Grazie per aver visitato Nature.com. La versione del browser che stai utilizzando ha un supporto CSS limitato. Per un'esperienza ottimale, ti consigliamo di utilizzare un browser aggiornato (o di disattivare la modalità di compatibilità in Internet Explorer). Nel frattempo, per garantire un supporto continuo, il sito verrà visualizzato senza stili e JavaScript.
Il lupino Angustifolius (NLL, Lupinus angustifolius L.) è una leguminosa utilizzata per la produzione alimentare e il miglioramento del suolo. L'espansione globale del NLL come coltura ha attratto molti funghi patogeni, tra cui l'antracnosi del lupino, causa della devastante malattia dell'antracnosi. Due alleli, Lanr1 e AnMan, che conferiscono una maggiore resistenza, sono stati utilizzati nel breeding del NLL, ma i meccanismi molecolari sottostanti rimangono sconosciuti. In questo studio, i marcatori Lanr1 e AnMan sono stati utilizzati per lo screening di campioni europei di NLL. La sperimentazione del vaccino in ambiente controllato ha confermato l'efficacia di entrambi i donatori resistenti. È stato effettuato un profilo di espressione genica differenziale su linee rappresentative resistenti e suscettibili. La resistenza all'antracnosi è stata associata alla sovraespressione dei termini ontologici genici "GO:0006952 Risposta di Difesa", "GO:0055114 Processo Redox" e "GO:0015979 Fotosintesi". Inoltre, la linea Lanr1(83A:476) ha mostrato una significativa riprogrammazione del trascrittoma rapidamente dopo l'inoculazione, mentre le altre linee hanno mostrato un ritardo in questa risposta di circa 42 ore. Le risposte di difesa sono associate ai geni TIR-NBS, CC-NBS-LRR e NBS-LRR, a 10 proteine ​​coinvolte nella patogenesi, alle proteine ​​di trasferimento lipidico, all'endoglucano-1,3-β-glucosidasi, alle proteine ​​della parete cellulare ricche di glicina e ai geni del percorso reattivo dell'ossigeno. Le risposte precoci a 83A:476, inclusa l'attenta soppressione dei geni associati alla fotosintesi, hanno coinciso con una protezione efficace durante la fase di crescita vegetativa della biologia fungina, suggerendo che un effettore inneschi l'immunità. La reazione di Mandeloop risulta rallentata, così come la resistenza orizzontale complessiva.
Il lupino a foglie strette (Lupinus angustifolius L., NLL) è un cereale ad alto contenuto proteico originario della regione del Mediterraneo occidentale1,2. È attualmente coltivato come coltura alimentare per animali e esseri umani. È anche considerato sovescio nei sistemi di rotazione delle colture grazie alla fissazione dell'azoto da parte di batteri azotofissatori simbiontici e al miglioramento complessivo della struttura del suolo. Il NLL ha subito un rapido processo di domesticazione nell'ultimo secolo ed è ancora sottoposto a un'elevata pressione riproduttiva3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Con la diffusa coltivazione del NLL, la successione di funghi patogeni ha creato nuove nicchie agricole e causato nuove malattie distruttive delle colture. L'evento più notevole per gli agricoltori e gli allevatori di lupini è stata la comparsa dell'antracnosi, causata dal fungo patogeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. L'evento più notevole per gli agricoltori e gli allevatori di lupini è stata la comparsa dell'antracnosi, causata dal fungo patogeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. L'ottima indicazione per i frigoriferi e i selezionatori di lucidatura è stata un'ottima anomalia, ottimizzazione патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Ciò che ha destato più scalpore tra gli allevatori e i coltivatori di lupini è stata la comparsa dell'antracnosi causata dal fungo patogeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的。Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Capelli。1 I migliori strumenti per i frigoriferi e i selezionatori di labbra hanno un'antagonista disordinata, avvincente патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Ciò che colpisce di più gli allevatori e i coltivatori di lupini è la comparsa dell'antracnosi causata dal fungo patogeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Le prime segnalazioni della malattia provenivano dal Brasile e dagli Stati Uniti, con sintomi tipici comparsi rispettivamente nel 1912 e nel 1929. Tuttavia, dopo circa 30 anni, il patogeno fu designato come Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorfo Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfo Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfo di Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., 有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., 有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in Morfologia mirata. & H. Schrenk,. e H. Schrenk, .e H. Schrenk. & H.施伦克,。 & H.施伦克,。e H. Schlenk, .La fenotipizzazione preliminare della malattia effettuata a metà del XX secolo ha mostrato una certa resistenza nelle accessioni di NLL e lupino giallo (L. luteus L.), ma tutte le accessioni di lupino bianco (L. albus L.) testate erano altamente suscettibili15,16. Studi hanno dimostrato che lo sviluppo dell'antracnosi è associato a un aumento delle precipitazioni (umidità dell'aria) e della temperatura (nell'intervallo 12-28 °C), portando a una violazione della resistenza a temperature più elevate17, 18. Infatti, il tempo necessario alla germinazione dei conidi e all'insorgenza della malattia era quattro volte inferiore a 24 °C (4 ore) rispetto a 12 °C (16 ore) in condizioni di elevata umidità19. Pertanto, il riscaldamento globale in corso ha portato alla diffusione dell'antracnosi. Tuttavia, la malattia fu osservata in Francia (1982) e Ucraina (1983) come presagio di una minaccia imminente, ma all'epoca fu apparentemente ignorata dall'industria del lupino20,21. Pochi anni dopo, questa malattia devastante si diffuse in tutto il mondo e colpì anche importanti paesi produttori di lupino come Australia, Polonia e Germania22,23,24. A seguito di un'epidemia di antracnosi a metà degli anni '90, uno screening approfondito portò all'identificazione di diversi donatori resistenti nei campioni di NLL19. La resistenza di NLL all'antracnosi è controllata da due distinti alleli dominanti presenti in diverse fonti di germoplasma: Lanr1 nelle cultivar Tanjil e Wonga e AnMan nella cultivar Mandalay25,26. Questi alleli integrano i marcatori molecolari che supportano la selezione di germoplasma resistente nei programmi di miglioramento genetico25,26,27,28,29,30. La linea riproduttiva resistente 83A:476, portatrice dell'allele Lanr1, è stata incrociata con la linea selvatica suscettibile P27255 per ottenere una popolazione RIL segregante per la resistenza all'antracnosi, il che ha reso possibile assegnare il locus Lanr1 al cromosoma NLL-1131, 32, 33. L'allineamento dei marcatori della mappa di linkage dai loci di resistenza fiancheggianti l'antracnosi con un quadro genomico, NLL, ha rivelato la posizione di tutti e tre gli alleli sullo stesso cromosoma (NLL-11), ma in posizioni diverse29,34,35. Tuttavia, a causa del piccolo numero di RIL e dell'ampia distanza genetica tra marcatori e alleli corrispondenti, non è possibile trarre conclusioni affidabili sui loro geni sottostanti. D'altra parte, l'uso della genetica inversa nei lupini è difficile a causa del loro bassissimo potenziale di rigenerazione, che rende macchinosa la manipolazione genetica37.
Lo sviluppo di germoplasma domestico che porta l'allele desiderato allo stato omozigote, come 83A:476 (Lanr1) e Mandelup (AnMan), ha aperto le porte allo studio della resistenza all'antracnosi in presenza di combinazioni alleliche opposte nelle popolazioni selvatiche. Possibilità di meccanismi molecolari. Confrontare le risposte di difesa generate da genotipi specifici. Questo studio ha valutato la risposta trascrittomica precoce di NLL alla vaccinazione con C. lupini. In primo luogo, un pannello di germoplasma europeo di NLL contenente 215 linee è stato sottoposto a screening utilizzando marcatori molecolari che marcano gli alleli Lanr1 e AnMan. La fenotipizzazione dell'antracnosi è stata quindi eseguita su 50 linee di NLL, precedentemente selezionate per i marcatori molecolari, in condizioni controllate. Sulla base di questi esperimenti, sono state selezionate quattro linee che differivano per resistenza all'antracnosi e composizione allelica Lanr1/AnMan per la profilazione dell'espressione genica della difesa differenziale, utilizzando due approcci complementari: sequenziamento dell'RNA ad alto rendimento e quantificazione PCR in tempo reale.
Lo screening di un set di germoplasma NLL (N = 215) con i marcatori Lanr1 (Anseq3 e Anseq4) e AnMan (Anseq4) e AnMan (AnManM1) ha mostrato che solo una linea (95726, vicino a Salamanca-b) amplifica l'allele di "resistenza" per tutti i marcatori, mentre "Presenza di alleli 'suscettibili'" ha rilevato la proporzione di tutti i marcatori in 158 (~73,5%) linee. Tredici linee hanno prodotto due alleli "resistenti" del marcatore Lanr1 e 8 linee hanno prodotto alleli "resistenti" del marcatore Lanr1. L'allele di "resistenza" del marcatore AnMan (Tabella supplementare S1). Due linee erano eterozigoti per il marcatore Anseq3 e una eterozigote per il marcatore AnManM1. 42 linee (19,5%) presentavano fasi opposte degli alleli Anseq3 e Anseq4, indicando un'elevata frequenza di ricombinazione tra questi due loci. I fenotipi di antracnosi in condizioni controllate (Tabella Supplementare S2) hanno rivelato variabilità nella resistenza dei genotipi testati, che si è riflessa nella gravità dell'antracnosi. Le differenze nei punteggi medi variavano da 1,8 (moderatamente resistente) a 6,9 (suscettibile) e le differenze di peso delle piante variavano da 0,62 (suscettibile) a 4,45 g (resistente). È stata riscontrata una correlazione significativa tra i valori osservati in due repliche dell'esperimento (0,51 per i punteggi di gravità della malattia, P = 0,00017 e 0,61 per il peso della pianta, P < 0,0001) e tra questi due parametri (− 0,59 e − 0,77, P < 0,0001). È stata riscontrata una correlazione significativa tra i valori osservati in due repliche dell'esperimento (0,51 per i punteggi di gravità della malattia, P = 0,00017 e 0,61 per il peso della pianta, P < 0,0001) e tra questi due parametri (− 0,59 e − 0,77, P < 0,0001). La correlazione tra le statistiche è stata valutata in due esperimenti sperimentali (0,51 per balli) тяжести болезни, P = 0,00017 e 0,61 per la massa di dosaggio, P < 0,0001), e anche tra due parametri (-0,59 e -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). È stata riscontrata una correlazione significativa tra i valori osservati in due ripetizioni dell'esperimento (0,51 per i punteggi di gravità della malattia, P = 0,00017 e 0,61 per il peso della pianta, P < 0,0001), nonché tra questi due parametri (- 0,59 e -0,77, P < 0,0001).0,51 P = 0,51 0,00017, 0,61, P < 0,0001, P < 0,0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为分为 0,51, p = 0,00017, 植物 为 为 0,61, p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0,59 和– 0,59和– 0,59 和– 0,59 和- 0,77, P < 0,0001)。 La correlazione tra le tue preferenze è stata stabilita in base alle tue conoscenze e alle tue esigenze deformazione 0,51, P = 0,00017 e massa della prestazione 0,61, P <0,0001), e mezzo di due parametri (-0,59 e -0,0001) 0,77, P <0,0001. È stata riscontrata una correlazione significativa tra i valori osservati in duplicato (punteggio di gravità della malattia 0,51, P = 0,00017 e peso della pianta 0,61, P < 0,0001) e tra questi due parametri (-0,59 e -0,0001) 0,77, P < 0,0001. ).I sintomi tipici osservati nelle piante sensibili includono piegamento e torsione del fusto, simile a una struttura ad "arco di pastore", seguita da lesioni ovali con sporozoiti arancioni/rosa (Figura 1 supplementare). Le accessioni australiane portatrici dei geni Lanr1 (83A:476 e Tanjil) e AnMan (Mandelup) sono moderatamente resistenti, rispettivamente 0,0331 e 0,0036. Alcune linee che portano anche alleli "resistenti" per Lanr1 e/o AnMan mostrano sintomi della malattia.
È interessante notare che alcune linee NLL prive di qualsiasi allele marcatore "resistente" hanno rivelato un elevato livello di resistenza all'antracnosi (paragonabile o superiore rispetto ai genotipi Lanr1 o AnMan), come Boregine (valore P < 0,0001 per entrambi i parametri), Bojar (valore P < 0,0001 per il punteggio e 0,001 per il peso della pianta) e Popolazione B-549/79b (valore P < 0,0001 per il punteggio e non significativo per il peso). È interessante notare che alcune linee NLL prive di qualsiasi allele marcatore "resistente" hanno rivelato un elevato livello di resistenza all'antracnosi (paragonabile o superiore rispetto ai genotipi Lanr1 o AnMan), come Boregine (valore P < 0,0001 per entrambi i parametri), Bojar (valore P < 0,0001 per il punteggio e 0,001 per il peso della pianta) e Popolazione B-549/79b (valore P < 0,0001 per il punteggio e non significativo per il peso). Interessante che la nuova linea NLL, un semplice libro di testo «resistenziale» alleato di marca, sia stata molto utile уровень устойчивости к l'antagonista (sistema o una grande quantità di dati per la generazione di Lanr1 o AnMan), così come Boregine (valore P <0,0001 per gli oggetti) parametri), Bojar (значение P < 0,0001 per le bevande e 0,001 per le masse) e la popolazione B-549/79b (valore P <0,0001 per le bevande e le insufficienze per le masse). È interessante notare che diverse linee NLL prive di qualsiasi allele marcatore "resistente" hanno mostrato un elevato livello di resistenza all'antracnosi (paragonabile o superiore a quello dei genotipi Lanr1 o AnMan), come Boregine (valore P < 0,0001 per entrambi i parametri), Bojar (valore P < 0,0001 per la valutazione e 0,001 per il peso della pianta) e la popolazione B-549/79b (valore P < 0,0001 per la valutazione e non significativo per il peso).Per ulteriori informazioni, non esitate a contattarci.或AnMan 基因型相当或更高）,例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）e种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）. È interessante notare che alcuni sistemi NLL che non presentano marcatori “antigenici” mostrano un’elevata resistenza orizzontale (equivalente ai geni Lanr1 o AnMan o superiore), come Boregine (entrambi i parametri P < 0,0001), Bojar (valore P < 0,0001, peso della pianta 0,001) e il ceppo B-549/79b (valore P < 0,0001, peso non significativo). Interessante che le nuove linee NLL, simili ai simboli allegati alla "resistenza", siano state indicate in termini di resistenza уровни устойчивости к anomalia (schermata o tua, che è stata generata da Lanr1 o AnMan), così come Boregine (schermata P per i parametri presenti <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, massa растения 0,001) e la popolazione B-549/79b (indice P <0,0001, massa ridotta). È interessante notare che alcune linee NLL prive di alleli marcatori di "resistenza" hanno mostrato livelli elevati di resistenza all'antracnosi (paragonabili o superiori ai genotipi Lanr1 o AnMan), come Boregine (valore P per entrambi i parametri <0,0001), Bojar (valore P < 0,0001, peso della pianta 0,001) e popolazione B-549/79b (valore P < 0,0001, peso non significativo).Questo fenomeno suggerisce la possibilità di una nuova fonte genetica di resistenza, spiegando la mancanza di correlazione osservata tra i genotipi dei marcatori e i fenotipi della malattia (valori di P da ~0,42 a ~0,98). Pertanto, il test di Kolmogorov-Smirnov ha mostrato che i dati sulla resistenza all'antracnosi presentavano una distribuzione approssimativamente normale per punteggi (valori di P 0,25 e 0,11) e massa vegetale (valori di P 0,47 e 0,55), suggerendo la mia ipotesi che siano coinvolti più alleli di Lanr1 e AnMan.
Sulla base dei risultati dello screening di resistenza all'antracnosi, sono state selezionate 4 linee per l'analisi del trascrittoma: 83A:476, Boregine, Mandelup e popolazione 22660. Queste linee sono state nuovamente sottoposte a test di resistenza all'antrace in esperimenti di inoculazione mediante sequenziamento dell'RNA, a condizione che fossero identiche a quelle del test precedente. I valori dei punteggi sono stati i seguenti: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) e popolazione 22660 (6,11 ± 1,29).
Il protocollo Illumina NovaSeq 6000 ha raggiunto una media di 40,5 coppie di Mread per campione (da 29,7 a 54,4 Mread) (Tabella Supplementare S3). I punteggi di allineamento nella sequenza di riferimento variavano dal 75,5% all'88,6%. La correlazione media dei dati di conteggio delle letture tra le varianti sperimentali e i replicati biologici variava da 0,812 a 0,997 (media 0,959). Dei 35.170 geni analizzati, 2917 non hanno rivelato alcuna espressione, mentre gli altri 4785 geni sono stati espressi a un livello trascurabile (media di base < 5). Dei 35.170 geni analizzati, 2917 non hanno rivelato alcuna espressione, mentre gli altri 4785 geni sono stati espressi a un livello trascurabile (media di base < 5). A partire da 35 170 gennaio 2917 l'espressione professionale non è stata eseguita, mentre l'espressione 4785 gennaio è stata eseguita su незначительном уровне (базовое среднее <5). Dei 35.170 geni analizzati, 2917 non hanno mostrato alcuna espressione, mentre i restanti 4785 geni sono stati espressi a un livello trascurabile (media di base <5).35.170 anni di attività, 2917 个没有表达, 4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值<5）.35.170 Da 35 170 gennaio 2917 non è stato espresso, a partire da 4785 giorni non è stato espresso экспрессию (bazoвое среднее conoscenza <5). Dei 35.170 geni analizzati, 2917 non sono stati espressi e i restanti 4785 geni avevano un'espressione trascurabile (media di base <5).Pertanto, il numero di geni considerati espressi (media di base ≥ 5) durante l'esperimento è stato 27.468 (78,1%) (Tabella supplementare S4).
Fin dal primo istante, tutte le linee NLL hanno risposto all'inoculazione di C. lupini (ceppo Col-08) riprogrammando il trascrittoma (Tabella 1); tuttavia, sono state osservate differenze significative tra le linee. Pertanto, la linea di resistenza 83A:476 (che porta il gene Lanr1) ha mostrato una significativa riprogrammazione del trascrittoma al primo istante (6 ore dopo l'inoculazione) con un aumento di 31-69 volte del numero di geni up e down isolati rispetto ad altri istante a questo istante. Inoltre, questo picco è stato di breve durata, poiché l'espressione di solo pochi geni è rimasta significativamente alterata al secondo istante (12 ore dopo l'inoculazione). È interessante notare che Boregine, che ha mostrato anch'essa un elevato livello di resistenza nel test di trapianto, non ha subito una riprogrammazione trascrizionale così massiva durante l'esperimento. Tuttavia, il numero di geni differenzialmente espressi (DEG) era lo stesso per Boregine e 83A:476 a 12 ore dopo l'inoculazione. Sia Mandelup che la popolazione 22660 hanno mostrato picchi DEG nell'ultimo punto temporale (48 l/s), indicando un ritardo relativo nelle risposte di difesa.
Poiché 83A:476 ha subito una massiccia riprogrammazione del trascrittoma in risposta a C. lupini a 6 ore di vita media rispetto a tutte le altre linee, circa il 91% dei DEG osservati a questo punto temporale era specifico del lignaggio (Fig. 1). Tuttavia, si è riscontrata una certa sovrapposizione nelle risposte precoci tra le linee di studio, poiché il 68,5%, il 50,9% e il 52,6% dei DEG rispettivamente in Boregine, Mandelup e nella popolazione 22660 si sovrapponevano a quelli riscontrati in 83A:476 in determinati momenti. Tuttavia, questi DEG rappresentavano solo una piccola frazione (0,97-1,70%) di tutti i DEG attualmente rilevati utilizzando 83A:476. Inoltre, 11 DEG di tutte le linee erano coerenti in questo momento (Tabelle supplementari S4-S6), compresi i componenti comuni delle risposte di difesa delle piante: proteina di trasferimento lipidico (TanjilG_32225), enzima endoglucano-1,3-β-glucoside (TanjilG_23384), due proteine ​​inducibili dallo stress come SAM22 (TanjilG_31528 e TanjilG_31531), proteina del lattice basico (TanjilG_32352) e due proteine ​​della parete cellulare strutturale ricche di glicina (TanjilG_19701 e TanjilG_19702). Si è riscontrata anche una sovrapposizione relativamente elevata nelle risposte del trascrittoma tra 83A:476 e Boregine a 24 ore di osservazione (totale 16-38% DEG) e tra Mandelup e la popolazione 22660 a 48 ore di osservazione (totale 14-20% DEG).
Diagramma di Venn che mostra il numero di geni differenzialmente espressi (DEG) in linee di lupino a foglie strette (NLL) inoculate con Colletotrichum lupini (ceppo Col-08 ottenuto da campi di lupino a Wierzhenice, Polonia, 1999). Le linee NLL analizzate erano: 83A:476 (resistente, portatrice dell'allele Lanr1), Boregine (resistente, background genetico sconosciuto), Mandelup (moderatamente resistente, portatrice dell'allele AnMan) e popolazione 22660 (molto suscettibile). L'abbreviazione hpi sta per ore dopo la vaccinazione. I valori zero sono stati rimossi per semplificare il grafico.
L'insieme dei geni sovraespressi a 6 ore dall'infezione è stato analizzato per la presenza di domini canonici del gene R (Tabella Supplementare S7). Questo studio ha rivelato l'induzione del trascrittoma di geni classici di resistenza alle malattie con domini NBS-LRR solo a 83A:476. Questo insieme era composto da un gene TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), cinque geni CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 e tanjilg_16162), e quattro geni NBS-LR, Tanjilg_16162, quattro geni NBS-LRRE (tanjilg_16162), nonché quattro geni NBS-Lrr (tanjilg_16162) e quattro geni NBS-LRR (TANJILG_16162). Tutti questi geni presentano domini canonici organizzati in sequenze conservate. Oltre ai geni del dominio NBS-LRR, diverse chinasi RLL sono state attivate a 6 ore dall'infezione, in particolare una in Boregine (TanjilG_19877), due in Mandelup (TanjilG_07141 e TanjilG_19877) e nella popolazione 22660 (TanjilG_09014 e TanjilG_10361) e due in 83A 27:476.
I geni con espressione significativamente alterata in risposta all'inoculazione con C. lupini (ceppo Col-08) sono stati sottoposti ad analisi di arricchimento Gene Ontology (GO) (Tabella supplementare S8). Il termine del processo biologico più frequentemente sovrarappresentato è stato “GO:0006952 risposta di difesa” che è apparso in 6 su 16 combinazioni (tempo × linea) con elevata significatività (valore P < 0,001) (Fig. 2). Il termine del processo biologico più frequentemente sovrarappresentato è stato “GO:0006952 risposta di difesa” che è apparso in 6 su 16 combinazioni (tempo × linea) con elevata significatività (valore P < 0,001) (Fig. 2). Il termine più semplice del processo biologico è «GO: 0006952 защитный ответ», chi è andato dal 6 al 16 (tempo × linea) combinato con l'elevata concentrazione (livello P <0,001) (ris. 2). Il termine del processo biologico più frequentemente sovrarappresentato è stato "GO:0006952 risposta di difesa", che è apparso in 6 delle 16 combinazioni (tempo × lignaggio) con elevata significatività (valore P < 0,001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”,它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中,具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）. Il termine più rappresentativo del processo biologico è “GO:0006952 risposta di difesa”, che appare in 6 delle 16 (时间×线) combinazioni, con elevata significatività (valore P < 0,001) (图2). Il termine più semplice del processo biologico è stato «GO: 0006952 Defense Response», da cui появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × linea) con una grande importanza (значение P <0,001) (ris. 2). Il termine del processo biologico più frequentemente sovrarappresentato è stato "GO:0006952 Risposta di difesa", che è apparso in 6 su 16 combinazioni (tempo × linea) con elevata significatività (valore P < 0,001) (Fig. 2).Questo termine è risultato sovrarappresentato in due punti temporali in 83A: 476 e Boregine (6 e 24 ore di vita) e in un punto temporale in Mandelup e nella popolazione 22660 (rispettivamente 12 e 6 ore di vita). Si tratta di un risultato atteso, che evidenzia la risposta antifungina delle linee resistenti. Inoltre, 83A:476 ha risposto a C. lupini inducendo rapidamente geni correlati al picco ossidativo rappresentato dal termine "processo redox GO:0055114", indicando una risposta difensiva specifica, mentre Boregine ha rivelato risposte difensive specifiche, correlate al termine "GO". :0006950 Risposta allo stress”. La popolazione 22660 ha attivato la risposta di resistenza orizzontale che coinvolge metaboliti secondari, evidenziando il numero eccessivo di termini “GO:0016104 Processo di biosintesi dei triterpeni” e “GO:0006722 Processo di metabolismo dei triterpeni” (entrambi i termini appartengono allo stesso set di geni), tenendo conto dei risultati dell'analisi di arricchimento dei termini GO, la stabilità della reazione di Mandelup era tra Boregine e la popolazione 22660. Inoltre, la reazione precoce 83A:476 (6 hpi) e la reazione ritardata Mandelup e la popolazione 22660 includono il termine GO:0015979 'fotosintesi' e altri processi biologici correlati.
I termini ontologici dei geni di bioprocesso selezionati nell'annotazione dei geni differenzialmente espressi durante le risposte del trascrittoma di lupino a foglie strette (NLL) inoculato con lupino carbonchio (ceppo Col-08 ottenuto da campi di lupino a Wierzhenice, Polonia, nel 1999) sono notevolmente esagerati. Le linee NLL analizzate erano: 83A:476 (resistente, portatrice dell'allele omozigote Lanr1), Boregine (resistente, background genetico sconosciuto), Mandelup (moderatamente resistente, portatrice dell'allele omozigote AnMan) e popolazione 22660 (suscettibile).
Poiché questo studio mirava a identificare i geni che contribuiscono alla resistenza all'antracnosi, i geni assegnati ai termini GO "GO: 0006952 Risposte difensive" e "GO: 0055114 Processi redox" sono stati analizzati con valori di cut-off poiché la media basale era ≥ 30 con almeno una linea x punto temporale, combinando valori statisticamente significativi di log2 (variazione di piega). Il numero di geni che soddisfacevano questi criteri era 65 per GO:0006952 e 524 per GO:0055114.
83A:476 ha rivelato due picchi DEG annotati con il termine GO:0006952, il primo a 6 geni per pollice (64 geni, regolazione positiva e negativa) e il secondo a 24 geni per pollice (15 geni, solo regolazione positiva). Boregine ha anche mostrato che GO:0006952 ha raggiunto il picco allo stesso punto temporale, ma con meno DEG (11 e 8) e attivazione preferenziale. Mandeloop ha mostrato due picchi di GO:0006952 a 12 e 48 ore di esposizione al sole, entrambi portatori di 12 geni (il primo con geni attivatori e il secondo con soli geni soppressivi), mentre la popolazione 22660 a 6 ore di esposizione al sole (13 geni) presentava una maggiore predominanza del picco di incremento della regolazione. È importante notare che il 96,4% di GO:0006952 DEG in questi picchi ha mostrato lo stesso tipo di risposta (verso l'alto o verso il basso), indicando una significativa sovrapposizione nelle risposte di difesa nonostante le differenze nel numero di geni coinvolti. Il gruppo più numeroso di sequenze correlate al termine GO:0006952 codifica per la proteina 22 del messaggio associato allo stress da fame (SAM22-like), che appartiene al clade proteico della proteina associata alla patogenesi di classe 10 (PR-10) e alla proteina del core (Fig. 3). I due gruppi differivano nella natura dell'espressione e nella direzione della risposta. I geni che codificano per proteine ​​simili a SAM22 hanno mostrato un'induzione costante e significativa nei punti temporali precoci (6 o 12 ore prima dell'esperimento) e non hanno mostrato generalmente risposta alla fine dell'esperimento (48 ore prima dell'esperimento), mentre le proteine ​​simili a MLP hanno mostrato un coordinamento a 6 ore prima dell'esperimento. 83A:476 e Mandelup a 48 hp/pollice, quasi tutti gli altri punti dati non hanno risposto. Inoltre, le differenze nei profili di espressione dei geni della proteina SAM22-simile hanno seguito la variabilità osservata nella resistenza all'antracnosi, poiché le linee più resistenti presentavano più punti temporali che inducevano significativamente questi geni rispetto ai geni più suscettibili. Un altro gene PR-10 LlR18A/B-simile ha mostrato un pattern di espressione molto simile al gene della proteina SAM22-simile.
Sono stati identificati i componenti principali del processo biologico denominato "GO:0006952 Risposta di Difesa" e i pattern di espressione dei geni candidati degli alleli Lanr1 e AnMan. La scala Log2 rappresenta i valori di log2 (variazione in termini di volte) tra piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenuto da campi di lupino, Wizhenica, Polonia, 1999) e piante di controllo (inoculate in modo fittizio) allo stesso punto temporale. Sono state analizzate le seguenti linee di lupino a foglia stretta: 83A:476 (resistente, portatrice dell'allele omozigote Lanr1), Boregine (resistente, background genetico sconosciuto), Mandelup (moderatamente resistente, portatrice dell'allele omozigote AnMan) e Popolazione 22660 (suscettibile).
Inoltre, sono stati valutati i profili di espressione dei geni candidati RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) e AnMan (TanjilG_12861) (Fig. 3). Il gene TanjilG_05042 ha mostrato una risposta significativa (attivazione) a 83A:476 solo al primo punto temporale (6 ore), mentre TanjilG_12861 è risultato significativo in Mandeloop solo a due punti temporali: 6 ore (downregulation) e 24 ore (6 ore). Con.). regolabile) ).
I geni più sovraespressi nel termine "processo redox" GO:0055114 erano geni che codificano per le proteine ​​del citocromo P450 e per la perossidasi (Fig. 4). Per i campioni isolati da 83A:476 a 6 ore di vita, sono stati generalmente osservati valori massimi o minimi di log2 (fold change) (per l'86,6% dei geni) tra piante inoculate e di controllo, evidenziando l'elevata risposta di questo genotipo all'inoculazione del sesso. 83A:476 ha mostrato il DEG GO:0055114 più significativo a 6 ore di vita (503 geni), mentre le restanti linee a 48 ore di vita (Boregine, 31 geni; Mandelup, 85 geni; e Popolazione 22660, 78 geni). Nella maggior parte dei geni della famiglia GO:0055114, sono stati osservati due tipi di risposta alla vaccinazione (attivazione e inibizione). È interessante notare che fino al 97,6% dei DEG identificati per il termine GO: 0055114 in Mandelupe a 48 hp. Queste osservazioni suggeriscono che, nonostante la scala significativamente più piccola (ovvero il numero di geni redox mutati, 85 contro 503), il modello di risposte trascrittomiche ritardate di mandelupe all'antracnosi è simile alla risposta precoce di 83A:476. In Boregine e nella popolazione 22660, questa convergenza è inferiore, rispettivamente del 51,6% e del 75,6%.
Sono stati rivelati i modelli di espressione dei principali componenti del processo biologico "GO:0055114 Redox process". La scala Log2 rappresenta i valori di log2 (variazione in termini di volte) tra piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenuto da campi di lupino, Wizhenica, Polonia, 1999) e piante di controllo (inoculate in modo fittizio) allo stesso punto temporale. Sono state analizzate le seguenti linee di lupino a foglia stretta: 83A:476 (resistente, portatrice dell'allele omozigote Lanr1), Boregine (resistente, background genetico sconosciuto), Mandelup (moderatamente resistente, portatrice dell'allele omozigote AnMan) e Popolazione 22660 (suscettibile).
83A:476 Le risposte trascrittomiche all'inoculazione con C. lupini (ceppo Col-08) includevano anche il silenziamento coordinato dei geni attribuiti al termine GO:0015979 "fotosintesi" e ad altri processi biologici correlati (FIG. 5). Questo set di DEG GO:0015979 conteneva 105 geni che erano significativamente repressi a 6 ore di vita al punto 83A:476. In questo sottoinsieme, 37 geni erano anche sottoregolati in Mandelup a 48 ore di vita e 35 allo stesso punto temporale nella popolazione 22660, inclusi 19 DEG comuni a entrambi i genotipi. Nessun DEG correlato al termine GO:0015979 è stato significativamente attivato in alcuna combinazione (linea x tempo).
Sono stati rivelati i modelli di espressione dei principali componenti del processo biologico "GO:0015979 Fotosintesi". La scala Log2 rappresenta i valori log2 (variazione in termini di volte) tra piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenuto da campi di lupino, Wizhenica, Polonia, 1999) e piante di controllo (inoculate in modo fittizio) allo stesso punto temporale. Sono state analizzate le seguenti linee di lupino a foglia stretta: 83A:476 (resistente, portatrice dell'allele omozigote Lanr1), Boregine (resistente, background genetico sconosciuto), Mandelup (moderatamente resistente, portatrice dell'allele omozigote AnMan) e Popolazione 22660 (suscettibile).
Sulla base dei risultati dell'analisi dell'espressione differenziale e presumibilmente coinvolti nelle risposte di difesa contro i funghi patogeni, questo set di sette geni è stato selezionato per la quantificazione dei profili di espressione mediante PCR in tempo reale (Tabella supplementare S9).
Il gene proteico putativo TanjilG_10657 è stato significativamente indotto in tutte le linee studiate e in tutti i punti temporali rispetto alle piante di controllo (mimiche) (Tabelle Supplementari S10, S11). Inoltre, il profilo di espressione di TanjilG_10657 ha mostrato un trend crescente nel corso dell'esperimento per tutte le linee. La popolazione 22660 ha mostrato la massima sensibilità di TanjilG_10657 all'inoculazione, con un'attivazione di 114 volte superiore e il più alto livello di espressione relativa (4,4 ± 0,4) a 24 ore di incubazione (Fig. 6a). Anche il gene proteico PR10 LlR18A TanjilG_27015 ha mostrato attivazione in tutte le linee e in tutti i punti temporali, con significatività statistica nella maggior parte dei punti dati (Fig. 6b). Analogamente a TanjilG_10657, il livello di espressione relativa più elevato di TanjilG_27015 è stato osservato nella popolazione 22660 inoculata a 24 ore di incubazione (19,5 ± 2,4). Il gene dell'endochitinasi acida TanjilG_04706 è risultato significativamente sovraregolato in tutte le linee e a tutti i tempi, ad eccezione di Boregine 6 ore di incubazione (Fig. 6c). È stato fortemente indotto al primo tempo di incubazione (6 ore di incubazione) a 83A:476 (di 10,5 volte) e moderatamente aumentato nelle altre linee (di 6,6-7,5 volte). Durante l'esperimento, l'espressione di TanjilG_04706 è rimasta a livelli simili in 83A:476 e Boregine, mentre in Mandelup e nella popolazione 22660 è aumentata significativamente, raggiungendo valori relativamente elevati (rispettivamente 5,9 ± 1,5 e 6,2 ± 1,5). Il gene TanjilG_23384, simile all'endoglucano-1,3-β-glucosidasi, ha mostrato un'elevata attivazione ai primi due punti temporali (6 e 12 ore dopo l'infezione) in tutte le linee, eccetto la popolazione 22660 (Fig. 6d). I livelli di espressione relativa più elevati di TanjilG_23384 sono stati osservati al secondo punto temporale (12 ore dopo l'infezione) in Mandelup (2,7 ± 0,3) e 83A:476 (1,5 ± 0,1). A 24 ore dopo l'infezione, l'espressione di TanjilG_23384 era relativamente bassa in tutte le linee studiate (da 0,04 ± 0,009 a 0,44 ± 0,12).
Profili di espressione di geni selezionati (ag) rivelati mediante PCR quantitativa. I numeri 6, 12 e 24 rappresentano le ore successive alla vaccinazione. I geni LanDExH7 e LanTUB6 sono stati utilizzati per la normalizzazione e LanTUB6 è stato utilizzato per la calibrazione inter-serie. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard basata su tre repliche biologiche, ciascuna delle quali è la media di tre repliche tecniche. La significatività statistica delle differenze nei livelli di espressione tra le piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenuto nel 1999 dal campo di lupini a Wierzenica, Polonia) e quelle di controllo (finta inoculazione) è indicata sopra i punti dati (*valore P < 0,05, **valore P ≤ 0,01, ***valore P ≤ 0,001). La significatività statistica delle differenze nei livelli di espressione tra le piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenuto nel 1999 dal campo di lupini a Wierzenica, Polonia) e quelle di controllo (finta inoculazione) è indicata sopra i punti dati (*valore P < 0,05, **valore P ≤ 0,01, ***valore P ≤ 0,001). Statistica statisticamente efficace nell'espressione dell'ossigeno (Colletotrichum lupini, campione Col-08, polучен в 1999 con la poesia di Lipsia Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Differenze statisticamente significative nei livelli di espressione tra piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenuto nel 1999 da un campo di lupini a Wierzhenice, Polonia) e piante di controllo (inoculate in modo fittizio) sono evidenziate sopra i punti dati (*valore P < 0,05, **valore P ≤ 0,01, ***valore P ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini, Col-08株, 1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001)。接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物 之间水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Analisi statistiche sull'espressione orale del mezzo inoculomico (Colletotrichum lupini, colonna Col-08, polученный с полей люпина в Верженице, Polьша, в 1999 г.) e controlli (loжно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Differenze statisticamente significative nei livelli di espressione tra piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenuto da campi di lupini a Verzhenice, Polonia, nel 1999) e piante di controllo (inoculate in modo fittizio) sono evidenziate sopra i punti dati (*valore P < 0,05, **valore P ≤ 0,01, ***valore P ≤ 0,001).Le linee NLL analizzate erano: 83A:476 (resistente, portatrice dell'allele omozigote Lanr1), Mandelup (moderatamente resistente, portatrice dell'allele omozigote AnMan), Boregine (resistente, background genetico sconosciuto) e popolazione 22660 (suscettibile).
Il gene candidato TanjilG_05042 al locus Lanr1 ha mostrato un pattern di espressione notevolmente diverso dai profili ottenuti dagli studi di RNA-seq (Fig. 6e). Un'attivazione significativa di questo gene è stata osservata in Mandelup e nella popolazione 22660 (rispettivamente fino a 39,7 e 11,7 volte), con conseguenti livelli di espressione relativamente elevati (rispettivamente fino a 1,4 ± 0,14 e 7,2 ± 1,3). 83A:476 ha anche rivelato una certa sovraregolazione del gene TanjilG_05042 (fino a 3,8 volte); tuttavia, i livelli di espressione relativi raggiunti (0,044 ± 0,002) erano oltre 30 volte inferiori a quelli osservati in Mandelup e nella popolazione 22660. analizzati tramite qPCR hanno mostrato differenze significative nei livelli di espressione tra i genotipi nelle varianti vaccinate in modo simulato (controllo), raggiungendo una differenza di 58 volte tra le popolazioni 22660 e 83A:476, così come tra le popolazioni 22660 e 22660. È stata ottenuta una differenza doppia tra Boregine e Mandalup.
Il gene candidato al locus AnMan, TanjilG_12861, è stato attivato in risposta alla vaccinazione in 83A:476 e Mandelup, è risultato neutro nella popolazione 22660 ed è stato downregolato in Boregine (Fig. 6f). L'espressione relativa del gene TanjilG_12861 è stata la più alta nella popolazione 83A:476 inoculata (0,14±0,01). Il gene della proteina da shock termico di classe I da 17,4 kDa, TanjilG_05080 HSP17.4, ha mostrato livelli di espressione relativa inferiori in tutti i ceppi e i punti temporali studiati (Fig. 6g). Il valore più alto è stato osservato a 24 ore di esposizione alla vaccinazione nella popolazione 22660 (0,14±0,02, un aumento di otto volte nella risposta alla vaccinazione).
Il confronto dei profili di espressione genica (Fig. 7) ha rivelato un'elevata correlazione tra TanjilG_10657 e altri quattro geni: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) e TanjilG_04706 (r = 0,79). Tali risultati potrebbero indicare una co-regolazione di questi geni durante le risposte di difesa. I geni TanjilG_12861 e TanjilG_23384 hanno mostrato profili di espressione diversi con valori del coefficiente di correlazione di Pearson inferiori (rispettivamente da 0,08 a 0,43 e da -0,19 a 0,28) rispetto ad altri geni.
Le correlazioni tra i profili di espressione genica sono state rilevate mediante PCR quantitativa. Sono state analizzate le seguenti linee di lupino a foglia stretta: 83A:476 (resistente, portatrice dell'allele omozigote Lanr1), Mandelup (moderatamente resistente, portatrice dell'allele omozigote AnMan), Boregine (resistente, background genetico sconosciuto) e Popolazione 22660 (suscettibile). Sono stati calcolati tre punti temporali (6, 12 e 24 ore dopo l'inoculazione), includendo piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenuto da campi di lupino a Wierzhenice, Polonia, nel 1999) e piante di controllo (inoculate in modo fittizio). La scala mostra il valore del coefficiente di correlazione di Pearson.
Sulla base dei dati ottenuti a 6 cavalli vapore per pollice, è stata eseguita la WGCNA su 9981 DEG identificati confrontando piante inoculate e di controllo per concentrarsi sulle risposte di difesa precoci (Tabella Supplementare S12). Sono stati individuati ventidue moduli genici (cluster) con profili di espressione correlati (positivi o negativi) tra genotipi e varianti sperimentali. In media, i livelli di espressione genica erano in discesa nell'ordine 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazione 22660 (in entrambe le varianti, tuttavia, questa tendenza era più forte nelle piante di controllo). In media, i livelli di espressione genica erano in discesa nell'ordine 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazione 22660 (in entrambe le varianti, tuttavia, questa tendenza era più forte nelle piante di controllo). Nell'espressione dell'espressione espressa da Genovese si trova in 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazione 22660 (nelle varianti standard, ovviamente, questa tendenza è stata uccisa controllo delle impostazioni). In media, i livelli di espressione genica sono diminuiti nell'ordine 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazione 22660 (in entrambe le varianti, tuttavia, questa tendenza era più forte nelle piante di controllo).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazione 22660的顺序下降（然而,在两种变体中,这种趋势在对照植物中更强）.平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> popolazione 22660 的 顺序 下降 （, 在 种 中 ， 这 种 在 在植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 Nell'espressione dell'espressione espressa da Genevo si è verificato nel 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazione 22660 (o nell'elenco delle varianti qui sotto) la tendenza era silenziosa e di controllo (pastino). In media, i livelli di espressione genica sono diminuiti nella serie 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazione 22660 (tuttavia, in entrambe le varianti, questa tendenza era più forte nelle piante di controllo).La vaccinazione ha portato a una sovraregolazione dell'espressione genica, in particolare nei moduli 18, 19, 14, 6 e 1 (in ordine decrescente di effetto), regolazione negativa (ad esempio moduli 9 e 20) o con effetti neutri (ad esempio moduli 11, 22, 8 e 13). L'analisi di arricchimento del termine GO (Tabella supplementare S13) ha rivelato "GO: 0006952 Risposte protettive" per il modulo inoculato (18) con attivazione massima, inclusi i geni analizzati mediante qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 e TanjilG_27015), così come molti dei moduli di fotosintesi più soppressi (9). Il concentratore del modulo 18 (Fig. 8) è stato identificato come il gene TanjilG_26536, che codifica per la proteina LlR18B simile a PR-10, e il concentratore del modulo 9 è stato identificato come il gene TanjilG_28955, che codifica per la proteina PsbQ del fotosistema II. Un gene candidato per la resistenza all'antracnosi, Lanr1, TanjilG_05042, è stato trovato nel modulo 22 (Fig. 9) ed è associato ai termini "GO:0044260 Processi metabolici macromolecolari cellulari" e "GO:0006355 Regolazione trascrizionale, templating del DNA", che porta l'hub TanjilG_01212. Il gene codifica per il fattore di trascrizione dello stress termico A-4a (HSFA4a).
Analisi di rete ponderata della coespressione genica di moduli con termini di processo biologico sovrarappresentati "GO: 0006952 Risposte di difesa". La legatura è stata semplificata per evidenziare i quattro geni analizzati mediante qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 e TanjilG_27015).
Analisi di rete ponderata della coespressione genica di un modulo con un termine di processo biologico sovrarappresentato "GO: 0006355: Regolazione trascrizionale, templating del DNA" e contenente un gene candidato per la resistenza all'antracnosi, Lanr1 TanjilG_05042. La legatura è stata semplificata per isolare il gene TanjilG_05042 e il gene centrale TanjilG_01212.
Lo screening di resistenza all'antracnosi condotto in Australia ha mostrato che la maggior parte delle cultivar rilasciate precocemente erano suscettibili; Kalya, Coromup e Mandelup sono state descritte come moderatamente resistenti, mentre Wonga, Tanjil e 83A:476 sono state descritte come altamente resistenti26,27,31. presentavano lo stesso allele di resistenza, denominato Lanr1, mentre Coromup e Mandelup avevano un allele diverso, denominato AnMan10, 26, 39, mentre Kalya ha trasmesso un allele diverso. , Lanr2. Lo screening per la resistenza all'antracnosi in Germania ha portato all'identificazione di una linea resistente Bo7212 con un allele candidato diverso da Lanr1, denominato LanrBo36.
Il nostro studio ha rivelato una frequenza molto bassa (circa il 6%) dell'allele Lanr1 nel germoplasma testato. Questa osservazione è coerente con i risultati dello screening del germoplasma dell'Europa orientale utilizzando i marcatori Anseq3 e Anseq4, che hanno mostrato che l'allele Lanr1 è presente solo in due linee bielorusse. Ciò suggerisce che l'allele Lanr1 non è ancora ampiamente utilizzato dai programmi di breeding locali, a differenza dell'Australia, dove è uno degli alleli chiave per il breeding assistito da marcatori. Ciò potrebbe essere dovuto al minore livello di resistenza fornito dall'allele Lanr1 nelle condizioni di campo europee rispetto al rapporto australiano. Inoltre, studi sull'antracnosi in aree ad alta piovosità in Australia hanno dimostrato che le risposte di resistenza mediate dall'allele Lanr1 potrebbero non essere efficaci in condizioni meteorologiche che favoriscono la crescita e il rapido sviluppo del patogeno19,42. Infatti, nel presente studio, alcuni sintomi di antracnosi sono stati osservati anche nei genotipi portatori dell'allele Lanr1, suggerendo che la resistenza potrebbe scomparire in condizioni ottimali per lo sviluppo di C. lupini. Inoltre, sono possibili interpretazioni falso-positive della presenza dei marcatori Anseq3 e Anseq4, che distano circa 1 cM dal locus Lanr1 28,30,43 .
Il nostro studio ha dimostrato che 83A:476, portatore dell'allele Lanr1, ha risposto all'inoculazione di C. lupini con una riprogrammazione del trascrittoma su larga scala al primo punto temporale analizzato (6 ore dopo l'infezione), mentre in Mandelup, portatore dell'allele AnMan, le risposte trascrittomiche sono state osservate molto più tardi (da 24 a 48 ore dopo l'infezione). Queste variazioni temporali nelle risposte di difesa sono associate a differenze nei sintomi della malattia, evidenziando l'importanza del riconoscimento precoce del patogeno per una risposta efficace alla resistenza. Per infettare i tessuti vegetali, le spore di antrace devono attraversare diverse fasi di sviluppo sulla superficie dell'ospite, tra cui germinazione, divisione cellulare e formazione di un appressorio. Un'appendice è una struttura infettiva che si attacca alla superficie dell'ospite e ne facilita la penetrazione nei tessuti. Pertanto, le spore di C. gloeosporioides nell'estratto di pisello hanno mostrato la prima divisione del nucleo dopo 75-90 minuti di incubazione, la formazione di un tubo germinativo dopo 90-120 minuti e la soppressione dopo 4 ore 45 . Il mango C. gloeosporioides ha mostrato oltre il 40% di germinazione conidiale dopo 3 ore di incubazione e circa il 20% di formazione di appressori dopo 4 ore. Il gene CAP20 associato alla virulenza di C. gloeosporioides ha mostrato attività trascrizionale nei conidi formanti epifite dopo 3,5 ore di incubazione nella cera di superficie di avocado con alte concentrazioni di proteina CAP20 dopo 4 ore 46 min. Analogamente, l'attività dei geni di biosintesi della melanina in C. trifolii è stata indotta durante un'incubazione di 2 ore seguita dalla formazione di un appressorio dopo 1 ora. Studi sui tessuti fogliari hanno dimostrato che le fragole inoculate con C. acutatum presentano una prima soppressione a 8 ore dopo l'infezione, mentre i pomodori inoculate con C. coccodes presentano una prima soppressione a 4 ore dopo l'infezione48,49. Ciò è ampiamente coerente con la scala temporale del processo infettivo di Colletotrichum spp. Le risposte di difesa rapide a 83A:476 suggeriscono il coinvolgimento dei geni di resistenza delle piante e dell'immunità indotta da effettori (ETI) in questa linea, mentre le risposte ritardate di Mandelup supportano l'ipotesi di immunità indotta da pattern molecolari microassociati (MTI) 50. Risposte precoci a 83A:476 e Mandelup. Anche la parziale sovrapposizione tra geni sovraregolati o sottoregolati nella risposta ritardata supporta questo concetto, poiché l'ETI è spesso considerata una risposta MTI accelerata e potenziata che culmina nella morte cellulare programmata nel sito di infezione, nota come shock anafilattico 51,52.
La maggior parte dei geni attribuiti al termine sovrarappresentato Gene Ontology GO:0006952 "Risposta di Difesa" sono gli 11 omologhi della proteina 22 del messaggio di digiuno indotto da stress (simile a SAM22) e le sette principali proteine ​​simili al lattice (MLP). Le proteine ​​31, 34, 43 e 423 hanno mostrato similarità di sequenza. I geni simili a SAM22 hanno mostrato un'attivazione significativa e di maggiore durata, evidenziando livelli più elevati di resistenza all'antracnosi (83A:476 e Boregine). Tuttavia, i geni simili a MLP sono stati downregolati solo nelle linee portanti l'allele candidato alla resistenza (83A:476/Lanr1 a 6 ore dopo l'infezione e Mandelup/AnMan a 24 ore dopo l'infezione). È importante notare che tutti gli omologhi simili a SAM22 identificati provengono da un cluster genico di circa 105 kb, mentre i geni simili a MLP provengono da regioni separate del genoma. L'attivazione coordinata di tali geni simili a SAM22 è stata riscontrata anche nel nostro precedente studio sulla resistenza dei linfociti NLL all'inoculazione di Diaporthetoxica, suggerendo che siano coinvolti nelle componenti orizzontali della risposta difensiva. Questa conclusione è supportata anche da segnalazioni di una risposta positiva dei geni simili a SAM22 a lesioni o trattamenti con acido salicilico, induttori fungini o perossido di idrogeno.
È stato dimostrato che i geni simili a MLP rispondono a vari stress abiotici e biotici, tra cui infezioni batteriche, virali e fungine patogene in molte specie vegetali55. Le direzioni di risposta a determinate interazioni tra piante e patogeni variavano da un forte aumento (ad esempio, durante l'infestazione del cotone con Verticillium dahliae) a una significativa diminuzione (ad esempio, dopo l'infezione del melo con Alternaria spp.)56,57. Una significativa downregulation del gene 423 simile a MLP è stata osservata durante le difese dell'avocado contro l'infezione da F. niger e durante l'infezione del melo. Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola e Alternaria alternata sono patotipi del melo58,59. Inoltre, i calli del melo che sovraesprimevano il gene 423 simile a MLP presentavano una minore espressione di geni associati alla resistenza ed erano più suscettibili alle infezioni fungine59. In seguito al Fusarium oxysporum f, anche il gene 423 simile a MLP è stato soppresso nel germoplasma resistente del fagiolo comune. cn. Infezione del fagiolo 60.
Altri membri della famiglia PR-10 identificati nel nostro studio di RNA-seq sono stati i geni LlR18A e LlR18B in risposta alla sovraregolazione, così come il gene sovraregolato (1 gene) o sottoregolato (3 geni) per la proteina di trasferimento lipidico DIR1. Inoltre, il WGCNA evidenzia il gene LlR18B come hub in questo modulo, che è altamente suscettibile alla vaccinazione e trasporta diversi geni di risposta protettiva. I geni LlR18A e LlR18B sono stati indotti nelle foglie di lupino giallo in risposta a batteri patogeni, così come nei fusti di NLL dopo l'inoculazione di D. toxica, mentre l'omologo di questi geni nel riso, RSOsPR10, è stato rapidamente indotto da un'infezione fungina presumibilmente coinvolta nella via di segnalazione dell'acido jasmonico53,61, 62. Il gene DIR1 codifica per proteine ​​di trasporto lipidico aspecifiche, necessarie per l'insorgenza della resistenza acquisita sistemica (SAR). Con lo sviluppo di reazioni protettive, la proteina DIR1 viene trasportata dal focolaio di infezione attraverso il floema per indurre la SAR in organi distanti. È interessante notare che il gene DIR1 di TanjilG_02313 è stato indotto significativamente al primo punto temporale nelle linee 84A:476 e nella popolazione 22660, ma la resistenza all'antracnosi si è sviluppata con successo solo nella linea 84A:476. Ciò potrebbe indicare una certa subfunzionalizzazione del gene DIR1 nell'NLL, poiché i restanti tre omologhi hanno risposto all'inoculazione solo nella linea 83A:476 a 6 ore dall'infezione e questa risposta era diretta verso il basso.
Nel nostro studio, i componenti più comuni corrispondenti al processo biologico denominato "Processo Redox GO:0055114" erano la proteina del citocromo P450, la perossidasi, l'acido linoleico 9S-/13S-lipossigenasi e l'acido 1-amminociclopropano-1-carbossilico ossidasi. Inoltre, il nostro WGCNA definisce l'omologo di HSFA4a come un hub che trasporta moduli come il gene candidato per la resistenza a Lanr1, TanjilG_05042. HSFA4a è un componente della regolazione redox-dipendente della trascrizione nucleare nelle piante.
Le proteine ​​del citocromo P450 sono ossidoreduttasi che catalizzano reazioni di idrossilazione dipendenti da NADPH e/o O₂ nel metabolismo primario e secondario, incluso il metabolismo degli xenobiotici, così come di ormoni, acidi grassi, steroli, componenti della parete cellulare, biopolimeri e la biosintesi di composti protettivi 69. Nel nostro studio, la variabilità nella funzione del citocromo P450 nelle piante è stata ridotta da -10,6 log₂ (variazione di ampiezza) a 5,7 a causa di un gran numero di omologhi alterati (37) e di differenze nei modelli di risposta tra geni specifici, riflettendo una revisione al rialzo. L'utilizzo esclusivo di dati RNA-seq per chiarire la presunta funzione biologica dei geni NLL in una superfamiglia proteica così ampia sarebbe altamente speculativo. Tuttavia, vale la pena notare che alcuni geni del citocromo P450 sono associati a una maggiore resistenza a funghi o batteri patogeni, incluso un contributo alle reazioni allergiche69,70,71.
Le perossidasi di classe III sono enzimi vegetali multifunzionali coinvolti in un'ampia gamma di processi metabolici durante la crescita e lo sviluppo delle piante, nonché in risposta a stress ambientali come salinità, siccità, elevata intensità luminosa e attacco di patogeni72. Le perossidasi sono coinvolte nell'interazione di diverse specie vegetali con Anthracis, tra cui Stylosanthes humilis e C. gloeosporioides, Lens culinaris e C. truncatum, Phaseolus vulgaris e C. lindemuthianum, Cucumis sativus e C. lagenarium73,74,75,76. La risposta è molto rapida, a volte anche a 4 ore di esposizione al sole, prima che il fungo penetri nel tessuto vegetale73. Il gene della perossidasi ha risposto anche all'inoculazione di NLL di D. toxica. Oltre alle loro tipiche funzioni di regolazione del burst ossidativo o di eliminazione dello stress ossidativo, le perossidasi possono interferire con la crescita dei patogeni creando barriere fisiche basate sul rinforzo della parete cellulare durante la lignificazione, la subunità o la reticolazione di composti specifici. Questa funzione può essere attribuita in silico al gene TanjilG_03329, che codifica per una potenziale perossidasi anionica formante lignina, che è risultata significativamente sovraregolata nel nostro studio nella linea resistente 83A:476 a 6 ore di esposizione al sole, ma non in altri ceppi e punti temporali che non hanno risposto.
La 9S-/13S-lipossigenasi dell'acido linoleico è il primo passaggio nel percorso ossidativo della biosintesi lipidica78. I prodotti di questo percorso svolgono molteplici funzioni nella difesa delle piante, tra cui il rafforzamento della parete cellulare attraverso la formazione di depositi di callosio e pectina, e la regolazione dello stress ossidativo attraverso la produzione di specie reattive dell'ossigeno79,80,81,82,83. Nel presente studio, l'espressione della 9S-/13S-lipossigenasi dell'acido linoleico è risultata alterata in tutti i ceppi, ma nella popolazione suscettibile 22660, la sovraregolazione ha prevalso in diversi punti temporali, mentre nei ceppi portatori di Lanr1 resistente e dell'allele AnMan, ciò sottolinea la diversificazione dello strato di ossilipina nelle reazioni protettive contro l'antrace tra questi genotipi.
L'omologo della 1-amminociclopropano-1-carbossilato ossidasi (ACO) è risultato significativamente sovraregolato (9 geni) o sottoregolato (2 geni) quando inoculato con lupino. Con due eccezioni, tutte queste risposte si sono verificate a 6 hp a 83A:476. La reazione enzimatica mediata dalle proteine ​​ACO è il passaggio limitante nella produzione di etilene ed è quindi altamente regolata84. L'etilene è un ormone vegetale che svolge diversi ruoli nella regolazione dello sviluppo delle piante e nella risposta a condizioni di stress abiotico e biotico. L'induzione della trascrizione di ACO e l'attivazione della via di segnalazione dell'etilene sono coinvolte nell'aumento della resistenza del riso al fungo emibiotrofico oryzae oryzae regolando la produzione di specie reattive dell'ossigeno e fitoalessine. Un processo di infezione fogliare molto simile riscontrato tra M. oryzae e C. lupini88,89, sullo sfondo di un significativo aumento degli omologhi di ACO nella linea 83A:476 riportato in questo studio, sposta la possibilità di conferire resistenza all'antracnosi NLL Etilene a un passaggio centrale di segnalazione nei percorsi molecolari.
Nel presente studio, è stata osservata una soppressione su larga scala di molti geni associati alla fotosintesi a 6 ore post-infezione in 83A:476 e a 48 ore post-infezione a Mandeloop e nella popolazione di 22660. L'entità e la progressione di questi cambiamenti sono proporzionali al livello. In questo esperimento è stata osservata resistenza all'antracnosi. Recentemente, è stata segnalata una forte e precoce repressione dei trascritti correlati alla fotosintesi in diversi modelli di interazioni pianta-patogeno, inclusi batteri e funghi patogeni. La rapidità (a partire da 2 ore post-infezione in alcune interazioni) e la soppressione globale dei geni associati alla fotosintesi in risposta all'infezione possono innescare l'immunità delle piante basata sull'impiego di specie reattive dell'ossigeno e sulla loro interazione con la via dell'acido salicilico per mediare le reazioni allergiche 90,94.
In conclusione, i meccanismi di risposta difensiva proposti per il lignaggio più resistente (83A:476) includono il rapido riconoscimento del patogeno da parte del gene R (presumibilmente TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) e la segnalazione di acido salicilico ed etilene mediata dalla risposta allergica, seguita dall'instaurarsi di SAR a lungo raggio. L'azione è supportata dalla proteina DIR-1. È opportuno notare che il periodo biotrofico per l'infezione da C. lupini è molto breve (circa 2 giorni), seguito da crescita necrotica95. La transizione tra queste fasi può essere associata a necrosi ed espressione di proteine ​​inducibili dall'etilene che agiscono come fattori scatenanti delle reazioni di ipersensibilità nelle piante ospiti. Pertanto, la finestra temporale per la cattura di C. lupini allo stadio biotrofico è molto ristretta. La riprogrammazione dei geni associati alla redox e alla fotosintesi osservata in 83A:476 a 6 ore dall'infezione è coerente con la progressione delle ife fungine e preannuncia lo sviluppo di una risposta protettiva efficace allo stadio biotrofico. Le risposte trascrittomiche di Mandelup e della popolazione 22660 potrebbero essere troppo tardive per catturare il fungo prima di passare alla crescita necrotica; tuttavia, Mandelup potrebbe essere più efficace della popolazione 22660 perché la regolazione relativamente rapida della proteina PR-10 promuove la resistenza orizzontale.
L'ETI, indotta dal gene canonico R, sembra essere un meccanismo comune per la resistenza del fagiolo all'antracnosi. Pertanto, nel modello leguminoso Medicago truncatula, la resistenza all'antracnosi è conferita dal gene RCT1, membro della classe genica R delle piante TIR-NBS-LRR97. Questo gene conferisce anche una resistenza ad ampio spettro all'antracnosi nell'erba medica quando trasferito a piante suscettibili. Nel fagiolo comune (P. vulgaris), sono stati identificati finora più di due dozzine di geni di resistenza all'antracnosi. Alcuni di questi geni si trovano in regioni prive di geni canonici R, tuttavia molti altri sono localizzati ai margini dei cromosomi che trasportano il cluster genico NBS-LRR, inclusi i geni TIR-NBS-LRR99. Lo studio SSR genomico ha anche confermato l'associazione del gene NBS-LRR con la resistenza all'antracnosi nel fagiolo comune. Il gene canonico R è stato trovato anche nella regione genomica che trasporta il principale locus di resistenza all'antracnosi nel lupino bianco 101.
Il nostro lavoro dimostra che una reazione di resistenza immediata, attivata in una fase precoce dell'infezione della pianta (preferibilmente non oltre 12 settimane di vita), protegge efficacemente il lupino a foglia stretta dall'antracnosi causata dal fungo patogeno Collelotrichum lupini. Utilizzando il sequenziamento ad alto rendimento, abbiamo dimostrato profili di espressione differenziali dei geni di resistenza all'antracnosi nelle piante di lupino a foglia stretta (LLL), mediati dai geni di resistenza Lanr1 e AnMan. Una difesa efficace implica un'attenta progettazione dei geni per le proteine ​​coinvolte nella redox, nella fotosintesi e nella patogenesi entro poche ore dal primo contatto della pianta con un patogeno. Reazioni protettive simili, ma ritardate nel tempo, sono molto meno efficaci nel proteggere le piante dalle malattie. La resistenza all'antrace mediata dal gene Lanr1 assomiglia alla tipica risposta rapida del gene R (immunità innescata da un effettore), mentre il gene AnMan fornisce molto probabilmente una risposta orizzontale (immunità innescata da un pattern molecolare associato al microbio), garantendo un livello moderato di sostenibilità.
Le 215 linee NLL utilizzate per lo screening dei marcatori di antracnosi erano composte da 74 cultivar, 60 linee ottenute per incrocio o breeding, 5 mutanti e 76 germoplasmi selvatici o originali. Le linee provenivano da 17 paesi, principalmente da Polonia (58), Spagna (47), Germania (27), Australia (26), Russia (19), Bielorussia (7), Italia (5) e altre linee da 10 paesi. Il set include anche linee resistenti di riferimento: 83A:476, Tanjil, Wonga portanti l'allele Lanr1 e Mandelup portanti l'allele AnMan. Le linee sono state ottenute dall'European Lupine Genetic Resource Database gestito da Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polonia (Tabella supplementare S1).
Le piante sono state coltivate in condizioni controllate (fotoperiodo di 16 ore, temperatura di 25 °C di giorno e 18 °C di notte). Sono state analizzate due repliche biologiche. Il DNA è stato isolato da foglie di tre settimane utilizzando il kit DNeasy Plant Mini (Qiagen, Hilden, Germania) secondo il protocollo. La qualità e la concentrazione del DNA isolato sono state valutate mediante metodi spettrofotometrici (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Sono stati analizzati il ​​marcatore AnManM1, che identifica il gene di resistenza all'antracnosi AnMan (derivato dal cv. Mandelup) e i marcatori Anseq3 e Anseq4 che fiancheggiano il gene Lanr1 (derivato dal cv. Tanjil) 11, 26, 28. Gli omozigoti per l'allele di resistenza sono stati classificati come "1", i suscettibili come "0" e gli eterozigoti come 0,5.
Sulla base dei risultati dello screening per i marcatori AnManM1, AnSeq3 e AnSeq4 e della disponibilità di semi per gli esperimenti di follow-up finali, sono state selezionate 50 linee di NLL per la fenotipizzazione della resistenza all'antracnosi. L'analisi è stata eseguita in duplicato in una serra controllata da computer con un fotoperiodo di 14 ore e un intervallo di temperatura di 22 °C durante il giorno e 19 °C di notte. I semi vengono raschiati (tagliando il tegumento sul lato opposto dell'embrione con una lama affilata) prima della semina per evitare la dormienza dei semi dovuta a un tegumento troppo duro e per garantire una germinazione uniforme. Le piante sono state coltivate in vasi (11 × 11 × 21 cm) con terreno sterile (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsavia, Polonia). L'inoculazione è stata effettuata con il ceppo Colletotrichum lupini Col-08, coltivato nel 1999 da steli di piante di lupino a foglie strette coltivate in un campo a Verzhenitsa, Grande Polonia (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Ottenere un'area. Gli isolati sono stati coltivati ​​in terreno SNA a 20° C sotto luce nera per 21 giorni per indurre la sporulazione. Quattro settimane dopo la semina, quando le piante avevano raggiunto lo stadio di 4-6 foglie, l'inoculazione è stata effettuata spruzzando una sospensione di conidi a una concentrazione di 0,5 x 106 conidi per ml. Dopo l'inoculazione, le piante sono state tenute al buio per 24 ore a un'umidità di circa il 98% e una temperatura di 25° C per facilitare la germinazione dei conidi e il processo di infezione. Le piante sono state quindi coltivate sotto un fotoperiodo di 14 ore a 22 °C giorno/19 °C notte e 70% di umidità. Il punteggio della malattia è stato calcolato 22 giorni dopo l'inoculazione e variava da 0 (immune) a 9 (molto suscettibile) a seconda della presenza o assenza di lesioni necrotiche su steli e foglie. Inoltre, dopo il punteggio, è stato misurato il peso delle piante. Le relazioni tra genotipi marcatori e fenotipi della malattia sono state calcolate come correlazioni punto-due (assenza di marcatori eterozigoti nell'insieme di linee per l'analisi del fenotipo di resistenza all'antracnosi).