Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju). Medtem bomo za zagotovitev nadaljnje podpore spletno mesto prikazali brez slogov in JavaScripta.
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) je stročnica, ki se uporablja za pridelavo hrane in izboljšanje tal. Globalna širitev NLL kot kulture je privabila številne patogene glive, vključno z antraknozo volčjega boba, ki povzroča uničujočo bolezen antraknoze. Pri vzreji NLL sta bila uporabljena dva alela, Lanr1 in AnMan, ki zagotavljata povečano odpornost, vendar osnovni molekularni mehanizmi ostajajo neznani. V tej študiji sta bila markerja Lanr1 in AnMan uporabljena za presejanje evropskih vzorcev NLL. Testiranje cepiva v nadzorovanem okolju je potrdilo učinkovitost obeh odpornih darovalcev. Diferencialno profiliranje genske ekspresije je bilo izvedeno na reprezentativnih odpornih in dovzetnih linijah. Odpornost na antraknozo je bila povezana s prekomernim izražanjem izrazov genske ontologije »GO:0006952 Defense Response« (Obrambni odziv), »GO:0055114 Redoks proces« in »GO:0015979 Photosynthesis« (Fotosinteza). Poleg tega je linija Lanr1(83A:476) po inokulaciji pokazala znatno reprogramiranje transkriptoma, medtem ko so druge linije pokazale približno 42-urno zamudo pri tem odzivu. Obrambni odzivi so povezani z geni TIR-NBS, CC-NBS-LRR in NBS-LRR, 10 beljakovinami, ki sodelujejo pri patogenezi, beljakovinami za prenos lipidov, endoglukan-1,3-β-glukozidazo, beljakovinami celične stene, bogatimi z glicinom, in geni iz reaktivne poti kisika. Zgodnji odzivi na 83A:476, vključno s skrbnim zaviranjem genov, povezanih s fotosintezo, so sovpadali z uspešno zaščito med vegetativno rastno fazo glivične biologije, kar kaže na to, da efektor sproži imunost. Mandeloopova reakcija je upočasnjena, prav tako pa tudi celotni horizontalni upor.
Ozkolistni volčji bob (NLL, Lupinus angustifolius L.) je žito z visoko vsebnostjo beljakovin, ki izvira iz zahodnega Sredozemlja1,2. Trenutno se goji kot prehranski pridelek za živali in ljudi. V sistemih kolobarjenja velja tudi za zeleno gnojilo zaradi fiksacije dušika s simbiotskimi bakterijami, ki fiksirajo dušik, in splošnega izboljšanja strukture tal. NLL je v zadnjem stoletju doživel hiter proces udomačitve in je še vedno pod velikim pritiskom zaradi vzreje3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Z razširjenim gojenjem NLL je nasledstvo patogenih gliv razvilo nove kmetijske niše in povzročilo nove bolezni, ki uničujejo pridelek. Za pridelovalce in rejce volčjega boba je bil najbolj izjemen pojav antraknoze, ki jo povzroča patogena gliva Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Za pridelovalce in rejce volčjega boba je bil najbolj izjemen pojav antraknoze, ki jo povzroča patogena gliva Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Najbolj pomemben za kmete in selektorje lupine je bil pojav antraknoze, povzročene s patogenim glivom Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Za pridelovalce in rejce volčjega boba je bil najbolj opazen pojav antraknoze, ki jo povzroča patogena gliva Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler in Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Haired。1 Najbolj škodljiv za kmete in selekcionerje lupina je pojav antraknoze, ki jo povzroča patogeni gliv Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Za pridelovalce in rejce volčjega boba je najbolj presenetljiv pojav antraknoze, ki jo povzroča patogena gliva Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Najzgodnejša poročila o bolezni prihajajo iz Brazilije in Združenih držav Amerike, značilni simptomi pa so se pojavili leta 1912 oziroma 1929. Vendar pa je bil patogen po približno 30 letih označen kot Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf vrste Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld v Celovito urejeni morfologiji. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld v ciljni morfologiji. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .in H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。in H. Schlenk, .Predhodno fenotipiziranje bolezni, opravljeno sredi 20. stoletja, je pokazalo nekaj odpornosti pri NLL in rumenem volčjem bobu (L. luteus L.), vendar so bili vsi testirani primerki belega volčjega boba (L. albus L.) zelo dovzetni15,16. Študije so pokazale, da je razvoj antraknoze povezan s povečanimi padavinami (vlažnostjo zraka) in temperaturo (v območju 12–28 °C), kar vodi do kršitve odpornosti pri višjih temperaturah17, 18. Pravzaprav je bil čas, potreben za kalitev konidij in začetek bolezni, pri 24 °C (4 ure) štirikrat krajši kot pri 12 °C (16 ur) v pogojih visoke vlažnosti19. Tako je nenehno globalno segrevanje privedlo do širjenja antraknoze. Vendar pa je bila bolezen opažena v Franciji (1982) in Ukrajini (1983) kot znanilec bližajoče se grožnje, vendar jo je industrija volčjega boba takrat očitno ignorirala20,21. Nekaj ​​let pozneje se je ta uničujoča bolezen razširila po vsem svetu in prizadela tudi večje države pridelovalke volčjega boba, kot so Avstralija, Poljska in Nemčija22,23,24. Po izbruhu antraknoze sredi devetdesetih let prejšnjega stoletja je obsežno presejanje privedlo do identifikacije več odpornih donorjev v vzorcih NLL19. Odpornost NLL na antraknozo nadzirata dva ločena dominantna alela, ki ju najdemo v različnih virih zarodne plazme: Lanr1 v kultivarjih Tanjil in Wonga ter AnMan v kultivarju Mandalay25,26. Ti aleli dopolnjujejo molekularne označevalce, ki podpirajo selekcijo odporne zarodne plazme v programih žlahtnjenja25,26,27,28,29,30. Odporna linija 83A:476, ki nosi alel Lanr1, je bila križana z dovzetno divjo linijo P27255, da bi dobili populacijo RIL, ki se ločuje za odpornost na antraknozo, kar je omogočilo dodelitev lokusa Lanr1 kromosomu NLL-1131, 32, 33. Z uskladitvijo markerjev na zemljevidu povezav od bočnih lokusov odpornosti do antraknoze z genomskim ogrodjem je NLL razkril lokacijo vseh treh alelov na istem kromosomu (NLL-11), vendar na različnih položajih29,34,35. Vendar pa zaradi majhnega števila RIL in velike genetske razdalje med markerji in ustreznimi aleli ni mogoče sklepati zanesljivih zaključkov o njihovih osnovnih genih. Po drugi strani pa je uporaba reverzne genetike pri volčjem boku težka zaradi njihovega zelo nizkega regeneracijskega potenciala, zaradi česar je genetska manipulacija okorna37.
Razvoj udomačene zarodne plazme, ki nosi želeni alel v homozigotnem stanju, kot sta 83A:476 (Lanr1) in Mandelup (AnMan), je odprl vrata za preučevanje odpornosti na antraknozo kljub prisotnosti nasprotujočih si kombinacij alelov v divjih populacijah. Možnosti molekularnih mehanizmov. Primerjava obrambnih odzivov, ki jih povzročajo specifični genotipi. Ta študija je ocenila zgodnji transkriptomski odziv NLL na cepljenje proti C. lupini. Najprej je bil evropski panel zarodne plazme NLL, ki je vseboval 215 linij, pregledan z uporabo molekularnih markerjev, ki označujejo alela Lanr1 in AnMan. Nato je bilo izvedeno fenotipiziranje antraknoze na 50 linijah NLL, predhodno izbranih za molekularne markerje, pod nadzorovanimi pogoji. Na podlagi teh poskusov so bile za diferencialno profiliranje izražanja obrambnih genov z uporabo dveh komplementarnih pristopov: visokozmogljivega sekvenciranja RNA in kvantifikacije PCR v realnem času izbrane štiri linije, ki se razlikujejo po odpornosti na antraknozo in alelni sestavi Lanr1/AnMan.
Presejanje niza zarodne plazme NLL (N = 215) z markerji Lanr1 (Anseq3 in Anseq4) ter AnMan (Anseq4) in AnMan (AnManM1) je pokazalo, da le ena linija (95726, blizu Salamanca-b) pomnoži alel »odpornosti« za vse markerje, medtem ko je »prisotnost 'dovzetnih' alelov' ugotovila delež vseh markerjev v 158 (~73,5 %) linijah. Trinajst linij je proizvedlo dva »odporna« alela markerja Lanr1, 8 linij pa »odporne« alele markerja Lanr1. Alel »odpornosti« markerja AnMan (dodatna tabela S1). Dve liniji sta bili heterozigotni za marker Anseq3 in ena heterozigotna za marker AnManM1. 42 linij (19,5 %) je imelo nasprotne faze alelov Anseq3 in Anseq4, kar kaže na visoko pogostost rekombinacije med tema dvema lokusoma. Fenotipi antraknoze v nadzorovanih pogojih (dodatna tabela S2) so pokazali variabilnost v odpornosti testiranih genotipov, kar se je odražalo v resnosti antraknoze. Razlike v povprečnih ocenah so se gibale od 1,8 (zmerno odporne) do 6,9 (občutljive), razlike v teži rastlin pa od 0,62 (občutljive) do 4,45 g (odporne). V dveh ponovitvah poskusa je bila ugotovljena pomembna korelacija med vrednostmi, opaženimi v dveh ponovitvah (0,51 za oceno resnosti bolezni, P = 0,00017 in 0,61 za težo rastline, P < 0,0001), kot tudi med tema dvema parametroma (-0,59 in -0,77, P < 0,0001). V dveh ponovitvah poskusa je bila ugotovljena pomembna korelacija med vrednostmi, opaženimi v dveh ponovitvah (0,51 za oceno resnosti bolezni, P = 0,00017 in 0,61 za težo rastline, P < 0,0001), kot tudi med tema dvema parametroma (-0,59 in -0,77, P < 0,0001). Izkazana je resnična korelacija med vrednostmi, opaženimi v dveh ponovnih poskusih (0,51 za število težkih bolezni, P = 0,00017 in 0,61 za maso rastlin, P < 0,0001), in tudi med tema dvema parametroma (-0,59 in -0,77, R < 0,0001) 0,0001). Ugotovljena je bila pomembna korelacija med vrednostmi, opaženimi v dveh ponovitvah poskusa (0,51 za ocene resnosti bolezni, P = 0,00017 in 0,61 za težo rastline, P < 0,0001), kot tudi med tema dvema parametroma (-0,59 in -0,77, P < 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为0,51，P = 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间，(- 0,59 和- 0,77，P < 0,0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为0,51, p = 0,00017, več kot 0,61, p <0,0001). 0,59 和– 0,59 和 – 0,59 和 – 0,77, P < 0,0001). Ugotovljena je bila pomembna korelacija med vrednostmi, opaženimi v dveh ponovitvah (ocena teže bolezni 0,51, P = 0,00017 in masa rastline 0,61, P <0,0001), in med tema dvema parametroma (-0,59 in -0,0001) 0,77, P <0,0001. Med vrednostmi, opaženimi v dvojniku (ocena resnosti bolezni 0,51, P = 0,00017 in teža rastline 0,61, P < 0,0001), je bila ugotovljena pomembna korelacija, med tema dvema parametroma (-0,59 in -0,0001) pa 0,77, P < 0,0001. ).Tipični simptomi, ki jih opazimo pri dovzetnih rastlinah, vključujejo upogibanje in zvijanje stebla, ki spominja na strukturo "pastirskega loka", čemur sledijo ovalne lezije z oranžnimi/rožnatimi sporozoiti (dodatna slika 1). Avstralski pristopi, ki nosijo gena Lanr1 (83A:476 in Tanjil) in AnMan (Mandelup), so zmerno odporni, 0,0331 in 0,0036). Nekatere linije, ki nosijo tudi "odporna" alela Lanr1 in/ali AnMan, kažejo simptome bolezni.
Zanimivo je, da je nekaj linij NLL, ki nimajo nobenega "odpornega" markernega alela, pokazalo visoko stopnjo odpornosti na antraknozo (primerljivo ali višjo kot pri genotipih Lanr1 ali AnMan), kot so Boregine (vrednost P < 0,0001 za oba parametra), Bojar (vrednost P < 0,0001 za rezultat in 0,001 za težo rastline) in populacija B-549/79b (vrednost P < 0,0001 za rezultat in neznačilna za težo). Zanimivo je, da je nekaj linij NLL, ki nimajo nobenega "odpornega" markernega alela, pokazalo visoko stopnjo odpornosti na antraknozo (primerljivo ali višjo kot pri genotipih Lanr1 ali AnMan), kot so Boregine (vrednost P < 0,0001 za oba parametra), Bojar (vrednost P < 0,0001 za rezultat in 0,001 za težo rastline) in populacija B-549/79b (vrednost P < 0,0001 za rezultat in neznačilna za težo). Zanimivo je, da je več linij NLL, ki so bile odstranjene kot "rezistentne" markerske alele, pokazale visoko stopnjo odpornosti na antraknozo (souporabno ali večjo kot za genotipov Lanr1 ali AnMan), kot so Boregine (oznaka P <0,0001 za vse parametre), Bojar (oznaka P < 0,0001 za ocene in 0,001 za množico rastlin) in populacije B-549/79b (oznaka P <0,0001 za ocene in nepomembna za maso). Zanimivo je, da je več linij NLL, ki nimajo nobenega "odpornega" markernega alela, pokazalo visoko stopnjo odpornosti na antraknozo (primerljivo ali višjo kot pri genotipih Lanr1 ali AnMan), kot so Boregine (vrednost P < 0,0001 za oba parametra), Bojar (vrednost P < 0,0001 za oceno in 0,001 za težo rastline) in populacija B-549/79b (vrednost P < 0,0001 za oceno in ni statistično pomembna za težo).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar(P 值<得分为0,0001，植物重量为0,001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）。 Zanimivo je, da nekateri NLL sistemi, ki nimajo nobenih "antigenih" markerjev, kažejo visoko horizontalno odpornost (enakovredno genom Lanr1 ali AnMan ali višjo), kot so Boregine (oba parametra P < 0,0001), Bojar (vrednost P < 0,0001, teža rastline 0,001) in sev B-549/79b (vrednost P < 0,0001, teža ni statistično pomembna). Zanimivo je, da so nekatere črte NLL, ki nimajo kakršnih koli označevalnih alelov "odpornosti", pokazale visoko raven odpornosti na antraknozo (primerljive ali višje, kot pri genotipu Lanr1 ali AnMan), kot so Boregine (oznaka P za vse parametre <0,0001), Bojar (oznaka P <0,0001, masa rastlin 0,001) in populacija B-549/79b (ocena P-pomen <0,0001, masa nepomembna). Zanimivo je, da so nekatere linije NLL, ki nimajo nobenih alelov markerjev "odpornosti", pokazale visoke ravni odpornosti na antraknozo (primerljive ali višje od genotipov Lanr1 ali AnMan), kot so Boregine (vrednost P za oba parametra <0,0001), Bojar (vrednost P <0,0001, teža rastline 0,001) in populacija B-549/79b (vrednost P <0,0001, teža ni statistično pomembna).Ta pojav nakazuje na možnost novega genetskega vira odpornosti, kar pojasnjuje opaženo pomanjkanje korelacije med genotipi markerjev in fenotipi bolezni (vrednosti P od ~0,42 do ~0,98). Kolmogorov-Smirnov test je tako pokazal, da so bili podatki o odpornosti na antraknozo približno normalno porazdeljeni za rezultate (vrednosti P 0,25 in 0,11) in maso rastline (vrednosti P 0,47 in 0,55), kar nakazuje na hipotezo, da je vključenih več alelov kot le Lanr1 in AnMan.
Na podlagi rezultatov presejanja odpornosti na antraknozo so bile za analizo transkriptomov izbrane 4 linije: 83A:476, Boregine, Mandelup in populacija 22660. Te linije so bile ponovno testirane na odpornost na antraks v poskusih inokulacije s sekvenciranjem RNA, pod pogojem, da so bile enake kot v prejšnjem testu. Vrednosti rezultatov so bile naslednje: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) in populacija 22660 (6,11 ± 1,29).
Protokol Illumina NovaSeq 6000 je dosegel povprečno 40,5 parov odčitkov Mread na vzorec (29,7 do 54,4 parov odčitkov Mread) (dodatna tabela S3). Rezultati poravnave v referenčnem zaporedju so se gibali od 75,5 % do 88,6 %. Povprečna korelacija podatkov o številu odčitkov med eksperimentalnimi različicami med biološkimi ponovitvami se je gibala od 0,812 do 0,997 (povprečje 0,959). Od 35.170 analiziranih genov jih 2917 ni pokazalo nobene ekspresije, preostalih 4785 genov pa je bilo izraženih na zanemarljivi ravni (osnovno povprečje < 5). Od 35.170 analiziranih genov jih 2917 ni pokazalo nobene ekspresije, preostalih 4785 genov pa je bilo izraženih na zanemarljivi ravni (osnovno povprečje < 5). Od 35 170 proanaliziranih genov 2917 ni izkazalo ekspresije, preostalih 4785 genov pa je bilo ekspresirano na nepomembni ravni (bazno srednje <5). Od 35.170 analiziranih genov jih 2917 ni pokazalo nobene ekspresije, preostalih 4785 genov pa je bilo izraženih na zanemarljivi ravni (osnovno povprečje <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。.35.170 Od 35 170 proanaliziranih genov 2917 ni bilo ekspresirano, preostalih 4785 genov pa je imelo nepomembno ekspresijo (bazno srednje vrednost <5). Od 35.170 analiziranih genov jih 2917 ni bilo izraženih, preostalih 4785 genov pa je imelo zanemarljivo izražanje (osnovno povprečje <5).Tako je bilo število genov, ki so bili med poskusom izraženi (osnovno povprečje ≥ 5), 27.468 (78,1 %) (dodatna tabela S4).
Od prve časovne točke naprej so se vse linije NLL odzvale na inokulacijo s C. lupini (sev Col-08) z reprogramiranjem transkriptoma (tabela 1), vendar so bile med linijami opažene pomembne razlike. Tako je linija odpornosti 83A:476 (ki nosi gen Lanr1) v prvi časovni točki (6 hpi) pokazala pomembno reprogramiranje transkriptoma s 31–69-kratnim povečanjem števila izoliranih navzgor in navzdol usmerjenih genov v primerjavi z drugimi časovnimi točkami v tej časovni točki. Poleg tega je bil ta vrh kratkotrajen, saj je izražanje le nekaj genov v drugi časovni točki (12 hpi) ostalo bistveno spremenjeno. Zanimivo je, da Boregine, ki je prav tako pokazal visoko raven odpornosti v testu presadka, med poskusom ni bil podvržen tako obsežnemu transkripcijskemu reprogramiranju. Vendar pa je bilo število diferencialno izraženih genov (DEG) enako za Boregine in 83A:476 pri 12 HPI. Tako Mandelup kot populacija 22660 sta v zadnji časovni točki (48 l/s) pokazala vrhove DEG, kar kaže na relativno zamudo pri obrambnih odzivih.
Ker je linija 83A:476 pri 6 HPI doživela obsežno reprogramiranje transkriptoma kot odziv na C. lupini v primerjavi z vsemi drugimi linijami, je bilo ~91 % diferenčno eksponentnih genov, opaženih v tej časovni točki, specifičnih za linijo (slika 1). Vendar pa je prišlo do nekaj prekrivanja v zgodnjih odzivih med študijskimi linijami, saj se je 68,5 %, 50,9 % in 52,6 % DEG v Boregine, Mandelup in populaciji 22660 v določenih časovnih točkah prekrivalo s tistimi, ki so jih našli v liniji 83A:476. Vendar so ti DEG predstavljali le majhen delež (0,97–1,70 %) vseh DEG, ki so trenutno zaznani z uporabo linije 83A:476. Poleg tega je bilo v tem času koherentnih 11 DEG iz vseh linij (dodatne tabele S4-S6), vključno s skupnimi komponentami obrambnih odzivov rastlin: protein za prenos lipidov (TanjilG_32225), encim endoglukan-1,3-β-glukozid (TanjilG_23384), dva proteina, ki ju inducira stres, kot sta SAM22 (TanjilG_31528 in TanjilG_31531), bazični lateks protein (TanjilG_32352) in dva z glicinom bogata strukturna proteina celične stene (TanjilG_19701 in TanjilG_19702). Prav tako je bilo relativno veliko prekrivanje transkriptomskih odzivov med 83A:476 in Boregine pri 24 HPI (skupaj 16-38 % DEG) ter med Mandelup in populacijo 22660 pri 48 HPI (skupaj 14-20 % DEG).
Vennov diagram, ki prikazuje število diferencialno izraženih genov (DEG) v linijah ozkolistnega volčjega boba (NLL), cepljenih s Colletotrichum lupini (sev Col-08, pridobljen z volčjih polj v Wierzhenicah na Poljskem, 1999). Analizirane linije NLL so bile: 83A:476 (odporna, nosi alel Lanr1), Boregine (odporna, genetsko ozadje neznano), Mandelup (zmerno odporna, nosi alel AnMan) in populacija 22660 (zelo dovzetna). Kratica hpi pomeni ure po cepljenju. Ničelne vrednosti so bile odstranjene zaradi poenostavitve grafa.
Nabor prekomerno izraženih genov pri 6 hpi je bil analiziran na prisotnost kanoničnih domen gena R (dodatna tabela S7). Ta študija je pokazala transkriptomsko indukcijo klasičnih genov odpornosti na bolezni samo z domenami NBS-LRR pri 83A:476. Ta nabor je obsegal en gen TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), pet genov CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 in tanjilg_16162) ter štiri NBS-LR, Tanjilg_16162) in štiri NBS-LRRE (tanjilg_16162), pa tudi štiri NBS-Lrr (tanjilg_16162) in štiri NBS-LRR (TANJILG_16162). Vsi ti geni imajo kanonične domene, razporejene v ohranjenih zaporedjih. Poleg genov domene NBS-LRR je bilo pri 6 hpi aktiviranih več RLL kinaz, in sicer ena v Boregine (TanjilG_19877), dve v Mandelup (TanjilG_07141 in TanjilG_19877) in v populaciji 22660 (TanjilG_09014 in TanjilG_10361) ter dve v 83A 27:476.
Geni s pomembno spremenjeno ekspresijo kot odziv na inokulacijo s C. lupini (sev Col-08) so bili podvrženi analizi obogatitve z gensko ontologijo (GO) (dodatna tabela S8). Najpogosteje zastopan izraz biološkega procesa je bil »obrambni odziv GO:0006952«, ki se je pojavil v 6 od 16 kombinacij (čas × črta) z visoko pomembnostjo (vrednost P < 0,001) (slika 2). Najpogosteje zastopan izraz biološkega procesa je bil »obrambni odziv GO:0006952«, ki se je pojavil v 6 od 16 kombinacij (čas × črta) z visoko pomembnostjo (vrednost P < 0,001) (slika 2). Najpogosteje uporabljen izraz biološkega procesa je bil »GO: 0006952 zaščitni odgovor«, ki se je pojavil v 6 od 16 (čas × črta) kombinacije z visoko pomembnostjo (pomen P <0,001) (slika 2). Najpogosteje zastopan izraz biološkega procesa je bil »obrambni odziv GO:0006952«, ki se je pojavil v 6 od 16 kombinacij (čas × rod) z visoko pomembnostjo (vrednost P < 0,001) (slika 2).最常被过度代表的生物过程术语是»GO:0006952 防御反应«，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 Najbolj reprezentativen izraz za biološki proces je »obrambni odziv GO:0006952«, ki se pojavlja v 6 od 16 kombinacij (时间×线) z visoko značilnostjo (vrednost P < 0,001) (图2). Najpogosteje uporabljen izraz biološkega procesa je bil »GO: 0006952 obrambni odziv«, ki se je pojavil v 6 od 16 kombinacij (čas × črta) z visoko pomembnostjo (pomen P <0,001) (slika 2). Najpogosteje zastopan izraz biološkega procesa je bil »GO:0006952 Obrambni odziv«, ki se je pojavil v 6 od 16 kombinacij (čas × črta) z visoko pomembnostjo (vrednost P < 0,001) (slika 2).Ta izraz je bil v populaciji 83A prekomerno zastopan v dveh časovnih točkah: 476 in Boregine (6 in 24 hpi) ter v enem časovnem obdobju v populaciji Mandelup in 22660 (12 oziroma 6 hpi). To je pričakovan rezultat, ki poudarja protiglivični odziv odpornih linij. Poleg tega se je 83A:476 na C. lupini odzval s hitro indukcijo genov, povezanih z oksidativnim izbruhom, ki ga predstavlja izraz »redoks proces GO:0055114«, kar kaže na specifičen obrambni odziv, medtem ko je Boregine pokazal specifične obrambne odzive, povezane z izrazom »GO«. :0006950 Stresni odziv“. Populacija 22660 je aktivirala horizontalni odziv odpornosti, ki vključuje sekundarne metabolite, kar poudarja prekomerno število izrazov »GO:0016104 Proces biosinteze triterpenov« in »GO:0006722 Proces presnove triterpenov« (oba izraza pripadata istemu nizu genov). Ob upoštevanju rezultatov analize obogatitve z izrazom GO je bila stabilnost Mandelupove reakcije med Boreginom in populacijo 22660. Poleg tega zgodnja reakcija 83A:476 (6 hpi) in zapoznela reakcija Mandelup in populacija 22660 vključujeta izraz GO:0015979 »fotosinteza« in druge sorodne biološke procese.
Izrazi bioprocesne ontologije genov, izbrani v opombah diferencialno izraženih genov med transkriptomskimi odzivi ozkolistnega volčjega boba (NLL), inokuliranega z antraksnim volčjim bobom (sev Col-08, pridobljen z volčjih polj v Wierzhenicah na Poljskem leta 1999), so močno pretirani. Analizirane linije NLL so bile: 83A:476 (odporna, nosi homozigotni alel Lanr1), Boregine (odporna, neznano genetsko ozadje), Mandelup (zmerno odporna, nosi homozigotni alel AnMan) in populacija 22660 (dovzetna).
Ker je bil cilj te študije identificirati gene, ki prispevajo k odpornosti na antraknozo, so bili geni, dodeljeni izrazoma GO »GO: 0006952 Obrambni odzivi« in »GO: 0055114 Redoks procesi«, analizirani z mejnimi vrednostmi, saj so izhodiščna povprečja ≥ 30 z vsaj eno črto. × časovna točka, ki združuje statistično značilne vrednosti log2 (kratna sprememba). Število genov, ki so izpolnjevali ta merila, je bilo 65 za GO:0006952 in 524 za GO:0055114.
83A:476 je razkril dva vrhova DEG, označena z izrazom GO:0006952, prvega pri 6 genih na palec (64 genov, regulacija navzgor in navzdol), drugega pa pri 24 genih na palec (15 genov, samo regulacija navzgor). Boregine je tudi pokazal, da je GO:0006952 dosegel vrh v isti časovni točki, vendar z manj DEG (11 in 8) in prednostno aktivacijo. Mandeloop je pokazal dva vrhova GO:0006952 pri 12 in 48 HPI, oba sta nosila 12 genov (prvi z aktivacijskimi geni, drugi pa samo s supresivnimi geni), medtem ko je imela populacija 22660 pri 6 HPI (13 genov) večjo prevlado regulacije vrha povečanja. Treba je opozoriti, da je imelo 96,4 % DEG GO:0006952 v teh vrhovih enako vrsto odziva (navzgor ali navzdol), kar kaže na znatno prekrivanje obrambnih odzivov kljub razlikam v številu vključenih genov. Največja skupina zaporedij, povezanih z izrazom GO:0006952, kodira protein 22, povezan s stresom pri stradanju (SAM22-like), ki spada v klado proteinov PR-10 (pathogenesis-associated protein) razreda 10 in v lateks protein, podoben proteinu MLP (slika 3). Skupini sta se razlikovali po naravi izražanja in smeri odziva. Geni, ki kodirajo proteine, podobne SAM22, so pokazali dosledno in pomembno indukcijo v zgodnjih časovnih točkah (6 ali 12 hpi) in so bili na koncu poskusa (48 hpi) na splošno neodzivni, medtem ko so proteini, podobni MLP, pokazali koordinacijo pri 6 hpi. 83A:476 in Mandelup pri 48 hp/in, skoraj vse druge podatkovne točke pa so bile neodzivne. Poleg tega so razlike v ekspresijskih profilih genov, podobnih SAM22, sledile opaženi variabilnosti v odpornosti na antraknozo, saj so imele bolj odporne linije več časovnih točk, ki so te gene pomembno inducirale, kot bolj dovzetni geni. Drug gen PR-10, podoben LlR18A/B, je pokazal zelo podoben vzorec izražanja kot gen proteina, podobnega SAM22.
Identificirane so bile glavne komponente biološkega procesnega izraza »GO:0006952 Defense Response« in vzorci izražanja kandidatnih genov alelov Lanr1 in AnMan. Lestvica Log2 predstavlja vrednosti log2 (kratna sprememba) med inokuliranimi (Colletotrichum lupini, sev Col-08, pridobljen z volčjih polj, Wizhenica, Poljska, 1999) in kontrolnimi (lažno inokuliranimi) rastlinami v istem časovnem obdobju. Analizirane so bile naslednje linije ozkolistnega volčjega boba: 83A:476 (odporna, nosi homozigotni alel Lanr1), Boregine (odporna, genetsko ozadje neznano), Mandelup (zmerno odporna, nosi homozigotni alel AnMan) in populacija 22660 (dovzetna).
Poleg tega so bili ovrednoteni profili ekspresije kandidatnih genov RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) in AnMan (TanjilG_12861) (slika 3). Gen TanjilG_05042 je pokazal pomemben odziv (aktivacijo) pri 83A:476 le v prvi časovni točki (6 hpi), medtem ko je bil TanjilG_12861 v Mandeloopu pomemben le v dveh časovnih točkah: 6 hpi (znižana regulacija) in 24 hpi (6 hpi). Z.). nastavljivim) ).
Najbolj prekomerno izraženi geni v terminu GO:0055114 »redoks proces« so bili geni, ki kodirajo proteine ​​citokroma P450 in peroksidazo (slika 4). Pri vzorcih, izoliranih iz 83A:476 pri 6 HPI, so bile največje ali minimalne vrednosti log2 (kratna sprememba) (za 86,6 % genov) na splošno opažene med inokuliranimi in kontrolnimi rastlinami, kar poudarja visok odziv tega genotipa na inokulacijo spola. 83A:476 je pokazal najpomembnejši GO:0055114 DEG pri 6 hpi (503 geni), preostale linije pa pri 48 hpi (Boregine, 31 genov; Mandelup, 85 genov; in populacija 22660, 78 genov)). Pri večini genov družine GO:0055114 sta bili opaženi dve vrsti odziva na cepljenje (aktivacija in inhibicija). Zanimivo je, da je bilo do 97,6 % DEG identificiranih za izraz GO: 0055114 v Mandelupe pri 48 hp. Ta opažanja kažejo, da je vzorec zapoznelih transkriptomskih odzivov mandelupa na antraknozo kljub bistveno manjšemu obsegu (tj. številu mutiranih redoks genov, 85 v primerjavi s 503) podoben zgodnjemu odzivu 83A:476. V Boregine in populaciji 22660 je ta konvergenca nižja, in sicer 51,6 % oziroma 75,6 %.
Razkriti so bili vzorci izražanja glavnih komponent termina biološkega procesa »GO:0055114 Redoks proces«. Lestvica Log2 predstavlja log2 vrednosti (kratna sprememba) med inokuliranimi (Colletotrichum lupini, sev Col-08, pridobljen z volčjih polj, Wizhenica, Poljska, 1999) in kontrolnimi (lažno inokuliranimi) rastlinami v istem časovnem obdobju. Analizirane so bile naslednje linije ozkolistnega volčjega boba: 83A:476 (odporna, nosi homozigotni alel Lanr1), Boregine (odporna, genetsko ozadje neznano), Mandelup (zmerno odporna, nosi homozigotni alel AnMan) in populacija 22660 (dovzetna).
83A:476 Transkriptomski odzivi na inokulacijo s C. lupini (sev Col-08) so vključevali tudi koordinirano utišanje genov, pripisanih izrazu GO:0015979 »fotosinteza« in drugim sorodnim biološkim procesom (SLIKA 5). Ta niz DEG GO:0015979 je vseboval 105 genov, ki so bili pri 83A:476 znatno potlačeni pri 6 hpi. V tej podskupini je bilo pri Mandelupu pri 48 HPI in 35 v istem časovnem obdobju v populaciji 22660 znižanih tudi 37 genov, vključno z 19 DEG, skupnimi obema genotipoma. Noben DEG, povezan s izrazom GO: 0015979, ni bil bistveno aktiviran v nobeni kombinaciji (vrstica x čas).
Razkriti so bili vzorci izražanja glavnih komponent termina biološkega procesa »GO:0015979 Fotosinteza«. Lestvica Log2 predstavlja log2 vrednosti (kratna sprememba) med inokuliranimi (Colletotrichum lupini, sev Col-08, pridobljen z volčjih polj, Wizhenica, Poljska, 1999) in kontrolnimi (lažno inokuliranimi) rastlinami v istem časovnem obdobju. Analizirane so bile naslednje linije ozkolistnega volčjega boba: 83A:476 (odporna, nosi homozigotni alel Lanr1), Boregine (odporna, genetsko ozadje neznano), Mandelup (zmerno odporna, nosi homozigotni alel AnMan) in populacija 22660 (dovzetna).
Na podlagi rezultatov analize diferencialne ekspresije in domnevno vključenih v obrambne odzive proti patogenim glivam je bil ta niz sedmih genov izbran za kvantifikacijo ekspresijskih profilov s PCR v realnem času (dodatna tabela S9).
Domnevni proteinski gen TanjilG_10657 je bil v vseh preučevanih linijah in časovnih točkah znatno induciran v primerjavi s kontrolnimi (mimičnimi) rastlinami (dodatni tabeli S10, S11). Poleg tega je profil ekspresije TanjilG_10657 v teku poskusa pokazal naraščajoč trend za vse linije. Populacija 22660 je pokazala najvišjo občutljivost TanjilG_10657 na inokulacijo s 114-kratno aktivacijo in najvišjo relativno stopnjo ekspresije (4,4 ± 0,4) pri 24 HPI (slika 6a). Tudi proteinski gen PR10 LlR18A TanjilG_27015 je pokazal aktivacijo v vseh linijah in časovnih točkah, s statistično značilnostjo pri večini podatkovnih točk (slika 6b). Podobno kot pri TanjilG_10657 je bila najvišja relativna stopnja ekspresije TanjilG_27015 opažena v inokulirani populaciji 22660 pri 24 HPI (19,5 ± 2,4). Gen za kislo endohitinazo TanjilG_04706 je bil v vseh linijah in v vseh časovnih točkah, razen pri Boregine 6 hpi (slika 6c), znatno povečan. V prvi časovni točki (6 HPI) pri 83A:476 je bil močno induciran (za 10,5-krat), v drugih linijah pa zmerno povečan (za 6,6–7,5-krat). Med poskusom je izražanje TanjilG_04706 ostalo na podobnih ravneh v 83A:476 in Boregine, medtem ko se je v Mandelupu in populaciji 22660 znatno povečalo in doseglo relativno visoke vrednosti (5,9 ± 1,5 oziroma 6,2 ± 1,5). Gen TanjilG_23384, podoben endoglukan-1,3-β-glukozidazi, je pokazal visoko aktivacijo v prvih dveh časovnih točkah (6 in 12 hpi) v vseh linijah, razen v populaciji 22660 (slika 6d). Najvišje relativne ravni izražanja TanjilG_23384 so bile opažene v drugi časovni točki (12 hpi) pri Mandelupu (2,7 ± 0,3) in 83A:476 (1,5 ± 0,1). Pri 24 HPI je bila ekspresija TanjilG_23384 relativno nizka v vseh preučevanih linijah (od 0,04 ± 0,009 do 0,44 ± 0,12).
Profili ekspresije izbranih genov (ag), ugotovljeni s kvantitativno PCR. Številke 6, 12 in 24 predstavljajo ure po cepljenju. Geni LanDExH7 in LanTUB6 so bili uporabljeni za normalizacijo, LanTUB6 pa za medserijsko kalibracijo. Stolpci napak predstavljajo standardni odklon na podlagi treh bioloških ponovitev, od katerih je vsaka povprečje treh tehničnih ponovitev. Statistična značilnost razlik v ravneh izražanja med inokuliranimi (Colletotrichum lupini, sev Col-08, pridobljen leta 1999 z volčjega polja v Wierzenici na Poljskem) in kontrolnimi (lažno inokuliranimi) rastlinami je označena nad podatkovnimi točkami (*P vrednost < 0,05, **P vrednost ≤ 0,01, ***P vrednost ≤ 0,001). Statistična značilnost razlik v ravneh izražanja med inokuliranimi (Colletotrichum lupini, sev Col-08, pridobljen leta 1999 z volčjega polja v Wierzenici na Poljskem) in kontrolnimi (lažno inokuliranimi) rastlinami je označena nad podatkovnimi točkami (*P vrednost < 0,05, **P vrednost ≤ 0,01, ***P vrednost ≤ 0,001). Statistična pomembnost razlike v stopnji izražanja med inokuliranimi (Colletotrichum lupini, št. Col-08, pridobljeno leta 1999 s polja lupina v Verženicah, Poljska) in kontrolnimi (ložno inokuliranimi) rastlinami, označenimi nad točkami podatkov (*pomen P < 0,05, **pomen P ≤ 0,01, ***pomen P ≤ 0,001). Statistično značilne razlike v ravneh izražanja med inokuliranimi (Colletotrichum lupini, sev Col-08, pridobljen leta 1999 z volčjega polja v Wierzhenicah na Poljskem) in kontrolnimi (lažno inokuliranimi) rastlinami so navedene nad podatkovnimi točkami (*P-vrednost < 0,05, **P-vrednost ≤ 0,01, ***P-vrednost ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ，, 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001). Statistično pomembne razlike v stopnjah izražanja med inokuliranimi (Colletotrichum lupini, št. Col-08, pridobljeno s pol lupina v Verženicah, Poljska, leta 1999) in kontrolnimi (ložno inokuliranimi) rastlinami, označenimi nad točkami podatkov (* vrednost P < 0,05, ** P-pomen ≤ 0,01, ***P-pomen ≤ 0,001). Statistično značilne razlike v ravneh izražanja med inokuliranimi (Colletotrichum lupini, sev Col-08, pridobljen z volčjih polj v Verženicah na Poljskem leta 1999) in kontrolnimi (lažno inokuliranimi) rastlinami so navedene nad podatkovnimi točkami (*P-vrednost < 0,05, **P-vrednost ≤ 0,01, ***P-vrednost ≤ 0,001).Analizirane linije NLL so bile: 83A:476 (odporna, nosi homozigotni alel Lanr1), Mandelup (zmerno odporna, nosi homozigotni alel AnMan), Boregine (odporna, neznano genetsko ozadje) in populacija 22660 (dovzetna).
Kandidatni gen TanjilG_05042 na lokusu Lanr1 je pokazal izrazito drugačen vzorec izražanja od profilov, pridobljenih s študijami RNA-seq (slika 6e). V populaciji Mandelup in 22660 so opazili znatno aktivacijo tega gena (do 39,7-krat oziroma 11,7-krat), kar je povzročilo relativno visoke ravni izražanja (do 1,4 ± 0,14 oziroma 7,2 ± 1,3). 83A:476 je prav tako pokazal nekaj povečanja izražanja gena TanjilG_05042 (do 3,8-krat), vendar so bile dosežene relativne ravni izražanja (0,044 ± 0,002) več kot 30-krat nižje od tistih, opaženih v populaciji Mandelup in 22660. Analizirane s qPCR so pokazale pomembne razlike v ravneh izražanja med genotipi v kontrolnih (lestvicah) variantah, ki so dosegle 58-kratno razliko med populacijama 22660 in 83A:476, pa tudi med populacijama 22660 in 22660. Med Boregine in Mandalup je bila dosežena dvakratna razlika.
Kandidatni gen na lokusu AnMan, TanjilG_12861, se je aktiviral kot odziv na cepljenje pri sevih 83A:476 in Mandelup, je bil nevtralen pri populaciji 22660 in zmanjšano izražen pri Boregine (slika 6f). Relativna ekspresija gena TanjilG_12861 je bila najvišja pri inokuliranem sevu 83A:476 (0,14 ± 0,01). Gen TanjilG_05080 HSP17.4 za protein toplotnega šoka razreda I z molekulsko maso 17,4 kDa je pokazal nižje relativne ravni ekspresije pri vseh preučevanih sevih in časovnih točkah (slika 6g). Najvišja vrednost je bila opažena pri 24 HPI pri populaciji 22660 (0,14 ± 0,02, osemkratno povečanje odziva na cepljenje).
Primerjava profilov izražanja genov (slika 7) je pokazala visoko korelacijo med TanjilG_10657 in štirimi drugimi geni: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) in TanjilG_04706 (r = 0,79). Takšni rezultati lahko kažejo na soregulacijo teh genov med obrambnimi odzivi. Geni TanjilG_12861 in TanjilG_23384 sta pokazala različne profile izražanja z nižjimi vrednostmi Pearsonovega korelacijskega koeficienta (od 0,08 do 0,43 oziroma -0,19 do 0,28) v primerjavi z drugimi geni.
Korelacije med profili izražanja genov so bile zaznane s kvantitativno PCR. Analizirane so bile naslednje linije ozkolistnega volčjega boba: 83A:476 (odporna, nosi homozigotni alel Lanr1), Mandelup (zmerno odporna, nosi homozigotni alel AnMan), Boregine (odporna, genetsko ozadje neznano) in populacija 22660 (dovzetna). Izračunane so bile tri časovne točke (6, 12 in 24 ur po inokulaciji), vključno z inokuliranimi (Colletotrichum lupini, sev Col-08, pridobljen s polj volčjega boba v Wierzhenicah na Poljskem leta 1999) in kontrolnimi (lažno inokuliranimi) rastlinami. Lestvica prikazuje vrednost Pearsonovega korelacijskega koeficienta.
Na podlagi podatkov, pridobljenih pri 6 konjskih moči na palec (6 konjskih moči na palec), je bila izvedena WGCNA na 9981 DEG, identificiranih s primerjavo inokuliranih in kontrolnih rastlin, da bi se osredotočili na zgodnje obrambne odzive (dodatna tabela S12). Ugotovljenih je bilo 22 genskih modulov (grozdov) s koreliranimi (pozitivnimi ali negativnimi) ekspresijskimi profili med genotipi in eksperimentalnimi različicami. V povprečju so bile ravni izražanja genov padajoče v vrstnem redu 83A:476 > Mandelup > Boregine > populacija 22660 (v obeh variantah pa je bil ta trend močnejši pri kontrolnih rastlinah). V povprečju so bile ravni izražanja genov padajoče v vrstnem redu 83A:476 > Mandelup > Boregine > populacija 22660 (v obeh variantah pa je bil ta trend močnejši pri kontrolnih rastlinah). V srednjem nivoju ekspresije so se genov znižali v vrstnem redu 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (v obeh različicah je bila ta težnja močnejša pri nadzornih rasti). V povprečju so se ravni izražanja genov zmanjševale v vrstnem redu 83A:476 > Mandelup > Boregine > populacija 22660 (v obeh variantah pa je bil ta trend močnejši pri kontrolnih rastlinah).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> prebivalstvo 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种在 在 植物 中 更). V srednjem nivoju ekspresije so se genov zmanjšali v vrstici 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (enako v obeh različicah je bila ta težnja močnejša v kontrolnih rasti). V povprečju so se ravni izražanja genov zmanjšale v seriji 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (vendar je bil ta trend v obeh variantah močnejši pri kontrolnih rastlinah).Cepljenje je povzročilo povečano izražanje genov, zlasti v modulih 18, 19, 14, 6 in 1 (v padajočem vrstnem redu učinka), negativno regulacijo (npr. moduli 9 in 20) ali nevtralne učinke (npr. moduli 11, 22, 8 in 13). Analiza obogatitve z GO-terminom (dodatna tabela S13) je pokazala »GO: 0006952 Zaščitni odzivi« za inokulirani modul (18) z največjo aktivacijo, vključno z geni, analiziranimi s qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 in TanjilG_27015), kot tudi številne inokulirane module, ki so najbolj zavirali fotosintezo (9). Koncentrator modula 18 (slika 8) je bil identificiran kot gen TanjilG_26536, ki kodira protein LlR18B, podoben PR-10, koncentrator modula 9 pa kot gen TanjilG_28955, ki kodira protein fotosistema II PsbQ. Kandidatni gen za odpornost proti antraknozi Lanr1, TanjilG_05042, je bil najden v modulu 22 (slika 9) in je povezan z izrazoma »GO:0044260 Celični makromolekularni presnovni procesi« in »GO:0006355 Transkripcijska regulacija, tvorba DNA«, ki nosita vozlišče TanjilG_01212. Gen kodira transkripcijski faktor toplotnega stresa A-4a (HSFA4a).
Utežena mrežna analiza soizražanja genskih modulov s prekomerno zastopanimi biološkimi procesnimi izrazi »GO: 0006952 Defense responses«. Ligacija je bila poenostavljena, da bi poudarili štiri gene, analizirane s qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 in TanjilG_27015).
Utežena mrežna analiza soizražanja genov modula s prekomerno zastopanim biološkim procesnim izrazom »GO: 0006355: Transkripcijska regulacija, tvorba DNA predlog« in z genom za odpornost proti antraknozi Lanr1 TanjilG_05042. Ligacija je bila poenostavljena za izolacijo gena TanjilG_05042 in osrednjega gena TanjilG_01212.
Presejalni testi za odpornost proti antraknozi, zbrani v Avstraliji, so pokazali, da je bila večina zgodaj sproščenih kultivarjev dovzetnih; Kalya, Coromup in Mandelup so bili opisani kot zmerno odporni, medtem ko so bili Wonga, Tanjil in 83A:476 opisani kot zelo odporni26,27,31. so imeli isti alel za odpornost, označen kot Lanr1, Coromup in Mandelup pa sta imela drugačen alel, označen kot AnMan10, 26, 39, medtem ko je Kalya prenesla drugačen alel, Lanr2. Presejalni testi za odpornost proti antraknozi v Nemčiji so privedli do identifikacije odporne linije Bo7212 s kandidatnim alelom, ki ni Lanr1, označen kot LanrBo36.
Naša študija je pokazala zelo nizko frekvenco (približno 6 %) alela Lanr1 v testirani zarodni plazmi. To opažanje je skladno z rezultati presejanja vzhodnoevropske zarodne plazme z uporabo markerjev Anseq3 in Anseq4, ki je pokazalo, da je alel Lanr1 prisoten le v dveh beloruskih linijah. To kaže, da alel Lanr1 še ni široko uporabljen v lokalnih programih žlahtnjenja, za razliko od Avstralije, kjer je eden ključnih alelov za žlahtnjenje s pomočjo markerjev. To je lahko posledica nižje ravni odpornosti, ki jo zagotavlja alel Lanr1 v evropskih terenskih pogojih v primerjavi z avstralskim poročilom. Poleg tega so študije antraknoze na območjih z veliko padavinami v Avstraliji pokazale, da odzivi odpornosti, ki jih posreduje alel Lanr1, morda niso učinkoviti v vremenskih razmerah, ki spodbujajo rast in hiter razvoj patogena19,42. Pravzaprav so bili v tej študiji nekateri simptomi antraknoze opaženi tudi pri genotipih, ki nosijo alel Lanr1, kar kaže na to, da lahko odpornost izgine v optimalnih pogojih za razvoj C. lupini. Poleg tega so možne lažno pozitivne interpretacije prisotnosti markerjev Anseq3 in Anseq4, ki so približno 1 cM oddaljeni od lokusa Lanr1, 28,30,43.
Naša študija je pokazala, da se je 83A:476, ki nosi alel Lanr1, na inokulacijo s C. lupini odzval z obsežnim reprogramiranjem transkriptoma v prvi analizirani časovni točki (6 hpi), medtem ko so bili pri Mandelupu, ki nosi alel AnMan, transkriptomski odzivi opaženi veliko kasneje (od 24 do 48 hpi). Te časovne razlike v obrambnih odzivih so povezane z razlikami v simptomih bolezni, kar poudarja pomen zgodnjega prepoznavanja patogena za uspešen odziv na odpornost. Da bi okužile rastlinsko tkivo, morajo spore antraksa na površini gostitelja preiti skozi več razvojnih stopenj, vključno s kalitvijo, delitvijo celic in nastankom apresorija. Privesek je infekcijska struktura, ki se pritrdi na površino gostitelja in olajša prodiranje v gostiteljska tkiva. Tako so spore C. gloeosporioides v ekstraktu graha pokazale prvo delitev jedra po 75–90 minutah inkubacije, nastanek zarodne cevke po 90–120 minutah in supresijo po 4 urah 45. Mangova vrsta C. gloeosporioides je po 3 urah inkubacije pokazala več kot 40-odstotno kalitev konidij in po 4 urah približno 20-odstotno tvorbo apresorjev. Z virulenco povezan gen CAP20 vrste C. gloeosporioides je po 3,5-urni inkubaciji v površinskem vosku avokada z visokimi koncentracijami proteina CAP20 po 4 urah in 46 minutah pokazal transkripcijsko aktivnost v konidijah, ki tvorijo epifite. Podobno je bila aktivnost genov za biosintezo melanina pri vrsti C. trifolii inducirana med 2-urno inkubacijo, ki ji je sledila tvorba apresorija po 1 uri. Študije listnih tkiv so pokazale, da imajo jagode, inokulirane s C. acutatum, prvo supresijo pri 8 urah po uri ... Hitri obrambni odzivi na 83A:476 kažejo na vključenost genov za odpornost rastlin in efektorsko sproženo imunost (ETI) v tej liniji, medtem ko Mandelupovi zapozneli odzivi podpirajo hipotezo o mikro-povezani molekularni vzorčno sproženi imunosti (MTI) 50. Zgodnji odzivi na 83A: 476 in Mandelupa. Delno prekrivanje med navzgor ali navzdol reguliranimi geni pri zapoznelem odzivu prav tako podpira ta koncept, saj se ETI pogosto šteje za pospešen in okrepljen odziv MTI, ki doseže vrhunec v programirani celični smrti na mestu okužbe, znani kot anafilaktični šok 51,52.
Večina genov, ki se pripisujejo preveč zastopanemu izrazu Gene Ontology GO:0006952 »obrambni odziv«, je 11 homologov proteina, ki ga povzroča stresno sporočilo 22 (podobnega kot SAM22), in sedmih glavnih proteinom, podobnim lateksnim proteinom (MLP), proteinov 31, 34, 43 in 423, ki so pokazali podobnost v zaporedju. Geni, podobni SAM22, so pokazali znatno aktivacijo, ki je trajala dlje, kar je pokazalo povečano raven odpornosti na antraknozo (83A:476 in Boregine). Vendar pa so bili geni, podobni MLP, znižano izraženi le v linijah, ki nosijo kandidatni alel odpornosti (83A:476/Lanr1 pri 6 hpi in Mandelup/AnMan pri 24 hpi). Treba je opozoriti, da vsi identificirani homologi, podobni SAM22, izvirajo iz genske skupine, ki obsega približno 105 kb, medtem ko geni, podobni MLP, izvirajo iz ločenih regij genoma. Koordinirano aktivacijo takšnih genov, podobnih SAM22, smo ugotovili tudi v naši prejšnji študiji odpornosti NLL na inokulacijo z Diaporthetoxica, kar kaže na to, da so vključeni v horizontalne komponente obrambnega odziva. Ta sklep podpirajo tudi poročila o pozitivnem odzivu genov, podobnih SAM22, na poškodbo ali zdravljenje s salicilno kislino, glivičnimi induktorji ali vodikovim peroksidom.
Dokazano je, da se geni, podobni MLP, odzivajo na različne abiotske in biotske strese, vključno z bakterijskimi, virusnimi in patogenimi glivičnimi okužbami pri mnogih rastlinskih vrstah55. Smeri odziva na določene interakcije med rastlinami in patogeni so se gibale od močnega povečanja (tj. med okužbo bombaža z Verticillium dahliae) do znatnega zmanjšanja (tj. po okužbi jablane z Alternaria spp.)56,57. Pomembno znižanje ekspresije gena 423, podobnega MLP, so opazili med obrambo avokada pred okužbo z F. niger in med okužbo jablane. Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola in Alternaria alternata sta patotipa jablan58,59. Poleg tega so imeli jabolčni kalusi, ki prekomerno izražajo gen 423, podoben MLP, nižjo ekspresijo genov, povezanih z odpornostjo, in so bili bolj dovzetni za glivične okužbe59. Po okužbi z Fusarium oxysporum f je bil gen 423, podoben MLP, potlačen tudi v odporni zarodni plazmi navadnega fižola. cn. Okužba z fižolom 60.
Drugi člani družine PR-10, identificirani v naši študiji RNA-seq, so bili geni LlR18A in LlR18B kot odziv na povečano regulacijo, kot tudi povečano (1 gen) ali zmanjšano (3 geni) gen za protein za prenos lipidov DIR1. Poleg tega WGCNA izpostavlja gen LlR18B kot središče v tem modulu, ki je zelo dovzeten za cepljenje in nosi več genov zaščitnega odziva. Geni LlR18A in LlR18B so bili inducirani v listih rumenega volčjega boba kot odziv na patogene bakterije, pa tudi v steblih NLL po inokulaciji z D. toxica, medtem ko je bil rižev homolog teh genov, RSOsPR10, hitro induciran z glivično okužbo, ki je verjetno vključena v signalno pot jasmonske kisline53,61,62. Gen DIR1 kodira nespecifične proteine ​​za prenos lipidov, ki so potrebni za nastanek sistemske pridobljene odpornosti (SAR). Z razvojem zaščitnih reakcij se protein DIR1 prenese iz žarišča okužbe skozi floem, da inducira SAR v oddaljenih organih. Zanimivo je, da je bil gen TanjilG_02313 DIR1 v linijah 84A:476 in populaciji 22660 v prvi časovni točki znatno induciran, vendar se je odpornost na antraknozo uspešno razvila le v liniji 84A:476. To lahko kaže na nekaj subfunkcionalizacije gena DIR1 pri NLL, saj so se preostali trije homologi na inokulacijo odzvali le v liniji 83A:476 pri 6 hpi, ta odziv pa je bil usmerjen navzdol.
V naši študiji so bile najpogostejše komponente, ki ustrezajo biološkemu procesu, imenovanemu »GO:0055114 Redoks proces«, protein citokroma P450, peroksidaza, linolna kislina 9S-/13S-lipoksigenaza in 1-aminociklopropan-1-karboksilna kislina oksidaza. Poleg tega naša WGCNA opredeljuje homolog HSFA4a kot vozlišče, ki nosi module, kot je kandidatni gen za odpornost proti Lanr1 TanjilG_05042. HSFA4a je komponenta redoks-odvisne regulacije jedrne transkripcije v rastlinah.
Beljakovine citokroma P450 so oksidoreduktaze, ki katalizirajo reakcije hidroksilacije, odvisne od NADPH in/ali O2, v primarnem in sekundarnem metabolizmu, vključno s metabolizmom ksenobiotikov, pa tudi hormonov, maščobnih kislin, sterolov, komponent celične stene, biopolimerov in biosinteze zaščitnih spojin 69. V naši študiji se je variabilnost delovanja rastlinskega citokroma P450 zmanjšala z -10,6 log2 (kratna sprememba) na 5,7 zaradi velikega števila spremenjenih homologov (37) in razlik v vzorcih odziva med specifičnimi geni, kar odraža revizijo navzgor. Uporaba samo podatkov RNA-sekvenciranja za pojasnitev domnevne biološke funkcije genov NLL v tako veliki superdružini beljakovin bi bila zelo špekulativna. Vendar je treba omeniti, da so nekateri geni citokroma P450 povezani s povečano odpornostjo na patogene glive ali bakterije, vključno s prispevkom k alergijskim reakcijam 69,70,71.
Peroksidaze razreda III so večfunkcijski rastlinski encimi, ki sodelujejo v številnih presnovnih procesih med rastjo in razvojem rastlin, pa tudi kot odziv na okoljske strese, kot so slanost, suša, visoka intenzivnost svetlobe in napad patogenov72. Peroksidaze sodelujejo pri interakciji več rastlinskih vrst z antracisom, vključno s Stylosanthes humilis in C. gloeosporioides, Lens culinaris in C. truncatum, Phaseolus vulgaris in C. lindemuthianum, Cucumis sativus in C. lagenarium73,74,75,76. Odziv je zelo hiter, včasih celo pri 4 HPI, preden gliva prodre v rastlinsko tkivo73. Gen za peroksidazo se je odzval tudi na inokulacijo z D. toxica NLL. Poleg svojih tipičnih funkcij uravnavanja oksidativnega izbruha ali odpravljanja oksidativnega stresa lahko peroksidaze vplivajo na rast patogenov z ustvarjanjem fizičnih ovir, ki temeljijo na okrepitvi celične stene med lignifikacijo, podenoto ali zamreženjem specifičnih spojin. To funkcijo lahko in silico pripišemo genu TanjilG_03329, ki kodira domnevno lignin-tvorečo anionsko peroksidazo, ki je bila v naši študiji pri odporni liniji 83A:476 pri 6 HPI znatno povečana, ne pa tudi pri drugih sevih in časovnih točkah, ki se niso odzvali.
9S-/13S-lipoksigenaza linolne kisline je prvi korak v oksidativni poti biosinteze lipidov78. Produkti te poti imajo več funkcij v obrambi rastlin, vključno s krepitvijo celične stene z nastajanjem kaloze in pektinskih usedlin ter uravnavanjem oksidativnega stresa z nastajanjem reaktivnih kisikovih spojin79,80,81,82,83. V tej študiji je bila ekspresija linolne kisline 9S-/13S-lipoksigenaze spremenjena pri vseh sevih, vendar je pri dovzetni populaciji 22660 v različnih časovnih točkah prevladovala povečana regulacija, medtem ko pri sevih, ki nosijo odporni alel Lanr1 in AnMan, poudarja diverzifikacijo oksilipinske plasti v zaščitnih reakcijah antraksa med temi genotipi.
Homolog 1-aminociklopropan-1-karboksilat oksidaze (ACO) je bil pri inokulaciji z volčjim bobom znatno povečan (9 genov) ali zmanjšan (2 gena). Z dvema izjemama so se vsi ti odzivi pojavili pri 6 hp pri 83A:476. Encimska reakcija, ki jo posredujejo proteini ACO, je korak, ki omejuje hitrost proizvodnje etilena, zato je močno regulirana84. Etilen je rastlinski hormon, ki ima različne vloge pri uravnavanju razvoja rastlin in odziva na abiotske in biotske stresne razmere. Indukcija transkripcije ACO in aktivacija signalne poti etilena sodelujeta pri povečanju odpornosti riža na hemibiotrofno glivo oryzae oryzae z uravnavanjem proizvodnje reaktivnih kisikovih spojin in fitoaleksinov. Zelo podoben proces okužbe listov, ugotovljen med M. oryzae in C. lupini88,89, ob ozadju znatne povečane ekspresije homologov ACO v liniji 83A:476, o kateri poročamo v tej študiji, premika možnost, da odpornost na NLL antraknozo etilen postane osrednji signalni korak v molekularnih poteh.
V tej študiji so pri 6 hpi v populaciji 83A:476 in pri 48 hpi v populaciji Mandeloop in 22660 opazili obsežno supresijo številnih genov, povezanih s fotosintezo. Obseg in napredovanje teh sprememb sta sorazmerna z ravnjo. V tem poskusu so opazili odpornost na antraknozo. Nedavno so v več modelih interakcij med rastlinami in patogeni, vključno s patogenimi bakterijami in glivami, poročali o močni in zgodnji represiji transkriptov, povezanih s fotosintezo. Naglica (od 2 HPI v nekaterih interakcijah) in globalna supresija genov, povezanih s fotosintezo, kot odziv na okužbo lahko sprožita rastlinsko imunost, ki temelji na uporabi reaktivnih kisikovih vrst in njihovi interakciji s salicilno kislino za posredovanje alergijskih reakcij 90,94.
Skratka, mehanizmi obrambnega odziva, predlagani za najbolj odporno linijo (83A:476), vključujejo hitro prepoznavanje patogena s strani gena R (verjetno TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) in signalizacijo salicilne kisline in etilena, ki jo posreduje alergijski odziv, čemur sledi vzpostavitev dolgoročnega SAR. Delovanje podpira protein DIR-1. Treba je opozoriti, da je biotrofično obdobje okužbe s C. lupini zelo kratko (približno 2 dni), sledi pa mu nekrotična rast95. Prehod med tema fazama je lahko povezan z nekrozo in izražanjem etilen-inducibilnih proteinov, ki delujejo kot sprožilci preobčutljivostnih reakcij v gostiteljskih rastlinah. Zato je časovno okno za uspešen ulov C. lupini v biotrofični fazi zelo ozko. Reprogramiranje genov, povezanih z redoksom in fotosintezo, opaženo v 83A:476 pri 6 hpi, je skladno z napredovanjem glivičnih hif in napoveduje razvoj uspešnega zaščitnega odziva v biotrofični fazi. Transkriptomski odzivi Mandelupa in populacije 22660 so lahko preveč zapozneli, da bi zajeli glivo, preden preidejo na nekrotično rast, vendar je Mandelup lahko učinkovitejši od populacije 22660, ker relativno hitra regulacija proteina PR-10 spodbuja horizontalno odpornost.
Zdi se, da je ETI, ki ga poganja kanonični gen R, pogost mehanizem za odpornost fižola na antraknozo. Tako je pri modelni stročnici Medicago truncatula odpornost na antraknozo posledica gena RCT1, ki spada v razred rastlinskih genov R TIR-NBS-LRR97. Ta gen daje tudi širokospektralno odpornost na antraknozo pri lucerni, ko je prenesen na dovzetne rastline. Pri navadnem fižolu (P. vulgaris) je bilo do danes identificiranih več kot dva ducata genov za odpornost na antraknozo. Nekateri od teh genov se nahajajo v regijah, ki nimajo nobenih kanoničnih genov R, mnogi drugi pa se nahajajo na robovih kromosomov, ki nosijo gensko gručo NBS-LRR, vključno s TIR-NBS-LRRs99. Študija SSR na ravni celotnega genoma je potrdila tudi povezavo gena NBS-LRR z odpornostjo na antraknozo pri navadnem fižolu. Kanonični gen R je bil najden tudi v genomski regiji, ki nosi glavni lokus odpornosti na antraknozo pri belem volčjem bobu 101.
Naše delo kaže, da takojšnja reakcija odpornosti, aktivirana v zgodnji fazi okužbe rastlin (po možnosti najkasneje 12 hpi), učinkovito ščiti ozkolistni volčji bob pred antraknozo, ki jo povzroča patogena gliva Collelotrichum lupini. Z uporabo visokozmogljivega sekvenciranja smo prikazali diferencialne profile ekspresije genov odpornosti na antraknozo pri rastlinah NLL, ki jih posredujejo geni odpornosti Lanr1 in AnMan. Uspešna obramba vključuje skrbno načrtovanje genov za beljakovine, ki sodelujejo pri redoksu, fotosintezi in patogenezi, v nekaj urah po prvem stiku rastline s patogenom. Podobne zaščitne reakcije, vendar časovno zapoznele, so veliko manj učinkovite pri zaščiti rastlin pred boleznimi. Odpornost na antrakso, ki jo posreduje gen Lanr1, je podobna tipičnemu hitremu odzivu gena R (imunost, sprožena z efektorjem), medtem ko gen AnMan najverjetneje zagotavlja horizontalni odziv (imunost, ki jo sproži molekularni vzorec, povezan z mikrobom), kar zagotavlja zmerno raven trajnosti.
215 linij NLL, uporabljenih za presejanje antraknoznih markerjev, je obsegalo 74 kultivarjev, 60 linij, pridobljenih s križanjem ali vzrejo, 5 mutantov in 76 divjih ali originalnih zarodnih plazm. Linije so prihajale iz 17 držav, predvsem iz Poljske (58), Španije (47), Nemčije (27), Avstralije (26), Rusije (19), Belorusije (7), Italije (5) in druge linije iz 10 držav. Nabor vključuje tudi referenčne odporne linije: 83A:476, Tanjil, Wonga z alelom Lanr1 in Mandelup z alelom AnMan. Linije so bile pridobljene iz Evropske baze podatkov o genetskih virih volčjega boba, ki jo vzdržuje Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Poljska (dodatna tabela S1).
Rastline so gojili v kontroliranih pogojih (fotoperioda 16 ur, temperatura 25 °C podnevi in ​​18 °C ponoči). Analizirali smo dve biološki ponovitvi. DNK smo izolirali iz tri tedne starih listov z uporabo kompleta DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Nemčija) v skladu s protokolom. Kakovost in koncentracijo izolirane DNK smo ocenili s spektrofotometričnimi metodami (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA). Analizirali smo marker AnManM1, ki označuje gen za odpornost proti antraknozi AnMan (izpeljan iz sorte Mandelup), in markerja Anseq3 in Anseq4, ki obdajata gen Lanr1 (izpeljan iz sorte Tanjil). 11,26,28. Homozigoti za odporni alel so bili ocenjeni kot »1«, dovzetni kot »0« in heterozigoti kot 0,5.
Na podlagi rezultatov presejanja za markerje AnManM1, AnSeq3 in AnSeq4 ter razpoložljivosti semen za končne nadaljnje poskuse je bilo za fenotipizacijo odpornosti na antraknozo izbranih 50 linij NLL. Analiza je bila izvedena v dvojniku v računalniško vodenem rastlinjaku s 14-urnim fotoperiodom s temperaturnim razponom 22 °C podnevi in ​​19 °C ponoči. Semena so bila pred setvijo opraskana (semenska ovojnica na nasprotni strani zarodka je bila odrezana z ostrim rezilom), da se prepreči mirovanje semen zaradi pretrde semenske ovojnice in da se zagotovi enakomerna kalitev. Rastline so bile gojene v lončkih (11 × 11 × 21 cm) s sterilno zemljo (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varšava, Poljska). Inokulacijo smo izvedli s sevom Colletotrichum lupini Col-08, vzgojenim leta 1999 iz stebel ozkolistnih rastlin volčjega boba, vzgojenih na polju v Verženici na Velikopoljski (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Izbrali smo območje. Izolate smo gojili v gojišču SNA pri 20 °C pod črno svetlobo 21 dni, da bi sprožili sporulacijo. Štiri tedne po setvi, ko so rastline dosegle fazo 4-6 listov, smo izvedli inokulacijo s škropljenjem s suspenzijo konidij v koncentraciji 0,5 x 10⁶ konidij na ml. Po inokulaciji smo rastline 24 ur hranili v temi pri vlažnosti približno 98 % in temperaturi 25 °C, da bi olajšali kalitev konidij in proces okužbe. Rastline so nato gojili v 14-urnem fotoperiodu pri 22 °C podnevi/19 °C ponoči in 70 % vlažnosti. Ocena bolezni je bila določena 22 dni po inokulaciji in se je gibala od 0 (imune) do 9 (zelo dovzetne), odvisno od prisotnosti ali odsotnosti nekrotičnih lezij na steblih in listih. Poleg tega je bila po štetju izmerjena tudi teža rastlin. Razmerja med genotipi markerjev in fenotipi bolezni so bila izračunana kot korelacije dveh zaporednih točk (odsotnost heterozigotnih markerjev v nizu linij za analizo fenotipa odpornosti na antraknozo).