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アングスティフォリウス・ルピナス（NLL、ルピナス・アングスティフォリウスL.）は、食用および土壌改良に用いられるマメ科植物です。作物としてのNLLの世界的な拡大は、壊滅的な炭疽病を引き起こすルピナス炭疽病菌を含む多くの病原性真菌を引き寄せてきました。耐性を高める2つの対立遺伝子、Lanr1とAnManはNLLの育種に用いられてきましたが、その根底にある分子メカニズムは不明のままです。本研究では、Lanr1およびAnManマーカーを用いてヨーロッパ産NLLサンプルをスクリーニングしました。制御された環境下でのワクチン試験により、両方の耐性供与体の有効性が確認されました。代表的な耐性系統と感受性系統について、遺伝子発現プロファイルの差異解析を行いました。炭疽病耐性は、遺伝子オントロジー用語「GO:0006952 防御応答」、「GO:0055114 酸化還元プロセス」、「GO:0015979 光合成」の過剰発現と関連していました。さらに、Lanr1(83A:476)株は接種後すぐに顕著なトランスクリプトームの再プログラミングを示したが、他の株ではこの反応が約42時間遅れた。防御反応は、TIR-NBS、CC-NBS-LRR、NBS-LRR遺伝子、病原性に関与する10個のタンパク質、脂質輸送タンパク質、エンドグルカン-1,3-β-グルコシダーゼ、グリシンリッチ細胞壁タンパク質、および酸素の反応経路の遺伝子に関連している。光合成に関連する遺伝子の慎重な抑制を含む83A:476に対する初期反応は、真菌生物学の栄養成長期における保護の成功と一致しており、エフェクターが免疫を誘発することを示唆している。マンデループ反応は、全体的な水平方向の抵抗と同様に遅くなる。
ナローリーフ・ルピナス（NLL、Lupinus angustifolius L.）は、西地中海地域原産の高タンパク質穀物です1,2。現在、動物や人間の食用作物として栽培されています。また、共生窒素固定細菌による窒素固定と土壌構造の全体的な改善により、輪作体系における緑肥としても考えられています。NLLは過去1世紀に急速な栽培化の過程を経ており、現在も高い育種圧にさらされています3,4,5,6,7,8,9,10,11,12。NLLの広範な栽培により、病原菌の遷移が新たな農業ニッチを開拓し、新たな作物破壊病を引き起こしました。 ルピナス農家や育種家にとって最も注目すべき出来事は、病原菌である Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 によって引き起こされる炭疽病の発生でした。 ルピナス農家や育種家にとって最も注目すべき出来事は、病原菌である Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 によって引き起こされる炭疽病の発生でした。 Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогенным Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg、Feiler & Hagesorn13. ルピナス農家や育種家にとって最も注目すべきは、病原菌 Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 によって引き起こされる炭疽病の発生であった。羽扇豆類およびハゲドーンに関して最も注目すべきは、病原菌コレトトリクム・ルピニ（ボンダール）・ニーレンバーグ、フェイラーおよびハーゲドーンによって引き起こされる炭疽病の発生である13。羽扇豆類およびハイヤードに関して最も注目されるのは、病原菌コレトトリクム・ルピニ（ボンダール）による炭疽病の発生である。 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg、Feiler & Hagesorn13. ルピナス農家や育種家にとって最も衝撃的なのは、病原菌 Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 によって引き起こされる炭疽病の発生である。この病気に関する最初の報告はブラジルと米国から寄せられ、典型的な症状はそれぞれ1912年と1929年に現れた。しかし、約30年後、病原体はColletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz.と命名された。 & Sacc.、テレオモルフ Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.、テレオモルフ Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.、телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.、Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. の有性世代。 & Sacc.、目的の形の Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.、目的の形の Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.、Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии。 & Sacc.、Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld のターゲット形態学。 ＆H.シュレンク、。 ＆H.シュレンク、。そしてH.シュレンク。 & H.エピック、。 & H.エピック、。および H. シュレンク、。20世紀半ばに行われた予備的な病害表現型解析では、NLLと黄色ルピナス（L. luteus L.）の系統にはある程度の抵抗性があるものの、試験したすべての白色ルピナス（L. albus L.）の系統は非常に感受性が高いことが示されました15,16。研究によると、炭疽病の発生は降水量（空気湿度）と気温（12～28℃の範囲）の増加と関連しており、高温では抵抗性が破られることが示されています17, 18。実際、分生子が発芽して病気が始まるのに必要な時間は、高湿度条件下では24℃（4時間）の方が12℃（16時間）よりも4倍短くなっています19。このように、進行中の地球温暖化は炭疽病の蔓延につながっています。しかし、この病気はフランス（1982年）とウクライナ（1983年）で差し迫った脅威の前兆として観察されたが、当時ルピナス産業では明らかに無視されていた20,21。数年後、この壊滅的な病気は世界中に広がり、オーストラリア、ポーランド、ドイツなどの主要なルピナス生産国にも影響を与えた22,23,24。1990年代半ばの炭疽病の発生後、広範なスクリーニングにより、NLL19サンプルからいくつかの耐性ドナーが特定された。NLLの炭疽病耐性は、異なる遺伝資源源に見られる2つの異なる優性対立遺伝子によって制御されている。品種TanjilとWongaのLanr1と、品種MandalayのAnManである25,26。これらの対立遺伝子は、育種プログラムで耐性遺伝資源の選択をサポートする分子マーカーを補完する25,26,27,28,29,30。 Lanr1アレルを持つ耐性育種系統83A:476を感受性野生系統P27255と交配し、炭疽病耐性に関して分離するRIL集団を得​​た。これにより、Lanr1遺伝子座を染色体NLL-11に割り当てることが可能になった31, 32, 33。炭疽病耐性遺伝子座の隣接領域からの連鎖地図マーカーをゲノムフレームワークNLLとアライメントした結果、3つのアレルすべてが同じ染色体（NLL-11）上にあるが、位置が異なることが明らかになった29,34,35。しかし、RILの数が少なく、マーカーと対応するアレル間の遺伝的距離が大きいため、それらの根底にある遺伝子について信頼できる結論を出すことはできない。一方、ルピナスでは再生能力が非常に低いため、遺伝子操作が煩雑になり、逆遺伝学の使用が困難である37。
83A:476 (Lanr1) や Mandelup (AnMan) など、目的のアレルをホモ接合状態で持つ栽培化された遺伝資源の開発により、野生集団に反対の組み合わせのアレルが存在する状況下で炭疽病耐性を研究する道が開かれました。分子メカニズムの可能性。特定の遺伝子型によって生成される防御応答を比較します。この研究では、C. lupini ワクチン接種に対する NLL の初期トランスクリプトーム応答を評価しました。まず、215 系統を含むヨーロッパの NLL 遺伝資源パネルを、Lanr1 および AnMan アレルをマークする分子マーカーを使用してスクリーニングしました。次に、分子マーカー用に事前に選択された 50 の NLL 系統について、制御された条件下で炭疽病表現型解析を実施しました。これらの実験に基づき、炭疽病耐性とLanr1/AnMan対立遺伝子構成が異なる4つの系統を選定し、ハイスループットRNAシーケンスとリアルタイムPCR定量という2つの相補的な手法を用いて、防御遺伝子発現の差異プロファイリングを行った。
マーカー Lanr1 (Anseq3 および Anseq4) と AnMan (Anseq4) および AnMan (AnManM1) を使用して NLL 遺伝資源 (N = 215) のセットをスクリーニングしたところ、1 つの系統 (95726、サラマンカ-b 付近) のみがすべてのマーカーの「耐性」アレルを増幅することが示されました。一方、「感受性」アレルの存在は、158 系統 (約 73.5%) ですべてのマーカーの割合が判明しました。13 系統は Lanr1 マーカーの 2 つの「耐性」アレルを生成し、8 系統は Lanr1 マーカーの「耐性」アレルを生成しました。AnMan マーカーの「耐性」アレル (補足表 S1)。2 つの系統は Anseq3 マーカーに対してヘテロ接合であり、1 つの系統は AnManM1 マーカーに対してヘテロ接合でした。 42系統（19.5%）はAnseq3およびAnseq4アレルの逆相を有しており、これら2つの遺伝子座間の組換え頻度が高いことを示している。制御条件下での炭疽病表現型（補足表S2）は、試験した遺伝子型の抵抗性のばらつきを示しており、これは炭疽病の重症度に反映されている。平均スコアの差は1.8（中程度の抵抗性）から6.9（感受性）の範囲であり、植物重量の差は0.62g（感受性）から4.45g（抵抗性）の範囲であった。 実験の2回の繰り返しで観察された値の間には有意な相関関係があり（病害重症度スコアでは0.51、P = 0.00017、植物重量では0.61、P < 0.0001）、これら2つのパラメータ間にも有意な相関関係があった（-0.59と-0.77、P < 0.0001）。 実験の2回の繰り返しで観察された値の間には有意な相関関係があり（病害重症度スコアでは0.51、P = 0.00017、植物重量では0.61、P < 0.0001）、これら2つのパラメータ間にも有意な相関関係があった（-0.59と-0.77、P < 0.0001）。 Выявлена достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для) баллов тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, Р < 0.0001) 0.0001)。 実験の2回の繰り返しで観察された値の間には有意な相関関係が見られ（病害重症度スコアでは0.51、P = 0.00017、植物重量では0.61、P < 0.0001）、これら2つのパラメータ間にも有意な相関関係が見られました（-0.59と-0.77、P < 0.0001）。2 回の反復実験で観察された値の間には、関連性 (疾患の重度の分別は 0.51、P = 0.00017、植物は 0.61、P < 0.0001) およびこの 2 つのパラメータの間 (- 0.59 と- 0.77、P < 0.0001)。2 回の反復実験中に観察された値の間には相関性が存在します (疾患の重さの認定分数は 0.51 、p = 0.00017、植物は 0.61、p <0.0001) および 2パラメータ間の（（（- 0.59 および – 0.59 および – 0.59 および – 0.59 および – 0.77、P < 0.0001）。 Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести) заболевания 0,51, P = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001。 重複して観察された値（病害重症度スコア0.51、P = 0.00017および植物重量0.61、P < 0.0001）と、これら2つのパラメータ（-0.59および-0.0001）の間（0.77、P<0.0001）には有意な相関関係があった。 ).感受性植物に見られる典型的な症状としては、茎が「羊飼いの弓」のような形に曲がったりねじれたりし、その後、オレンジ色またはピンク色のスポロゾイトを伴う楕円形の病斑が現れます（補足図1）。Lanr1（83A:476およびTanjil）およびAnMan（Mandelup）遺伝子を持つオーストラリアの系統は中程度の耐性を示し、耐性値は0.0331および0.0036です。また、「耐性」Lanr1および/またはAnMan対立遺伝子を持つ系統の中には、この病気の症状を示すものもあります。
興味深いことに、「耐性」マーカーアレルを持たないいくつかのNLL系統は、高いレベルの炭疽病耐性（Lanr1またはAnMan遺伝子型と同等またはそれ以上）を示しました。例えば、Boregine（両方のパラメーターでP値<0.0001）、Bojar（スコアでP値<0.0001、植物重量で0.001）、および集団B-549/79b（スコアでP値<0.0001、重量で有意差なし）などです。 興味深いことに、「耐性」マーカーアレルを持たないいくつかのNLL系統は、高いレベルの炭疽病耐性（Lanr1またはAnMan遺伝子型と同等またはそれ以上）を示しました。例えば、Boregine（両方のパラメーターでP値<0.0001）、Bojar（スコアでP値<0.0001、植物重量で0.001）、および集団B-549/79b（スコアでP値<0.0001、重量で有意差なし）などです。 Интересно, что несколько линий NLL, лизенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обоих) параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и популяции B-549/79b (значение P <0,0001) для оценки и незначимо для массы)。 興味深いことに、耐性マーカーアレルを持たないいくつかのNLL系統は、炭疽病に対して高いレベルの耐性を示しました（Lanr1またはAnMan遺伝子型と同等かそれ以上）。例えば、Boregine（両方のパラメーターでP値<0.0001）、Bojar（評価でP値<0.0001、植物重量で0.001）、および集団B-549/79b（評価でP値<0.0001、重量では有意差なし）などです。興味深いことに、Boregine（2 つのパラメータの P 値 < 0.0001）、Bojar（P値＜得分値０．０００１、植物重量０．００１）および群Ｂ－５４９／７９ｂ（得分Ｐ値＜０．０００１、重量不着）。 興味深いことに、「抗原性」マーカーを持たないNLLシステムの中には、Boregine（両方のパラメーターでP < 0.0001）、Bojar（P値 < 0.0001、植物重量0.001）、および株B-549/79b（P値 < 0.0001、重量は有意差なし）のように、高い水平抵抗性（Lanr1またはAnMan遺伝子と同等かそれ以上）を示すものがある。 Интересно、что некоторые линии NLL、лизенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности»、показали высокие уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выbolе, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих) <0,0001)、ボジャール(значение P <0,0001, масса растения 0,001) と популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна)。 興味深いことに、耐性マーカーアレルを持たないNLL系統の中には、炭疽病に対する高い耐性（Lanr1またはAnMan遺伝子型と同等かそれ以上）を示すものがあり、例えばBoregine（両パラメーターのP値<0.0001）、Bojar（P値<0.0001、植物重量0.001）、および集団B-549/79b（P値<0.0001、重量は有意差なし）などが挙げられる。この現象は、耐性の新たな遺伝的源の可能性を示唆しており、マーカー遺伝子型と疾患表現型の間に相関が見られないこと（P値は約0.42～約0.98）を説明しています。したがって、コルモゴロフ・スミルノフ検定では、炭疽病耐性に関するデータは、スコア（P値0.25および0.11）と植物質量（P値0.47および0.55）についてほぼ正規分布していることが示され、Lanr1とAnMan以外の対立遺伝子が関与していると仮説を立てました。
炭疽病耐性スクリーニングの結果に基づき、83A:476、Boregine、Mandelup、およびPopulation 22660の4系統がトランスクリプトーム解析のために選択された。これらの系統は、前回の試験と同じであることを条件として、RNAシーケンスによる接種実験で炭疽病耐性について再試験された。スコア値は次のとおりであった：Boregin（1.71 ± 1.39）、83A:476（2.09 ± 1.38）、Mandelup（3.82 ± 1.42）、およびpopulation 22660（6.11 ± 1.29）。
Illumina NovaSeq 6000プロトコルでは、サンプルあたり平均40.5 Mreadペア（29.7～54.4 Mread）が得られました（補足表S3）。参照配列のアライメントスコアは75.5%～88.6%でした。生物学的複製間の実験バリアント間のリードカウントデータの平均相関は0.812～0.997（平均0.959）でした。 解析した35,170個の遺伝子のうち、2,917個は発現が認められず、残りの4,785個の遺伝子はごくわずかなレベルで発現していた（基本平均値＜5）。 解析した35,170個の遺伝子のうち、2,917個は発現が認められず、残りの4,785個の遺伝子はごくわずかなレベルで発現していた（基本平均値＜5）。 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5)。 解析した35,170個の遺伝子のうち、2,917個は発現が見られず、残りの4,785個の遺伝子はごくわずかなレベルで発現していた（基本平均値＜5）。分析された35,170個の遺伝子のうち、2917個は発現がなく、他の4785個の遺伝子の発現はわずかに観察されなかった（基本平均値<5）。35,170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительную экспрессию (базовое среднее значение <5)。 解析された35,170個の遺伝子のうち、2917個は発現しておらず、残りの4785個の遺伝子は発現がごくわずかであった（基本平均値＜5）。したがって、実験中に発現しているとみなされた遺伝子の数（基本平均≧5）は27,468（78.1%）であった（補足表S4）。
最初の時点から、すべてのNLL系統はC. lupini（Col-08株）の接種に対してトランスクリプトームの再プログラミングで反応したが（表1）、系統間で有意な差が観察された。例えば、耐性系統83A:476（Lanr1遺伝子を持つ）は、最初の時点（接種後6時間）でトランスクリプトームの再プログラミングが顕著に見られ、この時点で他の時点と比較して、分離されたアップ遺伝子とダウン遺伝子の数が31～69倍増加した。さらに、このピークは短命で、2番目の時点（接種後12時間）では、ごく少数の遺伝子の発現のみが有意に変化していた。興味深いことに、接ぎ木試験で高い耐性を示したBoregineは、実験中にこのような大規模な転写再プログラミングを受けなかった。しかし、12 HPIでは、Boregineと83A:476の差次的発現遺伝子（DEG）の数は同数であった。マンデルップと集団22660の両方で、DEGのピークが最後の時点（48 l/s）で示され、防御反応に相対的な遅延があることが示された。
83A:476は他のすべての系統と比較して、6 HPIでC. lupiniに応答して大規模なトランスクリプトーム再プログラミングを受けたため、この時点で観察されたDEGの約91%は系統特異的であった（図1）。しかし、研究対象系統間で初期応答に多少の重複があり、Boregine、Mandelup、および集団22660のDEGのそれぞれ68.5%、50.9%、および52.6%が、特定の時点で83A:476で見つかったものと重複していた。ただし、これらのDEGは、現在83A:476を使用して検出されているすべてのDEGのごく一部（0.97～1.70%）にすぎない。さらに、現時点では全系統から11個のDEGが一致しており（補足表S4-S6）、植物防御応答の共通成分として、脂質輸送タンパク質（TanjilG_32225）、エンドグルカン-1,3-β-グルコシド酵素（TanjilG_23384）、SAM22のよ​​うな2つのストレス誘導性タンパク質（TanjilG_31528およびTanjilG_31531）、塩基性ラテックスタンパク質（TanjilG_32352）、および2つのグリシンリッチ構造細胞壁タンパク質（TanjilG_19701およびTanjilG_19702）が含まれていました。また、24 HPIにおける83A:476とBoregineの間（合計16～38%のDEG）、および48 HPIにおけるMandelupとPopulation 22660の間（合計14～20%のDEG）で、トランスクリプトーム応答に比較的高い重複が見られた。
ポーランドのヴィエルジェニツェのルピナス畑から1999年に採取されたColletotrichum lupini株Col-08を接種した狭葉ルピナス（NLL）系統における、差次的発現遺伝子（DEG）の数を示すベン図。解析対象としたNLL系統は、83A:476（耐性、Lanr1対立遺伝子保有）、Boregine（耐性、遺伝的背景不明）、Mandelup（中程度の耐性、AnMan対立遺伝子保有）、および集団22660（非常に感受性）である。hpiはワクチン接種後の時間を表す略語である。グラフを簡略化するため、ゼロ値は除外した。
6 hpi で過剰発現した遺伝子のセットを、標準的な R 遺伝子ドメインの存在について分析した (補足表 S7)。この研究では、NBS-LRR ドメインを持つ古典的な病害抵抗性遺伝子のトランスクリプトーム誘導が 83A:476 でのみ起こることが明らかになった。このセットは、1 つの TIR-NBS-LRR 遺伝子 (tanjilg_05042)、5 つの CC-NBS-LRR 遺伝子 (tanjilg_06165、tanjilg_06162、tanjilg_22773、tanjilg_22640、tanjilg_16162)、4 つの NBS-LR (Tanjilg_16162)、4 つの NBS-LRRE (tanjilg_16162)、4 つの NBS-Lrr (tanjilg_16162)、および 4 つの NBS-LRR (TANJILG_16162) で構成されていた。これらの遺伝子はすべて、保存された配列に配置された標準的なドメインを持っています。NBS-LRRドメイン遺伝子に加えて、6 hpiでいくつかのRLLキナーゼが活性化されました。具体的には、Boregineで1つ（TanjilG_19877）、Mandelupで2つ（TanjilG_07141とTanjilG_19877）、集団22660で2つ（TanjilG_09014とTanjilG_10361）、83A 27:476で2つです。
C. lupini（Col-08株）の接種に応答して発現が著しく変化した遺伝子について、遺伝子オントロジー（GO）濃縮分析を行った（補足表S8）。 最も頻繁に過剰に表現された生物学的プロセス用語は「GO:0006952 防御応答」であり、16 通りの組み合わせのうち 6 通りで高い有意性 (P 値 < 0.001) で出現した (図 2)。 最も頻繁に過剰に表現された生物学的プロセス用語は「GO:0006952 防御応答」であり、16 通りの組み合わせのうち 6 通りで高い有意性 (P 値 < 0.001) で出現した (図 2)。 Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2)。 最も頻繁に過剰に表現された生物学的プロセス用語は「GO:0006952 防御応答」であり、16 通りの組み合わせのうち 6 通りで高い有意性 (P 値 < 0.001) で出現した (図 2)。最も代表的な生体プロセスは「GO:0006952 防御反応」で、16 個（時間×直線）の組み合わせのうち 6 個に出現し、高い定着性（P 値 < 0.001）を示します（図 2）。 最も代表的な生物学的プロセス用語は「GO:0006952 防御応答」であり、16 (時間×線) の組み合わせのうち 6 に現れ、高い有意性 (P 値 < 0.001) を示した (図2)。 Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», который появлялялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2)。 最も頻繁に過剰に表現された生物学的プロセス用語は「GO:0006952 防御応答」であり、16の組み合わせ（時間×行）のうち6つで高い有意性（P値<0.001）で出現した（図2）。この用語は、83A:476とBoregineの2つの時点（6および24 hpi）と、MandelupとPopulation 22660の1つの時点（それぞれ12および6 hpi）で過剰に発現していました。これは予想された結果であり、耐性系統の抗真菌反応を強調しています。さらに、83A:476はC. lupiniに対して、「GO:0055114 redox process」という用語で表される酸化バーストに関連する遺伝子を急速に誘導することで反応し、特異的な防御反応を示しました。一方、Boregineは「GO」という用語に関連する特異的な防御反応を示しました。 :0006950 ストレス応答」。集団 22660 は、二次代謝産物を含む水平抵抗応答を活性化し、「GO:0016104 トリテルペン生合成のプロセス」および「GO:0006722 トリテルペン代謝のプロセス」（両方の用語は同じ遺伝子セットに属する）という用語の過剰な数を強調し、GO 用語濃縮分析の結果を考慮すると、マンデルップ反応の安定性はボレギンと集団 22660 の間であった。さらに、初期反応 83A:476 (6 hpi) および遅延反応 マンデルップと集団 22660 には、用語 GO:0015979 '光合成' およびその他の関連する生物学的プロセスが含まれる。
ポーランドのヴィエルジェニツェのルピナス畑から1999年に採取されたCol-08株の炭疽菌を接種したナローリーフ・ルピナス（NLL）のトランスクリプトーム応答中に発現差のある遺伝子の注釈付けで選択されたバイオプロセス遺伝子オントロジー用語は、非常に誇張されている。解析されたNLL系統は、83A:476（耐性、ホモ接合型Lanr1対立遺伝子を持つ）、Boregine（耐性、遺伝的背景不明）、Mandelup（中程度の耐性、ホモ接合型AnMan対立遺伝子を持つ）、および集団22660（感受性）であった。
この研究は炭疽病耐性に寄与する遺伝子を特定することを目的としていたため、GO用語「GO: 0006952 防御応答」および「GO: 0055114 酸化還元プロセス」に割り当てられた遺伝子を、ベースライン平均が30以上で、かつ少なくとも1つの時点のlog2（倍率変化）の統計的に有意な値を組み合わせたカットオフ値で解析した。これらの基準を満たす遺伝子の数は、GO:0006952では65個、GO:0055114では524個であった。
83A:476 では、GO:0006952 という用語で注釈付けされた 2 つの DEG ピークが明らかになった。最初のピークは 6 遺伝子/インチ (64 遺伝子、アップおよびダウン調節)、2 番目のピークは 24 遺伝子/インチ (15 遺伝子、アップ調節のみ) であった。Boregine では、GO:0006952 が同じ時点でピークに達したが、DEG が少なく (11 と 8)、優先的に活性化されたことも示された。Mandeloop では、GO:0006952 の 2 つのピークが 12 HPI と 48 HPI に現れ、どちらも 12 個の遺伝子を保有していた (最初のピークは活性化遺伝子、2 番目のピークは抑制遺伝子のみ) が、6 HPI の 22660 集団 (13 個の遺伝子) では、増加ピークの優位性がより大きかった。これらのピークの 96.4% の GO:0006952 DEG が同じタイプの応答 (上昇または下降) を示したことに留意すべきである。これは、関与する遺伝子の数の違いにもかかわらず、防御応答に有意な重複があることを示している。用語 GO:0006952 に関連する配列の最大のグループは、飢餓ストレス関連メッセージタンパク質 22 (SAM22 様) をコードしており、これはクラス 10 病原性関連タンパク質 (PR-10) タンパク質クレードおよびコアタンパク質ラテックスに属する。類似 (MLP 様) タンパク質) タンパク質 (図 3)。2 つのグループは、発現の性質と応答の方向が異なっていた。SAM22 様タンパク質をコードする遺伝子は、初期の時点 (6 または 12 hpi) で一貫して有意な誘導を示し、実験の終了時 (48 hpi) には概して応答しなかったが、MLP 様タンパク質は 6 hpi で協調を示した。 83A:476 と Mandelup の 48 hp/in では、他のほとんどすべてのデータ ポイントは反応を示さなかった。さらに、SAM22 様タンパク質遺伝子の発現プロファイルの違いは、炭疽病耐性の変動性に追随しており、より耐性のある系統では、より感受性の高い遺伝子よりも、これらの遺伝子を有意に誘導する時点が多かった。別の LlR18A/B 様 PR-10 遺伝子は、SAM22 様タンパク質遺伝子と非常によく似た発現パターンを示した。
生物学的プロセス用語「GO:0006952 防御応答」の主要構成要素と、Lanr1 および AnMan アレルの候補遺伝子の発現パターンが特定された。Log2 スケールは、接種された植物 (Colletotrichum lupini、株 Col-08、1999 年にポーランドのウィジェニツァのルピナス畑から入手) と対照 (偽接種) 植物の同じ時点での log2 値 (倍率変化) を表す。以下の狭葉ルピナス系統が分析された: 83A:476 (耐性、ホモ接合型 Lanr1 アレルを保有)、Boregine (耐性、遺伝的背景不明)、Mandelup (中程度の耐性、ホモ接合型 AnMan アレルを保有)、および Population 22660 (感受性)。
さらに、RNA-seq候補遺伝子Lanr1（TanjilG_05042）とAnMan（TanjilG_12861）の発現プロファイルを評価した（図3）。TanjilG_05042遺伝子は、最初の時点（6 hpi）でのみ83A:476において有意な応答（活性化）を示したが、TanjilG_12861は、6 hpi（ダ​​ウンレギュレーション）と24 hpi（6 hpi）の2つの時点のみでMandeloopにおいて有意であった。（調整可能）
GO:0055114「酸化還元プロセス」の用語で最も過剰発現した遺伝子は、シトクロムP450タンパク質とペルオキシダーゼをコードする遺伝子でした（図4）。6 HPIで83A:476から分離したサンプルでは、​​接種植物と対照植物の間で、最大または最小のlog2（倍率変化）値（86.6%の遺伝子）が一般的に観察され、この遺伝子型の接種性別に対する高い応答が強調されました。83A:476は6 hpiで最も有意なGO:0055114 DEG（503遺伝子）を示しましたが、他の系統は48 hpiでした（Boregine、31遺伝子；Mandelup、85遺伝子；およびPopulation 22660、78遺伝子）。GO:0055114ファミリーのほとんどの遺伝子では、ワクチン接種に対する2種類の応答（活性化と阻害）が観察されました。興味深いことに、48 hp の Mandelupe で GO: 0055114 の用語で同定された DEG の最大 97.6% は、これらの観察結果から、規模が著しく小さいにもかかわらず (つまり、変異した酸化還元遺伝子の数、85 対 503)、炭疽病に対する Mandeloup の遅延したトランスクリプトーム応答のパターンは、83A:476 の早期応答と類似していることが示唆されます。Boregine と Population 22660 では、この収束はそれぞれ 51.6% と 75.6% と低くなっています。
生物学的プロセス「GO:0055114 酸化還元プロセス」の用語の主要構成要素の発現パターンが明らかになった。Log2 スケールは、接種した植物 (Colletotrichum lupini、株 Col-08、1999 年にポーランドのウィジェニツァのルピナス畑から入手) と対照 (偽接種) 植物の同じ時点での log2 値 (倍率変化) を表す。以下の狭葉ルピナス系統が分析された: 83A:476 (耐性、ホモ接合型 Lanr1 アレルを持つ)、Boregine (耐性、遺伝的背景不明)、Mandelup (中程度の耐性、ホモ接合型 AnMan アレルを持つ)、および Population 22660 (感受性)。
83A:476 C. lupini (株 Col-08) の接種に対するトランスクリプトーム応答には、用語 GO:0015979「光合成」およびその他の関連する生物学的プロセスに起因する遺伝子の協調的なサイレンシングも含まれていました (図 5)。この GO:0015979 DEG セットには、83A:476 で 6 hpi に有意に抑制された 105 個の遺伝子が含まれていました。このサブセットでは、48 HPI の Mandelup で 37 個の遺伝子がダウンレギュレーションされ、同じ時点で 22660 集団で 35 個の遺伝子がダウンレギュレーションされました。これには、両方の遺伝子型に共通する 19 個の DEG が含まれます。用語 GO:0015979 に関連する DEG は、どの組み合わせ (行 x 時間) でも有意に活性化されませんでした。
生物学的プロセス「GO:0015979 光合成」の主要構成要素の発現パターンが明らかになった。Log2 スケールは、接種した植物 (Colletotrichum lupini、株 Col-08、1999 年にポーランドのウィジェニツァのルピナス畑から入手) と対照 (偽接種) 植物の同じ時点での log2 値 (倍率変化) を表す。以下の狭葉ルピナス系統が分析された: 83A:476 (耐性、ホモ接合型 Lanr1 アレルを持つ)、Boregine (耐性、遺伝的背景不明)、Mandelup (中程度の耐性、ホモ接合型 AnMan アレルを持つ)、および Population 22660 (感受性)。
差次的発現解析の結果に基づき、病原性真菌に対する防御応答に関与していると考えられるこの7つの遺伝子群を、リアルタイムPCRによる発現プロファイルの定量化のために選択した（補足表S9）。
推定タンパク質遺伝子 TanjilG_10657 は、対照 (模倣) 植物と比較して、調査したすべての系統および時点において有意に誘導されました (補足表 S10、S11)。さらに、TanjilG_10657 の発現プロファイルは、すべての系統において実験の過程で増加傾向を示しました。集団 22660 は、接種に対する TanjilG_10657 の感受性が最も高く、24 HPI で 114 倍の活性化と最高の相対発現レベル (4.4 ± 0.4) を示しました (図 6a)。PR10 LlR18A タンパク質遺伝子 TanjilG_27015 も、すべての系統および時点において活性化を示し、ほとんどのデータポイントで統計的に有意でした (図 6b)。 TanjilG_10657と同様に、TanjilG_27015の相対発現レベルが最も高かったのは、接種後24時間（19.5 ± 2.4）の22660接種集団であった。酸性エンドキチナーゼ遺伝子TanjilG_04706は、Boregine 6 hpiを除くすべての系統およびすべての時点で有意に上方制御された（図6c）。83A:476では最初の時点（6 HPI）で強く誘導され（10.5倍）、他の系統では中程度に増加した（6.6～7.5倍）。実験中、TanjilG_04706の発現は83A:476とBoregineでは同様のレベルにとどまったが、Mandelupと集団22660では有意に増加し、比較的高い値（それぞれ5.9 ± 1.5と6.2 ± 1.5）に達した。エンドグルカン-1,3-β-グルコシダーゼ様遺伝子 TanjilG_23384 は、集団 22660 を除くすべての系統で最初の 2 つの時点 (6 時間と 12 hpi) で高い活性化を示した (図 6d)。TanjilG_23384 の相対発現レベルが最も高かったのは、2 番目の時点 (12 hpi) で、Mandelup (2.7 ± 0.3) と 83A:476 (1.5 ± 0.1) であった。24 HPI では、TanjilG_23384 の発現は、調査したすべての系統で比較的低かった (0.04 ± 0.009 ～ 0.44 ± 0.12)。
定量PCRにより明らかになった、選択された遺伝子（ag）の発現プロファイル。6、12、24はワクチン接種後の時間を表す。LanDExH7遺伝子とLanTUB6遺伝子を正規化に用い、LanTUB6遺伝子をシリーズ間キャリブレーションに用いた。エラーバーは、3つの生物学的複製に基づく標準偏差を表し、各生物学的複製は3つの技術的複製の平均値である。 接種した植物（Colletotrichum lupini、株Col-08、1999年にポーランドのヴィエルゼニツァのルピナス畑から採取）と対照植物（偽接種）の発現レベルの差の統計的有意性は、データポイントの上に示されています（*P値<0.05、**P値≤0.01、***P値≤0.001）。 接種した植物（Colletotrichum lupini、株Col-08、1999年にポーランドのヴィエルゼニツァのルピナス畑から採取）と対照植物（偽接種）の発現レベルの差の統計的有意性は、データポイントの上に示されています（*P値<0.05、**P値≤0.01、***P値≤0.001）。 Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, bol-08, получен) 1999 年、Верженице、Польза) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05、**значение P ≤ 0,01、***значение P ≤ 0,001)。 接種した植物（Colletotrichum lupini、株Col-08、1999年にポーランドのヴィエルジェニツェにあるルピナス畑から採取）と対照植物（偽接種）の発現レベルにおける統計的に有意な差は、データポイントの上に示されています（*P値<0.05、**P値≤0.01、***P値≤0.001）。接（Colletotrichum lupini、Col-08 株、1999 年波兰 Wierzenica の羽扇豆田入手）と対照（模倣）植物間のレベル差を示すデータポイント上にあります（*P 値 < 0.05、 **P 値≤ 0.01、***P 値≤ 0.001)。接 (colletotrichum lupini 、 color-08 株、 1999 年波兰 wierzenica の羽扇获得) と对照 (接植物間の水平差の構造的着性指標データポイント上方*p)値 <0.05、**P ≤ 0.01、***P ≤ 0.001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, øтамм Col-08, полученный) Верженице, Польза, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05、** P-значение ≤ 0,01、***P-значение ≤ 0,001)。 接種した植物（1999年にポーランドのヴェルジェニツェのルピナス畑から採取したColletotrichum lupini、Col-08株）と対照植物（偽接種）の発現レベルに統計的に有意な差があることがデータポイントの上に示されています（*P値<0.05、**P値≤0.01、***P値≤0.001）。解析されたNLL系統は、83A:476（耐性、ホモ接合型Lanr1対立遺伝子を保有）、Mandelup（中程度の耐性、ホモ接合型AnMan対立遺伝子を保有）、Boregine（耐性、遺伝的背景不明）、および集団22660（感受性）であった。
Lanr1 遺伝子座の候補遺伝子 TanjilG_05042 は、RNA-seq 研究から得られたプロファイルとは著しく異なる発現パターンを示した (図 6e)。この遺伝子の有意な活性化は、Mandelup と 22660 集団で観察され (それぞれ最大 39.7 倍と 11.7 倍)、比較的高い発現レベル (それぞれ最大 1.4 ± 0.14 と 7.2 ± 1.3) をもたらした。83A:476 でも TanjilG_05042 遺伝子のアップレギュレーションがいくつか見られた (最大 3.8 倍) が、達成された相対発現レベル (0.044 ± 0.002) は、Mandelup と 22660 集団で観察されたものよりも 30 倍以上低かった。 qPCRによる解析では、偽ワクチン接種（対照）群の遺伝子型間で発現レベルに有意な差が認められ、22660集団と83A:476集団間、および22660集団と22660集団間では58倍の差が見られた。ボレジンとマンダラップの間では2倍の差が認められた。
AnMan遺伝子座の候補遺伝子TanjilG_12861は、83A:476とMandelupではワクチン接種に応答して活性化され、22660集団では中立であり、Boregineではダウンレギュレーションされた（図6f）。TanjilG_12861遺伝子の相対発現は、接種された83A:476で最も高かった（0.14±0.01）。17.4 kDaクラスI熱ショックタンパク質遺伝子TanjilG_05080 HSP17.4は、調査したすべての系統と時点において相対発現レベルが低かった（図6g）。最高値は22660集団で24 HPIに観察された（0.14±0.02、ワクチン接種に応答して8倍増加）。
遺伝子発現プロファイルの比較（図 7）から、TanjilG_10657 と他の 4 つの遺伝子、TanjilG_27015 (r = 0.89)、TanjilG_05080 (r = 0.85)、TanjilG_05042 (r = 0.80)、および TanjilG_04706 (r = 0.79) との間に高い相関関係があることが明らかになった。このような結果は、防御応答中にこれらの遺伝子が共調節されていることを示唆している可能性がある。TanjilG_12861 および TanjilG_23384 遺伝子は、他の遺伝子と比較してピアソン相関係数の値が低く（それぞれ 0.08 ～ 0.43 および -0.19 ～ 0.28）、異なる発現プロファイルを示した。
定量PCRを用いて遺伝子発現プロファイル間の相関を検出した。分析対象としたナローリーフ・ルピナスの系統は以下のとおりである：83A:476（耐性、ホモ接合型Lanr1対立遺伝子保有）、Mandelup（中程度の耐性、ホモ接合型AnMan対立遺伝子保有）、Boregine（耐性、遺伝的背景不明）、およびPopulation 22660（感受性）。接種後6、12、24時間の3つの時点を算出し、接種植物（Colletotrichum lupini、Col-08株、1999年にポーランドのヴィエルジェニツェのルピナス畑から入手）と対照植物（偽接種）を含めた。スケールはピアソン相関係数の値を示す。
1インチあたり6馬力で得られたデータに基づき、接種植物と対照植物を比較して同定された9981個のDEGに対してWGCNAを実行し、初期防御応答に焦点を当てた（補足表S12）。遺伝子型と実験的変異体の間で相関（正または負）発現プロファイルを持つ22個の遺伝子モジュール（クラスター）が見つかった。 平均すると、遺伝子発現レベルは83A:476 > マンデルアップ > ボレジン > 集団22660の順に低下していた（ただし、どちらの変異体においても、この傾向は対照植物でより顕著であった）。 平均すると、遺伝子発現レベルは83A:476 > マンデルアップ > ボレジン > 集団22660の順に低下していた（ただし、どちらの変異体においても、この傾向は対照植物でより顕著であった）。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (в обоих вариантах, однако, эта) тенденция была сильнее у контрольных растений)。 平均すると、遺伝子発現レベルは83A:476 > マンデルップ > ボレジン > 集団22660の順に減少した（ただし、どちらの変異体においても、この傾向は対照植物でより顕著であった）。平均すると、遺伝子発現レベルは、83A:476 > マンデラップ > ボレジン > 集団 22660 の順に減少した(ただし、この傾向は、2 つの個体において、対照植物においてより顕著であった)。平均すると、遺伝子レベルは 83a:476 > マンデルアップ > ボレジン > 集団 22660 の順序で降下します (植物中ではさらに)。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (однако в обоих вариантах эта) тенденция была сильнее у контрольных растений)。 平均すると、遺伝子発現レベルは83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660の順に低下した（ただし、両方の変異体において、この傾向は対照植物でより顕著であった）。ワクチン接種により、特にモジュール 18、19、14、6、1 (効果の降順) で遺伝子発現が上方制御され、負の制御 ​​(モジュール 9 および 20 など) または中立的な効果 (モジュール 11、22、8、13 など) が見られました。GO 用語濃縮分析 (補足表 S13) では、qPCR で分析された遺伝子 (TanjilG_04706、TanjilG_23384、TanjilG_10657、TanjilG_27015) を含む、最大活性化の接種モジュール (18) に対して「GO: 0006952 保護応答」が明らかになり、接種によって最も抑制された光合成モジュール (9) の多くも含まれていました。モジュール 18 の濃縮器 (図 8) は、PR-10 様 LlR18B タンパク質をコードする TanjilG_26536 遺伝子として同定され、モジュール 9 の濃縮器は、光化学系 II PsbQ タンパク質をコードする TanjilG_28955 遺伝子として同定された。炭疽病耐性候補遺伝子 Lanr1、TanjilG_05042 はモジュール 22 (図 9) で見つかり、TanjilG_01212 ハブを持つ「GO:0044260 細胞高分子代謝プロセス」および「GO:0006355 転写調節、DNA 鋳型形成」の用語に関連付けられている。この遺伝子は、熱ストレス転写因子 A-4a (HSFA4a) をコードしている。
過剰に表現された生物学的プロセス用語「GO: 0006952 防御応答」を持つモジュールの遺伝子共発現の加重ネットワーク解析。qPCRで解析された4つの遺伝子（TanjilG_04706、TanjilG_23384、TanjilG_10657、TanjilG_27015）を強調するために、連結が簡略化されました。
過剰に表現された生物学的プロセス用語「GO: 0006355: 転写調節、DNAテンプレート形成」を持つモジュールの遺伝子共発現の加重ネットワーク解析を行い、炭疽病耐性候補遺伝子Lanr1 TanjilG_05042を保有するモジュールを解析した。ライゲーションを簡略化し、TanjilG_05042遺伝子と中央のTanjilG_01212遺伝子を単離した。
オーストラリアで収集された炭疽病耐性スクリーニングの結果、初期にリリースされた品種のほとんどが感受性であることが示されました。Kalya、Coromup、Mandelupは中程度の耐性があるとされ、Wonga、Tanjil、83A:476は高い耐性があるとされています26,27,31。 は、Lanr1と指定された同じ耐性アレルを持ち、CoromupとMandelupはAnMan10、26、39と指定された異なるアレルを持ち、Kalyaは異なるアレルを伝達しました。 、Lanr2。ドイツでの炭疽病耐性スクリーニングの結果、Lanr1以外の候補アレルを持つ耐性系統Bo7212が特定され、LanrBo36と指定されました。
私たちの研究では、検査した遺伝資源における Lanr1 アレル頻度が非常に低い（約 6%）ことが明らかになりました。この観察結果は、Anseq3 および Anseq4 マーカーを使用して東ヨーロッパの遺伝資源をスクリーニングした結果と一致しており、Lanr1 アレルはベラルーシの 2 系統にのみ存在することが示されています。これは、Lanr1 アレルがオーストラリアとは異なり、現地の育種プログラムではまだ広く使用されていないことを示唆しています。オーストラリアでは、Lanr1 アレルはマーカー支援育種の重要なアレルの 1 つです。これは、オーストラリアの報告と比較して、ヨーロッパの圃場条件では Lanr1 アレルによって提供される抵抗性のレベルが低いことが原因である可能性があります。さらに、オーストラリアの降雨量の多い地域での炭疽病の研究では、Lanr1 アレルによって媒介される抵抗性反応は、病原体の生育と急速な発達を促進する気象条件下では効果的ではない可能性があることが示されています 19,42。実際、本研究では、Lanr1アレルを持つ遺伝子型でも炭疽病の症状がいくつか観察されており、C. lupiniの発育に最適な条件下では抵抗性が消失する可能性があることが示唆されている。さらに、Lanr1遺伝子座から約1 cM離れたAnseq3およびAnseq4マーカーの存在について偽陽性の解釈が生じる可能性がある28,30,43。
私たちの研究では、Lanr1 アレルを持つ 83A:476 は、最初の解析時点 (6 hpi) で大規模なトランスクリプトーム再プログラミングによって C. lupini 接種に応答したのに対し、AnMan アレルを持つ Mandelup では、トランスクリプトーム応答ははるかに遅れて (24 ～ 48 hp) 観察されたことが示されました。防御応答のこれらの時間的変動は、病気の症状の違いと関連しており、抵抗性に対する応答を成功させるためには、病原体の早期認識が重要であることを強調しています。植物組織に感染するために、炭疽菌胞子は、発芽、細胞分裂、付着器の形成など、宿主表面でいくつかの発達段階を経る必要があります。付属器は、宿主の表面に付着し、宿主組織への侵入を容易にする感染構造です。このように、エンドウ豆抽出物中の C. gloeosporioides の胞子は、75～90 分の培養後に核の最初の分裂を示し、90～120 分の培養後に発芽管が形成され、4 時間後に抑制された 45。マンゴー C. gloeosporioides は、3 時間の培養後に 40% 以上の分生子発芽を示し、4 時間後に約 20% の付着器の形成を示した。C. gloeosporioides の病原性関連 CAP20 遺伝子は、4 時間後に高濃度の CAP20 タンパク質を含むアボカド表面ワックス中で 3.5 時間培養した後、着生形成分生子で転写活性を示した 46。同様に、C. trifolii のメラニン生合成遺伝子の活性は、2 時間の培養中に誘導され、1 時間後に付着器が形成された。葉組織の研究では、C. acutatum を接種したイチゴでは 8 hpi で最初の抑制が見られ、C. coccodes を接種したトマトでは 4 hpi で最初の抑制が見られることが示されています 48,49。これは、Colletotrichum spp. の感染プロセスの時間スケールとほぼ一致しています。83A:476 に対する迅速な防御反応は、この系統における植物抵抗性とエフェクター誘発免疫 (ETI) 遺伝子の関与を示唆していますが、Mandelup の遅延反応は、マイクロ関連分子パターン誘発免疫 (MTI) 仮説を支持しています 50。83A:476 と Mandelup に対する初期反応。遅延反応におけるアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされた遺伝子の部分的な重複もこの概念を支持しています。ETI は、感染部位でのプログラム細胞死 (アナフィラキシーショックとして知られる) で最高潮に達する加速および強化された MTI 反応であるとよく考えられているためです 51,52。
過剰に表現された用語 Gene Ontology GO:0006952「防御応答」に帰属する遺伝子のほとんどは、ストレス誘導性断食メッセージ 22 タンパク質 (SAM22 に類似) の 11 の相同体と 7 つの主要なラテックスタンパク質様タンパク質 (MLP) です。 類似タンパク質 31、34、43、および 423 は配列類似性を示しました。 SAM22 様遺伝子は、より長く持続する有意な活性化を示し、炭疽病耐性のレベルの増加を示しました (83A:476 および Boregine)。 しかし、MLP 様遺伝子は、候補耐性アレルを持つ系統 (6 hpi の 83A:476/Lanr1 および 24 hpi の Mandelup/AnMan) でのみダウンレギュレーションされました。注目すべきは、同定されたSAM22様ホモログはすべて約105kbの遺伝子クラスターに由来するのに対し、MLP様遺伝子はゲノムの異なる領域に由来するという点である。このようなSAM22様遺伝子の協調的な活性化は、以前に行ったNLLのDiaporthetoxica接種に対する抵抗性に関する研究でも確認されており、これらの遺伝子が防御応答の水平伝達に関与していることが示唆される。この結論は、SAM22様遺伝子が損傷やサリチル酸、真菌誘導物質、過酸化水素による処理に対して陽性反応を示すという報告によっても裏付けられている。
MLP様遺伝子は、多くの植物種において、細菌、ウイルス、病原性真菌感染を含む様々な非生物的および生物的ストレスに反応することが示されている55。植物と病原体間の特定の相互作用に対する反応の方向は、強く増加するもの（例えば、綿がVerticillium dahliaeに感染しているとき）から、著しく減少するもの（例えば、リンゴの木がAlternaria spp.に感染した後）まで多岐にわたる56,57。アボカドがF. niger感染に対して防御する際、およびリンゴの木がBotryosphaeria berengeriana f. cn. piricolaおよびAlternaria alternata（リンゴの病原型）に感染しているときに、MLP様423遺伝子の有意なダウンレギュレーションが観察されている58,59。さらに、MLP様423遺伝子を過剰発現するリンゴのカルスは、抵抗性関連遺伝子の発現が低く、真菌感染に対してより感受性が高かった59。 Fusarium oxysporum f に続いて、MLP 様 423 遺伝子も耐性インゲンマメ遺伝資源で抑制された。cn。インゲンマメ感染 60。
RNA-seq 研究で同定された PR-10 ファミリーの他のメンバーは、アップレギュレーションに応答した LlR18A および LlR18B 遺伝子、ならびに脂質輸送タンパク質 DIR1 のアップレギュレーション (1 遺伝子) またはダウンレギュレーション (3 遺伝子) された遺伝子でした。さらに、WGCNA は、ワクチン接種に非常に感受性が高く、いくつかの防御応答遺伝子を持つこのモジュールのハブとして LlR18B 遺伝子を強調しています。LlR18A および LlR18B 遺伝子は、病原性細菌に応答して黄色のルピナスの葉で、また D. toxica 接種後の NLL 茎で誘導されましたが、これらの遺伝子のイネ相同体である RSOsPR10 は、おそらくジャスモン酸シグナル伝達経路に関与する真菌感染によって急速に誘導されました 53,61, 62。DIR1 遺伝子は、全身獲得抵抗性 (SAR) の開始に必要な非特異的脂質輸送タンパク質をコードしています。防御反応の発達に伴い、DIR1タンパク質は感染部位から師管を通って遠隔器官に輸送され、SARを誘導する。興味深いことに、TanjilG_02313 DIR1遺伝子は、84A:476系統と集団22660の最初の時点で有意に誘導されたが、炭疽病抵抗性は84A:476系統でのみ正常に発達した。これは、残りの3つの相同遺伝子が6 hpiで83A:476系統でのみ接種に反応し、この反応が下方へ向けられていたことから、NLLにおけるDIR1遺伝子の機能分化を示している可能性がある。
本研究では、「GO:0055114 酸化還元プロセス」と呼ばれる生物学的プロセスに対応する最も一般的な構成要素は、シトクロムP450タンパク質、ペルオキシダーゼ、リノール酸9S-/13S-リポキシゲナーゼ、および1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸オキシダーゼであった。さらに、WGCNAでは、HSFA4aホモログが、Lanr1耐性遺伝子候補TanjilG_05042などのモジュールを運ぶハブとして定義されている。HSFA4aは、植物における核転写の酸化還元依存性制御の構成要素である。
シトクロムP450タンパク質は、一次および二次代謝においてNADPHおよび/またはO2依存性水酸化反応を触媒する酸化還元酵素であり、異物代謝、ホルモン、脂肪酸、ステロール、細胞壁成分、生体高分子、および保護化合物の生合成に関与している69。我々の研究では、植物シトクロムP450機能の変動は、多数の変異ホモログ（37）と特定の遺伝子間の応答パターンの違いにより、-10.6 log2（倍率変化）から5.7に減少しており、これは上方修正を反映している。このような大きなタンパク質スーパーファミリーにおけるNLL遺伝子の推定される生物学的機能を解明するためにRNA-seqデータのみを使用することは、非常に憶測的である。しかし、一部のシトクロムP450遺伝子は、アレルギー反応への寄与を含め、病原性真菌や細菌に対する抵抗性の増加と関連していることに留意する価値がある69,70,71。
クラス III ペルオキシダーゼは、植物の成長と発達中の幅広い代謝プロセス、および塩分、干ばつ、高光強度、病原菌の攻撃などの環境ストレスへの応答に関与する多機能植物酵素です 72。ペルオキシダーゼは、Stylosanthes humilis と C. gloeosporioides、Lens culinaris と C. truncatum、Phaseolus vulgaris と C. lindemuthianum、Cucumis sativus と C. lagenarium など、いくつかの植物種と炭疽菌との相互作用に関与しています 73,74,75,76。応答は非常に速く、菌が植物組織に侵入する前の 4 HPI でさえ応答することがあります 73。ペルオキシダーゼ遺伝子は D. toxica NLL 接種にも応答しました。ペルオキシダーゼは、酸化バーストの調節や酸化ストレスの除去といった典型的な機能に加えて、リグニン化、サブユニット形成、または特定の化合物の架橋による細胞壁の強化に基づく物理的障壁を形成することで、病原体の増殖を阻害する可能性がある。この機能は、推定リグニン形成アニオンペルオキシダーゼをコードするTanjilG_03329遺伝子に起因すると考えられる。この遺伝子は、本研究において、83A:476耐性株で感染後6時間（6 HPI）に有意に発現上昇したが、他の株や反応を示さなかった時点では発現上昇は見られなかった。
リノール酸の9S-/13S-リポキシゲナーゼは、脂質生合成の酸化経路の最初のステップである78。この経路の産物は、カロースとペクチン沈着物の形成による細胞壁の強化、活性酸素種の生成による酸化ストレスの調節など、植物の防御において複数の機能を持つ79,80,81,82,83。本研究では、リノール酸9S-/13S-リポキシゲナーゼの発現はすべての株で変化したが、感受性集団22660では、異なる時点で上方制御が優勢であったのに対し、耐性Lanr1とAnMan対立遺伝子を持つ株では、これらの遺伝子型間の保護炭疽反応におけるオキシリピン層の多様性が強調された。
1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸オキシダーゼ（ACO）ホモログは、ルピナスを接種すると有意に上方制御（9遺伝子）または下方制御（2遺伝子）された。2つの例外を除いて、これらの応答はすべて6 hpで発生した。83A:476。ACOタンパク質によって媒介される酵素反応はエチレン生成の律速段階であり、したがって高度に制御されている84。エチレンは、植物の発達と非生物的および生物的ストレス条件への応答を調節するさまざまな役割を果たす植物ホルモンである。ACO転写の誘導とエチレンシグナル伝達経路の活性化は、活性酸素種とフィトアレキシンの生成を調節することにより、イネの半生体栄養性真菌であるoryzae oryzaeに対する抵抗性を高めることに関与している。本研究で報告された83A:476系統におけるACOホモログの有意な上方制御を背景に、M. oryzaeとC. lupini88,89の間で非常に類似した葉の感染プロセスが発見され、NLL炭疽病に対する耐性を付与する可能性が分子経路のシグナル伝達の中心的なステップであるエチレンに変化した。
本研究では、83A:476では感染後6時間、Mandeloopおよび22660集団では感染後48時間で、光合成に関連する多くの遺伝子の大規模な抑制が観察された。これらの変化の程度と進行は、レベルに比例する。この実験では炭疽病耐性が観察された。最近、病原性細菌や真菌を含む植物病原体相互作用のいくつかのモデルで、光合成関連転写産物の強力かつ早期の抑制が報告されている。感染に対する光合成関連遺伝子の迅速な（一部の相互作用では感染後2時間から）全体的な抑制は、活性酸素種の展開とサリチル酸経路との相互作用に基づいて植物の免疫を誘発し、アレルギー反応を媒介する可能性がある90,94。
結論として、最も耐性のある系統（83A:476）に提案されている防御応答メカニズムには、R遺伝子（おそらくTIR-NBS-LRR TanjilG_05042）による迅速な病原体認識と、アレルギー反応を介したサリチル酸とエチレンのシグナル伝達、それに続く長距離SARの確立が含まれます。作用はDIR-1タンパク質によってサポートされています。C. lupini感染の生物栄養期は非常に短く（約2日間）、その後壊死成長が続くことに注意する必要があります95。これらの段階間の移行は、壊死と、宿主植物の過敏性反応の引き金となるエチレン誘導性タンパク質の発現に関連している可能性があります。したがって、生物栄養期にC. lupiniをうまく捕獲できる時間枠は非常に狭いです。 83A:476株で感染後6時間目に観察された酸化還元反応および光合成に関連する遺伝子の再プログラミングは、菌糸の伸長と一致しており、生物栄養段階における効果的な防御応答の発達を予兆している。マンデルップ株および22660株のトランスクリプトーム応答は、菌が壊死性増殖に移行する前に捕捉するには遅すぎる可能性があるが、PR-10タンパク質の比較的速い調節が水平抵抗性を促進するため、マンデルップ株は22660株よりも効果的である可能性がある。
標準的なR遺伝子によって駆動されるETIは、インゲンマメの炭疽病抵抗性の一般的なメカニズムであると考えられる。そのため、モデルマメ科植物であるMedicago truncatulaでは、炭疽病抵抗性はTIR-NBS-LRR97植物R遺伝子クラスに属するRCT1遺伝子によって付与される。この遺伝子は、感受性植物に導入すると、アルファルファにも広範囲の炭疽病抵抗性を付与する。インゲンマメ（P. vulgaris）では、これまでに20個以上の炭疽病抵抗性遺伝子が同定されている。これらの遺伝子の中には、標準的なR遺伝子が存在しない領域に存在するものもあるが、多くはTIR-NBS-LRRs99を含むNBS-LRR遺伝子クラスターを持つ染色体の端に位置している。ゲノムワイドSSR研究でも、インゲンマメの炭疽病抵抗性とNBS-LRR遺伝子の関連性が確認されている。典型的なR遺伝子は、シロバナルピナス101の主要な炭疽病抵抗性遺伝子座を含むゲノム領域にも見出された。
私たちの研究は、植物感染の初期段階（できれば感染後12時間以内）に活性化される即時抵抗反応が、病原菌Collelotrichum lupiniによって引き起こされる炭疽病から狭葉ルピナスを効果的に保護することを示しています。ハイスループットシーケンスを使用して、Lanr1およびAnMan抵抗遺伝子によって媒介されるNLL植物の炭疽病抵抗遺伝子の異なる発現プロファイルを示しました。効果的な防御には、植物が病原体と最初に接触してから数時間以内に、酸化還元、光合成、および病原性に関与するタンパク質の遺伝子を慎重に設計することが必要です。同様の保護反応でも、時間が遅れると、植物を病気から保護する効果ははるかに低くなります。Lanr1遺伝子によって媒介される炭疽病抵抗性は、R遺伝子の典型的な迅速応答（エフェクター誘発免疫）に似ていますが、AnMan遺伝子はおそらく水平応答（微生物関連分子パターンによって誘発される免疫）を提供し、中程度のレベルの持続性を提供します。
炭疽病マーカーのスクリーニングに使用された 215 系統の NLL は、74 品種、交配または育種によって得られた 60 系統、5 変異体、および 76 野生または元の遺伝資源から構成されていました。これらの系統は 17 か国から来ており、主にポーランド (58)、スペイン (47)、ドイツ (27)、オーストラリア (26)、ロシア (19)、ベラルーシ (7)、イタリア (5) およびその他の 10 か国からの系統です。このセットには、参照抵抗性系統も含まれています。83A:476、Tanjil、Lanr1 アレルを持つ Wonga、および AnMan アレルを持つ Mandelup です。これらの系統は、ポーランドの Wiatrowo にある Poznań Plant Breeding Ltd. が管理する European Lupine Genetic Resource Database から入手しました (補足表 S1)。
植物は制御された条件下（日長16時間、昼間の温度25℃、夜間18℃）で栽培した。2つの生物学的複製を分析した。3週間前の葉から、DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen、ドイツ、ヒルデン）を使用してプロトコルに従ってDNAを抽出した。抽出したDNAの品質と濃度は、分光光度法（NanoDrop 2000、Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で評価した。炭疽病耐性遺伝子AnMan（品種Mandelup由来）を示すAnManM1マーカーと、遺伝子Lanr1（品種Tanjil由来）を挟むAnseq3およびAnseq4マーカーを分析した11,26,28。耐性アレルホモ接合体は「1」、感受性は「0」、ヘテロ接合体は0.5とスコアした。
マーカー AnManM1、AnSeq3、AnSeq4 のスクリーニング結果と最終フォローアップ実験用の種子の入手可能性に基づいて、炭疽病耐性表現型解析のために 50 系統の NLL が選抜された。解析は、日中 22 ℃、夜間 19 ℃ の温度範囲で 14 時間の日長を持つコンピューター制御温室で 2 回ずつ実施された。種子は、種皮が硬すぎるために休眠状態になるのを防ぎ、均一な発芽を確保するために、播種前に傷をつける (鋭利な刃で胚の反対側の種皮を切り取る)。植物は、滅菌土壌 (TS-1 REC 085 Medium Basic、Klasmann-Deilmann Polska、ワルシャワ、ポーランド) を入れた鉢 (11 × 11 × 21 cm) で栽培された。接種は、1999 年に大ポーランドのヴェルジェニツァ (北緯 52° 27′ 42″、東経 17° 04′ 05″) の畑で栽培された狭葉ルピナス植物の茎から培養された Colletotrichum lupini Col-08 株を用いて行われた。 分離株は、胞子形成を誘導するために、20 ° C で SNA 培地で 21 日間、ブラックライトの下で培養された。播種から 4 週間後、植物が 4〜6 葉の段階に達したときに、0.5 x 10⁶ 個/ ml の濃度の分生子懸濁液を噴霧して接種を行った。接種後、植物は、分生子の発芽と感染プロセスを促進するために、湿度約 98%、温度 25 ° C で 24 時間暗所に置かれた。その後、植物は14時間の日長、昼間22℃/夜間19℃、湿度70%の条件下で栽培された。接種後22日目に病害スコアが付けられ、茎や葉の壊死病斑の有無に応じて0（免疫）から9（非常に感受性が高い）の範囲で評価された。さらに、スコア付け後、植物の重量が測定された。マーカー遺伝子型と病害表現型との関係は、点2シーケンス相関（炭疽病抵抗性表現型の解析に用いる系統群にヘテロ接合マーカーが存在しない）として計算された。