תודה שביקרתם באתר Nature.com. גרסת הדפדפן בה אתם משתמשים כוללת תמיכה מוגבלת ב-CSS. לחוויית המשתמש הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נציג את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
תורמוס אנגוסטיפוליוס (NLL, Lupinus angustifolius L.) הוא צמח קטניות המשמש לייצור מזון ולשיפור קרקע. ההתפשטות העולמית של NLL כגידול משכה אליו פטריות פתוגניות רבות, כולל אנתרקנוז תורמוס, הגורמת למחלת האנתרקנוז ההרסנית. שני אללים, Lanr1 ו-AnMan, המקנים עמידות מוגברת, שימשו בטיפוח NLL, אך המנגנונים המולקולריים הבסיסיים נותרו לא ידועים. במחקר זה, סמני Lanr1 ו-AnMan שימשו לסינון דגימות NLL אירופיות. בדיקת החיסון בסביבה מבוקרת אישרה את יעילותם של שני התורמים העמידים. פרופיל ביטוי גנים דיפרנציאלי בוצע על קווים עמידים ורגישים מייצגים. עמידות לאנתרקנוז נקשרה לביטוי יתר של מונחי האונטולוגיה הגנטית "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process", ו-"GO:0015979 Photosynthesis". בנוסף, קו Lanr1(83A:476) הראה תכנות מחדש משמעותי במהירות לאחר ההזרקה, בעוד שהקווים האחרים הראו עיכוב בתגובה זו של כ-42 שעות. תגובות הגנה קשורות לגנים TIR-NBS, CC-NBS-LRR ו-NBS-LRR, 10 חלבונים המעורבים בפתוגנזה, חלבוני העברת שומנים, אנדוגלוקן-1,3-β-גלוקוזידאז, חלבוני דופן תא עשירים בגליצין, וגנים מנתיב ריאקטיבי של חמצן. תגובות מוקדמות ל-83A:476, כולל דיכוי זהיר של גנים הקשורים לפוטוסינתזה, התרחשו במקביל להגנה מוצלחת במהלך שלב הצמיחה הווגטטיבית של ביולוגיה פטרייתית, דבר המצביע על כך שאפקטור מפעיל חסינות. תגובת מנדלופ מואטת, וכך גם הגרר האופקי הכולל.
תורמוס צר-עלים (NLL, Lupinus angustifolius L.) הוא דגן עתיר חלבון שמקורו באזור המערבי הים התיכון1,2. כיום הוא גדל כגידול מזון לבעלי חיים ולבני אדם. הוא נחשב גם לזבל ירוק במערכות מחזור גידולים עקב קיבוע חנקן על ידי חיידקים סימביוטיים המקבעים חנקן ושיפור כללי של מבנה הקרקע. תורמוס צר-עלים עבר תהליך ביות מהיר במאה האחרונה ועדיין נמצא תחת לחץ רבייה גבוה3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. עם הגידול הנרחב של NLL, רצף הפטריות הפתוגניות פיתח נישות חקלאיות חדשות וגרמה למחלות חדשות ההרסניות של יבולים. הממצא הבולט ביותר עבור מגדלי תורמוסים היה הופעתה של אנתרקנוז, הנגרמת על ידי הפטרייה הפתוגנית, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. הממצא הבולט ביותר עבור מגדלי תורמוסים היה הופעתה של אנתרקנוז, הנגרמת על ידי הפטרייה הפתוגנית, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогного LU (בונדר) נירנברג, פיילר והגדורן13. הבולט ביותר עבור מגדלי תורמוסים הייתה הופעתה של אנתרקנוז הנגרמת על ידי הפטרייה הפתוגנית Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由眀引人注目的是炭疽病的出现，它是由県它是由県(בונדר) נירנברג, פיילר והאגדורן13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由眀引人注目的是炭疽病的出现，它是由県它是由県(Bondar)嵵שיער。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогент lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. הדבר הבולט ביותר עבור מגדלי תורמוסים הוא הופעתה של אנתרקנוז הנגרמת על ידי הפטרייה הפתוגנית Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.הדיווחים המוקדמים ביותר על המחלה הגיעו מברזיל וארצות הברית, כאשר תסמינים אופייניים הופיעו בשנת 1912 ו-1929 בהתאמה. עם זאת, לאחר כ-30 שנה, הפתוגן סומן כ-Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. וסאקק, טלאומורף Glomerella cingulata (סטונמן) ספולד. וסאקק, טלאומורף Glomerella cingulata (סטונמן) ספולד. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., טלאומורף של Glomerella cingulata (סטונמן) ספולד. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (סטונמן) ספולד. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (סטונמן) ספולד. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (סטונמן) ספולד במורפולוגיה ממוקדת. וה. שֶׁרֶנְק. וה. שֶׁרֶנְק.וה. שֶׁרֶנְק. & H.施伦克，. & H.施伦克，.וה. שלנק,.פנוטיפיזציה ראשונית של המחלה שנעשתה באמצע המאה ה-20 הראתה עמידות מסוימת בזני NLL ותורמוס צהוב (L. luteus L.), אך כל זני התורמוס הלבן (L. albus L.) שנבדקו היו רגישות מאוד15,16. מחקרים הראו כי התפתחות אנתרקנוז קשורה לעלייה במשקעים (לחות אוויר) ובטמפרטורה (בטווח של 12-28 מעלות צלזיוס), מה שמוביל להפרת עמידות בטמפרטורות גבוהות יותר17, 18. למעשה, הזמן שנדרש לנביטת הקונידיה ולתחילת המחלה היה קצר פי ארבעה ב-24 מעלות צלזיוס (4 שעות) מאשר ב-12 מעלות צלזיוס (16 שעות) בתנאי לחות גבוהה19. לפיכך, ההתחממות הגלובלית המתמשכת הובילה להתפשטות האנתרקנוז. עם זאת, המחלה נצפתה בצרפת (1982) ובאוקראינה (1983) כמבשר לאיום מתקרב, אך ככל הנראה התעלמה ממנה על ידי תעשיית התורמוסים באותה תקופה20,21. מספר שנים לאחר מכן, מחלה הרסנית זו התפשטה ברחבי העולם ופגעה גם במדינות ייצור תורמוס מרכזיות כמו אוסטרליה, פולין וגרמניה22,23,24. בעקבות התפרצות אנתרקנוז באמצע שנות ה-90, סינון נרחב הביא לזיהוי מספר תורמים עמידים בדגימות NLL19. עמידות NLL לאנתרקנוז נשלטת על ידי שני אללים דומיננטיים נפרדים הנמצאים במקורות נבט שונים: Lanr1 בזן Tanjil ו-Wonga ו-AnMan בזן Mandalay25,26. אללים אלה משלימים את הסמנים המולקולריים התומכים בבחירת נבט עמיד בתוכניות רבייה25,26,27,28,29,30. קו הרבייה העמיד 83A:476 הנושא את האלל Lanr1 עברו כליאה עם קו הפראי הרגיש P27255 כדי לקבל אוכלוסיית RIL המבודדת את עמידותם לאנתרקנוז, מה שאפשר לשייך את לוקוס Lanr1 לכרומוזום NLL-1131, 32, 33. יישור סמני מפת קישור מלוקוסי עמידות צידיים לאנתרקנוז עם מסגרת גנומית, NLL חשף את מיקומם של שלושת האללים על אותו כרומוזום (NLL-11), אך במיקומים שונים 29,34,35. עם זאת, בשל המספר הקטן של RILs והמרחק הגנטי הגדול בין סמנים לאללים התואמים, לא ניתן להסיק מסקנות אמינות לגבי הגנים הבסיסיים שלהם. מצד שני, השימוש בגנטיקה הפוכה בתורמוסים קשה בשל פוטנציאל ההתחדשות הנמוך מאוד שלהם, מה שהופך את המניפולציה הגנטית למסורבלת 37.
התפתחותה של נבט פלזמה מבויתת הנושאת את האלל הרצוי במצב הומוזיגוטי, כגון 83A:476 (Lanr1) ומנדלופ (AnMan), פתחה את הדלת לחקר עמידות לאנתרקנוז לנוכח נוכחות של צירופים מנוגדים של אללים באוכלוסיות בר. אפשרויות של מנגנונים מולקולריים. השווה תגובות הגנה שנוצרו על ידי גנוטיפים ספציפיים. מחקר זה העריך את תגובת הטרנסקריפטום המוקדמת של NLL לחיסון C. lupini. ראשית, פאנל נבט פלזמה אירופאי של NLL המכיל 215 שורות נבדק באמצעות סמנים מולקולריים המסמנים את האללים Lanr1 ו-AnMan. לאחר מכן בוצע פנוטיפיזציה של אנתרקנוז על 50 קווי NLL, שנבחרו בעבר עבור סמנים מולקולריים, בתנאים מבוקרים. בהתבסס על ניסויים אלה, נבחרו ארבעה שורות הנבדלות בעמידות לאנתרקנוז ובהרכב האללי Lanr1/AnMan לפרופיל ביטוי גנים דיפרנציאלי באמצעות שתי גישות משלימות: ריצוף RNA תפוקה גבוהה וכימות PCR בזמן אמת.
סינון של קבוצת נמפלזמות NLL (N = 215) עם הסמנים Lanr1 (Anseq3 ו-Anseq4) ו-AnMan (Anseq4) ו-AnMan (AnManM1) הראה שרק קו אחד (95726, ליד סלמנקה-ב) מגביר את האלל "עמידות" עבור כל הסמנים, בעוד ש"נוכחות של אללים 'רגישים'" מצאה את הפרופורציה של כל הסמנים ב-158 (~73.5%) קווים. שלושה עשר קווים ייצרו שני אללים "עמידים" של סמן Lanr1, ו-8 קווים ייצרו אללים "עמידים" של סמן Lanr1. אלל ה"עמידות" של סמן AnMan (טבלה משלימה S1). שני קווים היו הטרוזיגוטיים עבור סמן Anseq3 ואחד הטרוזיגוטי עבור סמן AnManM1. 42 קווים (19.5%) נשאו פאזות מנוגדות של האללים Anseq3 ו-Anseq4, דבר המצביע על תדירות גבוהה של רקומבינציה בין שני לוקוסים אלה. פנוטיפים של אנתרקנוז בתנאים מבוקרים (טבלה משלימה S2) גילו שונות בעמידות הגנוטיפים שנבדקו, אשר באה לידי ביטוי בחומרת האנתרקנוז. ההבדלים בממוצע הציונים נעו בין 1.8 (עמידות בינונית) ל-6.9 (רגישות) וההבדלים במשקל הצמח נעו בין 0.62 (רגישות) ל-4.45 גרם (עמידות). נמצא מתאם מובהק בין הערכים שנצפו בשתי חזרות של הניסוי (0.51 עבור ציוני חומרת המחלה, P = 0.00017 ו-0.61 עבור משקל הצמח, P < 0.0001) וכן בין שני פרמטרים אלה (-0.59 ו--0.77, P < 0.0001). נמצא מתאם מובהק בין הערכים שנצפו בשתי חזרות של הניסוי (0.51 עבור ציוני חומרת המחלה, P = 0.00017 ו-0.61 עבור משקל הצמח, P < 0.0001) וכן בין שני פרמטרים אלה (-0.59 ו--0.77, P < 0.0001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 רכיבים болезни, P = 0,00017 ו 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,50, Р, -0,50, Р. 0,0001). נמצא מתאם מובהק בין הערכים שנצפו בשתי חזרות של הניסוי (0.51 עבור ציוני חומרת המחלה, P = 0.00017 ו-0.61 עבור משקל הצמח, P < 0.0001), וכן בין שני פרמטרים אלה (-0.59 ו--0.77, P < 0.0001) .在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分1︌. 0.00017，植物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77。01)P在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 为庈度 诟分为 0.51 ， p = 0.00017 ， 植物 为 为 0.61 ， p <0.0001） 以及 两 个 参数 为（刼（，（（，（，，（ 0.59 和– 0.59 和– 0.59 和- 0.77，P < 0.0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценколитяжя 5, 5, 1 = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 ו -0,0001) 0,77, P <0,001. נמצא מתאם מובהק בין הערכים שנצפו בכפילות (ציון חומרת המחלה 0.51, P = 0.00017 ומשקל הצמח 0.61, P < 0.0001) ובין שני פרמטרים אלה (-0.59 ו--0.0001) 0.77, P<0.0001. ).תסמינים אופייניים הנראים בצמחים רגישים כוללים כיפוף ופיתול של הגבעול הדומה למבנה של "קשת רועים", ולאחר מכן נגעים סגלגלים עם ספורוזואיטים כתומים/ורודים (איור משלים 1). זנים אוסטרליים הנושאים את הגנים Lanr1 (83A:476 ו-Tanjil) ו-AnMan (Mandelup) עמידים במידה בינונית, 0.0331 ו-0.0036). חלק מהקווים הנושאים גם אללים "עמידים" של Lanr1 ו/או AnMan מראים תסמינים של המחלה.
מעניין לציין, שמספר קווי NLL חסרי אלל סמן "עמיד" גילו רמה גבוהה של עמידות לאנתרקנוז (דומה או גבוהה יותר מזו של גנוטיפים Lanr1 או AnMan), כגון Boregine (ערך P < 0.0001 עבור שני הפרמטרים), Bojar (ערך P < 0.0001 עבור ניקוד ו-0.001 עבור משקל הצמח) ואוכלוסייה B-549/79b (ערך P < 0.0001 עבור ניקוד ולא מובהק עבור משקל). מעניין לציין, שמספר קווי NLL חסרי אלל סמן "עמיד" גילו רמה גבוהה של עמידות לאנתרקנוז (דומה או גבוהה יותר מזו של גנוטיפים Lanr1 או AnMan), כגון Boregine (ערך P < 0.0001 עבור שני הפרמטרים), Bojar (ערך P < 0.0001 עבור ניקוד ו-0.001 עבור משקל הצמח) ואוכלוסייה B-549/79b (ערך P < 0.0001 עבור ניקוד ולא מובהק עבור משקל). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, покасаливывы устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 או AnMan), таких как Boregine (ב-1,0000 параметров), Bojar (זנת P < 0,0001 ל- оценки и 0,001 для массы растения) ו- популяции B-549/79b (זנה P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). מעניין לציין, שמספר קווי NLL חסרי אלל סמן "עמיד" הראו רמה גבוהה של עמידות לאנתרקנוז (דומה או גבוהה יותר מגנוטיפים של Lanr1 או AnMan), כגון Boregine (ערך P < 0.0001 עבור שני הפרמטרים), Bojar (ערך P < 0.0001 להערכה ו-0.001 למשקל הצמח) ואוכלוסייה B-549/79b (ערך P < 0.0001 להערכה ולא מובהק למשקל).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的瀅疽1或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，逍量㼌逍量 מעניין לציין שחלק ממערכות ה-NLL שאין להן סמנים "אנטיגניים" מראות עמידות אופקית גבוהה (שווה ערך לגנים Lanr1 או AnMan ומעלה), כגון Boregine (שני הפרמטרים P < 0.0001), Bojar (ערך P < 0.0001, משקל צמח 0.001) וזן B-549/79b (ערך P < 0.0001, משקל לא מובהק). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показаливи устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan) (זנה P <0,0001, רווח של 0,001) и популяция B-549/79b (אוזן P-значение <0,0001, масса незначительна). מעניין לציין, שכמה קווי NLL חסרי אללים של סמן 'עמידות' הראו רמות גבוהות של עמידות לאנתרקנוז (דומה או גבוהות יותר מגנוטיפים Lanr1 או AnMan), כגון Boregine (ערך P עבור שני הפרמטרים <0.0001), Bojar (ערך P < 0.0001, משקל צמח 0.001) ואוכלוסייה B-549/79b (ערך P < 0.0001, משקל לא מובהק).תופעה זו מצביעה על אפשרות של מקור גנטי חדש לעמידות, ומסבירה את חוסר המתאם שנצפה בין גנוטיפים של סמנים לפנוטיפים של המחלה (ערכי P מ-~0.42 עד ~0.98). לפיכך, מבחן קולמוגורוב-סמירנוב הראה כי הנתונים על עמידות לאנתרקנוז התפלגו בקירוב נורמלית עבור ציונים (ערכי P 0.25 ו-0.11) ומסת צמח (ערכי P 0.47 ו-0.55), דבר המצביע על כך שאני משער שמעורבים יותר אללים מאשר Lanr1 ו-AnMan.
בהתבסס על תוצאות סקר עמידות לאנתרקנוז, נבחרו 4 שורות לניתוח טרנסקריפטום: 83A:476, בורגין, מנדלופ ואוכלוסייה 22660. שורות אלו נבדקו שוב לעמידות לאנתרקס בניסויי חיסון באמצעות ריצוף RNA, בתנאי שהן היו זהות לאלו שבבדיקה הקודמת. ערכי הציון היו כדלקמן: בורגין (1.71 ± 1.39), 83A: 476 (2.09 ± 1.38), מנדלופ (3.82 ± 1.42) ואוכלוסייה 22660 (6.11 ± 1.29).
פרוטוקול Illumina NovaSeq 6000 השיג ממוצע של 40.5 זוגות Mread לדגימה (29.7 עד 54.4 Mreads) (טבלה משלימה S3). ציוני היישור ברצף הייחוס נעו בין 75.5% ל-88.6%. המתאם הממוצע של נתוני ספירת הקריאות בין וריאנטים ניסיוניים בין רפליקות ביולוגיות נע בין 0.812 ל-0.997 (ממוצע 0.959). מתוך 35,170 גנים שנותחו, 2917 לא גילו ביטוי, ו-4785 הגנים הנותרים באו לידי ביטוי ברמה זניחה (ממוצע בסיס < 5). מתוך 35,170 גנים שנותחו, 2917 לא גילו ביטוי, ו-4785 הגנים הנותרים באו לידי ביטוי ברמה זניחה (ממוצע בסיס < 5). בערך 35 170 רווחים 2917 לא רווחים, יש 4785 גנוב תקציבים. уровне (базовое среднее <5). מתוך 35,170 גנים שנותחו, 2917 לא הראו ביטוי, ו-4785 הגנים הנותרים באו לידי ביטוי ברמה זניחה (ממוצע בסיס <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）.35,170 בערך 35 170 רווחים 2917 לא רווחים среднее значение <5). מתוך 35,170 גנים שנותחו, 2917 לא באו לידי ביטוי ו-4785 הגנים הנותרים היו בעלי ביטוי זניח (ממוצע בסיס <5).לפיכך, מספר הגנים שנחשבו כבעלי ביטוי (ממוצע בסיס ≥ 5) במהלך הניסוי היה 27,468 (78.1%) (טבלה משלימה S4).
מנקודת הזמן הראשונה, כל קווי ה-NLL הגיבו לחיסון C. lupini (זן Col-08) על ידי תכנות מחדש של הטרנסקריפטום (טבלה 1), אולם נצפו הבדלים משמעותיים בין הקווים. לפיכך, קו העמידות 83A:476 (הנושא את הגן Lanr1) הראה תכנות מחדש משמעותי של הטרנסקריפטום בנקודת הזמן הראשונה (6 שעות לאחר הניתוח) עם עלייה של פי 31-69 במספר הגנים המבודדים למעלה ולמטה בהשוואה לנקודות זמן אחרות בנקודת זמן זו. בנוסף, שיא זה היה קצר מועד, שכן הביטוי של גנים מעטים בלבד נותר שונה באופן משמעותי בנקודת הזמן השנייה (12 שעות לאחר הניתוח). מעניין לציין, ש-Boregine, שהראה גם רמת עמידות גבוהה במבחן השתל, לא עבר תכנות מחדש כה מסיבי של תעתוק במהלך הניסוי. עם זאת, מספר הגנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי (DEG) היה זהה עבור Boregine ו-83A:476 ב-12 שעות לאחר הניתוח. גם מנדלופ וגם אוכלוסייה 22660 הראו שיאי DEG בנקודת הזמן האחרונה (48 ליטר/שנייה), דבר המצביע על עיכוב יחסי בתגובות ההגנה.
מכיוון ש-83A:476 עבר תכנות מחדש מסיבי של הטרנסקריפטום בתגובה ל-C. lupini ב-6 HPI בהשוואה לכל שאר הקווים, כ-91% מ-DEGs שנצפו בנקודת זמן זו היו ספציפיים לשושלת (איור 1). עם זאת, הייתה חפיפה מסוימת בתגובות המוקדמות בין קווי המחקר, כאשר 68.5%, 50.9% ו-52.6% DEG בבורגין, מנדלופ ואוכלוסייה 22660, בהתאמה, חפיפו לאלו שנמצאו ב-83A:476 בנקודות זמן מסוימות. עם זאת, DEGs אלו היוו רק חלק קטן (0.97-1.70%) מכלל ה-DEGs שזוהו כיום באמצעות 83A:476. בנוסף, 11 חלבוני DEG מכל הקווים היו קוהרנטיים בשלב זה (טבלאות משלימות S4-S6), כולל רכיבים משותפים של תגובות הגנה של צמחים: חלבון העברת שומנים (TanjilG_32225), אנזים אנדוגלוקן-1,3-β-גלוקוזיד (TanjilG_23384), שני חלבונים המושרים על ידי עקה כמו SAM22 (TanjilG_31528 ו-TanjilG_31531), חלבון לטקס בסיסי (TanjilG_32352), ושני חלבוני דופן תא מבניים עשירים בגליצין (TanjilG_19701 ו-TanjilG_19702). כמו כן, הייתה חפיפה גבוהה יחסית בתגובות הטרנסקריפטום בין 83A:476 לבין בורג'ין ב-24 HPI (סה"כ 16-38% DEG) ובין מנדלופ לאוכלוסייה 22660 ב-48 HPI (סה"כ 14-20% DEG).
דיאגרמת ון המציגה את מספר הגנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי (DEG) בקווי תורמוס צרי עלים (NLL) שחוסנו ב-Colletotrichum lupini (זן Col-08 שהושג משדות תורמוס בווירז'ניצה, פולין, 1999). קווי ה-NLL שנותחו היו: 83A:476 (עמיד, נושא את האלל Lanr1), בורגין (עמיד, רקע גנטי לא ידוע), מנדלופ (עמיד במידה בינונית, נושא את האלל AnMan) ואוכלוסייה 22660 (רגישים מאוד). הקיצור hpi מייצג שעות לאחר החיסון. ערכי אפס הוסרו כדי לפשט את הגרף.
קבוצת הגנים בעלי ביטוי יתר ב-6 שעות בשבוע נותחה לנוכחות דומיינים קנוניים של גן R (טבלה משלימה S7). מחקר זה גילה אינדוקציה טרנסקריפטומית של גנים קלאסיים של עמידות למחלות עם דומייני NBS-LRR רק ב-83A:476. קבוצה זו כללה גן TIR-NBS-LRR אחד (tanjilg_05042), חמישה גנים של CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, ו-tanjilg_16162), וארבעה גנים של NBS-LR, Tanjilg_16162), וארבעה NBS-LRRE (tanjilg_16162) כמו גם ארבעה NBS-Lrr (tanjilg_16162) וארבעה NBS-LRR (TANJILG_16162). לכל הגנים הללו דומיינים קנוניים המסודרים ברצפים שמורים. בנוסף לגנים של תחום NBS-LRR, מספר קינאזות RLL הופעלו ב-6 שעות לאחר הניתוח, כלומר אחת בבורגין (TanjilG_19877), שתיים במנדלופ (TanjilG_07141 ו-TanjilG_19877) ובאוכלוסייה 22660 (TanjilG_09014 ו-TanjilG_10361) ושתיים ב-83A 27:476.
גנים עם שינוי משמעותי בביטוי בתגובה לחיסון עם C. lupini (זן Col-08) עברו ניתוח העשרה של Gene Ontology (GO) (טבלה משלימה S8). מונח התהליך הביולוגי שזכה לייצוג יתר על המידה בתדירות הגבוהה ביותר היה "GO:0006952 defensive response" שהופיע ב-6 מתוך 16 צירופים (זמן × קו) עם מובהקות גבוהה (ערך P < 0.001) (איור 2). מונח התהליך הביולוגי שזכה לייצוג יתר על המידה בתדירות הגבוהה ביותר היה "GO:0006952 defensive response" שהופיע ב-6 מתוך 16 צירופים (זמן × קו) עם מובהקות גבוהה (ערך P < 0.001) (איור 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитнеты», ответный появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (זמן P <0,001) (רינס. 2). מונח התהליך הביולוגי שזכה לייצוג יתר על המידה בתדירות הגבוהה ביותר היה 'GO:0006952 defense response', אשר הופיע ב-6 מתוך 16 צירופי (זמן × שושלת) עם מובהקות גבוהה (ערך P < 0.001) (איור 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）. מונח התהליך הביולוגי המייצג ביותר הוא "GO:0006952 defense response", המופיע ב-6 מתוך 16 הצירופים (时间×线), עם מובהקות גבוהה (ערך P < 0.001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», колсторвыв16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). מונח התהליך הביולוגי שזכה לייצוג יתר על המידה בתדירות הגבוהה ביותר היה 'GO:0006952 Defense Response', שהופיע ב-6 מתוך 16 צירופים (זמן × קו) עם מובהקות גבוהה (ערך P < 0.001) (איור 2).מונח זה היה ייצוג יתר בשתי נקודות זמן ב-83A: 476 ו-Boregine (6 ו-24 hpi) ובנקודת זמן אחת ב-Mandelup ובאוכלוסייה 22660 (12 ו-6 hpi, בהתאמה). זוהי תוצאה צפויה, המדגישה את התגובה האנטי-פטרייתית של הקווים העמידים. בנוסף, 83A:476 הגיב ל-C. lupini על ידי גרימת גנים מהירה הקשורים להתפרצות חמצונית המיוצגת על ידי המונח "תהליך חמצון-חיזור GO:0055114", דבר המצביע על תגובת הגנה ספציפית, בעוד ש-Boregine גילה תגובות הגנה ספציפיות, הקשורות למונח 'GO'. :0006950 תגובת לחץ". אוכלוסייה 22660 הפעילה את תגובת ההתנגדות האופקית הכוללת מטבוליטים משניים, מה שמדגיש את המספר המוגזם של המונחים "GO:0016104 תהליך ביוסינתזה של טריטרפן" ו-"GO:0006722 תהליך מטבוליזם של טריטרפן" (שני המונחים שייכים לאותה קבוצת גנים). בהתחשב בתוצאות ניתוח העשרת מונחי GO, יציבות תגובת מנדלופ הייתה בין בורגין לאוכלוסייה 22660. בנוסף, תגובה מוקדמת 83A:476 (6 שעות בשבוע) והתגובה המאוחרת מנדלופ ואוכלוסייה 22660 כוללות את המונח GO:0015979 'פוטוסינתזה' ותהליכים ביולוגיים קשורים אחרים.
מונחי האונטולוגיה של גנים ביולוגיים שנבחרו בהערה של גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי במהלך תגובות טרנסקריפטום של תורמוס צר-עלים (NLL) שחוסן בתורמוס אנתרקס (זן Col-08 שהושג משדות תורמוס בווירז'ניצה, פולין, בשנת 1999) מוגזמים מאוד. קווי ה-NLL שנותחו היו: 83A:476 (עמיד, נושא את האלל ההומוזיגוטי Lanr1), בורגין (עמיד, רקע גנטי לא ידוע), מנדלופ (עמיד במידה בינונית, נושא את האלל ההומוזיגוטי AnMan) ואוכלוסייה 22660 (רגישים).
מכיוון שמטרת מחקר זה הייתה לזהות גנים התורמים לעמידות לאנתרקנוז, הגנים שהוקצו למונחים GO "GO: 0006952 Defensive responses" ו-"GO: 0055114 Redox processes" נותחו עם ערכי סף, שכן ממוצעי בסיס ≥ 30 עם לפחות שורה אחת. × נקודת זמן המשלבת ערכים מובהקים סטטיסטית של log2 (שינוי קיפול). מספר הגנים שעמדו בקריטריונים אלה היה 65 עבור GO:0006952 ו-524 עבור GO:0055114.
83A:476 חשף שני שיאי DEG המסומנים במונח GO:0006952, הראשון ב-6 גנים לאינץ' (64 גנים, ויסות כלפי מעלה ומטה) והשני ב-24 גנים לאינץ' (15 גנים, ויסות כלפי מעלה בלבד). בורגין גם הראה ש-GO:0006952 הגיע לשיאו באותה נקודת זמן, אך עם פחות DEG (11 ו-8) והפעלה מועדפת. מנדלופ הראה שני שיאים של GO:0006952 ב-12 ו-48 HPI, שניהם נושאים 12 גנים (הראשון עם גנים מפעילים, והשני עם גנים מדכאים בלבד), בעוד שאוכלוסיית 22660 ב-6 HPI (13 גנים) הראתה דומיננטיות גדולה יותר של ויסות שיא מוגבר. יש לציין כי 96.4% מ-GO:0006952 DEG בשיאים אלה הראו את אותו סוג תגובה (למעלה או למטה), דבר המצביע על חפיפה משמעותית בתגובות ההגנה למרות הבדלים במספר הגנים המעורבים. הקבוצה הגדולה ביותר של רצפים הקשורים למונח GO:0006952 מקודדת ל-Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-like), השייך לחלבון PR-10 (pathogenesis-associated protein) מסוג 10 ול-core protein latex. חלבון דומה (MLP-like) (איור 3). שתי הקבוצות נבדלו באופי הביטוי ובכיוון התגובה. הגנים המקודדים חלבונים דמויי SAM22 הראו אינדוקציה עקבית ומשמעותית בנקודות זמן מוקדמות (6 או 12 שעות ביממה) ובדרך כלל לא הגיבו בסוף הניסוי (48 שעות ביממה), בעוד שחלבונים דמויי MLP הראו קואורדינציה ב-6 שעות ביממה. ב-83A:476 וב-Mandelup ב-48 שעות ביממה, כמעט כל נקודות הנתונים האחרות לא הגיבו. בנוסף, הבדלים בפרופילי הביטוי של גנים של חלבון דמוי SAM22 עקבו אחר השונות שנצפתה בעמידות לאנתרקנוז, מכיוון שקווים עמידים יותר הציגו יותר נקודות זמן שהפעילו באופן משמעותי את הגנים הללו מאשר גנים רגישים יותר. גן PR-10 נוסף דמוי LlR18A/B הראה דפוס ביטוי דומה מאוד לגן החלבון דמוי SAM22.
המרכיבים העיקריים של מונח התהליך הביולוגי "GO:0006952 Defense Response" ודפוסי הביטוי של גנים מועמדים של אללים Lanr1 ו-AnMan זוהו. סולם Log2 מייצג ערכי log2 (שינוי קיפול) בין צמחים מחוסנים (Colletotrichum lupini, זן Col-08, שהושג משדות תורמוס, Wizhenica, פולין, 1999) לבין צמחים בקרה (חוסנים בדומה) באותה נקודת זמן. קווי התורמוסים הצרים הבאים נותחו: 83A:476 (עמיד, נושא את האלל ההומוזיגוטי Lanr1), Boregine (עמיד, רקע גנטי לא ידוע), Mandelup (עמיד במידה בינונית, נושא את האלל ההומוזיגוטי AnMan), ואוכלוסייה 22660 (רגישים).
בנוסף, הוערכו פרופילי הביטוי של גנים מועמדים ל-RNA-seq Lanr1 ‏(TanjilG_05042) ו-AnMan ‏(TanjilG_12861) (איור 3). הגן TanjilG_05042 הראה תגובה משמעותית (הפעלה) ב-83A:476 רק בנקודת הזמן הראשונה (6 hpi), בעוד ש-TanjilG_12861 היה משמעותי במנדלופ רק בשתי נקודות זמן: 6 hpi (רגולציה כלפי מטה) ו-24 hpi (6 hpi). עם התאמה).
הגנים בעלי ביטוי יתר הגבוה ביותר במונח GO:0055114 "תהליך חיזור-חמצון" היו גנים המקודדים חלבוני ציטוכרום P450 ופראוקסידאז (איור 4). עבור דגימות שבודדו מ-83A:476 ב-6 HPI, נצפו בדרך כלל ערכי log2 (שינוי קיפול) מקסימליים או מינימליים (עבור 86.6% מהגנים) בין צמחים מחוסנים לצמחי ביקורת, דבר המדגיש את התגובה הגבוהה של גנוטיפ זה למין המחוסן. 83A:476 הראה את GO: 0055114 DEG המשמעותי ביותר ב-6 hpi (503 גנים), בעוד ששאר הקווים ב-48 hpi (בורגין, 31 גנים; מנדלופ, 85 גנים; ואוכלוסייה 22660, 78 גנים). ברוב הגנים של משפחת GO:0055114 נצפו שני סוגי תגובות לחיסון (הפעלה ועיכוב). מעניין לציין, שעד 97.6% מהגנים מסוג DEG זוהו עבור המונח GO: 0055114 במנדלופה ב-48 כ"ס. תצפיות אלו מצביעות על כך שלמרות קנה המידה הקטן משמעותית (כלומר, מספר גני החמצון-חיזור המוטנטיים, 85 לעומת 503), דפוס התגובות הטרנסקריפטומיות המאוחרות של מנדלופ לאנתרקנוז דומה לתגובה המוקדמת של 83A:476. בבורגין ובאוכלוסייה 22660, התכנסות זו נמוכה יותר, ועומדת על 51.6% ו-75.6%, בהתאמה.
דפוסי הביטוי של המרכיבים העיקריים של המונח של התהליך הביולוגי "תהליך חמצון-חיזור GO:0055114" נחשפו. סולם Log2 מייצג ערכי log2 (שינוי קיפול) בין צמחים מחוסנים (Colletotrichum lupini, זן Col-08, שהושג משדות תורמוס, ויז'ניצה, פולין, 1999) לבין צמחים מחוסנים (מחוסנים בדומה) באותה נקודת זמן. קווי התורמוסים הצרים הבאים נותחו: 83A:476 (עמיד, נושא את האלל ההומוזיגוטי Lanr1), Boregine (עמיד, רקע גנטי לא ידוע), Mandelup (עמיד במידה בינונית, נושא את האלל ההומוזיגוטי AnMan), ואוכלוסייה 22660 (רגישים).
83A:476 תגובות טרנסקריפטומיות לחיסון עם C. lupini (זן Col-08) כללו גם השתקה מתואמת של גנים המיוחסים למונח GO:0015979 "פוטוסינתזה" ולתהליכים ביולוגיים קשורים אחרים (איור 5). קבוצת DEG זו של GO:0015979 הכילה 105 גנים שהיו מדוכאים באופן משמעותי ב-6 hpi ב-83A:476. בתת-קבוצה זו, 37 גנים היו גם הם מווסתים כלפי מטה במנדלופ ב-48 HPI ו-35 באותה נקודת זמן באוכלוסייה של 22660, כולל 19 DEGs משותפים לשני הגנוטיפים. אף DEGs הקשורים למונח GO: 0015979 לא הופעלו באופן משמעותי בשום שילוב (שורה x זמן).
דפוסי הביטוי של המרכיבים העיקריים של המונח של התהליך הביולוגי "GO:0015979 פוטוסינתזה" נחשפו. סולם Log2 מייצג ערכי log2 (שינוי קיפול) בין צמחים מחוסנים (Colletotrichum lupini, זן Col-08, שהושג משדות תורמוס, ויז'ניצה, פולין, 1999) לבין צמחים בקרה (חוסנים בדומה) באותה נקודת זמן. קווי התורמוס הצרים הבאים נותחו: 83A:476 (עמיד, נושא את האלל ההומוזיגוטי Lanr1), Boregine (עמיד, רקע גנטי לא ידוע), Mandelup (עמיד במידה בינונית, נושא את האלל ההומוזיגוטי AnMan), ואוכלוסייה 22660 (רגישים).
בהתבסס על תוצאות ניתוח ביטוי דיפרנציאלי וככל הנראה מעורב בתגובות הגנה כנגד פטריות פתוגניות, קבוצה זו של שבעה גנים נבחרה לכימות פרופילי ביטוי באמצעות PCR בזמן אמת (טבלה משלימה S9).
גן החלבון המשוער TanjilG_10657 הושרה באופן משמעותי בכל הקווים ונקודות הזמן שנחקרו בהשוואה לצמחי ביקורת (חיקוי) (טבלאות משלימות S10, S11). בנוסף, פרופיל הביטוי של TanjilG_10657 הראה מגמה עולה במהלך הניסוי עבור כל הקווים. אוכלוסייה 22660 הראתה את הרגישות הגבוהה ביותר של TanjilG_10657 לחיסון עם הפעלה פי 114 ורמת הביטוי היחסית הגבוהה ביותר (4.4 ± 0.4) ב-24 HPI (איור 6a). גן החלבון PR10 LlR18A TanjilG_27015 הראה גם הפעלה בכל הקווים ונקודות הזמן, עם מובהקות סטטיסטית ברוב נקודות הנתונים (איור 6b). בדומה ל-TanjilG_10657, רמת הביטוי היחסית הגבוהה ביותר של TanjilG_27015 נצפתה באוכלוסייה 22660 שחוסנה ב-24 HPI (19.5 ± 2.4). גן האנדוכיטינאז החומצי TanjilG_04706 היה מוגבר באופן משמעותי בכל השורות ובכל נקודות הזמן למעט Boregine 6 hpi (איור 6c). הוא הושרה חזק בנקודת הזמן הראשונה (6 HPI) ב-83A:476 (פי 10.5) ועלה במידה בינונית בשורות אחרות (פי 6.6-7.5). במהלך הניסוי, הביטוי של TanjilG_04706 נותר ברמות דומות ב-83A:476 וב-Boregine, בעוד שב-Mandelup ובאוכלוסייה 22660 הוא עלה באופן משמעותי, והגיע לערכים גבוהים יחסית (5.9 ± 1.5 ו-6.2 ± 1.5, בהתאמה). הגן דמוי האנדוגלוקן-1,3-β-גלוקוזידאז TanjilG_23384 הראה הפעלה גבוהה בשתי נקודות הזמן הראשונות (6 ו-12 hpi) בכל השורות למעט אוכלוסייה 22660 (איור 6d). רמות הביטוי היחסיות הגבוהות ביותר של TanjilG_23384 נצפו בנקודת הזמן השנייה (12 hpi) במנדלופ (2.7 ± 0.3) ו-83A:476 (1.5 ± 0.1). ב-24 HPI, ביטוי TanjilG_23384 היה נמוך יחסית בכל הקווים שנחקרו (מ-0.04 ± 0.009 עד 0.44 ± 0.12).
פרופילי ביטוי של גנים נבחרים (ag) שנחשפו על ידי PCR כמותי. המספרים 6, 12 ו-24 מייצגים שעות לאחר החיסון. הגנים LanDExH7 ו-LanTUB6 שימשו לנורמליזציה ו-LanTUB6 שימש לכיול בין-סדרות. סרגלי שגיאה מייצגים את סטיית התקן המבוססת על שלושה חזרות ביולוגיות, שכל אחד מהם הוא ממוצע של שלושה חזרות טכניות. המובהקות הסטטיסטית של ההבדלים ברמות הביטוי בין צמחי הגידול (Colletotrichum lupini, זן Col-08, שהושג בשנת 1999 משדה תורמוסים בווירזניצה, פולין) לבין צמחי הביקורת (בעלי גידול מדומים) מסומנות מעל נקודות הנתונים (*ערך P < 0.05, **ערך P ≤ 0.01, ***ערך P ≤ 0.001). המובהקות הסטטיסטית של ההבדלים ברמות הביטוי בין צמחי הגידול (Colletotrichum lupini, זן Col-08, שהושג בשנת 1999 משדה תורמוסים בווירזניצה, פולין) לבין צמחי הביקורת (בעלי גידול מדומים) מסומנות מעל נקודות הנתונים (*ערך P < 0.05, **ערך P ≤ 0.01, ***ערך P ≤ 0.001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, 9 בספטמבר 9, 9. поля люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмеченная надихированными (* טכני) 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). הבדלים מובהקים סטטיסטית ברמות הביטוי בין צמחים מחוסנים (Colletotrichum lupini, זן Col-08, שהושג בשנת 1999 משדה תורמוסים בווירז'ניצה, פולין) לבין צמחים מחוסנים בקבוצת הביקורת (מחוסנים בדמה) מצוינים מעל נקודות הנתונים (*ערך P < 0.05, **ערך P ≤ 0.01, ***ערך P ≤ 0.001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在繰标记在繰（ 0.05, **P 值≤ 0.01, ***P 值≤ 0.001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 撌 鯹煤秉 种水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 。01) 。. Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полйсч люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмеченды (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). הבדלים מובהקים סטטיסטית ברמות הביטוי בין צמחים מחוסנים (Colletotrichum lupini, זן Col-08, שהושג משדות תורמוס בורז'ניצה, פולין, בשנת 1999) לבין צמחים בקבוצת הביקורת (חוסנים בדמה) מצוינים מעל נקודות הנתונים (*ערך P < 0.05, **ערך P ≤ 0.01, ***ערך P ≤ 0.001).קווי ה-NLL שנותחו היו: 83A:476 (עמידים, נושאים את האלל ההומוזיגוטי Lanr1), Mandelup (עמידים במידה בינונית, נושאים את האלל ההומוזיגוטי AnMan), Boregine (עמידים, רקע גנטי לא ידוע) ואוכלוסייה 22660 (רגישים).
הגן המועמד TanjilG_05042 בלוקוס Lanr1 הראה דפוס ביטוי שונה באופן מובהק מהפרופילים שהתקבלו ממחקרי RNA-seq (איור 6e). הפעלה משמעותית של גן זה נצפתה במנדלופ ובאוכלוסיית 22660 (עד פי 39.7 ו-11.7, בהתאמה), וכתוצאה מכך רמות ביטוי גבוהות יחסית (עד פי 1.4 ± 0.14 ו-7.2 ± 1.3, בהתאמה). 83A:476 גילה גם עלייה מסוימת בגן TanjilG_05042 (עד פי 3.8), אולם רמות הביטוי היחסיות שהושגו (0.044 ± 0.002) היו נמוכות פי 30 ביותר מאלה שנצפו במנדלופ ובאוכלוסיית 22660. ניתוח באמצעות qPCR הראה הבדלים משמעותיים ברמות הביטוי בין גנוטיפים בווריאנטים שחוסנו בדמה (ביקורת), והגיע להבדל של פי 58 בין אוכלוסיות 22660 ו-83A:476, כמו גם בין אוכלוסיות 22660 ו-22660. הבדל כפול הושג בין בורגין למנדלופ.
הגן המועמד בלוקוס AnMan, TanjilG_12861, הופעל בתגובה לחיסון ב-83A:476 וב-Mandelup, היה ניטרלי באוכלוסיית 22660, והיה בעל ויסות מופחת ב-Boregine (איור 6f). הביטוי היחסי של הגן TanjilG_12861 היה הגבוה ביותר ב-83A:476 שהוכנס לחיסון (0.14±0.01). גן חלבון הלם חום מסוג I במשקל 17.4 kDa, TanjilG_05080 HSP17.4, הראה רמות ביטוי יחסיות נמוכות יותר בכל הזנים ונקודות הזמן שנחקרו (איור 6g). הערך הגבוה ביותר נצפה ב-24 HPI באוכלוסיית 22660 (0.14 ± 0.02, עלייה פי שמונה בתגובה לחיסון).
השוואה של פרופילי ביטוי גנים (איור 7) גילתה מתאם גבוה בין TanjilG_10657 לארבעה גנים אחרים: TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.80), ו-TanjilG_04706 (r = 0.79). תוצאות כאלה עשויות להצביע על ויסות משותף של גנים אלה במהלך תגובות הגנה. הגנים TanjilG_12861 ו-TanjilG_23384 הראו פרופילי ביטוי שונים עם ערכי מקדם מתאם פירסון נמוכים יותר (מ-0.08 עד 0.43 ו--0.19 עד 0.28, בהתאמה) בהשוואה לגנים אחרים.
קורלציות בין פרופילי ביטוי גנים זוהו באמצעות PCR כמותי. קווי התורמוס הצרים הבאים נותחו: 83A:476 (עמיד, נושא את האלל ההומוזיגוטי Lanr1), Mandelup (עמיד במידה בינונית, נושא את האלל ההומוזיגוטי AnMan), Boregine (עמיד, רקע גנטי לא ידוע), ואוכלוסייה 22660 (רגיש). חושבו שלוש נקודות זמן (6, 12 ו-24 שעות לאחר ההזרקה), כולל צמחים מחוסנים (Colletotrichum lupini, זן Col-08, שהושג משדות תורמוס בווירז'ניצה, פולין, בשנת 1999) וצמחים בקרה (חוסנים במובן). הסולם מציג את ערך מקדם המתאם של פירסון.
בהתבסס על נתונים שהתקבלו ב-6 כוחות סוס לאינץ', בוצעה בדיקת WGCNA על 9981 DEG שזוהו על ידי השוואת צמחים מחוסנים וצמחי ביקורת כדי להתמקד בתגובות הגנה מוקדמות (טבלה משלימה S12). נמצאו עשרים ושניים מודולי גנים (אשכולות) עם פרופילי ביטוי מתואמים (חיוביים או שליליים) בין גנוטיפים לווריאנטים ניסיוניים. בממוצע, רמות ביטוי גנים היו יורדות בסדר 83A:476 > מנדלופ > בורגין > אוכלוסייה 22660 (עם זאת, בשני הווריאנטים, מגמה זו הייתה חזקה יותר בצמחי הביקורת). בממוצע, רמות ביטוי גנים היו יורדות בסדר 83A:476 > מנדלופ > בורגין > אוכלוסייה 22660 (עם זאת, בשני הווריאנטים, מגמה זו הייתה חזקה יותר בצמחי הביקורת). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > אוכלוסייה 22660 (в обоих вариантах, вариантах тенденция была сильнее у контрольных растений). בממוצע, רמות ביטוי גנים ירדו בסדר גודל 83A:476 > מנדלופ > בורגין > אוכלוסייה 22660 (בשני הווריאנטים, לעומת זאת, מגמה זו הייתה חזקה יותר בצמחי הביקורת).平均而言，基因表达水平按83A:476 > מנדלופ > בורג'ין > אוכלוסייה 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> אוכלוסייה 22660 的 顺序 下降 （， 県 噿在 在 植物 中 更）。。。。。。。。。…… В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > מנדלופ > בורג'ין > אוכלוסייה 22660 была сильнее у контрольных растений). בממוצע, רמות ביטוי הגנים ירדו בסדרה 83A:476 > מנדלופ > בורגין > אוכלוסייה 22660 (עם זאת, בשני הווריאנטים, מגמה זו הייתה חזקה יותר בצמחי הביקורת).חיסון הביא לעלייה בביטוי גנים, במיוחד במודולים 18, 19, 14, 6 ו-1 (בסדר יורד של השפעה), ויסות שלילי (למשל מודולים 9 ו-20) או עם השפעות ניטרליות (למשל מודולים 11, 22, 8 ו-13). ניתוח העשרה של מונחי GO (טבלה משלימה S13) גילה "GO: 0006952 תגובות מגן" עבור המודול שהוכנס (18) עם הפעלה מקסימלית, כולל גנים שנותחו על ידי qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 ו-TanjilG_27015), כמו גם מודולים רבים של הפוטוסינתזה המדוכאת ביותר של ה-Inoculate (9). מודול 18 (איור 8) זוהה כגן TanjilG_26536 המקודד לחלבון LlR18B דמוי PR-10, ומרכז מודול 9 זוהה כגן TanjilG_28955 המקודד לחלבון PsbQ של פוטוסיסטם II. גן עמידות לאנתרקנוז, Lanr1, ‏TanjilG_05042, נמצא במודול 22 (איור 9) והוא קשור למונחים "GO:0044260 Cellular macromolecular metabolic processes" ו-"GO:0006355 Transcriptional Regulation, DNA templating" הנושא את הרכזת TanjilG_01212. הגן מקודד את גורם שעתוק עומס חום A-4a (HSFA4a).
ניתוח רשת משוקלל של ביטוי משותף של גנים של מודולים עם מונחי תהליך ביולוגיים מיוצגים ביתר "GO: 0006952 Defense responses". קשירת הגנים פושטה כדי להדגיש את ארבעת הגנים שנותחו על ידי qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 ו-TanjilG_27015).
ניתוח רשת משוקלל של ביטוי משותף גנטי של מודול עם מונח תהליך ביולוגי מיוצג ביתר "GO: 0006355: תקנה תעתוקית, תבניות DNA" ונושא גן עמידות מועמד לאנתרקנוז Lanr1 TanjilG_05042. קשירת הגן פושטה כדי לבודד את הגן TanjilG_05042 ואת הגן המרכזי TanjilG_01212.
בדיקות סקר לעמידות לאנתרקנוז שנאספו באוסטרליה הראו שרוב הזנים ששוחררו מוקדם היו רגישים; קליה, קורומופ ומנדלופ תוארו כעמידים במידה בינונית, בעוד שווונגה, טנג'יל ו-83A:476 תוארו כעמידים מאוד26,27,31. היו בעלי אותו אלל עמידות, שסומן ב-Lanr1, ולקורומופ ומנדלופ היה אלל שונה, שסומן ב-AnMan10,26,39, בעוד שקליה העבירה אלל שונה, Lanr2. בדיקות סקר לעמידות לאנתרקנוז בגרמניה הביאו לזיהוי של קו עמיד Bo7212 עם אלל מועמד שאינו Lanr1, שסומן ב-LanrBo36.
המחקר שלנו גילה שכיחות נמוכה מאוד (כ-6%) של האלל Lanr1 בגידול הנבט שנבדק. תצפית זו עולה בקנה אחד עם תוצאות סינון גידול הנבט ממזרח אירופה באמצעות הסמנים Anseq3 ו-Anseq4, שהראו כי האלל Lanr1 קיים רק בשני קווים בלארוסיים. דבר זה מצביע על כך שאלל Lanr1 עדיין אינו בשימוש נרחב על ידי תוכניות רבייה מקומיות, בניגוד לאוסטרליה, שם הוא אחד האללים המרכזיים לרבייה בסיוע סמנים. ייתכן שזה נובע מרמת העמידות הנמוכה יותר שמספק האלל Lanr1 בתנאי שדה אירופיים בהשוואה לדו"ח האוסטרלי. בנוסף, מחקרים על אנתרקנוז באזורים עתירי גשם באוסטרליה הראו כי תגובות עמידות בתיווך האלל Lanr1 עשויות שלא להיות יעילות בתנאי מזג אוויר המעודדים צמיחה והתפתחות מהירה של הפתוגן19,42. למעשה, במחקר הנוכחי, נצפו גם כמה תסמינים של אנתרקנוז בגנוטיפים הנושאים את האלל Lanr1, דבר המצביע על כך שעמידות עשויה להיעלם בתנאים אופטימליים להתפתחות C. lupini. בנוסף, פרשנויות חיוביות שגויות לנוכחות סמני Anseq3 ו-Anseq4, הנמצאים במרחק של כ-1 cM ממוקד Lanr1, אפשריות 28,30,43.
המחקר שלנו הראה כי נבגי אנתרקס 83A:476, הנושאים את האלל Lanr1, הגיבו לחיסון C. lupini באמצעות תכנות מחדש של טרנסקריפטומים בקנה מידה גדול בנקודת הזמן הראשונה שנותחה (6 שעות בשבוע), בעוד שבמנדלופ, הנושאים את האלל AnMan, תגובות טרנסקריפטומיות נצפו הרבה יותר מאוחר (מ-24 עד 48 שעות בשבוע). שינויים זמניים אלה בתגובות ההגנה קשורים להבדלים בתסמיני המחלה, דבר המדגיש את החשיבות של זיהוי מוקדם של פתוגנים לתגובה מוצלחת לעמידות. כדי להדביק רקמת צמח, נבגי אנתרקס חייבים לעבור מספר שלבי התפתחות על פני השטח של המארח, כולל נביטה, חלוקת תאים ויצירת אפרסוריום. תוספת היא מבנה זיהומי הנצמד לפני השטח של המארח ומקל על חדירה לרקמות המארח. לפיכך, נבגי C. gloeosporioides בתמצית אפונה הראו את החלוקה הראשונה של הגרעין לאחר 75-90 דקות של דגירה, היווצרות צינור נבט לאחר 90-120 דקות ודיכוי לאחר 4 שעות. נביטת צמח המנגו C. gloeosporioides הראתה יותר מ-40% נביטה של ​​קונידיאלים לאחר 3 שעות דגירה וכ-20% היווצרות מדכאים לאחר 4 שעות. גן CAP20 הקשור לאלרגיות של C. gloeosporioides הראה פעילות שעתוק בקונידיה יוצרת אפיפיטים לאחר דגירה של 3.5 שעות בשעווה על פני השטח של אבוקדו עם ריכוזים גבוהים של חלבון CAP20 לאחר 4 שעות ו-46 דקות. באופן דומה, פעילות גנים לביוסינתזה של מלנין ב-C. trifolii הושרה במהלך דגירה של שעתיים ולאחר מכן היווצרות אפרסוריום לאחר שעה. מחקרים ברקמות עלים הראו שתותים שחוסנו ב-C. acutatum מדכאים לראשונה לאחר 8 שעות ביום, בעוד שעגבניות שחוסנו ב-C. coccodes מדכאות לראשונה לאחר 4 שעות ביום48,49. תוצאה עקבית במידה רבה עם סולם הזמן של תהליך הזיהום של Colletotrichum spp. תגובות הגנה מהירות ל-83A:476 מצביעות על מעורבות של גנים של עמידות צמחית וחסינות המופעלת על ידי אפקטור (ETI) בקו זה, בעוד שהתגובות המאוחרות של מנדלופ תומכות בהשערת החסינות המופעלת על ידי דפוס מולקולרי מיקרו-קשורה (MTI) 50. תגובות מוקדמות ל-83A:476 ולמנדלופ. החפיפה החלקית בין גנים המווסתים כלפי מעלה או כלפי מטה בתגובה מאוחרת תומכת גם היא ברעיון זה, שכן ETI נחשב לעתים קרובות לתגובת MTI מואצת ומשופרת שמגיעה לשיאה במוות תאי מתוכנת באתר הזיהום, המכונה הלם אנפילקטי 51,52.
רוב הגנים המיוחסים למונח Gene Ontology GO:0006952 "Defense Response" (תגובת הגנה), המוצג ביתר, הם 11 הומולוגים של חלבון 22 המושרה על ידי לחץ (בדומה ל-SAM22) ושבעת חלבוני הלטקס דמויי החלבון העיקריים (MLPs). חלבונים דמויי לטקס 31, 34, 43 ו-423 הראו דמיון ברצף. גנים דמויי SAM22 הראו הפעלה משמעותית שנמשכה זמן רב יותר, והראו רמות מוגברות של עמידות לאנתרקנוז (83A:476 ו-Boregine). עם זאת, גנים דמויי MLP היו מווסתים כלפי מטה רק בקווים הנושאים את אלל העמידות המועמד (83A:476/Lanr1 ב-6 hpi ו-Mandelup/AnMan ב-24 hpi). יש לציין שכל ההומולוגים דמויי SAM22 שזוהו מקורם באשכול גנים המשתרע על פני כ-105 kb, בעוד שגנים דמויי MLP מקורם באזורים נפרדים של הגנום. הפעלה מתואמת של גנים דמויי SAM22 כאלה נמצאה גם במחקר הקודם שלנו על עמידות NLL לחיסון Diaporthetoxica, דבר המצביע על כך שהם מעורבים במרכיבים האופקיים של תגובת ההגנה. מסקנה זו נתמכת גם על ידי דיווחים על תגובה חיובית של גנים דמויי SAM22 לפגיעה או טיפול בחומצה סליצילית, מעוררי פטריות או מי חמצן.
גנים דמויי MLP הוכחו כמגיבים למגוון גורמים של עקה אביוטית וביוטית, כולל זיהומים חיידקיים, ויראליים ופתוגניים במיני צמחים רבים55. כיווני התגובה לאינטראקציות מסוימות בין צמחים לפתוגנים נעו בין עלייה חזקה (כלומר, במהלך נגיעות של כותנה עם Verticillium dahliae) לירידה משמעותית (כלומר, לאחר הדבקה של עץ תפוח עם Alternaria spp.)56,57. ירידה משמעותית בגן MLP-like 423 נצפתה במהלך הגנות אבוקדו מפני זיהום F. niger ובמהלך הדבקה של עץ התפוח Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola ו-Alternaria alternata הם פתוטיפים של תפוחים58,59. בנוסף, קלי תפוח המבטאים ביתר את הגן MLP-like 423 הראו ביטוי נמוך יותר של גנים הקשורים לעמידות והיו רגישים יותר לזיהום פטרייתי59. בעקבות Fusarium oxysporum f, הגן MLP-like 423 דוכא גם בנבט של שעועית רגילה עמידה. cn. זיהום שעועית 60.
חברים נוספים במשפחת PR-10 שזוהו במחקר ה-RNA-seq שלנו היו הגנים LlR18A ו-LlR18B בתגובה לעליית ויסות, כמו גם הגן המווסת לעליית ויסות (גן 1) או המווסת כלפי מטה (3 גנים) עבור חלבון העברת השומנים DIR1. בנוסף, WGCNA מדגיש את הגן LlR18B כמרכז במודול זה, שהוא רגיש מאוד לחיסון ונושא מספר גנים של תגובה מגנה. הגנים LlR18A ו-LlR18B הושרו בעלי תורמוס צהובים בתגובה לחיידקים פתוגניים, כמו גם בגבעולי NLL לאחר חיסון D. toxica, בעוד שההומולוג של האורז של גנים אלה, RSOsPR10, הושרה במהירות על ידי זיהום פטרייתי שככל הנראה מעורב במסלול האיתות של חומצה יסמונית 53,61, 62. הגן DIR1 מקודד חלבוני העברת שומנים לא ספציפיים הנדרשים להופעת עמידות נרכשת מערכתית (SAR). עם התפתחות תגובות מגנות, חלבון DIR1 מועבר ממוקד הזיהום דרך השיפה כדי לגרום ל-SAR באיברים מרוחקים. מעניין לציין, כי הגן TanjilG_02313 DIR1 הושרה באופן משמעותי בנקודת הזמן הראשונה בקווים 84A:476 ובאוכלוסייה 22660, אך עמידות לאנתרקנוז התפתחה בהצלחה רק בשורה 84A:476. ייתכן שזה מצביע על תת-פונקציונליזציה מסוימת של הגן DIR1 ב-NLL, מכיוון ששלושת ההומולוגים הנותרים הגיבו לחיסון רק בקו 83A:476 ב-6 שעות בשבוע, ותגובה זו כוונה כלפי מטה.
במחקר שלנו, הרכיבים הנפוצים ביותר התואמים לתהליך הביולוגי הנקרא "תהליך חמצון-חיזור GO:0055114" היו חלבון ציטוכרום P450, פראוקסידאז, חומצה לינולאית 9S-/13S-ליפוקסיגנאז, ו-1-אמינוציקלופרופן-1-קרבוקסילית אוקסידאז. בנוסף, מחקר WGCNA שלנו מגדיר את ההומולוג של HSFA4a כנושא הנושא מודולים כגון מועמד הגן עמידות Lanr1 TanjilG_05042. HSFA4a הוא רכיב בוויסות תלוי-חמצון-חיזור של שעתוק גרעיני בצמחים.
חלבוני ציטוכרום P450 הם אוקסידורדוקטאזות המזרזות תגובות הידרוקסילציה תלויות NADPH ו/או O2 בחילוף חומרים ראשוני ומשני, כולל חילוף חומרים מזינים, כמו גם הורמונים, חומצות שומן, סטרולים, רכיבי דופן תא, ביופולימרים וביוסינתזה של תרכובות מגנות 69. במחקר שלנו, השונות בתפקוד ציטוכרום P450 בצמח פחתה מ-10.6 log2 (שינוי קיפול) ל-5.7 עקב מספר רב של הומולוגים משתנים (37) והבדלים בדפוסי תגובה בין גנים ספציפיים, מה שמשקף עדכון כלפי מעלה. שימוש בנתוני RNA-seq בלבד כדי להבהיר את התפקוד הביולוגי המשוער של גני NLL במשפחת חלבונים כה גדולה יהיה ספקולטיבי ביותר. עם זאת, ראוי לציין שחלק מגני ציטוכרום P450 קשורים לעמידות מוגברת לפטריות או חיידקים פתוגניים, כולל תרומה לתגובות אלרגיות 69,70,71.
פרוקסידאזות מסוג III הן אנזימים צמחיים רב-תכליתיים המעורבים במגוון רחב של תהליכים מטבוליים במהלך גדילה והתפתחות צמחים, כמו גם בתגובה ללחצים סביבתיים כגון מליחות, בצורת, עוצמת אור גבוהה והתקפת פתוגנים72. פרוקסידאזות מעורבות באינטראקציה של מספר מיני צמחים עם Anthracis, כולל Stylosanthes humilis ו-C. gloeosporioides, Lens culinaris ו-C. truncatum, Phaseolus vulgaris ו-C. lindemuthianum, Cucumis sativus ו-C. lagenarium73,74,75,76. התגובה מהירה מאוד, לפעמים אפילו ב-4 HPI, לפני שהפטרייה חודרת לרקמת הצמח73. גן הפרוקסידאז הגיב גם לחיסון NLL של D. toxica. בנוסף לתפקידיהם האופייניים לוויסות התפרצות חמצונית או סילוק לחץ חמצוני, פרוקסידאזות יכולות להפריע לגדילת פתוגנים על ידי יצירת מחסומים פיזיים המבוססים על חיזוק דופן התא במהלך ליגניפיקציה, קישור תת-יחידות או קישור צולב של תרכובות ספציפיות. ניתן לייחס פונקציה זו in silico לגן TanjilG_03329 המקודד אניון פראוקסידאז ליצירת ליגנין, אשר היה מוגבר באופן משמעותי במחקר שלנו בקו העמיד 83A:476 ב-6 HPI, אך לא בזנים ובנקודות זמן אחרות שלא הגיבו.
9S-/13S-ליפוקסיגנאז של חומצה לינולאית הוא הצעד הראשון במסלול החמצוני של ביוסינתזה של ליפידים78. לתוצרי מסלול זה מספר פונקציות בהגנה על הצמח, כולל חיזוק דופן התא באמצעות היווצרות משקעי קלוז ופקטין, וויסות עקה חמצונית באמצעות ייצור של מיני חמצן ריאקטיביים79,80,81,82,83. במחקר הנוכחי, הביטוי של חומצה לינולאית 9S-/13S-ליפוקסיגנאז השתנה בכל הזנים, אך באוכלוסייה הרגישה 22660, גברה עלייה ברמת הוויסות בנקודות זמן שונות, בעוד שבזנים הנושאים את האלל Lanr1 והאלל AnMan העמידים, הוא מדגיש את הגיוון של שכבת האוקסיליפין בתגובות אנתרקס מגנות בין גנוטיפים אלה.
ההומולוג של 1-אמינוציקלופרופן-1-קרבוקסילאט אוקסידאז (ACO) היה מווסת באופן משמעותי כלפי מעלה (9 גנים) או כלפי מטה (2 גנים) כאשר הוזן עם תורמוס. למעט שני יוצאים מן הכלל, כל התגובות הללו התרחשו ב-6 hp ב-83A:476. התגובה האנזימטית בתיווך חלבוני ACO היא השלב מגביל הקצב בייצור אתילן ולכן היא מווסתת מאוד84. אתילן הוא הורמון צמחי הממלא מגוון תפקידים בוויסות התפתחות הצמח ותגובתו לתנאי עקה אביוטיים וביוטיים. אינדוקציה של שעתוק ACO והפעלת מסלול איתות אתילן מעורבים בהגברת עמידות האורז לפטרייה ההמיביוטרופית oryzae oryzae על ידי ויסות ייצור מיני חמצן ריאקטיביים ופיטואלקסים. תהליך זיהום עלים דומה מאוד שנמצא בין M. oryzae ו-C. lupini88,89, על רקע עלייה משמעותית בהומולוגים של ACO בקו 83A:476 שדווח במחקר זה, מעביר את האפשרות להעניק עמידות לאנתרקנוז אתילן של NLL, שלב מרכזי באיתות במסלולים מולקולריים.
במחקר הנוכחי, נצפה דיכוי בקנה מידה גדול של גנים רבים הקשורים לפוטוסינתזה ב-6 hpi ב-83A:476 וב-48 hpi במנדלופ ובאוכלוסייה של 22660. היקף והתקדמות השינויים הללו פרופורציונליים לרמה. בניסוי זה נצפתה עמידות לאנתרקנוז. לאחרונה, דווח על דיכוי חזק ומוקדם של תמלילים הקשורים לפוטוסינתזה במספר מודלים של אינטראקציות בין צמחים לפתוגנים, כולל חיידקים ופטריות פתוגניים. דיכוי מהיר (מ-2 HPI בחלק מהאינטראקציות) ודיכוי כללי של גנים הקשורים לפוטוסינתזה בתגובה לזיהום יכולים לעורר חסינות צמחית על סמך פריסת מיני חמצן ריאקטיביים והאינטראקציה שלהם עם מסלול חומצה סליצילית לתווך תגובות אלרגיות 90,94.
לסיכום, מנגנוני תגובת הגנה שהוצעו עבור השושלת העמידה ביותר (83A:476) כוללים זיהוי מהיר של פתוגנים על ידי הגן R (ככל הנראה TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) ואיתות חומצה סליצילית ואתילן בתיווך תגובה אלרגית, ולאחר מכן ביסוס SAR ארוך טווח. הפעולה נתמכת על ידי חלבון DIR-1. יש לציין כי התקופה הביוטרופית לזיהום ב-C. lupini קצרה מאוד (כ-2 ימים), ולאחר מכן צמיחה נמקית95. המעבר בין שלבים אלה עשוי להיות קשור לנמק ולביטוי של חלבונים המושרים על ידי אתילן הפועלים כגורמים מעוררים לתגובות רגישות יתר בצמחי פונדקאים. לכן, חלון הזמן ללכידה מוצלחת של C. lupini בשלב הביוטרופי הוא צר מאוד. התכנות מחדש של גנים הקשורים לחמצון-חיזור ופוטוסינתזה שנצפה ב-83A:476 ב-6 שעות בשבוע עולה בקנה אחד עם התקדמות ההיפות הפטרייתיות ומבשר על התפתחות תגובה מגנה מוצלחת בשלב הביוטרופי. ייתכן שהתגובות הטרנסקריפטומיות של מנדלופ ושל אוכלוסיית 22660 מתעכבות מדי מכדי ללכוד את הפטרייה לפני המעבר לצמיחה נמקית, אולם, מנדלופ עשוי להיות יעיל יותר מאוכלוסיית 22660 מכיוון שהוויסות המהיר יחסית של חלבון PR-10 מקדם עמידות אופקית.
נראה כי עמידות בפני אנתרקנוז (ETI), המונעת על ידי הגן הקנוני R, היא מנגנון נפוץ לעמידות שעועית לאנתרקנוז. לפיכך, בקטנית המודל Medicago truncatula, עמידות לאנתרקנוז מוענקת על ידי הגן R1, חבר במחלקת גן ה-R של הצמח TIR-NBS-LRR97. גן זה מעניק גם עמידות רחבת טווח לאנתרקנוז באספסת כאשר היא מועברת לצמחים רגישים. בשעועית מצויה (P. vulgaris), זוהו עד כה יותר משני תריסר גנים של עמידות לאנתרקנוז. חלק מהגנים הללו נמצאים באזורים החסרים גנים קנוניים של R, אולם רבים אחרים ממוקמים בקצוות הכרומוזומים הנושאים את צביר הגנים NBS-LRR, כולל TIR-NBS-LRRs99. מחקר ה-SSR כלל-גנומי אישר גם את הקשר של הגן NBS-LRR לעמידות לאנתרקנוז בשעועית מצויה. הגן הקנוני R נמצא גם באזור הגנומי הנושא את מוקד העמידות העיקרי לאנתרקנוז בתורמוס לבן 101.
עבודתנו מראה שתגובת עמידות מיידית, המופעלת בשלב מוקדם של זיהום הצמח (רצוי לא יאוחר מ-12 שעות בשבוע), מגנה ביעילות על תורמוס צר-עלים מפני אנתרקנוז הנגרמת על ידי הפטרייה הפתוגנית Collelotrichum lupini. באמצעות ריצוף תפוקה גבוהה, הדגמנו פרופילי ביטוי דיפרנציאליים של גנים עמידים לאנתרקנוז בצמחי NLL בתיווך גני העמידות Lanr1 ו-AnMan. הגנה מוצלחת כרוכה בתכנון קפדני של הגנים לחלבונים המעורבים בחמצון-חיזור, פוטוסינתזה ופתוגנזה תוך שעות מהמגע הראשון של הצמח עם פתוגן. תגובות הגנה דומות, אך מתעכבות בזמן, הן הרבה פחות יעילות בהגנה על צמחים מפני מחלות. עמידות לאנתרקס בתיווך הגן Lanr1 דומה לתגובה המהירה האופיינית של גן R (חסינות המופעלת על ידי אפקטור), בעוד שגן AnMan מספק ככל הנראה תגובה אופקית (חסינות המופעלת על ידי דפוס מולקולרי הקשור למיקרוב), ומספקת רמה בינונית של קיימות.
215 קווי ה-NLL ששימשו לסינון סמני אנתרקנוז כללו 74 זנים, 60 קווים שהתקבלו על ידי הכלאה או רבייה, 5 מוטציות ו-76 זני נבט פראיים או מקוריים. הקווים הגיעו מ-17 מדינות, בעיקר מפולין (58), ספרד (47), גרמניה (27), אוסטרליה (26), רוסיה (19), בלארוס (7), איטליה (5) וקווים אחרים מ-10 מדינות. הסט כולל גם קווי ייחוס עמידים: 83A:476, Tanjil, Wonga הנושאים את האלל Lanr1, ומנדלופ הנושאים את האלל AnMan. הקווים התקבלו ממאגר המשאבים הגנטיים של תורמוסים אירופאי המתוחזק על ידי Poznań Plant Breeding Ltd., ויאטרובו, פולין (טבלה משלימה S1).
צמחים גודלו בתנאים מבוקרים (תקופת אור 16 שעות, טמפרטורה 25°C במהלך היום ו-18°C בלילה). נותחו שני דגימות ביולוגיות. DNA בודד מעלים בני שלושה שבועות באמצעות ערכת DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, גרמניה) בהתאם לפרוטוקול. איכות וריכוז ה-DNA המבודד הוערכו בשיטות ספקטרופוטומטריות (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב). נותחו סמן AnManM1 המסמן את גן העמידות לאנתרקנוז AnMan (נגזר מהקורונה Mandelup) והסמנים Anseq3 ו-Anseq4 המקיפים את הגן Lanr1 (נגזר מהקורונה Tanjil). הומוזיגוטים לאלל העמיד דורגו כ-"1", רגישים - כ-"0", והטרוזיגוטים - כ-0.5.
בהתבסס על תוצאות הסינון לסמנים AnManM1, AnSeq3 ו-AnSeq4 ועל זמינות הזרעים לניסויי מעקב סופיים, נבחרו 50 קווי NLL לפנוטיפיזציה של עמידות לאנתרקנוז. הניתוח בוצע בכפילות בחממה מבוקרת מחשב עם תקופת אור של 14 שעות וטווח טמפרטורות של 22°C במהלך היום ו-19°C בלילה. הזרעים נגרדו (חיתוך קליפת הזרע בצד הנגדי של העובר בעזרת סכין חדה) לפני הזריעה כדי למנוע תרדמת הזרעים עקב קשה מדי של קליפת הזרע ולהבטיח נביטה אחידה. הצמחים גודלו בעציצים (11 × 11 × 21 ס"מ) עם אדמה סטרילית (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, ורשה, פולין). ההזרקה בוצעה באמצעות זן Colletotrichum lupini Col-08, שגודל בשנת 1999 מגבעולי צמחי תורמוס צרי-עלים שגודלו בשדה בורז'ניצה, פולין רבתי (52° 27′ 42″ צפון 17° 04′ 05″ מזרח). בחרו אזור. הזרעים גודלו במדיום SNA בטמפרטורה של 20° צלזיוס תחת אור שחור למשך 21 יום כדי לגרום ליצירת נבגים. ארבעה שבועות לאחר הזריעה, כאשר הצמחים הגיעו לשלב 4-6 עלים, ההזרקה בוצעה על ידי ריסוס בתרחיף קונידיה בריכוז של 0.5 x 106 קונידיה לכל מ"ל. לאחר ההזרקה, הצמחים הוחזקו בחושך למשך 24 שעות בלחות של כ-98% וטמפרטורה של 25° צלזיוס כדי להקל על נביטת הקונידיה ועל תהליך ההדבקה. לאחר מכן גודלו הצמחים תחת תקופת אור של 14 שעות בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס ביום/19 מעלות צלזיוס בלילה ולחות של 70%. ציון המחלה נקבע 22 ימים לאחר ההזרקה ונע בין 0 (חיסון) ל-9 (רגיש מאוד) בהתאם לנוכחות או היעדר נגעים נמקיים על הגבעולים והעלים. בנוסף, לאחר הניקוד, נמדד משקל הצמחים. הקשרים בין גנוטיפים של סמנים לפנוטיפים של מחלות חושבו כקורלציות של נקודות דו-רצפיות (היעדר סמנים הטרוזיגוטיים בקבוצת הקווים לניתוח פנוטיפ עמידות לאנתרקנוז).