Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Limitado ang suporta sa CSS sa bersyon ng browser na iyong ginagamit. Para sa pinakamahusay na karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng updated na browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer). Samantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ire-render namin ang site nang walang mga style at JavaScript.
Ang Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) ay isang halamang leguminous na ginagamit para sa produksyon ng pagkain at pagpapabuti ng lupa. Ang pandaigdigang paglawak ng NLL bilang isang pananim ay nakaakit ng maraming pathogenic fungi, kabilang ang lupine anthracnose, na nagdudulot ng mapaminsalang sakit na anthracnose. Dalawang alleles, ang Lanr1 at AnMan, na nagbibigay ng mas mataas na resistensya, ang ginamit sa pagpaparami ng NLL, ngunit ang pinagbabatayang mekanismo ng molekula ay nananatiling hindi alam. Sa pag-aaral na ito, ang mga marker ng Lanr1 at AnMan ay ginamit upang i-screen ang mga sample ng European NLL. Kinumpirma ng pagsusuri sa bakuna sa isang kontroladong kapaligiran ang bisa ng parehong resistant donors. Isinagawa ang differential gene expression profiling sa mga kinatawan na resistant at susceptible na linya. Ang resistensya sa anthracnose ay nauugnay sa overexpression ng mga terminong gene ontology na "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process", at "GO:0015979 Photosynthesis". Bukod pa rito, ang linyang Lanr1(83A:476) ay nagpakita ng makabuluhang mabilis na pag-reprogram ng transcriptome pagkatapos ng inoculation, habang ang iba pang mga linya ay nagpakita ng pagkaantala sa tugon na ito nang humigit-kumulang 42 oras. Ang mga tugon sa depensa ay nauugnay sa mga gene na TIR-NBS, CC-NBS-LRR at NBS-LRR, 10 protina na kasangkot sa pathogenesis, mga protina sa paglilipat ng lipid, endoglucan-1,3-β-glucosidase, mga protina sa cell wall na mayaman sa glycine, at mga gene mula sa reactive path ng oxygen. Ang mga maagang tugon sa 83A:476, kabilang ang maingat na pagsugpo sa mga gene na nauugnay sa photosynthesis, ay kasabay ng matagumpay na proteksyon sa panahon ng vegetative growth phase ng fungal biology, na nagmumungkahi na ang isang effector ay nagpapalitaw ng kaligtasan sa sakit. Ang reaksyon ng Mandeloop ay bumagal, gayundin ang pangkalahatang horizontal drag.
Ang narrow-leaved lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) ay isang cereal na mataas sa protina na nagmumula sa kanlurang rehiyon ng Mediterranean1,2. Kasalukuyan itong itinatanim bilang pananim na pagkain para sa mga hayop at tao. Itinuturing din itong berdeng pataba sa mga sistema ng pag-ikot ng pananim dahil sa nitrogen fixation ng symbiotic nitrogen fixing bacteria at pangkalahatang pagpapabuti ng istruktura ng lupa. Ang NLL ay sumailalim sa mabilis na proseso ng pagpapaamo sa nakaraang siglo at nasa ilalim pa rin ng mataas na presyon ng pag-aanak3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Dahil sa malawakang paglilinang ng NLL, ang sunod-sunod na mga pathogenic fungi ay bumuo ng mga bagong nitso sa agrikultura at nagdulot ng mga bagong sakit na sumisira sa pananim. Ang pinakakapansin-pansin para sa mga magsasaka at tagapag-alaga ng lupin ay ang paglitaw ng anthracnose, na dulot ng pathogenic fungus na Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Ang pinakakapansin-pansin para sa mga magsasaka at tagapag-alaga ng lupin ay ang paglitaw ng anthracnose, na dulot ng pathogenic fungus na Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, селекционеров люпина было появление антракноза, селекционеров (Bondar) Nirenberg, Feiler at Hagedorn13. Pinakapansin-pansin sa mga magsasaka at tagapag-alaga ng lupine ay ang paglitaw ng anthracnose na dulot ng pathogenic fungus na Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真由病原眀引菌疽病的出现，它是由病原真tric菌Colombier Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原眀菌病原眀菌菌它是由病原真菌真菌。 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемогего прикмто lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler at Hagedorn13. Pinakapansin-pansin sa mga magsasaka at tagapag-alaga ng lupine ay ang paglitaw ng anthracnose na dulot ng pathogenic fungus na Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Ang mga pinakaunang ulat ng sakit ay nagmula sa Brazil at Estados Unidos, na may mga tipikal na sintomas na lumitaw noong 1912 at 1929 ayon sa pagkakabanggit. Gayunpaman, pagkatapos ng humigit-kumulang 30 taon, ang pathogen ay itinalaga bilang Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorph na Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph na Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorpo ng Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld sa Targeted Morphology. at H. Schrenk,. at H. Schrenk, .at H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。at H. Schlenk, .Ang paunang phenotyping ng sakit na ginawa noong kalagitnaan ng ika-20 siglo ay nagpakita ng ilang resistensya sa mga accession ng NLL at yellow lupine (L. luteus L.), ngunit lahat ng accession ng white lupine (L. albus L.) na sinubukan ay lubos na madaling kapitan15,16. Ipinakita ng mga pag-aaral na ang pag-unlad ng anthracnose ay nauugnay sa pagtaas ng presipitasyon (humilig sa hangin) at temperatura (sa hanay na 12-28°C), na humahantong sa paglabag sa resistensya sa mas mataas na temperatura17, 18. Sa katunayan, ang oras na kinakailangan para tumubo ang conidia at magsimula ang sakit ay apat na beses na mas maikli sa 24°C (4 na oras) kaysa sa 12°C (16 na oras) sa ilalim ng mga kondisyon ng mataas na humidity19. Kaya, ang patuloy na pag-init ng mundo ay humantong sa pagkalat ng anthracnose. Gayunpaman, ang sakit ay naobserbahan sa France (1982) at Ukraine (1983) bilang isang harbinger ng isang paparating na banta, ngunit tila hindi pinansin ng industriya ng lupine noong panahong iyon20,21. Pagkalipas ng ilang taon, ang mapaminsalang sakit na ito ay kumalat sa buong mundo at nakaapekto rin sa mga pangunahing bansang gumagawa ng lupine tulad ng Australia, Poland at Germany22,23,24. Kasunod ng pagsiklab ng anthracnose noong kalagitnaan ng dekada 1990, ang malawakang screening ay nagresulta sa pagtukoy ng ilang resistant donor sa mga sample ng NLL19. Ang resistensya ng NLL sa anthracnose ay kinokontrol ng dalawang magkahiwalay na dominanteng alleles na matatagpuan sa iba't ibang pinagmumulan ng germplasm: Lanr1 sa cultivar na Tanjil at Wonga at AnMan sa cultivar. Mandalay 25, 26. Ang mga alleles na ito ay kumukumpleto sa mga molecular marker na sumusuporta sa pagpili ng resistant germplasm sa mga programa sa pagpaparami25,26,27,28,29,30. Ang resistant breeding line na 83A:476 na may dalang Lanr1 allele ay pinag-cross sa susceptible wild line na P27255 upang makakuha ng populasyon ng RIL na naghihiwalay para sa anthracnose resistance, na nagbigay-daan upang maitalaga ang Lanr1 locus sa chromosome NLL-1131, 32, 33. Sa pamamagitan ng pag-align ng linkage map markers mula sa flanking resistance loci hanggang sa anthracnose gamit ang genomic framework, ipinakita ng NLL ang lokasyon ng lahat ng tatlong alleles sa iisang chromosome (NLL-11), ngunit sa magkaibang posisyon29,34,35. Gayunpaman, dahil sa maliit na bilang ng mga RIL at sa malaking genetic distance sa pagitan ng mga marker at kaukulang alleles, walang maaasahang konklusyon ang maaaring makuha tungkol sa kanilang mga pinagbabatayan na gene. Sa kabilang banda, ang paggamit ng reverse genetics sa mga lupin ay mahirap dahil sa kanilang napakababang regeneration potential, na nagpapahirap sa genetic manipulation37.
Ang pag-unlad ng pinaamo na germplasm na nagdadala ng ninanais na allele sa homozygous na estado, tulad ng 83A:476 (Lanr1) at Mandelup (AnMan), ay nagbukas ng pinto sa pag-aaral ng resistensya sa anthracnose sa harap ng pagkakaroon ng magkasalungat na kumbinasyon ng mga alleles sa mga ligaw na populasyon. Mga posibilidad ng mga mekanismong molekular. Paghambingin ang mga tugon sa depensa na nabuo ng mga partikular na genotype. Sinuri ng pag-aaral na ito ang maagang tugon ng transcriptome ng NLL sa pagbabakuna ng C. lupini. Una, isang European NLL germplasm panel na naglalaman ng 215 linya ang sinuri gamit ang mga molecular marker na nagmamarka sa mga alleles ng Lanr1 at AnMan. Pagkatapos ay isinagawa ang phenotyping ng Anthracnose sa 50 linya ng NLL, na dating napili para sa mga molecular marker, sa ilalim ng mga kontroladong kondisyon. Batay sa mga eksperimentong ito, apat na linya na magkakaibang resistensya sa anthracnose at komposisyon ng allelic ng Lanr1/AnMan ang napili para sa differential defense gene expression profiling gamit ang dalawang komplementaryong pamamaraan: high-throughput RNA sequencing at real-time PCR quantification.
Ang screening ng isang set ng NLL germplasm (N = 215) gamit ang mga marker na Lanr1 (Anseq3 at Anseq4) at AnMan (Anseq4) at AnMan (AnManM1) ay nagpakita na iisang linya lamang (95726, malapit sa Salamanca-b) ang nagpapalakas sa “resistance” allele para sa lahat ng marker, habang ang “Presence of 'susceptible' alleles” ay natagpuan ang proporsyon ng lahat ng marker sa 158 (~73.5%) na linya. Labintatlong linya ang gumawa ng dalawang “resistant” alleles ng Lanr1 marker, at 8 linya ang gumawa ng “resistant” alleles ng Lanr1. marker. Ang “resistance” allele ng AnMan marker (Supplementary Table S1). Dalawang linya ang heterozygous para sa Anseq3 marker at isang heterozygous para sa AnManM1 marker. 42 linya (19.5%) ang nagtataglay ng magkasalungat na mga yugto ng mga alleles ng Anseq3 at Anseq4, na nagpapahiwatig ng mataas na dalas ng rekombinasyon sa pagitan ng dalawang loci na ito. Ang mga phenotype ng Anthracnose sa ilalim ng mga kontroladong kondisyon (Supplementary Table S2) ay nagpakita ng pagkakaiba-iba sa resistensya ng mga sinubok na genotype, na makikita sa kalubhaan ng anthracnose. Ang mga pagkakaiba sa mean score ay mula 1.8 (katamtamang lumalaban) hanggang 6.9 (madaling maapektuhan) at ang mga pagkakaiba sa bigat ng halaman ay mula 0.62 (madaling maapektuhan) hanggang 4.45 g (lumalaban). Mayroong makabuluhang ugnayan sa pagitan ng mga halagang naobserbahan sa dalawang replikasyon ng eksperimento (0.51 para sa mga marka ng kalubhaan ng sakit, P = 0.00017 at 0.61 para sa bigat ng halaman, P < 0.0001) pati na rin sa pagitan ng dalawang parametrong ito (− 0.59 at − 0.77, P < 0.0001). Nagkaroon ng makabuluhang ugnayan sa pagitan ng mga halagang naobserbahan sa dalawang replikasyon ng eksperimento (0.51 para sa mga marka ng kalubhaan ng sakit, P = 0.00017 at 0.61 para sa bigat ng halaman, P < 0.0001) pati na rin sa pagitan ng dalawang parametrong ito (− 0.59 at − 0.77, P < 0.0001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для тля бля = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, Р00 < 0,0). Isang makabuluhang ugnayan ang natagpuan sa pagitan ng mga halagang naobserbahan sa dalawang pag-uulit ng eksperimento (0.51 para sa mga marka ng kalubhaan ng sakit, P = 0.00017 at 0.61 para sa bigat ng halaman, P < 0.0001), pati na rin sa pagitan ng dalawang parameter na ito (- 0.59 at -0.77, P < 0.0001) 0.0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为 = P0. 0.00017，植物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P <0.0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 了了了了0.51 ， p = 0.00017 ， 植物 为 为 0.61 ， p <0.0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（ 和 9.–5. 0.59 和– 0.59 和- 0.77, P < 0.0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести ва,10 тяжести, за 0 0, за 1 и масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001. Mayroong makabuluhang ugnayan sa pagitan ng mga halagang naobserbahan nang duplikado (iskor ng kalubhaan ng sakit na 0.51, P = 0.00017 at bigat ng halaman na 0.61, P < 0.0001) at sa pagitan ng dalawang parametrong ito (-0.59 at -0 .0001) ay 0.77, P<0.0001. ).Ang mga karaniwang sintomas na nakikita sa mga halamang madaling kapitan ng sakit ay kinabibilangan ng pagkiling at pag-ikot ng tangkay na kahawig ng istrukturang "pana ng pastol", na sinusundan ng mga hugis-itlog na sugat na may mga orange/pink na sporozoite (Karagdagang Larawan 1). Ang mga accession ng Australia na may dalang mga gene na Lanr1 (83A:476 at Tanjil) at AnMan (Mandelup) ay katamtamang lumalaban, 0.0331 at 0.0036). Ang ilang linya na may dalang mga "lumalaban" na alleles ng Lanr1 at/o AnMan ay nagpapakita ng mga sintomas ng sakit.
Kapansin-pansin, ang ilang linya ng NLL na kulang sa anumang allele ng marker na "lumalaban" ay nagpakita ng mataas na antas ng resistensya sa anthracnose (maihahambing o mas mataas kaysa sa mga genotype ng Lanr1 o AnMan), tulad ng Boregine (P value < 0.0001 para sa parehong parameter), Bojar (P value < 0.0001 para sa score at 0.001 para sa bigat ng halaman) at Population B-549/79b (P value < 0.0001 para sa score at hindi makabuluhan para sa bigat). Kapansin-pansin, ang ilang linya ng NLL na kulang sa anumang allele ng marker na "lumalaban" ay nagpakita ng mataas na antas ng resistensya sa anthracnose (maihahambing o mas mataas kaysa sa mga genotype ng Lanr1 o AnMan), tulad ng Boregine (P value < 0.0001 para sa parehong parameter), Bojar (P value < 0.0001 para sa score at 0.001 para sa bigat ng halaman) at Population B-549/79b (P value < 0.0001 para sa score at hindi makabuluhan para sa bigat). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокнийчикистного антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 o AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для проба), Boregine (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) at популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Kapansin-pansin, ilang linya ng NLL na kulang sa anumang 'resistant' marker allele ang nagpakita ng mataas na antas ng resistensya sa anthracnose (maihahambing o mas mataas kaysa sa mga genotype ng Lanr1 o AnMan), tulad ng Boregine (P value < 0.0001 para sa parehong parameter), Bojar (P value < 0.0001 para sa ebalwasyon at 0.001 para sa bigat ng halaman) at populasyon na B-549/79b (P value < 0.0001 para sa ebalwasyon at hindi makabuluhan para sa bigat).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗中性病抗怎基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显。 Kapansin-pansin na ang ilang mga sistemang NLL na walang anumang "antigenic" marker ay nagpapakita ng mataas na horizontal resistance (katumbas ng mga gene na Lanr1 o AnMan o mas mataas pa), tulad ng Boregine (parehong parameter na P < 0.0001), Bojar (P value < 0.0001, bigat ng halaman 0.001) at strain na B-549/79b (P value < 0.0001, timbang na hindi makabuluhan). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уостовнич антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 o AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001, Bojar <0,0001), Boregine масса растения 0,001) at популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Kapansin-pansin, ang ilang linya ng NLL na kulang sa anumang 'resistance' marker alleles ay nagpakita ng mataas na antas ng resistensya sa anthracnose (maihahambing o mas mataas kaysa sa mga genotype ng Lanr1 o AnMan), tulad ng Boregine (P value para sa parehong parameter na <0.0001), Bojar (P-value < 0.0001, bigat ng halaman 0.001) at populasyon na B-549/79b (P-value < 0.0001, timbang na hindi makabuluhan).Ang penomenong ito ay nagmumungkahi ng posibilidad ng isang nobelang genetic na pinagmumulan ng resistensya, na nagpapaliwanag sa naobserbahang kawalan ng ugnayan sa pagitan ng mga marker genotype at mga phenotype ng sakit (mga P value mula ~0.42 hanggang ~0.98). Kaya, ipinakita ng Kolmogorov-Smirnov test na ang datos sa resistensya sa anthracnose ay humigit-kumulang normal na ipinamamahagi para sa mga score (P-value 0.25 at 0.11) at masa ng halaman (P-value 0.47 at 0.55), na nagmumungkahi na ipinapalagay ko na mas maraming alleles ang kasangkot kaysa sa Lanr1 at AnMan.
Batay sa mga resulta ng screening laban sa anthracnose, 4 na linya ang napili para sa transcriptome analysis: 83A:476, Boregine, Mandelup, at Population 22660. Ang mga linyang ito ay muling sinubukan para sa anthrax resistance sa mga eksperimento sa pagbabakuna sa pamamagitan ng RNA sequencing, sa kondisyon na ang mga ito ay kapareho ng sa nakaraang pagsubok. Ang mga halaga ng iskor ay ang mga sumusunod: Boregin (1.71 ± 1.39), 83A: 476 (2.09 ± 1.38), Mandelup (3.82 ± 1.42) at populasyon 22660 (6.11 ± 1.29).
Ang Illumina NovaSeq 6000 protocol ay nakamit ang average na 40.5 Mread pairs bawat sample (29.7 hanggang 54.4 Mreads) (Karagdagang Talahanayan S3). Ang mga marka ng pagkakahanay sa reference sequence ay mula 75.5% hanggang 88.6%. Ang average na korelasyon ng read count data sa pagitan ng mga experimental variant sa pagitan ng mga biological replicate ay mula 0.812 hanggang 0.997 (mean 0.959). Sa 35,170 genes na sinuri, 2917 ang nagpakita ng walang ekspresyon, at ang iba pang 4785 genes ay ipinahayag sa bale-wala na antas (base mean < 5). Sa 35,170 genes na sinuri, 2917 ang nagpakita ng walang ekspresyon, at ang iba pang 4785 genes ay ipinahayag sa bale-wala na antas (base mean < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались темирон (базовое среднее <5). Sa 35,170 genes na sinuri, 2917 ang nagpakita ng walang ekspresyon, at ang natitirang 4785 genes ay naipahayag sa bale-wala na antas (base mean <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以忽略可以忽略不埡5）.35,170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 walang экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительнсубю среднее значение <5). Sa 35,170 genes na sinuri, 2917 ang hindi naipahayag at ang natitirang 4785 genes ay mayroong bale-wala na ekspresyon (base mean <5).Kaya, ang bilang ng mga gene na isinaalang-alang na ipinahayag (base mean ≥ 5) sa panahon ng eksperimento ay 27,468 (78.1%) (Karagdagang Talahanayan S4).
Mula sa unang punto ng pagkakataon, lahat ng linya ng NLL ay tumugon sa pagbabakuna ng C. lupini (strain Col-08) sa pamamagitan ng muling pagprograma ng transcriptome (Talahanayan 1), gayunpaman, may mga makabuluhang pagkakaiba na naobserbahan sa pagitan ng mga linya. Kaya, ang linya ng resistensya 83A:476 (na may dalang Lanr1 gene) ay nagpakita ng makabuluhang muling pagprograma ng transcriptome sa unang punto ng pagkakataon (6 hpi) na may 31-69-tiklop na pagtaas sa bilang ng mga nakahiwalay na pataas at pababa na gene kumpara sa iba pang mga punto ng oras sa puntong ito. Bukod pa rito, ang peak na ito ay panandalian lamang, dahil ang ekspresyon ng ilang gene lamang ang nanatiling makabuluhang nagbago sa pangalawang punto ng pagkakataon (12 hpi). Kapansin-pansin, ang Boregine, na nagpakita rin ng mataas na antas ng resistensya sa graft test, ay hindi sumailalim sa napakalaking transcriptional reprogramming sa panahon ng eksperimento. Gayunpaman, ang bilang ng mga differentially expressed genes (DEG) ay pareho para sa Boregine at 83A:476 sa 12 HPI. Parehong nagpakita ang Mandelup at ang populasyon na 22660 ng mga peak ng DEG sa huling punto ng oras (48 l/s), na nagpapahiwatig ng relatibong pagkaantala sa mga tugon sa depensa.
Dahil ang 83A:476 ay sumailalim sa malawakang transcriptome reprogramming bilang tugon sa C. lupini sa 6 HPI kumpara sa lahat ng iba pang linya, ~91% ng mga DEG na naobserbahan sa puntong ito ay partikular sa lahi (Larawan 1). Gayunpaman, mayroong ilang pagsasanib sa mga unang tugon sa pagitan ng mga linya ng pag-aaral, dahil ang 68.5%, 50.9%, at 52.6% DEG sa Boregine, Mandelup, at populasyon na 22660, ayon sa pagkakabanggit, ay nag-overlap sa mga natagpuan sa 83A:476 sa ilang mga punto ng panahon. Gayunpaman, ang mga DEG na ito ay bumubuo lamang ng isang maliit na bahagi (0.97–1.70%) ng lahat ng mga DEG na kasalukuyang natukoy gamit ang 83A:476. Bukod pa rito, 11 DEG mula sa lahat ng linya ay magkakaugnay sa panahong ito (Mga Supplementary Tables S4-S6), kabilang ang mga karaniwang bahagi ng mga tugon sa depensa ng halaman: lipid transfer protein (TanjilG_32225), endoglucan-1,3-β-glucoside enzyme (TanjilG_23384), dalawang stress-inducible protein tulad ng SAM22 (TanjilG_31528 at TanjilG_31531), basic latex protein (TanjilG_32352), at dalawang glycine-rich structural cell wall protein (TanjilG_19701 at TanjilG_19702). Nagkaroon din ng medyo mataas na overlap sa mga tugon ng transcriptome sa pagitan ng 83A:476 at Boregine sa 24 HPI (kabuuang 16-38% DEG) at sa pagitan ng Mandelup at Population 22660 sa 48 HPI (kabuuang 14-20% DEG).
Ang Venn diagram na nagpapakita ng bilang ng mga differentially expressed genes (DEG) sa mga linya ng narrow-leaved lupine (NLL) na inoculated ng Colletotrichum lupini (strain Col-08 na nakuha mula sa mga lupine field sa Wierzhenice, Poland, 1999). Ang mga linya ng NLL na sinuri ay: 83A:476 (resistant, may dalang allele ng Lanr1), Boregine (resistant, hindi alam ang genetic background), Mandelup (moderately resistant, may dalang allele ng AnMan) at populasyon na 22660 (very susceptible). Ang pagpapaikli na hpi ay nangangahulugang mga oras pagkatapos ng pagbabakuna. Ang mga halaga ng zero ay inalis upang gawing simple ang graph.
Ang hanay ng mga overexpressed genes sa 6 hpi ay sinuri para sa presensya ng mga canonical R gene domain (Supplementary Table S7). Ang pag-aaral na ito ay nagsiwalat ng transcriptome induction ng mga klasikong disease resistance genes na may mga NBS-LRR domain lamang sa 83A:476. Ang hanay na ito ay binubuo ng isang TIR-NBS-LRR gene (tanjilg_05042), limang CC-NBS-LRR genes (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, at tanjilg_16162), at Apat na NBS-LR, Tanjilg_16162), at Apat na NBS-LRRE (tanjilg_16162) pati na rin ang Apat na NBS-Lrr (tanjilg_16162) at Apat na NBS-LRR (TANJILG_16162). Ang lahat ng mga gene na ito ay may mga canonical domain na nakaayos sa mga conserved sequence. Bukod sa mga gene ng NBS-LRR domain, ilang RLL kinase ang na-activate sa 6 hpi, isa sa Boregine (TanjilG_19877), dalawa sa Mandelup (TanjilG_07141 at TanjilG_19877) at sa populasyon na 22660 (TanjilG_09014 at TanjilG_10361) at dalawa sa 83A 27:476.
Ang mga gene na may makabuluhang binagong ekspresyon bilang tugon sa pagbabakuna gamit ang C. lupini (strain Col-08) ay isinailalim sa Gene Ontology (GO) enrichment analysis (Supplementary Table S8). Ang termino para sa prosesong biyolohikal na pinakamadalas na labis na kinakatawan ay ang “GO:0006952 defense response” na lumitaw sa 6 sa 16 na kombinasyon (time × line) na may mataas na kahalagahan (P value < 0.001) (Fig. 2). Ang termino para sa prosesong biyolohikal na pinakamadalas na labis na kinakatawan ay ang “GO:0006952 defense response” na lumitaw sa 6 sa 16 na kombinasyon (time × line) na may mataas na kahalagahan (P value < 0.001) (Fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответо» 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Ang termino para sa prosesong biyolohikal na pinakamadalas na labis na kinakatawan ay ang 'GO:0006952 defense response', na lumitaw sa 6 sa 16 na kombinasyon (time × lineage) na may mataas na kahalagahan (P value < 0.001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（时间（时间筐一一们一一们一一一上个中，具有高显着性（P ‼< 0.001）（图2）。 Ang pinakarepresentatibong termino sa prosesong biyolohikal ay ang "GO:0006952 defense response", na lumilitaw sa 6 sa 16 na kombinasyon (时间×线), na may mataas na kahalagahan (P value < 0.001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», котовырыл 6 поского комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Ang termino para sa prosesong biyolohikal na pinakamadalas na labis na kinakatawan ay ang 'GO:0006952 Defense Response', na lumitaw sa 6 sa 16 na kombinasyon (time × line) na may mataas na kahalagahan (P value < 0.001) (Fig. 2).Ang terminong ito ay labis na kinakatawan sa dalawang punto ng panahon sa 83A: 476 at Boregine (6 at 24 hpi) at sa isang punto ng panahon sa Mandelup at Populasyon 22660 (12 at 6 hpi, ayon sa pagkakabanggit). Ito ay isang inaasahang resulta, na nagpapakita ng tugon ng antifungal ng mga lumalaban na linya. Bukod pa rito, ang 83A:476 ay tumugon sa C. lupini sa pamamagitan ng mabilis na pag-udyok ng mga gene na may kaugnayan sa oxidative burst na kinakatawan ng terminong "GO:0055114 redox process", na nagpapahiwatig ng isang partikular na tugon sa depensa, habang ang Boregine ay nagpakita ng mga partikular na tugon sa depensa, na may kaugnayan sa terminong 'GO'. :0006950 Tugon sa stress”. Ang populasyon 22660 ay nag-activate ng pahalang na tugon sa resistensya na kinasasangkutan ng mga pangalawang metabolite, na nagpapakita ng labis na bilang ng mga terminong “GO:0016104 Proseso ng biosynthesis ng triterpene” at “GO:0006722 Proseso ng metabolismo ng triterpene” (parehong termino ay kabilang sa parehong hanay ng mga gene), kung isasaalang-alang ang mga resulta ng pagsusuri ng pagpapayaman ng terminong GO, ang katatagan ng reaksyon ng Mandelup ay nasa pagitan ng Boregine at Populasyon 22660. Bilang karagdagan, ang maagang reaksyon 83A:476 (6 hpi) at naantalang reaksyon na Mandelup at Populasyon 22660 ay kinabibilangan ng terminong GO:0015979 'photosynthesis' at iba pang kaugnay na prosesong biyolohikal.
Ang mga termino sa bioprocess gene ontology na napili sa anotasyon ng mga gene na may magkakaibang ekspresyon sa panahon ng mga tugon ng transcriptome ng narrow-leaved lupine (NLL) na inoculated ng anthrax lupine (Col-08 strain na nakuha mula sa mga lupine field sa Wierzhenice, Poland, noong 1999) ay labis na pinalaki. Ang mga linya ng NLL na sinuri ay: 83A:476 (lumalaban, may dalang homozygous Lanr1 allele), Boregine (lumalaban, hindi alam ang genetic background), Mandelup (katamtamang lumalaban, may dalang homozygous AnMan allele) at populasyon 22660 (madaling kapitan).
Dahil nilalayon ng pag-aaral na ito na tukuyin ang mga gene na nakakatulong sa resistensya sa anthracnose, ang mga gene na itinalaga sa mga terminong GO na “GO: 0006952 Defensive responses” at “GO: 0055114 Redox processes” ay sinuri gamit ang mga cut-off dahil ang baseline mean ay ≥ 30 na may kahit isang linya. × point in time na pinagsasama ang mga statistically significant values ​​ng log2 (fold change). Ang bilang ng mga gene na nakakatugon sa mga pamantayang ito ay 65 para sa GO:0006952 at 524 para sa GO:0055114.
Ang 83A:476 ay nagpakita ng dalawang peak ng DEG na may anotasyon ng terminong GO:0006952, ang una ay nasa 6 na gene bawat pulgada (64 na gene, pataas at pababa na regulasyon) at ang pangalawa ay nasa 24 na gene bawat pulgada (15 gene, pataas na regulasyon lamang). Ipinakita rin ng Boregine na ang GO:0006952 ay umabot sa peak sa parehong punto ng oras, ngunit may mas kaunting DEG (11 at 8) at preferential activation. Nagpakita ang Mandeloop ng dalawang peak ng GO:0006952 sa 12 at 48 HPI, parehong may dalang 12 gene (ang una ay may mga activating gene, at ang pangalawa ay may mga suppressive gene lamang), habang ang 22660 na populasyon sa 6 na HPI (13 gene) ay may mas malaking pangingibabaw sa pagtaas ng peak regulation. Dapat tandaan na 96.4% ng GO:0006952 DEG sa mga peak na ito ay may parehong uri ng tugon (pataas o pababa), na nagpapahiwatig ng isang makabuluhang overlap sa mga tugon sa depensa sa kabila ng mga pagkakaiba sa bilang ng mga gene na kasangkot. Ang pinakamalaking grupo ng mga sequence na may kaugnayan sa terminong GO:0006952 ay nagko-code ng Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-like), na kabilang sa class 10 pathogenesis-associated protein (PR-10) protein clade at sa core protein latex. katulad (MLP-like) protein) protein (Fig. 3). Ang dalawang grupo ay magkaiba sa uri ng ekspresyon at direksyon ng tugon. Ang mga gene na nagko-code ng mga SAM22-like na protina ay nagpakita ng pare-pareho at makabuluhang induction sa mga unang punto ng oras (6 o 12 hpi) at sa pangkalahatan ay hindi tumutugon sa pagtatapos ng eksperimento (48 hpi), habang ang mga MLP-like na protina ay nagpakita ng koordinasyon sa 6 hpi. hpi. 83A:476 at Mandelup sa 48 hp/in, halos lahat ng iba pang data point ay hindi tumutugon. Bilang karagdagan, ang mga pagkakaiba sa mga expression profile ng mga SAM22-like na protina gene ay sumunod sa naobserbahang variability sa anthracnose resistance, dahil ang mas maraming resistant na linya ay may mas maraming time point na makabuluhang nag-i-induce sa mga gene na ito kaysa sa mas madaling kapitan na mga gene. Isa pang LlR18A/B-like PR-10 gene ang nagpakita ng halos kaparehong padron ng ekspresyon sa SAM22-like protein gene.
Natukoy ang mga pangunahing bahagi ng terminong biyolohikal na proseso na "GO:0006952 Defense Response" at ang mga pattern ng ekspresyon ng mga kandidatong gene ng mga alleles ng Lanr1 at AnMan. Ang Log2 scale ay kumakatawan sa mga halaga ng log2 (pagbabago ng fold) sa pagitan ng mga inoculated (Colletotrichum lupini, strain Col-08, na nakuha mula sa mga patlang ng lupine, Wizhenica, Poland, 1999) at mga kontrol (sham-inoculated) na halaman sa parehong punto ng oras. Ang mga sumusunod na linya ng narrowleaf lupine ay sinuri: 83A:476 (lumalaban, may dalang homozygous Lanr1 allele), Boregine (lumalaban, hindi alam ang genetic background), Mandelup (katamtamang lumalaban, may dalang homozygous AnMan allele), at Populasyon 22660 (madaling kapitan).
Bukod pa rito, sinuri ang mga profile ng ekspresyon ng mga kandidatong gene ng RNA-seq na Lanr1 (TanjilG_05042) at AnMan (TanjilG_12861) (Larawan 3). Ang gene ng TanjilG_05042 ay nagpakita ng isang makabuluhang tugon (pag-activate) sa 83A:476 lamang sa unang punto ng oras (6 hpi), habang ang TanjilG_12861 ay makabuluhan sa Mandeloop lamang sa dalawang punto ng oras: 6 hpi (down regulation) at 24 hpi (6 hpi). May.). adjustable) ).
Ang mga gene na may pinakamaraming overexpressed na epekto sa terminong GO:0055114 na “redox process” ay ang mga gene na nagko-code ng cytochrome P450 proteins at peroxidase (Fig. 4). Para sa mga sample na nakahiwalay mula sa 83A:476 sa 6 HPI, ang pinakamataas o pinakamababang halaga ng log2 (fold change) (para sa 86.6% ng mga gene) ay karaniwang naobserbahan sa pagitan ng mga inoculated at control plants, na nagpapakita ng mataas na tugon ng genotype na ito sa inoculating sex. Ipinakita ng 83A:476 ang pinakamahalagang GO: 0055114 DEG sa 6 hpi (503 genes), habang ang natitirang bahagi ng mga linya sa 48 hpi (Boregine, 31 genes; Mandelup, 85 genes; at Population 22660, 78 genes)). Sa karamihan ng mga gene ng pamilyang GO:0055114, dalawang uri ng tugon sa pagbabakuna (activation at inhibition) ang naobserbahan. Kapansin-pansin, hanggang 97.6% ng mga DEG ang natukoy para sa terminong GO: 0055114 sa Mandelupe sa 48 hp. Ang mga obserbasyong ito ay nagmumungkahi na, sa kabila ng mas maliit na sukat (ibig sabihin, ang bilang ng mga mutated redox genes, 85 laban sa 503), ang pattern ng mga naantalang transcriptome responses ng mandeloup sa anthracnose ay katulad ng maagang tugon ng 83A:476. Sa Boregine at Population 22660, ang convergence na ito ay mas mababa sa 51.6% at 75.6%, ayon sa pagkakabanggit.
Ang mga padron ng ekspresyon ng mga pangunahing bahagi ng termino ng prosesong biyolohikal na "GO:0055114 Redox process" ay isiniwalat. Ang Log2 scale ay kumakatawan sa mga halaga ng log2 (pagbabago ng fold) sa pagitan ng mga inoculated (Colletotrichum lupini, strain Col-08, na nakuha mula sa mga lupine field, Wizhenica, Poland, 1999) at mga kontrol (sham-inoculated) na halaman sa parehong punto ng oras. Ang mga sumusunod na linya ng narrowleaf lupine ay sinuri: 83A:476 (lumalaban, may dalang homozygous Lanr1 allele), Boregine (lumalaban, hindi alam ang genetic background), Mandelup (katamtamang lumalaban, may dalang homozygous AnMan allele), at Populasyon 22660 (madaling kapitan).
83A:476 Kasama rin sa mga tugon ng transcriptomic sa inoculation gamit ang C. lupini (strain Col-08) ang koordinadong pagpapatahimik ng mga gene na maiuugnay sa terminong GO:0015979 na "photosynthesis" at iba pang kaugnay na prosesong biyolohikal (FIG. 5). Ang set na ito ng GO:0015979 DEG ay naglalaman ng 105 gene na makabuluhang napigilan sa 6 hpi sa 83A:476. Sa subset na ito, 37 gene ang nabawasan din sa Mandelup sa 48 HPI at 35 sa parehong punto ng oras sa populasyon na 22660, kabilang ang 19 DEG na karaniwan sa parehong genotype. Walang DEG na nauugnay sa terminong GO: 0015979 ang makabuluhang na-activate sa anumang kumbinasyon (linya x oras).
Ang mga padron ng ekspresyon ng mga pangunahing bahagi ng termino ng prosesong biyolohikal na "GO:0015979 Photosynthesis" ay isiniwalat. Ang Log2 scale ay kumakatawan sa mga halaga ng log2 (pagbabago ng fold) sa pagitan ng mga inoculated (Colletotrichum lupini, strain Col-08, na nakuha mula sa mga lupine field, Wizhenica, Poland, 1999) at mga kontrol (sham-inoculated) na halaman sa parehong punto ng oras. Ang mga sumusunod na linya ng narrowleaf lupine ay sinuri: 83A:476 (lumalaban, may dalang homozygous Lanr1 allele), Boregine (lumalaban, hindi alam ang genetic background), Mandelup (katamtamang lumalaban, may dalang homozygous AnMan allele), at Populasyon 22660 (madaling kapitan).
Batay sa mga resulta ng pagsusuri ng differential expression at malamang na kasangkot sa mga tugon sa depensa laban sa mga pathogenic fungi, ang set na ito ng pitong gene ay napili para sa pagbibilang ng mga expression profile sa pamamagitan ng real-time PCR (Supplementary Table S9).
Ang posibleng protein gene na TanjilG_10657 ay makabuluhang na-induce sa lahat ng pinag-aralang linya at time point kumpara sa mga control (mimic) na halaman (Mga Supplementary Tables S10, S11). Bukod pa rito, ang expression profile ng TanjilG_10657 ay nagpakita ng pagtaas ng trend sa kabuuan ng eksperimento para sa lahat ng linya. Ang populasyon na 22660 ay nagpakita ng pinakamataas na sensitivity ng TanjilG_10657 sa inoculation na may 114-fold activation at ang pinakamataas na relative expression level (4.4 ± 0.4) sa 24 HPI (Fig. 6a). Ang PR10 LlR18A protein gene na TanjilG_27015 ay nagpakita rin ng activation sa lahat ng linya at time point, na may statistical significance sa karamihan ng mga data point (Fig. 6b). Katulad ng TanjilG_10657, ang pinakamataas na relative expression level ng TanjilG_27015 ay naobserbahan sa 22660 na inoculated na populasyon sa 24 HPI (19.5 ± 2.4). Ang acid endochitinase gene na TanjilG_04706 ay tumaas nang malaki sa lahat ng linya at sa lahat ng oras maliban sa Boregine 6 hpi (Fig. 6c). Ito ay malakas na na-induce sa unang oras (6 HPI) sa 83A:476 (ng 10.5 beses) at katamtamang tumaas sa iba pang mga linya (ng 6.6-7.5 beses). Sa panahon ng eksperimento, ang ekspresyon ng TanjilG_04706 ay nanatili sa magkatulad na antas sa 83A:476 at Boregine, habang sa Mandelup at Population 22660 ito ay tumaas nang malaki, na umabot sa medyo mataas na halaga (5.9 ± 1.5 at 6.2 ± 1.5, ayon sa pagkakabanggit). Ang endoglucan-1,3-β-glucosidase-like gene na TanjilG_23384 ay nagpakita ng mataas na activation sa unang dalawang oras (6 at 12 hpi) sa lahat ng linya maliban sa populasyon 22660 (Fig. 6d). Ang pinakamataas na relatibong antas ng ekspresyon ng TanjilG_23384 ay naobserbahan sa pangalawang punto ng oras (12 hpi) sa Mandelup (2.7 ± 0.3) at 83A:476 (1.5 ± 0.1). Sa 24 HPI, ang ekspresyon ng TanjilG_23384 ay medyo mababa sa lahat ng pinag-aralang linya (mula 0.04 ± 0.009 hanggang 0.44 ± 0.12).
Mga profile ng ekspresyon ng mga piling gene (ag) na ipinakita sa pamamagitan ng quantitative PCR. Ang mga numerong 6, 12 at 24 ay kumakatawan sa mga oras pagkatapos ng pagbabakuna. Ang mga gene na LanDExH7 at LanTUB6 ay ginamit para sa normalisasyon at ang LanTUB6 ay ginamit para sa inter-series calibration. Ang mga error bar ay kumakatawan sa standard deviation batay sa tatlong biological replicates, na ang bawat isa ay ang average ng tatlong technical replicates. Ang istatistikal na kahalagahan ng mga pagkakaiba sa mga antas ng ekspresyon sa pagitan ng mga halamang binakunahan (Colletotrichum lupini, strain Col-08, na nakuha noong 1999 mula sa bukid ng lupin sa Wierzenica, Poland) at mga kontrol (kunwaring binakunahan) ay minarkahan sa itaas ng mga punto ng datos (*P value < 0.05, **P value ≤ 0.01, ***P value ≤ 0.001). Ang istatistikal na kahalagahan ng mga pagkakaiba sa mga antas ng ekspresyon sa pagitan ng mga halamang binakunahan (Colletotrichum lupini, strain Col-08, na nakuha noong 1999 mula sa bukid ng lupin sa Wierzenica, Poland) at mga kontrol (kunwaring binakunahan) ay minarkahan sa itaas ng mga punto ng datos (*P value < 0.05, **P value ≤ 0.01, ***P value ≤ 0.001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен гля г. 999 г. в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*знач0наченых, **знач0наче P 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Ang mga makabuluhang pagkakaiba sa antas ng ekspresyon sa pagitan ng mga halamang binakunahan (Colletotrichum lupini, strain Col-08, na nakuha noong 1999 mula sa isang bukid ng lupine sa Wierzhenice, Poland) at mga kontrol (sham-inoculated) ay nabanggit sa itaas ng mga punto ng datos (*P value < 0.05, **P-value ≤ 0.01, ***P-value ≤ 0.001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据為0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （ 接秉 （接秉水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001). Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученплый спо Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками (* данных ден, 5 * данных P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Ang mga makabuluhang pagkakaiba sa antas ng ekspresyon sa pagitan ng mga halamang binakunahan (Colletotrichum lupini, strain Col-08, na nakuha mula sa mga taniman ng lupine sa Verzhenice, Poland, noong 1999) at mga kontrol (sham-inoculated) ay nabanggit sa itaas ng mga punto ng datos (*P value < 0.05, **P-value ≤ 0.01, ***P-value ≤ 0.001).Ang mga linyang NLL na sinuri ay: 83A:476 (lumalaban, may dalang homozygous Lanr1 allele), Mandelup (katamtamang lumalaban, may dalang homozygous AnMan allele), Boregine (lumalaban, hindi alam ang genetic background) at populasyon na 22660 (madaling kapitan).
Ang kandidatong gene na TanjilG_05042 sa locus ng Lanr1 ay nagpakita ng kakaibang padron ng ekspresyon mula sa mga profile na nakuha mula sa mga pag-aaral ng RNA-seq (Larawan 6e). Naobserbahan ang makabuluhang pag-aktibo ng gene na ito sa Mandelup at sa populasyon ng 22660 (hanggang 39.7 at 11.7 beses, ayon sa pagkakabanggit), na nagresulta sa medyo mataas na antas ng ekspresyon (hanggang 1.4 ± 0.14 at 7.2 ± 1.3, ayon sa pagkakabanggit). Ipinakita rin ng 83A:476 ang ilang pagtaas ng gene na TanjilG_05042 (hanggang 3.8 beses), gayunpaman, ang mga relatibong antas ng ekspresyon na nakamit (0.044 ± 0.002) ay mahigit 30 beses na mas mababa kaysa sa mga naobserbahan sa Mandelup at sa populasyon ng 22660. Ang mga pagsusuri gamit ang qPCR ay nagpakita ng mga makabuluhang pagkakaiba sa mga antas ng ekspresyon sa pagitan ng mga genotype sa mga mock-vaccinated (kontrol) na variant, na umabot sa 58-fold na pagkakaiba sa pagitan ng mga populasyon na 22660 at 83A:476, pati na rin sa pagitan ng mga populasyon na 22660 at 22660. Isang dobleng pagkakaiba ang nakamit sa pagitan ng Boregine at Mandalup.
Ang kandidatong gene sa lokus ng AnMan, ang TanjilG_12861, ay na-activate bilang tugon sa pagbabakuna sa 83A:476 at Mandelup, ay neutral sa populasyon ng 22660, at nabawasan sa Boregine (Larawan 6f). Ang relatibong ekspresyon ng gene ng TanjilG_12861 ay ang pinakamataas sa inoculated 83A: 476 (0.14±0.01). Ang 17.4 kDa class I heat shock protein gene na TanjilG_05080 HSP17.4 ay nagpakita ng mas mababang relatibong antas ng ekspresyon sa lahat ng pinag-aralang strain at time points (Larawan 6g). Ang pinakamataas na halaga ay naobserbahan sa 24 HPI sa populasyon ng 22660 (0.14 ± 0.02, isang walong beses na pagtaas sa tugon sa pagbabakuna).
Ang paghahambing ng mga profile ng ekspresyon ng gene (Larawan 7) ay nagpakita ng mataas na ugnayan sa pagitan ng TanjilG_10657 at apat na iba pang gene: TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.80), at TanjilG_04706 (r = 0.79). Ang mga resultang ito ay maaaring magpahiwatig ng co-regulasyon ng mga gene na ito sa panahon ng mga tugon sa depensa. Ang mga gene na TanjilG_12861 at TanjilG_23384 ay nagpakita ng iba't ibang profile ng ekspresyon na may mas mababang halaga ng Pearson correlation coefficient (mula 0.08 hanggang 0.43 at -0.19 hanggang 0.28, ayon sa pagkakabanggit) kumpara sa iba pang mga gene.
Ang mga ugnayan sa pagitan ng mga profile ng ekspresyon ng gene ay natukoy gamit ang quantitative PCR. Ang mga sumusunod na linya ng narrowleaf lupine ay sinuri: 83A:476 (lumalaban, may dalang homozygous Lanr1 allele), Mandelup (katamtamang lumalaban, may dalang homozygous AnMan allele), Boregine (lumalaban, hindi alam ang genetic background), at Populasyon 22660 (madaling maapektuhan). Tatlong punto ng oras ang kinalkula (6, 12 at 24 na oras pagkatapos ng pagbabakuna), kabilang ang mga binakunahan (Colletotrichum lupini, strain Col-08, na nakuha mula sa mga taniman ng lupine sa Wierzhenice, Poland, noong 1999) at mga kontrol (sham-inoculated) na halaman. Ipinapakita ng iskala ang halaga ng Pearson correlation coefficient.
Batay sa datos na nakuha sa 6 na horsepower kada pulgada, ang WGCNA ay isinagawa sa 9981 DEG na kinilala sa pamamagitan ng paghahambing ng mga inoculated at control plant upang tumuon sa mga maagang tugon sa depensa (Supplementary Table S12). Dalawampu't dalawang gene module (cluster) ang natagpuan na may magkakaugnay (positibo o negatibo) na mga profile ng ekspresyon sa pagitan ng mga genotype at mga eksperimental na variant. Sa karaniwan, ang mga antas ng ekspresyon ng gene ay bumababa sa pagkakasunud-sunod na 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasyon 22660 (gayunpaman, sa parehong variant, ang trend na ito ay mas malakas sa mga control plant). Sa karaniwan, ang mga antas ng ekspresyon ng gene ay bumababa sa pagkakasunud-sunod na 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasyon 22660 (gayunpaman, sa parehong variant, ang trend na ito ay mas malakas sa mga control plant). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasyon 22660 (sa обоих вариантах, оэцтанако, бел сильнее у контрольных растений). Sa karaniwan, ang mga antas ng ekspresyon ng gene ay bumaba sa pagkakasunud-sunod na 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasyon 22660 (gayunpaman, sa parehong variant, ang trend na ito ay mas malakas sa mga control plant).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasyon 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> populasyon 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中植物 中 更） .. . . . . . . . . . . . . . В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasyon 22660 (однако в обоих вариантах эта тенд контрольных растений). Sa karaniwan, ang mga antas ng ekspresyon ng gene ay bumaba sa seryeng 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasyon 22660 (gayunpaman, sa parehong variant, ang trend na ito ay mas malakas sa mga control plant).Ang pagbabakuna ay nagresulta sa pagtaas ng ekspresyon ng gene, lalo na sa mga module 18, 19, 14, 6 at 1 (sa pababang pagkakasunud-sunod ng epekto), negatibong regulasyon (hal. mga module 9 at 20) o may mga neutral na epekto (hal. mga module 11, 22, 8 at 13). Ang pagsusuri ng pagpapayaman ng termino ng GO (Supplementary Table S13) ay nagsiwalat ng "GO: 0006952 Protective responses" para sa inoculated module (18) na may pinakamataas na activation, kabilang ang mga gene na sinuri ng qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 at TanjilG_27015), pati na rin ang maraming Inoculate most suppressed photosynthesis modules (9). Ang Module 18 concentrator (Larawan 8) ay kinilala bilang ang TanjilG_26536 gene na nagko-code ng PR-10-like LlR18B protein, at ang module 9 concentrator ay kinilala bilang ang TanjilG_28955 gene na nagko-code ng photosystem II PsbQ protein. Isang candidate anthracnose resistance gene na Lanr1, ang TanjilG_05042, ay natagpuan sa module 22 (Larawan 9) at iniuugnay sa mga terminong “GO:0044260 Cellular macromolecular metabolic processes” at “GO:0006355 Transcriptional regulation, DNA templating” na may dalang TanjilG_01212 hub. Ang gene ay nagko-code ng heat stress transcription factor A-4a (HSFA4a).
Ang weighted network analysis ng gene co-expression ng mga module na may labis na representasyon ng mga biological process term na "GO: 0006952 Defense responses". Pinasimple ang ligation upang i-highlight ang apat na gene na sinuri ng qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 at TanjilG_27015).
Weighted network analysis ng gene co-expression ng isang module na may overrepresented biological process term na “GO: 0006355: Transcriptional regulation, DNA templating” at may dalang candidate anthracnose resistance gene na Lanr1 TanjilG_05042. Pinasimple ang ligation upang ihiwalay ang TanjilG_05042 gene at ang central TanjilG_01212 gene.
Ang screening para sa anthracnose resistance na nakolekta sa Australia ay nagpakita na karamihan sa mga unang inilabas na cultivar ay madaling kapitan; Ang Kalya, Coromup at Mandelup ay inilarawan bilang katamtamang lumalaban, habang ang Wonga, Tanjil at 83A:476 ay inilarawan bilang lubos na lumalaban26,27,31. ay may parehong resistance allele, na itinalagang Lanr1, at sina Coromup at Mandelup ay may ibang allele, na itinalagang AnMan10, 26, 39, habang ang Kalya ay nagpasa ng ibang allele., Lanr2. Ang screening para sa anthracnose resistance sa Germany ay nagresulta sa pagtukoy ng isang resistant line na Bo7212 na may candidate allele maliban sa Lanr1, na itinalagang LanrBo36.
Ang aming pag-aaral ay nagsiwalat ng napakababang dalas (mga 6%) ng Lanr1 allele sa sinubok na germplasm. Ang obserbasyong ito ay naaayon sa mga resulta ng screening ng East European germplasm gamit ang mga marker ng Anseq3 at Anseq4, na nagpakita na ang Lanr1 allele ay naroroon lamang sa dalawang linya ng Belarus. Ipinahihiwatig nito na ang Lanr1 allele ay hindi pa malawakang ginagamit ng mga lokal na programa sa pagpaparami, hindi tulad sa Australia, kung saan ito ay isa sa mga pangunahing alleles para sa marker-assisted breeding. Maaaring ito ay dahil sa mas mababang antas ng resistensya na ibinibigay ng Lanr1 allele sa mga kondisyon ng larangan sa Europa kumpara sa ulat ng Australia. Bilang karagdagan, ang mga pag-aaral ng anthracnose sa mga lugar na may mataas na ulan sa Australia ay nagpakita na ang mga tugon sa resistensya na namamagitan sa Lanr1 allele ay maaaring hindi epektibo sa mga kondisyon ng panahon na pabor sa paglaki at mabilis na pag-unlad ng pathogen19,42. Sa katunayan, sa kasalukuyang pag-aaral, ang ilang sintomas ng anthracnose ay naobserbahan din sa mga genotype na may dalang Lanr1 allele, na nagmumungkahi na ang resistensya ay maaaring mawala sa ilalim ng pinakamainam na mga kondisyon para sa pag-unlad ng C. lupini. Bukod pa rito, posible ang mga maling positibong interpretasyon ng presensya ng mga marker ng Anseq3 at Anseq4, na humigit-kumulang 1 cM mula sa lokus ng Lanr1, 28, 30, 43.
Ipinakita ng aming pag-aaral na ang 83A:476, na may dalang allele ng Lanr1, ay tumugon sa pagbabakuna ng C. lupini gamit ang malawakang transcriptome reprogramming sa unang sinuring time point (6 hpi), habang sa Mandelup, na may dalang allele ng AnMan, ang mga tugon ng transcriptomic ay naobserbahan kalaunan (mula 24 hanggang 48 hp). Ang mga temporal na pagkakaiba-iba sa mga tugon sa depensa ay nauugnay sa mga pagkakaiba sa mga sintomas ng sakit, na nagbibigay-diin sa kahalagahan ng maagang pagkilala sa pathogen para sa isang matagumpay na tugon sa resistensya. Upang mahawahan ang tisyu ng halaman, ang mga spore ng anthrax ay dapat dumaan sa ilang mga yugto ng pag-unlad sa ibabaw ng host, kabilang ang pagtubo, paghahati ng cell, at pagbuo ng isang appressorium. Ang isang appendage ay isang nakakahawang istruktura na kumakapit sa ibabaw ng host at nagpapadali sa pagtagos sa mga tisyu ng host. Kaya, ang mga spore ng C. gloeosporioides sa pea extract ay nagpakita ng unang paghahati ng nucleus pagkatapos ng 75-90 minuto ng incubation, ang pagbuo ng isang germ tube pagkatapos ng 90-120 minuto, at pagsugpo pagkatapos ng 4 na oras 45. Ang Mango C. gloeosporioides ay nagpakita ng mahigit 40% na pagtubo ng conidial pagkatapos ng 3 oras na incubation at humigit-kumulang 20% ​​na pagbuo ng mga appressor pagkatapos ng 4 na oras. Ang virulence-associated CAP20 gene ng C. gloeosporioides ay nagpakita ng transcriptional activity sa epiphyte-forming conidia pagkatapos ng 3.5 oras na incubation sa avocado surface wax na may mataas na konsentrasyon ng CAP20 protein pagkatapos ng 4 na oras at 46 minuto. Gayundin, ang aktibidad ng melanin biosynthesis genes sa C. trifolii ay na-induce sa loob ng 2-oras na incubation na sinundan ng pagbuo ng isang appressorium pagkatapos ng 1 oras. Ipinakita ng mga pag-aaral sa mga tisyu ng dahon na ang mga strawberry na inoculated ng C. acutatum ay may unang suppression sa 8 hpi, habang ang mga kamatis na inoculated ng C. coccodes ay may unang suppression sa 4 hpi48,49. na higit na naaayon sa time scale ng proseso ng impeksyon ng Colletotrichum spp. Ang mabilis na mga tugon sa depensa sa 83A:476 ay nagmumungkahi ng pagkakasangkot ng resistensya ng halaman at mga gene na may effector-triggered immunity (ETI) sa linyang ito, habang ang mga naantalang tugon ni Mandelup ay sumusuporta sa micro-associated molecular pattern-triggered immunity (MTI) hypothesis 50. Mga maagang tugon sa 83A: 476 at Mandelup. Ang bahagyang pagsasanib sa pagitan ng mga gene na pataas o pababa ang regulasyon sa naantalang tugon ay sumusuporta rin sa konseptong ito, dahil ang ETI ay madalas na itinuturing na isang pinabilis at pinahusay na tugon ng MTI na nagtatapos sa programmed cell death sa lugar ng impeksyon, na kilala bilang anaphylactic shock 51,52.
Karamihan sa mga gene na iniuugnay sa labis na kinakatawan na terminong Gene Ontology GO:0006952 na "Defense Response" ay ang 11 homologue ng stress-induced fasting message 22 protein (katulad ng SAM22) at ang pitong pangunahing latex protein-likes (MLPs). Ang mga -like protein 31, 34, 43 at 423 ay nagpakita ng pagkakatulad ng sequence. Ang mga SAM22-like gene ay nagpakita ng makabuluhang activation na mas tumagal, na nagpapakita ng pagtaas ng antas ng anthracnose resistance (83A:476 at Boregine). Gayunpaman, ang mga MLP-like gene ay nabawasan lamang sa mga linyang may dalang candidate resistance allele (83A:476/Lanr1 sa 6 hpi at Mandelup/AnMan sa 24 hpi). Dapat tandaan na ang lahat ng natukoy na SAM22-like homologue ay nagmula sa isang gene cluster na sumasaklaw sa humigit-kumulang 105 kb, habang ang mga MLP-like gene ay nagmula sa magkakahiwalay na rehiyon ng genome. Ang koordinadong pag-activate ng mga naturang SAM22-like genes ay natagpuan din sa aming nakaraang pag-aaral ng NLL resistance sa Diaporthetoxica inoculation, na nagmumungkahi na ang mga ito ay kasangkot sa mga pahalang na bahagi ng tugon sa depensa. Ang konklusyong ito ay sinusuportahan din ng mga ulat ng isang positibong tugon ng mga SAM22-like genes sa pinsala o paggamot gamit ang salicylic acid, fungal inducers, o hydrogen peroxide.
Ang mga gene na parang MLP ay naipakita na tumutugon sa iba't ibang abiotic at biotic stress, kabilang ang mga impeksyon sa bacterial, viral at pathogenic fungal sa maraming uri ng halaman55. Ang mga direksyon ng tugon sa ilang mga interaksyon sa pagitan ng mga halaman at mga pathogen ay mula sa matinding pagtaas (ibig sabihin, sa panahon ng infestation ng bulak na may Verticillium dahliae) hanggang sa makabuluhang pagbaba (ibig sabihin, pagkatapos ng impeksyon ng puno ng mansanas na may Alternaria spp.)56,57. Ang makabuluhang pagbaba ng MLP-like 423 gene ay naobserbahan sa panahon ng mga depensa ng avocado laban sa impeksyon ng F. niger at sa panahon ng impeksyon ng puno ng mansanas na Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola at Alternaria alternata ay mga pathotype ng mansanas58,59. Bilang karagdagan, ang apple calli na labis na nagpapahayag ng MLP-like 423 gene ay may mas mababang pagpapahayag ng mga gene na nauugnay sa resistensya at mas madaling kapitan ng impeksyon sa fungal59. Kasunod ng Fusarium oxysporum f, ang MLP-like 423 gene ay napigilan din sa resistant common bean germplasm. cn. Impeksyon ng bean 60.
Ang iba pang miyembro ng pamilyang PR-10 na nakilala sa aming pag-aaral ng RNA-seq ay ang mga gene na LlR18A at LlR18B bilang tugon sa upregulation, pati na rin ang upregulated (1 gene) o downregulated (3 genes) gene para sa lipid transfer protein na DIR1. Bukod pa rito, itinatampok ng WGCNA ang gene na LlR18B bilang sentro sa modyul na ito, na lubhang madaling kapitan ng pagbabakuna at may dalang ilang protective response genes. Ang mga gene na LlR18A at LlR18B ay na-induce sa mga dahon ng dilaw na lupine bilang tugon sa mga pathogenic bacteria, pati na rin sa mga tangkay ng NLL pagkatapos ng inoculation ng D. toxica, habang ang homologue ng palay ng mga gene na ito, ang RSOsPR10, ay mabilis na na-induce ng isang impeksyong fungal na malamang na sangkot sa jasmonic acid signaling pathway53,61, 62. Ang gene na DIR1 ay nagko-code ng mga nonspecific lipid transport protein na kinakailangan para sa pagsisimula ng systemic acquired resistance (SAR). Kasabay ng pag-unlad ng mga reaksyong pangproteksyon, ang protina ng DIR1 ay dinadala mula sa sentro ng impeksyon patungo sa phloem upang magdulot ng SAR sa malalayong organo. Kapansin-pansin, ang gene ng TanjilG_02313 DIR1 ay makabuluhang na-induce sa unang pagkakataon sa mga linya 84A:476 at Populasyon 22660, ngunit ang resistensya sa anthracnose ay matagumpay na nabuo lamang sa linya 84A:476. Maaaring ipahiwatig nito ang ilang subfunctionalization ng gene ng DIR1 sa NLL, dahil ang natitirang tatlong homologue ay tumugon lamang sa inoculation sa linya 83A:476 sa 6 hpi, at ang tugon na ito ay nakadirekta pababa.
Sa aming pag-aaral, ang pinakakaraniwang mga sangkap na tumutugma sa prosesong biyolohikal na tinatawag na "GO:0055114 Redox process" ay ang cytochrome P450 protein, peroxidase, linoleic acid 9S-/13S-lipoxygenase, at 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase. Bukod pa rito, tinukoy ng aming WGCNA ang homologue ng HSFA4a bilang isang hub na nagdadala ng mga module tulad ng Lanr1 resistance gene candidate na TanjilG_05042. Ang HSFA4a ay isang sangkap ng redox-dependent regulation ng nuclear transcription sa mga halaman.
Ang mga protina ng Cytochrome P450 ay mga oxidoreductase na nagpapabilis sa mga reaksyon ng hydroxylation na umaasa sa NADPH at/o O2 sa pangunahin at pangalawang metabolismo, kabilang ang metabolismo ng xenobiotics, pati na rin ang mga hormone, fatty acid, sterol, mga bahagi ng cell wall, biopolymer, at ang biosynthesis ng mga protective compound 69. Sa aming Sa isang pag-aaral, ang pagkakaiba-iba sa function ng cytochrome P450 ng halaman ay nabawasan mula -10.6 log2 (pagbabago sa fold) hanggang 5.7 dahil sa isang malaking bilang ng mga binagong homologue (37) at mga pagkakaiba sa mga pattern ng tugon sa pagitan ng mga partikular na gene, na sumasalamin sa isang pataas na rebisyon. . Ang paggamit lamang ng datos ng RNA-seq upang linawin ang maaaring biyolohikal na function ng mga gene ng NLL sa isang malaking superfamily ng protina ay magiging lubos na haka-haka. Gayunpaman, mahalagang tandaan na ang ilang mga gene ng cytochrome P450 ay nauugnay sa pagtaas ng resistensya sa mga pathogenic fungi o bacteria, kabilang ang isang kontribusyon sa mga reaksiyong alerdyi 69,70,71.
Ang mga Class III peroxidase ay mga multifunctional na enzyme ng halaman na kasangkot sa malawak na hanay ng mga proseso ng metabolismo sa panahon ng paglaki at pag-unlad ng halaman, pati na rin bilang tugon sa mga stress sa kapaligiran tulad ng kaasinan, tagtuyot, matinding tindi ng liwanag, at pag-atake ng pathogen72. Ang mga peroxidase ay kasangkot sa interaksyon ng ilang uri ng halaman sa Anthracis, kabilang ang Stylosanthes humilis at C. gloeosporioides, Lens culinaris at C. truncatum, Phaseolus vulgaris at C. lindemuthianum, Cucumis sativus at C. lagenarium73,74,75,76. Ang tugon ay napakabilis, minsan kahit na sa 4 HPI, bago tumagos ang fungus sa tisyu ng halaman73. Ang peroxidase gene ay tumugon din sa inoculation ng D. toxica NLL. Bilang karagdagan sa kanilang karaniwang mga tungkulin na pangasiwaan ang oxidative burst o alisin ang oxidative stress, ang mga peroxidase ay maaaring makagambala sa paglaki ng pathogen sa pamamagitan ng paglikha ng mga pisikal na hadlang batay sa pagpapalakas ng cell wall sa panahon ng lignification, subunit o cross-linking ng mga partikular na compound. Ang tungkuling ito ay maaaring maiugnay in silico sa gene na TanjilG_03329 na nagko-encode ng isang putative lignin-forming anion peroxidase na makabuluhang tumaas sa aming pag-aaral sa 83A:476 resistant line sa 6 HPI, ngunit hindi sa iba pang mga strain at time point na hindi tumugon.
Ang 9S-/13S-lipoxygenase ng linoleic acid ang unang hakbang sa oxidative pathway ng lipid biosynthesis78. Ang mga produkto ng pathway na ito ay may maraming tungkulin sa depensa ng halaman, kabilang ang pagpapalakas ng cell wall sa pamamagitan ng pagbuo ng mga deposito ng callose at pectin, at regulasyon ng oxidative stress sa pamamagitan ng produksyon ng reactive oxygen species79,80,81,82,83. Sa kasalukuyang pag-aaral, ang ekspresyon ng linoleic acid na 9S-/13S-lipoxygenase ay nabago sa lahat ng strain, ngunit sa susceptible population 22660, ang upregulation ay nanaig sa iba't ibang time points, habang sa mga strain na may dalang resistant Lanr1 at AnMan allele, binibigyang-diin nito ang diversification ng oxylipin layer sa mga protective anthrax reaction sa pagitan ng mga genotype na ito.
Ang homologue na 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase (ACO) ay makabuluhang tumaas ang regulasyon (9 na gene) o bumaba ang regulasyon (2 gene) nang inoculate ng lupine. Maliban sa dalawang eksepsiyon, lahat ng mga tugon na ito ay naganap sa 6 hp. sa 83A:476. Ang enzymatic reaction na namamagitan sa mga protina ng ACO ang hakbang na naglilimita sa rate sa produksyon ng ethylene at samakatuwid ay lubos na kinokontrol84. Ang Ethylene ay isang hormone ng halaman na gumaganap ng iba't ibang papel sa pag-regulate ng pag-unlad ng halaman at tugon sa mga abiotic at biotic stress conditions. Ang induction ng ACO transcription at activation ng ethylene signaling pathway ay kasangkot sa pagtaas ng resistensya ng palay sa hemibiotrophic fungus oryzae oryzae sa pamamagitan ng pag-regulate ng produksyon ng reactive oxygen species at phytoalexins. Isang halos kaparehong proseso ng impeksyon sa dahon na natagpuan sa pagitan ng M. oryzae at C. lupini88,89, laban sa backdrop ng isang makabuluhang pagtaas ng mga homologue ng ACO sa linyang 83A:476 na iniulat sa pag-aaral na ito, ay nagbabago sa posibilidad ng pagbibigay ng resistensya sa NLL anthracnose Ethylene, isang pangunahing hakbang sa pagbibigay ng senyas sa mga molecular pathway.
Sa kasalukuyang pag-aaral, ang malawakang pagsugpo sa maraming gene na nauugnay sa photosynthesis ay naobserbahan sa 6 hpi sa 83A:476 at sa 48 hpi sa Mandeloop at sa populasyon na 22660. Ang lawak at pag-unlad ng mga pagbabagong ito ay proporsyonal sa antas. Naobserbahan ang resistensya sa anthracnose sa eksperimentong ito. Kamakailan lamang, ang malakas at maagang pagsugpo sa mga transcript na nauugnay sa photosynthesis ay naiulat sa ilang mga modelo ng mga interaksyon ng halaman-pathogen, kabilang ang mga pathogenic bacteria at fungi. Ang pagmamadali (mula sa 2 HPI sa ilang mga interaksyon) at pandaigdigang pagsugpo sa mga gene na nauugnay sa photosynthesis bilang tugon sa impeksyon ay maaaring mag-trigger ng kaligtasan sa sakit ng halaman batay sa pag-deploy ng mga reactive oxygen species at ang kanilang interaksyon sa salicylic acid pathway upang mamagitan sa mga allergic reaction 90,94.
Bilang konklusyon, ang mga mekanismo ng tugon sa depensa na iminungkahi para sa pinakamatatag na linya (83A:476) ay kinabibilangan ng mabilis na pagkilala ng pathogen ng R gene (malamang na TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) at allergic response-mediated salicylic acid at ethylene signaling, na sinusundan ng pagtatatag ng long-range SAR. Ang aksyon ay sinusuportahan ng DIR-1 protein. Dapat tandaan na ang biotrophic period para sa impeksyon ng C. lupini ay napakaikli (humigit-kumulang 2 araw), na sinusundan ng necrotic growth95. Ang paglipat sa pagitan ng mga yugtong ito ay maaaring nauugnay sa necrosis at ekspresyon ng mga ethylene-inducible protein na nagsisilbing trigger para sa mga reaksyon ng hypersensitivity sa mga halamang host. Samakatuwid, ang time window para sa matagumpay na pagkuha ng C. lupini sa biotrophic stage ay napakakitid. Ang reprogramming ng mga gene na nauugnay sa redox at photosynthesis na naobserbahan sa 83A:476 sa 6 hpi ay naaayon sa pag-unlad ng fungal hyphae at nagbabadya ng pag-unlad ng isang matagumpay na protective response sa biotrophic stage. Ang mga transcriptomic na tugon ng Mandelup at ng populasyon ng 22660 ay maaaring masyadong naantala upang makuha ang fungus bago lumipat sa necrotic growth, gayunpaman, ang Mandelup ay maaaring mas epektibo kaysa sa populasyon ng 22660 dahil ang medyo mabilis na regulasyon ng protina ng PR-10 ay nagtataguyod ng pahalang na resistensya.
Ang ETI, na pinapatakbo ng canonical R gene, ay tila isang karaniwang mekanismo para sa resistensya ng bean sa anthracnose. Kaya, sa modelong legume na Medicago truncatula, ang resistensya sa anthracnose ay ibinibigay ng gene na RCT1, isang miyembro ng klase ng gene na TIR-NBS-LRR97 plant R. Ang gene na ito ay nagbibigay din ng malawak na spectrum na resistensya sa anthracnose sa alfalfa kapag inilipat sa mga halamang madaling kapitan. Sa karaniwang bean (P. vulgaris), mahigit dalawang dosenang gene na resistensya sa anthracnose ang natukoy hanggang sa kasalukuyan. Ang ilan sa mga gene na ito ay matatagpuan sa mga rehiyon na walang anumang canonical R gene, gayunpaman marami pang iba ang matatagpuan sa mga gilid ng mga chromosome na nagdadala ng kumpol ng gene na NBS-LRR, kabilang ang TIR-NBS-LRRs99. Kinumpirma rin ng pag-aaral ng genome-wide SSR ang kaugnayan ng gene na NBS-LRR sa resistensya sa anthracnose sa karaniwang bean. Ang canonical R gene ay natagpuan din sa genomic region na nagdadala ng pangunahing locus ng resistensya sa anthracnose sa puting lupine 101.
Ipinapakita ng aming trabaho na ang isang agarang reaksyon ng resistensya, na na-activate sa maagang yugto ng impeksyon ng halaman (mas mabuti na hindi lalampas sa 12 hpi), ay epektibong nagpoprotekta sa makitid na dahon na lupine mula sa anthracnose na dulot ng pathogenic fungus na Collelotrichum lupini. Gamit ang mataas na throughput sequencing, ipinakita namin ang magkakaibang mga profile ng ekspresyon ng mga gene na lumalaban sa anthracnose sa mga halamang NLL na namamagitan sa mga gene na lumalaban sa Lanr1 at AnMan. Ang matagumpay na depensa ay kinabibilangan ng maingat na pagdidisenyo ng mga gene para sa mga protina na kasangkot sa redox, photosynthesis, at pathogenesis sa loob ng ilang oras mula sa unang pakikipag-ugnayan ng halaman sa isang pathogen. Ang mga katulad na reaksyon ng proteksyon, ngunit naantala sa oras, ay hindi gaanong epektibo sa pagprotekta sa mga halaman mula sa mga sakit. Ang resistensya sa anthrax na namamagitan sa Lanr1 gene ay kahawig ng karaniwang mabilis na tugon ng R gene (effector-triggered immunity), habang ang AnMan gene ay malamang na nagbibigay ng pahalang na tugon (immunity na na-trigger ng isang microbe-associated molecular pattern), na nagbibigay ng katamtamang antas ng pagpapanatili.
Ang 215 na linya ng NLL na ginamit upang masuri ang mga marker ng anthracnose ay binubuo ng 74 na kultibar, 60 linya na nakuha sa pamamagitan ng crossing o breeding, 5 mutants, at 76 na wild o original germplasm. Ang mga linya ay nagmula sa 17 bansa, pangunahin na mula sa Poland (58), Spain (47), Germany (27), Australia (26), Russia (19), Belarus (7), Italy (5) at iba pang mga linya mula sa 10 bansa. Kasama rin sa set ang mga linyang reference resistant: 83A:476, Tanjil, Wonga na may dalang Lanr1 allele, at Mandelup na may dalang AnMan allele. Ang mga linya ay nakuha mula sa European Lupine Genetic Resource Database na pinapanatili ng Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Poland (Supplementary Table S1).
Ang mga halaman ay pinalaki sa ilalim ng kontroladong mga kondisyon (photoperiod 16 na oras, temperatura 25°C sa araw at 18°C ​​sa gabi). Dalawang biological replicates ang sinuri. Ang DNA ay inihiwalay mula sa mga dahon na tatlong linggong gulang gamit ang DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) ayon sa protocol. Ang kalidad at konsentrasyon ng nakahiwalay na DNA ay tinasa gamit ang mga pamamaraang spectrophotometric (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Ang marker na AnManM1 na nagmamarka sa anthracnose resistance gene na AnMan (nagmula sa cv. Mandelup) at ang mga marker na Anseq3 at Anseq4 na katabi ng gene na Lanr1 (nagmula sa cv. Tanjil) ay sinuri 11,26,28. Ang mga homozygotes para sa resistant allele ay binigyan ng marka bilang "1", susceptible - bilang "0", at mga heterozygotes - bilang 0.5.
Batay sa mga resulta ng screening para sa mga marker na AnManM1, AnSeq3 at AnSeq4 at sa pagkakaroon ng mga buto para sa mga pangwakas na follow-up na eksperimento, 50 linya ng NLL ang napili para sa phenotyping laban sa anthracnose. Ang pagsusuri ay isinagawa nang doble sa isang greenhouse na kontrolado ng computer na may 14 na oras na photoperiod na may saklaw ng temperatura na 22°C sa araw at 19°C sa gabi. Ang mga buto ay kinakamot (pinuputol ang balat ng buto sa kabilang panig ng embryo gamit ang isang matalas na talim) bago itanim upang maiwasan ang dormancy ng buto dahil sa sobrang tigas ng balat ng buto at upang matiyak ang pantay na pagtubo. Ang mga halaman ay itinanim sa mga paso (11 × 11 × 21 cm) na may isterilisadong lupa (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warsaw, Poland). Isinagawa ang pagbabakuna gamit ang Colletotrichum lupini Col-08 strain, na lumaki noong 1999 mula sa mga tangkay ng makikitid na dahon na halamang lupine na lumaki sa isang bukid sa Verzhenitsa, Greater Poland (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Kumuha ng isang lugar. Ang mga isolate ay kinultura sa SNA medium sa 20° C sa ilalim ng itim na ilaw sa loob ng 21 araw upang ma-induce ang sporulation. Apat na linggo pagkatapos ng paghahasik, nang ang mga halaman ay umabot na sa 4-6 na yugto ng dahon, isinagawa ang pagbabakuna sa pamamagitan ng pag-spray ng suspensyon ng conidia sa konsentrasyon na 0.5 x 106 conidia bawat ml. Pagkatapos ng pagbabakuna, ang mga halaman ay pinanatili sa dilim sa loob ng 24 na oras sa humidity na humigit-kumulang 98% at temperatura na 25°C upang mapadali ang pagtubo ng conidia at ang proseso ng impeksyon. Ang mga halaman ay pinatubo sa ilalim ng 14-oras na photoperiod sa 22°C araw/19°C gabi at 70% humidity. Ang score ng sakit ay ginawa 22 araw pagkatapos ng pagbabakuna at mula 0 (immune) hanggang 9 (napaka-madaling maapektuhan) depende sa presensya o kawalan ng mga necrotic lesion sa mga tangkay at dahon. Bukod pa rito, pagkatapos ng pag-iskor, sinukat ang bigat ng mga halaman. Ang mga ugnayan sa pagitan ng mga marker genotype at mga phenotype ng sakit ay kinalkula bilang point two-sequence correlations (kawalan ng mga heterozygous marker sa hanay ng mga linya para sa pagsusuri ng phenotype ng resistensya sa anthracnose).