Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazivat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) je mahunarka koja se koristi za proizvodnju hrane i poboljšanje tla. Globalno širenje NLL-a kao kulture privuklo je mnoge patogene gljivice, uključujući lupinsku antraknozu, koja uzrokuje razornu bolest antraknoze. Dva alela, Lanr1 i AnMan, koji daju povećanu otpornost, korištena su u oplemenjivanju NLL-a, ali temeljni molekularni mehanizmi ostaju nepoznati. U ovoj studiji, Lanr1 i AnMan markeri korišteni su za probir europskih uzoraka NLL-a. Testiranje cjepiva u kontroliranom okruženju potvrdilo je učinkovitost oba rezistentna donora. Diferencijalno profiliranje genske ekspresije provedeno je na reprezentativnim rezistentnim i osjetljivim linijama. Otpornost na antraknozu bila je povezana s prekomjernom ekspresijom termina genske ontologije „GO:0006952 Obrambeni odgovor“, „GO:0055114 Redoks proces“ i „GO:0015979 Fotosinteza“. Osim toga, linija Lanr1(83A:476) pokazala je značajno reprogramiranje transkriptoma brzo nakon inokulacije, dok su ostale linije pokazale kašnjenje u ovom odgovoru za oko 42 sata. Obrambeni odgovori povezani su s genima TIR-NBS, CC-NBS-LRR i NBS-LRR, 10 proteina uključenih u patogenezu, proteinima za prijenos lipida, endoglukan-1,3-β-glukozidazom, proteinima stanične stijenke bogatim glicinom i genima iz reaktivnog puta kisika. Rani odgovori na 83A:476, uključujući pažljivo suzbijanje gena povezanih s fotosintezom, podudarali su se s uspješnom zaštitom tijekom vegetativne faze rasta gljivične biologije, što sugerira da efektor pokreće imunitet. Mandeloopova reakcija je usporena, kao i ukupni horizontalni otpor.
Uskolisni lupin (NLL, Lupinus angustifolius L.) je žitarica s visokim udjelom proteina podrijetlom iz zapadnog Mediterana1,2. Trenutno se uzgaja kao prehrambena kultura za životinje i ljude. Također se smatra zelenim gnojivom u sustavima plodoreda zbog fiksacije dušika simbiotskim bakterijama koje fiksiraju dušik i općeg poboljšanja strukture tla. NLL je prošao brz proces domestikacije u prošlom stoljeću i još uvijek je pod velikim pritiskom uzgoja3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. S raširenim uzgojem NLL-a, sukcesija patogenih gljivica razvila je nove poljoprivredne niše i uzrokovala nove bolesti koje uništavaju usjeve. Najznačajnija za uzgajivače lupina bila je pojava antraknoze, koju uzrokuje patogena gljivica Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Najznačajnija za uzgajivače lupina bila je pojava antraknoze, koju uzrokuje patogena gljivica Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Najvažnije za uzgajivače i selekcionere lupine bila je pojava antraknoze izazvane patogenom gljivicom Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Najznačajnija za uzgajivače lupina bila je pojava antraknoze uzrokovane patogenom gljivicom Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Kosat。1 Najugroženiji za uzgajivače i selekcionere lupina je pojava antraknoze koju izaziva patogena gljivica Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Najupečatljivija za uzgajivače lupina je pojava antraknoze uzrokovane patogenom gljivicom Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Najranija izvješća o bolesti potječu iz Brazila i Sjedinjenih Država, s tipičnim simptomima koji su se pojavili 1912. odnosno 1929. godine. Međutim, nakon otprilike 30 godina, patogen je označen kao Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf vrste Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld u Celenopravnoj morfologiji. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld u ciljanoj morfologiji. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .i H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。i H. Schlenk,.Preliminarna fenotipizacija bolesti provedena sredinom 20. stoljeća pokazala je određenu otpornost kod NLL i pristupnica žutog lupina (L. luteus L.), ali sve testirane pristupnice bijelog lupina (L. albus L.) bile su vrlo osjetljive15,16. Studije su pokazale da je razvoj antraknoze povezan s povećanom količinom oborina (vlažnosti zraka) i temperaturom (u rasponu od 12-28°C), što dovodi do kršenja otpornosti na višim temperaturama17, 18. Zapravo, vrijeme potrebno za klijanje konidija i početak bolesti bilo je četiri puta kraće na 24°C (4 sata) nego na 12°C (16 sati) u uvjetima visoke vlažnosti19. Dakle, kontinuirano globalno zatopljenje dovelo je do širenja antraknoze. Međutim, bolest je uočena u Francuskoj (1982.) i Ukrajini (1983.) kao vjesnik nadolazeće prijetnje, ali ju je industrija lupina u to vrijeme očito ignorirala20,21. Nekoliko godina kasnije, ova razorna bolest proširila se cijelim svijetom i zahvatila glavne zemlje proizvođače lupina poput Australije, Poljske i Njemačke22,23,24. Nakon izbijanja antraknoze sredinom 1990-ih, opsežno probirno istraživanje rezultiralo je identifikacijom nekoliko rezistentnih donora u uzorcima NLL19. Otpornost NLL-a na antraknozu kontroliraju dva odvojena dominantna alela pronađena u različitim izvorima germplazme: Lanr1 u kultivarima Tanjil i Wonga te AnMan u kultivarima Mandalay25,26. Ovi aleli nadopunjuju molekularne markere koji podržavaju selekciju rezistentne germplazme u programima oplemenjivanja25,26,27,28,29,30. Rezistentna linija 83A:476 koja nosi alel Lanr1 križana je s osjetljivom divljom linijom P27255 kako bi se dobila RIL populacija koja se segregira za otpornost na antraknozu, što je omogućilo dodjeljivanje lokusa Lanr1 kromosomu NLL-1131, 32, 33. Usklađivanjem markera mape povezivanja s bočnih lokusa otpornosti na antraknozu s genomskim okvirom, NLL je otkrio lokaciju sva tri alela na istom kromosomu (NLL-11), ali na različitim pozicijama29,34,35. Međutim, zbog malog broja RIL-ova i velike genetske udaljenosti između markera i odgovarajućih alela, ne mogu se izvući pouzdani zaključci o njihovim temeljnim genima. S druge strane, korištenje reverzne genetike kod lupina je otežano zbog njihovog vrlo niskog regeneracijskog potencijala, što genetsku manipulaciju čini nezgrapnom37.
Razvoj domaće germplazme koja nosi željeni alel u homozigotnom stanju, kao što su 83A:476 (Lanr1) i Mandelup (AnMan), otvorio je vrata proučavanju otpornosti na antraknozu usprkos prisutnosti suprotstavljenih kombinacija alela u divljim populacijama. Mogućnosti molekularnih mehanizama. Usporedite obrambene odgovore generirane specifičnim genotipovima. Ova studija procijenila je rani transkriptomski odgovor NLL-a na cijepljenje protiv C. lupini. Prvo je pregledana europska ploča germplazme NLL-a koja sadrži 215 linija pomoću molekularnih markera koji označavaju alele Lanr1 i AnMan. Zatim je provedeno fenotipiziranje antraknoze na 50 NLL linija, prethodno odabranih za molekularne markere, pod kontroliranim uvjetima. Na temelju ovih eksperimenata, četiri linije koje se razlikuju u otpornosti na antraknozu i alelnom sastavu Lanr1/AnMan odabrane su za diferencijalno profiliranje ekspresije obrambenih gena korištenjem dva komplementarna pristupa: sekvenciranja RNA visokog protoka i kvantifikacije PCR-om u stvarnom vremenu.
Probir skupa NLL germplazme (N = 215) s markerima Lanr1 (Anseq3 i Anseq4) te AnMan (Anseq4) i AnMan (AnManM1) pokazao je da samo jedna linija (95726, blizu Salamanca-b) amplificira alel „otpornosti“ za sve markere, dok je „Prisutnost 'osjetljivih' alela“ pronašla udio svih markera u 158 (~73,5%) linija. Trinaest linija proizvelo je dva „otporna“ alela markera Lanr1, a 8 linija „otporne“ alele markera Lanr1. Alel „otpornosti“ markera AnMan (Dodatna tablica S1). Dvije linije bile su heterozigotne za marker Anseq3, a jedna heterozigotna za marker AnManM1. 42 linije (19,5%) nosile suprotne faze alela Anseq3 i Anseq4, što ukazuje na visoku učestalost rekombinacije između ova dva lokusa. Fenotipovi antraknoze u kontroliranim uvjetima (Dodatna tablica S2) pokazali su varijabilnost u otpornosti testiranih genotipova, što se odrazilo na težini antraknoze. Razlike u prosječnim rezultatima kretale su se od 1,8 (umjereno otporne) do 6,9 (osjetljive), a razlike u težini biljaka kretale su se od 0,62 (osjetljive) do 4,45 g (otporne). Postojala je značajna korelacija između vrijednosti uočenih u dva ponavljanja pokusa (0,51 za ocjenu težine bolesti, P = 0,00017 i 0,61 za težinu biljke, P < 0,0001), kao i između ova dva parametra (-0,59 i -0,77, P < 0,0001). Postojala je značajna korelacija između vrijednosti uočenih u dva ponavljanja eksperimenta (0,51 za ocjenu težine bolesti, P = 0,00017 i 0,61 za težinu biljke, P < 0,0001), kao i između ova dva parametra (-0,59 i -0,77, P < 0,0001). Utvrđena je točna korelacija između značenja koja se promatraju u dva ponovljena eksperimenta (0,51 za težinu bolesti, P = 0,00017 i 0,61 za masu biljaka, P < 0,0001), kao i između ova dva parametra (-0,59 i -0,77, R < 0,0001) 0,0001). Značajna korelacija utvrđena je između vrijednosti uočenih u dva ponavljanja pokusa (0,51 za ocjenu težine bolesti, P = 0,00017 i 0,61 za težinu biljke, P < 0,0001), kao i između ova dva parametra (-0,59 i -0,77, P < 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为0,51，P = 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间，(- 0,59 和- 0,77，P < 0,0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0,59 和– 0,59 和 – 0,59 和 – 0,59 和 - 0,77，P < 0,0001). Uočena je značajna korelacija između značenja koja se promatraju u dvije ponovljenosti (ocjena težine bolesti 0,51, P = 0,00017 i masa biljke 0,61, P <0,0001), i između ova dva parametra (-0,59 i -0,0001) 0,77, P <0,0001. Postojala je značajna korelacija između vrijednosti uočenih u duplikatu (ocjena težine bolesti 0,51, P = 0,00017 i težina biljke 0,61, P < 0,0001) i između ova dva parametra (-0,59 i -0,0001) 0,77, P < 0,0001. ).Tipični simptomi koji se vide kod osjetljivih biljaka uključuju savijanje i uvijanje stabljike koje nalikuje strukturi „pastirskog luka“, nakon čega slijede ovalne lezije s narančastim/ružičastim sporozoitima (Dodatna slika 1). Australski pristupi koji nose gene Lanr1 (83A:476 i Tanjil) i AnMan (Mandelup) umjereno su otporni, 0,0331 i 0,0036). Neke linije koje također nose „rezistentne“ alele Lanr1 i/ili AnMan pokazuju simptome bolesti.
Zanimljivo je da je nekoliko NLL linija kojima nedostaje bilo koji „rezistentni“ marker alel pokazalo visoku razinu otpornosti na antraknozu (usporedivu ili višu nego za genotipove Lanr1 ili AnMan), kao što su Boregine (P vrijednost < 0,0001 za oba parametra), Bojar (P vrijednost < 0,0001 za rezultat i 0,001 za težinu biljke) i populacija B-549/79b (P vrijednost < 0,0001 za rezultat i neznačajno za težinu). Zanimljivo je da je nekoliko NLL linija kojima nedostaje bilo koji „rezistentni“ marker alel pokazalo visoku razinu otpornosti na antraknozu (usporedivu ili višu nego za genotipove Lanr1 ili AnMan), kao što su Boregine (P vrijednost < 0,0001 za oba parametra), Bojar (P vrijednost < 0,0001 za rezultat i 0,001 za težinu biljke) i populacija B-549/79b (P vrijednost < 0,0001 za rezultat i neznačajno za težinu). Zanimljivo je da je nekoliko linija NLL, lišenih bilo kakvog «rezistentnog» markerskog alela, pokazalo visoku razinu otpornosti na antraknozu (supostavljenu ili više visoku nego za genotipe Lanr1 ili AnMan), kao što je Boregine (značaj P <0,0001 za sve parametre), Bojar (značaj P < 0,0001 za ocjene i 0,001 za masu biljaka) i populaciju B-549/79b (značenje P <0,0001 za ocjenu i nevažno za masu). Zanimljivo je da je nekoliko NLL linija kojima nedostaje bilo koji 'rezistentni' marker alel pokazalo visoku razinu otpornosti na antraknozu (usporedivu ili višu nego za genotipove Lanr1 ili AnMan), kao što su Boregine (P vrijednost < 0,0001 za oba parametra), Bojar (P vrijednost < 0,0001 za procjenu i 0,001 za težinu biljke) i populacija B-549/79b (P vrijednost < 0,0001 za procjenu i nije značajno za težinu).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar(P 值<得分为0,0001，植物重量为0,001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）。 Zanimljivo je da neki NLL sustavi koji nemaju nikakve „antigenske“ markere pokazuju visoku horizontalnu otpornost (ekvivalentnu genima Lanr1 ili AnMan ili višu), kao što su Boregine (oba parametra P < 0,0001), Bojar (P vrijednost < 0,0001, težina biljke 0,001) i soj B-549/79b (P vrijednost < 0,0001, težina nije značajna). Zanimljivo je da su neke linije NLL, lišene bilo kojih markerskih alelija «otpornosti», pokazale visoku razinu otpornosti na antraknozu (usporedno ili više, nego kod genotipa Lanr1 ili AnMan), kao što je Boregine (značaj P za sve parametre <0,0001), Bojar (značaj P <0,0001, masa biljaka 0,001) i populacija B-549/79b (ocjena P-značenje <0,0001, masa neznačajna). Zanimljivo je da su neke NLL linije kojima nedostaju aleli markera 'otpornosti' pokazale visoke razine otpornosti na antraknozu (usporedive s ili više od genotipova Lanr1 ili AnMan), kao što su Boregine (P-vrijednost za oba parametra <0,0001), Bojar (P-vrijednost <0,0001, težina biljke 0,001) i populacija B-549/79b (P-vrijednost <0,0001, težina nije značajna).Ovaj fenomen sugerira mogućnost novog genetskog izvora otpornosti, objašnjavajući uočeni nedostatak korelacije između marker genotipova i fenotipova bolesti (P-vrijednosti od ~0,42 do ~0,98). Dakle, Kolmogorov-Smirnov test pokazao je da su podaci o otpornosti na antraknozu približno normalno raspoređeni za rezultate (P-vrijednosti 0,25 i 0,11) i masu biljke (P-vrijednosti 0,47 i 0,55), što sugerira hipotezu da je uključeno više alela od Lanr1 i AnMan.
Na temelju rezultata probira na otpornost na antraknozu, za analizu transkriptoma odabrane su 4 linije: 83A:476, Boregine, Mandelup i Populacija 22660. Ove linije su ponovno testirane na otpornost na antraks u eksperimentima inokulacije sekvenciranjem RNA, pod uvjetom da su bile iste kao u prethodnom testu. Vrijednosti rezultata bile su sljedeće: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) i populacija 22660 (6,11 ± 1,29).
Protokol Illumina NovaSeq 6000 postigao je prosječno 40,5 Mread parova po uzorku (29,7 do 54,4 Mreadova) (Dodatna tablica S3). Rezultati poravnanja u referentnoj sekvenci kretali su se od 75,5% do 88,6%. Prosječna korelacija podataka o broju očitavanja između eksperimentalnih varijanti između bioloških replikata kretala se od 0,812 do 0,997 (srednja vrijednost 0,959). Od 35 170 analiziranih gena, 2917 nije pokazalo nikakvu ekspresiju, a ostalih 4785 gena je bilo izraženo na zanemarivoj razini (osnovni prosjek < 5). Od 35 170 analiziranih gena, 2917 nije pokazalo nikakvu ekspresiju, a ostalih 4785 gena je bilo izraženo na zanemarivoj razini (osnovni prosjek < 5). Od 35 170 proanaliziranih gena 2917 nije pokazalo ekspresiju, a ostalih 4785 gena ekspresirano je na neznačajnoj razini (bazno srednje <5). Od 35 170 analiziranih gena, 2917 nije pokazalo ekspresiju, a preostalih 4785 gena je eksprimirano na zanemarivoj razini (osnovni prosjek <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35.170 Od 35 170 proanaliziranih gena 2917 nije ekspresirano, a preostalih 4785 gena imalo je neznačajnu ekspresiju (bazno srednje značenje <5). Od 35 170 analiziranih gena, 2917 nije bilo eksprimirano, a preostalih 4785 gena imalo je zanemarivu ekspresiju (osnovni prosjek <5).Dakle, broj gena koji su smatrani eksprimiranim (osnovni prosjek ≥ 5) tijekom eksperimenta bio je 27.468 (78,1%) (Dodatna tablica S4).
Od prve vremenske točke, sve NLL linije reagirale su na inokulaciju C. lupini (soj Col-08) reprogramiranjem transkriptoma (Tablica 1), međutim, uočene su značajne razlike između linija. Tako je linija otpornosti 83A:476 (koja nosi gen Lanr1) pokazala značajno reprogramiranje transkriptoma u prvoj vremenskoj točki (6 hpi) s 31-69-strukim povećanjem broja izoliranih up- i down-gena u usporedbi s drugim vremenskim točkama u ovoj vremenskoj točki. Osim toga, ovaj vrh bio je kratkotrajan, jer je ekspresija samo nekoliko gena ostala značajno promijenjena u drugoj vremenskoj točki (12 hpi). Zanimljivo je da Boregine, koji je također pokazao visoku razinu otpornosti u testu cijepljenja, nije prošao kroz tako masovno transkripcijsko reprogramiranje tijekom eksperimenta. Međutim, broj različito eksprimiranih gena (DEG) bio je isti za Boregine i 83A:476 pri 12 HPI. I Mandelup i populacija 22660 pokazali su vrhove DEG-a u posljednjoj vremenskoj točki (48 l/s), što ukazuje na relativno kašnjenje u obrambenim odgovorima.
Budući da je 83A:476 prošao kroz masovno reprogramiranje transkriptoma kao odgovor na C. lupini pri 6 HPI u usporedbi sa svim ostalim linijama, ~91% DEG-ova uočenih u ovom vremenskom trenutku bilo je specifično za liniju (slika 1). Međutim, došlo je do određenog preklapanja u ranim odgovorima između proučavanih linija, budući da se 68,5%, 50,9% i 52,6% DEG-ova u Boregine, Mandelup i populaciji 22660 preklapalo s onima pronađenim u 83A:476 u određenim vremenskim točkama. Međutim, ovi DEG-ovi činili su samo mali dio (0,97–1,70%) svih DEG-ova trenutno detektiranih pomoću 83A:476. Osim toga, 11 DEG-ova iz svih linija bilo je koherentno u ovom trenutku (Dodatne tablice S4-S6), uključujući uobičajene komponente obrambenih odgovora biljaka: protein za prijenos lipida (TanjilG_32225), enzim endoglukan-1,3-β-glukozid (TanjilG_23384), dva proteina inducirana stresom poput SAM22 (TanjilG_31528 i TanjilG_31531), bazični lateks protein (TanjilG_32352) i dva strukturna proteina stanične stijenke bogata glicinom (TanjilG_19701 i TanjilG_19702). Također je postojalo relativno veliko preklapanje u transkriptomskim odgovorima između 83A:476 i Boreginea na 24 HPI (ukupno 16-38% DEG) te između Mandelupa i populacije 22660 na 48 HPI (ukupno 14-20% DEG).
Vennov dijagram prikazuje broj različito eksprimiranih gena (DEG) u linijama uskolisne lupine (NLL) inokuliranim s Colletotrichum lupini (soj Col-08 dobiven s polja lupine u Wierzhenicama, Poljska, 1999.). Analizirane NLL linije bile su: 83A:476 (rezistentna, nosi alel Lanr1), Boregine (rezistentna, nepoznata genetska pozadina), Mandelup (umjereno otporna, nosi alel AnMan) i populacija 22660 (vrlo osjetljiva). Kratica hpi označava sate nakon cijepljenja. Nulte vrijednosti su uklonjene radi pojednostavljenja grafa.
Skup prekomjerno eksprimiranih gena nakon 6 hpi analiziran je na prisutnost kanonskih R genskih domena (Dodatna tablica S7). Ova studija otkrila je transkriptomsku indukciju klasičnih gena otpornosti na bolesti samo s NBS-LRR domenama na 83A:476. Ovaj skup sastojao se od jednog TIR-NBS-LRR gena (tanjilg_05042), pet CC-NBS-LRR gena (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 i tanjilg_16162), te četiri NBS-LR, Tanjilg_16162), i četiri NBS-LRRE (tanjilg_16162), kao i četiri NBS-Lrr (tanjilg_16162) i četiri NBS-LRR (TANJILG_16162). Svi ovi geni imaju kanonske domene raspoređene u konzerviranim sekvencama. Uz gene NBS-LRR domene, nekoliko RLL kinaza aktivirano je nakon 6 hpi, i to jedna u Boregineu (TanjilG_19877), dvije u Mandelupu (TanjilG_07141 i TanjilG_19877) i u populaciji 22660 (TanjilG_09014 i TanjilG_10361) te dvije u 83A 27:476.
Geni sa značajno promijenjenom ekspresijom kao odgovor na inokulaciju s C. lupini (soj Col-08) podvrgnuti su analizi obogaćivanja Gene Ontology (GO) (Dodatna tablica S8). Najčešće prekomjerno zastupljeni termin biološkog procesa bio je „GO:0006952 obrambeni odgovor“ koji se pojavio u 6 od 16 kombinacija (vrijeme × linija) s visokom značajnošću (P vrijednost < 0,001) (slika 2). Najčešće prekomjerno zastupljeni termin biološkog procesa bio je „GO:0006952 obrambeni odgovor“ koji se pojavio u 6 od 16 kombinacija (vrijeme × linija) s visokom značajnošću (P vrijednost < 0,001) (slika 2). Najčešće izmjereno prikazan termin biološkog procesa bio je «GO: 0006952 zaštitni odgovor», koji se pojavio u 6 od 16 (vrijeme × linija) kombinacije s visokom značajnošću (značenje P <0,001) (slika 2). Najčešće prekomjerno zastupljeni termin biološkog procesa bio je 'GO:0006952 obrambeni odgovor', koji se pojavio u 6 od 16 kombinacija (vrijeme × loza) s visokom značajnošću (P vrijednost < 0,001) (slika 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 Najreprezentativniji termin biološkog procesa je „GO:0006952 obrambeni odgovor“, koji se pojavljuje u 6 od 16 kombinacija (时间×线), s visokom značajnošću (P-vrijednost < 0,001) (图2). Najčešće izmjereno prikazan termin biološkog procesa bio je «GO: 0006952 obrambeni odgovor», koji se pojavio u 6 od 16 kombinacija (vrijeme × linija) s visokom značajnošću (značenje P <0,001) (slika 2). Najčešće prekomjerno zastupljeni termin biološkog procesa bio je 'GO:0006952 Obrambeni odgovor', koji se pojavio u 6 od 16 kombinacija (vrijeme × linija) s visokom značajnošću (P vrijednost < 0,001) (slika 2).Ovaj je pojam bio prekomjerno zastupljen u dvije vremenske točke u 83A: 476 i Boregine (6 i 24 hpi) te u jednoj vremenskoj točki u Mandelup i populaciji 22660 (12 i 6 hpi). Ovo je očekivani rezultat, koji ističe antifungalni odgovor rezistentnih linija. Osim toga, 83A:476 je reagirao na C. lupini brzom indukcijom gena povezanih s oksidativnim naletom predstavljenim pojmom „GO:0055114 redoks proces“, što ukazuje na specifičan obrambeni odgovor, dok je Boregine pokazao specifične obrambene odgovore povezane s pojmom 'GO'. :0006950 Odgovor na stres”. Populacija 22660 aktivirala je horizontalni odgovor otpora koji uključuje sekundarne metabolite, ističući prekomjeran broj termina „GO:0016104 Proces biosinteze triterpena” i „GO:0006722 Proces metabolizma triterpena” (oba termina pripadaju istom skupu gena), uzimajući u obzir rezultate analize obogaćivanja GO termina, stabilnost Mandelupove reakcije bila je između Boregine i populacije 22660. Osim toga, rana reakcija 83A:476 (6 hpi) i odgođena reakcija Mandelupa i populacije 22660 uključuju termin GO:0015979 'fotosinteza' i druge povezane biološke procese.
Termini bioprocesne ontologije gena odabrani u anotaciji različito eksprimiranih gena tijekom transkriptomskih odgovora uskolisne lupine (NLL) inokulirane antraksnim lupinom (soj Col-08 dobiven s polja lupine u Wierzhenicama, Poljska, 1999.) uvelike su pretjerani. Analizirane NLL linije bile su: 83A:476 (rezistentna, nosi homozigotni alel Lanr1), Boregine (rezistentna, nepoznata genetska pozadina), Mandelup (umjereno rezistentna, nosi homozigotni alel AnMan) i populacija 22660 (osjetljiva).
Budući da je cilj ove studije bio identificirati gene koji doprinose otpornosti na antraknozu, geni dodijeljeni pojmovima GO „GO: 0006952 Obrambeni odgovori“ i „GO: 0055114 Redoks procesi“ analizirani su s graničnim vrijednostima od početnih vrijednosti ≥ 30 s barem jednom linijom. × vremenska točka koja kombinira statistički značajne vrijednosti log2 (promjena omjera). Broj gena koji zadovoljavaju ove kriterije bio je 65 za GO:0006952 i 524 za GO:0055114.
83A:476 otkrio je dva DEG vrha označena terminom GO:0006952, prvi na 6 gena po inču (64 gena, regulacija prema gore i dolje), a drugi na 24 gena po inču (15 gena, samo regulacija prema gore). Boregine je također pokazao da je GO:0006952 dosegao vrh u istoj vremenskoj točki, ali s manje DEG-a (11 i 8) i preferencijalnom aktivacijom. Mandeloop je pokazao dva vrha GO:0006952 na 12 i 48 HPI, oba s 12 gena (prvi s aktivirajućim genima, a drugi samo sa supresivnim genima), dok je populacija 22660 na 6 HPI (13 gena) imala veću prevlast povećanja vrha. Treba napomenuti da je 96,4% GO:0006952 DEG u tim vrhovima imalo istu vrstu odgovora (gore ili dolje), što ukazuje na značajno preklapanje u obrambenim odgovorima unatoč razlikama u broju uključenih gena. Najveća skupina sekvenci povezanih s pojmom GO:0006952 kodira protein 22 povezan s gladovanjem i stresom (SAM22-like), koji pripada proteinskoj kladi PR-10 (pathogenesis-associated protein) klase 10 i proteinu sličnom MLP-u (MLP-like protein) (slika 3). Dvije skupine razlikovale su se po prirodi ekspresije i smjeru odgovora. Geni koji kodiraju proteine ​​slične SAM22 pokazali su dosljednu i značajnu indukciju u ranim vremenskim točkama (6 ili 12 hpi) i općenito nisu reagirali na kraju eksperimenta (48 hpi), dok su proteini slični MLP-u pokazali koordinaciju na 6 hpi, 83A:476 i Mandelup na 48 hp/in, gotovo sve ostale podatkovne točke nisu reagirale. Osim toga, razlike u profilima ekspresije gena proteina sličnih SAM22 pratile su uočenu varijabilnost u otpornosti na antraknozu, jer su otpornije linije imale više vremenskih točaka koje značajno induciraju ove gene od osjetljivijih gena. Drugi PR-10 gen sličan LlR18A/B pokazao je vrlo sličan obrazac ekspresije kao i gen proteina sličan SAM22.
Identificirane su glavne komponente termina biološkog procesa „GO:0006952 Obrambeni odgovor“ i obrasci ekspresije kandidatskih gena alela Lanr1 i AnMan. Log2 skala predstavlja log2 vrijednosti (promjena omjera) između inokuliranih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobiven s polja lupine, Wizhenica, Poljska, 1999.) i kontrolnih (lažno inokuliranih) biljaka u istom vremenskom trenutku. Analizirane su sljedeće linije uskolisne lupine: 83A:476 (otporna, nosi homozigotni alel Lanr1), Boregine (otporna, nepoznata genetska pozadina), Mandelup (umjereno otporna, nosi homozigotni alel AnMan) i Populacija 22660 (osjetljiva).
Osim toga, procijenjeni su profili ekspresije RNA-seq kandidatskih gena Lanr1 (TanjilG_05042) i AnMan (TanjilG_12861) (slika 3). Gen TanjilG_05042 pokazao je značajan odgovor (aktivaciju) u 83A:476 samo u prvoj vremenskoj točki (6 hpi), dok je TanjilG_12861 bio značajan u Mandeloopu samo u dvije vremenske točke: 6 hpi (smanjena regulacija) i 24 hpi (6 hpi). S.). podesivim) ).
Najviše prekomjerno eksprimirani geni u terminu GO:0055114 „redoks proces“ bili su geni koji kodiraju proteine ​​citokroma P450 i peroksidazu (slika 4). Za uzorke izolirane iz 83A:476 pri 6 HPI, maksimalne ili minimalne log2 (promjena omjera) vrijednosti (za 86,6% gena) općenito su uočene između inokuliranih i kontrolnih biljaka, što ističe visok odgovor ovog genotipa na inokulirajući spol. 83A:476 pokazao je najznačajniji GO:0055114 DEG pri 6 hpi (503 gena), dok su ostale linije pri 48 hpi (Boregine, 31 gen; Mandelup, 85 gena; i Populacija 22660, 78 gena)). U većini gena porodice GO:0055114 uočene su dvije vrste odgovora na cijepljenje (aktivacija i inhibicija). Zanimljivo je da je do 97,6% DEG-ova identificirano za termin GO: 0055114 u Mandelupeu pri 48 hp. Ova opažanja sugeriraju da je, unatoč značajno manjem opsegu (tj. broju mutiranih redoks gena, 85 naspram 503), obrazac odgođenih transkriptomskih odgovora mandelupa na antraknozu sličan ranom odgovoru 83A:476. U Boregineu i populaciji 22660 ova konvergencija je niža, 51,6% odnosno 75,6%.
Otkriveni su obrasci ekspresije glavnih komponenti termina biološkog procesa „GO:0055114 Redoks proces“. Log2 skala predstavlja log2 vrijednosti (promjena struka) između inokuliranih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobiven s polja lupine, Wizhenica, Poljska, 1999.) i kontrolnih (lažno inokuliranih) biljaka u istoj vremenskoj točki. Analizirane su sljedeće linije uskolisne lupine: 83A:476 (otporna, nosi homozigotni alel Lanr1), Boregine (otporna, nepoznata genetska pozadina), Mandelup (umjereno otporna, nosi homozigotni alel AnMan) i Populacija 22660 (osjetljiva).
83A:476 Transkriptomski odgovori na inokulaciju s C. lupini (soj Col-08) također su uključivali koordinirano utišavanje gena pripisanih terminu GO:0015979 "fotosinteza" i drugim srodnim biološkim procesima (SLIKA 5). Ovaj GO:0015979 DEG skup sadržavao je 105 gena koji su bili značajno potisnuti nakon 6 hpi kod 83A:476. U ovom podskupu, 37 gena je također bilo smanjeno u Mandelupu nakon 48 HPI i 35 u istoj vremenskoj točki u populaciji od 22660, uključujući 19 DEG zajedničkih za oba genotipa. Nijedan DEG povezan s terminom GO: 0015979 nije bio značajno aktiviran ni u jednoj kombinaciji (linija x vrijeme).
Otkriveni su obrasci ekspresije glavnih komponenti termina biološkog procesa „GO:0015979 Fotosinteza“. Log2 skala predstavlja log2 vrijednosti (promjena struka) između inokuliranih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobiven s polja lupine, Wizhenica, Poljska, 1999.) i kontrolnih (lažno inokuliranih) biljaka u istom vremenskom trenutku. Analizirane su sljedeće linije uskolisne lupine: 83A:476 (otporna, nosi homozigotni alel Lanr1), Boregine (otporna, nepoznata genetska pozadina), Mandelup (umjereno otporna, nosi homozigotni alel AnMan) i Populacija 22660 (osjetljiva).
Na temelju rezultata analize diferencijalne ekspresije i vjerojatno uključenih u obrambene odgovore protiv patogenih gljivica, ovaj skup od sedam gena odabran je za kvantifikaciju profila ekspresije pomoću PCR-a u stvarnom vremenu (Dodatna tablica S9).
Pretpostavljeni proteinski gen TanjilG_10657 značajno je induciran u svim proučavanim linijama i vremenskim točkama u usporedbi s kontrolnim (mimičkim) biljkama (Dodatne tablice S10, S11). Osim toga, profil ekspresije TanjilG_10657 pokazao je rastući trend tijekom eksperimenta za sve linije. Populacija 22660 pokazala je najveću osjetljivost TanjilG_10657 na inokulaciju sa 114-strukom aktivacijom i najvišom relativnom razinom ekspresije (4,4 ± 0,4) na 24 HPI (slika 6a). Gen proteina PR10 LlR18A TanjilG_27015 također je pokazao aktivaciju na svim linijama i vremenskim točkama, sa statističkom značajnošću na većini podatkovnih točaka (slika 6b). Slično kao kod TanjilG_10657, najviša relativna razina ekspresije TanjilG_27015 uočena je u inokuliranoj populaciji 22660 na 24 HPI (19,5 ± 2,4). Gen kisele endohitinaze TanjilG_04706 bio je značajno povišen u svim linijama i u svim vremenskim točkama osim kod Boregine 6 hpi (slika 6c). Snažno je induciran u prvoj vremenskoj točki (6 HPI) kod 83A:476 (za 10,5 puta) i umjereno povećan u ostalim linijama (za 6,6-7,5 puta). Tijekom eksperimenta, ekspresija TanjilG_04706 ostala je na sličnim razinama kod 83A:476 i Boregine, dok se kod Mandelup i populacije 22660 značajno povećala, dosegnuvši relativno visoke vrijednosti (5,9 ± 1,5 odnosno 6,2 ± 1,5). Gen sličan endoglukan-1,3-β-glukozidazi TanjilG_23384 pokazao je visoku aktivaciju u prve dvije vremenske točke (6 i 12 hpi) u svim linijama osim populacije 22660 (slika 6d). Najviše relativne razine ekspresije TanjilG_23384 uočene su u drugoj vremenskoj točki (12 hpi) u Mandelupu (2,7 ± 0,3) i 83A:476 (1,5 ± 0,1). Pri 24 HPI, ekspresija TanjilG_23384 bila je relativno niska u svim proučavanim linijama (od 0,04 ± 0,009 do 0,44 ± 0,12).
Profili ekspresije odabranih gena (ag) otkriveni kvantitativnom PCR-om. Brojevi 6, 12 i 24 predstavljaju sate nakon cijepljenja. Geni LanDExH7 i LanTUB6 korišteni su za normalizaciju, a LanTUB6 je korišten za interserijsku kalibraciju. Trake pogreške predstavljaju standardnu ​​devijaciju na temelju tri biološka ponavljanja, od kojih je svako prosjek tri tehnička ponavljanja. Statistička značajnost razlika u razinama ekspresije između inokuliranih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobiven 1999. s polja lupine u Wierzenici, Poljska) i kontrolnih (lažno inokuliranih) biljaka označena je iznad podatkovnih točaka (*P vrijednost < 0,05, **P vrijednost ≤ 0,01, ***P vrijednost ≤ 0,001). Statistička značajnost razlika u razinama ekspresije između inokuliranih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobiven 1999. s polja lupine u Wierzenici, Poljska) i kontrolnih (lažno inokuliranih) biljaka označena je iznad podatkovnih točaka (*P vrijednost < 0,05, **P vrijednost ≤ 0,01, ***P vrijednost ≤ 0,001). Statistička značajnost razlike u razini ekspresije između inokuliranih (Colletotrichum lupini, grm Col-08, dobiveno 1999 g. s polja lupine u Verženicama, Poljska) i kontrolnih (ložno inokuliranih) biljaka označenih nad točkama podataka (*značenje P < 0,05, **značenje P ≤ 0,01, ***značenje P ≤ 0,001). Statistički značajne razlike u razinama ekspresije između inokuliranih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobiven 1999. s polja lupine u Wierzhenicama, Poljska) i kontrolnih (lažno inokuliranih) biljaka navedene su iznad podatkovnih točaka (*P-vrijednost < 0,05, **P-vrijednost ≤ 0,01, ***P-vrijednost ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Statistički značajne razlike u razini ekspresije između inokuliranih (Colletotrichum lupini, stamm Col-08, dobiveno s poljima lupine u Verženicama, Poljska, 1999.) i kontrolnih (ložno inokuliranih) biljaka označenih nad točkama vrijednosti podataka (* P < 0,05, ** P-značenje ≤ 0,01, ***P-značenje ≤ 0,001). Statistički značajne razlike u razinama ekspresije između inokuliranih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobiven s polja lupine u Verzhenicama, Poljska, 1999.) i kontrolnih (lažno inokuliranih) biljaka navedene su iznad podatkovnih točaka (*P-vrijednost < 0,05, **P-vrijednost ≤ 0,01, ***P-vrijednost ≤ 0,001).Analizirane NLL linije bile su: 83A:476 (rezistentna, nosi homozigotni alel Lanr1), Mandelup (umjereno rezistentna, nosi homozigotni alel AnMan), Boregine (rezistentna, nepoznata genetska pozadina) i populacija 22660 (osjetljiva).
Kandidatni gen TanjilG_05042 na lokusu Lanr1 pokazao je značajno drugačiji obrazac ekspresije od profila dobivenih iz RNA-seq studija (slika 6e). Značajna aktivacija ovog gena uočena je u Mandelupu i populaciji 22660 (do 39,7 odnosno 11,7 puta), što je rezultiralo relativno visokim razinama ekspresije (do 1,4 ± 0,14 odnosno 7,2 ± 1,3). 83A:476 također je otkrio određenu pojačanu regulaciju gena TanjilG_05042 (do 3,8 puta), međutim, postignute relativne razine ekspresije (0,044 ± 0,002) bile su više od 30 puta niže od onih uočenih u Mandelupu i populaciji 22660. analizirani qPCR-om pokazali su značajne razlike u razinama ekspresije između genotipova u lažno cijepljenim (kontrolnim) varijantama, dosegnuvši 58-struku razliku između populacija 22660 i 83A:476, kao i između populacija 22660 i 22660. Dvostruka razlika postignuta je između Boregine i Mandalup.
Kandidatni gen na AnMan lokusu, TanjilG_12861, aktiviran je kao odgovor na cijepljenje u populaciji 83A:476 i Mandelup, bio je neutralan u populaciji 22660, a smanjen u populaciji Boregine (slika 6f). Relativna ekspresija gena TanjilG_12861 bila je najviša u inokuliranom soju 83A:476 (0,14 ± 0,01). Gen za protein toplinskog šoka klase I od 17,4 kDa, TanjilG_05080 HSP17.4, pokazao je niže relativne razine ekspresije u svim proučavanim sojevima i vremenskim točkama (slika 6g). Najviša vrijednost uočena je nakon 24 HPI u populaciji 22660 (0,14 ± 0,02, osmerostruko povećanje odgovora na cijepljenje).
Usporedba profila ekspresije gena (slika 7) otkrila je visoku korelaciju između TanjilG_10657 i četiri druga gena: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) i TanjilG_04706 (r = 0,79). Takvi rezultati mogu ukazivati ​​na koregulaciju ovih gena tijekom obrambenih odgovora. Geni TanjilG_12861 i TanjilG_23384 pokazali su različite profile ekspresije s nižim vrijednostima Pearsonovog koeficijenta korelacije (od 0,08 do 0,43 i -0,19 do 0,28) u usporedbi s drugim genima.
Korelacije između profila ekspresije gena detektirane su kvantitativnom PCR metodom. Analizirane su sljedeće linije uskolisne lupine: 83A:476 (rezistentna, nosi homozigotni alel Lanr1), Mandelup (umjereno rezistentna, nosi homozigotni alel AnMan), Boregine (rezistentna, nepoznata genetska pozadina) i Populacija 22660 (osjetljiva). Izračunate su tri vremenske točke (6, 12 i 24 sata nakon inokulacije), uključujući inokulirane (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobiven s polja lupine u Wierzhenicama, Poljska, 1999.) i kontrolne (lažno inokulirane) biljke. Ljestvica prikazuje vrijednost Pearsonovog koeficijenta korelacije.
Na temelju podataka dobivenih pri 6 konjskih snaga po inču, WGCNA je provedena na 9981 DEG identificiranih usporedbom inokuliranih i kontrolnih biljaka kako bi se usredotočilo na rane obrambene odgovore (Dodatna tablica S12). Pronađena su dvadeset dva genska modula (klastera) s koreliranim (pozitivnim ili negativnim) profilima ekspresije između genotipova i eksperimentalnih varijanti. U prosjeku, razine ekspresije gena bile su silazne redoslijedom 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (međutim, u obje varijante ovaj je trend bio jači u kontrolnim biljkama). U prosjeku, razine ekspresije gena bile su silazne redoslijedom 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (međutim, u obje varijante ovaj je trend bio jači u kontrolnim biljkama). U srednjoj razini ekspresije gena smanjile su se u redoslijedu 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (u obje varijante, međutim, ta je tendencija bila silnija u kontrolnim rastenjima). U prosjeku, razine ekspresije gena smanjivale su se redoslijedom 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (međutim, u obje varijante ovaj je trend bio jači u kontrolnim biljkama).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> stanovništvo 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种在 在 植物 中 更）...... U srednjoj razini ekspresije gena smanjile su se u nizu 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (za razliku od ostalih varijanti ova tendencija je bila silnija u kontrolnim rastenjima). U prosjeku, razine ekspresije gena smanjile su se u seriji 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (međutim, u obje varijante ovaj je trend bio jači u kontrolnim biljkama).Cijepljenje je rezultiralo pojačanom ekspresijom gena, posebno u modulima 18, 19, 14, 6 i 1 (u silaznom redoslijedu učinka), negativnom regulacijom (npr. moduli 9 i 20) ili neutralnim učincima (npr. moduli 11, 22, 8 i 13). Analiza obogaćivanja GO termina (Dodatna tablica S13) otkrila je „GO: 0006952 Zaštitne odgovore“ za inokulirani modul (18) s maksimalnom aktivacijom, uključujući gene analizirane qPCR-om (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 i TanjilG_27015), kao i mnoge module fotosinteze koji su najviše potisnuti inokulacijom (9). Koncentrator modula 18 (slika 8) identificiran je kao gen TanjilG_26536 koji kodira protein LlR18B sličan PR-10, a koncentrator modula 9 identificiran je kao gen TanjilG_28955 koji kodira protein fotosustava II PsbQ. Kandidatni gen otpornosti na antraknozu Lanr1, TanjilG_05042, pronađen je u modulu 22 (slika 9) i povezan je s pojmovima „GO:0044260 Stanični makromolekularni metabolički procesi“ i „GO:0006355 Transkripcijska regulacija, izrada predložaka DNA“ koji nose čvorište TanjilG_01212. Gen kodira transkripcijski faktor toplinskog stresa A-4a (HSFA4a).
Analiza ponderirane mreže koekspresije gena modula s prekomjerno zastupljenim terminima bioloških procesa „GO: 0006952 Obrambeni odgovori“. Ligacija je pojednostavljena kako bi se istaknula četiri gena analizirana qPCR-om (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 i TanjilG_27015).
Analiza ponderirane mreže koekspresije gena modula s prekomjerno zastupljenim terminom biološkog procesa „GO: 0006355: Transkripcijska regulacija, DNA templating“ i koji nosi kandidatski gen otpornosti na antraknozu Lanr1 TanjilG_05042. Ligacija je pojednostavljena kako bi se izolirao gen TanjilG_05042 i središnji gen TanjilG_01212.
Probir na otpornost na antraknozu prikupljen u Australiji pokazao je da je većina rano priznatih kultivara bila osjetljiva; Kalya, Coromup i Mandelup opisani su kao umjereno otporni, dok su Wonga, Tanjil i 83A:476 opisani kao visoko otporni26,27,31. imali su isti alel otpornosti, označen kao Lanr1, a Coromup i Mandelup imali su drugačiji alel, označen kao AnMan10, 26, 39, dok je Kalya prenijela drugačiji alel, Lanr2. Probir na otpornost na antraknozu u Njemačkoj rezultirao je identifikacijom otporne linije Bo7212 s kandidatskim alelom koji nije Lanr1, označen kao LanrBo36.
Naša studija otkrila je vrlo nisku učestalost (oko 6%) alela Lanr1 u testiranoj germplazmi. Ovo opažanje je u skladu s rezultatima probira istočnoeuropske germplazme korištenjem markera Anseq3 i Anseq4, koji su pokazali da je alel Lanr1 prisutan samo u dvije bjeloruske linije. To sugerira da alel Lanr1 još nije široko korišten u lokalnim programima oplemenjivanja, za razliku od Australije, gdje je jedan od ključnih alela za oplemenjivanje uz pomoć markera. To može biti zbog niže razine otpornosti koju pruža alel Lanr1 u europskim terenskim uvjetima u usporedbi s australskim izvješćem. Osim toga, studije antraknoze u područjima s visokim količinama oborina u Australiji pokazale su da odgovori otpornosti posredovani alelom Lanr1 možda neće biti učinkoviti u vremenskim uvjetima koji pogoduju rastu i brzom razvoju patogena19,42. Zapravo, u ovoj studiji, neki simptomi antraknoze uočeni su i kod genotipova koji nose alel Lanr1, što sugerira da otpornost može nestati pod optimalnim uvjetima za razvoj C. lupini. Osim toga, moguća su lažno pozitivna tumačenja prisutnosti Anseq3 i Anseq4 markera, koji su približno 1 cM udaljeni od lokusa Lanr1 28,30,43.
Naša studija pokazala je da je 83A:476, koji nosi alel Lanr1, reagirao na inokulaciju C. lupini reprogramiranjem transkriptoma velikih razmjera u prvoj analiziranoj vremenskoj točki (6 hpi), dok su kod Mandelupa, koji nosi alel AnMan, transkriptomski odgovori uočeni mnogo kasnije (od 24 do 48 hp). Ove vremenske varijacije u obrambenim odgovorima povezane su s razlikama u simptomima bolesti, što naglašava važnost ranog prepoznavanja patogena za uspješan odgovor na otpornost. Da bi zarazile biljno tkivo, spore antraksa moraju proći kroz nekoliko razvojnih faza na površini domaćina, uključujući klijanje, diobu stanica i stvaranje apresorija. Dodatak je infektivna struktura koja se pričvršćuje na površinu domaćina i olakšava prodiranje u tkiva domaćina. Dakle, spore C. gloeosporioides u ekstraktu graška pokazale su prvu diobu jezgre nakon 75-90 minuta inkubacije, stvaranje zametne cijevi nakon 90-120 minuta i supresiju nakon 4 sata 45. Mango C. gloeosporioides pokazao je više od 40% klijanja konidija nakon 3 sata inkubacije i oko 20% stvaranja apresora nakon 4 sata. Gen C. gloeosporioides povezan s virulencijom pokazao je transkripcijsku aktivnost u konidijama koje stvaraju epifite nakon 3,5 sata inkubacije u površinskom vosku avokada s visokim koncentracijama proteina CAP20 nakon 4 sata i 46 minuta. Slično tome, aktivnost gena biosinteze melanina u C. trifolii inducirana je tijekom 2-satne inkubacije, nakon čega je uslijedilo stvaranje apresorija nakon 1 sata. Studije tkiva lista pokazale su da jagode inokulirane s C. acutatum imaju prvu supresiju nakon 8 sati nakon infektivnog procesa, dok rajčice inokulirane s C. coccodes imaju prvu supresiju nakon 4 sata nakon infektivnog procesa48,49, što je uvelike u skladu s vremenskom ljestvicom zaraznog procesa Colletotrichum spp. Brzi obrambeni odgovori na 83A:476 sugeriraju uključenost gena otpornosti biljaka i gena imuniteta potaknutog efektorima (ETI) u ovoj liniji, dok Mandelupovi odgođeni odgovori podupiru hipotezu o imunitetu potaknutom efektorima (MTI) s mikro-povezanim molekularnim obrascem 50. Rani odgovori na 83A: 476 i Mandelupa. Djelomično preklapanje između gena s pojačanom ili smanjenom regulacijom u odgođenom odgovoru također podupire ovaj koncept, budući da se ETI često smatra ubrzanim i pojačanim MTI odgovorom koji kulminira programiranom staničnom smrću na mjestu infekcije, poznatom kao anafilaktički šok 51,52.
Većina gena koji se pripisuju prekomjerno zastupljenom terminu Gene Ontology GO:0006952 „Obrambeni odgovor“ su 11 homologa proteina stresom induciranog posta 22 (slično SAM22) i sedam glavnih proteina sličnih lateks proteinima (MLP) 31, 34, 43 i 423 pokazali su sličnost sekvenci. Geni slični SAM22 pokazali su značajnu aktivaciju koja je trajala dulje, pokazujući povećane razine otpornosti na antraknozu (83A:476 i Boregine). Međutim, geni slični MLP-u bili su smanjeno regulirani samo u linijama koje nose kandidatski alel otpornosti (83A:476/Lanr1 nakon 6 hpi i Mandelup/AnMan nakon 24 hpi). Treba napomenuti da svi identificirani homolozi slični SAM22 potječu iz genskog klastera koji se proteže na približno 105 kb, dok geni slični MLP-u potječu iz odvojenih regija genoma. Koordinirana aktivacija takvih gena sličnih SAM22 također je pronađena u našoj prethodnoj studiji otpornosti NLL-a na inokulaciju Diaporthetoxica, što sugerira da su uključeni u horizontalne komponente obrambenog odgovora. Ovaj zaključak također podupiru izvješća o pozitivnom odgovoru gena sličnih SAM22 na ozljedu ili liječenje salicilnom kiselinom, induktorima gljivica ili vodikovim peroksidom.
Pokazalo se da geni slični MLP-u reagiraju na različite abiotske i biotičke stresove, uključujući bakterijske, virusne i patogene gljivične infekcije kod mnogih biljnih vrsta55. Smjerovi odgovora na određene interakcije između biljaka i patogena kretali su se od snažnog povećanja (tj. tijekom zaraze pamuka s Verticillium dahliae) do značajnog smanjenja (tj. nakon infekcije stabla jabuke s Alternaria spp.)56,57. Značajno smanjenje ekspresije gena 423 sličnog MLP-u uočeno je tijekom obrane avokada od infekcije F. niger te tijekom infekcije stabla jabuke. Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola i Alternaria alternata su patotipovi jabuke58,59. Osim toga, kalusi jabuke koji prekomjerno eksprimiraju gen 423 sličan MLP-u imali su nižu ekspresiju gena povezanih s otpornošću i bili su osjetljiviji na gljivične infekcije59. Nakon Fusarium oxysporum f, gen 423 sličan MLP-u također je bio potisnut u rezistentnoj germplazmi običnog graha. cn. Infekcija graha 60.
Drugi članovi obitelji PR-10 identificirani u našoj studiji RNA-seq bili su geni LlR18A i LlR18B kao odgovor na pojačanu regulaciju, kao i pojačano (1 gen) ili smanjeno (3 gena) gen za protein za prijenos lipida DIR1. Osim toga, WGCNA ističe gen LlR18B kao središte u ovom modulu, koji je vrlo osjetljiv na cijepljenje i nosi nekoliko gena zaštitnog odgovora. Geni LlR18A i LlR18B inducirani su u listovima žutog lupina kao odgovor na patogene bakterije, kao i u stabljikama NLL nakon inokulacije D. toxica, dok je rižin homolog ovih gena, RSOsPR10, brzo induciran gljivičnom infekcijom vjerojatno uključenom u signalni put jasmonske kiseline53,61,62. Gen DIR1 kodira nespecifične proteine ​​za prijenos lipida koji su potrebni za nastanak sistemske stečene otpornosti (SAR). Razvojem zaštitnih reakcija, protein DIR1 se transportira iz žarišta infekcije kroz floem kako bi izazvao SAR u udaljenim organima. Zanimljivo je da je gen TanjilG_02313 DIR1 značajno induciran u prvoj vremenskoj točki u linijama 84A:476 i populaciji 22660, ali se otpornost na antraknozu uspješno razvila samo u liniji 84A:476. To može ukazivati ​​na određenu subfunkcionalizaciju gena DIR1 u NLL-u, budući da su preostala tri homologa reagirala na inokulaciju samo u liniji 83A:476 nakon 6 hpi, a taj je odgovor bio usmjeren prema dolje.
U našoj studiji, najčešće komponente koje odgovaraju biološkom procesu nazvanom „GO:0055114 Redoks proces“ bile su protein citokroma P450, peroksidaza, linolna kiselina 9S-/13S-lipoksigenaza i 1-aminociklopropan-1-karboksilna kiselina oksidaza. Osim toga, naša WGCNA definira homolog HSFA4a kao čvorište koje nosi module poput kandidata gena otpornosti na Lanr1 TanjilG_05042. HSFA4a je komponenta redoks-ovisne regulacije nuklearne transkripcije u biljkama.
Proteini citokroma P450 su oksidoreduktaze koje kataliziraju NADPH i/ili O2-ovisne reakcije hidroksilacije u primarnom i sekundarnom metabolizmu, uključujući metabolizam ksenobiotika, kao i hormona, masnih kiselina, sterola, komponenti stanične stijenke, biopolimera i biosintezu zaštitnih spojeva 69. U našoj studiji, varijabilnost funkcije biljnog citokroma P450 smanjena je s -10,6 log2 (promjena puta) na 5,7 zbog velikog broja promijenjenih homologa (37) i razlika u obrascima odgovora između specifičnih gena, što odražava reviziju prema gore. Korištenje samo podataka RNA-sekvenciranja za razjašnjenje pretpostavljene biološke funkcije NLL gena u tako velikoj proteinskoj superfamiliji bilo bi vrlo spekulativno. Međutim, vrijedi napomenuti da su neki geni citokroma P450 povezani s povećanom otpornošću na patogene gljivice ili bakterije, uključujući doprinos alergijskim reakcijama 69,70,71.
Peroksidaze klase III su multifunkcionalni biljni enzimi uključeni u širok raspon metaboličkih procesa tijekom rasta i razvoja biljaka, kao i kao odgovor na stresne uvjete iz okoliša poput slanosti, suše, visokog intenziteta svjetlosti i napada patogena72. Peroksidaze su uključene u interakciju nekoliko biljnih vrsta s anthracisom, uključujući Stylosanthes humilis i C. gloeosporioides, Lens culinaris i C. truncatum, Phaseolus vulgaris i C. lindemuthianum, Cucumis sativus i C. lagenarium73,74,75,76. Odgovor je vrlo brz, ponekad čak i na 4 HPI, prije nego što gljivica prodre u biljno tkivo73. Gen peroksidaze također je reagirao na inokulaciju D. toxica NLL. Osim svojih tipičnih funkcija regulacije oksidativnog naleta ili uklanjanja oksidativnog stresa, peroksidaze mogu ometati rast patogena stvaranjem fizičkih barijera na temelju ojačanja stanične stijenke tijekom lignifikacije, podjedinice ili umrežavanja specifičnih spojeva. Ova se funkcija može in silico pripisati genu TanjilG_03329 koji kodira pretpostavljenu anionsku peroksidazu koja stvara lignin, a čija je ekspresija u našoj studiji bila značajno povišena kod linije otporne na 83A:476 pri 6 HPI, ali ne i kod drugih sojeva i vremenskih točaka koje nisu reagirale.
9S-/13S-lipoksigenaza linolne kiseline prvi je korak u oksidativnom putu biosinteze lipida78. Produkti ovog puta imaju višestruke funkcije u obrani biljaka, uključujući jačanje stanične stijenke stvaranjem naslaga kaloze i pektina te regulaciju oksidativnog stresa proizvodnjom reaktivnih kisikovih vrsta79,80,81,82,83. U ovoj studiji, ekspresija linolne kiseline 9S-/13S-lipoksigenaze bila je promijenjena u svim sojevima, ali u osjetljivoj populaciji 22660 prevladavala je pojačana regulacija u različitim vremenskim točkama, dok u sojevima koji nose rezistentni Lanr1 i alel AnMan naglašava diverzifikaciju oksilipinskog sloja u zaštitnim reakcijama antraksa između ovih genotipova.
Homolog 1-aminociklopropan-1-karboksilat oksidaze (ACO) bio je značajno pojačano (9 gena) ili smanjeno (2 gena) kada je inokuliran lupinom. Uz dvije iznimke, svi ovi odgovori dogodili su se pri 6 hp na 83A:476. Enzimska reakcija posredovana ACO proteinima je korak koji ograničava brzinu u proizvodnji etilena i stoga je visoko regulirana84. Etilen je biljni hormon koji igra različite uloge u regulaciji razvoja biljaka i odgovora na abiotske i biotičke stresne uvjete. Indukcija ACO transkripcije i aktivacija signalnog puta etilena uključene su u povećanje otpornosti riže na hemibiotrofnu gljivicu oryzae oryzae reguliranjem proizvodnje reaktivnih kisikovih vrsta i fitoaleksina. Vrlo sličan proces infekcije lista pronađen između M. oryzae i C. lupini88,89, na pozadini značajnog povećanja ACO homologa u liniji 83A:476 opisanog u ovoj studiji, pomiče mogućnost davanja otpornosti na NLL antraknozu etilen kao središnjeg signalnog koraka u molekularnim putovima.
U ovoj studiji, uočena je velika supresija mnogih gena povezanih s fotosintezom nakon 6 hpi u populaciji 83A:476 i nakon 48 hpi u populaciji Mandeloop i 22660. Opseg i napredovanje tih promjena proporcionalni su razini. U ovom eksperimentu uočena je otpornost na antraknozu. Nedavno je zabilježena snažna i rana represija transkripata povezanih s fotosintezom u nekoliko modela interakcija biljaka i patogena, uključujući patogene bakterije i gljivice. Žurba (od 2 HPI u nekim interakcijama) i globalna supresija gena povezanih s fotosintezom kao odgovor na infekciju mogu pokrenuti imunitet biljaka na temelju primjene reaktivnih vrsta kisika i njihove interakcije sa salicilnom kiselinom kako bi posredovale u alergijskim reakcijama 90,94.
Zaključno, predloženi mehanizmi obrambenog odgovora za najotporniju liniju (83A:476) uključuju brzo prepoznavanje patogena od strane R gena (vjerojatno TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) i signalizaciju salicilne kiseline i etilena posredovanu alergijskim odgovorom, nakon čega slijedi uspostavljanje dugog dometa SAR-a. Djelovanje podržava protein DIR-1. Treba napomenuti da je biotrofno razdoblje za infekciju C. lupini vrlo kratko (otprilike 2 dana), nakon čega slijedi nekrotični rast95. Prijelaz između ovih faza može biti povezan s nekrozom i ekspresijom proteina inducibilnih etilenom koji djeluju kao okidači za reakcije preosjetljivosti u biljkama domaćinima. Stoga je vremenski prozor za uspješno hvatanje C. lupini u biotrofnoj fazi vrlo uzak. Reprogramiranje gena povezanih s redoksom i fotosintezom uočeno u 83A:476 nakon 6 hpi u skladu je s napredovanjem gljivičnih hifa i najavljuje razvoj uspješnog zaštitnog odgovora u biotrofnoj fazi. Transkriptomski odgovori Mandelupa i populacije 22660 mogu biti previše odgođeni da bi uhvatili gljivicu prije prelaska na nekrotični rast, međutim, Mandelup bi mogao biti učinkovitiji od populacije 22660 jer relativno brza regulacija proteina PR-10 potiče horizontalnu otpornost.
ETI, potaknut kanonskim R genom, čini se uobičajenim mehanizmom za otpornost graha na antraknozu. Dakle, kod modelne mahunarke Medicago truncatula, otpornost na antraknozu daje gen RCT1, član klase biljnih R gena TIR-NBS-LRR97. Ovaj gen također daje otpornost na antraknozu širokog spektra kod lucerne kada se prenese na osjetljive biljke. Kod običnog graha (P. vulgaris) do danas je identificirano više od dva tuceta gena otpornosti na antraknozu. Neki od ovih gena nalaze se u regijama kojima nedostaju kanonski R geni, međutim mnogi drugi nalaze se na rubovima kromosoma koji nose skupinu gena NBS-LRR, uključujući TIR-NBS-LRRs99. Studija SSR cijelog genoma također je potvrdila povezanost gena NBS-LRR s otpornošću na antraknozu kod običnog graha. Kanonski R gen također je pronađen u genomskoj regiji koja nosi glavni lokus otpornosti na antraknozu kod bijelog lupina 101.
Naš rad pokazuje da trenutna reakcija otpornosti, aktivirana u ranoj fazi biljne infekcije (po mogućnosti ne kasnije od 12 hpi), učinkovito štiti uskolisni lupin od antraknoze uzrokovane patogenom gljivicom Collelotrichum lupini. Korištenjem visokopropusnog sekvenciranja demonstrirali smo diferencijalne profile ekspresije gena otpornosti na antraknozu u NLL biljkama posredovane genima otpornosti Lanr1 i AnMan. Uspješna obrana uključuje pažljivo dizajniranje gena za proteine ​​uključene u redoks, fotosintezu i patogenezu unutar nekoliko sati od prvog kontakta biljke s patogenom. Slične zaštitne reakcije, ali odgođene u vremenu, mnogo su manje učinkovite u zaštiti biljaka od bolesti. Otpornost na antraks posredovana genom Lanr1 nalikuje tipičnom brzom odgovoru R gena (imunitet potaknut efektorom), dok gen AnMan najvjerojatnije pruža horizontalni odgovor (imunitet potaknut molekularnim uzorkom povezanim s mikrobom), pružajući umjerenu razinu održivosti.
215 NLL linija korištenih za probir na antraknozne markere sastojalo se od 74 kultivara, 60 linija dobivenih križanjem ili uzgojem, 5 mutanata i 76 divljih ili izvornih germplazmi. Linije su potjecale iz 17 zemalja, uglavnom iz Poljske (58), Španjolske (47), Njemačke (27), Australije (26), Rusije (19), Bjelorusije (7), Italije (5) i drugih linija iz 10 zemalja. Skup također uključuje referentne rezistentne linije: 83A:476, Tanjil, Wonga s alelom Lanr1 i Mandelup s alelom AnMan. Linije su dobivene iz Europske baze podataka genetskih resursa lupina koju održava Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Poljska (Dodatna tablica S1).
Biljke su uzgajane u kontroliranim uvjetima (fotoperiod 16 sati, temperatura 25°C tijekom dana i 18°C ​​​​noću). Analizirana su dva biološka ponavljanja. DNK je izolirana iz listova starih tri tjedna pomoću DNeasy Plant Mini Kit-a (Qiagen, Hilden, Njemačka) prema protokolu. Kvaliteta i koncentracija izolirane DNK procijenjene su spektrofotometrijskim metodama (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD). Analizirani su marker AnManM1 koji označava gen otpornosti na antraknozu AnMan (izveden iz sorte Mandelup) i markeri Anseq3 i Anseq4 koji okružuju gen Lanr1 (izveden iz sorte Tanjil) 11,26,28. Homozigoti za rezistentni alel ocijenjeni su s "1", osjetljivi s "0", a heterozigoti s 0,5.
Na temelju rezultata probira za markere AnManM1, AnSeq3 i AnSeq4 te dostupnosti sjemena za završne eksperimente praćenja, odabrano je 50 NLL linija za fenotipizaciju otpornosti na antraknozu. Analiza je provedena u duplikatu u računalno kontroliranom stakleniku s 14-satnim fotoperiodom s temperaturnim rasponom od 22°C tijekom dana i 19°C noću. Sjemenke se grebu (odrezivanje sjemene ovojnice na suprotnoj strani embrija oštrom oštricom) prije sjetve kako bi se spriječilo mirovanje sjemena zbog pretvrde sjemene ovojnice i kako bi se osiguralo ujednačeno klijanje. Biljke su uzgajane u posudama (11 × 11 × 21 cm) sa sterilnim tlom (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varšava, Poljska). Inokulacija je provedena sojem Colletotrichum lupini Col-08, uzgojenim 1999. godine iz stabljika uskolisne lupine uzgojene na polju u Verženici, Velikopoljska (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Izolati su uzgajani u SNA mediju na 20° C pod crnim svjetlom tijekom 21 dana kako bi se inducirala sporulacija. Četiri tjedna nakon sjetve, kada su biljke dosegle stadij 4-6 listova, provedena je inokulacija prskanjem suspenzijom konidija u koncentraciji od 0,5 x 10⁶ konidija po ml. Nakon inokulacije, biljke su držane u mraku 24 sata pri vlažnosti zraka od oko 98% i temperaturi od 25°C kako bi se olakšalo klijanje konidija i proces infekcije. Biljke su zatim uzgajane pod 14-satnim fotoperiodom na 22°C danju/19°C noću i 70% vlažnosti. Bodovna ocjena bolesti određena je 22 dana nakon inokulacije i kretala se od 0 (imuno) do 9 (vrlo osjetljivo) ovisno o prisutnosti ili odsutnosti nekrotičnih lezija na stabljikama i listovima. Osim toga, nakon bodovanja, izmjerena je težina biljaka. Odnosi između genotipova markera i fenotipova bolesti izračunati su kao korelacije točkastih dviju sekvenci (odsutnost heterozigotnih markera u skupu linija za analizu fenotipa otpornosti na antraknozu).