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ルピナス（NLL、Lupinus angustifolius L.）は、食料生産や土壌改良に用いられるマメ科植物です。作物としてのNLLの世界的拡大は、壊滅的な炭疽病を引き起こすルピナス炭疽病など、多くの病原菌を引きつけています。耐性を高める2つの対立遺伝子、Lanr1とAnManがNLL育種に使用されていますが、その根底にある分子メカニズムは依然として不明です。本研究では、Lanr1およびAnManマーカーを用いて、欧州のNLLサンプルをスクリーニングしました。管理された環境でのワクチン試験により、両方の耐性ドナーの有効性が確認されました。代表的な耐性および感受性系統で、差次的遺伝子発現プロファイリングを実施しました。炭疽病耐性は、遺伝子オントロジー用語「GO:0006952 防御応答」、「GO:0055114 酸化還元プロセス」、および「GO:0015979 光合成」の過剰発現と関連していました。さらに、Lanr1(83A:476)株は接種後速やかに顕著なトランスクリプトームリプログラミングを示したのに対し、他の株ではこの反応が約42時間遅れて現れた。防御反応は、TIR-NBS、CC-NBS-LRR、NBS-LRR遺伝子、病原性に関わる10種類のタンパク質、脂質輸送タンパク質、エンドグルカン-1,3-β-グルコシダーゼ、グリシンに富む細胞壁タンパク質、そして酸素の反応経路に関わる遺伝子と関連している。83A:476に対する初期の反応、特に光合成関連遺伝子の慎重な抑制は、真菌の栄養成長期における防御効果と一致しており、これはエフェクターが免疫を誘発することを示唆している。マンデループ反応は、全体的な水平抵抗と同様に遅くなる。
狭葉ルピナス（NLL、Lupinus angustifolius L.）は、地中海西部原産の高タンパク穀物です1,2。現在では、動物や人間の食用作物として栽培されています。また、共生窒素固定細菌による窒素固定と土壌構造の改善効果により、輪作体系における緑肥としても利用されています。NLLは、前世紀に急速に栽培化が進み、現在も高い繁殖圧力にさらされています3,4,5,6,7,8,9,10,11,12。NLLの栽培が広まるにつれ、病原菌の連鎖が新たな農業ニッチを生み出し、新たな作物破壊をもたらす病気を引き起こしています。 ルピナスの農家や育種家にとって最も注目すべきことは、病原菌 Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg、Feiler、Hagedorn13 によって引き起こされる炭疽病の出現でした。 ルピナスの農家や育種家にとって最も注目すべきことは、病原菌 Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg、Feiler、Hagedorn13 によって引き起こされる炭疽病の出現でした。 Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогенным Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg、Feiler & Hagesorn13. ルピナスの農家や育種家にとって最も注目されたのは、病原菌 Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg、Feiler、Hagedorn13 によって引き起こされる炭疽病の発生でした。羽扇豆類およびハゲドーンに関して最も注目すべきは、病原菌コレトトリクム・ルピニ（ボンダール）・ニーレンバーグ、フェイラーおよびハーゲドーンによって引き起こされる炭疽病の発生である13。羽扇豆類およびハイヤードに関して最も注目されるのは、病原菌コレトトリクム・ルピニ（ボンダール）による炭疽病の発生である。 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg、Feiler & Hagesorn13. ルピナスの農家や育種家にとって最も衝撃的なのは、病原菌 Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg、Feiler、Hagedorn13 によって引き起こされる炭疽病の発生です。この病気に関する最初の報告はブラジルとアメリカ合衆国から出ており、典型的な症状はそれぞれ1912年と1929年に現れました。しかし、約30年後、病原体はColletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penzと命名されました。 ＆ Sacc.、テレオモルフ Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. ＆ Sacc.、テレオモルフ Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.、телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.、Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld の終末型。 & Sacc.、目的の形の Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.、目的の形の Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.、Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии。 & Sacc.、Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld、「Targeted Morphology」に掲載。 ＆H.シュレンク。 ＆H.シュレンク、。および H. シュレンク。 & H.エピック、。 & H.エピック、。および H. Schlenk、.20世紀半ばに行われた予備的な病気の表現型解析では、NLLおよび黄色ルピナス（L. luteus L.）系統に若干の耐性が見られましたが、検査された白色ルピナス（L. albus L.）系統はすべて非常に感受性が高かった15,16。研究では、炭疽病の発生は降水量（空気中の湿度）の増加および気温（12～28℃の範囲）と関連​​しており、高温では耐性が損なわれることが示されています17, 18。実際、分生子が発芽して病気が始まるのに必要な時間は、高湿度条件下では24℃（4時間）の方が12℃（16時間）の4分の1でした19。したがって、進行中の地球温暖化が炭疽病の蔓延につながっています。しかし、この病気はフランス (1982 年) とウクライナ (1983 年) で差し迫った脅威の前兆として観察されていたが、当時ルピナス業界では明らかに無視されていた20,21。数年後、この壊滅的な病気は世界中に広がり、オーストラリア、ポーランド、ドイツなどの主要なルピナス生産国にも影響を及ぼしました22,23,24。1990 年代半ばの炭疽病の発生後、広範囲にわたるスクリーニングの結果、NLL19 サンプルで複数の耐性ドナーが特定されました。炭疽病に対する NLL 耐性は、異なる遺伝資源ソースで見つかった 2 つの別々の優性対立遺伝子によって制御されています。栽培品種 Tanjil および Wonga の Lanr1 と栽培品種 Mandalay の AnMan です25, 26。これらの対立遺伝子は、育種プログラムで耐性遺伝資源の選択をサポートする分子マーカーを補完します25,26,27,28,29,30。 Lanr1対立遺伝子を持つ耐性育種系統83A:476を感受性野生系統P27255と交配して、炭疽病耐性について分離したRIL集団を取得し、これによりLanr1遺伝子座を染色体NLL-11に割り当てることが可能になった31, 32, 33。炭疽病の隣接する耐性遺伝子座からの連鎖地図マーカーをゲノムフレームワークにアライメントした結果、3つの対立遺伝子すべてが同じ染色体（NLL-11）上にあるが異なる位置にあることが明らかになった29,34,35。しかし、RILの数が少なく、マーカーと対応する対立遺伝子間の遺伝的距離が大きいため、それらの基礎となる遺伝子について信頼できる結論を導き出すことはできません。一方、ルピナスは再生能力が非常に低いため逆遺伝学の使用が難しく、遺伝子操作が煩雑になる37。
83A:476 (Lanr1) や Mandelup (AnMan) といった、目的の対立遺伝子をホモ接合状態で有する栽培化遺伝資源の開発により、野生個体群における対立遺伝子の相反する組み合わせの存在下での炭疽病抵抗性の研究が可能になった。分子メカニズムの可能性。特定の遺伝子型によって生成される防御反応を比較する。本研究では、C. lupini ワクチン接種に対する NLL の初期トランスクリプトーム反応を評価した。まず、215 系統を含む欧州 NLL 遺伝資源パネルを、Lanr1 および AnMan 対立遺伝子を標識する分子マーカーを用いてスクリーニングした。次に、分子マーカーに基づいて事前に選抜された 50 系統の NLL 系統を用いて、管理された条件下で炭疽病の表現型解析を行った。これらの実験に基づいて、炭疽病耐性と Lanr1/AnMan 対立遺伝子構成が異なる 4 つの系統が選択され、2 つの相補的アプローチ (ハイスループット RNA シーケンシングとリアルタイム PCR 定量化) を使用して、差別的防御遺伝子発現プロファイリングが行われました。
NLL遺伝資源セット（N = 215）をマーカー Lanr1（Anseq3 と Anseq4）、AnMan（Anseq4）および AnMan（AnManM1）でスクリーニングしたところ、1 つのライン（95726、Salamanca-b 付近）のみがすべてのマーカーの「耐性」アレルを増幅することがわかりました。一方、「「感受性」アレルの存在」では、158 ライン（約 73.5 %）ですべてのマーカーの割合がわかりました。13 ラインが Lanr1 マーカーの 2 つの「耐性」アレルを生成し、8 ラインが Lanr1 の「耐性」アレルを生成しました。マーカー。AnMan マーカーの「耐性」アレル（補足表 S1）。2 つのラインは Anseq3 マーカーに対してヘテロ接合性であり、1 つのラインは AnManM1 マーカーに対してヘテロ接合性でした。 42系統（19.5%）がAnseq3およびAnseq4アレルの逆位相を有しており、これら2つの遺伝子座間の組換え頻度が高いことを示しています。管理された条件下での炭疽病の表現型（補足表S2）では、試験した遺伝子型の抵抗性にばらつきがあり、それが炭疽病の重症度に反映されていました。平均スコアの差は1.8（中等度抵抗性）から6.9（感受性）まで、植物重量の差は0.62（感受性）から4.45g（抵抗性）まででした。 実験を2回繰り返して観測された値（病気の重症度スコアでは0.51、P = 0.00017、植物重量では0.61、P < 0.0001）間、およびこれら2つのパラメータ間（−0.59および−0.77、P < 0.0001）には有意な相関関係があった。 実験を2回繰り返して観測された値（病気の重症度スコアでは0.51、P = 0.00017、植物重量では0.61、P < 0.0001）間、およびこれら2つのパラメータ（−0.59および−0.77、P < 0.0001）間には有意な相関関係がありました。 Выявлена достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для) баллов тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) 0,0001)。 実験を2回繰り返して観測された値（病気の重症度スコアの場合は0.51、P = 0.00017、植物の重量の場合は0.61、P < 0.0001）間、およびこれら2つのパラメーター（-0.59と-0.77、P < 0.0001）間には有意な相関関係が見られました。2 回の反復実験で観察された値の間には、関連性 (疾患の重度の分別は 0.51、P = 0.00017、植物は 0.61、P < 0.0001) およびこの 2 つのパラメータの間 (- 0.59 と- 0.77、P < 0.0001)。2 回の反復実験中に観察された値の間には相関性が存在します (疾患の重さの認定分数は 0.51 、p = 0.00017、植物は 0.61、p <0.0001) および 2パラメータ間の（（（- 0.59 および – 0.59 および – 0.59 および – 0.59 および – 0.77、P < 0.0001）。 Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести) заболевания 0,51, P = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001。 2回観測された値（病気の重症度スコア0.51、P = 0.00017および植物重量0.61、P < 0.0001）間およびこれら2つのパラメータ（-0.59および-0.0001）間の0.77、P <0.0001に有意な相関関係がありました。 ).感受性植物に見られる典型的な症状は、茎が「羊飼いの弓」のような構造にねじれ、その後、オレンジ色／ピンク色のスポロゾイトを伴う楕円形の病斑が現れることです（補足図1）。Lanr1（83A:476およびTanjil）遺伝子とAnMan（Mandelup）遺伝子を持つオーストラリア系統は、中程度の耐性を示し、それぞれ0.0331および0.0036です。「耐性」のLanr1および／またはAnManアレルを持つ一部の系統も、この病気の症状を示します。
興味深いことに、Boregine（両方のパラメータのP値<0.0001）、Bojar（スコアのP値<0.0001、植物重量のP値0.001）、Population B-549/79b（スコアのP値<0.0001、重量では有意差なし）など、いかなる「耐性」マーカー対立遺伝子も欠くいくつかのNLLラインは、炭疽病に対する高い耐性（Lanr1またはAnMan遺伝子型と同等かそれ以上）を示しました。 興味深いことに、Boregine（両方のパラメータのP値<0.0001）、Bojar（スコアのP値<0.0001、植物重量のP値0.001）、Population B-549/79b（スコアのP値<0.0001、重量では有意差なし）など、いかなる「耐性」マーカー対立遺伝子も欠くいくつかのNLLラインは、炭疽病に対する高い耐性（Lanr1またはAnMan遺伝子型と同等かそれ以上）を示しました。 Интересно, что несколько линий NLL, лизенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для) обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и популяции B-549/79b (значение P) <0,0001 日 оценки и незначимо для массы)。 興味深いことに、Boregine (両方のパラメータで P 値 < 0.0001)、Bojar (評価で P 値 < 0.0001、植物重量で 0.001)、および集団 B-549/79b (評価で P 値 < 0.0001、重量では有意ではない) など、'耐性' マーカー対立遺伝子をまったく持たないいくつかの NLL ラインは、炭疽病に対して高いレベルの耐性 (Lanr1 または AnMan 遺伝子型と同等かそれ以上) を示しました。興味深いことに、Boregine（2 つのパラメータの P 値 < 0.0001）、Bojar（P値＜得分値０．０００１、植物重量０．００１）および群Ｂ－５４９／７９ｂ（得分Ｐ値＜０．０００１、重量不着）。 興味深いことに、Boregine（両方のパラメータ P < 0.0001）、Bojar（P 値 < 0.0001、植物重量 0.001）、および株 B-549/79b（P 値 < 0.0001、重量は有意ではない）など、一部の NLL システムには「抗原」マーカーがまったくなく、高い水平抵抗（Lanr1 または AnMan 遺伝子と同等かそれ以上）を示すものもあります。 Интересно、что некоторые линии NLL、лизенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности»、показали высокие уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выbolе, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих) <0,0001)、ボジャール (значение P <0,0001, масса растения 0,001) と популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна)。 興味深いことに、Boregine (両方のパラメータの P 値 <0.0001)、Bojar (P 値 < 0.0001、植物重量 0.001)、および集団 B-549/79b (P 値 < 0.0001、重量は有意ではない) など、'耐性' マーカー対立遺伝子をまったく持たない一部の NLL ラインは、炭疽病耐性のレベルが高い (Lanr1 または AnMan 遺伝子型と同等かそれ以上) ことが示されました。この現象は、耐性の新たな遺伝的源の可能性を示唆しており、マーカー遺伝子型と病態表現型の間に相関が見られないこと（P値：約0.42～約0.98）を説明しています。コルモゴロフ・スミルノフ検定の結果、炭疽病耐性に関するデータは、スコア（P値：0.25および0.11）および植物質量（P値：0.47および0.55）に関してほぼ正規分布していることが示され、Lanr1およびAnMan以外のアレルが関与している可能性を示唆しています。
炭疽病耐性スクリーニングの結果に基づき、83A:476、Boregine、Mandelup、およびPopulation 22660の4つの系統がトランスクリプトーム解析のために選択されました。これらの系統は、前回の試験と同じであることを条件に、RNAシーケンシングによる接種実験で炭疽病耐性について再試験されました。スコア値は以下のとおりでした：Boregin（1.71 ± 1.39）、83A:476（2.09 ± 1.38）、Mandelup（3.82 ± 1.42）、およびpopulation 22660（6.11 ± 1.29）。
Illumina NovaSeq 6000プロトコルでは、サンプルあたり平均40.5 Mreadペア（29.7～54.4 Mread）を達成しました（補足表S3）。参照配列のアライメントスコアは75.5%～88.6%の範囲でした。実験的変異体間のリードカウントデータの平均相関は0.812～0.997（平均0.959）の範囲でした。 分析された 35,170 個の遺伝子のうち、2,917 個は発現が見られず、その他の 4,785 個の遺伝子はごくわずかなレベル (塩基平均 < 5) で発現していました。 分析された 35,170 個の遺伝子のうち、2,917 個は発現が見られず、その他の 4,785 個の遺伝子はごくわずかなレベル (塩基平均 < 5) で発現していました。 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5)。 分析された 35,170 個の遺伝子のうち、2,917 個は発現を示さず、残りの 4,785 個の遺伝子はごくわずかなレベル（基本平均 <5）で発現していました。分析された35,170個の遺伝子のうち、2917個は発現がなく、他の4785個の遺伝子の発現はわずかに観察されなかった（基本平均値<5）。35,170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительную экспрессию (базовое среднее значение <5)。 分析された 35,170 個の遺伝子のうち、2,917 個は発現せず、残りの 4,785 個の遺伝子はごくわずかな発現しか示しませんでした (塩基平均 <5)。したがって、実験中に発現したと考えられる遺伝子の数は（基本平均≥5）、27,468（78.1％）であった（補足表S4）。
最初の時点から、すべての NLL ラインは C. lupini (Col-08 株) の接種に応答してトランスクリプトームをリプログラミングしましたが (表 1)、ライン間で有意差が見られました。たとえば、耐性ライン 83A:476 (Lanr1 遺伝子を持つ) は、最初の時点 (6 hpi) で有意なトランスクリプトーム リプログラミングを示し、この時点では他の時点と比較して、孤立したアップ遺伝子とダウン遺伝子の数が 31～69 倍増加しました。さらに、このピークは短命で、2 番目の時点 (12 hpi) で有意に変化した遺伝子は少数のままでした。興味深いことに、接ぎ木テストでも高いレベルの耐性を示した Boregine は、実験中にこれほど大規模な転写リプログラミングを受けませんでした。ただし、12 HPI での差次的発現遺伝子 (DEG) の数マンデラップと個体群 22660 は両方とも、最後の時点 (48 l/s) で DEG ピークを示しており、防御反応の相対的な遅延を示しています。
83A:476は、他のすべての系統と比較して、6HPIでC. lupiniに対する大規模なトランスクリプトームリプログラミングを受けたため、この時点で観察されたDEGの約91%が系統特異的でした（図1）。しかし、研究対象系統間では初期反応に若干の重複が見られ、Boregine、Mandelup、および集団22660ではそれぞれ68.5%、50.9%、52.6%のDEGが、特定の時点で83A:476で検出されたDEGと重複していました。しかし、これらのDEGは、現在83A:476を用いて検出されている全DEGのごく一部（0.97～1.70%）に過ぎませんでした。さらに、この時点ではすべての系統からの 11 個の DEG が一貫性があり (補足表 S4 ～ S6)、植物防御反応の共通成分である脂質転送タンパク質 (TanjilG_32225)、エンドグルカン-1,3-β-グルコシド酵素 (TanjilG_23384)、SAM22 のような 2 つのストレス誘導性タンパク質 (TanjilG_31528 および TanjilG_31531)、塩基性ラテックスタンパク質 (TanjilG_32352)、および 2 つのグリシンに富む構造細胞壁タンパク質 (TanjilG_19701 および TanjilG_19702) が含まれていました。また、24 HPI での 83A:476 と Boregine の間 (合計 16-38% DEG)、および 48 HPI での Mandelup と Population 22660 の間 (合計 14-20% DEG) のトランスクリプトーム応答にも比較的高い重複が見られました。
Colletotrichum lupini（1999年にポーランド、ヴィェルジェニツェのルピナス畑から採取されたCol-08株）を接種した狭葉ルピナス（NLL）系統における遺伝子発現差（DEG）の数を示すベン図。分析対象としたNLL系統は、83A:476（耐性、Lanr1アレル保有）、Boregine（耐性、遺伝的背景不明）、Mandelup（中等度耐性、AnManアレル保有）、および集団22660（非常に感受性が高い）である。略語hpiはワクチン接種後の時間を表す。グラフを簡略化するため、ゼロ値は削除されている。
感染後6時間で過剰発現した遺伝子セットについて、標準的なR遺伝子ドメインの存在について解析した（補足表S7）。本研究では、83A:476にのみNBS-LRRドメインを持つ典型的な病害抵抗性遺伝子のトランスクリプトーム誘導が明らかになった。このセットは、TIR-NBS-LRR遺伝子1個（tanjilg_05042）、CC-NBS-LRR遺伝子5個（tanjilg_06165、tanjilg_06162、tanjilg_22773、tanjilg_22640、tanjilg_16162）、NBS-LR遺伝子4個（tanjilg_16162）、NBS-LRRE遺伝子4個（tanjilg_16162）、NBS-Lrr遺伝子4個（tanjilg_16162）、NBS-LRR遺伝子4個（TANJILG_16162）で構成されていた。これらの遺伝子はすべて、保存された配列に配置された標準ドメインを有しています。NBS-LRRドメイン遺伝子に加えて、6hpiで複数のRLLキナーゼが活性化されました。具体的には、Boregineで1つ（TanjilG_19877）、Mandelupで2つ（TanjilG_07141およびTanjilG_19877）、集団22660で2つ（TanjilG_09014およびTanjilG_10361）、そして83A 27:476で2つです。
C. lupini (株 Col-08) の接種に応じて発現が著しく変化した遺伝子について、遺伝子オントロジー (GO) エンリッチメント解析を行いました (補足表 S8)。 最も頻繁に過剰表現された生物学的プロセス用語は「GO:0006952 防御応答」であり、16 個の組み合わせ（時間 × 行）のうち 6 個に高い有意性（P 値 < 0.001）で出現しました（図 2）。 最も頻繁に過剰表現された生物学的プロセス用語は「GO:0006952 防御応答」であり、16 個の組み合わせ（時間 × 行）のうち 6 個に高い有意性（P 値 < 0.001）で出現しました（図 2）。 Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2)。 最も頻繁に過剰表現された生物学的プロセス用語は「GO:0006952 防御応答」であり、16 個の組み合わせ (時間 × 系統) のうち 6 個に高い有意性 (P 値 < 0.001) で出現しました (図 2)。最も代表的な生体プロセスは「GO:0006952 防御反応」で、16 個（時間×直線）の組み合わせのうち 6 個に出現し、高い定着性（P 値 < 0.001）を示します（図 2）。 最も代表的な生物学的プロセス用語は「GO:0006952 防御反応」であり、16通りの組み合わせ（時間×線）のうち6通りで出現し、高い有意性（P値<0.001）を示しました（図2）。 Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», который появлялялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2)。 最も頻繁に過剰表現された生物学的プロセス用語は「GO:0006952 Defense Response」であり、16 の組み合わせ (時間 × 行) のうち 6 つに高い有意性 (P 値 < 0.001) で出現しました (図 2)。この用語は、83A:476とBoregineでは2つの時点（それぞれ6hpiと24hpi）、MandelupとPopulation 22660では1つの時点（それぞれ12hpiと6hpi）で過剰発現していました。これは予想通りの結果であり、耐性株の抗真菌反応を浮き彫りにしています。さらに、83A:476はC. lupiniに対して、「GO:0055114」という用語で表される酸化バーストに関連する遺伝子を急速に誘導することで反応し、特異的な防御反応を示しました。一方、Boregineは「GO」という用語に関連する特異的な防御反応を示しました。 :0006950 ストレス応答」。集団22660は、二次代謝産物を含む水平抵抗応答を活性化し、「GO:0016104 トリテルペン生合成プロセス」および「GO:0006722 トリテルペン代謝プロセス」（両方の用語は同じ遺伝子セットに属します）という用語の過剰な数をハイライトしました。GO用語エンリッチメント分析の結果を考慮すると、Mandelup反応の安定性は、Boregineと集団22660の間でした。さらに、初期反応83A:476（6 hpi）と遅延反応Mandelupおよび集団22660には、用語GO:0015979「光合成」およびその他の関連する生物学的プロセスが含まれています。
炭疽菌ルピナス（1999年にポーランドのヴィェルジェニツェのルピナス圃場から採取したCol-08株）を接種した狭葉ルピナス（NLL）のトランスクリプトーム応答中に発現差を示した遺伝子のアノテーションにおいて選択されたバイオプロセス遺伝子オントロジー用語は、大幅に誇張されている。解析対象となったNLL系統は、83A:476（耐性、ホモ接合型Lanr1アレルを有する）、Boregine（耐性、遺伝的背景不明）、Mandelup（中等度耐性、ホモ接合型AnManアレルを有する）、および集団22660（感受性）であった。
本研究は炭疽病抵抗性に寄与する遺伝子を同定することを目的としていたため、GO「GO: 0006952 防御反応」および「GO: 0055114 酸化還元プロセス」という用語に割り当てられた遺伝子は、ベースライン平均値が30以上で、かつ少なくとも1つのラインが存在する時点をカットオフとして解析しました。× 統計的に有意なlog2（変化倍率）値を組み合わせた時点。これらの基準を満たす遺伝子の数は、GO:0006952では65個、GO:0055114では524個でした。
83A:476は、GO:0006952という用語でアノテーションされた2つのDEGピークを明らかにしました。1つ目は1インチあたり6遺伝子（64遺伝子、アップレギュレーションとダウンレギュレーション）、2つ目は1インチあたり24遺伝子（15遺伝子、アップレギュレーションのみ）です。Boregineはまた、GO:0006952が同じ時点でピークに達しましたが、DEGは少なく（11と8）、優先的に活性化されていました。Mandeloopは、GO:0006952の12 HPIと48 HPIの2つのピークを示しました。どちらも12個の遺伝子を含んでおり（1つ目は活性化遺伝子、2つ目は抑制遺伝子のみ）、一方、6 HPIの22660集団（13遺伝子）は増加ピークがより顕著でした。これらのピークにおける GO:0006952 DEG の 96.4% が同じタイプの応答 (上昇または下降) を示し、関与する遺伝子の数に違いがあるにもかかわらず、防御応答がかなり重複していることが示されたことは注目すべきことである。 GO:0006952 という用語に関連する配列の最大のグループは、クラス 10 病原性関連タンパク質 (PR-10) タンパク質クレードおよびコアタンパク質ラテックスに属する、飢餓ストレス関連メッセージ タンパク質 22 (SAM22-like) をコードしています。 類似 (MLP-like) タンパク質) タンパク質 (図 3)。 2 つのグループは、発現の性質と応答の方向が異なっていました。 SAM22-like タンパク質をコードする遺伝子は、初期の時点 (6 または 12 hpi) で一貫して有意な誘導を示し、実験終了時 (48 hpi) には概ね無反応でしたが、MLP-like タンパク質は 6 hpi で協調を示しました。 83A:476および48hp/inのMandelupと比較すると、ほぼすべてのデータポイントは反応しませんでした。さらに、SAM22様タンパク質遺伝子の発現プロファイルの違いは、炭疽病抵抗性の変動性に伴って見られ、より抵抗性の強い系統では、より感受性の高い遺伝子よりもこれらの遺伝子が有意に誘導される時点が多く見られました。別のLlR18A/B様PR-10遺伝子は、SAM22様タンパク質遺伝子と非常に類似した発現パターンを示しました。
生物学的プロセス用語「GO:0006952 防御応答」の主要構成要素と、Lanr1およびAnManアレルの候補遺伝子の発現パターンを特定しました。Log2スケールは、同時点における接種植物（Colletotrichum lupini株Col-08、ポーランド、ウィジェニツァのルピナス畑で1999年に採取）と対照植物（擬似接種）のlog2値（変化率）を表しています。解析対象としたナローリーフルピナス系統は、83A:476（耐性、ホモ接合Lanr1アレルを有する）、Boregine（耐性、遺伝的背景不明）、Mandelup（中程度の耐性、ホモ接合AnManアレルを有する）、およびPopulation 22660（感受性）です。
さらに、RNA-seq候補遺伝子Lanr1（TanjilG_05042）およびAnMan（TanjilG_12861）の発現プロファイルを評価した（図3）。TanjilG_05042遺伝子は、最初の時点（6 hpi）のみで83A:476において有意な反応（活性化）を示したのに対し、TanjilG_12861遺伝子は、Mandeloopにおいて、6 hpi（ダ​​ウンレギュレーション）および24 hpi（6 hpi）の2つの時点においてのみ有意な反応（活性化）を示した。（調整可能）。
GO:0055114「酸化還元プロセス」という用語で最も過剰発現していた遺伝子は、シトクロムP450タンパク質とペルオキシダーゼをコードする遺伝子でした（図4）。 83A:476から6 HPIで分離されたサンプルでは、​​接種植物と対照植物の間で最大または最小のlog2（変化倍数）値（遺伝子の86.6％）が一般的に観察され、この遺伝子型の接種に対する高い反応が強調されました。 83A:476は6 hpiで最も顕著なGO: 0055114 DEG（503遺伝子）を示しましたが、残りのラインは48 hpiで（Boregine、31遺伝子、Mandelup、85遺伝子、およびPopulation 22660、78遺伝子）を示しました。 GO:0055114ファミリーのほとんどの遺伝子で、ワクチン接種に対する2種類の反応（活性化と阻害）が観察されました。興味深いことに、48hpのマンデループにおいて、GO: 0055114という用語に同定されたDEGの最大97.6%が、マンデループの炭疽病に対するトランスクリプトーム応答の遅延パターン（すなわち、変異酸化還元遺伝子の数が85対503）であるにもかかわらず、マンデループの炭疽病に対する遅延応答パターンは、83A:476の早期応答と類似していることを示唆しています。ボレギンと個体群22660では、この収束率はそれぞれ51.6%と75.6%と低くなっています。
生物学的プロセス「GO:0055114 酸化還元プロセス」の主要構成要素の発現パターンが明らかになった。Log2スケールは、同時点における接種植物（Colletotrichum lupini、Col-08株、ポーランド、ヴィジェニツァのルピナス畑で1999年に採取）と対照植物（擬似接種）のlog2値（変化率）を表す。解析対象としたナローリーフルピナス系統は、83A:476（耐性、ホモ接合Lanr1アレルを有する）、Boregine（耐性、遺伝的背景不明）、Mandelup（中程度の耐性、ホモ接合AnManアレルを有する）、およびPopulation 22660（感受性）である。
83A:476 C. lupini（Col-08株）接種に対するトランスクリプトーム応答には、用語GO:0015979「光合成」およびその他関連する生物学的プロセスに起因する遺伝子の協調的サイレンシングも含まれていた（図5）。このGO:0015979 DEGセットには、83A:476において6hpiで有意に抑制された105個の遺伝子が含まれていた。このサブセットでは、Mandelupにおいて48HPIで37個の遺伝子、22660集団において同時期に35個の遺伝子がダウンレギュレーションされており、これには両遺伝子型に共通する19個のDEGが含まれる。GO: 0015979に関連するDEGは、いかなる組み合わせ（系統×時間）においても有意に活性化されなかった。
生物学的プロセス「GO:0015979 光合成」の主要構成要素の発現パターンが明らかになった。Log2スケールは、接種した植物（Colletotrichum lupini、Col-08株、ポーランド、ヴィジェニツァ、1999年のルピナス畑から採取）と対照（擬似接種）植物の同時点におけるlog2値（変化率）を表す。解析対象としたナローリーフルピナス系統は、83A:476（耐性、ホモ接合Lanr1アレルを有する）、Boregine（耐性、遺伝的背景不明）、Mandelup（中程度の耐性、ホモ接合AnManアレルを有する）、およびPopulation 22660（感受性）である。
差次的発現解析の結果に基づき、病原菌に対する防御反応に関与していると考えられるこの 7 つの遺伝子セットが、リアルタイム PCR による発現プロファイルの定量化のために選択されました (補足表 S9)。
推定タンパク質遺伝子TanjilG_10657は、対照（模倣）植物と比較して、すべての研究対象系統および時点において有意に誘導された（補足表S10、S11）。さらに、TanjilG_10657の発現プロファイルは、すべての系統において実験期間を通じて増加傾向を示した。集団22660は、接種に対するTanjilG_10657の感受性が最も高く、114倍の活性化と、24 HPIにおける相対発現レベル（4.4 ± 0.4）が最も高かった（図6a）。PR10 LlR18Aタンパク質遺伝子TanjilG_27015も、すべての系統および時点において活性化を示し、ほとんどのデータポイントで統計的有意性を示した（図6b）。 TanjilG_10657と同様に、TanjilG_27015の最も高い相対発現レベルは、接種後24日目（19.5±2.4）の22660集団で観察されました。酸性エンドキチナーゼ遺伝子TanjilG_04706は、Boregine 6 hpiを除くすべての系統およびすべての時点で有意に上方制御されました（図6c）。83A：476の最初の時点（6 HPI）で強く誘導され（10.5倍）、他の系統では中程度に増加しました（6.6～7.5倍）。実験中、TanjilG_04706の発現は83A：476とBoregineで同程度に留まりましたが、Mandelupと集団22660では有意に増加し、比較的高い値（それぞれ5.9±1.5と6.2±1.5）に達しました。エンドグルカン-1,3-β-グルコシダーゼ様遺伝子TanjilG_23384は、集団22660を除く全ての系統において、最初の2つの時点（6hpiおよび12hpi）で高い活性化を示した（図6d）。TanjilG_23384の相対的発現レベルが最も高かったのは、2番目の時点（12hpi）で、Mandelup（2.7 ± 0.3）および83A:476（1.5 ± 0.1）であった。24hpiでは、研究対象とした全ての系統においてTanjilG_23384の発現は比較的低かった（0.04 ± 0.009～0.44 ± 0.12）。
定量PCRによって明らかにされた、選択された遺伝子（ag）の発現プロファイル。6、12、24の数字はワクチン接種後時間を表す。LanDExH7遺伝子とLanTUB6遺伝子は正規化に、LanTUB6遺伝子はシリーズ間の較正に使用した。エラーバーは、3回の生物学的反復試験に基づく標準偏差を表し、各反復試験は3回の技術的反復試験の平均値である。 接種した植物（Colletotrichum lupini、株 Col-08、1999 年にポーランドのヴィエルジェニツァのルピナス畑から入手）とコントロール（模擬接種）植物間の発現レベルの差の統計的有意性は、上記のデータ ポイントに示されています（*P 値 < 0.05、**P 値 ≤ 0.01、***P 値 ≤ 0.001）。 接種した植物（Colletotrichum lupini、株 Col-08、1999 年にポーランドのヴィエルジェニツァのルピナス畑から入手）とコントロール（模擬接種）植物間の発現レベルの差の統計的有意性は、上記のデータ ポイントに示されています（*P 値 < 0.05、**P 値 ≤ 0.01、***P 値 ≤ 0.001）。 Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, bol-08, получен) 1999 年、Верженице、Польза) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05、**значение P ≤ 0,01、***значение P ≤ 0,001)。 接種した植物（Colletotrichum lupini、株 Col-08、1999 年にポーランドの Wierzhenice のルピナス畑から入手）とコントロール（疑似接種）植物間の発現レベルの統計的に有意な差が、データ ポイントの上に示されています（*P 値 < 0.05、**P 値 ≤ 0.01、***P 値 ≤ 0.001）。接（Colletotrichum lupini、Col-08 株、1999 年波兰 Wierzenica の羽扇豆田入手）と対照（模倣）植物間のレベル差を示すデータポイント上にあります（*P 値 < 0.05、 **P 値≤ 0.01、***P 値≤ 0.001)。接（colletotrichum lupini 、 color-08 株、 1999 年波兰 wierzenica の羽扇获得） と 对照 （接植物間の水平差の構造的着性指標データポイント 上方*p）値 <0.05、**P ≤ 0.01、***P ≤ 0.001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, øтамм Col-08, полученный) Верженице, Польза, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05、** P-значение ≤ 0,01、***P-значение ≤ 0,001)。 接種した植物（Colletotrichum lupini、株 Col-08、1999 年にポーランドのヴェルジェニツェのルピナス畑で入手）とコントロール（疑似接種）植物間の発現レベルの統計的に有意な差が、データ ポイントの上に示されています（* P 値 < 0.05、** P 値 ≤ 0.01、*** P 値 ≤ 0.001）。分析された NLL 系統は、83A:476 (耐性、ホモ接合 Lanr1 対立遺伝子を持つ)、Mandelup (中程度の耐性、ホモ接合 AnMan 対立遺伝子を持つ)、Boregine (耐性、遺伝的背景不明)、および集団 22660 (感受性) でした。
Lanr1遺伝子座位の候補遺伝子TanjilG_05042は、RNA-seq研究で得られたプロファイルとは著しく異なる発現パターンを示した（図6e）。この遺伝子はMandelupおよび22660集団で顕著に活性化（それぞれ最大39.7倍および11.7倍）し、相対的に高い発現レベル（それぞれ最大1.4 ± 0.14倍および7.2 ± 1.3倍）を示した。83A:476でもTanjilG_05042遺伝子の上方制御（最大3.8倍）が認められたが、得られた相対発現レベル（0.044 ± 0.002）はMandelupおよび22660集団で観察された値の30倍以上低かった。 qPCR で分析した結果、模擬ワクチン接種（コントロール）変異体の遺伝子型間で発現レベルに有意な差が見られ、集団 22660 と 83A:476 の間、および集団 22660 と 22660 の間で 58 倍の差に達しました。Boregine と Mandalup の間では 2 倍の差がありました。
AnMan遺伝子座位の候補遺伝子TanjilG_12861は、83A:476およびMandelupではワクチン接種に反応して活性化し、22660集団では中立的であったが、Boregineではダウンレギュレーションを示した（図6f）。TanjilG_12861遺伝子の相対発現は、接種した83A:476で最も高かった（0.14±0.01）。17.4 kDaのクラスI熱ショックタンパク質遺伝子TanjilG_05080 HSP17.4は、研究したすべての株および時点において相対発現レベルが低かった（図6g）。22660集団では、HPI24で最高値が観察され（0.14±0.02、ワクチン接種に対する反応の8倍の増加）、その差は顕著であった。
遺伝子発現プロファイルの比較（図7）では、TanjilG_10657と他の4つの遺伝子（TanjilG_27015（r = 0.89）、TanjilG_05080（r = 0.85）、TanjilG_05042（r = 0.80）、TanjilG_04706（r = 0.79））との間に高い相関が認められました。これらの結果は、防御反応におけるこれらの遺伝子の共制御を示唆している可能性があります。TanjilG_12861遺伝子とTanjilG_23384遺伝子は、他の遺伝子と比較して低いピアソン相関係数（それぞれ0.08～0.43、-0.19～0.28）を示し、異なる発現プロファイルを示しました。
遺伝子発現プロファイル間の相関は定量PCRを用いて検出した。解析対象とした系統は、以下のナローリーフルピナス系統である：83A:476（耐性、ホモ接合型Lanr1アレルを有する）、Mandelup（中等度耐性、ホモ接合型AnManアレルを有する）、Boregine（耐性、遺伝的背景不明）、およびPopulation 22660（感受性）。接種後6、12、24時間の3時点を算出し、接種株（Colletotrichum lupini、株Col-08、1999年にポーランド、ヴィェルジェニツェのルピナス圃場から入手）と対照株（擬似接種株）を測定した。目盛りはピアソン相関係数の値を示す。
6馬力/インチで得られたデータに基づき、接種植物と対照植物を比較することで同定された9981DEGに対してWGCNAを実施し、初期の防御反応に焦点を当てました（補足表S12）。遺伝子型と実験変異体の間で相関（正または負）のある発現プロファイルを示す22個の遺伝子モジュール（クラスター）が見つかりました。 平均すると、遺伝子発現レベルは 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 の順に低下していました (ただし、両方の変異体とも、この傾向はコントロール植物の方が強かったです)。 平均すると、遺伝子発現レベルは 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 の順に低下していました (ただし、両方の変異体とも、この傾向はコントロール植物の方が強かったです)。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (в обоих вариантах, однако, эта) тенденция была сильнее у контрольных растений)。 平均すると、遺伝子発現レベルは 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 の順に減少しました (ただし、両方の変異体とも、この傾向はコントロール植物の方が強かったです)。平均すると、遺伝子発現レベルは、83A:476 > マンデラップ > ボレジン > 集団 22660 の順に減少した(ただし、この傾向は、2 つの個体において、対照植物においてより顕著であった)。平均すると、遺伝子レベルは 83a:476 > マンデルアップ > ボレジン > 集団 22660 の順序で降下します (植物中ではさらに)。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (однако в обоих вариантах эта) тенденция была сильнее у контрольных растений)。 平均すると、83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 の順に遺伝子発現レベルが低下しました (ただし、両方の変異体において、この傾向はコントロール植物でより強くなりました)。ワクチン接種により、特にモジュール18、19、14、6、1（効果の降順）、負の調節（例：モジュール9および20）、または中立的な効果（例：モジュール11、22、8、13）において、遺伝子発現の上方制御が認められました。GO用語エンリッチメント解析（補足表S13）では、qPCRで解析された遺伝子（TanjilG_04706、TanjilG_23384、TanjilG_10657、およびTanjilG_27015）を含む、最大活性化を示した接種モジュール（18）と、最も抑制された光合成モジュール（9）の多くにおいて、「GO: 0006952 保護反応」が明らかになりました。モジュール18のコンセントレータ（図8）は、PR-10類似タンパク質LlR18BをコードするTanjilG_26536遺伝子として同定され、モジュール9のコンセントレータは、光合成系II PsbQタンパク質をコードするTanjilG_28955遺伝子として同定されました。炭疽病耐性遺伝子Lanr1の候補遺伝子であるTanjilG_05042は、モジュール22（図9）に存在し、「GO:0044260 Cellular macromolecular metabolic processes」および「GO:0006355 Transcriptional regulation, DNA templating」という用語と関連付けられており、TanjilG_01212ハブを有しています。この遺伝子は、熱ストレス転写因子A-4a（HSFA4a）をコードしています。
過剰発現している生物学的プロセス用語「GO: 0006952 防御応答」を含むモジュールの遺伝子共発現の重み付けネットワーク解析。qPCRで解析された4つの遺伝子（TanjilG_04706、TanjilG_23384、TanjilG_10657、およびTanjilG_27015）を強調するために、ライゲーションを簡略化しました。
過剰発現している生物学的プロセス用語「GO: 0006355: 転写調節、DNAテンプレート」と炭疽病抵抗性候補遺伝子Lanr1 TanjilG_05042を含むモジュールの遺伝子共発現の重み付けネットワーク解析。ライゲーションを簡素化し、TanjilG_05042遺伝子と中心遺伝子TanjilG_01212を単離した。
オーストラリアで収集された炭疽病耐性スクリーニングの結果、初期に導入された栽培品種のほとんどが感受性を示しました。Kalya、Coromup、Mandelupは中程度の耐性、Wonga、Tanjil、83A:476は高度の耐性と報告されています26,27,31。KalyaはLanr1と呼ばれる同じ耐性アレルを持ち、CoromupとMandelupはAnManと呼ばれる異なるアレルを持ちました10,26,39。一方、Kalyaは異なるアレルLanr2を持ちました。ドイツでの炭疽病耐性スクリーニングの結果、Lanr1以外の候補アレルを持つ耐性系統Bo7212が同定され、LanrBo36と命名されました。
私たちの研究では、検査した遺伝資源における Lanr1 アレルの頻度が非常に低い (約 6%) ことが明らかになりました。この観察結果は、Anseq3 および Anseq4 マーカーを使用して東ヨーロッパの遺伝資源をスクリーニングした結果と一致しており、Lanr1 アレルは 2 つのベラルーシの系統にのみ存在することがわかりました。これは、Lanr1 アレルがマーカー補助育種の重要なアレルの 1 つであるオーストラリアとは異なり、地元の育種プログラムではまだ広く使用されていないことを示唆しています。これは、オーストラリアの報告と比較して、ヨーロッパのフィールド条件では Lanr1 アレルによって提供される抵抗性のレベルが低いためと考えられます。さらに、オーストラリアの降雨量が多い地域での炭疽病の研究では、Lanr1 アレルによって媒介される抵抗性反応は、病原体の成長と急速な発達に有利な気象条件では効果的ではない可能性があることが示されています 19,42。実際、本研究では、Lanr1アレルを有する遺伝子型においても炭疽病の症状がいくつか観察されており、C. lupiniの発育に最適な条件下では抵抗性が消失する可能性があることを示唆しています。さらに、Lanr1遺伝子座から約1 cM離れたAnseq3およびAnseq4マーカーの存在が偽陽性と解釈される可能性もあります28,30,43。
本研究では、Lanr1アレルを持つ83A:476がC. lupini接種に対して、最初の解析時点（感染後6時間）で大規模なトランスクリプトームリプログラミング反応を示したのに対し、AnManアレルを持つMandelupでは、トランスクリプトーム反応がかなり後になってから（感染後24時間から48時間）観察されたことが示されました。このような防御反応の一時的な変動は、病徴の違いと関連しており、抵抗性への対応を成功させるには早期の病原体認識が重要であることを浮き彫りにしています。炭疽菌の胞子は、植物組織に感染するために、宿主表面で発芽、細胞分裂、付着器形成など、いくつかの発育段階を経る必要があります。付属器とは、宿主の表面に付着し、宿主組織への侵入を促進する感染構造です。その結果、エンドウ豆抽出物中の C. gloeosporioides の胞子は、培養開始から 75～90 分後に核の最初の分裂を示し、90～120 分後に発芽管を形成し、4 時間後には抑制が見られました 45。マンゴーの C. gloeosporioides は、培養開始から 3 時間後に 40% を超える分生子発芽を示し、4 時間後には約 20% の付着器形成を示しました。C. gloeosporioides の毒性に関連する CAP20 遺伝子は、CAP20 タンパク質が高濃度のアボカド表面ワックス中で 3.5 時間培養した後、4 時間 46 分後に着生分生子で転写活性を示しました。同様に、C. trifolii ではメラニン生合成遺伝子の活性が 2 時間の培養中に誘導され、1 時間後に付着器が形成しました。葉組織の研究により、C. acutatum を接種したイチゴは感染後 8 hpi で最初の抑制がみられるのに対し、C. coccodes を接種したトマトは感染後 4 hpi で最初の抑制がみられることが示されています48,49。これは Colletotrichum 属菌の感染過程の時間スケールとほぼ一致しています。83A:476 に対する迅速な防御反応は、この系統における植物抵抗性とエフェクター誘発免疫 (ETI) 遺伝子の関与を示唆しており、Mandelup の遅延反応は、ミクロ関連分子パターン誘発免疫 (MTI) 仮説を裏付けています50。83A: 476 と Mandelup に対する初期反応。遅延反応において上方制御または下方制御された遺伝子が部分的に重複していることもこの概念を裏付けています。ETI は、感染部位でのアナフィラキシーショックとして知られるプログラム細胞死に至る、加速および増強された MTI 反応であると考えられることが多いためです51,52。
遺伝子オントロジーGO:0006952「防御応答」という過剰発現の用語に帰属する遺伝子の大部分は、ストレス誘発性断食メッセージ22タンパク質（SAM22に類似）の11個の相同遺伝子と、7つの主要なラテックスタンパク質様タンパク質（MLP）です。SA​​M22様タンパク質31、34、43、および423は配列相同性を示しました。SAM22様遺伝子は有意な活性化を示し、その持続時間は長く、炭疽病抵抗性レベルの増加を示しました（83A:476およびBoregine）。しかし、MLP様遺伝子は、抵抗性候補アレルを有する系統（6hpiで83A:476/Lanr1、24hpiでMandelup/AnMan）でのみダウンレギュレーションされました。同定されたSAM22様ホモログはすべて約105kbに及ぶ遺伝子クラスターに由来するのに対し、MLP様遺伝子はゲノムの別々の領域に由来することに留意すべきである。このようなSAM22様遺伝子の協調的な活性化は、Diaporthetoxica接種に対するNLL耐性に関する我々の以前の研究でも確認されており、これらの遺伝子が防御反応の水平的構成要素に関与していることを示唆している。この結論は、SAM22様遺伝子が傷害またはサリチル酸、真菌誘導剤、または過酸化水素による処理に対して良好な反応を示すという報告によっても裏付けられている。
MLP 様遺伝子は、多くの植物種における細菌、ウイルス、病原性真菌の感染など、さまざまな非生物的および生物的ストレスに応答することが示されている55。植物と病原体との特定の相互作用に対する応答の方向は、大幅に増加する場合（綿花の Verticillium dahliae 感染時など）から大幅に減少する場合（リンゴの木の Alternaria spp. 感染後など）までの範囲であった56,57。MLP 様 423 遺伝子の大幅なダウンレギュレーションは、F. niger 感染に対するアボカドの防御時、およびリンゴの病原型である Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola と Alternaria alternata の感染時に観察されている58,59。さらに、MLP 様 423 遺伝子を過剰発現するリンゴのカルスでは、抵抗性関連遺伝子の発現が低下し、真菌感染に対する感受性が高まった59。 Fusarium oxysporum fに続いて、MLP様423遺伝子も耐性インゲン豆遺伝資源で抑制されました。cn. 豆感染症60。
私たちのRNA-seq研究で特定されたPR-10ファミリーの他のメンバーは、アップレギュレーションに反応するLlR18AおよびLlR18B遺伝子、および脂質輸送タンパク質DIR1のアップレギュレーション（1遺伝子）またはダウンレギュレーション（3遺伝子）遺伝子でした。さらに、WGCNAは、ワクチン接種に非常に感受性が高く、いくつかの防御反応遺伝子を持つLlR18B遺伝子をこのモジュールのハブとして強調しています。 LlR18A および LlR18B 遺伝子は、病原細菌への反応として黄色ルピナスの葉で誘導されたほか、D. toxica 接種後の NLL 茎でも誘導されましたが、これらの遺伝子のイネ相同遺伝子である RSOsPR10 は、おそらくジャスモン酸シグナル伝達経路に関与する真菌感染によって急速に誘導されました53,61, 62。DIR1 遺伝子は、全身獲得抵抗性 (SAR) の発現に必要な非特異的脂質輸送タンパク質をコードしています。防御反応の発達に伴い、DIR1 タンパク質は感染巣から師管を通って輸送され、遠隔器官で SAR を誘導します。興味深いことに、TanjilG_02313 DIR1 遺伝子は、系統 84A:476 および集団 22660 で最初の時点で有意に誘導されましたが、炭疽病抵抗性は系統 84A:476 でのみ正常に発達しました。残りの 3 つの相同遺伝子は 6 hpi で 83A:476 ラインでのみ接種に反応し、この反応は下向きであったため、これは NLL における DIR1 遺伝子の何らかの部分機能化を示している可能性があります。
本研究では、「GO:0055114 酸化還元プロセス」と呼ばれる生物学的プロセスに対応する最も一般的な構成要素は、シトクロムP450タンパク質、ペルオキシダーゼ、リノール酸9S-/13S-リポキシゲナーゼ、および1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸オキシダーゼでした。さらに、WGCNAでは、HSFA4aホモログを、Lanr1耐性遺伝子候補TanjilG_05042などのモジュールを運ぶハブとして定義しています。HSFA4aは、植物における酸化還元依存性の核転写制御の構成要素です。
シトクロム P450 タンパク質は、一次代謝と二次代謝における NADPH や O2 依存性水酸化反応を触媒する酸化還元酵素であり、これには生体異物、ホルモン、脂肪酸、ステロール、細胞壁成分、生体高分子、保護化合物 69 の生合成が含まれます。私たちの研究では、植物のシトクロム P450 機能の変動は、多数の変化した相同体 (37) と特定の遺伝子間の応答パターンの違いにより、-10.6 log2 (変化倍数) から 5.7 に減少し、上方修正を反映しました。RNA-seq データのみを使用して、このような大規模なタンパク質スーパーファミリーの NLL 遺伝子の推定生物学的機能を解明することは、非常に推測に頼ることになります。ただし、一部のシトクロム P450 遺伝子は、アレルギー反応69,70,71 への寄与を含め、病原性の真菌や細菌に対する抵抗力の向上と関連していることは注目に値します。
クラスIIIペルオキシダーゼは、植物の成長と発達における幅広い代謝プロセスに関与する多機能植物酵素であり、塩分、干ばつ、高光強度、病原菌の攻撃などの環境ストレスへの反応にも関与しています72。ペルオキシダーゼは、Stylosanthes humilisとC. gloeosporioides、Lens culinarisとC. truncatum、Phaseolus vulgarisとC. lindemuthianum、Cucumis sativusとC. lagenariumなど、いくつかの植物種と炭疽菌の相互作用に関与しています73,74,75,76。この反応は非常に迅速で、菌が植物組織に侵入する前の4 HPI（4 hpI）でも反応を示すことがあります73。このペルオキシダーゼ遺伝子は、D. toxicaのNLL接種にも反応しました。ペルオキシダーゼは、酸化バーストの制御や酸化ストレスの除去といった典型的な機能に加え、木質化、サブユニット化、あるいは特定の化合物の架橋反応における細胞壁強化に基づく物理的バリアを形成することで、病原体の増殖を阻害することができます。この機能は、リグニン形成能を持つと推定されるアニオンペルオキシダーゼをコードするTanjilG_03329遺伝子に起因しており、本研究では、耐性株83A:476においてHPI6で有意に発現が上昇しましたが、反応を示さなかった他の株および時点においては、この上昇は見られませんでした。
リノール酸の9S-/13S-リポキシゲナーゼは、脂質生合成における酸化経路の第一段階です78。この経路の産物は、カロースおよびペクチン沈着物の形成による細胞壁の強化、活性酸素種の産生による酸化ストレスの調節など、植物防御において多様な機能を有しています79,80,81,82,83。本研究では、リノール酸9S-/13S-リポキシゲナーゼの発現は全ての株で変化していましたが、感受性株22660では異なる時点で上方制御が優勢でした。一方、耐性Lanr1およびAnManアレルを有する株では、これらの遺伝子型間の防御炭疽反応におけるオキシリピン層の多様化が顕著に表れています。
1-アミノシクロプロパン-1-カルボキシレートオキシダーゼ（ACO）ホモログは、ルピナス接種により有意にアップレギュレーション（9遺伝子）またはダウンレギュレーション（2遺伝子）された。2つの例外を除き、これらの反応はすべて6 hp.で83A:476で発生した。ACOタンパク質が媒介する酵素反応はエチレン生成の律速段階であるため、高度に制御されている84。エチレンは植物ホルモンであり、植物の発育や非生物的および生物的ストレス条件への応答を制御する上で様々な役割を果たしている。ACO転写の誘導とエチレンシグナル伝達経路の活性化は、活性酸素種およびファイトアレキシンの産生を制御することで、半栄養性菌類であるイネいもち病菌に対するイネの耐性を高めることに関与している。 M. oryzae と C. lupini88,89 の間には非常によく似た葉の感染プロセスが見つかり、この研究で報告された 83A:476 ラインでの ACO 相同遺伝子の大幅なアップレギュレーションを背景に、NLL 炭疽病エチレンに対する耐性を付与する可能性が分子経路におけるシグナル伝達の中心的ステップにシフトしています。
本研究では、83A:476では感染後6hpi、Mandeloopおよび22660では感染後48hpiに、光合成に関連する多くの遺伝子の大規模な抑制が観察されました。これらの変化の程度と進行はレベルに比例しています。この実験では炭疽病抵抗性が観察されました。最近、病原細菌や真菌を含む植物と病原体の相互作用に関するいくつかのモデルにおいて、光合成関連転写産物の強力かつ早期の抑制が報告されています。感染に対する反応として、光合成関連遺伝子の急速な（一部の相互作用では2HPIから）抑制と全体的な抑制は、活性酸素種の配置とそれらがサリチル酸経路と相互作用してアレルギー反応を媒介することに基づいて植物の免疫を誘発する可能性があります90,94。
結論として、最も抵抗性の系統（83A:476）に対して提案されている防御応答機構には、R遺伝子（おそらくTIR-NBS-LRR TanjilG_05042）による迅速な病原体認識と、アレルギー反応を介したサリチル酸およびエチレンシグナル伝達、それに続く長距離SARの確立が含まれます。この作用はDIR-1タンパク質によってサポートされています。C. lupini感染の生体栄養期間は非常に短く（約2日間）、その後に壊死性成長が続くことに注意する必要があります95。これらの段階間の移行は、壊死と、宿主植物で過敏症反応の引き金となるエチレン誘導性タンパク質の発現に関連している可能性があります。したがって、生体栄養段階でC. lupiniをうまく捕獲できる時間枠は非常に狭いです。 83A:476において6hpiで観察された酸化還元および光合成に関連する遺伝子の再プログラム化は、真菌の菌糸の発達と一致しており、生物栄養段階における防御反応の発達を予兆しています。Mandelupおよび22660集団のトランスクリプトーム反応は、壊死性増殖に移行する前に真菌を捕獲するには遅すぎる可能性がありますが、PR-10タンパク質の比較的速い制御が水平抵抗性を促進するため、Mandelupは22660集団よりも効果的である可能性があります。
標準的なR遺伝子によって駆動されるETIは、豆類の炭疽病抵抗性における一般的なメカニズムであると考えられる。例えば、モデルマメ科植物であるMedicago truncatulaでは、炭疽病抵抗性は、TIR-NBS-LRR97植物R遺伝子クラスに属するRCT1遺伝子によって付与される。この遺伝子は、感受性植物に導入されると、アルファルファに広範囲の炭疽病抵抗性も付与する。インゲンマメ（P. vulgaris）では、これまでに24以上の炭疽病抵抗性遺伝子が同定されている。これらの遺伝子の一部は標準的なR遺伝子が存在しない領域に存在するが、他の多くはTIR-NBS-LRR99を含むNBS-LRR遺伝子クラスターを含む染色体の端に位置している。ゲノムワイドSSR研究によって、インゲンマメにおけるNBS-LRR遺伝子と炭疽病抵抗性の関連性も確認された。標準的な R 遺伝子は、白色ルピナス 101 の主要な炭疽病耐性遺伝子座を有するゲノム領域でも発見されました。
我々の研究は、植物感染の初期段階（できれば感染後12時間以内）で活性化される即時耐性反応が、病原菌Collelotrichum lupiniによって引き起こされる炭疽病から狭葉ルピナスを効果的に保護することを示している。ハイスループットシーケンシングを用いて、Lanr1およびAnMan耐性遺伝子によって媒介されるNLL植物における炭疽病耐性遺伝子の差次的発現プロファイルを実証した。防御を成功させるには、植物が病原体と初めて接触してから数時間以内に、酸化還元、光合成、および発病に関与するタンパク質の遺伝子を慎重に設計する必要がある。同様の防御反応だが時間が遅れると、植物を病気から保護する効果ははるかに低くなる。Lanr1遺伝子によって媒介される炭疽病耐性は、R遺伝子（エフェクター誘導免疫）の典型的な迅速応答に似ているが、AnMan遺伝子は水平応答（微生物関連分子パターンによって誘導される免疫）を提供し、中程度の持続可能性をもたらす可能性が高い。
炭疽病マーカーのスクリーニングに使用された215のNLL系統は、74の栽培品種、交配または育種によって得られた60の系統、5の突然変異体、そして76の野生または原種の遺伝資源で構成されていた。これらの系統は17か国に由来し、主にポーランド（58）、スペイン（47）、ドイツ（27）、オーストラリア（26）、ロシア（19）、ベラルーシ（7）、イタリア（5）の系統、そして10か国からのその他の系統が含まれていた。このセットには、83A:476、Tanjil、Lanr1アレルを持つWonga、およびAnManアレルを持つMandelupといった参照耐性系統も含まれている。これらの系統は、ポーランド、ヴィアトロヴォのPoznań Plant Breeding Ltd.が管理する欧州ルピナス遺伝資源データベースから入手された（補足表S1）。
植物は管理された条件（光周期16時間、日中温度25℃、夜間温度18℃）で栽培されました。2つの生物学的複製が分析されました。DNAは、DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen、ドイツ、ヒルデン）を使用して、プロトコルに従って3週間齢​​の葉から単離されました。単離されたDNAの品質と濃度は、分光光度法（NanoDrop 2000、Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で評価されました。炭疽病耐性遺伝子AnMan（cv. Mandelup由来）を示すAnManM1マーカーと、遺伝子Lanr1（cv. Tanjil由来）を挟むマーカーAnseq3とAnseq4を分析しました11,26,28。耐性対立遺伝子のホモ接合体は「1」、感受性対立遺伝子は「0」、ヘテロ接合体は0.5とスコア付けされました。
AnManM1、AnSeq3、およびAnSeq4マーカーのスクリーニング結果と、最終追跡実験用の種子の入手可能性に基づき、炭疽病抵抗性表現型解析のために50のNLL系統を選定しました。解析は、日中22℃、夜間19℃の温度範囲で14時間日長のコンピュータ制御温室で2回実施しました。播種前に種子をスクラッチ（胚の反対側の種皮を鋭利な刃で切り取る）することで、種皮が硬すぎることによる休眠を防ぎ、均一な発芽を確保しました。植物は、滅菌土壌（TS-1 REC 085 Medium Basic、Klasmann-Deilmann Polska、ワルシャワ、ポーランド）を用いてポット（11×11×21 cm）で栽培しました。接種は、1999年にヴィエルコポルスカ県ヴェルジェニツァ（北緯52° 27′ 42″、東経17° 04′ 05″）の畑で栽培された狭葉ルピナスの茎から栽培されたColletotrichum lupini Col-08株を使用して実施しました。領域を取得します。分離株は、胞子形成を誘発するために、20° C、ブラックライトの下で21日間SNA培地で培養されました。播種から4週間後、植物が4〜6葉期に達したときに、分生子の懸濁液を0.5 x 106分生子/ mlの濃度で噴霧することにより接種を実施しました。接種後、植物は、分生子の発芽と感染プロセスを促進するために、湿度約98％、温度25°Cで24時間暗所に置かれました。その後、植物は14時間日長、昼22℃、夜19℃、湿度70%の条件下で栽培された。接種後22日目に病害スコアが算出され、茎と葉の壊死病変の有無に応じて0（免疫）から9（非常に感受性）の範囲で評価された。さらに、スコアリング後に植物の重量を測定した。マーカー遺伝子型と病害表現型の関係は、点2配列相関（炭疽病抵抗性表現型解析のための系統セットにヘテロ接合マーカーが存在しない）として算出された。