว่าที่พบในประชากร Mandelup และ 22660 มากกว่า 30 เท่า ผลการวิเคราะห์ด้วย qPCR แสดงให้เห็นถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในระดับการแสดงออกระหว่างจีโนไทป์ในกลุ่มควบคุม (กลุ่มที่ไม่ได้ฉีดวัคซีน) โดยมีความแตกต่างกันถึง 58 เท่าระหว่างประชากร 22660 และ 83A:476 รวมถึงระหว่างประชากร 22660 และ 22660 และมีความแตกต่างกันสองเท่าระหว่าง Boregine และ Mandalup
ยีนเป้าหมายที่ตำแหน่ง AnMan คือ TanjilG_12861 ถูกกระตุ้นให้ทำงานเมื่อได้รับการฉีดวัคซีนในสายพันธุ์ 83A:476 และ Mandelup เป็นกลางในประชากร 22660 และถูกลดระดับการแสดงออกใน Boregine (รูปที่ 6f) ระดับการแสดงออกสัมพัทธ์ของยีน TanjilG_12861 สูงที่สุดในสายพันธุ์ 83A:476 ที่ได้รับการฉีดวัคซีน (0.14±0.01) ส่วนยีนโปรตีนช็อกความร้อนคลาส I ขนาด 17.4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 แสดงระดับการแสดงออกสัมพัทธ์ที่ต่ำกว่าในทุกสายพันธุ์และทุกช่วงเวลาที่ศึกษา (รูปที่ 6g) ค่าสูงสุดพบที่ 24 ชั่วโมงหลังการฉีดวัคซีนในประชากร 22660 (0.14 ± 0.02 เพิ่มขึ้นแปดเท่าเมื่อได้รับการฉีดวัคซีน)
การเปรียบเทียบโปรไฟล์การแสดงออกของยีน (รูปที่ 7) เผยให้เห็นความสัมพันธ์สูงระหว่าง TanjilG_10657 กับยีนอื่นอีกสี่ตัว ได้แก่ TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.80) และ TanjilG_04706 (r = 0.79) ผลลัพธ์ดังกล่าวอาจบ่งชี้ถึงการควบคุมร่วมกันของยีนเหล่านี้ในระหว่างการตอบสนองต่อการป้องกัน ส่วนยีน TanjilG_12861 และ TanjilG_23384 แสดงโปรไฟล์การแสดงออกที่แตกต่างกัน โดยมีค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์เพียร์สันต่ำกว่า (ตั้งแต่ 0.08 ถึง 0.43 และ -0.19 ถึง 0.28 ตามลำดับ) เมื่อเทียบกับยีนอื่นๆ
ตรวจหาความสัมพันธ์ระหว่างโปรไฟล์การแสดงออกของยีนโดยใช้ PCR เชิงปริมาณ วิเคราะห์สายพันธุ์ลูปินใบแคบต่อไปนี้: 83A:476 (ต้านทานโรค มีอัลลีล Lanr1 แบบโฮโมไซกัส), Mandelup (ต้านทานโรคปานกลาง มีอัลลีล AnMan แบบโฮโมไซกัส), Boregine (ต้านทานโรค ไม่ทราบพื้นฐานทางพันธุกรรม) และ Population 22660 (อ่อนแอต่อโรค) คำนวณค่าที่ 3 ช่วงเวลา (6, 12 และ 24 ชั่วโมงหลังการปลูกเชื้อ) โดยรวมถึงพืชที่ปลูกเชื้อ (Colletotrichum lupini สายพันธุ์ Col-08 ได้จากแปลงลูปินในเมืองเวียร์เซนิเซ ประเทศโปแลนด์ ในปี 1999) และพืชควบคุม (ปลูกเชื้อหลอก) มาตราส่วนแสดงค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ของเพียร์สัน
จากข้อมูลที่ได้จากการวัดด้วยกำลัง 6 แรงม้าต่อนิ้ว ได้ทำการวิเคราะห์ WGCNA กับยีนที่แสดงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (DEG) จำนวน 9981 ยีน โดยเปรียบเทียบพืชที่ได้รับการปลูกเชื้อกับพืชควบคุม เพื่อเน้นไปที่การตอบสนองการป้องกันในระยะเริ่มต้น (ตารางเสริม S12) พบโมดูลยีน (คลัสเตอร์) จำนวน 22 โมดูล ที่มีรูปแบบการแสดงออกที่สัมพันธ์กัน (ทั้งเชิงบวกและเชิงลบ) ระหว่างจีโนไทป์และตัวแปรทดลอง โดยเฉลี่ยแล้ว ระดับการแสดงออกของยีนลดลงตามลำดับ 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (อย่างไรก็ตาม ในทั้งสองสายพันธุ์ แนวโน้มนี้จะชัดเจนกว่าในพืชกลุ่มควบคุม) โดยเฉลี่ยแล้ว ระดับการแสดงออกของยีนลดลงตามลำดับ 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (อย่างไรก็ตาม ในทั้งสองสายพันธุ์ แนวโน้มนี้จะชัดเจนกว่าในพืชกลุ่มควบคุม) В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > ประชากร 22660 (в обоих вариантах, однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). โดยเฉลี่ยแล้ว ระดับการแสดงออกของยีนลดลงตามลำดับ 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (อย่างไรก็ตาม ในทั้งสองสายพันธุ์ แนวโน้มนี้จะชัดเจนกว่าในพืชกลุ่มควบคุม)平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > ประชากร 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对Photo植物中更强）。平均 而 言 , 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine>ประชากร 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种 在 植物 中。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > ประชากร 22660 (однако в обоих вариантах эта тенденция была сильнее у контрольных растений). โดยเฉลี่ยแล้ว ระดับการแสดงออกของยีนลดลงในลำดับ 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (อย่างไรก็ตาม ในทั้งสองสายพันธุ์ แนวโน้มนี้จะเด่นชัดกว่าในพืชกลุ่มควบคุม)การฉีดวัคซีนส่งผลให้มีการเพิ่มการแสดงออกของยีน โดยเฉพาะในโมดูล 18, 19, 14, 6 และ 1 (เรียงตามลำดับผลกระทบจากมากไปน้อย) การควบคุมเชิงลบ (เช่น โมดูล 9 และ 20) หรือมีผลกระทบที่เป็นกลาง (เช่น โมดูล 11, 22, 8 และ 13) การวิเคราะห์การเสริมคุณค่าของคำศัพท์ GO (ตารางเสริม S13) เผยให้เห็น “GO: 0006952 การตอบสนองเชิงป้องกัน” สำหรับโมดูลที่ได้รับการฉีดวัคซีน (18) ที่มีการกระตุ้นสูงสุด รวมถึงยีนที่วิเคราะห์โดย qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 และ TanjilG_27015) รวมถึงโมดูลการสังเคราะห์แสงที่ถูกยับยั้งมากที่สุดหลายโมดูล (9) โมดูล 18 (รูปที่ 8) ถูกระบุว่าเป็นยีน TanjilG_26536 ซึ่งเข้ารหัสโปรตีน LlR18B ที่คล้ายกับ PR-10 และโมดูล 9 ถูกระบุว่าเป็นยีน TanjilG_28955 ซึ่งเข้ารหัสโปรตีน PsbQ ของระบบสังเคราะห์แสง II ยีนต้านทานโรคแอนแทรคโนส Lanr1 ที่เป็นไปได้ TanjilG_05042 พบในโมดูล 22 (รูปที่ 9) และเกี่ยวข้องกับเงื่อนไข “GO:0044260 กระบวนการเผาผลาญโมเลกุลขนาดใหญ่ในเซลล์” และ “GO:0006355 การควบคุมการถอดรหัส การสร้างแม่แบบ DNA” ซึ่งมีศูนย์กลางอยู่ที่ TanjilG_01212 ยีนนี้เข้ารหัสปัจจัยการถอดรหัสความเครียดจากความร้อน A-4a (HSFA4a)
การวิเคราะห์เครือข่ายแบบถ่วงน้ำหนักของการแสดงออกร่วมกันของยีนในโมดูลที่มีคำศัพท์กระบวนการทางชีวภาพที่แสดงมากเกินไป “GO: 0006952 การตอบสนองต่อการป้องกัน” การเชื่อมต่อถูกทำให้ง่ายขึ้นเพื่อเน้นยีนทั้งสี่ที่วิเคราะห์โดย qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 และ TanjilG_27015)
การวิเคราะห์เครือข่ายแบบถ่วงน้ำหนักของการแสดงออกร่วมกันของยีนในโมดูลที่มีคำศัพท์กระบวนการทางชีวภาพที่แสดงมากเกินไป “GO: 0006355: การควบคุมการถอดรหัส, การสร้างแม่แบบ DNA” และมียีนต้านทานโรคแอนแทรคโนสที่คาดการณ์ไว้ Lanr1 TanjilG_05042 การเชื่อมต่อถูกทำให้ง่ายขึ้นเพื่อแยกยีน TanjilG_05042 และยีนกลาง TanjilG_01212
การคัดกรองความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนสที่เก็บรวบรวมในออสเตรเลียแสดงให้เห็นว่าพันธุ์ที่ปล่อยออกมาในช่วงแรกส่วนใหญ่มีความอ่อนแอต่อโรค โดย Kalya, Coromup และ Mandelup ถูกอธิบายว่ามีความต้านทานปานกลาง ในขณะที่ Wonga, Tanjil และ 83A:476 ถูกอธิบายว่ามีความต้านทานสูง26,27,31 พันธุ์เหล่านี้มีอัลลีลต้านทานเดียวกัน ซึ่งกำหนดให้เป็น Lanr1 และ Coromup และ Mandelup มีอัลลีลที่แตกต่างกัน ซึ่งกำหนดให้เป็น AnMan10, 26, 39 ในขณะที่ Kalya ส่งต่ออัลลีลที่แตกต่างกัน คือ Lanr2 การคัดกรองความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนสในเยอรมนีส่งผลให้มีการระบุสายพันธุ์ต้านทาน Bo7212 ที่มีอัลลีลที่อาจเป็นไปได้นอกเหนือจาก Lanr1 ซึ่งกำหนดให้เป็น LanrBo36
การศึกษาของเราเผยให้เห็นความถี่ที่ต่ำมาก (ประมาณ 6%) ของอัลลีล Lanr1 ในเชื้อพันธุ์ที่ทดสอบ การสังเกตนี้สอดคล้องกับผลการคัดกรองเชื้อพันธุ์จากยุโรปตะวันออกโดยใช้เครื่องหมาย Anseq3 และ Anseq4 ซึ่งแสดงให้เห็นว่าอัลลีล Lanr1 มีอยู่ในสายพันธุ์เบลารุสเพียงสองสายพันธุ์เท่านั้น นี่แสดงให้เห็นว่าอัลลีล Lanr1 ยังไม่ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในโครงการปรับปรุงพันธุ์ในท้องถิ่น ต่างจากในออสเตรเลียซึ่งเป็นหนึ่งในอัลลีลสำคัญสำหรับการปรับปรุงพันธุ์โดยใช้เครื่องหมาย อาจเป็นเพราะระดับความต้านทานที่อัลลีล Lanr1 ให้ในสภาพแวดล้อมภาคสนามของยุโรปนั้นต่ำกว่ารายงานของออสเตรเลีย นอกจากนี้ การศึกษาโรคแอนแทรคโนสในพื้นที่ที่มีปริมาณน้ำฝนสูงในออสเตรเลียแสดงให้เห็นว่าการตอบสนองต่อความต้านทานที่เกิดจากอัลลีล Lanr1 อาจไม่มีประสิทธิภาพในสภาพอากาศที่เอื้อต่อการเจริญเติบโตและการพัฒนาอย่างรวดเร็วของเชื้อโรค19,42 ในความเป็นจริง ในการศึกษาปัจจุบัน พบว่าอาการของโรคแอนแทรคโนสบางอย่างเกิดขึ้นในจีโนไทป์ที่มีอัลลีล Lanr1 ซึ่งบ่งชี้ว่าความต้านทานอาจหายไปภายใต้สภาวะที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการเจริญเติบโตของ C. lupini นอกจากนี้ การตีความผลบวกเท็จของการมีอยู่ของเครื่องหมาย Anseq3 และ Anseq4 ซึ่งอยู่ห่างจากตำแหน่ง Lanr1 ประมาณ 1 cM ก็เป็นไปได้เช่นกัน 28,30,43
การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่า 83A:476 ซึ่งมีอัลลีล Lanr1 ตอบสนองต่อการติดเชื้อ C. lupini ด้วยการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของยีนในระดับใหญ่ ณ จุดเวลาแรกที่วิเคราะห์ (6 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ) ในขณะที่ Mandelup ซึ่งมีอัลลีล AnMan การตอบสนองของการแสดงออกของยีนนั้นสังเกตได้ช้ากว่ามาก (ตั้งแต่ 24 ถึง 48 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ) ความแปรผันตามเวลาของการตอบสนองด้านการป้องกันนี้เกี่ยวข้องกับความแตกต่างของอาการของโรค ซึ่งเน้นย้ำถึงความสำคัญของการรับรู้เชื้อโรคในระยะเริ่มต้นเพื่อการตอบสนองต่อการต้านทานที่ประสบความสำเร็จ ในการเข้าสู่เนื้อเยื่อพืช สปอร์ของแอนแทรกซ์ต้องผ่านหลายขั้นตอนการพัฒนาบนพื้นผิวของพืชเจ้าบ้าน รวมถึงการงอก การแบ่งเซลล์ และการสร้างอัปเพรสโซเรียม อัปเพรสโซเรียมเป็นโครงสร้างที่ก่อให้เกิดการติดเชื้อซึ่งยึดติดกับพื้นผิวของพืชเจ้าบ้านและช่วยให้แทรกซึมเข้าไปในเนื้อเยื่อของพืชเจ้าบ้านได้ ดังนั้น สปอร์ของ C. gloeosporioides ในสารสกัดจากถั่วลันเตาแสดงการแบ่งตัวครั้งแรกของนิวเคลียสหลังจากบ่ม 75-90 นาที การสร้างท่อเจริญหลังจาก 90-120 นาที และการยับยั้งหลังจาก 4 ชั่วโมง 45 นาที C. gloeosporioides จากมะม่วงแสดงการงอกของโคนิเดียมากกว่า 40% หลังจากบ่ม 3 ชั่วโมง และการสร้างอัปเพรสโซเรียมประมาณ 20% หลังจาก 4 ชั่วโมง ยีน CAP20 ที่เกี่ยวข้องกับความรุนแรงของ C. gloeosporioides แสดงกิจกรรมการถอดรหัสในโคนิเดียที่สร้างเอพิไฟต์หลังจากบ่ม 3.5 ชั่วโมงในแว็กซ์ผิวอะโวคาโดที่มีความเข้มข้นของโปรตีน CAP20 สูงหลังจาก 4 ชั่วโมง 46 นาที ในทำนองเดียวกัน กิจกรรมของยีนสังเคราะห์เมลานินใน C. trifolii ถูกกระตุ้นในระหว่างการบ่ม 2 ชั่วโมง ตามด้วยการสร้างอัปเพรสโซเรียมหลังจาก 1 ชั่วโมง การศึกษาเนื้อเยื่อใบแสดงให้เห็นว่าสตรอว์เบอร์รีที่ติดเชื้อ C. acutatum จะมีการยับยั้งครั้งแรกที่ 8 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ ในขณะที่มะเขือเทศที่ติดเชื้อ C. coccodes จะมีการยับยั้งครั้งแรกที่ 4 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ48,49 ซึ่งสอดคล้องกับช่วงเวลาของกระบวนการติดเชื้อของ Colletotrichum spp. การตอบสนองการป้องกันอย่างรวดเร็วต่อ 83A:476 ชี้ให้เห็นถึงการมีส่วนร่วมของยีนต้านทานพืชและภูมิคุ้มกันที่ถูกกระตุ้นโดยสารก่อโรค (ETI) ในสายพันธุ์นี้ ในขณะที่การตอบสนองที่ล่าช้าของ Mandelup สนับสนุนสมมติฐานภูมิคุ้มกันที่ถูกกระตุ้นโดยรูปแบบโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับไมโคร (MTI) 50 การตอบสนองในช่วงต้นต่อ 83A:476 และ Mandelup การทับซ้อนบางส่วนระหว่างยีนที่ถูกควบคุมขึ้นหรือลงในการตอบสนองที่ล่าช้ายังสนับสนุนแนวคิดนี้ เนื่องจาก ETI มักถูกพิจารณาว่าเป็นการตอบสนอง MTI ที่เร่งและเพิ่มขึ้นซึ่งจบลงด้วยการตายของเซลล์ตามโปรแกรม ณ บริเวณที่ติดเชื้อ ซึ่งรู้จักกันในชื่อภาวะช็อกอะนาฟิแล็กติก 51,52
ยีนส่วนใหญ่ที่เกี่ยวข้องกับคำศัพท์ Gene Ontology GO:0006952 “Defense Response” ที่พบมากเกินไปนั้น ได้แก่ ยีนโฮโมล็อก 11 ตัวของโปรตีน stress-induced fasting message 22 (คล้ายกับ SAM22) และโปรตีน major latex protein-likes (MLPs) อีก 7 ตัว โปรตีนที่คล้ายกับ SAM22 ได้แก่ 31, 34, 43 และ 423 แสดงความคล้ายคลึงกันของลำดับเบส ยีนที่คล้ายกับ SAM22 แสดงการทำงานที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญและยาวนานขึ้น แสดงให้เห็นถึงระดับความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนสที่เพิ่มขึ้น (83A:476 และ Boregine) อย่างไรก็ตาม ยีนที่คล้ายกับ MLP ถูกลดระดับการแสดงออกเฉพาะในสายพันธุ์ที่มีอัลลีลต้านทานโรค (83A:476/Lanr1 ที่ 6 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ และ Mandelup/AnMan ที่ 24 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ) ควรสังเกตว่ายีนโฮโมล็อกที่คล้ายกับ SAM22 ที่ระบุทั้งหมดมาจากกลุ่มยีนที่ครอบคลุมพื้นที่ประมาณ 105 กิโลเบส ในขณะที่ยีนที่คล้ายกับ MLP มาจากบริเวณที่แยกต่างหากของจีโนม จากการศึกษาครั้งก่อนของเราเกี่ยวกับการต้านทานของ NLL ต่อการติดเชื้อ Diaporthetoxica พบว่ามีการทำงานประสานกันของยีนที่คล้ายกับ SAM22 ซึ่งบ่งชี้ว่ายีนเหล่านี้มีส่วนเกี่ยวข้องกับองค์ประกอบแนวนอนของการตอบสนองด้านการป้องกัน ข้อสรุปนี้ได้รับการสนับสนุนจากรายงานเกี่ยวกับการตอบสนองในเชิงบวกของยีนที่คล้ายกับ SAM22 ต่อการบาดเจ็บหรือการรักษาด้วยกรดซาลิไซลิก สารกระตุ้นเชื้อรา หรือไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์
ยีนที่คล้าย MLP ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าตอบสนองต่อความเครียดทางชีวภาพและอชีวภาพต่างๆ รวมถึงการติดเชื้อแบคทีเรีย ไวรัส และเชื้อราก่อโรคในพืชหลายชนิด55 ทิศทางการตอบสนองต่อปฏิสัมพันธ์บางอย่างระหว่างพืชและเชื้อก่อโรคมีตั้งแต่เพิ่มขึ้นอย่างมาก (เช่น ในระหว่างการระบาดของฝ้ายด้วย Verticillium dahliae) ไปจนถึงลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (เช่น หลังจากการติดเชื้อของต้นแอปเปิลด้วย Alternaria spp.)56,57 มีการสังเกตการลดลงอย่างมีนัยสำคัญของยีนที่คล้าย MLP 423 ในระหว่างการป้องกันของอะโวคาโดต่อการติดเชื้อ F. niger และในระหว่างการติดเชื้อของต้นแอปเปิล Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola และ Alternaria alternata ซึ่งเป็นเชื้อก่อโรคในแอปเปิล58,59 นอกจากนี้ เนื้อเยื่อเพาะเลี้ยงแอปเปิลที่แสดงออกมากเกินไปของยีนที่คล้าย MLP 423 มีการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับความต้านทานต่ำกว่าและมีความอ่อนแอต่อการติดเชื้อรามากขึ้น59 หลังจากการติดเชื้อ Fusarium oxysporum f แล้ว ยีน MLP-like 423 ก็ถูกยับยั้งในเชื้อพันธุ์ถั่วเหลืองที่ต้านทานโรคด้วยเช่นกัน cn. การติดเชื้อในถั่ว 60
สมาชิกอื่นๆ ในกลุ่ม PR-10 ที่ระบุได้จากการศึกษา RNA-seq ของเรา ได้แก่ ยีน LlR18A และ LlR18B ที่มีการตอบสนองต่อการเพิ่มการแสดงออก รวมถึงยีน DIR1 ซึ่งเป็นยีนที่เพิ่มการแสดงออก (1 ยีน) หรือลดการแสดงออก (3 ยีน) นอกจากนี้ WGCNA ยังเน้นย้ำว่ายีน LlR18B เป็นศูนย์กลางในโมดูลนี้ ซึ่งมีความไวต่อการฉีดวัคซีนสูงและมีหลายยีนที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองเชิงป้องกัน ยีน LlR18A และ LlR18B ถูกกระตุ้นในใบของต้นลูปินสีเหลืองเพื่อตอบสนองต่อแบคทีเรียก่อโรค เช่นเดียวกับในลำต้นของต้น NLL หลังจากการติดเชื้อ D. toxica ในขณะที่ยีน RSOsPR10 ซึ่งเป็นยีนที่คล้ายคลึงกันในข้าว ถูกกระตุ้นอย่างรวดเร็วโดยการติดเชื้อราที่คาดว่าเกี่ยวข้องกับเส้นทางการส่งสัญญาณของกรดจัสมอนิก53,61, 62 ยีน DIR1 เข้ารหัสโปรตีนขนส่งไขมันที่ไม่จำเพาะซึ่งจำเป็นสำหรับการเริ่มต้นของความต้านทานที่ได้รับมาอย่างเป็นระบบ (SAR) ด้วยการพัฒนาปฏิกิริยาป้องกัน โปรตีน DIR1 จะถูกขนส่งจากจุดศูนย์กลางของการติดเชื้อผ่านท่อลำเลียงอาหารเพื่อกระตุ้น SAR ในอวัยวะที่อยู่ห่างไกล ที่น่าสนใจคือ ยีน TanjilG_02313 DIR1 ถูกกระตุ้นอย่างมีนัยสำคัญในช่วงเวลาแรกในสายพันธุ์ 84A:476 และประชากร 22660 แต่ความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนสพัฒนาได้สำเร็จเฉพาะในสายพันธุ์ 84A:476 เท่านั้น สิ่งนี้อาจบ่งชี้ถึงการแบ่งหน้าที่ย่อยบางส่วนของยีน DIR1 ใน NLL เนื่องจากโฮโมล็อกที่เหลืออีกสามตัวตอบสนองต่อการฉีดวัคซีนเฉพาะในสายพันธุ์ 83A:476 ที่ 6 ชั่วโมงหลังการฉีดวัคซีน และการตอบสนองนี้มีทิศทางลงด้านล่าง
ในการศึกษาของเรา ส่วนประกอบที่พบได้บ่อยที่สุดซึ่งสอดคล้องกับกระบวนการทางชีวภาพที่เรียกว่า “GO:0055114 กระบวนการรีดอกซ์” ได้แก่ โปรตีนไซโตโครม P450, เพอร์ออกซิเดส, ไลโนเลอิกแอซิด 9S-/13S-ไลโปออกซิเจเนส และ 1-อะมิโนไซโคลโพรเพน-1-คาร์บอกซิลิกแอซิดออกซิเดส นอกจากนี้ WGCNA ของเรายังกำหนดให้โฮโมล็อก HSFA4a เป็นศูนย์กลางที่บรรจุโมดูลต่างๆ เช่น ยีนต้านทาน Lanr1 ที่เป็นผู้สมัคร TanjilG_05042 HSFA4a เป็นส่วนประกอบของการควบคุมการถอดรหัสในนิวเคลียสของพืชที่ขึ้นอยู่กับรีดอกซ์
โปรตีนไซโตโครม P450 เป็นออกซิโดรีดักเทสที่เร่งปฏิกิริยาไฮดรอกซิเลชันที่ขึ้นอยู่กับ NADPH และ/หรือ O2 ในเมตาบอลิซึมขั้นต้นและขั้นทุติยภูมิ รวมถึงเมตาบอลิซึมของสารแปลกปลอม ตลอดจนฮอร์โมน กรดไขมัน สเตอรอล ส่วนประกอบของผนังเซลล์ ไบโอโพลีเมอร์ และการสังเคราะห์สารประกอบป้องกัน 69 ในการศึกษาของเรา ความแปรปรวนในการทำงานของไซโตโครม P450 ในพืชลดลงจาก -10.6 log2 (การเปลี่ยนแปลงเท่าตัว) เป็น 5.7 เนื่องจากการเปลี่ยนแปลงโฮโมล็อกจำนวนมาก (37) และความแตกต่างในรูปแบบการตอบสนองระหว่างยีนเฉพาะ ซึ่งสะท้อนถึงการแก้ไขขึ้น การใช้ข้อมูล RNA-seq เพียงอย่างเดียวเพื่ออธิบายหน้าที่ทางชีวภาพที่คาดการณ์ได้ของยีน NLL ในซูเปอร์แฟมิลีโปรตีนขนาดใหญ่เช่นนี้จะเป็นการคาดเดาอย่างมาก อย่างไรก็ตาม เป็นที่น่าสังเกตว่ายีนไซโตโครม P450 บางชนิดมีความเกี่ยวข้องกับการเพิ่มความต้านทานต่อเชื้อราหรือแบคทีเรียที่ก่อโรค รวมถึงการมีส่วนช่วยในการเกิดปฏิกิริยาภูมิแพ้69,70,71
เพอร์ออกซิเดสคลาส III เป็นเอนไซม์พืชที่มีหน้าที่หลากหลาย เกี่ยวข้องกับกระบวนการเมตาบอลิซึมที่หลากหลายในระหว่างการเจริญเติบโตและพัฒนาการของพืช รวมถึงการตอบสนองต่อความเครียดจากสิ่งแวดล้อม เช่น ความเค็ม ความแห้งแล้ง ความเข้มแสงสูง และการโจมตีของเชื้อโรค72 เพอร์ออกซิเดสมีส่วนเกี่ยวข้องกับปฏิสัมพันธ์ของพืชหลายชนิดกับเชื้อรา Anthracis รวมถึง Stylosanthes humilis และ C. gloeosporioides, Lens culinaris และ C. truncatum, Phaseolus vulgaris และ C. lindemuthianum, Cucumis sativus และ C. lagenarium73,74,75,76 การตอบสนองนั้นรวดเร็วมาก บางครั้งเกิดขึ้นภายใน 4 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ ก่อนที่เชื้อราจะแทรกซึมเข้าไปในเนื้อเยื่อพืช73 ยีนเพอร์ออกซิเดสยังตอบสนองต่อการติดเชื้อ D. toxica NLL ด้วย นอกเหนือจากหน้าที่ปกติในการควบคุมการเกิดออกซิเดชันอย่างรวดเร็วหรือกำจัดความเครียดจากออกซิเดชันแล้ว เพอร์ออกซิเดสยังสามารถขัดขวางการเจริญเติบโตของเชื้อโรคได้โดยการสร้างสิ่งกีดขวางทางกายภาพโดยอาศัยการเสริมความแข็งแรงของผนังเซลล์ในระหว่างกระบวนการสร้างลิกนิน การเชื่อมโยงหน่วยย่อยหรือการเชื่อมโยงข้ามของสารประกอบเฉพาะ การทำงานนี้สามารถระบุได้จากการวิเคราะห์ทางคอมพิวเตอร์ (in silico) ว่าเป็นผลมาจากยีน TanjilG_03329 ที่เข้ารหัสเอนไซม์เพอร์ออกซิเดสชนิดแอนไอออนที่สร้างลิกนิน ซึ่งมีการแสดงออกเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในสายพันธุ์ต้านทาน 83A:476 ในการศึกษาของเราที่ 6 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ (HPI) แต่ไม่พบในสายพันธุ์และช่วงเวลาอื่น ๆ ที่ไม่ตอบสนอง
9S-/13S-ลิโปออกซิเจเนสของกรดลิโนเลอิกเป็นขั้นตอนแรกในวิถีออกซิเดชันของการสังเคราะห์ไขมัน78 ผลิตภัณฑ์ของวิถีนี้มีหน้าที่หลายอย่างในการป้องกันพืช รวมถึงการเสริมความแข็งแรงของผนังเซลล์ผ่านการสร้างแคลโลสและการสะสมเพคติน และการควบคุมความเครียดจากออกซิเดชันผ่านการผลิตสารออกซิเจนที่ว่องไว79,80,81,82,83 ในการศึกษาปัจจุบัน การแสดงออกของ 9S-/13S-ลิโปออกซิเจเนสของกรดลิโนเลอิกมีการเปลี่ยนแปลงในทุกสายพันธุ์ แต่ในประชากรที่อ่อนแอ 22660 การเพิ่มขึ้นของการแสดงออกเกิดขึ้นในช่วงเวลาที่แตกต่างกัน ในขณะที่ในสายพันธุ์ที่มียีนต้านทาน Lanr1 และอัลลีล AnMan เน้นย้ำถึงความหลากหลายของชั้นออกซิลิปินในปฏิกิริยาป้องกันแอนแทรกซ์ระหว่างจีโนไทป์เหล่านี้
ยีน 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase (ACO) ที่มีโครงสร้างคล้ายกันมีการแสดงออกเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (9 ยีน) หรือลดลง (2 ยีน) เมื่อได้รับการปลูกเชื้อด้วยลูปิน ยกเว้นสองกรณี การตอบสนองทั้งหมดนี้เกิดขึ้นที่ 6 ชั่วโมงหลังการปลูกเชื้อที่ 83A:476 ปฏิกิริยาเอนไซม์ที่เกิดจากโปรตีน ACO เป็นขั้นตอนที่จำกัดอัตราในการผลิตเอทิลีน ดังนั้นจึงมีการควบคุมอย่างเข้มงวด84 เอทิลีนเป็นฮอร์โมนพืชที่มีบทบาทหลากหลายในการควบคุมการเจริญเติบโตของพืชและการตอบสนองต่อสภาวะความเครียดจากสิ่งแวดล้อมและสิ่งมีชีวิต การเหนี่ยวนำการถอดรหัส ACO และการกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณเอทิลีนเกี่ยวข้องกับการเพิ่มความต้านทานของข้าวต่อเชื้อรากึ่งปรสิต Oryzae oryzae โดยการควบคุมการผลิตสารออกซิเจนที่ออกฤทธิ์และไฟโตอะเล็กซิน กระบวนการติดเชื้อที่ใบที่คล้ายคลึงกันมากที่พบระหว่าง M. oryzae และ C. lupini88,89 โดยมีพื้นฐานมาจากการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของโฮโมล็อก ACO ในสายพันธุ์ 83A:476 ที่รายงานในการศึกษานี้ ทำให้เกิดความเป็นไปได้ในการให้ความต้านทานต่อแอนแทรคโนส NLL เอทิลีนเป็นขั้นตอนสำคัญในการส่งสัญญาณในเส้นทางโมเลกุล
ในการศึกษาครั้งนี้ พบว่ามีการยับยั้งการแสดงออกของยีนจำนวนมากที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์แสงในวงกว้างที่ 6 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อในสายพันธุ์ 83A:476 และที่ 48 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อในสายพันธุ์ Mandeloop และประชากร 22660 ขอบเขตและความก้าวหน้าของการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้เป็นสัดส่วนกับระดับของการติดเชื้อ นอกจากนี้ยังพบความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนสในการทดลองนี้ เมื่อไม่นานมานี้ มีรายงานเกี่ยวกับการยับยั้งการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์แสงอย่างรุนแรงและรวดเร็วในแบบจำลองปฏิสัมพันธ์ระหว่างพืชและเชื้อโรคหลายแบบ รวมถึงแบคทีเรียและเชื้อราที่ก่อโรค การยับยั้งการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์แสงอย่างรวดเร็ว (ตั้งแต่ 2 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อในบางปฏิสัมพันธ์) และการยับยั้งทั่วทั้งระบบเพื่อตอบสนองต่อการติดเชื้อสามารถกระตุ้นภูมิคุ้มกันของพืชโดยอาศัยการใช้สารออกซิเจนที่ว่องไวและการมีปฏิสัมพันธ์กับวิถีทางของกรดซาลิไซลิกเพื่อควบคุมปฏิกิริยาภูมิแพ้ 90,94
โดยสรุป กลไกการตอบสนองการป้องกันที่เสนอสำหรับสายพันธุ์ที่ต้านทานมากที่สุด (83A:476) ได้แก่ การรับรู้เชื้อโรคอย่างรวดเร็วโดยยีน R (สันนิษฐานว่าเป็น TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) และการส่งสัญญาณกรดซาลิไซลิกและเอทิลีนที่เกิดจากการตอบสนองต่อภูมิแพ้ ตามด้วยการสร้าง SAR ระยะไกล การทำงานนี้ได้รับการสนับสนุนโดยโปรตีน DIR-1 ควรสังเกตว่าระยะเวลาการติดเชื้อ C. lupini แบบ biotrophic นั้นสั้นมาก (ประมาณ 2 วัน) ตามด้วยการเจริญเติบโตแบบเนื้อตาย95 การเปลี่ยนผ่านระหว่างระยะเหล่านี้อาจเกี่ยวข้องกับเนื้อตายและการแสดงออกของโปรตีนที่เหนี่ยวนำโดยเอทิลีนซึ่งทำหน้าที่เป็นตัวกระตุ้นปฏิกิริยาภูมิไวเกินในพืชเจ้าบ้าน ดังนั้น ช่วงเวลาสำหรับการจับ C. lupini ได้สำเร็จในระยะ biotrophic จึงแคบมาก การปรับเปลี่ยนโปรแกรมของยีนที่เกี่ยวข้องกับปฏิกิริยาออกซิเดชัน-รีดักชันและการสังเคราะห์แสงที่สังเกตได้ใน 83A:476 ที่ 6 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ สอดคล้องกับการเจริญเติบโตของเส้นใยเชื้อราและบ่งชี้ถึงการพัฒนาการตอบสนองการป้องกันที่ประสบความสำเร็จในระยะไบโอโทรฟิก การตอบสนองทางทรานสคริปโตมิกของ Mandelup และประชากร 22660 อาจล่าช้าเกินไปที่จะตรวจจับเชื้อราก่อนที่จะเปลี่ยนไปสู่การเจริญเติบโตแบบเนื้อตาย อย่างไรก็ตาม Mandelup อาจมีประสิทธิภาพมากกว่าประชากร 22660 เนื่องจากกลไกการควบคุมโปรตีน PR-10 ที่ค่อนข้างรวดเร็วช่วยส่งเสริมความต้านทานในแนวนอน
ETI ซึ่งถูกควบคุมโดยยีน R มาตรฐาน ดูเหมือนจะเป็นกลไกทั่วไปในการต้านทานโรคแอนแทรคโนสของถั่ว ดังนั้น ในพืชตระกูลถั่วต้นแบบ Medicago truncatula การต้านทานโรคแอนแทรคโนสเกิดจากยีน RCT1 ซึ่งเป็นสมาชิกของกลุ่มยีน R พืช TIR-NBS-LRR97 ยีนนี้ยังให้ความต้านทานโรคแอนแทรคโนสในวงกว้างในอัลฟัลฟาเมื่อถ่ายโอนไปยังพืชที่อ่อนแอ ในถั่วฝักยาว (P. vulgaris) มีการระบุยีนต้านทานโรคแอนแทรคโนสมากกว่าสองโหลแล้วในปัจจุบัน ยีนบางส่วนพบในบริเวณที่ไม่มีกลุ่มยีน R มาตรฐาน แต่หลายยีนตั้งอยู่ที่ขอบของโครโมโซมที่มีกลุ่มยีน NBS-LRR รวมถึง TIR-NBS-LRRs99 การศึกษา SSR ทั่วทั้งจีโนมยังยืนยันความสัมพันธ์ของยีน NBS-LRR กับการต้านทานโรคแอนแทรคโนสในถั่วฝักยาวด้วย นอกจากนี้ ยังพบยีน R มาตรฐานในบริเวณจีโนมที่บรรจุตำแหน่งยีนต้านทานโรคแอนแทรคโนสหลักในลูปินขาวสายพันธุ์ 101 อีกด้วย
งานวิจัยของเราแสดงให้เห็นว่า ปฏิกิริยาต้านทานแบบฉับพลัน ซึ่งถูกกระตุ้นในระยะเริ่มต้นของการติดเชื้อในพืช (โดยเฉพาะอย่างยิ่งไม่เกิน 12 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ) สามารถปกป้องต้นลูปินใบแคบจากโรคแอนแทรคโนสที่เกิดจากเชื้อราก่อโรค Collelotrichum lupini ได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยใช้เทคนิคการลำดับดีเอ็นเอความเร็วสูง เราได้แสดงให้เห็นถึงรูปแบบการแสดงออกที่แตกต่างกันของยีนต้านทานโรคแอนแทรคโนสในต้นลูปินใบแคบ ซึ่งถูกควบคุมโดยยีนต้านทาน Lanr1 และ AnMan การป้องกันที่ประสบความสำเร็จนั้นเกี่ยวข้องกับการออกแบบยีนสำหรับโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับปฏิกิริยาออกซิเดชัน-รีดักชัน การสังเคราะห์แสง และการเกิดโรคอย่างระมัดระวังภายในไม่กี่ชั่วโมงหลังจากการสัมผัสกับเชื้อโรคครั้งแรกของพืช ปฏิกิริยาป้องกันที่คล้ายกัน แต่ล่าช้ากว่า จะมีประสิทธิภาพน้อยกว่ามากในการปกป้องพืชจากโรค การต้านทานโรคแอนแทรคโนสที่ควบคุมโดยยีน Lanr1 คล้ายกับการตอบสนองอย่างรวดเร็วของยีน R (ภูมิคุ้มกันที่ถูกกระตุ้นโดยตัวกระตุ้น) ในขณะที่ยีน AnMan น่าจะให้การตอบสนองในแนวนอน (ภูมิคุ้มกันที่ถูกกระตุ้นโดยรูปแบบโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับจุลินทรีย์) ซึ่งให้ความยั่งยืนในระดับปานกลาง
สายพันธุ์ NLL จำนวน 215 สายพันธุ์ที่ใช้ในการคัดกรองเครื่องหมายโรคแอนแทรคโนส ประกอบด้วยพันธุ์ปลูก 74 สายพันธุ์ สายพันธุ์ที่ได้จากการผสมข้ามพันธุ์หรือการผสมพันธุ์ 60 สายพันธุ์ สายพันธุ์กลายพันธุ์ 5 สายพันธุ์ และสายพันธุ์ป่าหรือเชื้อพันธุกรรมดั้งเดิม 76 สายพันธุ์ สายพันธุ์เหล่านี้มาจาก 17 ประเทศ ส่วนใหญ่มาจากโปแลนด์ (58) สเปน (47) เยอรมนี (27) ออสเตรเลีย (26) รัสเซีย (19) เบลารุส (7) อิตาลี (5) และสายพันธุ์อื่นๆ จาก 10 ประเทศ ชุดนี้ยังรวมถึงสายพันธุ์ต้านทานโรคอ้างอิง ได้แก่ 83A:476, Tanjil, Wonga ที่มีอัลลีล Lanr1 และ Mandelup ที่มีอัลลีล AnMan สายพันธุ์เหล่านี้ได้มาจากฐานข้อมูลทรัพยากรพันธุกรรมลูปินยุโรป ซึ่งดูแลโดยบริษัท Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, โปแลนด์ (ตารางเสริม S1)
ปลูกพืชภายใต้สภาวะควบคุม (ช่วงเวลาแสง 16 ชั่วโมง อุณหภูมิ 25°C ในเวลากลางวันและ 18°C ​​ในเวลากลางคืน) วิเคราะห์ตัวอย่างทางชีวภาพ 2 ชุด แยก DNA จากใบอายุ 3 สัปดาห์โดยใช้ชุด DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) ตามโปรโตคอล ประเมินคุณภาพและความเข้มข้นของ DNA ที่แยกได้โดยวิธีสเปกโทรโฟโตเมตริก (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) วิเคราะห์เครื่องหมาย AnManM1 ที่ระบุยีนต้านทานโรคแอนแทรคโนส AnMan (ได้มาจากพันธุ์ Mandelup) และเครื่องหมาย Anseq3 และ Anseq4 ที่อยู่รอบยีน Lanr1 (ได้มาจากพันธุ์ Tanjil) 11,26,28 โฮโมไซโกตสำหรับอัลลีลต้านทานให้คะแนนเป็น “1” ไวต่อโรคให้คะแนนเป็น “0” และเฮเทโรไซโกตให้คะแนนเป็น 0.5
จากผลการคัดกรองเครื่องหมาย AnManM1, AnSeq3 และ AnSeq4 และความพร้อมของเมล็ดพันธุ์สำหรับการทดลองติดตามผลขั้นสุดท้าย ได้คัดเลือกสายพันธุ์ NLL จำนวน 50 สายพันธุ์สำหรับการศึกษาลักษณะความต้านทานต่อโรคแอนแทรคโนส การวิเคราะห์ดำเนินการซ้ำสองครั้งในเรือนกระจกควบคุมด้วยคอมพิวเตอร์ โดยมีช่วงเวลาการให้แสง 14 ชั่วโมง และอุณหภูมิในช่วง 22°C ในเวลากลางวันและ 19°C ในเวลากลางคืน เมล็ดจะถูกขูด (ตัดเปลือกเมล็ดด้านตรงข้ามของเอ็มบริโอด้วยใบมีดคม) ก่อนการเพาะปลูกเพื่อป้องกันการพักตัวของเมล็ดเนื่องจากเปลือกเมล็ดแข็งเกินไปและเพื่อให้มั่นใจว่าการงอกสม่ำเสมอ ต้นกล้าปลูกในกระถาง (11 × 11 × 21 ซม.) ด้วยดินปลอดเชื้อ (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warsaw, Poland) การปลูกเชื้อทำโดยใช้เชื้อรา Colletotrichum lupini สายพันธุ์ Col-08 ซึ่งเพาะเลี้ยงในปี 1999 จากลำต้นของต้นลูปินใบแคบที่ปลูกในแปลงที่เมืองเวอร์เซนิตซา ประเทศโปแลนด์ (52° 27′ 42″ เหนือ 17° 04′ 05″ ตะวันออก) นำเชื้อที่แยกได้มาเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ SNA ที่อุณหภูมิ 20°C ภายใต้แสงสีดำเป็นเวลา 21 วัน เพื่อกระตุ้นการสร้างสปอร์ สี่สัปดาห์หลังจากปลูก เมื่อต้นกล้ามีใบ 4-6 ใบ จึงทำการปลูกเชื้อโดยการฉีดพ่นสารละลายสปอร์ที่มีความเข้มข้น 0.5 x 10⁶ สปอร์ต่อมิลลิลิตร หลังจากปลูกเชื้อแล้ว นำต้นกล้าไปเก็บไว้ในที่มืดเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ที่ความชื้นประมาณ 98% และอุณหภูมิ 25°C เพื่อช่วยให้สปอร์งอกและเกิดการติดเชื้อ จากนั้นจึงนำพืชไปปลูกภายใต้ช่วงเวลาแสง 14 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 22°C กลางวัน/19°C กลางคืน และความชื้น 70% ทำการประเมินคะแนนความรุนแรงของโรคหลังจากฉีดเชื้อ 22 วัน โดยให้คะแนนตั้งแต่ 0 (ต้านทานโรค) ถึง 9 (อ่อนแอต่อโรคมาก) ขึ้นอยู่กับการมีหรือไม่มีแผลเนื้อตายบนลำต้นและใบ นอกจากนี้ หลังจากประเมินคะแนนแล้ว ยังทำการวัดน้ำหนักของพืชด้วย ความสัมพันธ์ระหว่างจีโนไทป์ของเครื่องหมายและฟีโนไทป์ของโรคคำนวณโดยใช้ค่าสหสัมพันธ์แบบจุดสองลำดับ (การไม่มีเครื่องหมายเฮเทอโรไซกัสในชุดสายพันธุ์สำหรับการวิเคราะห์ฟีโนไทป์ต้านทานโรคแอนแทรคโนส)