Gràcies per visitar Nature.com. La versió del navegador que esteu utilitzant té compatibilitat limitada amb CSS. Per a una millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o que desactiveu el mode de compatibilitat a l'Internet Explorer). Mentrestant, per garantir el suport continu, renderem el lloc web sense estils ni JavaScript.
El llop Angustifolius (NLL, Lupinus angustifolius L.) és una planta lleguminosa utilitzada per a la producció d'aliments i la millora del sòl. L'expansió global del NLL com a cultiu ha atret molts fongs patògens, inclosa l'antracnosi del llop, que causa la devastadora malaltia de l'antracnosi. Dos al·lels, Lanr1 i AnMan, que confereixen una major resistència, s'han utilitzat en la millora de NLL, però els mecanismes moleculars subjacents continuen sent desconeguts. En aquest estudi, els marcadors Lanr1 i AnMan es van utilitzar per cribrar mostres europees de NLL. Les proves de la vacuna en un entorn controlat van confirmar l'eficàcia d'ambdós donants resistents. Es va realitzar un perfil d'expressió gènica diferencial en línies resistents i susceptibles representatives. La resistència a l'antracnosi es va associar amb la sobreexpressió dels termes de l'ontologia gènica "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process" i "GO:0015979 Photosynthesis". A més, la línia Lanr1(83A:476) va mostrar una reprogramació transcriptoma significativa i ràpida després de la inoculació, mentre que les altres línies van mostrar un retard en aquesta resposta d'unes 42 hores. Les respostes de defensa s'associen amb els gens TIR-NBS, CC-NBS-LRR i NBS-LRR, 10 proteïnes implicades en la patogènesi, proteïnes de transferència de lípids, endoglucà-1,3-β-glucosidasa, proteïnes de la paret cel·lular riques en glicina i gens de la via reactiva de l'oxigen. Les primeres respostes a 83A:476, inclosa la supressió acurada dels gens associats amb la fotosíntesi, van coincidir amb una protecció reeixida durant la fase de creixement vegetatiu de la biologia dels fongs, cosa que suggereix que un efector desencadena la immunitat. La reacció de Mandeloop s'alenteix, igual que l'arrossegament horitzontal general.
El llopí de fulla estreta (NLL, Lupinus angustifolius L.) és un cereal ric en proteïnes originari de la regió mediterrània occidental1,2. Actualment es conrea com a cultiu alimentari per a animals i humans. També es considera adob verd en sistemes de rotació de cultius a causa de la fixació de nitrogen per bacteris simbiòtics fixadors de nitrogen i la millora general de l'estructura del sòl. El NLL ha experimentat un ràpid procés de domesticació durant el segle passat i encara està sota una alta pressió de reproducció3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Amb el cultiu generalitzat de NLL, la successió de fongs patògens va desenvolupar nous nínxols agrícoles i va causar noves malalties que destrueixen els cultius. El més remarcable per als agricultors i criadors de llobins va ser l'aparició d'antracnosi, causada pel fong patogen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. El més remarcable per als agricultors i criadors de llobins va ser l'aparició d'antracnosi, causada pel fong patogen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракнозав, патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. El més notable per als agricultors i criadors de llops va ser l'aparició d'antracnosi causada pel fong patogen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是现，它是由眗腏由真hum 豆的是炭目的是炭目现Nirenberg, Feiler i Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是现，它是玟眗Collethum (Bondar)嵵Haired。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракнозозакнозозонеров патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. El més sorprenent per als agricultors i criadors de llops és l'aparició d'antracnosi causada pel fong patogen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Els primers informes de la malaltia provenien del Brasil i els Estats Units, amb símptomes típics que van aparèixer el 1912 i el 1929 respectivament. Tanmateix, després d'uns 30 anys, el patogen va ser designat com a Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorfa Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfa Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf de Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld a Morfologia dirigida. & H. Schrenk,. i H. Schrenk,.i H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。i H. Schlenk.La fenotipificació preliminar de la malaltia realitzada a mitjans del segle XX va mostrar certa resistència en les accessions de NLL i de llopí groc (L. luteus L.), però totes les accessions de llopí blanc (L. albus L.) analitzades van ser altament susceptibles15,16. Els estudis han demostrat que el desenvolupament de l'antracnosi s'associa amb un augment de les precipitacions (humitat de l'aire) i la temperatura (en el rang de 12-28 °C), cosa que provoca una violació de la resistència a temperatures més altes17, 18. De fet, el temps necessari perquè les conídies germinessin i comencés la malaltia va ser quatre vegades més curt a 24 °C (4 hores) que a 12 °C (16 hores) en condicions d'alta humitat19. Així, l'escalfament global continu ha provocat la propagació de l'antracnosi. Tanmateix, la malaltia es va observar a França (1982) i Ucraïna (1983) com a presagi d'una amenaça imminent, però aparentment va ser ignorada per la indústria del llopí en aquell moment20,21. Uns anys més tard, aquesta devastadora malaltia es va estendre per tot el món i també va afectar els principals països productors de llopins com Austràlia, Polònia i Alemanya22,23,24. Després d'un brot d'antracnosi a mitjans de la dècada de 1990, un cribratge exhaustiu va permetre identificar diversos donants resistents en mostres NLL19. La resistència NLL a l'antracnosi està controlada per dos al·lels dominants separats que es troben en diferents fonts de germoplasma: Lanr1 en el cultivar Tanjil i Wonga i AnMan en el cultivar Mandalay25, 26. Aquests al·lels complementen els marcadors moleculars que donen suport a la selecció de germoplasma resistent en programes de millora25,26,27,28,29,30. La línia de reproducció resistent 83A:476 que portava l'al·lel Lanr1 es va creuar amb la línia salvatge susceptible P27255 per obtenir una població RIL segregada per a la resistència a l'antracnosi, cosa que va permetre assignar el locus Lanr1 al cromosoma NLL-1131, 32, 33. L'alineació dels marcadors del mapa d'enllaç des dels loci de resistència flanquejants fins a l'antracnosi amb un marc genòmic, NLL, va revelar la ubicació dels tres al·lels al mateix cromosoma (NLL-11), però en posicions diferents29,34,35. Tanmateix, a causa del petit nombre de RIL i la gran distància genètica entre els marcadors i els al·lels corresponents, no es poden extreure conclusions fiables sobre els seus gens subjacents. D'altra banda, l'ús de genètica inversa en llopins és difícil a causa del seu potencial de regeneració molt baix, cosa que fa que la manipulació genètica sigui feixuga37.
El desenvolupament de germoplasma domesticat que porta l'al·lel desitjat en estat homozigot, com ara 83A:476 (Lanr1) i Mandelup (AnMan), ha obert la porta a l'estudi de la resistència a l'antracnosi davant la presència de combinacions oposades d'al·lels en poblacions salvatges. Possibilitats de mecanismes moleculars. Comparar les respostes de defensa generades per genotips específics. Aquest estudi va avaluar la resposta del transcriptoma primerenc de NLL a la vacunació amb C. lupini. Primer, es va examinar un panell de germoplasma de NLL europeu que contenia 215 línies mitjançant marcadors moleculars que marquen els al·lels Lanr1 i AnMan. A continuació, es va realitzar la fenotipificació de l'antracnosi en 50 línies NLL, prèviament seleccionades per a marcadors moleculars, en condicions controlades. A partir d'aquests experiments, es van seleccionar quatre línies que difereixen en la resistència a l'antracnosi i la composició al·lèlica Lanr1/AnMan per a la perfilació de l'expressió gènica de defensa diferencial mitjançant dos enfocaments complementaris: la seqüenciació d'ARN d'alt rendiment i la quantificació per PCR en temps real.
El cribratge d'un conjunt de germoplasma NLL (N = 215) amb marcadors Lanr1 (Anseq3 i Anseq4) i AnMan (Anseq4) i AnMan (AnManM1) va mostrar que només una línia (95726, prop de Salamanca-b) amplifica l'al·lel de "resistència" per a tots els marcadors, mentre que "Presència d'al·lels 'susceptibles'" va trobar la proporció de tots els marcadors en 158 (~73,5%) línies. Tretze línies van produir dos al·lels "resistents" del marcador Lanr1, i 8 línies van produir al·lels "resistents" del marcador Lanr1. L'al·lel de "resistència" del marcador AnMan (Taula suplementària S1). Dues línies eren heterozigotes per al marcador Anseq3 i una heterozigota per al marcador AnManM1. 42 línies (19,5%) portaven fases oposades dels al·lels Anseq3 i Anseq4, cosa que indica una alta freqüència de recombinació entre aquests dos loci. Els fenotips d'antracnosi en condicions controlades (Taula suplementària S2) van revelar variabilitat en la resistència dels genotips provats, cosa que es va reflectir en la gravetat de l'antracnosi. Les diferències en les puntuacions mitjanes van oscil·lar entre 1,8 (moderadament resistent) i 6,9 (susceptible) i les diferències de pes de les plantes van oscil·lar entre 0,62 (susceptible) i 4,45 g (resistent). Hi va haver una correlació significativa entre els valors observats en dues rèpliques de l'experiment (0,51 per a les puntuacions de gravetat de la malaltia, P = 0,00017 i 0,61 per al pes de la planta, P < 0,0001), així com entre aquests dos paràmetres (−0,59 i −0,77, P < 0,0001). Hi va haver una correlació significativa entre els valors observats en dues rèpliques de l'experiment (0,51 per a les puntuacions de gravetat de la malaltia, P = 0,00017 i 0,61 per al pes de la planta, P < 0,0001), així com entre aquests dos paràmetres (−0,59 i −0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция экс1пах э0 баллов тяжести болезни, P = 0,00017 i 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между между эрамди эрами (-0,59 i -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Es va trobar una correlació significativa entre els valors observats en dues repeticions de l'experiment (0,51 per a les puntuacions de gravetat de la malaltia, P = 0,00017 i 0,61 per al pes de la planta, P < 0,0001), així com entre aquests dos paràmetres (-0,59 i -0,77, P < 0,0001) (0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分1︺0.51为0. 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77） 0,77） 1)在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 诸度 诸分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之（ 参数 之（ （ （ 9. 0,59 和– 0,59 和– 0,59 和- 0,77，P <0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух постениями (постениями) тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 i масса растения 0,61, P <0,0001), i между этими двуми двуме-0,5рами -0,0001) 0,77, P <0,0001. Hi va haver una correlació significativa entre els valors observats per duplicat (puntuació de gravetat de la malaltia 0,51, P = 0,00017 i pes de la planta 0,61, P < 0,0001) i entre aquests dos paràmetres (-0,59 i -0,0001) 0,77, P < 0,0001. ).Els símptomes típics que s'observen en plantes susceptibles inclouen torçades i encorbaments de la tija que semblen una estructura d'"arc de pastor", seguits de lesions ovalades amb esporozoïts de color taronja/rosa (figura suplementària 1). Les accessions australianes que porten els gens Lanr1 (83A:476 i Tanjil) i AnMan (Mandelup) són moderadament resistents, 0,0331 i 0,0036). Algunes línies que també porten al·lels "resistents" Lanr1 i/o AnMan mostren símptomes de la malaltia.
Curiosament, algunes línies NLL que no tenien cap al·lel marcador "resistent" van revelar un alt nivell de resistència a l'antracnosi (comparable o superior al dels genotips Lanr1 o AnMan), com ara Boregine (valor P < 0,0001 per a ambdós paràmetres), Bojar (valor P < 0,0001 per a la puntuació i 0,001 per al pes de la planta) i la Població B-549/79b (valor P < 0,0001 per a la puntuació i no significatiu per al pes). Curiosament, algunes línies NLL que no tenien cap al·lel marcador "resistent" van revelar un alt nivell de resistència a l'antracnosi (comparable o superior al dels genotips Lanr1 o AnMan), com ara Boregine (valor P < 0,0001 per a ambdós paràmetres), Bojar (valor P < 0,0001 per a la puntuació i 0,001 per al pes de la planta) i la Població B-549/79b (valor P < 0,0001 per a la puntuació i no significatiu per al pes). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллокавы аллокавы золесно, уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 илаи или более высокий, чем для генотипов Lanr1 илаи кинх ила (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P <0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) i популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Curiosament, diverses línies NLL que no tenien cap al·lel marcador "resistent" van mostrar un alt nivell de resistència a l'antracnosi (comparable o superior al dels genotips Lanr1 o AnMan), com ara Boregine (valor P < 0,0001 per a ambdós paràmetres), Bojar (valor P < 0,0001 per a l'avaluació i 0,001 per al pes de la planta) i la població B-549/79b (valor P < 0,0001 per a l'avaluació i no significatiu per al pes).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭水平的炭等位基因的NLL或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值<0,0001）、Bojar（P 值<得分为0,0001，植物重量为0,001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重显睂怍量睂 És interessant que alguns sistemes NLL que no tenen cap marcador "antigènic" mostrin una alta resistència horitzontal (equivalent als gens Lanr1 o AnMan o superior), com ara Boregine (ambdós paràmetres P < 0,0001), Bojar (valor P < 0,0001, pes de la planta 0,001) i la soca B-549/79b (valor P < 0,0001, pes no significatiu). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентноста», споликава уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие какие кака чдлеше Boregine обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) i популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Curiosament, algunes línies NLL que no tenien cap al·lel marcador de "resistència" van mostrar alts nivells de resistència a l'antracnosi (comparables o superiors als genotips Lanr1 o AnMan), com ara Boregine (valor P per a ambdós paràmetres <0,0001), Bojar (valor P <0,0001, pes de la planta 0,001) i la població B-549/79b (valor P <0,0001, pes no significatiu).Aquest fenomen suggereix la possibilitat d'una nova font genètica de resistència, cosa que explica la manca de correlació observada entre els genotips marcadors i els fenotips de la malaltia (valors P de ~0,42 a ~0,98). Així, la prova de Kolmogorov-Smirnov va mostrar que les dades sobre la resistència a l'antracnosi tenien una distribució aproximadament normal per a les puntuacions (valors P 0,25 i 0,11) i la massa vegetal (valors P 0,47 i 0,55), cosa que suggereix que formulo la hipòtesi que hi ha més al·lels implicats que Lanr1 i AnMan.
A partir dels resultats del cribratge de resistència a l'antracnosi, es van seleccionar 4 línies per a l'anàlisi del transcriptoma: 83A:476, Boregine, Mandelup i Població 22660. Aquestes línies es van tornar a provar per a la resistència a l'antrax en experiments d'inoculació mitjançant seqüenciació d'ARN, sempre que fossin les mateixes que en la prova anterior. Els valors de puntuació van ser els següents: Boregine (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) i població 22660 (6,11 ± 1,29).
El protocol Illumina NovaSeq 6000 va aconseguir una mitjana de 40,5 parells de Mread per mostra (29,7 a 54,4 Mreads) (Taula suplementària S3). Les puntuacions d'alineació a la seqüència de referència van oscil·lar entre el 75,5% i el 88,6%. La correlació mitjana de les dades del recompte de lectures entre variants experimentals entre rèpliques biològiques va oscil·lar entre 0,812 i 0,997 (mitjana 0,959). Dels 35.170 gens analitzats, 2917 no van revelar cap expressió i els altres 4785 gens es van expressar a un nivell insignificant (mitjana base < 5). Dels 35.170 gens analitzats, 2917 no van revelar cap expressió i els altres 4785 gens es van expressar a un nivell insignificant (mitjana base < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов слсинов экспрессии незначительном уровне (базовое среднее <5). Dels 35.170 gens analitzats, 2917 no van mostrar cap expressió i els 4785 gens restants es van expressar a un nivell insignificant (mitjana base <5).在分析的35.170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35.170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 геннов имелинов имелись экспрессию (базовое среднее значение <5). Dels 35.170 gens analitzats, 2917 no s'expressaven i els 4785 gens restants tenien una expressió insignificant (mitjana base <5).Així, el nombre de gens considerats expressats (mitjana base ≥ 5) durant l'experiment va ser de 27.468 (78,1%) (Taula suplementària S4).
Des del primer punt de temps, totes les línies NLL van respondre a la inoculació de C. lupini (soca Col-08) reprogramant el transcriptoma (Taula 1), però es van observar diferències significatives entre les línies. Així, la línia de resistència 83A:476 (portadora del gen Lanr1) va mostrar una reprogramació significativa del transcriptoma en el primer punt de temps (6 hpi) amb un augment de 31-69 vegades en el nombre de gens ascendents i descendents aïllats en comparació amb altres punts de temps en aquest punt de temps. A més, aquest pic va ser de curta durada, ja que l'expressió de només uns quants gens va romandre significativament alterada en el segon punt de temps (12 hpi). Curiosament, Boregine, que també va mostrar un alt nivell de resistència a la prova d'empelt, no va experimentar una reprogramació transcripcional tan massiva durant l'experiment. Tanmateix, el nombre de gens amb expressió diferencial (DEG) va ser el mateix per a Boregine i 83A:476 a les 12 HPI. Tant Mandelup com la població 22660 van mostrar pics de DEG en l'últim punt de temps (48 l/s), cosa que indica un retard relatiu en les respostes de defensa.
Com que 83A:476 va experimentar una reprogramació transcriptoma massiva en resposta a C. lupini a 6 HPI en comparació amb totes les altres línies, ~91% dels DEG observats en aquest moment eren específics del llinatge (Fig. 1). Tanmateix, hi va haver certa superposició en les respostes inicials entre les línies d'estudi, ja que el 68,5%, 50,9% i 52,6% de DEG a Boregine, Mandelup i la població 22660, respectivament, es van superposar amb els trobats a 83A:476 en certs moments. Tanmateix, aquests DEG només representaven una petita fracció (0,97–1,70%) de tots els DEG detectats actualment mitjançant 83A:476. A més, 11 DEG de totes les línies eren coherents en aquest moment (Taules suplementàries S4-S6), incloent-hi components comuns de les respostes de defensa de les plantes: proteïna de transferència de lípids (TanjilG_32225), enzim endoglucà-1,3-β-glucòsid (TanjilG_23384), dues proteïnes induïbles per estrès com SAM22 (TanjilG_31528 i TanjilG_31531), proteïna bàsica de làtex (TanjilG_32352) i dues proteïnes estructurals de la paret cel·lular riques en glicina (TanjilG_19701 i TanjilG_19702). També hi va haver una superposició relativament alta en les respostes del transcriptoma entre 83A:476 i Boregine a 24 HPI (total 16-38% DEG) i entre Mandelup i Població 22660 a 48 HPI (total 14-20% DEG).
Diagrama de Venn que mostra el nombre de gens amb expressió diferencial (DEG) en línies de llopins de fulla estreta (NLL) inoculades amb Colletotrichum lupini (soca Col-08 obtinguda de camps de llopins a Wierzhenice, Polònia, 1999). Les línies NLL analitzades van ser: 83A:476 (resistent, portadora de l'al·lel Lanr1), Boregine (resistent, fons genètic desconegut), Mandelup (moderadament resistent, portadora de l'al·lel AnMan) i la població 22660 (molt susceptible). L'abreviatura hpi significa hores després de la vacunació. S'han eliminat els valors zero per simplificar el gràfic.
El conjunt de gens sobreexpressats a 6 hpi es va analitzar per detectar la presència de dominis canònics del gen R (Taula suplementària S7). Aquest estudi va revelar la inducció del transcriptoma de gens de resistència a malalties clàssiques amb dominis NBS-LRR només a 83A:476. Aquest conjunt constava d'un gen TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), cinc gens CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 i tanjilg_16162), i quatre NBS-LR, Tanjilg_16162), i quatre NBS-LRRE (tanjilg_16162), així com quatre NBS-Lrr (tanjilg_16162) i quatre NBS-LRR (TANJILG_16162). Tots aquests gens tenen dominis canònics disposats en seqüències conservades. A més dels gens del domini NBS-LRR, es van activar diverses cinases RLL a les 6 hpi, concretament una a Boregine (TanjilG_19877), dues a Mandelup (TanjilG_07141 i TanjilG_19877) i a la població 22660 (TanjilG_09014 i TanjilG_10361) i dues a 83A 27:476.
Els gens amb una expressió significativament alterada en resposta a la inoculació amb C. lupini (soca Col-08) van ser sotmesos a una anàlisi d'enriquiment de Gene Ontology (GO) (Taula suplementària S8). El terme de procés biològic sobrerepresentat amb més freqüència va ser "GO:0006952 defense response", que va aparèixer en 6 de les 16 combinacions (temps × línia) amb alta significació (valor P < 0,001) (Fig. 2). El terme de procés biològic sobrerepresentat amb més freqüència va ser "GO:0006952 defense response", que va aparèixer en 6 de les 16 combinacions (temps × línia) amb alta significació (valor P < 0,001) (Fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 тетнащого процесса который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значимостью (значимостью) (значение P <0). El terme de procés biològic sobrerepresentat amb més freqüència va ser la "resposta de defensa GO:0006952", que va aparèixer en 6 de 16 combinacions (temps × llinatge) amb alta significació (valor P < 0,001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 El terme de procés biològic més representatiu és "GO:0006952 defense response", que apareix en 6 de les 16 combinacions (时间×线), amb una significació alta (valor P < 0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defensa», появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис.2). El terme de procés biològic sobrerepresentat amb més freqüència va ser "GO:0006952 Defense Response", que va aparèixer en 6 de les 16 combinacions (temps × línia) amb una alta significació (valor P < 0,001) (Fig. 2).Aquest terme es va sobrerepresentar en dos moments a 83A: 476 i Boregine (6 i 24 hpi) i en un moment a Mandelup i Població 22660 (12 i 6 hpi, respectivament). Aquest és un resultat esperat, que destaca la resposta antifúngica de les línies resistents. A més, 83A:476 va respondre a C. lupini induint ràpidament gens relacionats amb l'esclat oxidatiu representat pel terme "GO:0055114 procés redox", cosa que indica una resposta de defensa específica, mentre que Boregine va revelar respostes de defensa específiques, relacionades amb el terme 'GO'. :0006950 Resposta a l'estrès”. La població 22660 va activar la resposta de resistència horitzontal que implica metabòlits secundaris, destacant el nombre excessiu de termes “GO:0016104 Procés de biosíntesi de triterpens” i “GO:0006722 Procés de metabolisme de triterpens” (ambdós termes pertanyen al mateix conjunt de gens), tenint en compte els resultats de l'anàlisi d'enriquiment de termes GO, l'estabilitat de la reacció de Mandelup es va situar entre Boregine i la població 22660. A més, la reacció primerenca 83A:476 (6 hpi) i la reacció retardada de Mandelup i la població 22660 inclouen el terme GO:0015979 'fotosíntesi' i altres processos biològics relacionats.
Els termes d'ontologia gènica del bioprocess seleccionats en l'anotació de gens expressats diferencialment durant les respostes del transcriptoma del llopí de fulla estreta (NLL) inoculat amb llopí amb àntrax (soca Col-08 obtinguda de camps de llopins a Wierzhenice, Polònia, el 1999) estan molt exagerats. Les línies NLL analitzades van ser: 83A:476 (resistent, portadora de l'al·lel Lanr1 homozigot), Boregine (resistent, fons genètic desconegut), Mandelup (moderadament resistent, portadora de l'al·lel AnMan homozigot) i la població 22660 (susceptible).
Com que aquest estudi tenia com a objectiu identificar gens que contribueixen a la resistència a l'antracnosi, els gens assignats als termes GO "GO: 0006952 Defensive responses" i "GO: 0055114 Redox processes" es van analitzar amb valors de tall, ja que les mitjanes basals eren ≥ 30 amb almenys una línia × punt en el temps combinant valors estadísticament significatius de log2 (canvi de plegament). El nombre de gens que complien aquests criteris va ser 65 per a GO:0006952 i 524 per a GO:0055114.
83A:476 va revelar dos pics DEG anotats amb el terme GO:0006952, el primer a 6 gens per polzada (64 gens, regulació ascendent i descendent) i el segon a 24 gens per polzada (15 gens, només regulació ascendent). Boregine també va mostrar que GO:0006952 va assolir el seu pic en el mateix punt temporal, però amb menys DEG (11 i 8) i activació preferencial. Mandeloop va mostrar dos pics de GO:0006952 a 12 i 48 HPI, tots dos portadors de 12 gens (el primer amb gens activadors i el segon només amb gens supressors), mentre que la població 22660 a 6 HPI (13 gens) tenia un major predomini de la regulació del pic d'augment. Cal destacar que el 96,4% dels DEG GO:0006952 en aquests pics tenien el mateix tipus de resposta (amunt o avall), cosa que indica una superposició significativa en les respostes de defensa malgrat les diferències en el nombre de gens implicats. El grup més gran de seqüències relacionades amb el terme GO:0006952 codifica la proteïna Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-like), que pertany al clade de proteïnes PR-10 (proteïna associada a la patogènesi de classe 10) i a la proteïna central làtex (proteïna similar (MLP-like)) (Fig. 3). Els dos grups difereixen en la naturalesa de l'expressió i la direcció de la resposta. Els gens que codifiquen les proteïnes SAM22 van mostrar una inducció consistent i significativa en punts de temps inicials (6 o 12 hpi) i generalment no responien al final de l'experiment (48 hpi), mentre que les proteïnes MLP van mostrar coordinació a les 6 hpi. hpi. 83A:476 i Mandelup a 48 hp/in, gairebé tots els altres punts de dades no responien. A més, les diferències en els perfils d'expressió dels gens de les proteïnes SAM22 van seguir la variabilitat observada en la resistència a l'antracnosi, ja que les línies més resistents van tenir més punts de temps que van induir significativament aquests gens que els gens més susceptibles. Un altre gen PR-10 similar a LlR18A/B va mostrar un patró d'expressió molt similar al gen de la proteïna similar a SAM22.
Es van identificar els components principals del terme del procés biològic "GO:0006952 Defense Response" i els patrons d'expressió dels gens candidats dels al·lels Lanr1 i AnMan. L'escala Log2 representa els valors de log2 (canvi de plec) entre les plantes inoculades (Colletotrichum lupini, soca Col-08, obtinguda de camps de llobins, Wizhenica, Polònia, 1999) i les plantes de control (inoculades de manera simulada) al mateix moment. Es van analitzar les següents línies de llobins de fulla estreta: 83A:476 (resistent, portadora de l'al·lel homozigot Lanr1), Boregine (resistent, fons genètic desconegut), Mandelup (moderadament resistent, portadora de l'al·lel homozigot AnMan) i la Població 22660 (susceptible).
A més, es van avaluar els perfils d'expressió dels gens candidats a RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) i AnMan (TanjilG_12861) (Fig. 3). El gen TanjilG_05042 va mostrar una resposta significativa (activació) a 83A:476 només en el primer punt de temps (6 hpi), mentre que TanjilG_12861 va ser significatiu a Mandeloop només en dos punts de temps: 6 hpi (regulació a la baixa) i 24 hpi (6 hpi). Amb.). ajustable) ).
Els gens més sobreexpressats en el terme GO:0055114 "procés redox" van ser els gens que codifiquen proteïnes del citocrom P450 i la peroxidasa (Fig. 4). Per a mostres aïllades de 83A:476 a 6 HPI, els valors màxims o mínims de log2 (canvi de plec) (per al 86,6% dels gens) es van observar generalment entre les plantes inoculades i les de control, destacant l'alta resposta d'aquest genotip al sexe inoculant. 83A:476 va mostrar el DEG GO:0055114 més significatiu a 6 hpi (503 gens), mentre que la resta de línies a 48 hpi (Boregine, 31 gens; Mandelup, 85 gens; i Població 22660, 78 gens)). En la majoria dels gens de la família GO:0055114, es van observar dos tipus de respostes a la vacunació (activació i inhibició). Curiosament, fins a un 97,6% dels DEG identificats per al terme GO: 0055114 a Mandelupe a 48 hp. Aquestes observacions suggereixen que, malgrat l'escala significativament més petita (és a dir, el nombre de gens redox mutats, 85 versus 503), el patró de respostes del transcriptoma retardades de mandeloup a l'antracnosi és similar a la resposta primerenca de 83A:476. A Boregine i Població 22660, aquesta convergència és menor, del 51,6% i el 75,6%, respectivament.
Es van revelar els patrons d'expressió dels components principals del terme del procés biològic "GO:0055114 Procés redox". L'escala Log2 representa els valors de log2 (canvi de plec) entre plantes inoculades (Colletotrichum lupini, soca Col-08, obtinguda de camps de llobins, Wizhenica, Polònia, 1999) i plantes de control (inoculades de manera simulada) al mateix punt temporal. Es van analitzar les següents línies de llobins de fulla estreta: 83A:476 (resistent, portadora de l'al·lel homozigot Lanr1), Boregine (resistent, fons genètic desconegut), Mandelup (moderadament resistent, portadora de l'al·lel homozigot AnMan) i Població 22660 (susceptible).
83A:476 Les respostes transcriptòmiques a la inoculació amb C. lupini (soca Col-08) també van incloure el silenciament coordinat de gens atribuïts al terme GO:0015979 "fotosíntesi" i altres processos biològics relacionats (FIG. 5). Aquest conjunt de DEG GO:0015979 contenia 105 gens que van ser reprimits significativament a 6 hpi a 83A:476. En aquest subconjunt, 37 gens també van ser regulats a la baixa a Mandelup a 48 HPI i 35 al mateix punt temporal a la població 22660, incloent-hi 19 DEG comuns a tots dos genotips. Cap DEG relacionat amb el terme GO:0015979 es va activar significativament en cap combinació (línia x temps).
Es van revelar els patrons d'expressió dels components principals del terme del procés biològic "GO:0015979 Fotosíntesi". L'escala Log2 representa els valors de log2 (canvi de plec) entre plantes inoculades (Colletotrichum lupini, soca Col-08, obtinguda de camps de llops, Wizhenica, Polònia, 1999) i plantes de control (inoculades de manera simulada) al mateix punt temporal. Es van analitzar les següents línies de llops de fulla estreta: 83A:476 (resistent, portadora de l'al·lel homozigot Lanr1), Boregine (resistent, fons genètic desconegut), Mandelup (moderadament resistent, portadora de l'al·lel homozigot AnMan) i Població 22660 (susceptible).
Basant-se en els resultats de l'anàlisi d'expressió diferencial i presumiblement implicats en respostes de defensa contra fongs patògens, aquest conjunt de set gens es va seleccionar per a la quantificació dels perfils d'expressió mitjançant PCR en temps real (Taula suplementària S9).
El gen putatiu de la proteïna TanjilG_10657 es va induir significativament en totes les línies i punts de temps estudiats en comparació amb les plantes de control (imitadores) (Taules suplementàries S10, S11). A més, el perfil d'expressió de TanjilG_10657 va mostrar una tendència creixent al llarg de l'experiment per a totes les línies. La població 22660 va mostrar la sensibilitat més alta de TanjilG_10657 a la inoculació amb una activació de 114 vegades i el nivell d'expressió relativa més alt (4,4 ± 0,4) a 24 HPI (Fig. 6a). El gen de la proteïna PR10 LlR18A TanjilG_27015 també va mostrar activació en totes les línies i punts de temps, amb significació estadística a la majoria dels punts de dades (Fig. 6b). De manera similar a TanjilG_10657, el nivell d'expressió relativa més alt de TanjilG_27015 es va observar a la població inoculada 22660 a 24 HPI (19,5 ± 2,4). El gen de l'endoquitinasa àcida TanjilG_04706 va estar significativament sobreexpressat en totes les línies i en tots els punts temporals excepte per a Boregine 6 hpi (Fig. 6c). Es va induir fortament en el primer punt temporal (6 HPI) a 83A:476 (en 10,5 vegades) i va augmentar moderadament en altres línies (en 6,6-7,5 vegades). Durant l'experiment, l'expressió de TanjilG_04706 es va mantenir a nivells similars a 83A:476 i Boregine, mentre que a Mandelup i Població 22660 va augmentar significativament, assolint valors relativament alts (5,9 ± 1,5 i 6,2 ± 1,5, respectivament). El gen similar a l'endoglucà-1,3-β-glucosidasa TanjilG_23384 va mostrar una alta activació en els dos primers punts temporals (6 i 12 hpi) en totes les línies excepte la població 22660 (Fig. 6d). Els nivells d'expressió relativa més alts de TanjilG_23384 es van observar en el segon punt de temps (12 hpi) a Mandelup (2,7 ± 0,3) i 83A:476 (1,5 ± 0,1). Als 24 HPI, l'expressió de TanjilG_23384 va ser relativament baixa en totes les línies estudiades (de 0,04 ± 0,009 a 0,44 ± 0,12).
Perfils d'expressió de gens seleccionats (ag) revelats per PCR quantitativa. Els números 6, 12 i 24 representen les hores posteriors a la vacunació. Els gens LanDExH7 i LanTUB6 es van utilitzar per a la normalització i LanTUB6 es va utilitzar per a la calibració entre sèries. Les barres d'error representen la desviació estàndard basada en tres rèpliques biològiques, cadascuna de les quals és la mitjana de tres rèpliques tècniques. La significació estadística de les diferències en els nivells d'expressió entre les plantes inoculades (Colletotrichum lupini, soca Col-08, obtinguda el 1999 del camp de llopins a Wierzenica, Polònia) i les plantes de control (inoculades amb simulació) es marca a sobre dels punts de dades (*valor P < 0,05, **valor P ≤ 0,01, ***valor P ≤ 0,001). La significació estadística de les diferències en els nivells d'expressió entre les plantes inoculades (Colletotrichum lupini, soca Col-08, obtinguda el 1999 del camp de llopins a Wierzenica, Polònia) i les plantes de control (inoculades amb simulació) es marca a sobre dels punts de dades (*valor P < 0,05, **valor P ≤ 0,01, ***valor P ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, м Статистическая) получен в 1999 г. с поля люпина в Верженице, Польша) i контрольными (ложно инокулимиров) отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Es mostren diferències estadísticament significatives en els nivells d'expressió entre les plantes inoculades (Colletotrichum lupini, soca Col-08, obtinguda el 1999 d'un camp de llobins a Wierzhenice, Polònia) i les plantes de control (inoculades de manera simulada) per sobre dels punts de dades (*valor P < 0,05, **valor P ≤ 0,01, ***valor P ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数渍在数渍在数水平差异的统计学显着性标记在敹乼渍在数渍0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照秉 波兰 ）水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。0,001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, м ш08 полученный с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) i контрольными (ложно ино инокаулиро инокаул отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Es mostren diferències estadísticament significatives en els nivells d'expressió entre les plantes inoculades (Colletotrichum lupini, soca Col-08, obtinguda de camps de llopins a Verzhenice, Polònia, el 1999) i les plantes de control (inoculades de manera simulada) per sobre dels punts de dades (*valor P < 0,05, **valor P ≤ 0,01, ***valor P ≤ 0,001).Les línies NLL analitzades van ser: 83A:476 (resistent, portadora de l'al·lel homozigot Lanr1), Mandelup (moderadament resistent, portadora de l'al·lel homozigot AnMan), Boregine (resistent, fons genètic desconegut) i la població 22660 (susceptible).
El gen candidat TanjilG_05042 al locus Lanr1 va mostrar un patró d'expressió marcadament diferent dels perfils obtinguts a partir d'estudis de RNA-seq (Fig. 6e). Es va observar una activació significativa d'aquest gen a Mandelup i a la població 22660 (fins a 39,7 i 11,7 vegades, respectivament), donant lloc a nivells d'expressió relativament alts (fins a 1,4 ± 0,14 i 7,2 ± 1,3, respectivament). 83A:476 també va revelar una certa regulació a l'alça del gen TanjilG_05042 (fins a 3,8 vegades), però els nivells d'expressió relatius assolits (0,044 ± 0,002) van ser més de 30 vegades inferiors als observats a Mandelup i a la població 22660. Les proves analitzades per qPCR van mostrar diferències significatives en els nivells d'expressió entre genotips en variants vacunades amb simulació (control), arribant a una diferència de 58 vegades entre les poblacions 22660 i 83A:476, així com entre les poblacions 22660 i 22660. Es va aconseguir una diferència doble entre Boregine i Mandalup.
El gen candidat al locus AnMan, TanjilG_12861, es va activar en resposta a la vacunació en 83A:476 i Mandelup, va ser neutre a la població 22660 i es va regular a la baixa en Boregine (Fig. 6f). L'expressió relativa del gen TanjilG_12861 va ser la més alta en 83A:476 inoculat (0,14 ± 0,01). El gen de la proteïna de xoc tèrmic de classe I de 17,4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 va mostrar nivells d'expressió relativa més baixos en totes les soques i punts de temps estudiats (Fig. 6g). El valor més alt es va observar a 24 HPI a la població 22660 (0,14 ± 0,02, un augment de vuit vegades en la resposta a la vacunació).
La comparació dels perfils d'expressió gènica (Fig. 7) va revelar una alta correlació entre TanjilG_10657 i quatre altres gens: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) i TanjilG_04706 (r = 0,79). Aquests resultats poden indicar una coregulació d'aquests gens durant les respostes de defensa. Els gens TanjilG_12861 i TanjilG_23384 van mostrar perfils d'expressió diferents amb valors de coeficient de correlació de Pearson més baixos (de 0,08 a 0,43 i de -0,19 a 0,28, respectivament) en comparació amb altres gens.
Les correlacions entre els perfils d'expressió gènica es van detectar mitjançant PCR quantitativa. Es van analitzar les següents línies de llopins de fulla estreta: 83A:476 (resistent, portadora de l'al·lel homozigot Lanr1), Mandelup (moderadament resistent, portadora de l'al·lel homozigot AnMan), Boregine (resistent, fons genètic desconegut) i Població 22660 (susceptible). Es van calcular tres punts de temps (6, 12 i 24 hores després de la inoculació), incloent-hi plantes inoculades (Colletotrichum lupini, soca Col-08, obtinguda de camps de llopins a Wierzhenice, Polònia, el 1999) i plantes de control (inoculades de manera simulada). L'escala mostra el valor del coeficient de correlació de Pearson.
A partir de les dades obtingudes a 6 cavalls de força per polzada, es va realitzar un WGCNA en 9981 DEG identificats comparant plantes inoculades i de control per centrar-se en les respostes de defensa primerenques (Taula suplementària S12). Es van trobar vint-i-dos mòduls gènics (clústers) amb perfils d'expressió correlacionats (positius o negatius) entre genotips i variants experimentals. De mitjana, els nivells d'expressió gènica anaven descendent en ordre 83A:476 > Mandelup > Boregine > Població 22660 (en ambdues variants, però, aquesta tendència va ser més forta en les plantes de control). De mitjana, els nivells d'expressió gènica anaven descendent en ordre 83A:476 > Mandelup > Boregine > Població 22660 (en ambdues variants, però, aquesta tendència va ser més forta en les plantes de control). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Població 22660 (в обоих, ндатах, ндав эта тенденция была сильнее у контрольных растений). De mitjana, els nivells d'expressió gènica van disminuir en l'ordre 83A:476 > Mandelup > Boregine > Població 22660 (en ambdues variants, però, aquesta tendència va ser més forta en les plantes de control).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Població 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> població 22660 的 顺序 下降 （， ， 在 翭 在在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。... В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Població 22660 тенденция была сильнее у контрольных растений). De mitjana, els nivells d'expressió gènica van disminuir a la sèrie 83A:476 > Mandelup > Boregine > Població 22660 (tanmateix, en ambdues variants, aquesta tendència va ser més forta en les plantes de control).La vacunació va provocar una regulació a l'alça de l'expressió gènica, especialment en els mòduls 18, 19, 14, 6 i 1 (en ordre descendent d'efecte), regulació negativa (per exemple, mòduls 9 i 20) o amb efectes neutres (per exemple, mòduls 11, 22, 8 i 13). L'anàlisi d'enriquiment del terme GO (Taula suplementària S13) va revelar "GO: 0006952 Protective responses" per al mòdul inoculat (18) amb activació màxima, incloent-hi els gens analitzats per qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 i TanjilG_27015), així com molts mòduls de fotosíntesi més suprimits (9). El concentrador del mòdul 18 (Fig. 8) es va identificar com el gen TanjilG_26536 que codifica la proteïna LlR18B de tipus PR-10, i el concentrador del mòdul 9 es va identificar com el gen TanjilG_28955 que codifica la proteïna PsbQ del fotosistema II. Un gen candidat de resistència a l'antracnosi Lanr1, TanjilG_05042, es va trobar al mòdul 22 (Fig. 9) i està associat amb els termes "GO:0044260 Cellular macromolecular metabolic processes" i "GO:0006355 Transcriptional regulation, DNA templating" que porten el centre TanjilG_01212. El gen codifica el factor de transcripció d'estrès tèrmic A-4a (HSFA4a).
Anàlisi de xarxa ponderada de la coexpressió gènica de mòduls amb termes de processos biològics sobrerepresentats "GO: 0006952 Respostes de defensa". La lligadura es va simplificar per ressaltar els quatre gens analitzats per qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 i TanjilG_27015).
Anàlisi de xarxa ponderada de la coexpressió gènica d'un mòdul amb un terme de procés biològic sobrerepresentat "GO: 0006355: Regulació transcripcional, plantilla d'ADN" i que porta un gen candidat de resistència a l'antracnosi Lanr1 TanjilG_05042. La lligadura es va simplificar per aïllar el gen TanjilG_05042 i el gen central TanjilG_01212.
Les proves de resistència a l'antracnosi recollides a Austràlia van mostrar que la majoria dels cultivars alliberats primerencs eren susceptibles; Kalya, Coromup i Mandelup s'han descrit com a moderadament resistents, mentre que Wonga, Tanjil i 83A:476 s'han descrit com a altament resistents26,27,31. tenien el mateix al·lel de resistència, designat Lanr1, i Coromup i Mandelup tenien un al·lel diferent, designat AnMan10, 26, 39, mentre que Kalya va passar un al·lel diferent, Lanr2. La detecció de la resistència a l'antracnosi a Alemanya va permetre identificar una línia resistent Bo7212 amb un al·lel candidat diferent de Lanr1, designat LanrBo36.
El nostre estudi va revelar una freqüència molt baixa (al voltant del 6%) de l'al·lel Lanr1 en el germoplasma provat. Aquesta observació és coherent amb els resultats de la selecció de germoplasma de l'Europa de l'Est utilitzant els marcadors Anseq3 i Anseq4, que van mostrar que l'al·lel Lanr1 només és present en dues línies bielorusses. Això suggereix que l'al·lel Lanr1 encara no és àmpliament utilitzat pels programes de millora locals, a diferència d'Austràlia, on és un dels al·lels clau per a la millora assistida per marcadors. Això pot ser degut al menor nivell de resistència proporcionat per l'al·lel Lanr1 en condicions de camp europeu en comparació amb l'informe australià. A més, estudis d'antracnosi en zones de pluges elevades a Austràlia han demostrat que les respostes de resistència mediades per l'al·lel Lanr1 poden no ser efectives en condicions meteorològiques que afavoreixen el creixement i el ràpid desenvolupament del patogen19,42. De fet, en el present estudi, també es van observar alguns símptomes d'antracnosi en genotips que porten l'al·lel Lanr1, cosa que suggereix que la resistència pot desaparèixer en condicions òptimes per al desenvolupament de C. lupini. A més, són possibles interpretacions falsos positives de la presència dels marcadors Anseq3 i Anseq4, que es troben aproximadament a 1 cM del locus Lanr1 28, 30, 43.
El nostre estudi va mostrar que 83A:476, portador de l'al·lel Lanr1, va respondre a la inoculació de C. lupini amb una reprogramació del transcriptoma a gran escala en el primer punt de temps analitzat (6 hpi), mentre que a Mandelup, portador de l'al·lel AnMan, les respostes transcriptòmiques es van observar molt més tard (de 24 a 48 hp). Aquestes variacions temporals en les respostes de defensa s'associen amb diferències en els símptomes de la malaltia, cosa que destaca la importància del reconeixement precoç dels patògens per a una resposta reeixida a la resistència. Per infectar el teixit vegetal, les espores d'àntrax han de passar per diverses etapes de desenvolupament a la superfície de l'hoste, incloent-hi la germinació, la divisió cel·lular i la formació d'un apressori. Un apèndix és una estructura infectiva que s'adhereix a la superfície de l'hoste i facilita la penetració als teixits de l'hoste. Així, les espores de C. gloeosporioides en extracte de pèsol van mostrar la primera divisió del nucli després de 75-90 minuts d'incubació, la formació d'un tub germinatiu després de 90-120 minuts i la supressió després de 4 hores. El mango C. gloeosporioides va mostrar una germinació conidial de més del 40% després de 3 hores d'incubació i aproximadament un 20% de formació d'apressors després de 4 hores. El gen CAP20 associat a la virulència de C. gloeosporioides va mostrar activitat transcripcional en conídies formadores d'epífits després de 3,5 h d'incubació en cera superficial d'alvocat amb altes concentracions de proteïna CAP20 després de 4 h 46 min. De la mateixa manera, l'activitat dels gens de biosíntesi de melanina en C. trifolii es va induir durant una incubació de 2 hores seguida de la formació d'un apressori després d'1 hora. Estudis de teixits foliars han demostrat que les maduixes inoculades amb C. acutatum tenen una primera supressió a les 8 hpi, mentre que els tomàquets inoculats amb C. coccodes tenen una primera supressió a les 4 hpi48,49. En gran part consistent amb l'escala de temps del procés infecciós de Colletotrichum spp. Les respostes de defensa ràpides a 83A:476 suggereixen la implicació de gens de resistència vegetal i immunitat desencadenada per efectors (ETI) en aquesta línia, mentre que les respostes retardades de Mandelup donen suport a la hipòtesi de la immunitat desencadenada per patrons moleculars microassociats (MTI) 50. Respostes primerenques a 83A: 476 i Mandelup. La superposició parcial entre gens regulats a l'alça o a la baixa en la resposta retardada també dóna suport a aquest concepte, ja que sovint es considera que l'ETI és una resposta MTI accelerada i millorada que culmina en la mort cel·lular programada al lloc de la infecció, coneguda com a xoc anafilàctic 51,52.
La majoria dels gens atribuïts al terme sobrerepresentat Gene Ontology GO:0006952 "Resposta de Defensa" són els 11 homòlegs de la proteïna 22 del missatge de dejuni induït per l'estrès (similar a SAM22) i les set principals proteïnes similars a proteïnes del làtex (MLP). Les proteïnes similars a 31, 34, 43 i 423 van mostrar similitud de seqüència. Els gens similars a SAM22 van mostrar una activació significativa que va durar més, mostrant nivells augmentats de resistència a l'antracnosi (83A:476 i Boregine). Tanmateix, els gens similars a MLP només es van regular a la baixa en línies que portaven l'al·lel de resistència candidat (83A:476/Lanr1 a les 6 hpi i Mandelup/AnMan a les 24 hpi). Cal destacar que tots els homòlegs similars a SAM22 identificats provenen d'un clúster de gens que abasta aproximadament 105 kb, mentre que els gens similars a MLP provenen de regions separades del genoma. L'activació coordinada d'aquests gens similars a SAM22 també es va trobar en el nostre estudi previ de la resistència a les NLL a la inoculació de Diaporthetoxica, cosa que suggereix que estan implicats en els components horitzontals de la resposta de defensa. Aquesta conclusió també està recolzada per informes d'una resposta positiva dels gens similars a SAM22 a lesions o tractament amb àcid salicílic, inductors de fongs o peròxid d'hidrogen.
S'ha demostrat que els gens similars a les MLP responen a diversos estressos abiòtics i biòtics, incloent-hi infeccions bacterianes, virals i fúngiques patògenes en moltes espècies de plantes55. Les direccions de resposta a certes interaccions entre plantes i patògens van variar des d'un fort augment (és a dir, durant la infestació del cotó amb Verticillium dahliae) fins a una disminució significativa (és a dir, després de la infecció de la pomera amb Alternaria spp.)56,57. S'ha observat una regulació a la baixa significativa del gen 423 similar a les MLP durant les defenses de l'alvocat contra la infecció per F. niger i durant la infecció de la pomera Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola i Alternaria alternata són patotips de la poma58,59. A més, els calls de la poma que sobreexpressen el gen 423 similar a les MLP tenien una menor expressió de gens associats a la resistència i eren més susceptibles a la infecció per fongs59. Després de Fusarium oxysporum f, el gen 423 similar a les MLP també es va suprimir en el germoplasma resistent de la mongeta comuna. cn. Infecció per mongeta 60.
Altres membres de la família PR-10 identificats en el nostre estudi de RNA-seq van ser els gens LlR18A i LlR18B en resposta a la sobreexpressió, així com el gen sobreexpressió (1 gen) o infraexpressió (3 gens) de la proteïna de transferència de lípids DIR1. A més, el WGCNA destaca el gen LlR18B com a centre neuràlgic d'aquest mòdul, que és altament susceptible a la vacunació i porta diversos gens de resposta protectora. Els gens LlR18A i LlR18B es van induir en fulles de llopí groc en resposta a bacteris patògens, així com en tiges de NLL després de la inoculació de D. toxica, mentre que l'homòleg d'arròs d'aquests gens, RSOsPR10, va ser induït ràpidament per una infecció per fongs presumiblement implicada en la via de senyalització de l'àcid jasmònic53,61,62. El gen DIR1 codifica proteïnes de transport de lípids inespecífiques que són necessàries per a l'aparició de la resistència adquirida sistèmica (SAR). Amb el desenvolupament de reaccions protectores, la proteïna DIR1 es transporta des del focus d'infecció a través del floema per induir SAR en òrgans distants. Curiosament, el gen TanjilG_02313 DIR1 es va induir significativament en el primer moment a les línies 84A:476 i la Població 22660, però la resistència a l'antracnosi només es va desenvolupar amb èxit a la línia 84A:476. Això pot indicar una certa subfuncionalització del gen DIR1 en NLL, ja que els tres homòlegs restants van respondre a la inoculació només a la línia 83A:476 a les 6 hpi, i aquesta resposta es va dirigir cap avall.
En el nostre estudi, els components més comuns corresponents al procés biològic anomenat "GO:0055114 Procés redox" van ser la proteïna del citocrom P450, la peroxidasa, l'àcid linoleic 9S-/13S-lipoxigenasa i l'àcid 1-aminociclopropà-1-carboxílic oxidasa. A més, el nostre WGCNA defineix l'homòleg HSFA4a com un centre que porta mòduls com ara el gen candidat de resistència Lanr1 TanjilG_05042. L'HSFA4a és un component de la regulació redox-dependent de la transcripció nuclear en les plantes.
Les proteïnes del citocrom P450 són oxidoreductases que catalitzen reaccions d'hidroxilació dependents de NADPH i/o O2 en el metabolisme primari i secundari, incloent-hi el metabolisme dels xenobiòtics, així com les hormones, els àcids grassos, els esterols, els components de la paret cel·lular, els biopolímers i la biosíntesi de compostos protectors 69. En el nostre estudi, la variabilitat en la funció del citocrom P450 de les plantes es va reduir de -10,6 log2 (canvi de plec) a 5,7 a causa d'un gran nombre d'homòlegs alterats (37) i les diferències en els patrons de resposta entre gens específics, cosa que reflecteix una revisió a l'alça. Utilitzar només dades de seqüenciació d'ARN per elucidar la suposada funció biològica dels gens NLL en una superfamília de proteïnes tan gran seria altament especulatiu. Tanmateix, val la pena assenyalar que alguns gens del citocrom P450 estan associats amb una major resistència a fongs o bacteris patògens, inclosa una contribució a les reaccions al·lèrgiques 69,70,71.
Les peroxidases de classe III són enzims vegetals multifuncionals implicats en una àmplia gamma de processos metabòlics durant el creixement i desenvolupament de les plantes, així com en resposta a estressos ambientals com la salinitat, la sequera, la intensitat lumínica elevada i l'atac de patògens72. Les peroxidases estan implicades en la interacció de diverses espècies vegetals amb Anthracis, incloent-hi Stylosanthes humilis i C. gloeosporioides, Lens culinaris i C. truncatum, Phaseolus vulgaris i C. lindemuthianum, Cucumis sativus i C. lagenarium73,74,75,76. La resposta és molt ràpida, de vegades fins i tot a 4 HPI, abans que el fong penetri al teixit vegetal73. El gen de la peroxidasa també va respondre a la inoculació de NLL de D. toxica. A més de les seves funcions típiques de regular l'esclat oxidatiu o eliminar l'estrès oxidatiu, les peroxidases poden interferir amb el creixement de patògens creant barreres físiques basades en el reforç de la paret cel·lular durant la lignificació, la subunitat o l'enllaç creuat de compostos específics. Aquesta funció es pot atribuir in silico al gen TanjilG_03329 que codifica una suposada peroxidasa d'anions formadora de lignina que es va regular significativament a l'alça en el nostre estudi a la línia resistent 83A:476 a 6 HPI, però no en altres soques i punts de temps que no van respondre.
La 9S-/13S-lipoxigenasa de l'àcid linoleic és el primer pas en la via oxidativa de la biosíntesi de lípids78. Els productes d'aquesta via tenen múltiples funcions en la defensa de les plantes, incloent-hi l'enfortiment de la paret cel·lular mitjançant la formació de dipòsits de callosa i pectina, i la regulació de l'estrès oxidatiu mitjançant la producció d'espècies reactives d'oxigen79,80,81,82,83. En el present estudi, l'expressió de la 9S-/13S-lipoxigenasa de l'àcid linoleic es va alterar en totes les soques, però en la població susceptible 22660, la regulació a l'alça va prevaldre en diferents moments, mentre que en les soques portadores de Lanr1 resistent i l'al·lel AnMan, s'emfatitza la diversificació de la capa d'oxilipina en les reaccions protectores de l'àntrax entre aquests genotips.
L'homòleg de l'1-aminociclopropà-1-carboxilat oxidasa (ACO) va ser significativament regulat a l'alça (9 gens) o regulat a la baixa (2 gens) quan es va inocular amb llopí. Amb dues excepcions, totes aquestes respostes es van produir a 6 hp. a 83A:476. La reacció enzimàtica mediada per les proteïnes ACO és el pas limitant de la velocitat en la producció d'etilè i, per tant, està altament regulada84. L'etilè és una hormona vegetal que juga diversos papers en la regulació del desenvolupament de les plantes i la resposta a condicions d'estrès abiòtic i biòtic. La inducció de la transcripció de l'ACO i l'activació de la via de senyalització de l'etilè estan implicades en l'augment de la resistència de l'arròs al fong hemibiotròfic oryzae oryzae mitjançant la regulació de la producció d'espècies reactives d'oxigen i fitoalexines. Un procés d'infecció foliar molt similar trobat entre M. oryzae i C. lupini88,89, en el context d'una regulació a l'alça significativa dels homòlegs d'ACO a la línia 83A:476 descrita en aquest estudi, canvia la possibilitat de conferir resistència a l'etilè (antracnosi NLL), un pas central de senyalització en les vies moleculars.
En el present estudi, es va observar la supressió a gran escala de molts gens associats amb la fotosíntesi a 6 hpi a 83A:476 i a 48 hpi a Mandeloop i la població 22660. L'abast i la progressió d'aquests canvis són proporcionals al nivell. En aquest experiment es va observar resistència a l'antracnosi. Recentment, s'ha informat d'una repressió forta i primerenca dels transcrits relacionats amb la fotosíntesi en diversos models d'interaccions planta-patogen, inclosos bacteris i fongs patògens. La pressa (a partir de 2 HPI en algunes interaccions) i la supressió global de gens associats amb la fotosíntesi en resposta a la infecció poden desencadenar la immunitat de les plantes basada en el desplegament d'espècies reactives d'oxigen i la seva interacció amb la via de l'àcid salicílic per mediar reaccions al·lèrgiques 90,94.
En conclusió, els mecanismes de resposta de defensa proposats per al llinatge més resistent (83A:476) inclouen el reconeixement ràpid del patògen pel gen R (presumiblement TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) i la senyalització d'àcid salicílic i etilè mediada per resposta al·lèrgica, seguida de l'establiment d'una acció SAR de llarg abast. L'acció està recolzada per la proteïna DIR-1. Cal destacar que el període biotròfic per a la infecció per C. lupini és molt curt (aproximadament 2 dies), seguit d'un creixement necròtic95. La transició entre aquestes etapes pot estar associada amb necrosi i expressió de proteïnes induïbles per etilè que actuen com a desencadenants de reaccions d'hipersensibilitat en plantes hostes. Per tant, la finestra de temps per a la captura amb èxit de C. lupini a l'etapa biotròfica és molt estreta. La reprogramació de gens associats amb la redox i la fotosíntesi observada a 83A:476 a 6 hpi és coherent amb la progressió de les hifes fúngiques i anuncia el desenvolupament d'una resposta protectora amb èxit a l'etapa biotròfica. Les respostes transcriptòmiques de Mandelup i la població 22660 poden ser massa retardades per capturar el fong abans de canviar a creixement necròtic, però, Mandelup pot ser més eficaç que la població 22660 perquè la regulació relativament ràpida de la proteïna PR-10 promou la resistència horitzontal.
L'ETI, impulsada pel gen R canònic, sembla ser un mecanisme comú per a la resistència de les mongetes a l'antracnosi. Així, en la lleguminosa model Medicago truncatula, la resistència a l'antracnosi la confereix el gen RCT1, un membre de la classe del gen R de la planta TIR-NBS-LRR97. Aquest gen també confereix resistència a l'antracnosi d'ampli espectre a l'alfals quan es transfereix a plantes susceptibles. En la mongeta comuna (P. vulgaris), s'han identificat més de dues dotzenes de gens de resistència a l'antracnosi fins ara. Alguns d'aquests gens es troben en regions que no tenen gens R canònics, però molts altres es troben a les vores dels cromosomes que porten el clúster de gens NBS-LRR, inclosos els TIR-NBS-LRRs99. L'estudi SSR de tot el genoma també va confirmar l'associació del gen NBS-LRR amb la resistència a l'antracnosi en la mongeta comuna. El gen R canònic també es va trobar a la regió genòmica que porta el principal locus de resistència a l'antracnosi en el llopí blanc 101.
El nostre treball demostra que una reacció de resistència immediata, activada en una fase inicial de la infecció de la planta (preferiblement no més tard de 12 hpi), protegeix eficaçment el llop de fulla estreta de l'antracnosi causada pel fong patogen Collelotrichum lupini. Mitjançant la seqüenciació d'alt rendiment, vam demostrar perfils d'expressió diferencial de gens de resistència a l'antracnosi en plantes NLL mediats pels gens de resistència Lanr1 i AnMan. Una defensa reeixida implica dissenyar acuradament els gens de les proteïnes implicades en la redox, la fotosíntesi i la patogènesi en poques hores després del primer contacte de la planta amb un patogen. Reaccions protectores similars, però retardades en el temps, són molt menys efectives per protegir les plantes de les malalties. La resistència a l'antrax mediada pel gen Lanr1 s'assembla a la resposta ràpida típica del gen R (immunitat desencadenada per l'efector), mentre que el gen AnMan probablement proporciona una resposta horitzontal (immunitat desencadenada per un patró molecular associat a microbis), proporcionant un nivell moderat de sostenibilitat.
Les 215 línies NLL utilitzades per a la detecció de marcadors d'antracnosi constaven de 74 cultivars, 60 línies obtingudes per encreuament o cria, 5 mutants i 76 germoplasmes salvatges o originals. Les línies provenien de 17 països, principalment de Polònia (58), Espanya (47), Alemanya (27), Austràlia (26), Rússia (19), Bielorússia (7), Itàlia (5) i altres línies de 10 països. El conjunt també inclou línies resistents de referència: 83A:476, Tanjil, Wonga que porta l'al·lel Lanr1 i Mandelup que porta l'al·lel AnMan. Les línies es van obtenir de la base de dades europea de recursos genètics de lloms mantinguda per Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polònia (Taula suplementària S1).
Les plantes es van cultivar en condicions controlades (fotoperíode 16 hores, temperatura 25 °C durant el dia i 18 °C a la nit). Es van analitzar dues rèpliques biològiques. L'ADN es va aïllar de fulles de tres setmanes d'edat utilitzant el kit DNeasy Plant Mini (Qiagen, Hilden, Alemanya) segons el protocol. La qualitat i la concentració de l'ADN aïllat es van avaluar mitjançant mètodes espectrofotomètrics (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Es van analitzar el marcador AnManM1 que marca el gen de resistència a l'antracnosi AnMan (derivat del cv. Mandelup) i els marcadors Anseq3 i Anseq4 que flanquegen el gen Lanr1 (derivat del cv. Tanjil) 11, 26, 28. Els homozigots per a l'al·lel resistent es van classificar com a "1", els susceptibles - com a "0" i els heterozigots - com a 0,5.
A partir dels resultats de la selecció dels marcadors AnManM1, AnSeq3 i AnSeq4 i la disponibilitat de llavors per als experiments de seguiment finals, es van seleccionar 50 línies NLL per a la fenotipificació de la resistència a l'antracnosi. L'anàlisi es va realitzar per duplicat en un hivernacle controlat per ordinador amb un fotoperíode de 14 hores amb un rang de temperatura de 22 °C durant el dia i 19 °C a la nit. Les llavors es rasquen (tallant la capa de la llavor al costat oposat de l'embrió amb una fulla afilada) abans de sembrar per evitar la dormència de les llavors a causa d'una capa massa dura i per garantir una germinació uniforme. Les plantes es van cultivar en testos (11 × 11 × 21 cm) amb terra estèril (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsòvia, Polònia). La inoculació es va dur a terme amb la soca Colletotrichum lupini Col-08, cultivada el 1999 a partir de tiges de plantes de llop de fulla estreta cultivades en un camp a Verzhenitsa, Gran Polònia (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Obtenir una àrea. Els aïllats es van cultivar en medi SNA a 20° C sota llum negra durant 21 dies per induir l'esporulació. Quatre setmanes després de la sembra, quan les plantes havien arribat a l'etapa de 4-6 fulles, la inoculació es va dur a terme ruixant amb una suspensió de conídies a una concentració de 0,5 x 106 conídies per ml. Després de la inoculació, les plantes es van mantenir a les fosques durant 24 hores a una humitat d'aproximadament el 98% i una temperatura de 25°C per facilitar la germinació de les conídies i el procés d'infecció. A continuació, les plantes es van cultivar sota un fotoperíode de 14 hores a 22°C dia/19°C nit i 70% d'humitat. La puntuació de la malaltia es va fer 22 dies després de la inoculació i va oscil·lar entre 0 (immune) i 9 (molt susceptible) depenent de la presència o absència de lesions necròtiques a les tiges i les fulles. A més, després de la puntuació, es va mesurar el pes de les plantes. Les relacions entre els genotips marcadors i els fenotips de la malaltia es van calcular com a correlacions de dues seqüències puntuals (absència de marcadors heterozigots en el conjunt de línies per a l'anàlisi del fenotip de resistència a l'antracnosi).