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Il lupino angustifolius (NLL, Lupinus angustifolius L.) è una pianta leguminosa utilizzata per la produzione alimentare e il miglioramento del suolo. L'espansione globale del NLL come coltura ha attirato numerosi funghi patogeni, tra cui l'antracnosi del lupino, che causa la devastante malattia dell'antracnosi. Due alleli, Lanr1 e AnMan, che conferiscono una maggiore resistenza, sono stati utilizzati nel miglioramento genetico del NLL, ma i meccanismi molecolari sottostanti rimangono sconosciuti. In questo studio, i marcatori Lanr1 e AnMan sono stati utilizzati per lo screening di campioni europei di NLL. La sperimentazione del vaccino in un ambiente controllato ha confermato l'efficacia di entrambi i donatori resistenti. È stata eseguita un'analisi del profilo di espressione genica differenziale su linee rappresentative resistenti e suscettibili. La resistenza all'antracnosi è stata associata alla sovraespressione dei termini di ontologia genica "GO:0006952 Risposta di Difesa", "GO:0055114 Processo Redox" e "GO:0015979 Fotosintesi". Inoltre, la linea Lanr1(83A:476) ha mostrato un significativo riprogrammazione del trascrittoma rapidamente dopo l'inoculazione, mentre le altre linee hanno mostrato un ritardo in questa risposta di circa 42 ore. Le risposte di difesa sono associate ai geni TIR-NBS, CC-NBS-LRR e NBS-LRR, 10 proteine ​​coinvolte nella patogenesi, proteine ​​di trasferimento lipidico, endoglucano-1,3-β-glucosidasi, proteine ​​della parete cellulare ricche di glicina e geni del percorso reattivo dell'ossigeno. Le risposte precoci a 83A:476, inclusa un'attenta soppressione dei geni associati alla fotosintesi, hanno coinciso con una protezione efficace durante la fase di crescita vegetativa della biologia fungina, suggerendo che un effettore innesca l'immunità. La reazione di Mandeloop è rallentata, così come la resistenza orizzontale complessiva.
Il lupino a foglie strette (NLL, Lupinus angustifolius L.) è un cereale ad alto contenuto proteico originario della regione del Mediterraneo occidentale1,2. Attualmente viene coltivato come coltura alimentare per animali e esseri umani. È anche considerato un sovescio nei sistemi di rotazione delle colture grazie alla fissazione dell'azoto da parte di batteri simbionti azotofissatori e al miglioramento generale della struttura del suolo. Il lupino a foglie strette ha subito un rapido processo di domesticazione nell'ultimo secolo ed è tuttora sottoposto a un'elevata pressione di miglioramento genetico3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Con la coltivazione diffusa del lupino a foglie strette, la successione di funghi patogeni ha sviluppato nuove nicchie agricole e causato nuove malattie distruttive per le colture. L'evento più rilevante per i coltivatori e i selezionatori di lupini è stata la comparsa dell'antracnosi, causata dal fungo patogeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. L'evento più rilevante per i coltivatori e i selezionatori di lupini è stata la comparsa dell'antracnosi, causata dal fungo patogeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. L'ottima indicazione per i frigoriferi e i selezionatori di lucidatura è stata un'ottima anomalia, ottimizzazione патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. L'aspetto più rilevante per gli agricoltori e gli allevatori di lupini è stata la comparsa dell'antracnosi causata dal fungo patogeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的。Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Capelli。1 I migliori strumenti per i frigoriferi e i selezionatori di labbra hanno un'antagonista disordinata, avvincente патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler e Hagedorn13. L'aspetto più rilevante per gli agricoltori e gli allevatori di lupini è la comparsa dell'antracnosi causata dal fungo patogeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Le prime segnalazioni della malattia provenivano dal Brasile e dagli Stati Uniti, con sintomi tipici comparsi rispettivamente nel 1912 e nel 1929. Tuttavia, dopo circa 30 anni, l'agente patogeno è stato designato come Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorfo Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfo Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfo di Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., 有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., 有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in Targeted Morphology. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .e H. Schrenk. & H.施伦克,。 & H.施伦克,。e H. Schlenk, .La fenotipizzazione preliminare della malattia, effettuata a metà del XX secolo, ha mostrato una certa resistenza negli accessi di lupino bianco (L. luteus L.) e lupino giallo (L. albus L.), ma tutti gli accessi di lupino bianco (L. albus L.) testati si sono rivelati altamente suscettibili15,16. Studi hanno dimostrato che lo sviluppo dell'antracnosi è associato all'aumento delle precipitazioni (umidità dell'aria) e della temperatura (nell'intervallo 12-28°C), portando a una violazione della resistenza a temperature più elevate17, 18. Infatti, il tempo necessario alla germinazione delle spore e all'inizio della malattia è risultato quattro volte più breve a 24°C (4 ore) rispetto a 12°C (16 ore) in condizioni di elevata umidità19. Pertanto, il riscaldamento globale in corso ha portato alla diffusione dell'antracnosi. Tuttavia, la malattia fu osservata in Francia (1982) e in Ucraina (1983) come presagio di una minaccia imminente, ma fu apparentemente ignorata dall'industria del lupino all'epoca20,21. Pochi anni dopo, questa devastante malattia si diffuse in tutto il mondo e colpì anche i principali paesi produttori di lupino come Australia, Polonia e Germania22,23,24. A seguito di un'epidemia di antracnosi a metà degli anni '90, un ampio screening portò all'identificazione di diversi donatori resistenti nei campioni NLL19. La resistenza all'antracnosi della varietà NLL è controllata da due alleli dominanti distinti trovati in diverse fonti di germoplasma: Lanr1 nelle cultivar Tanjil e Wonga e AnMan nella cultivar Mandalay 25, 26. Questi alleli completano i marcatori molecolari che supportano la selezione di germoplasma resistente nei programmi di miglioramento genetico25,26,27,28,29,30. La linea di selezione resistente 83A:476, portatrice dell'allele Lanr1, è stata incrociata con la linea selvatica suscettibile P27255 per ottenere una popolazione RIL segregante per la resistenza all'antracnosi, il che ha permesso di assegnare il locus Lanr1 al cromosoma NLL-1131, 32, 33. L'allineamento dei marcatori della mappa di linkage dai loci di resistenza fiancheggianti all'antracnosi con un quadro genomico, NLL ha rivelato la posizione di tutti e tre gli alleli sullo stesso cromosoma (NLL-11), ma in posizioni diverse29,34,35. Tuttavia, a causa del piccolo numero di RIL e della grande distanza genetica tra i marcatori e gli alleli corrispondenti, non è possibile trarre conclusioni affidabili sui loro geni sottostanti. D'altra parte, l'uso della genetica inversa nei lupini è difficile a causa del loro bassissimo potenziale di rigenerazione, che rende la manipolazione genetica complessa37.
Lo sviluppo di germoplasma domestico portatore dell'allele desiderato allo stato omozigote, come 83A:476 (Lanr1) e Mandelup (AnMan), ha aperto la strada allo studio della resistenza all'antracnosi a fronte della presenza di combinazioni alleliche opposte nelle popolazioni selvatiche. Possibilità di meccanismi molecolari. Confronto delle risposte di difesa generate da genotipi specifici. Questo studio ha valutato la risposta trascrittomica precoce di NLL alla vaccinazione con C. lupini. In primo luogo, un pannello di germoplasma NLL europeo contenente 215 linee è stato analizzato utilizzando marcatori molecolari che identificano gli alleli Lanr1 e AnMan. La fenotipizzazione dell'antracnosi è stata quindi eseguita su 50 linee NLL, precedentemente selezionate per i marcatori molecolari, in condizioni controllate. Sulla base di questi esperimenti, sono state selezionate quattro linee che differivano per resistenza all'antracnosi e composizione allelica Lanr1/AnMan per la profilazione differenziale dell'espressione genica di difesa utilizzando due approcci complementari: sequenziamento dell'RNA ad alto rendimento e quantificazione mediante PCR in tempo reale.
Lo screening di un set di germoplasma NLL (N = 215) con i marcatori Lanr1 (Anseq3 e Anseq4) e AnMan (Anseq4) e AnMan (AnManM1) ha mostrato che solo una linea (95726, vicino a Salamanca-b) amplifica l'allele di "resistenza" per tutti i marcatori, mentre la "Presenza di alleli 'suscettibili'" ha trovato la proporzione di tutti i marcatori in 158 linee (~73,5%). Tredici linee hanno prodotto due alleli "resistenti" del marcatore Lanr1 e 8 linee hanno prodotto alleli "resistenti" del marcatore Lanr1. L'allele di "resistenza" del marcatore AnMan (Tabella supplementare S1). Due linee erano eterozigoti per il marcatore Anseq3 e una eterozigote per il marcatore AnManM1. 42 linee (19,5%) presentavano fasi opposte degli alleli Anseq3 e Anseq4, indicando un'elevata frequenza di ricombinazione tra questi due loci. I fenotipi dell'antracnosi in condizioni controllate (Tabella supplementare S2) hanno rivelato una variabilità nella resistenza dei genotipi testati, che si è riflessa nella gravità dell'antracnosi. Le differenze nei punteggi medi variavano da 1,8 (moderatamente resistente) a 6,9 (suscettibile) e le differenze nel peso delle piante variavano da 0,62 (suscettibile) a 4,45 g (resistente). È stata riscontrata una correlazione significativa tra i valori osservati nelle due repliche dell'esperimento (0,51 per i punteggi di gravità della malattia, P = 0,00017 e 0,61 per il peso della pianta, P < 0,0001) così come tra questi due parametri (− 0,59 e − 0,77, P < 0,0001). Si è osservata una correlazione significativa tra i valori rilevati nelle due repliche dell'esperimento (0,51 per i punteggi di gravità della malattia, P = 0,00017 e 0,61 per il peso della pianta, P < 0,0001) così come tra questi due parametri (− 0,59 e − 0,77, P < 0,0001). La correlazione tra le statistiche è stata valutata in due esperimenti sperimentali (0,51 per balloni) тяжести болезни, P = 0,00017 e 0,61 per la massa di dosaggio, P < 0,0001), e anche tra due parametri (-0,59 e -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). È stata riscontrata una correlazione significativa tra i valori osservati in due ripetizioni dell'esperimento (0,51 per i punteggi di gravità della malattia, P = 0,00017 e 0,61 per il peso della pianta, P < 0,0001), così come tra questi due parametri (-0,59 e -0,77, P < 0,0001).0,51 P = 0,51 0,00017, 0,61, P < 0,0001, P < 0,0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为分为 0,51, p = 0,00017, 植物 为 为 0,61, p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0,59 和– 0,59和– 0,59 和– 0,59 和- 0,77, P < 0,0001)。 La correlazione tra le tue preferenze è stata stabilita in base alle tue conoscenze e alle tue esigenze deformazione 0,51, P = 0,00017 e massa intervallo 0,61, P <0,0001), e mezzo di due parametri (-0,59 e -0,0001) 0,77, P <0,0001. C'era una correlazione significativa tra i valori osservati in duplicato (punteggio di gravità della malattia 0,51, P = 0,00017 e peso della pianta 0,61, P < 0,0001) e tra questi due parametri (-0,59 e -0,0001) 0,77, P<0,0001. ).I sintomi tipici osservati nelle piante suscettibili includono piegamenti e torsioni del fusto che ricordano una struttura ad "arco da pastore", seguiti da lesioni ovali con sporozoiti arancioni/rosa (Figura supplementare 1). Gli accessioni australiani che portano i geni Lanr1 (83A:476 e Tanjil) e AnMan (Mandelup) sono moderatamente resistenti, 0,0331 e 0,0036). Alcune linee che portano anche alleli "resistenti" Lanr1 e/o AnMan mostrano i sintomi della malattia.
È interessante notare che alcune linee NLL prive di alleli marcatori "resistenti" hanno rivelato un alto livello di resistenza all'antracnosi (comparabile o superiore a quello dei genotipi Lanr1 o AnMan), come Boregine (valore P < 0,0001 per entrambi i parametri), Bojar (valore P < 0,0001 per il punteggio e 0,001 per il peso della pianta) e Population B-549/79b (valore P < 0,0001 per il punteggio e non significativo per il peso). È interessante notare che alcune linee NLL prive di alleli marcatori "resistenti" hanno rivelato un alto livello di resistenza all'antracnosi (comparabile o superiore a quello dei genotipi Lanr1 o AnMan), come Boregine (valore P < 0,0001 per entrambi i parametri), Bojar (valore P < 0,0001 per il punteggio e 0,001 per il peso della pianta) e Population B-549/79b (valore P < 0,0001 per il punteggio e non significativo per il peso). Interessante che la nuova linea NLL, un semplice libro di testo «resistenziale» alleato di marca, sia stata molto utile уровень устойчивости к l'antagonista (sistema o una grande quantità di dati per la generazione Lanr1 o AnMan), così come Boregine (valore P <0,0001 per gli oggetti) parametri), Bojar (значение P < 0,0001 per le bevande e 0,001 per le masse) e la popolazione B-549/79b (valore P <0,0001 per le bevande e le insufficienze per le masse). È interessante notare che diverse linee NLL prive di alleli marcatori di "resistenza" hanno mostrato un alto livello di resistenza all'antracnosi (paragonabile o superiore a quello dei genotipi Lanr1 o AnMan), come Boregine (valore P < 0,0001 per entrambi i parametri), Bojar (valore P < 0,0001 per la valutazione e 0,001 per il peso della pianta) e la popolazione B-549/79b (valore P < 0,0001 per la valutazione e non significativo per il peso).Per ulteriori informazioni, non esitate a contattarci.或AnMan 基因型相当或更高）,例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）e种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）. È interessante notare che alcuni sistemi NLL che non presentano marcatori "antigenici" mostrano un'elevata resistenza orizzontale (equivalente ai geni Lanr1 o AnMan o superiore), come Boregine (entrambi i parametri P < 0,0001), Bojar (valore P < 0,0001, peso della pianta 0,001) e il ceppo B-549/79b (valore P < 0,0001, peso non significativo). Interessante che le nuove linee NLL, simili ai simboli allegati alla "resistenza", abbiano fornito informazioni уровни устойчивости к anomalia (schermata o tua, che è stata generata da Lanr1 o AnMan), così come Boregine (schermata P per i parametri presenti <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, massa растения 0,001) e la popolazione B-549/79b (indice P <0,0001, massa ridotta). È interessante notare che alcune linee NLL prive di alleli marcatori di "resistenza" hanno mostrato alti livelli di resistenza all'antracnosi (paragonabili o superiori a quelli dei genotipi Lanr1 o AnMan), come Boregine (valore P per entrambi i parametri <0,0001), Bojar (valore P < 0,0001, peso della pianta 0,001) e la popolazione B-549/79b (valore P < 0,0001, peso non significativo).Questo fenomeno suggerisce la possibilità di una nuova fonte genetica di resistenza, spiegando la mancanza di correlazione osservata tra i genotipi dei marcatori e i fenotipi della malattia (valori P da ~0,42 a ~0,98). Pertanto, il test di Kolmogorov-Smirnov ha mostrato che i dati sulla resistenza all'antracnosi erano approssimativamente distribuiti normalmente per i punteggi (valori P 0,25 e 0,11) e la massa della pianta (valori P 0,47 e 0,55), suggerendo che ipotizzo che siano coinvolti più alleli oltre a Lanr1 e AnMan.
In base ai risultati dello screening di resistenza all'antracnosi, sono state selezionate 4 linee per l'analisi del trascrittoma: 83A:476, Boregine, Mandelup e Popolazione 22660. Queste linee sono state nuovamente testate per la resistenza all'antrace in esperimenti di inoculazione mediante sequenziamento dell'RNA, a condizione che fossero le stesse del test precedente. I valori del punteggio sono stati i seguenti: Boregine (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) e popolazione 22660 (6,11 ± 1,29).
Il protocollo Illumina NovaSeq 6000 ha raggiunto una media di 40,5 coppie Mread per campione (da 29,7 a 54,4 Mread) (Tabella supplementare S3). I punteggi di allineamento nella sequenza di riferimento variavano dal 75,5% all'88,6%. La correlazione media dei dati di conteggio delle letture tra le varianti sperimentali tra le repliche biologiche variava da 0,812 a 0,997 (media 0,959). Dei 35.170 geni analizzati, 2917 non hanno mostrato alcuna espressione, mentre i restanti 4785 geni sono stati espressi a livelli trascurabili (media di base < 5). Dei 35.170 geni analizzati, 2917 non hanno mostrato alcuna espressione, mentre i restanti 4785 geni sono stati espressi a livelli trascurabili (media di base < 5). A partire da 35 170 gennaio 2917 l'espressione professionale non è stata eseguita, mentre l'espressione 4785 gennaio è stata eseguita su незначительном уровне (bazovoe più di 5). Dei 35.170 geni analizzati, 2917 non hanno mostrato alcuna espressione e i restanti 4785 geni sono stati espressi a un livello trascurabile (media di base <5).35.170 anni di attività, 2917 个没有表达, 4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值<5）.35.170 Da 35 170 gennaio 2917 non è stato espresso, a partire da 4785 giorni non è stato espresso экспрессию (bazoвое среднее значение <5). Dei 35.170 geni analizzati, 2917 non erano espressi e i restanti 4785 geni presentavano un'espressione trascurabile (media di base <5).Pertanto, il numero di geni considerati espressi (media di base ≥ 5) durante l'esperimento è stato di 27.468 (78,1%) (Tabella supplementare S4).
Fin dal primo punto temporale, tutte le linee NLL hanno risposto all'inoculazione di C. lupini (ceppo Col-08) riprogrammando il trascrittoma (Tabella 1), tuttavia, sono state osservate differenze significative tra le linee. In particolare, la linea resistente 83A:476 (portatrice del gene Lanr1) ha mostrato una significativa riprogrammazione del trascrittoma al primo punto temporale (6 ore post-inoculazione) con un aumento di 31-69 volte del numero di geni sovra- e sotto-espressi isolati rispetto agli altri punti temporali. Inoltre, questo picco è stato di breve durata, poiché l'espressione di solo pochi geni è rimasta significativamente alterata al secondo punto temporale (12 ore post-inoculazione). È interessante notare che Boregine, che ha mostrato anche un alto livello di resistenza nel test di innesto, non ha subito una riprogrammazione trascrizionale così massiccia durante l'esperimento. Tuttavia, il numero di geni differenzialmente espressi (DEG) era lo stesso per Boregine e 83A:476 a 12 ore post-inoculazione. Sia Mandelup che la popolazione 22660 hanno mostrato picchi DEG all'ultimo punto temporale (48 l/s), indicando un ritardo relativo nelle risposte difensive.
Poiché la linea 83A:476 ha subito un massiccio riprogrammazione del trascrittoma in risposta a C. lupini a 6 ore dall'infezione rispetto a tutte le altre linee, circa il 91% dei geni differenzialmente espressi (DEG) osservati in questo momento erano specifici del lignaggio (Fig. 1). Tuttavia, si è osservata una certa sovrapposizione nelle risposte precoci tra le linee studiate, in quanto il 68,5%, il 50,9% e il 52,6% dei DEG nelle linee Boregine, Mandelup e nella popolazione 22660, rispettivamente, si sovrapponevano a quelli riscontrati nella linea 83A:476 in determinati momenti. Tuttavia, questi DEG rappresentavano solo una piccola frazione (0,97-1,70%) di tutti i DEG attualmente rilevati utilizzando la linea 83A:476. Inoltre, 11 geni differenzialmente espressi (DEG) di tutte le linee erano coerenti in questo momento (Tabelle supplementari S4-S6), inclusi componenti comuni delle risposte di difesa delle piante: proteina di trasferimento lipidico (TanjilG_32225), enzima endoglucano-1,3-β-glucoside (TanjilG_23384), due proteine ​​inducibili dallo stress come SAM22 (TanjilG_31528 e TanjilG_31531), proteina basica del lattice (TanjilG_32352) e due proteine ​​strutturali della parete cellulare ricche di glicina (TanjilG_19701 e TanjilG_19702). Si è inoltre riscontrata una sovrapposizione relativamente elevata nelle risposte del trascrittoma tra 83A:476 e Boregine a 24 ore dall'infezione (DEG totale 16-38%) e tra Mandelup e la popolazione 22660 a 48 ore dall'infezione (DEG totale 14-20%).
Diagramma di Venn che mostra il numero di geni differenzialmente espressi (DEG) in linee di lupino a foglia stretta (NLL) inoculate con Colletotrichum lupini (ceppo Col-08 ottenuto da campi di lupino a Wierzhenice, Polonia, 1999). Le linee NLL analizzate erano: 83A:476 (resistente, portatrice dell'allele Lanr1), Boregine (resistente, background genetico sconosciuto), Mandelup (moderatamente resistente, portatrice dell'allele AnMan) e popolazione 22660 (molto suscettibile). L'abbreviazione hpi sta per ore dopo la vaccinazione. I valori zero sono stati rimossi per semplificare il grafico.
L'insieme dei geni sovraespressi a 6 ore dall'infezione è stato analizzato per la presenza di domini genici R canonici (Tabella supplementare S7). Questo studio ha rivelato l'induzione del trascrittoma di geni classici di resistenza alle malattie con domini NBS-LRR solo a 83A:476. Questo insieme era costituito da un gene TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), cinque geni CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 e tanjilg_16162), e quattro NBS-LR (tanjilg_16162), e quattro NBS-LRRE (tanjilg_16162) così come quattro NBS-Lrr (tanjilg_16162) e quattro NBS-LRR (TANJILG_16162). Tutti questi geni presentano domini canonici disposti in sequenze conservate. Oltre ai geni del dominio NBS-LRR, diverse chinasi RLL sono state attivate a 6 ore dall'infezione, in particolare una in Boregine (TanjilG_19877), due in Mandelup (TanjilG_07141 e TanjilG_19877) e nella popolazione 22660 (TanjilG_09014 e TanjilG_10361) e due in 83A 27:476.
I geni con espressione significativamente alterata in risposta all'inoculazione con C. lupini (ceppo Col-08) sono stati sottoposti ad analisi di arricchimento Gene Ontology (GO) (Tabella supplementare S8). Il termine del processo biologico più frequentemente sovrarappresentato è stato "GO:0006952 risposta di difesa", che è apparso in 6 combinazioni su 16 (tempo × linea) con elevata significatività (valore P < 0,001) (Fig. 2). Il termine del processo biologico più frequentemente sovrarappresentato è stato "GO:0006952 risposta di difesa", che è apparso in 6 combinazioni su 16 (tempo × linea) con elevata significatività (valore P < 0,001) (Fig. 2). Il termine più semplice del processo biologico è «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся в 6 из 16 (время × linea) combinato con un'elevata concentrazione (rischio P <0,001) (rischio 2). Il termine del processo biologico più frequentemente sovrarappresentato è stato "GO:0006952 risposta di difesa", che è apparso in 6 delle 16 combinazioni (tempo × lignaggio) con elevata significatività (valore P < 0,001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”,它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中,具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）. Il termine più rappresentativo del processo biologico è "GO:0006952 risposta di difesa", che appare in 6 delle 16 combinazioni (tempo×intervallo), con elevata significatività (valore P < 0,001) (Figura 2). Il termine più semplice del processo biologico è stato «GO: 0006952 Defense Response», da cui появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × linea) con una grande importanza (значение P <0,001) (ris. 2). Il termine del processo biologico più frequentemente sovrarappresentato è stato 'GO:0006952 Risposta di difesa', che è apparso in 6 combinazioni su 16 (tempo × linea) con elevata significatività (valore P < 0,001) (Fig. 2).Questo termine è risultato sovrarappresentato in due punti temporali in 83A:476 e Boregine (6 e 24 ore post-infezione) e in un punto temporale in Mandelup e Popolazione 22660 (rispettivamente 12 e 6 ore post-infezione). Questo è un risultato atteso, che evidenzia la risposta antifungina delle linee resistenti. Inoltre, 83A:476 ha risposto a C. lupini inducendo rapidamente geni correlati allo scoppio ossidativo rappresentato dal termine "processo redox GO:0055114", indicando una risposta di difesa specifica, mentre Boregine ha rivelato risposte di difesa specifiche, correlate al termine 'GO'. :0006950 Risposta allo stress”. La popolazione 22660 ha attivato la risposta di resistenza orizzontale che coinvolge i metaboliti secondari, evidenziando l'eccessivo numero di termini “GO:0016104 Processo di biosintesi dei triterpeni” e “GO:0006722 Processo di metabolismo dei triterpeni” (entrambi i termini appartengono allo stesso set di geni), tenendo conto dei risultati dell'analisi di arricchimento dei termini GO, la stabilità della reazione di Mandelup era tra Boregine e la popolazione 22660. Inoltre, la reazione precoce 83A:476 (6 hpi) e la reazione ritardata Mandelup e la popolazione 22660 includono il termine GO:0015979 'fotosintesi' e altri processi biologici correlati.
I termini di ontologia genica del bioprocesso selezionati nell'annotazione dei geni differenzialmente espressi durante le risposte del trascrittoma del lupino a foglia stretta (NLL) inoculato con lupino dell'antrace (ceppo Col-08 ottenuto da campi di lupino a Wierzhenice, Polonia, nel 1999) sono notevolmente esagerati. Le linee NLL analizzate erano: 83A:476 (resistente, portatrice dell'allele omozigote Lanr1), Boregine (resistente, background genetico sconosciuto), Mandelup (moderatamente resistente, portatrice dell'allele omozigote AnMan) e popolazione 22660 (suscettibile).
Poiché questo studio mirava a identificare i geni che contribuiscono alla resistenza all'antracnosi, i geni assegnati ai termini GO "GO: 0006952 Risposte difensive" e "GO: 0055114 Processi redox" sono stati analizzati con cut-off poiché le medie di base ≥ 30 con almeno una riga × punto nel tempo combinando valori statisticamente significativi ​​di log2 (fold change). Il numero di geni che soddisfacevano questi criteri era 65 per GO:0006952 e 524 per GO:0055114.
83A:476 ha rivelato due picchi DEG annotati con il termine GO:0006952, il primo a 6 geni per pollice (64 geni, regolazione positiva e negativa) e il secondo a 24 geni per pollice (15 geni, solo regolazione positiva). Boregine ha anche mostrato che GO:0006952 ha raggiunto il picco nello stesso punto temporale, ma con meno DEG (11 e 8) e attivazione preferenziale. Mandeloop ha mostrato due picchi di GO:0006952 a 12 e 48 HPI, entrambi con 12 geni (il primo con geni attivanti e il secondo con solo geni soppressivi), mentre la popolazione 22660 a 6 HPI (13 geni) aveva una maggiore predominanza del picco di aumento. regolazione. Va notato che il 96,4% dei DEG GO:0006952 in questi picchi aveva lo stesso tipo di risposta (su o giù), indicando una significativa sovrapposizione nelle risposte di difesa nonostante le differenze nel numero di geni coinvolti. Il gruppo più grande di sequenze correlate al termine GO:0006952 codifica la proteina SAM22-like (Starvation Stress-Associated Message Protein 22), che appartiene al clade proteico PR-10 (pathogenesis-associated protein) di classe 10 e alla proteina core latex. proteina simile (MLP-like) (Fig. 3). I due gruppi differivano nella natura dell'espressione e nella direzione della risposta. I geni che codificano le proteine ​​SAM22-like hanno mostrato un'induzione consistente e significativa nei primi punti temporali (6 o 12 hpi) e sono stati generalmente non responsivi alla fine dell'esperimento (48 hpi), mentre le proteine ​​MLP-like hanno mostrato coordinazione a 6 hpi. 83A:476 e Mandelup a 48 hp/in, quasi tutti gli altri punti dati non hanno risposto. Inoltre, le differenze nei profili di espressione dei geni della proteina simile a SAM22 hanno seguito la variabilità osservata nella resistenza all'antracnosi, poiché le linee più resistenti avevano più punti temporali che inducevano significativamente questi geni rispetto ai geni più suscettibili. Un altro gene PR-10 simile a LlR18A/B ha mostrato un modello di espressione molto simile al gene della proteina simile a SAM22.
Sono stati identificati i componenti principali del processo biologico denominato "GO:0006952 Risposta di Difesa" e i modelli di espressione dei geni candidati degli alleli Lanr1 e AnMan. La scala Log2 rappresenta i valori log2 (fold change) tra le piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenuto da campi di lupini, Wizhenica, Polonia, 1999) e le piante di controllo (inoculate fittizie) allo stesso punto temporale. Sono state analizzate le seguenti linee di lupino a foglia stretta: 83A:476 (resistente, portatrice dell'allele omozigote Lanr1), Boregine (resistente, background genetico sconosciuto), Mandelup (moderatamente resistente, portatrice dell'allele omozigote AnMan) e Population 22660 (suscettibile).
Inoltre, sono stati valutati i profili di espressione dei geni candidati RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) e AnMan (TanjilG_12861) (Fig. 3). Il gene TanjilG_05042 ha mostrato una risposta significativa (attivazione) a 83A:476 solo al primo punto temporale (6 hpi), mentre TanjilG_12861 è risultato significativo in Mandeloop solo in due punti temporali: 6 hpi (down-regulation) e 24 hpi (6 hpi). Con.). regolabile) ).
I geni più sovraespressi nel termine GO:0055114 “processo redox” erano geni che codificano proteine ​​del citocromo P450 e perossidasi (Fig. 4). Per i campioni isolati da 83A:476 a 6 HPI, i valori log2 (fold change) massimi o minimi (per l'86,6% dei geni) sono stati generalmente osservati tra piante inoculate e di controllo, evidenziando l'elevata risposta di questo genotipo al sesso di inoculazione. 83A:476 ha mostrato il più significativo GO: 0055114 DEG a 6 hpi (503 geni), mentre il resto delle linee a 48 hpi (Boregine, 31 geni; Mandelup, 85 geni; e Popolazione 22660, 78 geni)). Nella maggior parte dei geni della famiglia GO:0055114, sono stati osservati due tipi di risposte alla vaccinazione (attivazione e inibizione). È interessante notare che fino al 97,6% dei DEG identificati per il termine GO: 0055114 in Mandelupe a 48 hp Queste osservazioni suggeriscono che, nonostante la scala significativamente più piccola (ovvero, il numero di geni redox mutati, 85 contro 503), il modello di risposte trascrittomiche ritardate di mandelupe all'antracnosi è simile alla risposta precoce di 83A:476. In Boregine e nella popolazione 22660, questa convergenza è inferiore, rispettivamente al 51,6% e al 75,6%.
Sono stati rivelati i modelli di espressione dei componenti principali del termine del processo biologico "GO:0055114 Processo Redox". La scala Log2 rappresenta i valori log2 ​​(fold change) tra piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenuto da campi di lupini, Wizhenica, Polonia, 1999) e piante di controllo (insopportabilmente inoculate) allo stesso punto temporale. Sono state analizzate le seguenti linee di lupino a foglia stretta: 83A:476 (resistente, portatrice dell'allele omozigote Lanr1), Boregine (resistente, background genetico sconosciuto), Mandelup (moderatamente resistente, portatrice dell'allele omozigote AnMan) e Population 22660 (suscettibile).
83A:476 Le risposte trascrittomiche all'inoculazione con C. lupini (ceppo Col-08) includevano anche il silenziamento coordinato dei geni attribuiti al termine GO:0015979 "fotosintesi" e altri processi biologici correlati (FIG. 5). Questo set di geni differenzialmente espressi (DEG) GO:0015979 conteneva 105 geni che erano significativamente repressi a 6 ore dall'inoculazione (hpi) in 83A:476. In questo sottoinsieme, 37 geni erano anche sottoregolati in Mandelup a 48 ore dall'inoculazione (hpi) e 35 nello stesso punto temporale nella popolazione 22660, inclusi 19 DEG comuni a entrambi i genotipi. Nessun DEG correlato al termine GO: 0015979 era significativamente attivato in alcuna combinazione (linea x tempo).
Sono stati rivelati i modelli di espressione dei componenti principali del termine del processo biologico “GO:0015979 Fotosintesi”. La scala Log2 rappresenta i valori log2 ​​(fold change) tra piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenuto da campi di lupini, Wizhenica, Polonia, 1999) e piante di controllo (insopportabilmente inoculate) allo stesso punto temporale. Sono state analizzate le seguenti linee di lupino a foglia stretta: 83A:476 (resistente, portatrice dell'allele omozigote Lanr1), Boregine (resistente, background genetico sconosciuto), Mandelup (moderatamente resistente, portatrice dell'allele omozigote AnMan) e Population 22660 (suscettibile).
Sulla base dei risultati dell'analisi dell'espressione differenziale e presumibilmente coinvolti nelle risposte di difesa contro i funghi patogeni, questo set di sette geni è stato selezionato per la quantificazione dei profili di espressione mediante PCR in tempo reale (Tabella supplementare S9).
Il presunto gene proteico TanjilG_10657 è stato indotto in modo significativo in tutte le linee e i punti temporali studiati rispetto alle piante di controllo (mimiche) (Tabelle supplementari S10, S11). Inoltre, il profilo di espressione di TanjilG_10657 ha mostrato un trend crescente nel corso dell'esperimento per tutte le linee. La popolazione 22660 ha mostrato la più alta sensibilità di TanjilG_10657 all'inoculazione con un'attivazione 114 volte superiore e il più alto livello di espressione relativa (4,4 ± 0,4) a 24 ore dall'inoculazione (Fig. 6a). Anche il gene proteico PR10 LlR18A TanjilG_27015 ha mostrato attivazione in tutte le linee e i punti temporali, con significatività statistica nella maggior parte dei punti dati (Fig. 6b). Analogamente a TanjilG_10657, il livello di espressione relativa più elevato di TanjilG_27015 è stato osservato nella popolazione inoculata 22660 a 24 HPI (19,5 ± 2,4). Il gene dell'endochitinasi acida TanjilG_04706 è stato significativamente sovraregolato in tutte le linee e in tutti i punti temporali, ad eccezione di Boregine 6 hpi (Fig. 6c). È stato fortemente indotto al primo punto temporale (6 HPI) in 83A:476 (di 10,5 volte) e moderatamente aumentato nelle altre linee (di 6,6-7,5 volte). Durante l'esperimento, l'espressione di TanjilG_04706 è rimasta a livelli simili in 83A:476 e Boregine, mentre in Mandelup e nella popolazione 22660 è aumentata significativamente, raggiungendo valori relativamente elevati (5,9 ± 1,5 e 6,2 ± 1,5, rispettivamente). Il gene TanjilG_23384, simile all'endoglucano-1,3-β-glucosidasi, ha mostrato un'elevata attivazione nei primi due punti temporali (6 e 12 hpi) in tutte le linee tranne la popolazione 22660 (Fig. 6d). I livelli di espressione relativa più elevati di TanjilG_23384 sono stati osservati nel secondo punto temporale (12 hpi) in Mandelup (2,7 ± 0,3) e 83A:476 (1,5 ± 0,1). A 24 HPI, l'espressione di TanjilG_23384 era relativamente bassa in tutte le linee studiate (da 0,04 ± 0,009 a 0,44 ± 0,12).
Profili di espressione di geni selezionati (ag) rilevati mediante PCR quantitativa. I numeri 6, 12 e 24 rappresentano le ore successive alla vaccinazione. I geni LanDExH7 e LanTUB6 sono stati utilizzati per la normalizzazione e LanTUB6 è stato utilizzato per la calibrazione inter-serie. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard basata su tre repliche biologiche, ciascuna delle quali è la media di tre repliche tecniche. La significatività statistica delle differenze nei livelli di espressione tra le piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenuto nel 1999 dal campo di lupini di Wierzenica, Polonia) e le piante di controllo (inoculate con soluzione placebo) è indicata sopra i punti dati (*valore P < 0,05, **valore P ≤ 0,01, ***valore P ≤ 0,001). La significatività statistica delle differenze nei livelli di espressione tra le piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenuto nel 1999 dal campo di lupini di Wierzenica, Polonia) e le piante di controllo (inoculate con soluzione placebo) è indicata sopra i punti dati (*valore P < 0,05, **valore P ≤ 0,01, ***valore P ≤ 0,001). Statistica statisticamente efficace nell'espressione dell'ossigeno (Colletotrichum lupini, campione Col-08, polучен в 1999 con la poesia di Lipsia в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Le differenze statisticamente significative nei livelli di espressione tra le piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenuto nel 1999 da un campo di lupini a Wierzhenice, Polonia) e le piante di controllo (non inoculate) sono indicate sopra i punti dati (*valore P < 0,05, **valore P ≤ 0,01, ***valore P ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini, Col-08株, 1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001)。接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物 之间水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Analisi statistiche sull'espressione orale del mezzo inoculomico (Colletotrichum lupini, colonna Col-08, polученный с полей люпина в Верженице, Polьша, в 1999 г.) e controlli (loжно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Le differenze statisticamente significative nei livelli di espressione tra le piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenuto da campi di lupini a Verzhenice, Polonia, nel 1999) e le piante di controllo (non inoculate) sono indicate sopra i punti dati (*valore P < 0,05, **valore P ≤ 0,01, ***valore P ≤ 0,001).Le linee NLL analizzate sono state: 83A:476 (resistente, portatrice dell'allele omozigote Lanr1), Mandelup (moderatamente resistente, portatrice dell'allele omozigote AnMan), Boregine (resistente, background genetico sconosciuto) e popolazione 22660 (suscettibile).
Il gene candidato TanjilG_05042 nel locus Lanr1 ha mostrato un modello di espressione marcatamente diverso dai profili ottenuti dagli studi RNA-seq (Fig. 6e). Una significativa attivazione di questo gene è stata osservata in Mandelup e nella popolazione 22660 (fino a 39,7 e 11,7 volte, rispettivamente), con conseguenti livelli di espressione relativamente elevati (fino a 1,4 ± 0,14 e 7,2 ± 1,3, rispettivamente). Anche 83A:476 ha rivelato una certa sovraregolazione del gene TanjilG_05042 (fino a 3,8 volte), tuttavia, i livelli di espressione relativi raggiunti (0,044 ± 0,002) erano più di 30 volte inferiori a quelli osservati in Mandelup e nella popolazione 22660. L'analisi mediante qPCR ha mostrato differenze significative nei livelli di espressione tra i genotipi nelle varianti non vaccinate (controllo), raggiungendo una differenza di 58 volte tra le popolazioni 22660 e 83A:476, così come tra le popolazioni 22660 e 22660. Una differenza di due volte è stata raggiunta tra Boregine e Mandalup.
Il gene candidato nel locus AnMan, TanjilG_12861, è stato attivato in risposta alla vaccinazione in 83A:476 e Mandelup, è risultato neutro nella popolazione 22660 ed è stato downregolato in Boregine (Fig. 6f). L'espressione relativa del gene TanjilG_12861 è stata massima nel ceppo inoculato 83A:476 (0,14±0,01). Il gene della proteina da shock termico di classe I da 17,4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 ha mostrato livelli di espressione relativa inferiori in tutti i ceppi e punti temporali studiati (Fig. 6g). Il valore più alto è stato osservato a 24 HPI nella popolazione 22660 (0,14 ± 0,02, un aumento di otto volte in risposta alla vaccinazione).
Il confronto dei profili di espressione genica (Fig. 7) ha rivelato un'elevata correlazione tra TanjilG_10657 e altri quattro geni: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) e TanjilG_04706 (r = 0,79). Tali risultati potrebbero indicare una co-regolazione di questi geni durante le risposte di difesa. I geni TanjilG_12861 e TanjilG_23384 hanno mostrato profili di espressione differenti con valori del coefficiente di correlazione di Pearson inferiori (rispettivamente da 0,08 a 0,43 e da -0,19 a 0,28) rispetto agli altri geni.
Le correlazioni tra i profili di espressione genica sono state rilevate mediante PCR quantitativa. Sono state analizzate le seguenti linee di lupino a foglia stretta: 83A:476 (resistente, portatrice dell'allele omozigote Lanr1), Mandelup (moderatamente resistente, portatrice dell'allele omozigote AnMan), Boregine (resistente, background genetico sconosciuto) e Population 22660 (suscettibile). Sono stati calcolati tre punti temporali (6, 12 e 24 ore dopo l'inoculazione), includendo piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenuto da campi di lupino a Wierzhenice, Polonia, nel 1999) e piante di controllo (inoculate fittizie). La scala mostra il valore del coefficiente di correlazione di Pearson.
Sulla base dei dati ottenuti a 6 cavalli per pollice, è stata eseguita un'analisi WGCNA su 9981 geni differenzialmente espressi (DEG) identificati confrontando piante inoculate e di controllo per focalizzarsi sulle risposte di difesa precoci (Tabella supplementare S12). Sono stati trovati ventidue moduli genici (cluster) con profili di espressione correlati (positivi o negativi) tra genotipi e varianti sperimentali. In media, i livelli di espressione genica erano decrescenti nell'ordine 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazione 22660 (in entrambe le varianti, tuttavia, questa tendenza era più forte nelle piante di controllo). In media, i livelli di espressione genica erano decrescenti nell'ordine 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazione 22660 (in entrambe le varianti, tuttavia, questa tendenza era più forte nelle piante di controllo). Nell'espressione dell'espressione espressa da Genovese si trova in 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazione 22660 (nelle varianti standard, ovviamente, questa tendenza è stata uccisa controllo delle impostazioni). In media, i livelli di espressione genica sono diminuiti nell'ordine 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazione 22660 (in entrambe le varianti, tuttavia, questa tendenza è stata più marcata nelle piante di controllo).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazione 22660的顺序下降（然而,在两种变体中,这种趋势在对照植物中更强）.平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> popolazione 22660 的 顺序 下降 （, 在 种 中 ， 这 种 在 在植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 Nell'espressione dell'espressione espressa da Genev è stata menzionata nel 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazione 22660 (o nell'elenco delle varianti qui sotto) la tendenza era silenziosa e di controllo растений). In media, i livelli di espressione genica sono diminuiti nella serie 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazione 22660 (tuttavia, in entrambe le varianti, questa tendenza è stata più marcata nelle piante di controllo).La vaccinazione ha determinato una sovraregolazione dell'espressione genica, in particolare nei moduli 18, 19, 14, 6 e 1 (in ordine decrescente di effetto), una regolazione negativa (ad esempio i moduli 9 e 20) o con effetti neutri (ad esempio i moduli 11, 22, 8 e 13). L'analisi di arricchimento del termine GO (Tabella supplementare S13) ha rivelato "GO: 0006952 Risposte protettive" per il modulo inoculato (18) con massima attivazione, inclusi i geni analizzati tramite qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 e TanjilG_27015), così come molti moduli di fotosintesi più soppressi (9). Il concentratore del modulo 18 (Fig. 8) è stato identificato come il gene TanjilG_26536 che codifica la proteina LlR18B simile a PR-10, e il concentratore del modulo 9 è stato identificato come il gene TanjilG_28955 che codifica la proteina PsbQ del fotosistema II. Un gene candidato per la resistenza all'antracnosi, Lanr1, TanjilG_05042, è stato trovato nel modulo 22 (Fig. 9) ed è associato ai termini "GO:0044260 Processi metabolici macromolecolari cellulari" e "GO:0006355 Regolazione trascrizionale, stampo del DNA" che trasporta l'hub TanjilG_01212. Il gene codifica il fattore di trascrizione dello stress termico A-4a (HSFA4a).
Analisi di rete ponderata della co-espressione genica di moduli con termini di processo biologico sovrarappresentati "GO: 0006952 Risposte di difesa". La legatura è stata semplificata per evidenziare i quattro geni analizzati tramite qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 e TanjilG_27015).
Analisi di rete ponderata della co-espressione genica di un modulo con un termine di processo biologico sovrarappresentato "GO: 0006355: Regolazione trascrizionale, stampaggio del DNA" e contenente un gene candidato per la resistenza all'antracnosi Lanr1 TanjilG_05042. La ligazione è stata semplificata per isolare il gene TanjilG_05042 e il gene centrale TanjilG_01212.
Lo screening della resistenza all'antracnosi effettuato in Australia ha mostrato che la maggior parte delle cultivar rilasciate inizialmente erano suscettibili; Kalya, Coromup e Mandelup sono state descritte come moderatamente resistenti, mentre Wonga, Tanjil e 83A:476 sono state descritte come altamente resistenti26,27,31. avevano lo stesso allele di resistenza, denominato Lanr1, e Coromup e Mandelup avevano un allele diverso, denominato AnMan10, 26, 39, mentre Kalya ha trasmesso un allele diverso. , Lanr2. Lo screening per la resistenza all'antracnosi effettuato in Germania ha portato all'identificazione di una linea resistente Bo7212 con un allele candidato diverso da Lanr1, denominato LanrBo36.
Il nostro studio ha rivelato una frequenza molto bassa (circa il 6%) dell'allele Lanr1 nel germoplasma analizzato. Questa osservazione è coerente con i risultati dello screening del germoplasma dell'Europa orientale utilizzando i marcatori Anseq3 e Anseq4, che hanno mostrato la presenza dell'allele Lanr1 solo in due linee bielorusse. Ciò suggerisce che l'allele Lanr1 non sia ancora ampiamente utilizzato nei programmi di miglioramento genetico locali, a differenza dell'Australia, dove è uno degli alleli chiave per la selezione assistita da marcatori. Questo potrebbe essere dovuto al livello inferiore di resistenza fornito dall'allele Lanr1 nelle condizioni di campo europee rispetto a quanto riportato in Australia. Inoltre, studi sull'antracnosi in aree con elevate precipitazioni in Australia hanno dimostrato che le risposte di resistenza mediate dall'allele Lanr1 potrebbero non essere efficaci in condizioni climatiche che favoriscono la crescita e il rapido sviluppo del patogeno19,42. Infatti, nel presente studio, alcuni sintomi di antracnosi sono stati osservati anche nei genotipi portatori dell'allele Lanr1, suggerendo che la resistenza potrebbe scomparire in condizioni ottimali per lo sviluppo di C. lupini. Inoltre, sono possibili interpretazioni falsamente positive della presenza dei marcatori Anseq3 e Anseq4, che si trovano a circa 1 cM dal locus Lanr1 28,30,43.
Il nostro studio ha dimostrato che il ceppo 83A:476, portatore dell'allele Lanr1, ha risposto all'inoculazione di C. lupini con una riprogrammazione del trascrittoma su larga scala al primo punto temporale analizzato (6 ore post-inoculazione), mentre nel ceppo Mandelup, portatore dell'allele AnMan, le risposte trascrittomiche sono state osservate molto più tardi (da 24 a 48 ore post-inoculazione). Queste variazioni temporali nelle risposte di difesa sono associate a differenze nei sintomi della malattia, evidenziando l'importanza del riconoscimento precoce del patogeno per una risposta efficace alla resistenza. Per infettare i tessuti vegetali, le spore dell'antrace devono attraversare diverse fasi di sviluppo sulla superficie dell'ospite, tra cui la germinazione, la divisione cellulare e la formazione di un appressorio. Un'appendice è una struttura infettiva che si attacca alla superficie dell'ospite e ne facilita la penetrazione nei tessuti. Pertanto, le spore di C. gloeosporioides nell'estratto di pisello hanno mostrato la prima divisione del nucleo dopo 75-90 minuti di incubazione, la formazione di un tubo germinativo dopo 90-120 minuti e la soppressione dopo 4 ore 45. C. gloeosporioides del mango ha mostrato più del 40% di germinazione delle conidi dopo 3 ore di incubazione e circa il 20% di formazione di appressori dopo 4 ore. Il gene CAP20 associato alla virulenza di C. gloeosporioides ha mostrato attività trascrizionale nelle conidi epifite dopo 3,5 ore di incubazione nella cera superficiale dell'avocado con alte concentrazioni di proteina CAP20 dopo 4 ore e 46 minuti. Allo stesso modo, l'attività dei geni della biosintesi della melanina in C. trifolii è stata indotta durante un'incubazione di 2 ore seguita dalla formazione di un appressorio dopo 1 ora. Studi sui tessuti fogliari hanno dimostrato che le fragole inoculate con C. acutatum presentano la prima soppressione a 8 ore dall'inoculazione, mentre i pomodori inoculati con C. coccodes presentano la prima soppressione a 4 ore dall'inoculazione48,49, in gran parte coerente con la scala temporale del processo infettivo di Colletotrichum spp. Le rapide risposte di difesa a 83A:476 suggeriscono il coinvolgimento di geni di resistenza delle piante e di immunità innescata da effettori (ETI) in questa linea, mentre le risposte ritardate di Mandelup supportano l'ipotesi dell'immunità innescata da pattern molecolari microassociati (MTI)50. Risposte precoci a 83A:476 e Mandelup. La parziale sovrapposizione tra geni sovra- o sottoregolati nella risposta ritardata supporta anche questo concetto, poiché l'ETI è spesso considerata una risposta MTI accelerata e potenziata che culmina nella morte cellulare programmata nel sito di infezione, nota come shock anafilattico51,52.
La maggior parte dei geni attribuiti al termine sovrarappresentato Gene Ontology GO:0006952 "Risposta di Difesa" sono gli 11 omologhi della proteina SAM22 (simile a SAM22) e le sette principali proteine ​​simili alle proteine ​​del lattice (MLP). Le proteine ​​simili a SAM22 31, 34, 43 e 423 hanno mostrato similarità di sequenza. I geni simili a SAM22 hanno mostrato un'attivazione significativa e di durata maggiore, evidenziando livelli aumentati di resistenza all'antracnosi (83A:476 e Boregine). Tuttavia, i geni simili a MLP sono stati downregolati solo nelle linee portatrici dell'allele di resistenza candidato (83A:476/Lanr1 a 6 ore post-infezione e Mandelup/AnMan a 24 ore post-infezione). Va notato che tutti gli omologhi simili a SAM22 identificati hanno origine da un cluster genico che si estende per circa 105 kb, mentre i geni simili a MLP hanno origine da regioni separate del genoma. L'attivazione coordinata di geni simili a SAM22 è stata riscontrata anche nel nostro precedente studio sulla resistenza di NLL all'inoculazione di Diaporthetoxica, suggerendo un loro coinvolgimento nelle componenti orizzontali della risposta difensiva. Questa conclusione è supportata anche da segnalazioni di una risposta positiva dei geni simili a SAM22 a lesioni o trattamenti con acido salicilico, induttori fungini o perossido di idrogeno.
È stato dimostrato che i geni simili a MLP rispondono a vari stress abiotici e biotici, comprese infezioni batteriche, virali e fungine patogene in molte specie vegetali55. Le direzioni di risposta a determinate interazioni tra piante e patogeni variavano da un forte aumento (ad esempio, durante l'infestazione del cotone con Verticillium dahliae) a una significativa diminuzione (ad esempio, dopo l'infezione del melo con Alternaria spp.)56,57. Una significativa downregulation del gene MLP-like 423 è stata osservata durante le difese dell'avocado contro l'infezione da F. niger e durante l'infezione del melo. Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola e Alternaria alternata sono patotipi del melo58,59. Inoltre, i calli di melo che sovraesprimevano il gene MLP-like 423 avevano una minore espressione di geni associati alla resistenza ed erano più suscettibili all'infezione fungina59. A seguito di Fusarium oxysporum f, anche il gene MLP-like 423 è stato soppresso nel germoplasma di fagiolo comune resistente. cn. Infezione del fagiolo 60.
Altri membri della famiglia PR-10 identificati nel nostro studio RNA-seq sono stati i geni LlR18A e LlR18B in risposta alla sovraregolazione, così come il gene sovraregolato (1 gene) o sottoregolato (3 geni) per la proteina di trasferimento lipidico DIR1. Inoltre, WGCNA evidenzia il gene LlR18B come un hub in questo modulo, che è altamente suscettibile alla vaccinazione e porta diversi geni di risposta protettiva. I geni LlR18A e LlR18B sono stati indotti nelle foglie di lupino giallo in risposta a batteri patogeni, così come negli steli di NLL dopo l'inoculazione di D. toxica, mentre l'omologo del riso di questi geni, RSOsPR10, è stato rapidamente indotto da un'infezione fungina presumibilmente coinvolta nella via di segnalazione dell'acido jasmonico53,61, 62. Il gene DIR1 codifica proteine ​​di trasporto lipidico non specifiche che sono necessarie per l'insorgenza della resistenza sistemica acquisita (SAR). Con lo sviluppo di reazioni protettive, la proteina DIR1 viene trasportata dal focolaio di infezione attraverso il floema per indurre SAR in organi distanti. È interessante notare che il gene DIR1 TanjilG_02313 è stato indotto in modo significativo al primo punto temporale nelle linee 84A:476 e nella popolazione 22660, ma la resistenza all'antracnosi si è sviluppata con successo solo nella linea 84A:476. Ciò potrebbe indicare una subfunzionalizzazione del gene DIR1 in NLL, poiché i restanti tre omologhi hanno risposto all'inoculazione solo nella linea 83A:476 a 6 ore dall'infezione, e questa risposta era diretta verso il basso.
Nel nostro studio, i componenti più comuni corrispondenti al processo biologico denominato "GO:0055114 Processo Redox" erano la proteina citocromo P450, la perossidasi, la lipossigenasi dell'acido linoleico 9S/13S e l'ossidasi dell'acido 1-aminociclopropano-1-carbossilico. Inoltre, la nostra analisi WGCNA definisce l'omologo di HSFA4a come un hub che trasporta moduli come il gene candidato di resistenza Lanr1 TanjilG_05042. HSFA4a è un componente della regolazione redox-dipendente della trascrizione nucleare nelle piante.
Le proteine ​​del citocromo P450 sono ossidoreduttasi che catalizzano reazioni di idrossilazione dipendenti da NADPH e/o O2 nel metabolismo primario e secondario, incluso il metabolismo degli xenobiotici, nonché degli ormoni, degli acidi grassi, degli steroli, dei componenti della parete cellulare, dei biopolimeri e della biosintesi di composti protettivi 69. Nel nostro studio, la variabilità nella funzione del citocromo P450 delle piante è stata ridotta da -10,6 log2 (fold change) a 5,7 a causa di un gran numero di omologhi alterati (37) e differenze nei modelli di risposta tra geni specifici, riflettendo una revisione al rialzo. Utilizzare solo dati RNA-seq per chiarire la presunta funzione biologica dei geni NLL in una superfamiglia proteica così ampia sarebbe altamente speculativo. Tuttavia, vale la pena notare che alcuni geni del citocromo P450 sono associati a una maggiore resistenza a funghi o batteri patogeni, incluso un contributo alle reazioni allergiche69,70,71.
Le perossidasi di classe III sono enzimi vegetali multifunzionali coinvolti in una vasta gamma di processi metabolici durante la crescita e lo sviluppo delle piante, nonché in risposta a stress ambientali come salinità, siccità, elevata intensità luminosa e attacchi di patogeni72. Le perossidasi sono coinvolte nell'interazione di diverse specie vegetali con Anthracis, tra cui Stylosanthes humilis e C. gloeosporioides, Lens culinaris e C. truncatum, Phaseolus vulgaris e C. lindemuthianum, Cucumis sativus e C. lagenarium73,74,75,76. La risposta è molto rapida, a volte anche a 4 ore dall'inoculazione, prima che il fungo penetri nel tessuto vegetale73. Il gene della perossidasi ha risposto anche all'inoculazione di D. toxica NLL. Oltre alle loro tipiche funzioni di regolazione dello scoppio ossidativo o di eliminazione dello stress ossidativo, le perossidasi possono interferire con la crescita dei patogeni creando barriere fisiche basate sul rinforzo della parete cellulare durante la lignificazione, la formazione di subunità o la reticolazione di composti specifici. Questa funzione può essere attribuita in silico al gene TanjilG_03329 che codifica per una presunta perossidasi anionica formante lignina, la cui espressione è risultata significativamente aumentata nel nostro studio nella linea resistente 83A:476 a 6 ore dall'infezione, ma non in altri ceppi e punti temporali che non hanno mostrato risposta.
La 9S-/13S-lipossigenasi dell'acido linoleico è il primo passaggio nella via ossidativa della biosintesi dei lipidi78. I prodotti di questa via hanno molteplici funzioni nella difesa delle piante, tra cui il rafforzamento della parete cellulare attraverso la formazione di depositi di callosio e pectina e la regolazione dello stress ossidativo attraverso la produzione di specie reattive dell'ossigeno79,80,81,82,83. Nel presente studio, l'espressione della 9S-/13S-lipossigenasi dell'acido linoleico è risultata alterata in tutti i ceppi, ma nella popolazione suscettibile 22660, la sovraregolazione ha prevalso in diversi momenti, mentre nei ceppi portatori dell'allele resistente Lanr1 e dell'allele AnMan, ciò sottolinea la diversificazione dello strato di ossilipina nelle reazioni protettive contro l'antrace tra questi genotipi.
L'omologo dell'1-aminociclopropano-1-carbossilato ossidasi (ACO) è stato significativamente sovraregolato (9 geni) o sottoregolato (2 geni) quando inoculato con lupino. Con due eccezioni, tutte queste risposte si sono verificate a 6 ore in 83A:476. La reazione enzimatica mediata dalle proteine ​​ACO è la fase limitante della velocità nella produzione di etilene ed è quindi altamente regolata84. L'etilene è un ormone vegetale che svolge una varietà di ruoli nella regolazione dello sviluppo delle piante e nella risposta alle condizioni di stress abiotico e biotico. L'induzione della trascrizione dell'ACO e l'attivazione della via di segnalazione dell'etilene sono coinvolte nell'aumento della resistenza del riso al fungo emibiotrofico Oryza oryzae regolando la produzione di specie reattive dell'ossigeno e fitoalessine. Un processo di infezione fogliare molto simile riscontrato tra M. oryzae e C. lupini88,89, sullo sfondo di una significativa sovraregolazione degli omologhi ACO nella linea 83A:476 riportata in questo studio, sposta la possibilità di conferire resistenza all'antracnosi NLL Etilene un passaggio centrale di segnalazione nei percorsi molecolari.
Nel presente studio, è stata osservata una soppressione su larga scala di molti geni associati alla fotosintesi a 6 ore dall'infezione (hpi) nella linea 83A:476 e a 48 ore dall'infezione (hpi) nelle linee Mandeloop e 22660. L'entità e la progressione di questi cambiamenti sono proporzionali al livello di soppressione. In questo esperimento è stata osservata resistenza all'antracnosi. Recentemente, una forte e precoce repressione dei trascritti correlati alla fotosintesi è stata segnalata in diversi modelli di interazione pianta-patogeno, inclusi batteri e funghi patogeni. La rapidità (a partire da 2 ore dall'infezione in alcune interazioni) e la soppressione globale dei geni associati alla fotosintesi in risposta all'infezione possono innescare l'immunità delle piante basata sul rilascio di specie reattive dell'ossigeno e sulla loro interazione con la via dell'acido salicilico per mediare le reazioni allergiche 90,94.
In conclusione, i meccanismi di risposta di difesa proposti per il lignaggio più resistente (83A:476) includono il rapido riconoscimento del patogeno da parte del gene R (presumibilmente TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) e la segnalazione dell'acido salicilico e dell'etilene mediata dalla risposta allergica, seguita dall'instaurazione di SAR a lungo raggio. L'azione è supportata dalla proteina DIR-1. Va notato che il periodo biotrofico per l'infezione da C. lupini è molto breve (circa 2 giorni), seguito dalla crescita necrotica95. La transizione tra queste fasi può essere associata alla necrosi e all'espressione di proteine ​​inducibili dall'etilene che agiscono come inneschi per reazioni di ipersensibilità nelle piante ospiti. Pertanto, la finestra temporale per la cattura efficace di C. lupini nella fase biotrofica è molto ristretta. La riprogrammazione dei geni associati al redox e alla fotosintesi osservata in 83A:476 a 6 ore dall'infezione è coerente con la progressione delle ife fungine e preannuncia lo sviluppo di una risposta protettiva efficace nella fase biotrofica. Le risposte trascrittomiche di Mandelup e della popolazione 22660 potrebbero essere troppo ritardate per catturare il fungo prima del passaggio alla crescita necrotica; tuttavia, Mandelup potrebbe essere più efficace della popolazione 22660 perché la regolazione relativamente rapida della proteina PR-10 promuove la resistenza orizzontale.
L'ETI, guidata dal gene R canonico, sembra essere un meccanismo comune di resistenza all'antracnosi nel fagiolo. Pertanto, nella leguminosa modello Medicago truncatula, la resistenza all'antracnosi è conferita dal gene RCT1, un membro della classe di geni R vegetali TIR-NBS-LRR97. Questo gene conferisce anche una resistenza ad ampio spettro all'antracnosi nell'erba medica quando viene trasferito a piante suscettibili. Nel fagiolo comune (P. vulgaris), sono stati identificati finora più di venti geni di resistenza all'antracnosi. Alcuni di questi geni si trovano in regioni prive di geni R canonici, tuttavia molti altri sono localizzati ai margini dei cromosomi che portano il cluster genico NBS-LRR, incluso TIR-NBS-LRRs99. Lo studio SSR a livello genomico ha inoltre confermato l'associazione del gene NBS-LRR con la resistenza all'antracnosi nel fagiolo comune. Il gene R canonico è stato trovato anche nella regione genomica che ospita il principale locus di resistenza all'antracnosi nel lupino bianco 101.
Il nostro lavoro dimostra che una reazione di resistenza immediata, attivata in una fase precoce dell'infezione della pianta (preferibilmente non oltre 12 ore dall'infezione), protegge efficacemente il lupino a foglie strette dall'antracnosi causata dal fungo patogeno Collelotrichum lupini. Utilizzando il sequenziamento ad alto rendimento, abbiamo dimostrato profili di espressione differenziale dei geni di resistenza all'antracnosi nelle piante NLL mediati dai geni di resistenza Lanr1 e AnMan. Una difesa efficace implica un'attenta progettazione dei geni per le proteine ​​coinvolte nel redox, nella fotosintesi e nella patogenesi entro poche ore dal primo contatto della pianta con un patogeno. Reazioni protettive simili, ma ritardate nel tempo, sono molto meno efficaci nel proteggere le piante dalle malattie. La resistenza all'antrace mediata dal gene Lanr1 assomiglia alla tipica risposta rapida del gene R (immunità innescata da effettori), mentre il gene AnMan molto probabilmente fornisce una risposta orizzontale (immunità innescata da un modello molecolare associato al microbiota), garantendo un livello moderato di sostenibilità.
Le 215 linee NLL utilizzate per lo screening dei marcatori di antracnosi erano costituite da 74 cultivar, 60 linee ottenute per incrocio o riproduzione, 5 mutanti e 76 germoplasmi selvatici o originali. Le linee provenivano da 17 paesi, principalmente da Polonia (58), Spagna (47), Germania (27), Australia (26), Russia (19), Bielorussia (7), Italia (5) e altre linee da 10 paesi. Il set include anche linee di riferimento resistenti: 83A:476, Tanjil, Wonga portatrici dell'allele Lanr1 e Mandelup portatrici dell'allele AnMan. Le linee sono state ottenute dal database europeo delle risorse genetiche del lupino gestito da Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polonia (Tabella supplementare S1).
Le piante sono state coltivate in condizioni controllate (fotoperiodo 16 ore, temperatura 25°C durante il giorno e 18°C ​​durante la notte). Sono state analizzate due repliche biologiche. Il DNA è stato isolato da foglie di tre settimane utilizzando il kit DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germania) secondo il protocollo. La qualità e la concentrazione del DNA isolato sono state valutate mediante metodi spettrofotometrici (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Sono stati analizzati il ​​marcatore AnManM1 che marca il gene di resistenza all'antracnosi AnMan (derivato dalla cv. Mandelup) e i marcatori Anseq3 e Anseq4 che fiancheggiano il gene Lanr1 (derivato dalla cv. Tanjil) 11,26,28. Gli omozigoti per l'allele resistente sono stati valutati come "1", i suscettibili come "0" e gli eterozigoti come 0,5.
In base ai risultati dello screening per i marcatori AnManM1, AnSeq3 e AnSeq4 e alla disponibilità di semi per gli esperimenti di follow-up finali, sono state selezionate 50 linee NLL per la fenotipizzazione della resistenza all'antracnosi. L'analisi è stata eseguita in duplicato in una serra computerizzata con un fotoperiodo di 14 ore e una temperatura compresa tra 22 °C durante il giorno e 19 °C durante la notte. I semi sono stati graffiati (tagliando il tegumento del seme sul lato opposto all'embrione con una lama affilata) prima della semina per prevenire la dormienza dei semi dovuta all'eccessiva durezza del tegumento e per garantire una germinazione uniforme. Le piante sono state coltivate in vasi (11 × 11 × 21 cm) con terriccio sterile (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsavia, Polonia). L'inoculazione è stata effettuata con il ceppo Colletotrichum lupini Col-08, coltivato nel 1999 a partire da fusti di piante di lupino a foglia stretta coltivate in un campo a Verzhenitsa, Grande Polonia (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Gli isolati sono stati coltivati ​​in terreno SNA a 20°C sotto luce nera per 21 giorni per indurre la sporulazione. Quattro settimane dopo la semina, quando le piante avevano raggiunto lo stadio di 4-6 foglie, l'inoculazione è stata effettuata mediante irrorazione con una sospensione di conidi a una concentrazione di 0,5 x 10⁶ conidi per ml. Dopo l'inoculazione, le piante sono state mantenute al buio per 24 ore a un'umidità di circa il 98% e a una temperatura di 25°C per facilitare la germinazione dei conidi e il processo di infezione. Le piante sono state quindi coltivate con un fotoperiodo di 14 ore a 22 °C di giorno/19 °C di notte e 70% di umidità. Il punteggio di resistenza alla malattia è stato assegnato 22 giorni dopo l'inoculazione e variava da 0 (immune) a 9 (molto suscettibile) a seconda della presenza o assenza di lesioni necrotiche su fusti e foglie. Inoltre, dopo la valutazione, è stato misurato il peso delle piante. Le relazioni tra i genotipi dei marcatori e i fenotipi della malattia sono state calcolate come correlazioni punto-sequenza (assenza di marcatori eterozigoti nel set di linee per l'analisi del fenotipo di resistenza all'antracnosi).