Dankie dat u Nature.com besoek het. Die blaaierweergawe wat u gebruik, het beperkte CSS-ondersteuning. Vir die beste ervaring beveel ons aan dat u 'n opgedateerde blaaier gebruik (of Verenigbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer). Intussen, om voortgesette ondersteuning te verseker, sal ons die webwerf sonder style en JavaScript weergee.
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) is 'n peulplant wat gebruik word vir voedselproduksie en grondverbetering. Die wêreldwye uitbreiding van NLL as 'n gewas het baie patogene swamme gelok, insluitend lupienantracnose, wat die verwoestende antraknose-siekte veroorsaak. Twee allele, Lanr1 en AnMan, wat verhoogde weerstand verleen, is in NLL-teling gebruik, maar die onderliggende molekulêre meganismes bly onbekend. In hierdie studie is die Lanr1- en AnMan-merkers gebruik om Europese NLL-monsters te sif. Toetsing van die entstof in 'n beheerde omgewing het die doeltreffendheid van beide weerstandige skenkers bevestig. Differensiële geenekspressieprofilering is uitgevoer op verteenwoordigende weerstandige en vatbare lyne. Antraknose-weerstand is geassosieer met oorekspressie van die geenontologieterme "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process" en "GO:0015979 Photosintesis". Daarbenewens het die Lanr1(83A:476)-lyn beduidende transkriptoomherprogrammering vinnig na inenting getoon, terwyl die ander lyne 'n vertraging in hierdie reaksie van ongeveer 42 uur getoon het. Verdedigingsreaksies word geassosieer met die TIR-NBS-, CC-NBS-LRR- en NBS-LRR-gene, 10 proteïene betrokke by patogenese, lipiedoordragproteïene, endoglukaan-1,3-β-glukosidase, glisienryke selwandproteïene, en gene van die reaktiewe pad van suurstof. Vroeë reaksies op 83A:476, insluitend die versigtige onderdrukking van gene wat met fotosintese geassosieer word, het saamgeval met suksesvolle beskerming tydens die vegetatiewe groeifase van swambiologie, wat daarop dui dat 'n effektor immuniteit veroorsaak. Die Mandeloop-reaksie word vertraag, asook die algehele horisontale weerstand.
Die smalblaarlupien (NLL, Lupinus angustifolius L.) is 'n hoë-proteïen graansoort wat in die westelike Mediterreense streek ontstaan ​​​​het1,2. Dit word tans as 'n voedselgewas vir diere en mense verbou. Dit word ook as groenbemesting in gewasrotasiestelsels beskou as gevolg van stikstofbinding deur simbiotiese stikstofbindende bakterieë en die algehele verbetering van grondstruktuur. NLL het die afgelope eeu 'n vinnige proses van domestisering ondergaan en is steeds onder hoë teeldruk3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Met die wydverspreide verbouing van NLL het die opeenvolging van patogene swamme nuwe landbounisse ontwikkel en nuwe gewasvernietigende siektes veroorsaak. Die merkwaardigste vir lupienboere en -telers was die verskyning van antraknose, veroorsaak deur die patogene swam, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Die merkwaardigste vir lupienboere en -telers was die verskyning van antraknose, veroorsaak deur die patogene swam, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогного вызванного патогныго (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Die opkoms van antraknose, veroorsaak deur die patogene swam Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13, was die opvallendste vir lupienboere en -telers.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由県它是由県它是由県(Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由県它是由県它是由県(Bondar)嵵Haar。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенты lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Die opvallendste vir lupienboere en -telers is die opkoms van antraknose wat veroorsaak word deur die patogene swam Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Die vroegste verslae van die siekte het uit Brasilië en die Verenigde State gekom, met tipiese simptome wat onderskeidelik in 1912 en 1929 verskyn het. Na ongeveer 30 jaar is die patogeen egter as Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz aangewys. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf van Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Steenman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in Gerigte Morfologie. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .en H. Schrenk. & H.施伦克，. & H.施伦克，.en H. Schlenk, .Voorlopige siektefenotipering wat in die middel van die 20ste eeu gedoen is, het 'n mate van weerstand in NLL- en geel lupien (L. luteus L.)-toevoegings getoon, maar alle wit lupien (L. albus L.)-toevoegings wat getoets is, was hoogs vatbaar15,16. Studies het getoon dat die ontwikkeling van antraknose geassosieer word met verhoogde neerslag (lugvogtigheid) en temperatuur (in die reeks van 12-28°C), wat lei tot 'n skending van weerstand by hoër temperature17, 18. Trouens, die tyd wat nodig was vir konidia om te ontkiem en die siekte om te begin, was vier keer korter by 24°C (4 uur) as by 12°C (16 uur) onder hoë humiditeitstoestande19. Dus het die voortdurende aardverwarming gelei tot die verspreiding van antraknose. Die siekte is egter in Frankryk (1982) en Oekraïne (1983) waargeneem as 'n voorbode van 'n dreigende bedreiging, maar is blykbaar destyds deur die lupienbedryf geïgnoreer20,21. 'n Paar jaar later het hierdie verwoestende siekte regoor die wêreld versprei en ook groot lupienproduserende lande soos Australië, Pole en Duitsland geraak22,23,24. Na 'n antraknose-uitbraak in die middel-1990's, het uitgebreide sifting gelei tot die identifisering van verskeie weerstandige skenkers in NLL19-monsters. NLL-weerstand teen antraknose word beheer deur twee afsonderlike dominante allele wat in verskillende kiemplasma-bronne voorkom: Lanr1 in kultivar Tanjil en Wonga en AnMan in kultivar Mandalay25,26. Hierdie allele komplementeer die molekulêre merkers wat die seleksie van weerstandige kiemplasma in teelprogramme ondersteun25,26,27,28,29,30. Die weerstandige teellyn 83A:476 wat die Lanr1-alleel dra, is gekruis met die vatbare wilde lyn P27255 om 'n RIL-populasie te verkry wat segregeer vir antraknose-weerstand, wat dit moontlik gemaak het om die Lanr1-lokus aan chromosoom NLL-1131, 32, 33 toe te ken. Belyning van skakelkaartmerkers van flankerende weerstandsloci tot antraknose met 'n genomiese raamwerk, NLL het die ligging van al drie allele op dieselfde chromosoom (NLL-11) onthul, maar in verskillende posisies29,34,35. As gevolg van die klein aantal RIL's en die groot genetiese afstand tussen merkers en ooreenstemmende allele, kan geen betroubare gevolgtrekkings oor hul onderliggende gene gemaak word nie. Aan die ander kant is die gebruik van omgekeerde genetika in lupiene moeilik as gevolg van hul baie lae regenerasiepotensiaal, wat genetiese manipulasie omslagtig maak37.
Die ontwikkeling van makgemaakte kiemplasma wat die verlangde alleel in die homosigotiese toestand dra, soos 83A:476 (Lanr1) en Mandelup (AnMan), het die deur oopgemaak vir die bestudering van antraknose-weerstand in die lig van die teenwoordigheid van teenoorgestelde kombinasies van allele in wilde populasies. Moontlikhede van molekulêre meganismes. Vergelyk verdedigingsreaksies wat deur spesifieke genotipes gegenereer word. Hierdie studie het die vroeë transkriptoomrespons van NLL op C. lupini-inenting geëvalueer. Eerstens is 'n Europese NLL-kiemplasmapaneel met 215 lyne gekeur met behulp van molekulêre merkers wat die Lanr1- en AnMan-allele merk. Antraknose-fenotipering is toe uitgevoer op 50 NLL-lyne, voorheen geselekteer vir molekulêre merkers, onder beheerde toestande. Gebaseer op hierdie eksperimente, is vier lyne wat verskil in antraknose-weerstand en Lanr1/AnMan-alleliese samestelling, geselekteer vir differensiële verdedigingsgeenekspressieprofilering met behulp van twee komplementêre benaderings: hoë-deurset RNS-volgordebepaling en intydse PCR-kwantifisering.
Sifting van 'n stel NLL-kiemplasma (N = 215) met merkers Lanr1 (Anseq3 en Anseq4) en AnMan (Anseq4) en AnMan (AnManM1) het getoon dat slegs een lyn (95726, naby Salamanca-b) die "weerstands"-alleel vir alle merkers versterk, terwyl "Teenwoordigheid van 'vatbare' allele" die proporsie van alle merkers in 158 (~73.5%) lyne gevind het. Dertien lyne het twee "weerstands"-allele van die Lanr1-merker geproduseer, en 8 lyne het "weerstands"-allele van die Lanr1-merker geproduseer. Die "weerstands"-alleel van die AnMan-merker (Aanvullende Tabel S1). Twee lyne was heterosigoties vir die Anseq3-merker en een heterosigoties vir die AnManM1-merker. 42 lyne (19.5%) het teenoorgestelde fases van die Anseq3- en Anseq4-allele gedra, wat 'n hoë frekwensie van rekombinasie tussen hierdie twee loki aandui. Antraknose-fenotipes onder beheerde toestande (Aanvullende Tabel S2) het veranderlikheid in die weerstand van die getoetste genotipes getoon, wat weerspieël is in die erns van antraknose. Verskille in gemiddelde tellings het gewissel van 1.8 (matig weerstandig) tot 6.9 (vatbaar) en plantgewigverskille het gewissel van 0.62 (vatbaar) tot 4.45 g (bestand). Daar was 'n beduidende korrelasie tussen waardes wat in twee replikasies van die eksperiment waargeneem is (0.51 vir siekte-ernstigheidstellings, P = 0.00017 en 0.61 vir plantgewig, P < 0.0001) sowel as tussen hierdie twee parameters (− 0.59 en − 0.77, P < 0.0001). Daar was 'n beduidende korrelasie tussen waardes wat waargeneem is in twee replikasies van die eksperiment (0.51 vir siekte-ernstigheidtellings, P = 0.00017 en 0.61 vir plantgewig, P < 0.0001) sowel as tussen hierdie twee parameters (−0.59 en −0.77, P < 0.0001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми in двух повторностях эксперимента (0,51 bykomstighede) болезни, P = 0,00017 en 0,61 vir массы растения, P < 0,0001), as 'n maksimum aantal maandelikse vlakke (-0,59,0, -0,59,0и) 0,0001). 'n Beduidende korrelasie is gevind tussen die waardes wat waargeneem is in twee herhalings van die eksperiment (0.51 vir siekte-ernstigheidstellings, P = 0.00017 en 0.61 vir plantgewig, P < 0.0001), sowel as tussen hierdie twee parameters (-0.59 en -0.77, P < 0.0001) 0.0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分1︌三. 0,00017，植物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77。01)在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 为庈度 诟分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 为（鈼（（，（，７ ＋７ ＋. 0,59 和– 0,59 和– 0,59 和-0,77，P < 0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценколи тявиях, 5, 0, 0 = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0001), en между этими двумя параметрами (-0,59 en -0,0001) 0,77, P <0,0001. Daar was 'n beduidende korrelasie tussen die waardes wat in duplikaat waargeneem is (siekte-ernstigheidtelling 0.51, P = 0.00017 en plantgewig 0.61, P < 0.0001) en tussen hierdie twee parameters (-0.59 en -0.0001) 0.77, P<0.0001. ).Tipiese simptome wat in vatbare plante gesien word, sluit in die kinkel en draai van die stam wat soos 'n "herderboog"-struktuur lyk, gevolg deur ovaalvormige letsels met oranje/pienk sporozoïete (Aanvullende Fig. 1). Australiese byvoegings wat die Lanr1 (83A:476 en Tanjil) en AnMan (Mandelup) gene dra, is matig bestand, 0.0331 en 0.0036). Sommige lyne wat ook "bestande" Lanr1 en/of AnMan allele dra, toon simptome van die siekte.
Interessant genoeg het 'n paar NLL-lyne wat geen "weerstandige" merkerallel het nie, 'n hoë vlak van antraknose-weerstand getoon (vergelykbaar met of hoër as vir Lanr1- of AnMan-genotipes), soos Boregine (P-waarde < 0.0001 vir beide parameters), Bojar (P-waarde < 0.0001 vir telling en 0.001 vir plantgewig) en Populasie B-549/79b (P-waarde < 0.0001 vir telling en nie-beduidend vir gewig). Interessant genoeg het 'n paar NLL-lyne wat geen "weerstandige" merkerallel het nie, 'n hoë vlak van antraknose-weerstand getoon (vergelykbaar met of hoër as vir Lanr1- of AnMan-genotipes), soos Boregine (P-waarde < 0.0001 vir beide parameters), Bojar (P-waarde < 0.0001 vir telling en 0.001 vir plantgewig) en Populasie B-549/79b (P-waarde < 0.0001 vir telling en nie-beduidend vir gewig). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, покасусаливы устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (vanaf 0,000) параметров), Bojar (gesondheid P < 0,0001 vir оценки en 0,001 vir массы растения) en популяции B-549/79b (gesonde P <0,0001 vir оценки и незначимо для массы). Interessant genoeg het verskeie NLL-lyne sonder enige 'weerstandige' merkerallel 'n hoë vlak van weerstand teen antraknose getoon (vergelykbaar met of hoër as vir Lanr1- of AnMan-genotipes), soos Boregine (P-waarde < 0.0001 vir beide parameters), Bojar (P-waarde < 0.0001 vir evaluering en 0.001 vir plantgewig) en populasie B-549/79b (P-waarde < 0.0001 vir evaluering en nie beduidend vir gewig nie).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炧水平的炩r1或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，逍量れ逍量 Dit is interessant dat sommige NLL-stelsels wat geen "antigeniese" merkers het nie, hoë horisontale weerstand toon (gelykstaande aan Lanr1- of AnMan-gene of hoër), soos Boregine (beide parameters P < 0.0001), Bojar (P-waarde < 0.0001, plantgewig 0.001) en stam B-549/79b (P-waarde < 0.0001, gewig nie beduidend nie). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», покасазаливи устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (snaчение P обобоих,00пар, (gemiddelde P <0,0001, maksimum prys 0,001) en B-549/79b (gemiddelde P-waarde <0,0001, масса незначительна). Interessant genoeg het sommige NLL-lyne wat geen 'weerstand'-merkerallele het nie, hoë vlakke van antraknose-weerstand getoon (vergelykbaar met of hoër as Lanr1- of AnMan-genotipes), soos Boregine (P-waarde vir beide parameters <0.0001), Bojar (P-waarde < 0.0001, plantgewig 0.001) en populasie B-549/79b (P-waarde < 0.0001, gewig nie beduidend nie).Hierdie verskynsel dui op die moontlikheid van 'n nuwe genetiese bron van weerstand, wat die waargenome gebrek aan korrelasie tussen merkergenotipes en siektefenotipes (P-waardes van ~0.42 tot ~0.98) verklaar. Dus het die Kolmogorov-Smirnov-toets getoon dat die data oor antraknose-weerstand ongeveer normaal versprei was vir tellings (P-waardes 0.25 en 0.11) en plantmassa (P-waardes 0.47 en 0.55), wat daarop dui dat ek hipotetiseer dat meer allele as Lanr1 en AnMan betrokke is.
Gebaseer op die resultate van antraknose-weerstandsifting, is 4 lyne gekies vir transkriptoomanalise: 83A:476, Boregine, Mandelup, en Populasie 22660. Hierdie lyne is hertoets vir miltsiekteweerstand in inentingseksperimente deur RNS-volgordebepaling, mits hulle dieselfde was as in die vorige toets. Die tellingwaardes was soos volg: Boregin (1.71 ± 1.39), 83A: 476 (2.09 ± 1.38), Mandelup (3.82 ± 1.42) en populasie 22660 (6.11 ± 1.29).
Die Illumina NovaSeq 6000-protokol het gemiddeld 40.5 Mread-pare per monster behaal (29.7 tot 54.4 Mreads) (Aanvullende Tabel S3). Belyningstellings in die verwysingsvolgorde het gewissel van 75.5% tot 88.6%. Die gemiddelde korrelasie van leestellingdata tussen eksperimentele variante tussen biologiese replikate het gewissel van 0.812 tot 0.997 (gemiddeld 0.959). Uit die 35 170 gene wat geanaliseer is, het 2917 geen uitdrukking getoon nie, en die ander 4785 gene is teen 'n weglaatbare vlak uitgedruk (basisgemiddelde < 5). Uit die 35 170 gene wat geanaliseer is, het 2917 geen uitdrukking getoon nie, en die ander 4785 gene is teen 'n weglaatbare vlak uitgedruk (basisgemiddelde < 5). Ongeveer 35 170 jaar 2917 geen pryse nie, meer as 4785 gelde. уровне (базовое среднее <5). Van die 35 170 gene wat geanaliseer is, het 2917 geen uitdrukking getoon nie, en die oorblywende 4785 gene is teen 'n weglaatbare vlak uitgedruk (basisgemiddelde <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）.35,170 Ongeveer 35 170 nommers 2917 is nog nie beskikbaar nie, en 4785 nommers is nie beskikbaar nie (ons среднее значение <5). Van die 35 170 gene wat geanaliseer is, is 2917 nie uitgedruk nie en die oorblywende 4785 gene het weglaatbare uitdrukking gehad (basisgemiddelde <5).Dus was die aantal gene wat as uitgedruk beskou is (basisgemiddelde ≥ 5) tydens die eksperiment 27 468 (78,1%) (Aanvullende Tabel S4).
Van die eerste tydpunt af het alle NLL-lyne op die inenting van C. lupini (stam Col-08) gereageer deur die transkriptoom te herprogrammer (Tabel 1), maar beduidende verskille is tussen die lyne waargeneem. Dus het die weerstandslyn 83A:476 (wat die Lanr1-geen dra) beduidende transkriptoomherprogrammering by die eerste tydpunt (6 hpi) getoon met 'n 31-69-voudige toename in die aantal geïsoleerde op- en af-gene in vergelyking met ander tydpunte by hierdie tydpunt. Boonop was hierdie piek van korte duur, aangesien die uitdrukking van slegs 'n paar gene by die tweede tydpunt (12 hpi) beduidend verander gebly het. Interessant genoeg het Boregine, wat ook 'n hoë vlak van weerstand in die oorplantingstoets getoon het, nie so 'n massiewe transkripsieherprogrammering tydens die eksperiment ondergaan nie. Die aantal differensieel uitgedrukte gene (DEG) was egter dieselfde vir Boregine en 83A:476 by 12 HPI. Beide Mandelup en populasie 22660 het DEG-pieke op die laaste tydstip getoon (48 l/s), wat 'n relatiewe vertraging in verdedigingsreaksies aandui.
Omdat 83A:476 massiewe transkriptoomherprogrammering ondergaan het in reaksie op C. lupini teen 6 HPI in vergelyking met alle ander lyne, was ~91% van die DEG's wat op hierdie tydstip waargeneem is, afstammingspesifiek (Fig. 1). Daar was egter 'n mate van oorvleueling in vroeë reaksies tussen studielyne, aangesien 68.5%, 50.9% en 52.6% DEG in Boregine, Mandelup en populasie 22660 onderskeidelik oorvleuel het met dié wat in 83A:476 op sekere tydstippe gevind is. Hierdie DEG's het egter slegs 'n klein fraksie (0.97–1.70%) van alle DEG's wat tans met 83A:476 opgespoor word, uitgemaak. Daarbenewens was 11 DEG's van alle lyne op hierdie tydstip samehangend (Aanvullende Tabelle S4-S6), insluitend algemene komponente van plantverdedigingsreaksies: lipiedoordragproteïen (TanjilG_32225), endoglukaan-1,3-β-glukosiedensiem (TanjilG_23384), twee stres-induseerbare proteïene soos SAM22 (TanjilG_31528 en TanjilG_31531), basiese lateksproteïen (TanjilG_32352), en twee glisienryke strukturele selwandproteïene (TanjilG_19701 en TanjilG_19702). Daar was ook 'n relatief hoë oorvleueling in transkriptoomreaksies tussen 83A:476 en Boregine teen 24 HPI (totaal 16-38% DEG) en tussen Mandelup en Populasie 22660 teen 48 HPI (totaal 14-20% DEG).
Venn-diagram wat die aantal differensieel uitgedrukte gene (DEG) in smalblaarlupien (NLL) lyne toon wat ingeënt is met Colletotrichum lupini (stam Col-08 verkry van lupienvelde in Wierzhenice, Pole, 1999). Die NLL lyne wat geanaliseer is, was: 83A:476 (bestand, dra die Lanr1 alleel), Boregine (bestand, genetiese agtergrond onbekend), Mandelup (matig bestand, dra die AnMan alleel) en populasie 22660 (baie vatbaar). Die afkorting hpi staan ​​vir ure na inenting. Nulwaardes is verwyder om die grafiek te vereenvoudig.
Die stel ooruitgedrukte gene teen 6 hpi is geanaliseer vir die teenwoordigheid van kanonieke R-geendomeine (Aanvullende Tabel S7). Hierdie studie het transkriptoom-induksie van klassieke siekteweerstandsgene met NBS-LRR-domeine slegs teen 83A:476 getoon. Hierdie stel het bestaan ​​uit een TIR-NBS-LRR-geen (tanjilg_05042), vyf CC-NBS-LRR-gene (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, en tanjilg_16162), en Vier NBS-LR, Tanjilg_16162), en Vier NBS-LRRE (tanjilg_16162), sowel as Vier NBS-Lrr (tanjilg_16162) en Vier NBS-LRR (TANJILG_16162). Al hierdie gene het kanonieke domeine wat in gekonserveerde volgordes gerangskik is. Benewens die NBS-LRR-domeingene, is verskeie RLL-kinases teen 6 hpi geaktiveer, naamlik een in Boregine (TanjilG_19877), twee in Mandelup (TanjilG_07141 en TanjilG_19877) en in populasie 22660 (TanjilG_09014 en TanjilG_10361) en twee in 83A 27:476.
Gene met beduidend veranderde uitdrukking in reaksie op inenting met C. lupini (stam Col-08) is onderwerp aan Geenontologie (GO) verrykingsanalise (Aanvullende Tabel S8). Die mees oorverteenwoordigde biologiese prosesterm was "GO:0006952 verdedigingsrespons" wat in 6 uit 16 (tyd × lyn) kombinasies met hoë betekenisvolheid (P-waarde < 0.001) verskyn het (Fig. 2). Die mees oorverteenwoordigde biologiese prosesterm was "GO:0006952 verdedigingsrespons" wat in 6 uit 16 (tyd × lyn) kombinasies met hoë betekenisvolheid (P-waarde < 0.001) verskyn het (Fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитнеты», by появлялся в 6 tot 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (geskiedenis P <0,001) (r. 2). Die mees oorverteenwoordigde biologiese prosesterm was 'GO:0006952 verdedigingsrespons', wat in 6 van 16 (tyd × afstamming) kombinasies met hoë betekenisvolheid (P-waarde < 0.001) verskyn het (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）. Die mees verteenwoordigende biologiese prosesterm is "GO:0006952 verdedigingsrespons", wat in 6 van die 16 (时间×线) kombinasies voorkom, met hoë betekenisvolheid (P-waarde < 0.001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Verdedigingsreaksie», косторвыв 16 van 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Die mees oorverteenwoordigde biologiese prosesterm was 'GO:0006952 Defense Response', wat in 6 uit 16 kombinasies (tyd × lyn) met hoë betekenisvolheid (P-waarde < 0.001) verskyn het (Fig. 2).Hierdie term is oorverteenwoordig op twee tydspunte in 83A: 476 en Boregine (6 en 24 hpi) en op een tydspunt in Mandelup en Populasie 22660 (onderskeidelik 12 en 6 hpi). Dit is 'n verwagte resultaat, wat die antifungale reaksie van die weerstandige lyne beklemtoon. Daarbenewens het 83A:476 op C. lupini gereageer deur vinnig gene te induseer wat verband hou met die oksidatiewe uitbarsting wat deur die term "GO:0055114 redoksproses" verteenwoordig word, wat 'n spesifieke verdedigingsreaksie aandui, terwyl Boregine spesifieke verdedigingsreaksies getoon het, verwant aan die term 'GO'. :0006950 Stresrespons”. Populasie 22660 het die horisontale weerstandsrespons wat sekondêre metaboliete behels, geaktiveer, wat die oormatige aantal terme “GO:0016104 Proses van triterpeenbiosintese” en “GO:0006722 Proses van triterpeenmetabolisme” (beide terme behoort aan dieselfde stel gene) beklemtoon. Met inagneming van die resultate van die GO-termverrykingsanalise, was die Mandelup-reaksiestabiliteit tussen Boregine en Populasie 22660. Daarbenewens sluit die vroeë reaksie 83A:476 (6 hpi) en die vertraagde reaksie Mandelup en Populasie 22660 die term GO:0015979 'fotosintese' en ander verwante biologiese prosesse in.
Die bioproses-geenontologieterme wat gekies is in die annotasie van differensieel uitgedrukte gene tydens transkriptoomresponse van smalblaarlupien (NLL) wat met miltsiektelupien (Col-08-stam verkry van lupienvelde in Wierzhenice, Pole, in 1999) ingeënt is, is grootliks oordrewe. Die NLL-lyne wat geanaliseer is, was: 83A:476 (bestand, dra die homosigotiese Lanr1-alleel), Boregine (bestand, onbekende genetiese agtergrond), Mandelup (matig bestand, dra die homosigotiese AnMan-alleel) en populasie 22660 (vatbaar).
Omdat hierdie studie daarop gemik was om gene te identifiseer wat bydra tot antraknose-weerstand, is die gene wat aan die terme GO "GO: 0006952 Defensiewe reaksies" en "GO: 0055114 Redoksprosesse" toegeken is, geanaliseer met afsnypunte aangesien basislyngemiddeldes ≥ 30 is met ten minste een lyn × tydstip wat statisties beduidende waardes van log2 (vouverandering) kombineer. Die aantal gene wat aan hierdie kriteria voldoen het, was 65 vir GO:0006952 en 524 vir GO:0055114.
83A:476 het twee DEG-pieke onthul wat met die term GO:0006952 geannoteer is, die eerste teen 6 gene per duim (64 gene, op- en afregulering) en die tweede teen 24 gene per duim (15 gene, slegs opregulering). Boregine het ook getoon dat GO:0006952 op dieselfde tydstip 'n piek bereik het, maar met minder DEG (11 en 8) en voorkeuraktivering. Mandeloop het twee pieke van GO:0006952 teen 12 en 48 HPI getoon, beide met 12 gene (die eerste met aktiverende gene, en die tweede met slegs onderdrukkende gene), terwyl die 22660-populasie teen 6 HPI (13 gene) 'n groter oorheersing van die toenamespiekregulering gehad het. Daar moet kennis geneem word dat 96.4% van GO:0006952 DEG in hierdie pieke dieselfde tipe reaksie gehad het (op of af), wat 'n beduidende oorvleueling in verdedigingsreaksies aandui ten spyte van verskille in die aantal gene wat betrokke is. Die grootste groep rye wat verband hou met die term GO:0006952 kodeer vir die Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-agtig), wat behoort aan die klas 10 patogenese-geassosieerde proteïen (PR-10) proteïenklade en die kernproteïenlatex. soortgelyke (MLP-agtige) proteïen) proteïen (Fig. 3). Die twee groepe het verskil in die aard van uitdrukking en die rigting van die reaksie. Die gene wat vir SAM22-agtige proteïene kodeer, het konsekwente en beduidende induksie by vroeë tydspunte (6 of 12 hpi) getoon en was oor die algemeen onresponsief aan die einde van die eksperiment (48 hpi), terwyl MLP-agtige proteïene koördinasie by 6 hpi getoon het. hpi. 83A:476 en Mandelup by 48 hp/in, was byna alle ander datapunte onresponsief. Daarbenewens het verskille in uitdrukkingsprofiele van SAM22-agtige proteïengene gevolg op waargenome variasie in antraknose-weerstand, aangesien meer weerstandige lyne meer tydspunte gehad het wat hierdie gene beduidend geïnduseer het as meer vatbare gene. Nog 'n LlR18A/B-agtige PR-10-geen het 'n baie soortgelyke ekspressiepatroon as die SAM22-agtige proteïengeen getoon.
Die hoofkomponente van die biologiese prosesterm "GO:0006952 Defense Response" en die uitdrukkingspatrone van kandidaatgene van die Lanr1- en AnMan-allele is geïdentifiseer. Die Log2-skaal verteenwoordig log2-waardes (vouverandering) tussen geïnokuleerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkry van lupienvelde, Wizhenica, Pole, 1999) en kontrole (skyn-ingeënte) plante op dieselfde tydstip. Die volgende smalblaar-lupienlyne is geanaliseer: 83A:476 (bestand, dra die homosigotiese Lanr1-alleel), Boregine (bestand, genetiese agtergrond onbekend), Mandelup (matig bestand, dra die homosigotiese AnMan-alleel), en Populasie 22660 (vatbaar).
Daarbenewens is die ekspressieprofiele van RNA-seq kandidaatgene Lanr1 (TanjilG_05042) en AnMan (TanjilG_12861) geëvalueer (Fig. 3). Die TanjilG_05042-geen het 'n beduidende respons (aktivering) by 83A:476 slegs by die eerste tydspunt (6 hpi) getoon, terwyl TanjilG_12861 slegs by twee tydspunte beduidend in Mandeloop was: 6 hpi (afregulering) en 24 hpi (6 hpi). Met.). verstelbaar) ).
Die mees ooruitgedrukte gene in die term GO:0055114 "redoksproses" was gene wat kodeer vir sitochroom P450-proteïene en peroksidase (Fig. 4). Vir monsters wat geïsoleer is van 83A:476 teen 6 HPI, is maksimum of minimum log2 (vouverandering) waardes (vir 86.6% van die gene) oor die algemeen waargeneem tussen geïnokuleerde en kontroleplante, wat die hoë reaksie van hierdie genotipe op inokulerende geslag beklemtoon. 83A:476 het die mees beduidende GO: 0055114 DEG teen 6 hpi (503 gene) getoon, terwyl die res van die lyne teen 48 hpi (Boregine, 31 gene; Mandelup, 85 gene; en Populasie 22660, 78 gene)) getoon het. In die meeste gene van die GO:0055114-familie is twee tipes reaksies op inenting (aktivering en inhibisie) waargeneem. Interessant genoeg, tot 97.6% van die DEG's wat vir die term GO: 0055114 in Mandelupe teen 48 hp geïdentifiseer is. Hierdie waarnemings dui daarop dat, ten spyte van die aansienlik kleiner skaal (d.w.s. die aantal gemuteerde redoksgene, 85 teenoor 503), die patroon van vertraagde transkriptoomresponse van mandeloup op antraknose soortgelyk is aan die vroeë respons van 83A:476. In Boregine en Populasie 22660 is hierdie konvergensie laer teen onderskeidelik 51.6% en 75.6%.
Die uitdrukkingspatrone van die hoofkomponente van die term van die biologiese proses "GO:0055114 Redox-proses" is onthul. Die Log2-skaal verteenwoordig log2-waardes (vouverandering) tussen geïnokuleerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkry van lupienvelde, Wizhenica, Pole, 1999) en kontrole (skyn-ingeënte) plante op dieselfde tydstip. Die volgende smalblaar-lupienlyne is geanaliseer: 83A:476 (bestand, dra die homosigotiese Lanr1-alleel), Boregine (bestand, genetiese agtergrond onbekend), Mandelup (matig bestand, dra die homosigotiese AnMan-alleel), en Populasie 22660 (vatbaar).
83A:476 Transkriptomiese reaksies op inenting met C. lupini (stam Col-08) het ook gekoördineerde stilmaak van gene ingesluit wat toegeskryf word aan die term GO:0015979 "fotosintese" en ander verwante biologiese prosesse (FIG. 5). Hierdie GO:0015979 DEG-stel het 105 gene bevat wat beduidend onderdruk is teen 6 hpi teen 83A:476. In hierdie subgroep is 37 gene ook afgereguleer in Mandelup teen 48 HPI en 35 op dieselfde tydstip in die 22660-populasie, insluitend 19 DEG's wat algemeen is vir beide genotipes. Geen DEG's wat verband hou met term GO: 0015979 is beduidend geaktiveer in enige kombinasie nie (lyn x tyd).
Die uitdrukkingspatrone van die hoofkomponente van die term van die biologiese proses "GO:0015979 Fotosintese" is onthul. Die Log2-skaal verteenwoordig log2-waardes (vouverandering) tussen geïnokuleerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkry van lupienvelde, Wizhenica, Pole, 1999) en kontrole (skyn-ingeënte) plante op dieselfde tydstip. Die volgende smalblaar-lupienlyne is geanaliseer: 83A:476 (bestand, dra die homosigotiese Lanr1-alleel), Boregine (bestand, genetiese agtergrond onbekend), Mandelup (matig bestand, dra die homosigotiese AnMan-alleel), en Populasie 22660 (vatbaar).
Gebaseer op die resultate van differensiële ekspressie-analise en vermoedelik betrokke by verdedigingsreaksies teen patogene swamme, is hierdie stel van sewe gene geselekteer vir kwantifisering van ekspressieprofiele deur middel van intydse PCR (Aanvullende Tabel S9).
Die vermeende proteïengeen TanjilG_10657 is beduidend geïnduseer in alle bestudeerde lyne en tydpunte in vergelyking met kontrole (nabootsende) plante (Aanvullende Tabelle S10, S11). Daarbenewens het die ekspressieprofiel van TanjilG_10657 'n toenemende tendens getoon oor die verloop van die eksperiment vir alle lyne. Populasie 22660 het die hoogste sensitiwiteit van TanjilG_10657 vir inokulasie met 114-voudige aktivering en die hoogste relatiewe ekspressievlak (4.4 ± 0.4) teen 24 HPI getoon (Fig. 6a). Die PR10 LlR18A proteïengeen TanjilG_27015 het ook aktivering oor alle lyne en tydpunte getoon, met statistiese beduidendheid by die meeste datapunte (Fig. 6b). Soortgelyk aan TanjilG_10657, is die hoogste relatiewe ekspressievlak van TanjilG_27015 waargeneem in die 22660 geïnokuleerde populasie teen 24 HPI (19.5 ± 2.4). Die suur-endokitinasegeen TanjilG_04706 was beduidend opgereguleer in alle lyne en op alle tydspunte behalwe vir Boregine 6 hpi (Fig. 6c). Dit is sterk geïnduseer by die eerste tydspunt (6 HPI) by 83A:476 (met 10.5 keer) en matig toegeneem in ander lyne (met 6.6-7.5 keer). Tydens die eksperiment het die uitdrukking van TanjilG_04706 op soortgelyke vlakke gebly in 83A:476 en Boregine, terwyl dit in Mandelup en Populasie 22660 beduidend toegeneem het en relatief hoë waardes bereik het (onderskeidelik 5.9 ± 1.5 en 6.2 ± 1.5). Die endoglukaan-1,3-β-glukosidase-agtige geen TanjilG_23384 het hoë aktivering by die eerste twee tydspunte (6 en 12 hpi) in alle lyne behalwe populasie 22660 getoon (Fig. 6d). Die hoogste relatiewe ekspressievlakke van TanjilG_23384 is waargeneem by die tweede tydpunt (12 hpi) in Mandelup (2.7 ± 0.3) en 83A:476 (1.5 ± 0.1). By 24 HPI was TanjilG_23384-ekspressie relatief laag in alle bestudeerde lyne (van 0.04 ± 0.009 tot 0.44 ± 0.12).
Ekspressieprofiele van geselekteerde gene (ag) getoon deur kwantitatiewe PCR. Die nommers 6, 12 en 24 verteenwoordig ure na inenting. Die LanDExH7- en LanTUB6-gene is gebruik vir normalisering en LanTUB6 is gebruik vir interreekskalibrasie. Foutbalke verteenwoordig die standaardafwyking gebaseer op drie biologiese replikate, wat elk die gemiddelde van drie tegniese replikate is. Die statistiese beduidendheid van verskille in die ekspressievlakke tussen die geïnokuleerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkry in 1999 van die lupienveld in Wierzenica, Pole) en kontrole (spot-ingeënte) plante word bo datapunte aangedui (*P-waarde < 0.05, **P-waarde ≤ 0.01, ***P-waarde ≤ 0.001). Die statistiese beduidendheid van verskille in die ekspressievlakke tussen die geïnokuleerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkry in 1999 van die lupienveld in Wierzenica, Pole) en kontrole (spot-ingeënte) plante word bo datapunte aangedui (*P-waarde < 0.05, **P-waarde ≤ 0.01, ***P-waarde ≤ 0.001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Kol-08, 9 Desember, 9 Augustus. поля люпина в Верженице, Польша) en контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена надихными (*p. 0,05, **snaчение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Statisties beduidende verskille in ekspressievlakke tussen geïnokuleerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkry in 1999 van 'n lupienveld in Wierzhenice, Pole) en kontrole (skyn-ingeënte) plante word bo die datapunte aangedui (*P-waarde < 0.05, **P-waarde ≤ 0.01, ***P-waarde ≤ 0.001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在繰（标记在繂湰捈0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 撌 鯹煤秉 缈水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.01) 。. Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полйсч люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) en контрольными (ложно инокулированными) растениями отметченды (* syfer P < 0,05, ** P-tyd ≤ 0,01, ***P-punt ≤ 0,001). Statisties beduidende verskille in ekspressievlakke tussen geïnokuleerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkry van lupienlande in Verzhenice, Pole, in 1999) en kontrole (skyn-ingeënte) plante word bo die datapunte aangedui (*P-waarde < 0.05, **P-waarde ≤ 0.01, ***P-waarde ≤ 0.001).Die NLL-lyne wat geanaliseer is, was: 83A:476 (weerstandig, draer van die homosigotiese Lanr1-alleel), Mandelup (matig weerstandig, draer van die homosigotiese AnMan-alleel), Boregine (weerstandig, onbekende genetiese agtergrond) en populasie 22660 (vatbaar).
Die kandidaatgeen TanjilG_05042 by die Lanr1-lokus het 'n merkbaar verskillende ekspressiepatroon getoon as die profiele wat verkry is uit RNA-seq-studies (Fig. 6e). Beduidende aktivering van hierdie geen is waargeneem in Mandelup en die 22660-populasie (tot onderskeidelik 39.7 en 11.7 keer), wat gelei het tot relatief hoë ekspressievlakke (tot onderskeidelik 1.4 ± 0.14 en 7.2 ± 1.3). 83A:476 het ook 'n mate van opregulering van die TanjilG_05042-geen getoon (tot 3.8-voudig), maar die relatiewe ekspressievlakke wat bereik is (0.044 ± 0.002) was meer as 30-voudig laer as dié wat waargeneem is in Mandelup en die 22660-populasie. Ontleding deur qPCR het beduidende verskille in ekspressievlakke tussen genotipes in skyn-ingeënte (kontrole) variante getoon, wat 'n 58-voudige verskil tussen populasies 22660 en 83A:476, sowel as tussen populasies 22660 en 22660, bereik het. 'n Tweevoudige verskil is tussen Boregine en Mandalup bereik.
Die kandidaatgeen by die AnMan-lokus, TanjilG_12861, is geaktiveer in reaksie op inenting in 83A:476 en Mandelup, was neutraal in die 22660-populasie en was afgereguleer in Boregine (Fig. 6f). Die relatiewe uitdrukking van die TanjilG_12861-geen was die hoogste in geïnokuleerde 83A:476 (0.14±0.01). Die 17.4 kDa klas I hitteskokproteïengeen TanjilG_05080 HSP17.4 het laer relatiewe uitdrukkingsvlakke in alle bestudeerde stamme en tydpunte getoon (Fig. 6g). Die hoogste waarde is waargeneem by 24 HPI in die 22660-populasie (0.14 ± 0.02, 'n agtvoudige toename in reaksie op inenting).
Vergelyking van geenekspressieprofiele (Fig. 7) het 'n hoë korrelasie tussen TanjilG_10657 en vier ander gene getoon: TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.80), en TanjilG_04706 (r = 0.79). Sulke resultate kan dui op ko-regulering van hierdie gene tydens verdedigingsreaksies. Die TanjilG_12861- en TanjilG_23384-gene het verskillende ekspressieprofiele met laer Pearson-korrelasiekoëffisiëntwaardes (onderskeidelik van 0.08 tot 0.43 en -0.19 tot 0.28) getoon in vergelyking met ander gene.
Korrelasies tussen geenekspressieprofiele is met behulp van kwantitatiewe PCR opgespoor. Die volgende smalblaarlupienlyne is geanaliseer: 83A:476 (weerstandig, dra die homosigotiese Lanr1-alleel), Mandelup (matig weerstandig, dra die homosigotiese AnMan-alleel), Boregine (weerstandig, genetiese agtergrond onbekend), en Populasie 22660 (vatbaar). Drie tydpunte is bereken (6, 12 en 24 uur na inokulasie), insluitend geïnokuleerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkry van lupienvelde in Wierzhenice, Pole, in 1999) en kontrole (skyn-ingeënte) plante. Die skaal toon die waarde van die Pearson-korrelasiekoëffisiënt.
Gebaseer op data verkry teen 6 perdekrag per duim, is WGCNA uitgevoer op 9981 DEG wat geïdentifiseer is deur geïnokuleerde en kontroleplante te vergelyk om op vroeë verdedigingsreaksies te fokus (Aanvullende Tabel S12). Twee-en-twintig geenmodules (klusters) is gevind met gekorreleerde (positiewe of negatiewe) ekspressieprofiele tussen genotipes en eksperimentele variante. Gemiddeld was geenekspressievlakke dalend in orde 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasie 22660 (in beide variante was hierdie tendens egter sterker in kontroleplante). Gemiddeld was geenekspressievlakke dalend in orde 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasie 22660 (in beide variante was hierdie tendens egter sterker in kontroleplante). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Bevolking 22660 (в обоих вариантах, вариантах тенденция была сильнее у контрольных растений). Gemiddeld het geenekspressievlakke afgeneem in die orde 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasie 22660 (in beide variante was hierdie tendens egter sterker in kontroleplante).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Bevolking 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> bevolking 22660 的 顺序 下降 （， 県 噿在 在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。…… В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Bevolking 22660 (однако в обоианхтаэ была сильнее у контрольных растений). Gemiddeld het geenekspressievlakke afgeneem in die reeks 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasie 22660 (in beide variante was hierdie tendens egter sterker in kontroleplante).Inenting het gelei tot opregulering van geenekspressie, veral in modules 18, 19, 14, 6 en 1 (in dalende volgorde van effek), negatiewe regulering (bv. modules 9 en 20) of met neutrale effekte (bv. modules 11, 22, 8 en 13). GO-termverrykingsanalise (Aanvullende Tabel S13) het "GO: 0006952 Beskermende reaksies" vir die geïnokuleerde module (18) met maksimum aktivering aan die lig gebring, insluitend gene wat deur qPCR geanaliseer is (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 en TanjilG_27015), sowel as baie Inokulaat se mees onderdrukte fotosintese-modules (9). Module 18-konsentrator (Fig. 8) is geïdentifiseer as die TanjilG_26536-geen wat kodeer vir die PR-10-agtige LlR18B-proteïen, en module 9-konsentrator is geïdentifiseer as die TanjilG_28955-geen wat kodeer vir die fotosisteem II PsbQ-proteïen. 'n Kandidaat-antraknose-weerstandsgeen Lanr1, TanjilG_05042, is in module 22 (Fig. 9) gevind en word geassosieer met die terme "GO:0044260 Sellulêre makromolekulêre metaboliese prosesse" en "GO:0006355 Transkripsionele regulering, DNS-templatering" wat die TanjilG_01212-hub dra. Die geen kodeer vir hittestres-transkripsiefaktor A-4a (HSFA4a).
Geweegde netwerkanalise van geenko-ekspressie van modules met oorverteenwoordigde biologiese prosesterme "GO: 0006952 Verdedigingsresponse". Ligasie is vereenvoudig om die vier gene wat deur qPCR geanaliseer is (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 en TanjilG_27015) uit te lig.
Geweegde netwerkanalise van geenko-ekspressie van 'n module met 'n oorverteenwoordigde biologiese prosesterm "GO: 0006355: Transkripsieregulering, DNS-templateer" en wat 'n kandidaat-antraknose-weerstandsgeen Lanr1 TanjilG_05042 dra. Ligasie is vereenvoudig om die TanjilG_05042-geen en die sentrale TanjilG_01212-geen te isoleer.
Antraknose-weerstandsondersoeke wat in Australië versamel is, het getoon dat die meeste van die vroeg vrygestelde kultivars vatbaar was; Kalya, Coromup en Mandelup is as matig weerstandig beskryf, terwyl Wonga, Tanjil en 83A:476 as hoogs weerstandig beskryf is26,27,31. het dieselfde weerstandsalleel gehad, aangewys as Lanr1, en Coromup en Mandelup het 'n ander alleel gehad, aangewys as AnMan10,26,39, terwyl Kalya 'n ander alleel, Lanr2, oorgedra het. Sifting vir antraknose-weerstand in Duitsland het gelei tot die identifisering van 'n weerstandige lyn Bo7212 met 'n kandidaat-alleel anders as Lanr1, aangewys as LanrBo36.
Ons studie het 'n baie lae frekwensie (ongeveer 6%) van die Lanr1-alleel in die getoetste kiemplasma aan die lig gebring. Hierdie waarneming stem ooreen met die resultate van die sifting van Oos-Europese kiemplasma met behulp van die Anseq3- en Anseq4-merkers, wat getoon het dat die Lanr1-alleel slegs in twee Belarussiese lyne teenwoordig is. Dit dui daarop dat die Lanr1-alleel nog nie wyd deur plaaslike teelprogramme gebruik word nie, anders as in Australië, waar dit een van die sleutelallele vir merker-ondersteunde teling is. Dit kan wees as gevolg van die laer vlak van weerstand wat deur die Lanr1-alleel in Europese veldtoestande verskaf word in vergelyking met die Australiese verslag. Daarbenewens het studies van antraknose in hoë reënvalgebiede in Australië getoon dat weerstandsreaksies wat deur die Lanr1-alleel gemedieer word, dalk nie effektief is in weerstoestande wat die groei en vinnige ontwikkeling van die patogeen bevoordeel nie19,42. Trouens, in die huidige studie is sommige simptome van antraknose ook waargeneem in genotipes wat die Lanr1-alleel dra, wat daarop dui dat weerstand onder optimale toestande vir die ontwikkeling van C. lupini kan verdwyn. Daarbenewens is vals positiewe interpretasies van die teenwoordigheid van Anseq3- en Anseq4-merkers, wat ongeveer 1 cM van die Lanr1-lokus is, moontlik 28,30,43.
Ons studie het getoon dat 83A:476, wat die Lanr1-alleel dra, op C. lupini-inenting met grootskaalse transkriptoomherprogrammering gereageer het by die eerste geanaliseerde tydspunt (6 hpi), terwyl in Mandelup, wat die AnMan-alleel dra, transkriptomiese reaksies baie later waargeneem is (van 24 tot 48 hp). Hierdie temporale variasies in verdedigingsreaksies word geassosieer met verskille in siektesimptome, wat die belangrikheid van vroeë patogeenherkenning vir 'n suksesvolle reaksie op weerstand beklemtoon. Om plantweefsel te infekteer, moet miltsiektespore deur verskeie ontwikkelingsfases op die gasheeroppervlak gaan, insluitend ontkieming, seldeling en die vorming van 'n appressorium. 'n Aanhangsel is 'n infektiewe struktuur wat aan die oppervlak van die gasheer heg en penetrasie in die gasheerweefsel vergemaklik. Dus het spore van C. gloeosporioides in ertjie-ekstrak die eerste deling van die kern na 75-90 minute van inkubasie getoon, die vorming van 'n kiembuis na 90-120 minute, en onderdrukking na 4 uur. Mango C. gloeosporioides het meer as 40% konidiale ontkieming getoon na 3 uur se inkubasie en ongeveer 20% die vorming van appressors na 4 uur. Die virulensie-geassosieerde CAP20-geen van C. gloeosporioides het transkripsie-aktiwiteit in epifietvormende konidia getoon na 3.5 uur inkubasie in avokado-oppervlakwas met hoë konsentrasies CAP20-proteïen na 4 uur 46 min. Net so is die aktiwiteit van melanienbiosintese-gene in C. trifolii geïnduseer tydens 'n 2-uur inkubasie, gevolg deur die vorming van 'n appressorium na 1 uur. Studies van blaarweefsels het getoon dat aarbeie wat met C. acutatum ingeënt is, eerste onderdrukking teen 8 hpi het, terwyl tamaties wat met C. coccodes ingeënt is, eerste onderdrukking teen 4 hpi het48,49. Dit stem grootliks ooreen met die tydskaal van die Colletotrichum spp.-aansteeklike proses. Vinnige verdedigingsreaksies op 83A:476 dui op die betrokkenheid van plantweerstand en effektor-geaktiveerde immuniteit (ETI) gene in hierdie lyn, terwyl Mandelup se vertraagde reaksies die mikro-geassosieerde molekulêre patroon-geaktiveerde immuniteit (MTI) hipotese 50 ondersteun. Vroeë reaksies op 83A: 476 en Mandelup. Die gedeeltelike oorvleueling tussen op- of afgereguleerde gene in vertraagde reaksie ondersteun ook hierdie konsep, aangesien ETI dikwels beskou word as 'n versnelde en verbeterde MTI-reaksie wat kulmineer in geprogrammeerde seldood op die plek van infeksie, bekend as anafilaktiese skok 51,52.
Die meeste van die gene wat toegeskryf word aan die oorverteenwoordigde term Gene Ontology GO:0006952 "Defense Response" is die 11 homoloë van die stres-geïnduseerde vastende boodskap 22 proteïen (soortgelyk aan SAM22) en die sewe hoof lateksproteïenagtiges (MLP's). -agtige proteïene 31, 34, 43 en 423 het volgorde-ooreenkoms getoon. SAM22-agtige gene het beduidende aktivering getoon wat langer geduur het, wat verhoogde vlakke van antraknose-weerstand toon (83A:476 en Boregine). MLP-agtige gene is egter slegs afgereguleer in lyne wat die kandidaat-weerstandsalleel dra (83A:476/Lanr1 teen 6 hpi en Mandelup/AnMan teen 24 hpi). Daar moet kennis geneem word dat alle geïdentifiseerde SAM22-agtige homoloë afkomstig is van 'n geenkluster wat ongeveer 105 kb strek, terwyl MLP-agtige gene afkomstig is van aparte streke van die genoom. Gekoördineerde aktivering van sulke SAM22-agtige gene is ook gevind in ons vorige studie van NLL-weerstand teen Diaporthetoxica-inenting, wat daarop dui dat hulle betrokke is by die horisontale komponente van die verdedigingsreaksie. Hierdie gevolgtrekking word ook ondersteun deur verslae van 'n positiewe reaksie van SAM22-agtige gene op besering of behandeling met salisielsuur, swaminduseerders of waterstofperoksied.
MLP-agtige gene het getoon dat hulle reageer op verskeie abiotiese en biotiese stresfaktore, insluitend bakteriële, virale en patogene swaminfeksies in baie plantspesies55. Die reaksierigtings op sekere interaksies tussen plante en patogene het gewissel van sterk toename (d.w.s. tydens besmetting van katoen met Verticillium dahliae) tot beduidende afname (d.w.s. na infeksie van die appelboom met Alternaria spp.)56,57. Beduidende afregulering van die MLP-agtige 423-geen is waargeneem tydens avokado-verdediging teen F. niger-infeksie en tydens infeksie van die appelboom Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola en Alternaria alternata is appelpatotipes58,59. Daarbenewens het appelkalli wat die MLP-agtige 423-geen ooruitdruk, laer uitdrukking van weerstandsgeassosieerde gene gehad en was meer vatbaar vir swaminfeksie59. Na Fusarium oxysporum f is die MLP-agtige 423-geen ook onderdruk in weerstandige gewone boonkiemplasma. cn. Booninfeksie 60.
Ander lede van die PR-10-familie wat in ons RNA-seq-studie geïdentifiseer is, was die LlR18A- en LlR18B-gene in reaksie op opregulering, sowel as die opreguleerde (1 geen) of afreguleerde (3 gene) geen vir die lipiedoordragproteïen DIR1. Daarbenewens beklemtoon WGCNA die LlR18B-geen as 'n spilpunt in hierdie module, wat hoogs vatbaar is vir inenting en verskeie beskermende reaksiegene dra. Die LlR18A- en LlR18B-gene is geïnduseer in geel lupienblare in reaksie op patogene bakterieë, sowel as in NLL-stingels na D. toxica-inenting, terwyl die ryshomoloog van hierdie gene, RSOsPR10, vinnig geïnduseer is deur 'n swaminfeksie wat vermoedelik betrokke is by die jasmoniese suur-seinweg53,61, 62. Die DIR1-geen kodeer vir niespesifieke lipiedoordragproteïene wat benodig word vir die aanvang van sistemiese verworwe weerstand (SAR). Met die ontwikkeling van beskermende reaksies word die DIR1-proteïen vanaf die fokus van infeksie deur die floëem vervoer om SAR in verafgeleë organe te induseer. Interessant genoeg is die TanjilG_02313 DIR1-geen beduidend geïnduseer by die eerste tydpunt in lyne 84A:476 en Populasie 22660, maar antraknose-weerstand het slegs suksesvol in lyn 84A:476 ontwikkel. Dit kan dui op 'n mate van subfunksionalisering van die DIR1-geen in NLL, aangesien die oorblywende drie homoloë slegs op inenting in die 83A:476-lyn teen 6 hpi gereageer het, en hierdie reaksie afwaarts gerig was.
In ons studie was die mees algemene komponente wat ooreenstem met die biologiese proses genaamd "GO:0055114 Redoksproses" sitochroom P450-proteïen, peroksidase, linoleïensuur 9S-/13S-lipoksigenase en 1-aminosiklopropaan-1-karboksielsuuroksidase. Daarbenewens definieer ons WGCNA die HSFA4a-homoloog as 'n spilpunt wat modules soos die Lanr1-weerstandsgeenkandidaat TanjilG_05042 dra. HSFA4a is 'n komponent van die redoksafhanklike regulering van kerntranskripsie in plante.
Sitochroom P450-proteïene is oksidoreduktases wat NADPH en/of O2-afhanklike hidroksileringsreaksies in primêre en sekondêre metabolisme kataliseer, insluitend die metabolisme van xenobiotika, sowel as hormone, vetsure, sterole, selwandkomponente, biopolimere en die biosintese van beskermende verbindings 69. In ons In 'n studie is die veranderlikheid in plant-sitochroom P450-funksie verminder van -10.6 log2 (vouverandering) tot 5.7 as gevolg van 'n groot aantal veranderde homoloë (37) en verskille in reaksiepatrone tussen spesifieke gene, wat 'n opwaartse hersiening weerspieël. Die gebruik van slegs RNA-seq-data om die vermeende biologiese funksie van die NLL-gene in so 'n groot proteïen-superfamilie te verduidelik, sou hoogs spekulatief wees. Dit is egter die moeite werd om daarop te let dat sommige sitochroom P450-gene geassosieer word met verhoogde weerstand teen patogene swamme of bakterieë, insluitend 'n bydrae tot allergiese reaksies 69,70,71.
Klas III peroksidases is multifunksionele plantensieme wat betrokke is by 'n wye reeks metaboliese prosesse tydens plantgroei en -ontwikkeling, sowel as in reaksie op omgewingsstres soos soutgehalte, droogte, hoë ligintensiteit en patogeen-aanval72. Peroksidases is betrokke by die interaksie van verskeie plantspesies met Anthracis, insluitend Stylosanthes humilis en C. gloeosporioides, Lens culinaris en C. truncatum, Phaseolus vulgaris en C. lindemuthianum, Cucumis sativus en C. lagenarium73,74,75,76. Die reaksie is baie vinnig, soms selfs teen 4 HPI, voordat die swam die plantweefsel binnedring73. Die peroksidase-geen het ook gereageer op D. toxica NLL-inokulasie. Benewens hul tipiese funksies om oksidatiewe uitbarsting te reguleer of oksidatiewe stres uit te skakel, kan peroksidases inmeng met patogeengroei deur fisiese hindernisse te skep gebaseer op selwandversterking tydens lignifikasie, subeenheid- of kruisbinding van spesifieke verbindings. Hierdie funksie kan in silico toegeskryf word aan die TanjilG_03329-geen wat kodeer vir 'n vermeende lignienvormende anioonperoksidase wat in ons studie beduidend opgereguleer is in die 83A:476-weerstandige lyn teen 6 HPI, maar nie in ander stamme en tydpunte wat nie gereageer het nie.
9S-/13S-lipoksigenase van linoleïensuur is die eerste stap in die oksidatiewe pad van lipiedbiosintese78. Die produkte van hierdie pad het verskeie funksies in plantverdediging, insluitend selwandversterking deur die vorming van kallose- en pektienafsettings, en regulering van oksidatiewe stres deur die produksie van reaktiewe suurstofspesies79,80,81,82,83. In die huidige studie was die uitdrukking van linoleïensuur 9S-/13S-lipoksigenase in alle stamme verander, maar in die vatbare populasie 22660 het opregulering op verskillende tydspunte geheers, terwyl dit in stamme wat weerstandige Lanr1 en die AnMan-alleel dra, die diversifikasie van die oksilipienlaag in beskermende miltsiektereaksies tussen hierdie genotipes beklemtoon.
Die 1-aminosiklopropaan-1-karboksilaatoksidase (ACO) homoloog was beduidend opgereguleer (9 gene) of afgereguleer (2 gene) toe dit met lupien ingeënt is. Met twee uitsonderings het al hierdie reaksies plaasgevind teen 6 hp by 83A:476. Die ensiematiese reaksie wat deur ACO-proteïene gemedieer word, is die tempobeperkende stap in etileenproduksie en is dus hoogs gereguleer84. Etileen is 'n planthormoon wat 'n verskeidenheid rolle speel in die regulering van plantontwikkeling en reaksie op abiotiese en biotiese strestoestande. Die induksie van ACO-transkripsie en aktivering van die etileen-seinweg is betrokke by die verhoging van die weerstand van rys teen die hemibiotrofiese swam oryzae oryzae deur die produksie van reaktiewe suurstofspesies en fitoaleksiene te reguleer. 'n Baie soortgelyke blaarinfeksieproses wat tussen M. oryzae en C. lupini88,89 gevind is, teen die agtergrond van 'n beduidende opregulering van ACO-homoloë in die 83A:476-lyn wat in hierdie studie gerapporteer is, verskuif die moontlikheid om weerstand teen NLL-antraknose-etileen, 'n sentrale seinstap in molekulêre bane, te verleen.
In die huidige studie is grootskaalse onderdrukking van baie gene wat met fotosintese geassosieer word, waargeneem teen 6 hpi in 83A:476 en teen 48 hpi in Mandeloop en die 22660-populasie. Die omvang en progressie van hierdie veranderinge is eweredig aan die vlak. Antraknose-weerstand is in hierdie eksperiment waargeneem. Onlangs is sterk en vroeë onderdrukking van fotosintese-verwante transkripsies in verskeie modelle van plant-patogeen-interaksies, insluitend patogene bakterieë en swamme, gerapporteer. Haas (vanaf 2 HPI in sommige interaksies) en globale onderdrukking van gene wat met fotosintese geassosieer word in reaksie op infeksie kan plantimmuniteit veroorsaak gebaseer op die ontplooiing van reaktiewe suurstofspesies en hul interaksie met die salisielsuurroete om allergiese reaksies te bemiddel 90,94.
Ten slotte, verdedigingsreaksiemeganismes wat vir die mees weerstandige afstammingslyn (83A:476) voorgestel word, sluit in vinnige patogeenherkenning deur die R-geen (vermoedelik TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) en allergiese reaksie-gemedieerde salisielsuur- en etileenseintransduksie, gevolg deur die vestiging van langafstand SAR. Die aksie word ondersteun deur die DIR-1-proteïen. Daar moet kennis geneem word dat die biotrofiese periode vir C. lupini-infeksie baie kort is (ongeveer 2 dae), gevolg deur nekrotiese groei95. Die oorgang tussen hierdie stadiums kan geassosieer word met nekrose en uitdrukking van etileen-induseerbare proteïene wat as snellers vir hipersensitiwiteitsreaksies in gasheerplante optree. Daarom is die tydvenster vir suksesvolle vaslegging van C. lupini in die biotrofiese stadium baie nou. Die herprogrammering van gene wat geassosieer word met redoks en fotosintese wat in 83A:476 teen 6 hpi waargeneem word, is in ooreenstemming met die progressie van swamhifes en lui die ontwikkeling van 'n suksesvolle beskermende reaksie in die biotrofiese stadium in. Die transkriptomiese reaksies van Mandelup en die 22660-populasie mag dalk te vertraag wees om die swam vas te vang voordat dit oorskakel na nekrotiese groei, maar Mandelup mag dalk meer effektief wees as die 22660-populasie omdat die relatief vinnige regulering van die PR-10-proteïen horisontale weerstand bevorder.
ETI, gedryf deur die kanonieke R-geen, blyk 'n algemene meganisme vir boonweerstand teen antraknose te wees. Dus, in die modelpeulvrug Medicago truncatula, word weerstand teen antraknose toegeken deur die RCT1-geen, 'n lid van die TIR-NBS-LRR97 plant R-geenklas. Hierdie geen verleen ook breëspektrum antraknoseweerstand in lusern wanneer dit na vatbare plante oorgedra word. In die gewone boon (P. vulgaris) is meer as twee dosyn antraknoseweerstandsgene tot op datum geïdentifiseer. Sommige van hierdie gene word gevind in streke wat geen kanonieke R-gene het nie, maar baie ander is geleë aan die rande van chromosome wat die NBS-LRR-geenkluster dra, insluitend TIR-NBS-LRRs99. Die genoomwye SSR-studie het ook die assosiasie van die NBS-LRR-geen met antraknoseweerstand in die gewone boon bevestig. Die kanonieke R-geen is ook gevind in die genomiese streek wat die belangrikste antraknoseweerstandslokus in wit lupien 101 dra.
Ons werk toon dat 'n onmiddellike weerstandsreaksie, wat in 'n vroeë stadium van plantinfeksie geaktiveer word (verkieslik nie later nie as 12 hpi), smalblaarlupien effektief beskerm teen antraknose wat veroorsaak word deur die patogene swam Collelotrichum lupini. Deur gebruik te maak van hoë deursetvolgordebepaling, het ons differensiële ekspressieprofiele van antraknose-weerstandsgene in NLL-plante gedemonstreer, gemedieer deur die Lanr1- en AnMan-weerstandsgene. Suksesvolle verdediging behels die noukeurige ontwerp van die gene vir proteïene wat betrokke is by redoks, fotosintese en patogenese binne ure na die plant se eerste kontak met 'n patogeen. Soortgelyke beskermende reaksies, maar vertraag in tyd, is baie minder effektief om plante teen siektes te beskerm. Miltsiekteweerstand wat gemedieer word deur die Lanr1-geen lyk soos die tipiese vinnige reaksie van die R-geen (effektor-geaktiveerde immuniteit), terwyl die AnMan-geen heel waarskynlik 'n horisontale reaksie bied (immuniteit wat veroorsaak word deur 'n mikrobe-geassosieerde molekulêre patroon), wat 'n matige vlak van volhoubaarheid bied.
Die 215 NLL-lyne wat gebruik is om vir antraknose-merkers te sif, het bestaan ​​uit 74 kultivars, 60 lyne wat verkry is deur kruising of teling, 5 mutante en 76 wilde of oorspronklike kiemplasmas. Die lyne kom van 17 lande, hoofsaaklik van Pole (58), Spanje (47), Duitsland (27), Australië (26), Rusland (19), Belarus (7), Italië (5) en ander lyne van 10 lande. Die stel sluit ook verwysingsweerstandige lyne in: 83A:476, Tanjil, Wonga wat die Lanr1-alleel dra, en Mandelup wat die AnMan-alleel dra. Die lyne is verkry van die Europese Lupien Genetiese Hulpbrondatabasis wat deur Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Pole, onderhou word (Aanvullende Tabel S1).
Plante is onder beheerde toestande gekweek (fotoperiode 16 uur, temperatuur 25°C gedurende die dag en 18°C ​​in die nag). Twee biologiese replikate is geanaliseer. DNS is van drie weke oue blare geïsoleer met behulp van die DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Duitsland) volgens die protokol. Die kwaliteit en konsentrasie van die geïsoleerde DNS is beoordeel deur spektrofotometriese metodes (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VSA). Die AnManM1-merker wat die antraknose-weerstandsgeen AnMan (afgelei van cv. Mandelup) merk, en die merkers Anseq3 en Anseq4 wat die geen Lanr1 (afgelei van cv. Tanjil) flankeer, is geanaliseer 11,26,28. Homosigote vir die weerstandige alleel is as "1", vatbaar - as "0", en heterosigote - as 0.5 gegradeer.
Gebaseer op die resultate van sifting vir merkers AnManM1, AnSeq3 en AnSeq4 en die beskikbaarheid van sade vir finale opvolg-eksperimente, is 50 NLL-lyne geselekteer vir antraknose-weerstandsfenotipering. Die analise is in duplikaat uitgevoer in 'n rekenaarbeheerde kweekhuis met 'n 14-uur fotoperiode met 'n temperatuurreeks van 22°C gedurende die dag en 19°C in die nag. Sade word gekrap (die saadlaag aan die teenoorgestelde kant van die embrio met 'n skerp lem afgesny) voor saai om saadrus te voorkom as gevolg van die saadlaag wat te hard is en om eenvormige ontkieming te verseker. Plante is in potte (11 × 11 × 21 cm) met steriele grond (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warskou, Pole) gekweek. Inokulasie is uitgevoer met die Colletotrichum lupini Col-08-stam, wat in 1999 gekweek is uit die stingels van smalblaarlupienplante wat in 'n veld in Verzhenitsa, Groter Pole (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ O) gekweek is. Kry 'n area. Die isolate is vir 21 dae in SNA-medium by 20° C onder swart lig gekweek om sporulasie te veroorsaak. Vier weke na saai, toe die plante die 4-6-blaarstadium bereik het, is inokulasie uitgevoer deur te spuit met 'n suspensie van konidia teen 'n konsentrasie van 0.5 x 106 konidia per ml. Na inokulasie is die plante vir 24 uur in die donker gehou by 'n humiditeit van ongeveer 98% en 'n temperatuur van 25°C om die ontkieming van konidia en die infeksieproses te vergemaklik. Die plante is toe gekweek onder 'n 14-uur fotoperiode by 22°C dag/19°C nag en 70% humiditeit. Die siektetelling is 22 dae na inenting gemaak en het gewissel van 0 (immuun) tot 9 (baie vatbaar) afhangende van die teenwoordigheid of afwesigheid van nekrotiese letsels op stingels en blare. Daarbenewens is die gewig van die plante na telling gemeet. Verwantskappe tussen merkergenotipes en siektefenotipes is bereken as punt twee-volgorde korrelasies (afwesigheid van heterosigotiese merkers in die stel lyne vir analise van die antraknose-weerstandsfenotipe).