Faleminderit që vizituat Nature.com. Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar CSS. Për përvojën më të mirë, ne ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose të çaktivizoni Modalitetin e Përputhshmërisë në Internet Explorer). Ndërkohë, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne do ta paraqesim faqen pa stile dhe JavaScript.
Lupina Angustifolius (NLL, Lupinus angustifolius L.) është një bimë bishtajore që përdoret për prodhimin e ushqimit dhe përmirësimin e tokës. Zgjerimi global i NLL si kulturë ka tërhequr shumë kërpudha patogjene, duke përfshirë antraknozën e lupinës, e cila shkakton sëmundjen shkatërruese të antraknozës. Dy alele, Lanr1 dhe AnMan, të cilat japin rezistencë të shtuar, janë përdorur në kultivimin e NLL, por mekanizmat themelorë molekularë mbeten të panjohur. Në këtë studim, shënuesit Lanr1 dhe AnMan u përdorën për të shqyrtuar mostrat evropiane të NLL. Testimi i vaksinës në një mjedis të kontrolluar konfirmoi efikasitetin e të dy donatorëve rezistentë. Profilizimi diferencial i shprehjes së gjenit u krye në linja përfaqësuese rezistente dhe të ndjeshme. Rezistenca ndaj antrakonozës u shoqërua me mbishprehjen e termave të ontologjisë së gjenit "GO:0006952 Përgjigje Mbrojtëse", "GO:0055114 Procesi Redoks" dhe "GO:0015979 Fotosinteza". Përveç kësaj, linja Lanr1(83A:476) tregoi riprogramim të shpejtë të transkriptomit pas inokulimit, ndërsa linjat e tjera treguan një vonesë në këtë përgjigje me rreth 42 orë. Përgjigjet mbrojtëse shoqërohen me gjenet TIR-NBS, CC-NBS-LRR dhe NBS-LRR, 10 proteina të përfshira në patogjenezë, proteina të transferimit të lipideve, endoglukan-1,3-β-glukozidazë, proteina të murit qelizor të pasura me glicinë dhe gjenet nga rruga reaktive e oksigjenit. Përgjigjet e hershme ndaj 83A:476, duke përfshirë shtypjen e kujdesshme të gjeneve të shoqëruara me fotosintezën, përkuan me mbrojtje të suksesshme gjatë fazës vegjetative të rritjes së biologjisë kërpudhore, duke sugjeruar që një efektor shkakton imunitet. Reaksioni Mandeloop ngadalësohet, siç është edhe tërheqja e përgjithshme horizontale.
Lupini me gjethe të ngushta (NLL, Lupinus angustifolius L.) është një drithëra me përmbajtje të lartë proteinash me origjinë nga rajoni i Mesdheut perëndimor1,2. Aktualisht kultivohet si kulturë ushqimore për kafshët dhe njerëzit. Konsiderohet gjithashtu si pleh i gjelbër në sistemet e rrotullimit të të korrave për shkak të fiksimit të azotit nga bakteret simbiotike që fiksojnë azotin dhe përmirësimit të përgjithshëm të strukturës së tokës. NLL ka kaluar një proces të shpejtë zbutjeje në shekullin e fundit dhe është ende nën presion të lartë të mbarështimit3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Me kultivimin e përhapur të NLL, një sërë kërpudhash patogjene zhvilluan vende të reja bujqësore dhe shkaktuan sëmundje të reja që shkatërrojnë të korrat. Gjëja më e jashtëzakonshme për fermerët dhe mbarështuesit e lupinit ishte shfaqja e antrakonozës, e shkaktuar nga kërpudha patogjene, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Gjëja më e jashtëzakonshme për fermerët dhe mbarështuesit e lupinit ishte shfaqja e antrakonozës, e shkaktuar nga kërpudha patogjene, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным за фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Më e dukshmja për fermerët dhe mbarështuesit e lupinës ishte shfaqja e antrakonozës e shkaktuar nga kërpudha patogjene Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是猱lleumi珗(Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是猱lleumi珗(Bondar) me flokë. 1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Më e habitshme për fermerët dhe mbarështuesit e lupinës është shfaqja e antrakonozës e shkaktuar nga kërpudha patogjene Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Raportet më të hershme të sëmundjes erdhën nga Brazili dhe Shtetet e Bashkuara, me simptoma tipike që u shfaqën përkatësisht në vitin 1912 dhe 1929. Megjithatë, pas rreth 30 vitesh, patogjeni u përcaktua si Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorfi Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfi Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf i Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld во Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld në Morfologjinë e Synuar. & H. Schrenk,. & H. Schrenk,.dhe H. Schrenk. & H.施伦克，. & H.施伦克，.dhe H. Schlenk,.Fenotipizimi paraprak i sëmundjes i bërë në mesin e shekullit të 20-të tregoi njëfarë rezistence në shtesat e NLL dhe lupinës së verdhë (L. luteus L.), por të gjitha shtesat e lupinës së bardhë (L. albus L.) të testuara ishin shumë të ndjeshme15,16. Studimet kanë treguar se zhvillimi i antrakonozës shoqërohet me rritjen e reshjeve (lagështia e ajrit) dhe temperaturës (në intervalin 12-28°C), duke çuar në një shkelje të rezistencës në temperatura më të larta17, 18. Në fakt, koha e nevojshme që konidet të mbijnë dhe sëmundja të fillojë, ishte katër herë më e shkurtër në 24°C (4 orë) sesa në 12°C (16 orë) në kushte lagështie të lartë19. Kështu, ngrohja globale e vazhdueshme ka çuar në përhapjen e antrakonozës. Megjithatë, sëmundja u vu re në Francë (1982) dhe Ukrainë (1983) si një paralajmërues i një kërcënimi të afërt, por me sa duket u injorua nga industria e lupinës në atë kohë20,21. Disa vite më vonë, kjo sëmundje shkatërruese u përhap në të gjithë botën dhe preku edhe vendet kryesore prodhuese të lupinës, si Australia, Polonia dhe Gjermania22,23,24. Pas një shpërthimi të antrakonozës në mesin e viteve 1990, një shqyrtim i gjerë rezultoi në identifikimin e disa donatorëve rezistentë në mostrat e NLL19. Rezistenca e NLL ndaj antrakonozës kontrollohet nga dy alele dominuese të veçanta që gjenden në burime të ndryshme të gjermoplazmës: Lanr1 në kultivarin Tanjil dhe Wonga dhe AnMan në kultivarin Mandalay 25, 26. Këto alele plotësojnë shënuesit molekularë që mbështesin përzgjedhjen e gjermoplazmës rezistente në programet e mbarështimit25,26,27,28,29,30. Linja rezistente e riprodhimit 83A:476 që mbante alelin Lanr1 u kryqëzua me linjën e egër të ndjeshme P27255 për të marrë një popullatë RIL që ndahej për rezistencë ndaj antrakonozës, gjë që bëri të mundur caktimin e lokusit Lanr1 në kromozomin NLL-1131, 32, 33. Përputhja e shënuesve të hartës së lidhjes nga lokuset anësore të rezistencës në antrakonzë me një kornizë gjenomike, NLL zbuloi vendndodhjen e të tre aleleve në të njëjtin kromozom (NLL-11), por në pozicione të ndryshme29,34,35. Megjithatë, për shkak të numrit të vogël të RIL-ve dhe distancës së madhe gjenetike midis shënuesve dhe aleleve përkatëse, nuk mund të nxirren përfundime të besueshme rreth gjeneve të tyre themelore. Nga ana tjetër, përdorimi i gjenetikës së kundërt në lupina është i vështirë për shkak të potencialit të tyre shumë të ulët të rigjenerimit, gjë që e bën manipulimin gjenetik të vështirë37.
Zhvillimi i gjermoplazmës së zbutur që mban alelin e dëshiruar në gjendje homozigote, siç janë 83A:476 (Lanr1) dhe Mandelup (AnMan), ka hapur derën për studimin e rezistencës ndaj antrakonozës përballë pranisë së kombinimeve kundërshtare të aleleve në popullatat e egra. Mundësitë e mekanizmave molekularë. Krahasoni përgjigjet mbrojtëse të gjeneruara nga gjenotipe specifike. Ky studim vlerësoi përgjigjen e hershme transkriptomike të NLL ndaj vaksinimit C. lupini. Së pari, një panel evropian i gjermoplazmës NLL që përmbante 215 linja u shqyrtua duke përdorur shënjues molekularë që shënojnë alelet Lanr1 dhe AnMan. Fenotipizimi i antrakonozës u krye më pas në 50 linja NLL, të përzgjedhura më parë për shënjues molekularë, në kushte të kontrolluara. Bazuar në këto eksperimente, katër linja që ndryshonin në rezistencën ndaj antrakonozës dhe përbërjen alelike Lanr1/AnMan u përzgjodhën për profilizimin diferencial të shprehjes së gjenit mbrojtës duke përdorur dy qasje plotësuese: sekuencimin e ARN-së me rendiment të lartë dhe kuantifikimin PCR në kohë reale.
Shqyrtimi i një grupi të gjermoplazmës NLL (N = 215) me shënuesit Lanr1 (Anseq3 dhe Anseq4) dhe AnMan (Anseq4) dhe AnMan (AnManM1) tregoi se vetëm një linjë (95726, pranë Salamanca-b) amplifikon alelin e "rezistencës" për të gjithë shënuesit, ndërsa "Prania e aleleve 'të ndjeshme'" gjeti përqindjen e të gjithë shënuesve në 158 (~73.5%) linja. Trembëdhjetë linja prodhuan dy alele "rezistente" të shënuesit Lanr1, dhe 8 linja prodhuan alele "rezistente" të shënuesit Lanr1. Aleli i "rezistencës" i shënuesit AnMan (Tabela Plotësuese S1). Dy linja ishin heterozigote për shënuesin Anseq3 dhe një heterozigote për shënuesin AnManM1. 42 linja (19.5%) mbartnin faza të kundërta të aleleve Anseq3 dhe Anseq4, duke treguar një frekuencë të lartë të rekombinimit midis këtyre dy lokuseve. Fenotipet e antrakonozës në kushte të kontrolluara (Tabela Plotësuese S2) zbuluan ndryshueshmëri në rezistencën e gjenotipeve të testuara, gjë që u reflektua në ashpërsinë e antrakonozës. Dallimet në rezultatet mesatare varionin nga 1.8 (rezistencë e moderuar) në 6.9 (e ndjeshme) dhe ndryshimet në peshën e bimëve varionin nga 0.62 (e ndjeshme) në 4.45 g (rezistente). Kishte një korrelacion të rëndësishëm midis vlerave të vëzhguara në dy përsëritje të eksperimentit (0.51 për rezultatet e ashpërsisë së sëmundjes, P = 0.00017 dhe 0.61 për peshën e bimës, P < 0.0001), si dhe midis këtyre dy parametrave (-0.59 dhe -0.77, P < 0.0001). Kishte një korrelacion të rëndësishëm midis vlerave të vëzhguara në dy përsëritje të eksperimentit (0.51 për rezultatet e ashpërsisë së sëmundjes, P = 0.00017 dhe 0.61 për peshën e bimës, P < 0.0001), si dhe midis këtyre dy parametrave (-0.59 dhe -0.77, P < 0.0001). Выявлена ​​Достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми në dy herë përsëritje eksperimenta (0,51 për balllov тяжести болезни, P = 0,00017 dhe 0,61 për çdo masë të madhe <0,0, 0,00 për qind, 0,00017 dhe 0,61 në masë të madhe <0,0, 0,00,000,000,000) этими двумя параметри (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Një korrelacion i rëndësishëm u gjet midis vlerave të vëzhguara në dy përsëritje të eksperimentit (0.51 për rezultatet e ashpërsisë së sëmundjes, P = 0.00017 dhe 0.61 për peshën e bimës, P < 0.0001), si dhe midis këtyre dy parametrave (- 0.59 dhe -0.77, P < 0.0001) 0.0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分1 =P. 0,00017，植物重量为0,61，P <0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77，01P <.在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程庈 䆄分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之鈑 ， 5 ，（ ，（ ， 5 0,59 和 – 0,59 和- 0,59 ⒌- 0,77, P < 0,0001). Naблюдалась значительная корреляция между значениями, naблюдаемыми në dy herë përsëritje (përqindja e tyre për bolevania 0,51, P = 0,00017 dhe në masë në rritje 0,61, P <0,0001, p <0,0001), и -0,0001) 0,77, P <0,0001. Kishte një korrelacion të rëndësishëm midis vlerave të vëzhguara në dy kopje (rezultati i ashpërsisë së sëmundjes 0.51, P = 0.00017 dhe pesha e bimës 0.61, P < 0.0001) dhe midis këtyre dy parametrave (-0.59 dhe -0.0001) 0.77, P<0.0001. ).Simptomat tipike që shihen te bimët e ndjeshme përfshijnë përdredhjen dhe lakimin e kërcellit që i ngjan një strukture "harku bariu", e ndjekur nga lezione ovale me sporozoite portokalli/rozë (Fig. Plotësuese 1). Varietetet australiane që mbajnë gjenet Lanr1 (83A:476 dhe Tanjil) dhe AnMan (Mandelup) janë mesatarisht rezistente, 0.0331 dhe 0.0036). Disa linja që mbajnë gjithashtu alele "rezistente" Lanr1 dhe/ose AnMan tregojnë simptoma të sëmundjes.
Është interesante se disa linja NLL që nuk kanë asnjë alelë shënuese "rezistente" zbuluan një nivel të lartë të rezistencës ndaj antrakonozës (të krahasueshme ose më të lartë se për gjenotipet Lanr1 ose AnMan), të tilla si Boregine (vlera P < 0.0001 për të dy parametrat), Bojar (vlera P < 0.0001 për pikëzimin dhe 0.001 për peshën e bimës) dhe Popullata B-549/79b (vlera P < 0.0001 për pikëzimin dhe jo-signifikante për peshën). Është interesante se disa linja NLL që nuk kanë asnjë alelë shënuese "rezistente" zbuluan një nivel të lartë të rezistencës ndaj antrakonozës (të krahasueshme ose më të lartë se për gjenotipet Lanr1 ose AnMan), të tilla si Boregine (vlera P < 0.0001 për të dy parametrat), Bojar (vlera P < 0.0001 për pikëzimin dhe 0.001 për peshën e bimës) dhe Popullata B-549/79b (vlera P < 0.0001 për pikëzimin dhe jo-signifikante për peshën). Interesno, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к antraknozu (сопоставимый или более высокий, чем для для Laknr), Boregine (domethënia P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (vlera P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) dhe popullariteti B-549/79b (vlera P <0,0001 для незначимо для массы). Është interesante se disa linja NLL që nuk kishin asnjë alel shënues 'rezistent' treguan një nivel të lartë rezistence ndaj antrakonozës (i krahasueshëm ose më i lartë se për gjenotipet Lanr1 ose AnMan), të tilla si Boregine (vlera P < 0.0001 për të dy parametrat), Bojar (vlera P < 0.0001 për vlerësim dhe 0.001 për peshën e bimës) dhe popullata B-549/79b (vlera P < 0.0001 për vlerësim dhe jo domethënëse për peshën).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭 抗性或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重阾为 Është interesante që disa sisteme NLL që nuk kanë asnjë shënues "antigjenik" tregojnë rezistencë të lartë horizontale (ekuivalente me gjenet Lanr1 ose AnMan ose më të lartë), siç është Boregine (të dy parametrat P < 0.0001), Bojar (vlera P < 0.0001, pesha e bimës 0.001) dhe lloji B-549/79b (vlera P < 0.0001, pesha jo e rëndësishme). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показал высокие уровни устойчивости к antraknozu (сравнимые или повеќе, чем во генотипов Lanr1), танядня или AnM обоих параметри <0,0001), Bojar (domethënia P <0,0001, масса në rritje 0,001) dhe popullariteti B-549/79b (оценка P-domethënie <0,0001, масса незначительна). Është interesante se disa linja NLL që nuk kishin asnjë alele shënuese të 'rezistencës' treguan nivele të larta të rezistencës ndaj antrakonozës (të krahasueshme ose më të larta se gjenotipet Lanr1 ose AnMan), të tilla si Boregine (vlera P për të dy parametrat <0.0001), Bojar (vlera P < 0.0001, pesha e bimës 0.001) dhe popullata B-549/79b (vlera P < 0.0001, pesha jo e rëndësishme).Ky fenomen sugjeron mundësinë e një burimi të ri gjenetik të rezistencës, duke shpjeguar mungesën e vëzhguar të korrelacionit midis gjenotipeve të shënjuesve dhe fenotipeve të sëmundjeve (vlerat P nga ~0.42 në ~0.98). Kështu, testi Kolmogorov-Smirnov tregoi se të dhënat mbi rezistencën ndaj antrakonozës ishin afërsisht të shpërndara normalisht për pikët (vlerat P 0.25 dhe 0.11) dhe masën e bimëve (vlerat P 0.47 dhe 0.55), duke sugjeruar që unë hipotetizoj se përfshihen më shumë alele sesa Lanr1 dhe AnMan.
Bazuar në rezultatet e shqyrtimit të rezistencës ndaj antrakonozës, u përzgjodhën 4 linja për analizën e transkriptomës: 83A:476, Boregine, Mandelup dhe Popullata 22660. Këto linja u ritestuan për rezistencën ndaj antraksit në eksperimentet e inokulimit me anë të sekuencimit të ARN-së, me kusht që ato të ishin të njëjta si në testin e mëparshëm. Vlerat e pikëzimit ishin si më poshtë: Boregin (1.71 ± 1.39), 83A: 476 (2.09 ± 1.38), Mandelup (3.82 ± 1.42) dhe popullata 22660 (6.11 ± 1.29).
Protokolli Illumina NovaSeq 6000 arriti një mesatare prej 40.5 çiftesh Mread për mostër (29.7 deri në 54.4 Mreads) (Tabela Plotësuese S3). Rezultatet e shtrirjes në sekuencën referuese varionin nga 75.5% në 88.6%. Korrelacioni mesatar i të dhënave të numërimit të leximit midis varianteve eksperimentale midis replikimeve biologjike varionte nga 0.812 në 0.997 (mesatarja 0.959). Nga 35,170 gjenet e analizuara, 2917 nuk zbuluan shprehje, dhe 4785 gjenet e tjera u shprehën në një nivel të papërfillshëm (mesatarja bazë < 5). Nga 35,170 gjenet e analizuara, 2917 nuk zbuluan shprehje, dhe 4785 gjenet e tjera u shprehën në një nivel të papërfillshëm (mesatarja bazë < 5). Nga 35 170 proanalizirovannыh genov 2917 nuk proyavlyali эkspressii, dhe ostalьnые 4785 genov эkspressirovalisь на незначительном уровне (bazë e mesme <5). Nga 35,170 gjenet e analizuara, 2917 nuk treguan shprehje, dhe 4785 gjenet e mbetura u shprehën në një nivel të papërfillshëm (mesatarja bazë <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35,170 Nga 35 170 proanalizirovannыh genov 2917 nuk ekspresirovalisь, a ональные 4785 genov emeli i pakëtьную эkspressiю (bazavoe среднее значение <5). Nga 35,170 gjenet e analizuara, 2917 nuk u shprehën dhe 4785 gjenet e mbetura kishin shprehje të papërfillshme (mesatarja bazë <5).Kështu, numri i gjeneve të konsideruara të shprehura (mesatarja bazë ≥ 5) gjatë eksperimentit ishte 27,468 (78.1%) (Tabela Plotësuese S4).
Që nga pika e parë kohore, të gjitha linjat NLL iu përgjigjën inokulimit të C. lupini (lloji Col-08) duke riprogramuar transkriptomin (Tabela 1), megjithatë, u vunë re ndryshime të rëndësishme midis linjave. Kështu, linja e rezistencës 83A:476 (që mban gjenin Lanr1) tregoi riprogramim të rëndësishëm të transkriptomit në pikën e parë kohore (6 hpi) me një rritje 31-69-fish në numrin e gjeneve të izoluara lart dhe poshtë krahasuar me pikat e tjera kohore në këtë pikë kohore. Përveç kësaj, ky kulm ishte jetëshkurtër, pasi shprehja e vetëm disa gjeneve mbeti e ndryshuar ndjeshëm në pikën e dytë kohore (12 hpi). Është interesante se Boregine, e cila gjithashtu tregoi një nivel të lartë rezistence në testin e shartimit, nuk iu nënshtrua një riprogramimi kaq masiv transkriptues gjatë eksperimentit. Megjithatë, numri i gjeneve të shprehura në mënyrë të ndryshme (DEG) ishte i njëjtë për Boregine dhe 83A:476 në 12 HPI. Si Mandelup ashtu edhe popullata 22660 treguan maja DEG në pikën e fundit kohore (48 l/s), duke treguar një vonesë relative në përgjigjet mbrojtëse.
Meqenëse 83A:476 iu nënshtrua riprogramimit masiv të transkriptomit në përgjigje të C. lupini në 6 HPI krahasuar me të gjitha linjat e tjera, ~91% e DEG-ve të vëzhguara në këtë pikë kohore ishin specifike për linjën (Fig. 1). Megjithatë, pati disa mbivendosje në përgjigjet e hershme midis linjave të studimit, pasi 68.5%, 50.9% dhe 52.6% e DEG në Boregine, Mandelup dhe popullatën 22660, përkatësisht, mbivendoseshin me ato të gjetura në 83A:476 në pika të caktuara në kohë. Megjithatë, këto DEG përbënin vetëm një pjesë të vogël (0.97–1.70%) të të gjitha DEG-ve të zbuluara aktualisht duke përdorur 83A:476. Përveç kësaj, 11 DEG nga të gjitha linjat ishin koherente në këtë kohë (Tabelat Plotësuese S4-S6), duke përfshirë komponentët e zakonshëm të përgjigjeve mbrojtëse të bimëve: proteina e transferimit të lipideve (TanjilG_32225), enzima endoglukan-1,3-β-glukozid (TanjilG_23384), dy proteina të induktueshme nga stresi si SAM22 (TanjilG_31528 dhe TanjilG_31531), proteina bazike e lateksit (TanjilG_32352) dhe dy proteina strukturore të murit qelizor të pasura me glicinë (TanjilG_19701 dhe TanjilG_19702). Kishte gjithashtu një mbivendosje relativisht të lartë në përgjigjet e transkriptomave midis 83A:476 dhe Boregine në 24 HPI (gjithsej 16-38% DEG) dhe midis Mandelup dhe Popullatës 22660 në 48 HPI (gjithsej 14-20% DEG).
Diagrami i Venn-it që tregon numrin e gjeneve të shprehura në mënyrë të ndryshme (DEG) në linjat e lupinës me gjethe të ngushta (NLL) të inokuluara me Colletotrichum lupini (lloji Col-08 i marrë nga fushat e lupinës në Wierzhenice, Poloni, 1999). Linjat NLL të analizuara ishin: 83A:476 (rezistente, që mbart alelin Lanr1), Boregine (rezistente, prejardhja gjenetike e panjohur), Mandelup (mesatarisht rezistente, që mbart alelin AnMan) dhe popullata 22660 (shumë e ndjeshme). Shkurtesa hpi qëndron për orë pas vaksinimit. Vlerat zero janë hequr për të thjeshtuar grafikun.
Seti i gjeneve të mbishprehura në 6 hpi u analizua për praninë e domeneve kanonike të gjenit R (Tabela Plotësuese S7). Ky studim zbuloi induksionin transkriptom të gjeneve klasike të rezistencës ndaj sëmundjeve vetëm me domene NBS-LRR në 83A:476. Ky set përbëhej nga një gjen TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), pesë gjene CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 dhe tanjilg_16162), dhe katër NBS-LR, Tanjilg_16162), dhe katër NBS-LRRE (tanjilg_16162), si dhe katër NBS-Lrr (tanjilg_16162) dhe katër NBS-LRR (TANJILG_16162). Të gjitha këto gjene kanë domene kanonike të rregulluara në sekuenca të konservuara. Përveç gjeneve të domenit NBS-LRR, disa kinaza RLL u aktivizuan në 6 hpi, përkatësisht një në Boregine (TanjilG_19877), dy në Mandelup (TanjilG_07141 dhe TanjilG_19877) dhe në popullatën 22660 (TanjilG_09014 dhe TanjilG_10361) dhe dy në 83A 27:476.
Gjenet me shprehje të ndryshuar ndjeshëm në përgjigje të inokulimit me C. lupini (lloji Col-08) iu nënshtruan analizës së pasurimit të Ontologjisë së Gjeneve (GO) (Tabela Plotësuese S8). Termi i procesit biologjik më i mbipërfaqësuar ishte "GO:0006952 përgjigje mbrojtëse" i cili u shfaq në 6 nga 16 kombinime (koha × vija) me rëndësi të lartë (vlera P < 0.001) (Fig. 2). Termi i procesit biologjik më i mbipërfaqësuar ishte "GO:0006952 përgjigje mbrojtëse" i cili u shfaq në 6 nga 16 kombinime (koha × vija) me rëndësi të lartë (vlera P < 0.001) (Fig. 2). Наиболее часто черезмерно представленным термином biologicheskogo processa был «GO: 0006952 përщитный ответ», который появлялся во 6 nga 16 (vремя × liniя) kombinimi me высоко, (0006952). Termi i procesit biologjik më i mbipërfaqësuar ishte 'GO:0006952 përgjigje mbrojtëse', i cili u shfaq në 6 nga 16 kombinime (kohë × prejardhje) me rëndësi të lartë (vlera P < 0.001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 Termi më përfaqësues i procesit biologjik është "GO:0006952 përgjigje mbrojtëse", i cili shfaqet në 6 nga 16 kombinimet (时间×线), me rëndësi të lartë (vlera P < 0.001) (图2). Наиболее часто черезмерно представленным термином biologicheskogo processa был «GO: 0006952 Defense Response», koторый появлялся во 6 од 16 kombinaciy (vremya × liniя) me высокой значимостью (2.00) <0,000 P. Termi i procesit biologjik më i mbipërfaqësuar ishte 'GO:0006952 Reagim Mbrojtës', i cili u shfaq në 6 nga 16 kombinime (koha × vija) me rëndësi të lartë (vlera P < 0.001) (Fig. 2).Ky term u përfaqësua tepër në dy pika kohore në 83A: 476 dhe Boregine (6 dhe 24 hpi) dhe në një pikë kohore në Mandelup dhe Popullatën 22660 (përkatësisht 12 dhe 6 hpi). Ky është një rezultat i pritur, që nxjerr në pah përgjigjen antifungale të linjave rezistente. Përveç kësaj, 83A:476 iu përgjigj C. lupini duke nxitur me shpejtësi gjenet që lidhen me shpërthimin oksidativ të përfaqësuar nga termi "procesi redoks GO:0055114", duke treguar një përgjigje specifike mbrojtëse, ndërsa Boregine zbuloi përgjigje specifike mbrojtëse, të lidhura me termin 'GO'. :0006950 Përgjigje ndaj stresit”. Popullata 22660 aktivizoi përgjigjen horizontale të rezistencës që përfshinte metabolitët sekondarë, duke theksuar numrin e tepërt të termave "GO:0016104 Procesi i biosintezës së triterpeneve" dhe "GO:0006722 Procesi i metabolizmit të triterpeneve" (të dy termat i përkasin të njëjtit grup gjenesh), duke marrë parasysh rezultatet e analizës së pasurimit të termit GO, stabiliteti i reaksionit Mandelup ishte midis Boregine dhe Popullatës 22660. Përveç kësaj, reaksioni i hershëm 83A:476 (6 hpi) dhe reaksioni i vonuar Mandelup dhe Popullata 22660 përfshijnë termin GO:0015979 'fotosintezë' dhe procese të tjera biologjike të lidhura.
Termat e ontologjisë së gjenit të bioproceseve të përzgjedhura në shënimin e gjeneve të shprehura në mënyrë të ndryshme gjatë përgjigjeve transkriptomike të lupinës me gjethe të ngushta (NLL) të inokuluar me lupinë të antraksit (lloji Col-08 i marrë nga fushat e lupinës në Wierzhenice, Poloni, në vitin 1999) janë shumë të ekzagjeruara. Linjat NLL të analizuara ishin: 83A:476 (rezistente, që mbante alelin homozigot Lanr1), Boregine (rezistente, prejardhje gjenetike e panjohur), Mandelup (mesatarisht rezistente, që mbante alelin homozigot AnMan) dhe popullata 22660 (e ndjeshme).
Meqenëse ky studim synonte të identifikonte gjenet që kontribuojnë në rezistencën ndaj antrakonozës, gjenet e caktuara për termat GO “GO: 0006952 Përgjigje mbrojtëse” dhe “GO: 0055114 Procese redoks” u analizuan me vlera prerëse pasi mesataret bazë ≥ 30 me të paktën një vijë. × pikë në kohë duke kombinuar vlera statistikisht të rëndësishme të log2 (ndryshimi i fishit). Numri i gjeneve që përmbushnin këto kritere ishte 65 për GO:0006952 dhe 524 për GO:0055114.
83A:476 zbuloi dy maja DEG të shënuara me termin GO:0006952, e para në 6 gjene për inç (64 gjene, rregullim lart dhe poshtë) dhe e dyta në 24 gjene për inç (15 gjene, vetëm rregullim lart). Boregine tregoi gjithashtu se GO:0006952 arriti kulmin në të njëjtën pikë kohore, por me më pak DEG (11 dhe 8) dhe aktivizim preferencial. Mandeloop tregoi dy maja të GO:0006952 në 12 dhe 48 HPI, të dyja mbanin 12 gjene (e para me gjene aktivizuese, dhe e dyta vetëm me gjene shtypëse), ndërsa popullata 22660 në 6 HPI (13 gjene) kishte një mbizotërim më të madh të rregullimit të pikut të rritjes. Duhet të theksohet se 96.4% e GO:0006952 DEG në këto maja kishin të njëjtin lloj përgjigjeje (lart ose poshtë), duke treguar një mbivendosje të konsiderueshme në përgjigjet mbrojtëse pavarësisht ndryshimeve në numrin e gjeneve të përfshira. Grupi më i madh i sekuencave që lidhen me termin GO:0006952 kodon Proteinën e Mesazhit të Lidhur me Stresin e Urisë 22 (të ngjashme me SAM22), e cila i përket kladës së proteinave të lidhura me patogjenezën e klasës 10 (PR-10) dhe proteinës bazë (proteina latex similar (MLP-like)) (Fig. 3). Të dy grupet ndryshonin në natyrën e shprehjes dhe drejtimin e përgjigjes. Gjenet që kodojnë proteinat e ngjashme me SAM22 treguan induksion të qëndrueshëm dhe domethënës në pikat e hershme kohore (6 ose 12 hpi) dhe në përgjithësi nuk reagonin në fund të eksperimentit (48 hpi), ndërsa proteinat e ngjashme me MLP treguan koordinim në 6 hpi. hpi. 83A:476 dhe Mandelup në 48 hp/in, pothuajse të gjitha pikat e tjera të të dhënave nuk reagonin. Përveç kësaj, ndryshimet në profilet e shprehjes së gjeneve të proteinave të ngjashme me SAM22 ndoqën ndryshueshmërinë e vëzhguar në rezistencën ndaj antrakonozës, pasi linjat më rezistente kishin më shumë pika kohore që i induktonin ndjeshëm këto gjene sesa gjenet më të ndjeshme. Një tjetër gjen PR-10 i ngjashëm me LlR18A/B tregoi një model shprehjeje shumë të ngjashëm me gjenin e proteinës së ngjashme me SAM22.
U identifikuan komponentët kryesorë të termit të procesit biologjik "GO:0006952 Response Defense" dhe modelet e shprehjes së gjeneve kandidate të aleleve Lanr1 dhe AnMan. Shkalla Log2 përfaqëson vlerat log2 (ndryshimi i fishuar) midis bimëve të inokuluara (Colletotrichum lupini, lloji Col-08, i marrë nga fushat e lupinës, Wizhenica, Poloni, 1999) dhe bimëve kontrolluese (të inokuluara në mënyrë të rreme) në të njëjtën pikë kohore. U analizuan linjat e mëposhtme të lupinës me gjethe të ngushta: 83A:476 (rezistente, që mbart alelin homozigot Lanr1), Boregine (rezistente, sfondi gjenetik i panjohur), Mandelup (mesatarisht rezistente, që mbart alelin homozigot AnMan) dhe Popullata 22660 (e ndjeshme).
Përveç kësaj, u vlerësuan profilet e shprehjes së gjeneve kandidate të ARN-seq Lanr1 (TanjilG_05042) dhe AnMan (TanjilG_12861) (Fig. 3). Gjeni TanjilG_05042 tregoi një përgjigje (aktivizim) të rëndësishme në 83A:476 vetëm në pikën e parë kohore (6 hpi), ndërsa TanjilG_12861 ishte i rëndësishëm në Mandeloop vetëm në dy pika kohore: 6 hpi (rregullim poshtë) dhe 24 hpi (6 hpi). Me.). i rregullueshëm) ).
Gjenet më të mbishprehura në termin GO:0055114 "proces redoks" ishin gjenet që kodifikonin proteinat e citokromit P450 dhe peroksidazën (Fig. 4). Për mostrat e izoluara nga 83A:476 në 6 HPI, vlerat maksimale ose minimale log2 (ndryshimi i fishuar) (për 86.6% të gjeneve) u vunë re përgjithësisht midis bimëve të inokuluara dhe bimëve të kontrollit, duke theksuar përgjigjen e lartë të këtij gjenotipi ndaj seksit të inokuluar. 83A:476 tregoi GO: 0055114 DEG më të rëndësishëm në 6 hpi (503 gjene), ndërsa pjesa tjetër e linjave në 48 hpi (Boregine, 31 gjene; ​​Mandelup, 85 gjene; ​​dhe Popullata 22660, 78 gjene)). Në shumicën e gjeneve të familjes GO:0055114, u vunë re dy lloje përgjigjesh ndaj vaksinimit (aktivizimi dhe frenimi). Është interesante se deri në 97.6% të DEG-ve të identifikuara për termin GO: 0055114 në Mandelupe me 48 hp. Këto vëzhgime sugjerojnë që, pavarësisht shkallës dukshëm më të vogël (domethënë, numri i gjeneve redoks të mutuara, 85 kundrejt 503), modeli i përgjigjeve të vonuara të transkriptomës së mandeloup ndaj antrakonozës është i ngjashëm me përgjigjen e hershme të 83A:476. Në Boregine dhe Popullatën 22660, kjo konvergjencë është më e ulët në 51.6% dhe 75.6%, përkatësisht.
U zbuluan modelet e shprehjes së komponentëve kryesorë të termit të procesit biologjik "GO:0055114 Procesi Redoks". Shkalla Log2 përfaqëson vlerat log2 (ndryshimi i fishuar) midis bimëve të inokuluara (Colletotrichum lupini, lloji Col-08, i marrë nga fushat e lupinës, Wizhenica, Poloni, 1999) dhe bimëve kontrolluese (të inokuluara artificialisht) në të njëjtën pikë kohore. U analizuan linjat e mëposhtme të lupinës me gjethe të ngushta: 83A:476 (rezistente, që mbart alelin homozigot Lanr1), Boregine (rezistente, prejardhja gjenetike e panjohur), Mandelup (mesatarisht rezistente, që mbart alelin homozigot AnMan) dhe Popullata 22660 (e ndjeshme).
83A:476 Përgjigjet transkriptomike ndaj inokulimit me C. lupini (lloji Col-08) përfshinin gjithashtu heshtjen e koordinuar të gjeneve që i atribuohen termit GO:0015979 "fotosintezë" dhe proceseve të tjera biologjike të lidhura (FIG. 5). Ky grup GO:0015979 DEG përmbante 105 gjene që ishin shtypur ndjeshëm në 6 hpi në 83A:476. Në këtë nëngrup, 37 gjene u ulën gjithashtu në Mandelup në 48 HPI dhe 35 në të njëjtën pikë kohore në popullatën 22660, duke përfshirë 19 DEG të përbashkëta për të dy gjenotipet. Asnjë DEG i lidhur me termin GO: 0015979 nuk u aktivizua ndjeshëm në asnjë kombinim (rreshti x koha).
U zbuluan modelet e shprehjes së komponentëve kryesorë të termit të procesit biologjik "GO:0015979 Fotosinteza". Shkalla Log2 përfaqëson vlerat log2 (ndryshimi i fishuar) midis bimëve të inokuluara (Colletotrichum lupini, lloji Col-08, i marrë nga fushat e lupinës, Wizhenica, Poloni, 1999) dhe bimëve kontrolluese (të inokuluara artificialisht) në të njëjtën pikë kohore. U analizuan linjat e mëposhtme të lupinës me gjethe të ngushta: 83A:476 (rezistente, që mban alelin homozigot Lanr1), Boregine (rezistente, prejardhja gjenetike e panjohur), Mandelup (mesatarisht rezistente, që mban alelin homozigot AnMan) dhe Popullata 22660 (e ndjeshme).
Bazuar në rezultatet e analizës diferenciale të shprehjes dhe me sa duket të përfshirë në përgjigjet mbrojtëse kundër kërpudhave patogjene, ky grup prej shtatë gjenesh u zgjodh për përcaktimin sasior të profileve të shprehjes me anë të PCR në kohë reale (Tabela Plotësuese S9).
Gjeni i supozuar i proteinës TanjilG_10657 u induktua ndjeshëm në të gjitha linjat dhe pikat kohore të studiuara krahasuar me bimët kontrolluese (imitative) (Tabelat Plotësuese S10, S11). Përveç kësaj, profili i shprehjes së TanjilG_10657 tregoi një trend në rritje gjatë rrjedhës së eksperimentit për të gjitha linjat. Popullata 22660 tregoi ndjeshmërinë më të lartë të TanjilG_10657 ndaj inokulimit me aktivizim 114-fish dhe nivelin më të lartë relativ të shprehjes (4.4 ± 0.4) në 24 HPI (Fig. 6a). Gjeni i proteinës PR10 LlR18A TanjilG_27015 gjithashtu tregoi aktivizim në të gjitha linjat dhe pikat kohore, me rëndësi statistikore në shumicën e pikave të të dhënave (Fig. 6b). Ngjashëm me TanjilG_10657, niveli më i lartë relativ i shprehjes së TanjilG_27015 u vu re në popullatën e inokuluar 22660 në 24 HPI (19.5 ± 2.4). Gjeni i endokitinazës acide TanjilG_04706 u rrit ndjeshëm në të gjitha linjat dhe në të gjitha pikat kohore përveç Boregine 6 hpi (Fig. 6c). Ai u induktua fuqishëm në pikën e parë kohore (6 HPI) në 83A:476 (me 10.5 herë) dhe u rrit në mënyrë të moderuar në linjat e tjera (me 6.6-7.5 herë). Gjatë eksperimentit, shprehja e TanjilG_04706 mbeti në nivele të ngjashme në 83A:476 dhe Boregine, ndërsa në Mandelup dhe Popullatën 22660 u rrit ndjeshëm, duke arritur vlera relativisht të larta (5.9 ± 1.5 dhe 6.2 ± 1.5, përkatësisht). Gjeni i ngjashëm me endoglukan-1,3-β-glukozidazën TanjilG_23384 tregoi aktivizim të lartë në dy pikat e para kohore (6 dhe 12 hpi) në të gjitha linjat përveç popullatës 22660 (Fig. 6d). Nivelet më të larta të shprehjes relative të TanjilG_23384 u vunë re në pikën e dytë kohore (12 hpi) në Mandelup (2.7 ± 0.3) dhe 83A:476 (1.5 ± 0.1). Në 24 HPI, shprehja e TanjilG_23384 ishte relativisht e ulët në të gjitha linjat e studiuara (nga 0.04 ± 0.009 në 0.44 ± 0.12).
Profilet e shprehjes së gjeneve të përzgjedhura (ag) të zbuluara nga PCR sasiore. Numrat 6, 12 dhe 24 përfaqësojnë orë pas vaksinimit. Gjenet LanDExH7 dhe LanTUB6 u përdorën për normalizim dhe LanTUB6 u përdor për kalibrimin ndër-seri. Shiritat e gabimit përfaqësojnë devijimin standard bazuar në tre replikime biologjike, secila prej të cilave është mesatarja e tre replikimeve teknike. Rëndësia statistikore e ndryshimeve në nivelet e shprehjes midis bimëve të inokuluara (Colletotrichum lupini, lloji Col-08, i marrë në vitin 1999 nga fusha e lupinës në Wierzenica, Poloni) dhe bimëve të kontrollit (të inokuluara simuluese) është shënuar mbi pikat e të dhënave (*vlera P < 0.05, **vlera P ≤ 0.01, ***vlera P ≤ 0.001). Rëndësia statistikore e ndryshimeve në nivelet e shprehjes midis bimëve të inokuluara (Colletotrichum lupini, lloji Col-08, i marrë në vitin 1999 nga fusha e lupinës në Wierzenica, Poloni) dhe bimëve të kontrollit (të inokuluara simuluese) është shënuar mbi pikat e të dhënave (*vlera P < 0.05, **vlera P ≤ 0.01, ***vlera P ≤ 0.001). Статистическая значитемость различий во уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, poluchen në 1999 g. со поля люпина во Верженице, Польша) и надгледно инди точками данных (* kuptimi P < 0,05, ** kuptimi P ≤ 0,01, ***kuptimi P ≤ 0,001). Dallime statistikisht të rëndësishme në nivelet e shprehjes midis bimëve të inokuluara (Colletotrichum lupini, lloji Col-08, i marrë në vitin 1999 nga një fushë lupine në Wierzhenice, Poloni) dhe bimëve të kontrollit (të inokuluara në mënyrë të rreme) janë vërejtur mbi pikat e të dhënave (*vlera P < 0.05, **vlera P ≤ 0.01, ***vlera P ≤ 0.001).接种 (Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在敼数0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对椥 ）之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, 001, ***P. Statistice në rritje të madhe në shprehjet e shtypjes mezhdu inokulirovannыmi (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, poluchennый со полей люпина во Верженице, Poloni, në 1999 në 1999) отмечены над точкими данных (* kuptimi P < 0,05, ** P-kuptimi ≤ 0,01, ***P-kuptimi ≤ 0,001). Dallime statistikisht të rëndësishme në nivelet e shprehjes midis bimëve të inokuluara (Colletotrichum lupini, lloji Col-08, i marrë nga fushat e lupinës në Verzhenice, Poloni, në vitin 1999) dhe bimëve të kontrollit (të inokuluara në mënyrë të rreme) janë vërejtur mbi pikat e të dhënave (*vlera P < 0.05, **vlera P ≤ 0.01, ***vlera P ≤ 0.001).Linjat NLL të analizuara ishin: 83A:476 (rezistente, që mbart alelin homozigot Lanr1), Mandelup (mesatarisht rezistente, që mbart alelin homozigot AnMan), Boregine (rezistente, prejardhje gjenetike e panjohur) dhe popullata 22660 (e ndjeshme).
Gjeni kandidat TanjilG_05042 në lokusin Lanr1 tregoi një model shprehjeje dukshëm të ndryshëm nga profilet e marra nga studimet e ARN-seq (Fig. 6e). Një aktivizim i rëndësishëm i këtij gjeni u vu re në Mandelup dhe popullatën 22660 (deri në 39.7 dhe 11.7 herë, përkatësisht), duke rezultuar në nivele relativisht të larta shprehjeje (deri në 1.4 ± 0.14 dhe 7.2 ± 1.3, përkatësisht). 83A:476 zbuloi gjithashtu një rritje të gjenit TanjilG_05042 (deri në 3.8-fish), megjithatë, nivelet relative të shprehjes së arritura (0.044 ± 0.002) ishin më shumë se 30 herë më të ulëta se ato të vëzhguara në Mandelup dhe popullatën 22660. të analizuara nga qPCR treguan ndryshime të rëndësishme në nivelet e shprehjes midis gjenotipeve në variantet e vaksinuara simuluese (kontroll), duke arritur një ndryshim 58-fish midis popullatave 22660 dhe 83A:476, si dhe midis popullatave 22660 dhe 22660. Një ndryshim dyfish u arrit midis Boregine dhe Mandalup.
Gjeni kandidat në lokusin AnMan, TanjilG_12861, u aktivizua në përgjigje të vaksinimit në 83A:476 dhe Mandelup, ishte neutral në popullatën 22660 dhe u ul në Boregine (Fig. 6f). Shprehja relative e gjenit TanjilG_12861 ishte më e larta në 83A:476 të inokuluar (0.14±0.01). Gjeni i proteinës së shokut nga nxehtësia i klasës I, TanjilG_05080 HSP17.4, me kapacitet 17.4 kDa, tregoi nivele më të ulëta relative të shprehjes në të gjitha llojet dhe pikat kohore të studiuara (Fig. 6g). Vlera më e lartë u vu re në 24 HPI në popullatën 22660 (0.14 ± 0.02, një rritje tetëfish në përgjigje të vaksinimit).
Krahasimi i profileve të shprehjes së gjeneve (Fig. 7) zbuloi një korrelacion të lartë midis TanjilG_10657 dhe katër gjeneve të tjera: TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.80) dhe TanjilG_04706 (r = 0.79). Rezultate të tilla mund të tregojnë bashkë-rregullim të këtyre gjeneve gjatë përgjigjeve mbrojtëse. Gjenet TanjilG_12861 dhe TanjilG_23384 treguan profile të ndryshme shprehjeje me vlera më të ulëta të koeficientit të korrelacionit Pearson (nga 0.08 në 0.43 dhe -0.19 në 0.28, përkatësisht) krahasuar me gjenet e tjera.
Korrelacionet midis profileve të shprehjes së gjeneve u zbuluan duke përdorur PCR sasiore. Linjat e mëposhtme të lupinës me gjethe të ngushta u analizuan: 83A:476 (rezistente, që mbart alelin homozigot Lanr1), Mandelup (mesatarisht rezistente, që mbart alelin homozigot AnMan), Boregine (rezistente, prejardhja gjenetike e panjohur) dhe Popullata 22660 (e ndjeshme). U llogaritën tre pika kohore (6, 12 dhe 24 orë pas inokulimit), duke përfshirë bimët e inokuluara (Colletotrichum lupini, lloji Col-08, i marrë nga fushat e lupinës në Wierzhenice, Poloni, në vitin 1999) dhe bimët kontrolluese (të inokuluara në mënyrë të rreme). Shkalla tregon vlerën e koeficientit të korrelacionit Pearson.
Bazuar në të dhënat e marra me 6 kuaj fuqi për inç, WGCNA u krye në 9981 DEG të identifikuar duke krahasuar bimët e inokuluara dhe ato të kontrollit për t'u përqendruar në përgjigjet e hershme mbrojtëse (Tabela Plotësuese S12). U gjetën njëzet e dy module gjenesh (grupime) me profile shprehjeje të korreluara (pozitive ose negative) midis gjenotipeve dhe varianteve eksperimentale. Mesatarisht, nivelet e shprehjes së gjeneve ishin në rënie në rendin 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popullata 22660 (megjithatë, në të dy variantet, kjo prirje ishte më e fortë në bimët kontrolluese). Mesatarisht, nivelet e shprehjes së gjeneve ishin në rënie në rendin 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popullata 22660 (megjithatë, në të dy variantet, kjo prirje ishte më e fortë në bimët kontrolluese). Në mesnem уровни экспрессии генови снижались во порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popullsia 22660 (in обоих варијантах, однако, эта tendencija была сильнее у контрольных во пораст). Mesatarisht, nivelet e shprehjes së gjeneve u ulën në rendin 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popullata 22660 (megjithatë, në të dy variantet kjo tendencë ishte më e fortë në bimët kontrolluese).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Popullsia 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> popullsia 22660 的 顺序 下降 （， 下降 （， 圸在 在 植物 中 更）.............. Në mesnem уровни экспрессии генови снижались во 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popullsia 22660 (однако в обоих варијантах эта tendencija была сильнее у контрольных во пораст). Mesatarisht, nivelet e shprehjes së gjeneve u ulën në serinë 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popullata 22660 (megjithatë, në të dy variantet, kjo tendencë ishte më e fortë në bimët kontrolluese).Vaksinimi rezultoi në rritje të shprehjes së gjeneve, veçanërisht në modulet 18, 19, 14, 6 dhe 1 (në rend zbritës të efektit), rregullim negativ (p.sh. modulet 9 dhe 20) ose me efekte neutrale (p.sh. modulet 11, 22, 8 dhe 13). Analiza e pasurimit të termit GO (Tabela Plotësuese S13) zbuloi "GO: 0006952 Përgjigje mbrojtëse" për modulin e inokuluar (18) me aktivizim maksimal, duke përfshirë gjenet e analizuara nga qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 dhe TanjilG_27015), si dhe shumë module fotosinteze të inokuluara më së shumti (9). Përqendruesi i Modulit 18 (Fig. 8) u identifikua si gjeni TanjilG_26536 që kodon proteinën LlR18B të ngjashme me PR-10, dhe përqendruesi i modulit 9 u identifikua si gjeni TanjilG_28955 që kodon proteinën PsbQ të fotosistemit II. Një gjen kandidat i rezistencës ndaj antrakonozës Lanr1, TanjilG_05042, u gjet në modulin 22 (Fig. 9) dhe shoqërohet me termat "GO:0044260 Procese metabolike makromolekulare qelizore" dhe "GO:0006355 Rregullimi transkriptues, modelimi i ADN-së" që mbart qendrën TanjilG_01212. Gjeni kodon faktorin e transkriptimit të stresit të nxehtësisë A-4a (HSFA4a).
Analiza e rrjetit të ponderuar të bashkë-shprehjes së gjeneve të moduleve me terma të procesit biologjik të mbipërfaqësuar "GO: 0006952 Përgjigje mbrojtëse". Lidhja u thjeshtua për të nxjerrë në pah katër gjenet e analizuara nga qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 dhe TanjilG_27015).
Analiza e rrjetit të ponderuar të bashkë-shprehjes së gjenit të një moduli me një term të procesit biologjik të mbipërfaqësuar "GO: 0006355: Rregullimi transkriptues, modelimi i ADN-së" dhe që mbart një gjen kandidat të rezistencës ndaj antrakonozës Lanr1 TanjilG_05042. Lidhja u thjeshtua për të izoluar gjenin TanjilG_05042 dhe gjenin qendror TanjilG_01212.
Testet e rezistencës ndaj antrakonozës të mbledhura në Australi treguan se shumica e kultivarëve të lëshuar herët ishin të ndjeshëm; Kalya, Coromup dhe Mandelup janë përshkruar si mesatarisht rezistentë, ndërsa Wonga, Tanjil dhe 83A:476 janë përshkruar si shumë rezistentë26,27,31. kishin të njëjtin alel rezistence, të caktuar Lanr1, dhe Coromup dhe Mandelup kishin një alel të ndryshëm, të caktuar AnMan10, 26, 39, ndërsa Kalya kaloi një alel të ndryshëm. , Lanr2. Testimi për rezistencë ndaj antrakonozës në Gjermani rezultoi në identifikimin e një linje rezistente Bo7212 me një alel kandidat tjetër përveç Lanr1, të caktuar LanrBo36.
Studimi ynë zbuloi një frekuencë shumë të ulët (rreth 6%) të alelit Lanr1 në plazmën e testuar. Ky vëzhgim është në përputhje me rezultatet e shqyrtimit të plazmës së Evropës Lindore duke përdorur shënuesit Anseq3 dhe Anseq4, të cilët treguan se aleli Lanr1 është i pranishëm vetëm në dy linja bjelloruse. Kjo sugjeron që aleli Lanr1 nuk përdoret ende gjerësisht nga programet lokale të mbarështimit, ndryshe nga Australia, ku është një nga alelet kryesore për mbarështimin e asistuar nga shënuesit. Kjo mund të jetë për shkak të nivelit më të ulët të rezistencës së ofruar nga aleli Lanr1 në kushtet e fushës evropiane krahasuar me raportin australian. Përveç kësaj, studimet e antrakonozës në zonat me reshje të larta në Australi kanë treguar se përgjigjet e rezistencës të ndërmjetësuara nga aleli Lanr1 mund të mos jenë efektive në kushtet e motit që favorizojnë rritjen dhe zhvillimin e shpejtë të patogjenit19,42. Në fakt, në studimin e tanishëm, disa simptoma të antrakonozës u vunë re edhe në gjenotipet që mbajnë alelin Lanr1, duke sugjeruar që rezistenca mund të zhduket në kushte optimale për zhvillimin e C. lupini. Përveç kësaj, interpretime të rreme pozitive të pranisë së shënuesve Anseq3 dhe Anseq4, të cilët janë afërsisht 1 cM nga lokusi Lanr1, janë të mundshme 28,30,43.
Studimi ynë tregoi se 83A:476, që mbante alelin Lanr1, iu përgjigj inokulimit të C. lupini me riprogramim të transkriptomit në shkallë të gjerë në pikën e parë kohore të analizuar (6 hpi), ndërsa në Mandelup, që mbante alelin AnMan, përgjigjet transkriptomike u vunë re shumë më vonë (nga 24 në 48 hp). Këto ndryshime kohore në përgjigjet mbrojtëse shoqërohen me ndryshime në simptomat e sëmundjes, duke theksuar rëndësinë e njohjes së hershme të patogjenit për një përgjigje të suksesshme ndaj rezistencës. Për të infektuar indin bimor, sporet e antraksit duhet të kalojnë nëpër disa faza zhvillimi në sipërfaqen e strehuesit, duke përfshirë mbirjen, ndarjen qelizore dhe formimin e një apresoriumi. Një shtojcë është një strukturë infektive që ngjitet në sipërfaqen e strehuesit dhe lehtëson depërtimin në indet e strehuesit. Kështu, sporet e C. gloeosporioides në ekstraktin e bizeleve treguan ndarjen e parë të bërthamës pas 75-90 minutash inkubacion, formimin e një tubi embrioni pas 90-120 minutash dhe shtypjen pas 4 orësh 45. Mango C. gloeosporioides tregoi më shumë se 40% mbirje konidiale pas 3 orësh inkubim dhe rreth 20% formim të apresorëve pas 4 orësh. Gjeni CAP20 i lidhur me virulencën i C. gloeosporioides tregoi aktivitet transkriptues në konidet që formojnë epifite pas 3.5 orësh inkubim në dyll sipërfaqësor të avokados me përqendrime të larta të proteinës CAP20 pas 4 orësh e 46 minutash. Në mënyrë të ngjashme, aktiviteti i gjeneve të biosintezës së melaninës në C. trifolii u induktua gjatë një inkubimi 2-orësh, i ndjekur nga formimi i një apresoriumi pas 1 ore. Studimet e indeve të gjetheve kanë treguar se luleshtrydhet e inokuluara me C. acutatum kanë shtypjen e parë në 8 hpi, ndërsa domatet e inokuluara me C. coccodes kanë shtypjen e parë në 4 hpi48,49. kryesisht në përputhje me shkallën kohore të procesit infektiv të Colletotrichum spp. Përgjigjet e shpejta mbrojtëse ndaj 83A:476 sugjerojnë përfshirjen e gjeneve të rezistencës së bimëve dhe imunitetit të shkaktuar nga efektori (ETI) në këtë linjë, ndërsa përgjigjet e vonuara të Mandelup mbështesin hipotezën e imunitetit të shkaktuar nga modeli molekular i mikro-shoqëruar (MTI) 50. Përgjigje të hershme ndaj 83A: 476 dhe Mandelup. Mbivendosja e pjesshme midis gjeneve të rregulluara lart ose poshtë në përgjigjen e vonuar gjithashtu mbështet këtë koncept, pasi ETI shpesh konsiderohet të jetë një përgjigje e përshpejtuar dhe e përmirësuar e MTI që kulmon në vdekjen e programuar të qelizave në vendin e infeksionit, e njohur si shok anafilaktik 51,52.
Shumica e gjeneve që i atribuohen termit të mbi-përfaqësuar Gene Ontology GO:0006952 "Reagim Mbrojtës" janë 11 homologët e proteinës së mesazhit të agjërimit të induktuar nga stresi 22 (e ngjashme me SAM22) dhe shtatë proteinat kryesore të ngjashme me proteinat e lateksit (MLP). Proteinat 31, 34, 43 dhe 423 treguan ngjashmëri sekuence. Gjenet e ngjashme me SAM22 treguan aktivizim të konsiderueshëm që zgjati më shumë, duke treguar nivele të rritura të rezistencës ndaj antrakonozës (83A:476 dhe Boregine). Megjithatë, gjenet e ngjashme me MLP u ulën vetëm në linjat që mbanin alelin e rezistencës kandidate (83A:476/Lanr1 në 6 hpi dhe Mandelup/AnMan në 24 hpi). Duhet të theksohet se të gjithë homologët e identifikuar të ngjashëm me SAM22 burojnë nga një grumbull gjenesh që përfshin afërsisht 105 kb, ndërsa gjenet e ngjashme me MLP burojnë nga rajone të ndara të gjenomit. Aktivizimi i koordinuar i gjeneve të tilla të ngjashme me SAM22 u gjet edhe në studimin tonë të mëparshëm të rezistencës së NLL ndaj inokulimit me Diaporthetoxica, duke sugjeruar që ato janë të përfshira në komponentët horizontalë të përgjigjes mbrojtëse. Ky përfundim mbështetet edhe nga raportet e një përgjigjeje pozitive të gjeneve të ngjashme me SAM22 ndaj dëmtimit ose trajtimit me acid salicilik, induktorë kërpudhorë ose peroksid hidrogjeni.
Gjenet e ngjashme me MLP-në kanë treguar se i përgjigjen streseve të ndryshme abiotike dhe biotike, duke përfshirë infeksione bakteriale, virale dhe patogjene kërpudhore në shumë specie bimore55. Drejtimet e përgjigjes ndaj ndërveprimeve të caktuara midis bimëve dhe patogjenëve varionin nga një rritje e fortë (domethënë, gjatë infektimit të pambukut me Verticillium dahliae) në një rënie të ndjeshme (domethënë, pas infektimit të pemës së mollës me Alternaria spp.)56,57. Një ulje e ndjeshme e gjenit 423 të ngjashëm me MLP-në është vërejtur gjatë mbrojtjes së avokados ndaj infeksionit F. niger dhe gjatë infeksionit të pemës së mollës. Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola dhe Alternaria alternata janë patotipe të mollës58,59. Përveç kësaj, kaluset e mollës që shprehin tepër gjenin 423 të ngjashëm me MLP-në kishin shprehje më të ulët të gjeneve të lidhura me rezistencën dhe ishin më të ndjeshëm ndaj infeksionit kërpudhor59. Pas Fusarium oxysporum f, gjeni 423 i ngjashëm me MLP-në u shtyp gjithashtu në germoplazmën rezistente të fasules së zakonshme. cn. Infeksioni i fasules 60.
Anëtarë të tjerë të familjes PR-10 të identifikuar në studimin tonë ARN-seq ishin gjenet LlR18A dhe LlR18B në përgjigje të rritjes së rezistencës, si dhe gjeni i rritur (1 gjen) ose i ulur (3 gjene) për proteinën e transferimit të lipideve DIR1. Përveç kësaj, WGCNA thekson gjenin LlR18B si një qendër në këtë modul, i cili është shumë i ndjeshëm ndaj vaksinimit dhe mbart disa gjene mbrojtëse të përgjigjes. Gjenet LlR18A dhe LlR18B u induktuan në gjethet e verdha të lupinës në përgjigje të baktereve patogjene, si dhe në kërcejtë NLL pas inokulimit të D. toxica, ndërsa homologu i orizit i këtyre gjeneve, RSOsPR10, u induktua me shpejtësi nga një infeksion kërpudhor me sa duket i përfshirë në rrugën e sinjalizimit të acidit jasmonik53,61, 62. Gjeni DIR1 kodon proteina jospecifike të transportit të lipideve që janë të nevojshme për fillimin e rezistencës sistemike të fituar (SAR). Me zhvillimin e reaksioneve mbrojtëse, proteina DIR1 transportohet nga vatra e infeksionit përmes floemës për të nxitur SAR në organet e largëta. Është interesante se gjeni TanjilG_02313 DIR1 u induktua ndjeshëm në pikën e parë kohore në linjat 84A:476 dhe Popullatën 22660, por rezistenca ndaj antrakonozës u zhvillua me sukses vetëm në linjën 84A:476. Kjo mund të tregojë një nënfunksionalizim të gjenit DIR1 në NLL, pasi tre homologët e mbetur iu përgjigjën inokulimit vetëm në linjën 83A:476 me 6 hpi, dhe kjo përgjigje ishte e drejtuar poshtë.
Në studimin tonë, përbërësit më të zakonshëm që korrespondojnë me procesin biologjik të quajtur "procesi GO:0055114 Redoks" ishin proteina e citokromit P450, peroksidaza, acidi linoleik 9S-/13S-lipoksigjenaza dhe oksidaza e acidit 1-aminociklopropan-1-karboksilik. Përveç kësaj, WGCNA jonë përcakton homologun HSFA4a si një qendër që mbart module të tilla si kandidati i gjenit të rezistencës Lanr1 TanjilG_05042. HSFA4a është një përbërës i rregullimit redoks të varur të transkriptimit bërthamor në bimë.
Proteinat e citokromit P450 janë oksidoreduktaza që katalizojnë reaksionet e hidroksilimit të varur nga NADPH dhe/ose O2 në metabolizmin primar dhe sekondar, duke përfshirë metabolizmin e ksenobiotikëve, si dhe hormoneve, acideve yndyrore, steroleve, përbërësve të murit qelizor, biopolimerëve dhe biosintezën e komponimeve mbrojtëse 69. Në një studim tonë, ndryshueshmëria në funksionin e citokromit P450 të bimëve u zvogëlua nga -10.6 log2 (ndryshim i fishuar) në 5.7 për shkak të një numri të madh homologësh të ndryshuar (37) dhe ndryshimeve në modelet e përgjigjes midis gjeneve specifike, duke reflektuar një rishikim lart. Përdorimi vetëm i të dhënave të sekuencës së ARN-së për të sqaruar funksionin biologjik të supozuar të gjeneve NLL në një superfamilje kaq të madhe proteinash do të ishte shumë spekulative. Megjithatë, vlen të përmendet se disa gjene të citokromit P450 shoqërohen me rezistencë të shtuar ndaj kërpudhave ose baktereve patogjene, duke përfshirë një kontribut në reaksionet alergjike 69,70,71.
Peroksidazat e Klasës III janë enzima shumëfunksionale bimore të përfshira në një gamë të gjerë procesesh metabolike gjatë rritjes dhe zhvillimit të bimëve, si dhe në përgjigje të streseve mjedisore si kripësia, thatësira, intensiteti i lartë i dritës dhe sulmi i patogjenëve72. Peroksidazat janë të përfshira në bashkëveprimin e disa specieve bimore me Anthracis, duke përfshirë Stylosanthes humilis dhe C. gloeosporioides, Lens culinaris dhe C. truncatum, Phaseolus vulgaris dhe C. lindemuthianum, Cucumis sativus dhe C. lagenarium73,74,75,76. Përgjigja është shumë e shpejtë, ndonjëherë edhe në 4 HPI, përpara se kërpudha të depërtojë në indin e bimës73. Gjeni i peroksidazës iu përgjigj gjithashtu inokulimit të NLL me D. toxica. Përveç funksioneve të tyre tipike për të rregulluar shpërthimin oksidativ ose për të eliminuar stresin oksidativ, peroksidazat mund të ndërhyjnë në rritjen e patogjenëve duke krijuar barriera fizike bazuar në përforcimin e murit qelizor gjatë lignifikimit, nënnjësisë ose lidhjes së kryqëzuar të komponimeve specifike. Ky funksion mund t'i atribuohet in silico gjenit TanjilG_03329 që kodon një anion peroksidazë të supozuar që formon ligninë, e cila u rrit ndjeshëm në studimin tonë në linjën rezistente 83A:476 në 6 HPI, por jo në shtame dhe pika kohore të tjera që nuk reaguan.
9S-/13S-lipoksigjenaza e acidit linoleik është hapi i parë në rrugën oksidative të biosintezës së lipideve78. Produktet e kësaj rruge kanë funksione të shumëfishta në mbrojtjen e bimëve, duke përfshirë forcimin e murit qelizor përmes formimit të depozitave të kalozës dhe pektinës, dhe rregullimin e stresit oksidativ përmes prodhimit të specieve reaktive të oksigjenit79,80,81,82,83. Në studimin e tanishëm, shprehja e acidit linoleik 9S-/13S-lipoksigjenazës u ndryshua në të gjitha llojet, por në popullatën e ndjeshme 22660, mbizotëroi rritja në pika të ndryshme kohore, ndërsa në llojet që mbartin Lanr1 rezistent dhe alelin AnMan, ajo thekson diversifikimin e shtresës së oksilipinës në reaksionet mbrojtëse të antraksit midis këtyre gjenotipeve.
Homologu i 1-aminociklopropan-1-karboksilat oksidazës (ACO) u rrit ndjeshëm (9 gjene) ose u ul (2 gjene) kur u inokulua me lupinë. Me dy përjashtime, të gjitha këto përgjigje ndodhën në 6 hp. në 83A:476. Reaksioni enzimatik i ndërmjetësuar nga proteinat ACO është hapi që kufizon shpejtësinë në prodhimin e etilenit dhe për këtë arsye është shumë i rregulluar84. Etileni është një hormon bimor që luan një sërë rolesh në rregullimin e zhvillimit të bimëve dhe përgjigjes ndaj kushteve të stresit abiotik dhe biotik. Induksioni i transkriptimit të ACO dhe aktivizimi i rrugës së sinjalizimit të etilenit janë të përfshira në rritjen e rezistencës së orizit ndaj kërpudhës hemibiotrofe oryzae oryzae duke rregulluar prodhimin e specieve reaktive të oksigjenit dhe fitoaleksinave. Një proces shumë i ngjashëm i infeksionit të gjetheve i gjetur midis M. oryzae dhe C. lupini88,89, në sfondin e një rritjeje të ndjeshme të homologëve ACO në linjën 83A:476 të raportuar në këtë studim, zhvendos mundësinë e dhënies së rezistencës ndaj antrakonozës NLL. Etilenit, një hap qendror sinjalizues në rrugët molekulare.
Në studimin e tanishëm, shtypja në shkallë të gjerë e shumë gjeneve të lidhura me fotosintezën u vu re në 6 hpi në 83A:476 dhe në 48 hpi në Mandeloop dhe popullatën 22660. Shkalla dhe përparimi i këtyre ndryshimeve është proporcionale me nivelin. Rezistenca ndaj antrakonozës u vu re në këtë eksperiment. Kohët e fundit, shtypja e fortë dhe e hershme e transkripteve të lidhura me fotosintezën është raportuar në disa modele të ndërveprimeve bimë-patogjen, duke përfshirë bakteret dhe kërpudhat patogjene. Shpejtësia (nga 2 HPI në disa ndërveprime) dhe shtypja globale e gjeneve të lidhura me fotosintezën në përgjigje të infeksionit mund të shkaktojë imunitet të bimëve bazuar në vendosjen e specieve reaktive të oksigjenit dhe ndërveprimin e tyre me rrugën e acidit salicilik për të ndërmjetësuar reaksionet alergjike 90,94.
Si përfundim, mekanizmat e reagimit mbrojtës të propozuar për linjën më rezistente (83A:476) përfshijnë njohjen e shpejtë të patogjenit nga gjeni R (me sa duket TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) dhe sinjalizimin e acidit salicilik dhe etilenit të ndërmjetësuar nga përgjigja alergjike, e ndjekur nga vendosja e veprimit SAR me rreze të gjatë mbështetet nga proteina DIR-1. Duhet të theksohet se periudha biotrofike për infeksionin C. lupini është shumë e shkurtër (afërsisht 2 ditë), e ndjekur nga rritja nekrotike95. Kalimi midis këtyre fazave mund të shoqërohet me nekrozë dhe shprehje të proteinave të induktueshme nga etilen që veprojnë si shkaktarë për reaksione të mbindjeshmërisë në bimët pritëse. Prandaj, dritarja kohore për kapjen e suksesshme të C. lupini në fazën biotrofike është shumë e ngushtë. Riprogramimi i gjeneve të shoqëruara me redoks dhe fotosintezë të vëzhguar në 83A:476 në 6 hpi është në përputhje me përparimin e hifeve kërpudhore dhe paralajmëron zhvillimin e një përgjigjeje të suksesshme mbrojtëse në fazën biotrofike. Përgjigjet transkriptomike të Mandelup dhe popullatës 22660 mund të vonohen shumë për të kapur kërpudhat para se të kalojnë në rritje nekrotike, megjithatë, Mandelup mund të jetë më efektiv se popullata 22660 sepse rregullimi relativisht i shpejtë i proteinës PR-10 nxit rezistencën horizontale.
ETI, i nxitur nga gjeni kanonik R, duket se është një mekanizëm i zakonshëm për rezistencën e fasules ndaj antrakonozës. Kështu, në bishtajoren model Medicago truncatula, rezistenca ndaj antrakonozës jepet nga gjeni RCT1, një anëtar i klasës së gjenit R të bimës TIR-NBS-LRR97. Ky gjen gjithashtu jep rezistencë ndaj antrakonozës me spektër të gjerë në jonxhë kur transferohet në bimë të ndjeshme. Në fasulen e zakonshme (P. vulgaris), deri më sot janë identifikuar më shumë se dy duzina gjene të rezistencës ndaj antrakonozës. Disa nga këto gjene gjenden në rajone që nuk kanë ndonjë gjen kanonik R, megjithatë shumë të tjerë ndodhen në skajet e kromozomeve që mbajnë grumbullin e gjeneve NBS-LRR, duke përfshirë TIR-NBS-LRRs99. Studimi SSR në të gjithë gjenomin konfirmoi gjithashtu lidhjen e gjenit NBS-LRR me rezistencën ndaj antrakonozës në fasulen e zakonshme. Gjeni kanonik R u gjet gjithashtu në rajonin gjenomik që mbante lokusin kryesor të rezistencës ndaj antrakonozës në lupinën e bardhë 101.
Puna jonë tregon se një reagim i menjëhershëm i rezistencës, i aktivizuar në një fazë të hershme të infeksionit të bimës (mundësisht jo më vonë se 12 hpi), mbron në mënyrë efektive lupinën me gjethe të ngushta nga antrakonoza e shkaktuar nga kërpudha patogjene Collelotrichum lupini. Duke përdorur sekuencim me rendiment të lartë, ne demonstruam profile diferenciale të shprehjes së gjeneve të rezistencës ndaj antrakonozës në bimët NLL të ndërmjetësuara nga gjenet e rezistencës Lanr1 dhe AnMan. Mbrojtja e suksesshme përfshin hartimin me kujdes të gjeneve për proteinat e përfshira në redoks, fotosintezë dhe patogjenezë brenda orëve nga kontakti i parë i bimës me një patogjen. Reaksione të ngjashme mbrojtëse, por të vonuara në kohë, janë shumë më pak efektive në mbrojtjen e bimëve nga sëmundjet. Rezistenca ndaj antraksit e ndërmjetësuar nga gjeni Lanr1 i ngjan përgjigjes tipike të shpejtë të gjenit R (imunitet i shkaktuar nga efektori), ndërsa gjeni AnMan ka shumë të ngjarë të ofrojë një përgjigje horizontale (imunitet i shkaktuar nga një model molekular i shoqëruar me mikrobet), duke siguruar një nivel të moderuar të qëndrueshmërisë.
215 linjat NLL të përdorura për të kontrolluar shënjuesit e antrakonozës përbëheshin nga 74 kultivarë, 60 linja të marra nga kryqëzimi ose mbarështimi, 5 mutantë dhe 76 germoplazma të egra ose origjinale. Linjat vinin nga 17 vende, kryesisht nga Polonia (58), Spanja (47), Gjermania (27), Australia (26), Rusia (19), Bjellorusia (7), Italia (5) dhe linja të tjera nga 10 vende. Seti përfshin gjithashtu linja rezistente referuese: 83A:476, Tanjil, Wonga që mbajnë alelin Lanr1 dhe Mandelup që mban alelin AnMan. Linjat u morën nga Baza e të Dhënave Evropiane të Burimeve Gjenetike të Lupinës e mirëmbajtur nga Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Poloni (Tabela Plotësuese S1).
Bimët u rritën në kushte të kontrolluara (fotoperioda 16 orë, temperatura 25°C gjatë ditës dhe 18°C ​​natën). U analizuan dy replikime biologjike. ADN-ja u izolua nga gjethet tre-javore duke përdorur DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Gjermani) sipas protokollit. Cilësia dhe përqendrimi i ADN-së së izoluar u vlerësua me metoda spektrofotometrike (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SHBA). U analizua shënuesi AnManM1 që shënon gjenin e rezistencës ndaj antrakonozës AnMan (i nxjerrë nga cv. Mandelup) dhe shënuesit Anseq3 dhe Anseq4 që rrethojnë gjenin Lanr1 (i nxjerrë nga cv. Tanjil). Homozigotët për alelin rezistent u vlerësuan si "1", të ndjeshëmit - si "0" dhe heterozigotët - si 0.5.
Bazuar në rezultatet e shqyrtimit për shënuesit AnManM1, AnSeq3 dhe AnSeq4 dhe disponueshmërinë e farërave për eksperimentet përfundimtare të ndjekjes, u përzgjodhën 50 linja NLL për fenotipizimin e rezistencës ndaj antrakonozës. Analiza u krye në dy kopje në një serë të kontrolluar nga kompjuteri me një fotoperiod 14-orësh me një diapazon temperature prej 22°C gjatë ditës dhe 19°C gjatë natës. Farërat kruhen (duke prerë shtresën e farës në anën e kundërt të embrionit me një teh të mprehtë) para mbjelljes për të parandaluar qetësinë e farës për shkak se shtresa e farës është shumë e fortë dhe për të siguruar mbirje uniforme. Bimët u rritën në vazo (11 × 11 × 21 cm) me tokë sterile (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varshavë, Poloni). Inokulimi u krye me llojin Colletotrichum lupini Col-08, të rritur në vitin 1999 nga kërcejtë e bimëve të lupinit me gjethe të ngushta të rritura në një fushë në Verzhenitsa, Polonia e Madhe (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Merrni një sipërfaqe. Izolatet u kultivuan në mjedisin SNA në 20° C nën dritë të zezë për 21 ditë për të nxitur sporulimin. Katër javë pas mbjelljes, kur bimët kishin arritur fazën 4-6 gjethe, inokulimi u krye duke spërkatur me një pezullim konidesh në një përqendrim prej 0.5 x 106 konide për ml. Pas inokulimit, bimët u mbajtën në errësirë ​​për 24 orë në një lagështi prej rreth 98% dhe një temperaturë prej 25°C për të lehtësuar mbirjen e konideve dhe procesin e infeksionit. Bimët u rritën më pas nën një fotoperiod 14-orësh në 22°C ditë/19°C natë dhe 70% lagështi. Rezultati i sëmundjes u bë 22 ditë pas inokulimit dhe varionte nga 0 (imune) në 9 (shumë e ndjeshme) në varësi të pranisë ose mungesës së lezioneve nekrotike në kërcell dhe gjethe. Përveç kësaj, pas vlerësimit, u mat pesha e bimëve. Marrëdhëniet midis gjenotipeve shënjuese dhe fenotipeve të sëmundjes u llogaritën si korrelacione pika-dy-sekuencë (mungesa e shënjuesve heterozigotë në grupin e linjave për analizën e fenotipit të rezistencës ndaj antrakonozës).