Tankewol foar jo besite oan Nature.com. De browserferzje dy't jo brûke hat beheinde CSS-stipe. Foar de bêste ûnderfining riede wy jo oan om in bywurke browser te brûken (of kompatibiliteitsmodus yn Internet Explorer út te skeakeljen). Yn 'e tuskentiid, om trochgeande stipe te garandearjen, sille wy de side sûnder stilen en JavaScript werjaan.
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) is in peulvrucht dy't brûkt wurdt foar itenproduksje en boaiemferbettering. De wrâldwide útwreiding fan NLL as gewaaks hat in protte patogene skimmels oanlutsen, ynklusyf lupine-antracnose, dy't de ferneatigjende antraknosesykte feroarsaket. Twa allelen, Lanr1 en AnMan, dy't ferhege wjerstân jouwe, binne brûkt yn NLL-fokkerij, mar de ûnderlizzende molekulêre meganismen bliuwe ûnbekend. Yn dizze stúdzje waarden de Lanr1- en AnMan-markers brûkt om Jeropeeske NLL-samples te screenen. Testen fan it faksin yn in kontroleare omjouwing befêstige de effektiviteit fan beide resistente donoren. Differinsjele genekspresjeprofilering waard útfierd op represintative resistente en gefoelige linen. Antraknose-resistinsje waard assosjeare mei oerekspresje fan 'e genontologytermen "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process", en "GO:0015979 Photosynthesis". Derneist liet de Lanr1(83A:476) line wichtige transkriptoom-herprogrammearring rap sjen nei yninting, wylst de oare linen in fertraging yn dizze reaksje fan sawat 42 oeren lieten sjen. Ferdigeningsreaksjes wurde assosjeare mei de TIR-NBS-, CC-NBS-LRR- en NBS-LRR-genen, 10 proteïnen belutsen by patogenese, lipide-oerdrachtproteïnen, endoglucan-1,3-β-glucosidase, glycine-rike selwandproteïnen, en genen fan it reaktive paad fan soerstof. Iere reaksjes op 83A:476, ynklusyf soarchfâldige ûnderdrukking fan genen dy't assosjeare binne mei fotosynteze, gongen gear mei suksesfolle beskerming tidens de fegetative groeifaze fan skimmelbiology, wat suggerearret dat in effektor immuniteit triggert. De Mandeloop-reaksje wurdt fertrage, lykas de algemiene horizontale wjerstân.
De smelblêdige lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) is in nôt mei in hege proteïne-ynhâld dy't ûntstien is yn 'e westlike Middellânske See-regio1,2. It wurdt op it stuit ferboud as in fiedingsgewaaks foar bisten en minsken. It wurdt ek beskôge as griene dong yn gewaaksrotaasjesystemen fanwegen stikstoffixaasje troch symbiotyske stikstoffixearjende baktearjes en in algemiene ferbettering fan 'e boaiemstruktuer. NLL hat yn 'e lêste ieu in rap proses fan domestikaasje ûndergien en stiet noch altyd ûnder hege fokdruk3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Mei de wiidfersprate kultivaasje fan NLL ûntwikkele de opienfolging fan patogene skimmels nije lânbouniches en feroarsake nije gewaaksferneatigjende sykten. It meast opmerklike foar lupineboeren en -kwekers wie it ferskinen fan anthracnose, feroarsake troch de patogene skimmel, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. It meast opmerklike foar lupineboeren en -kwekers wie it ferskinen fan anthracnose, feroarsake troch de patogene skimmel, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогного LU (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. It meast opmerklik foar lupineboeren en -kwekers wie it ûntstean fan anthracnose feroarsake troch de patogene skimmel Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由眀引人注目的是炭疽病的出现，它是由県它是由県(Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由眀引人注目的是炭疽病的出现，它是由県它是由県(Bondar)嵵Haired。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патмого lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. It meast opfallend foar lupineboeren en -kwekers is it ûntstean fan anthracnose feroarsake troch de patogene skimmel Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.De ierste rapporten fan 'e sykte kamen út Brazylje en de Feriene Steaten, mei typyske symptomen dy't ferskynden yn respektivelik 1912 en 1929. Nei sawat 30 jier waard de patogeen lykwols oantsjutten as Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf fan Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld yn Rjochte Morfology. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .en H. Schrenk. & H.施伦克,. & H.施伦克,.en H. Schlenk,.Foarriedige syktefenotyping útfierd yn 'e midden fan' e 20e iuw liet wat ferset sjen yn NLL- en giele lupine (L. luteus L.) aksessys, mar alle testte wite lupine (L. albus L.) aksessys wiene tige gefoelich15,16. Undersyk hat oantoand dat de ûntwikkeling fan anthracnose assosjeare wurdt mei ferhege delslach (loftfochtigens) en temperatuer (yn it berik fan 12-28 °C), wat liedt ta in oertreding fan ferset by hegere temperatueren17, 18. Eins wie de tiid dy't nedich wie foar konidia om te ûntkiemen en de sykte om te begjinnen, fjouwer kear koarter by 24 °C (4 oeren) dan by 12 °C (16 oeren) ûnder omstannichheden mei hege fochtigens19. Sa hat de oanhâldende wrâldwide opwaarming laat ta de fersprieding fan anthracnose. De sykte waard lykwols waarnommen yn Frankryk (1982) en Oekraïne (1983) as in foarteken fan in driigjende bedriging, mar waard doe blykber negearre troch de lupine-yndustry20,21. In pear jier letter fersprate dizze ferneatigjende sykte him oer de hiele wrâld en rekke ek wichtige lupineprodusearjende lannen lykas Austraalje, Poalen en Dútslân22,23,24. Nei in anthracnose-útbraak yn 'e midden fan' e jierren '90 resultearre wiidweidige screening yn 'e identifikaasje fan ferskate resistente donoren yn NLL19-samples. NLL-resistinsje tsjin anthracnose wurdt kontroleare troch twa aparte dominante allelen dy't fûn wurde yn ferskate kiemplasma-boarnen: Lanr1 yn cultivar Tanjil en Wonga en AnMan yn cultivar. Mandalay25,26. Dizze allelen komplementearje de molekulêre markers dy't de seleksje fan resistent kiemplasma yn fokprogramma's stypje25,26,27,28,29,30. De resistente fokline 83A:476 dy't it Lanr1-allel droech, waard krúst mei de gefoelige wylde line P27255 om in RIL-populaasje te krijen dy't segregearre foar antraknose-resistinsje, wat it mooglik makke om de Lanr1-lokus ta te wizen oan chromosoom NLL-1131, 32, 33. Útrjochting fan keppelingskaartmarkers fan flankearjende resistinsjeloci nei antraknose mei in genomysk ramt, NLL liet de lokaasje sjen fan alle trije allelen op itselde chromosoom (NLL-11), mar op ferskillende posysjes29,34,35. Fanwegen it lytse oantal RIL's en de grutte genetyske ôfstân tusken markers en oerienkommende allelen kinne lykwols gjin betroubere konklúzjes lutsen wurde oer har ûnderlizzende genen. Oan 'e oare kant is it gebrûk fan reverse genetika yn lupinen lestich fanwegen har heul lege regeneraasjepotinsjeel, wat genetyske manipulaasje omslachtich makket37.
De ûntwikkeling fan domestisearre kiemplasma dat it winske allel yn 'e homozygote steat draacht, lykas 83A:476 (Lanr1) en Mandelup (AnMan), hat de doar iepene foar it bestudearjen fan antraknose-resistinsje yn it ljocht fan 'e oanwêzigens fan tsjinoerstelde kombinaasjes fan allelen yn wylde populaasjes. Mooglikheden fan molekulêre meganismen. Fergelykje ferdigeningsreaksjes generearre troch spesifike genotypes. Dizze stúdzje evaluearre de iere transkriptoomreaksje fan NLL op C. lupini-faksinaasje. Earst waard in Europeesk NLL-kiemplasmapaniel mei 215 rigels screene mei molekulêre markers dy't de Lanr1- en AnMan-allelen markearje. Antraknose-fenotyping waard doe útfierd op 50 NLL-rigels, earder selektearre foar molekulêre markers, ûnder kontroleare omstannichheden. Op basis fan dizze eksperiminten waarden fjouwer rigels dy't ferskille yn antraknose-resistinsje en Lanr1/AnMan-allelkomposysje selektearre foar differinsjele ferdigeningsgenekspresjeprofilering mei twa komplementêre oanpakken: hege-trochput RNA-sekwinsje en real-time PCR-kwantifikaasje.
Screening fan in set NLL-kiemplasma (N = 215) mei markers Lanr1 (Anseq3 en Anseq4) en AnMan (Anseq4) en AnMan (AnManM1) liet sjen dat mar ien line (95726, tichtby Salamanca-b) it "resistinsje"-allel foar alle markers fersterket, wylst "Oanwêzigens fan 'gefoelige' allelen" it oandiel fan alle markers fûn yn 158 (~73,5%) linen. Trettjin linen produsearren twa "resistinte" allelen fan 'e Lanr1-marker, en 8 linen produsearren "resistinte" allelen fan Lanr1. marker. It "resistinsje"-allel fan 'e AnMan-marker (Oanfoljende Tabel S1). Twa linen wiene heterozygoot foar de Anseq3-marker en ien heterozygoot foar de AnManM1-marker. 42 linen (19,5%) droegen tsjinoerstelde fazen fan 'e Anseq3- en Anseq4-allelen, wat in hege frekwinsje fan rekombinaasje tusken dizze twa loci oanjout. Antraknose-fenotypen ûnder kontroleare omstannichheden (Oanfoljende Tabel S2) lieten fariaasje sjen yn 'e resistinsje fan' e testte genotypes, wat wjerspegele waard yn 'e earnst fan antraknose. Ferskillen yn gemiddelde skoares fariearden fan 1,8 (matig resistint) oant 6,9 (gefoelich) en ferskillen yn plantgewicht fariearden fan 0,62 (gefoelich) oant 4,45 g (resistint). Der wie in wichtige korrelaasje tusken wearden dy't waarnommen waarden yn twa replikaasjes fan it eksperimint (0,51 foar sykte-earnstskoares, P = 0,00017 en 0,61 foar plantgewicht, P < 0,0001) en ek tusken dizze twa parameters (-0,59 en -0,77, P < 0,0001). Der wie in wichtige korrelaasje tusken wearden dy't waarnommen waarden yn twa replikaasjes fan it eksperimint (0.51 foar sykte-earnstskoares, P = 0.00017 en 0.61 foar plantgewicht, P < 0.0001) en ek tusken dizze twa parameters (-0.59 en -0.77, P < 0.0001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 poal болезни, P = 0,00017 en 0,61 foar массы растения, P < 0,0001), as также между этими двумя параметрами (-0,59, 0, -0,59,0и) 0,0001). In wichtige korrelaasje waard fûn tusken de wearden dy't waarnommen waarden yn twa werhellingen fan it eksperimint (0.51 foar sykte-earnstskoares, P = 0.00017 en 0.61 foar plantgewicht, P < 0.0001), en ek tusken dizze twa parameters (- 0.59 en -0.77, P < 0.0001) 0.0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分丌丌. 0.00017，植物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77。0.01)在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 为庈度 诟分为 0.51 ， p = 0.00017 ， 植物 为 为 0.61 ， p <0.0001） 以及 两 个 参数 为（鈼（（，（，７ Fan 0.59 Nei 0.59 0,59 oant 0,77, P < 0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценколи тяжя 5, 5, p. = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0001), en между этими двумя параметрами (-0,59 en -0,0001) 0,77, P <0,00. Der wie in wichtige korrelaasje tusken de wearden dy't yn duplikaat waarnommen waarden (sykte-earnstskoare 0.51, P = 0.00017 en plantgewicht 0.61, P < 0.0001) en tusken dizze twa parameters (-0.59 en -0.0001) 0.77, P<0.0001. ).Typyske symptomen dy't sjoen wurde yn gefoelige planten omfetsje it knikken en draaien fan 'e stam dy't liket op in "hoedersbôge"-struktuer, folge troch ovale laesjes mei oranje/rôze sporozoïten (Oanfoljende Fig. 1). Australyske aksessys dy't de Lanr1 (83A:476 en Tanjil) en AnMan (Mandelup) genen drage, binne matich resistint, 0.0331 en 0.0036). Guon linen dy't ek "resistinte" Lanr1- en/of AnMan-allelen drage, litte symptomen fan 'e sykte sjen.
Nijsgjirrich is dat in pear NLL-linen sûnder in "resistint" markerallel in hege nivo fan anthracnose-resistinsje lieten sjen (fergelykber mei of heger as foar Lanr1- of AnMan-genotypen), lykas Boregine (P-wearde < 0.0001 foar beide parameters), Bojar (P-wearde < 0.0001 foar skoare en 0.001 foar plantgewicht) en Populaasje B-549/79b (P-wearde < 0.0001 foar skoare en net-signifikant foar gewicht). Nijsgjirrich is dat in pear NLL-linen sûnder in "resistint" markerallel in hege nivo fan anthracnose-resistinsje lieten sjen (fergelykber mei of heger as foar Lanr1- of AnMan-genotypen), lykas Boregine (P-wearde < 0.0001 foar beide parameters), Bojar (P-wearde < 0.0001 foar skoare en 0.001 foar plantgewicht) en Populaasje B-549/79b (P-wearde < 0.0001 foar skoare en net-signifikant foar gewicht). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, покасусаливы устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 и AnMan), таких как Boregine (fûns 0,000). параметров), Bojar (ûnthâld P < 0,0001 foar оценки en 0,001 foar массы растения) en популяции B-549/79b (ûntwerp P <0,0001 foar оценки и незначимо для массы). Nijsgjirrich is dat ferskate NLL-linen sûnder in 'resistint' markerallel in hege mjitte fan resistinsje tsjin anthracnose lieten sjen (fergelykber mei of heger as foar Lanr1- of AnMan-genotypen), lykas Boregine (P-wearde < 0.0001 foar beide parameters), Bojar (P-wearde < 0.0001 foar evaluaasje en 0.001 foar plantgewicht) en populaasje B-549/79b (P-wearde < 0.0001 foar evaluaasje en net signifikant foar gewicht).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值> It is nijsgjirrich dat guon NLL-systemen dy't gjin "antigenyske" markers hawwe, hege horizontale wjerstân sjen litte (lykweardich oan Lanr1- of AnMan-genen of heger), lykas Boregine (beide parameters P < 0.0001), Bojar (P-wearde < 0.0001, plantgewicht 0.001) en stam B-549/79b (P-wearde < 0.0001, gewicht net signifikant). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», покасазаливи устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P обобоих,00пара,00пара, 000пов), (oanwêzige P <0,0001, maksimaal 0,001) en B-549/79b (P-oandielen <0,0001, масса незначительна). Nijsgjirrich is dat guon NLL-linen sûnder 'resistinsje'-markerallelen hege nivo's fan anthracnose-resistinsje lieten sjen (fergelykber mei of heger as Lanr1- of AnMan-genotypen), lykas Boregine (P-wearde foar beide parameters <0.0001), Bojar (P-wearde < 0.0001, plantgewicht 0.001) en populaasje B-549/79b (P-wearde < 0.0001, gewicht net signifikant).Dit ferskynsel suggerearret de mooglikheid fan in nije genetyske boarne fan resistinsje, wat it waarnommen gebrek oan korrelaasje tusken markergenotypen en syktefenotypen ferklearret (P-wearden fan ~0.42 oant ~0.98). Sa liet de Kolmogorov-Smirnov-test sjen dat de gegevens oer antraknose-resistinsje sawat normaal ferdield wiene foar skoares (P-wearden 0.25 en 0.11) en plantmassa (P-wearden 0.47 en 0.55), wat suggerearret dat ik de hypoteze opstelle dat mear allelen as Lanr1 en AnMan belutsen binne.
Op basis fan 'e resultaten fan screening op antraksresistinsje waarden 4 linen selektearre foar transkriptoomanalyse: 83A:476, Boregine, Mandelup, en Populaasje 22660. Dizze linen waarden opnij hifke op antraksresistinsje yn ynokulaasje-eksperiminten troch RNA-sekwinsje, mits se itselde wiene as yn 'e foarige test. De skoarewearden wiene as folget: Boregin (1.71 ± 1.39), 83A: 476 (2.09 ± 1.38), Mandelup (3.82 ± 1.42) en populaasje 22660 (6.11 ± 1.29).
It Illumina NovaSeq 6000-protokol berikte in gemiddelde fan 40,5 Mread-pearen per stekproef (29,7 oant 54,4 Mreads) (Oanfoljende tabel S3). De ôfstimmingsskoares yn 'e referinsjesekwinsje fariearden fan 75,5% oant 88,6%. De gemiddelde korrelaasje fan lêstellinggegevens tusken eksperimintele farianten tusken biologyske replikaten fariearde fan 0,812 oant 0,997 (gemiddelde 0,959). Fan 'e 35.170 analysearre genen lieten 2917 gjin ekspresje sjen, en de oare 4785 genen waarden op in ferwaarloosber nivo útdrukt (basisgemiddelde < 5). Fan 'e 35.170 analysearre genen lieten 2917 gjin ekspresje sjen, en de oare 4785 genen waarden op in ferwaarloosber nivo útdrukt (basisgemiddelde < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировалис уровне (базовое среднее <5). Fan 'e 35.170 analysearre genen lieten 2917 gjin ekspresje sjen, en de oerbleaune 4785 genen waarden op in ferwaarloosber nivo útdrukt (basisgemiddelde <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）.35.170 Fan 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначировались ( среднее значение <5). Fan 'e 35.170 analysearre genen waarden 2917 net útdrukt en de oerbleaune 4785 genen hienen ferwaarloosbere ekspresje (basisgemiddelde <5).Sa wie it oantal genen dat as útdrukt beskôge waard (basisgemiddelde ≥ 5) tidens it eksperimint 27.468 (78,1%) (Oanfoljende tabel S4).
Fan it earste tiidpunt ôf reagearren alle NLL-linen op 'e yninting fan C. lupini (stam Col-08) troch it transkriptoom te reprogrammearjen (Tabel 1), lykwols waarden wichtige ferskillen tusken de linen waarnommen. Sa liet de resistinsjeline 83A:476 (dy't it Lanr1-gen draacht) wichtige transkriptoom-reprogrammearring sjen op it earste tiidpunt (6 hpi) mei in 31-69-fâldige tanimming fan it oantal isolearre op- en delgenen yn ferliking mei oare tiidpunten op dit tiidpunt. Derneist wie dizze pyk koart, om't de ekspresje fan mar in pear genen signifikant feroare bleau op it twadde tiidpunt (12 hpi). Nijsgjirrich is dat Boregine, dat ek in hege mjitte fan resistinsje sjen liet yn 'e transplantaattest, net sa'n massive transkripsjonele reprogrammearring ûndergie tidens it eksperimint. It oantal ferskillend útdrukte genen (DEG) wie lykwols itselde foar Boregine en 83A:476 op 12 HPI. Sawol Mandelup as populaasje 22660 lieten DEG-pieken sjen op it lêste tiidpunt (48 l/s), wat in relative fertraging yn ferdigeningsreaksjes oanjout.
Omdat 83A:476 massale transkriptoom-reprogrammearring ûndergie as reaksje op C. lupini by 6 HPI yn ferliking mei alle oare linen, wiene ~91% fan 'e DEG's dy't op dit tiidstip waarnommen waarden, lineage-spesifyk (Fig. 1). D'r wie lykwols wat oerlaap yn iere reaksjes tusken stúdzjelinen, om't 68,5%, 50,9% en 52,6% DEG yn Boregine, Mandelup en populaasje 22660, respektivelik, oerlaapten mei dy fûn yn 83A:476 op bepaalde tiidpunten. Dizze DEG's wiene lykwols mar ferantwurdlik foar in lytse fraksje (0,97–1,70%) fan alle DEG's dy't op it stuit detektearre binne mei 83A:476. Derneist wiene 11 DEG's fan alle linen op dit stuit koherint (Oanfoljende Tabellen S4-S6), ynklusyf mienskiplike komponinten fan plantferdigeningsreaksjes: lipide-oerdrachtproteïne (TanjilG_32225), endoglucan-1,3-β-glucoside-enzym (TanjilG_23384), twa stress-indusearbere proteïnen lykas SAM22 (TanjilG_31528 en TanjilG_31531), basisch latexproteïne (TanjilG_32352), en twa glycine-rike strukturele selwandproteïnen (TanjilG_19701 en TanjilG_19702). Der wie ek in relatyf hege oerlap yn transkriptoomreaksjes tusken 83A:476 en Boregine by 24 HPI (totaal 16-38% DEG) en tusken Mandelup en Populaasje 22660 by 48 HPI (totaal 14-20% DEG).
Venn-diagram dat it oantal ferskillend útdrukte genen (DEG) sjen lit yn smelblêdige lupine (NLL) linen yninting mei Colletotrichum lupini (stam Col-08 krigen fan lupinefjilden yn Wierzhenice, Poalen, 1999). De analysearre NLL-linen wiene: 83A:476 (resistint, drager fan it Lanr1-allel), Boregine (resistint, genetyske eftergrûn ûnbekend), Mandelup (matich resistint, drager fan it AnMan-allel) en populaasje 22660 (tige gefoelich). De ôfkoarting hpi stiet foar oeren nei faksinaasje. Nulwearden binne fuorthelle om de grafyk te ferienfâldigjen.
De set fan oerekspressearre genen by 6 hpi waard analysearre op 'e oanwêzigens fan kanonike R-gendomeinen (Oanfoljende tabel S7). Dizze stúdzje liet transkriptoomynduksje fan klassike sykteresistinsjegenen sjen mei allinich NBS-LRR-domeinen by 83A:476. Dizze set bestie út ien TIR-NBS-LRR-gen (tanjilg_05042), fiif CC-NBS-LRR-genen (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, en tanjilg_16162), en fjouwer NBS-LR, Tanjilg_16162), en fjouwer NBS-LRRE (tanjilg_16162), lykas fjouwer NBS-Lrr (tanjilg_16162) en fjouwer NBS-LRR (TANJILG_16162). Al dizze genen hawwe kanonike domeinen dy't yn konservearre sekwinsjes binne rangearre. Neist de NBS-LRR-domeingenen waarden ferskate RLL-kinasen aktivearre by 6 hpi, nammentlik ien yn Boregine (TanjilG_19877), twa yn Mandelup (TanjilG_07141 en TanjilG_19877) en yn populaasje 22660 (TanjilG_09014 en TanjilG_10361) en twa yn 83A 27:476.
Genen mei signifikant feroare ekspresje as reaksje op ynokulaasje mei C. lupini (stam Col-08) waarden ûnderwurpen oan Gene Ontology (GO) ferrikingsanalyze (Oanfoljende tabel S8). De meast faak oerfertsjintwurdige biologyske prosesterm wie "GO:0006952 ferdigeningsreaksje" dy't ferskynde yn 6 fan de 16 (tiid × line) kombinaasjes mei hege betsjutting (P-wearde < 0.001) (Fig. 2). De meast faak oerfertsjintwurdige biologyske prosesterm wie "GO:0006952 ferdigeningsreaksje" dy't ferskynde yn 6 fan de 16 (tiid × line) kombinaasjes mei hege betsjutting (P-wearde < 0.001) (Fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитнетый», появлялся в 6 fan 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (útjefte P <0,001) (r. 2). De meast faak oerfertsjintwurdige biologyske prosesterm wie 'GO:0006952 ferdigeningsreaksje', dy't ferskynde yn 6 fan 16 (tiid × lineage) kombinaasjes mei hege betsjutting (P-wearde < 0.001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）. De meast represintative biologyske prosesterm is "GO:0006952 ferdigeningsreaksje", dy't ferskynt yn 6 fan 'e 16 (时间×线) kombinaasjes, mei hege betsjutting (P-wearde < 0.001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», косторыв 16 косторыв 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). De meast faak oerfertsjintwurdige biologyske prosesterm wie 'GO:0006952 Defense Response', dy't ferskynde yn 6 fan de 16 kombinaasjes (tiid × line) mei hege betsjutting (P-wearde < 0.001) (Fig. 2).Dizze term waard oerfertsjintwurdige op twa tiidpunten yn 83A: 476 en Boregine (6 en 24 hpi) en op ien tiidpunt yn Mandelup en Populaasje 22660 (respektyflik 12 en 6 hpi). Dit is in ferwachte resultaat, dat de antifungale reaksje fan 'e resistente linen markearret. Derneist reagearre 83A:476 op C. lupini troch it rap ynducearjen fan genen relatearre oan 'e oksidative útbarsting fertsjintwurdige troch de term "GO:0055114 redoksproses", wat in spesifike ferdigeningsreaksje oanjout, wylst Boregine spesifike ferdigeningsreaksjes sjen liet, relatearre oan 'e term 'GO'. :0006950 Stressreaksje”. Populaasje 22660 aktivearre de horizontale fersetreaksje mei sekundêre metaboliten, wat it oermjittige oantal termen "GO:0016104 Proses fan triterpeenbiosynteze" en "GO:0006722 Proses fan triterpeenmetabolisme" markearret (beide termen hearre ta deselde set genen), rekken hâldend mei de resultaten fan 'e GO-termferrikingsanalyze, wie de stabiliteit fan 'e Mandelup-reaksje tusken Boregine en Populaasje 22660. Derneist omfetsje de iere reaksje 83A:476 (6 hpi) en de fertrage reaksje Mandelup en Populaasje 22660 de term GO:0015979 'fotosynteze' en oare relatearre biologyske prosessen.
De bioprosesgenontologytermen dy't selektearre binne yn 'e annotaasje fan ferskillend útdrukte genen tidens transkriptoomreaksjes fan smelblêdige lupine (NLL) yninting mei miltbrandlupine (Col-08-stam krigen fan lupinefjilden yn Wierzhenice, Poalen, yn 1999) binne sterk oerdreaun. De analysearre NLL-linen wiene: 83A:476 (resistint, drager fan it homozygote Lanr1-allel), Boregine (resistint, ûnbekende genetyske eftergrûn), Mandelup (matich resistint, drager fan it homozygote AnMan-allel) en populaasje 22660 (gefoelich).
Omdat dizze stúdzje rjochte wie op it identifisearjen fan genen dy't bydrage oan antraknose-resistinsje, waarden de genen dy't tawiisd waarden oan de termen GO "GO: 0006952 Defensive responses" en "GO: 0055114 Redox-prosessen" analysearre mei cut-offs, om't baseline-gemiddelden ≥ 30 wiene mei teminsten ien line × tiidpunt, wêrby't statistysk signifikante wearden fan log2 (foldferoaring) kombinearre waarden. It oantal genen dat oan dizze kritearia foldie wie 65 foar GO:0006952 en 524 foar GO:0055114.
83A:476 liet twa DEG-pieken sjen dy't annotearre wiene mei de term GO:0006952, de earste by 6 genen per inch (64 genen, op- en delregeling) en de twadde by 24 genen per inch (15 genen, allinich opregeling). Boregine liet ek sjen dat GO:0006952 op itselde tiidpunt in pyk berikte, mar mei minder DEG (11 en 8) en foarkarsaktivaasje. Mandeloop liet twa pieken fan GO:0006952 sjen by 12 en 48 HPI, beide mei 12 genen (de earste mei aktivearjende genen, en de twadde mei allinich ûnderdrukkende genen), wylst de 22660-populaasje by 6 HPI (13 genen) in gruttere oerhearsking hie fan 'e tanimmende pykregeling. It moat opmurken wurde dat 96,4% fan GO:0006952 DEG yn dizze pieken itselde type antwurd hie (op of del), wat in wichtige oerlaap yn ferdigeningsreaksjes oanjout nettsjinsteande ferskillen yn it oantal belutsen genen. De grutste groep sekwinsjes dy't relatearre binne oan de term GO:0006952 kodearret foar it Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-like), dat heart ta de klasse 10 patogenese-assosjeare proteïne (PR-10) proteïneklade en de kearnproteïne-latex. ferlykber (MLP-lik) proteïne) proteïne (Fig. 3). De twa groepen ferskillen yn 'e aard fan ekspresje en de rjochting fan' e reaksje. De genen dy't kodearje foar SAM22-like proteïnen lieten konsekwinte en wichtige ynduksje sjen op iere tiidpunten (6 of 12 hpi) en reagearren oer it algemien net oan 'e ein fan it eksperimint (48 hpi), wylst MLP-like proteïnen koördinaasje lieten sjen by 6 hpi. hpi. 83A:476 en Mandelup by 48 hp/in, hast alle oare datapunten reagearren net. Derneist folgen ferskillen yn ekspresjeprofilen fan SAM22-like proteïnegenen waarnommen fariabiliteit yn anthracnose-resistinsje, om't mear resistente linen mear tiidpunten hienen dy't dizze genen signifikant ynducearren as mear gefoelige genen. In oar LlR18A/B-eftich PR-10-gen liet in tige ferlykber ekspresjepatroan sjen as it SAM22-like proteïnegen.
De wichtichste komponinten fan 'e biologyske prosesterm "GO:0006952 Defense Response" en de ekspresjepatroanen fan kandidaatgenen fan 'e Lanr1- en AnMan-allelen waarden identifisearre. De Log2-skaal fertsjintwurdiget log2-wearden (fâldferoaring) tusken yninting (Colletotrichum lupini, stam Col-08, krigen fan lupinefjilden, Wizhenica, Poalen, 1999) en kontrôle (sham-yninting) planten op itselde tiidpunt. De folgjende smelblêdige lupinelinen waarden analysearre: 83A:476 (resistint, drager fan it homozygote Lanr1-allel), Boregine (resistint, genetyske eftergrûn ûnbekend), Mandelup (matig resistint, drager fan it homozygote AnMan-allel), en Populaasje 22660 (gefoelich).
Derneist waarden de ekspresjeprofilen fan RNA-seq kandidaatgenen Lanr1 (TanjilG_05042) en AnMan (TanjilG_12861) evaluearre (Fig. 3). It TanjilG_05042-gen liet allinich op it earste tiidpunt (6 hpi) in wichtige respons (aktivaasje) sjen by 83A:476, wylst TanjilG_12861 allinich op twa tiidpunten signifikant wie yn Mandeloop: 6 hpi (delregeling) en 24 hpi (6 hpi). Mei.). ferstelber) ).
De meast oerekspressearre genen yn 'e term GO:0055114 "redoxproses" wiene genen dy't kodearje foar cytochroom P450-proteinen en peroxidase (Fig. 4). Foar samples isolearre fan 83A:476 by 6 HPI waarden oer it algemien maksimale of minimale log2 (foldferoaring) wearden (foar 86,6% fan 'e genen) waarnommen tusken yninte en kontrôleplanten, wat de hege reaksje fan dit genotype op yninte geslacht markearret. 83A:476 liet de meast wichtige GO: 0055114 DEG sjen by 6 hpi (503 genen), wylst de rest fan 'e linen by 48 hpi (Boregine, 31 genen; Mandelup, 85 genen; en Populaasje 22660, 78 genen)). Yn 'e measte genen fan' e GO:0055114-famylje waarden twa soarten reaksjes op faksinaasje (aktivaasje en ynhibysje) waarnommen. Nijsgjirrich is dat oant 97,6% fan 'e DEG's identifisearre foar de term GO: 0055114 yn Mandelupe op 48 hp. Dizze observaasjes suggerearje dat, nettsjinsteande de signifikant lytsere skaal (d.w.s. it oantal mutearre redoksgenen, 85 tsjin 503), it patroan fan fertrage transkriptoomreaksjes fan mandeloup op anthracnose fergelykber is mei de iere reaksje fan 83A:476. Yn Boregine en Populaasje 22660 is dizze konverginsje leger op respektivelik 51,6% en 75,6%.
De ekspresjepatroanen fan 'e wichtichste komponinten fan 'e term fan it biologyske proses "GO:0055114 Redox-proses" waarden iepenbiere. De Log2-skaal fertsjintwurdiget log2-wearden (fâldferoaring) tusken yninting (Colletotrichum lupini, stam Col-08, krigen fan lupinefjilden, Wizhenica, Poalen, 1999) en kontrôle (sham-yninting) planten op itselde tiidpunt. De folgjende smelblêdige lupinelinen waarden analysearre: 83A:476 (resistint, drager fan it homozygote Lanr1-allel), Boregine (resistint, genetyske eftergrûn ûnbekend), Mandelup (matig resistint, drager fan it homozygote AnMan-allel), en Populaasje 22660 (gefoelich).
83A:476 Transkriptomyske reaksjes op yninting mei C. lupini (stam Col-08) omfette ek koördinearre stilmeitsjen fan genen dy't taskreaun wurde oan de term GO:0015979 "fotosynteze" en oare relatearre biologyske prosessen (FIG. 5). Dizze GO:0015979 DEG-set befette 105 genen dy't signifikant ûnderdrukt waarden by 6 hpi by 83A:476. Yn dizze subset waarden 37 genen ek delregulearre yn Mandelup by 48 HPI en 35 op itselde tiidstip yn 'e 22660-populaasje, ynklusyf 19 DEG's dy't mienskiplik binne foar beide genotypes. Gjin DEG's relatearre oan term GO: 0015979 waarden signifikant aktivearre yn hokker kombinaasje dan ek (line x tiid).
De ekspresjepatroanen fan 'e wichtichste komponinten fan 'e term fan it biologyske proses "GO:0015979 Fotosynteze" waarden iepenbiere. De Log2-skaal fertsjintwurdiget log2-wearden (fâldferoaring) tusken yninting (Colletotrichum lupini, stam Col-08, krigen fan lupinefjilden, Wizhenica, Poalen, 1999) en kontrôle (sham-yninting) planten op itselde tiidpunt. De folgjende smelblêdige lupinelinen waarden analysearre: 83A:476 (resistint, drager fan it homozygote Lanr1-allel), Boregine (resistint, genetyske eftergrûn ûnbekend), Mandelup (matig resistint, drager fan it homozygote AnMan-allel), en Populaasje 22660 (gefoelich).
Op basis fan 'e resultaten fan differinsjele ekspresje-analyze en wierskynlik belutsen by ferdigeningsreaksjes tsjin patogene skimmels, waard dizze set fan sân genen selektearre foar kwantifikaasje fan ekspresjeprofilen troch real-time PCR (Oanfoljende tabel S9).
It fermoedelike proteïnegen TanjilG_10657 waard signifikant ynducearre yn alle bestudearre linen en tiidpunten yn ferliking mei kontrôle (mimyske) planten (Oanfoljende Tabellen S10, S11). Derneist liet it ekspresjeprofyl fan TanjilG_10657 in tanimmende trend sjen yn 'e rin fan it eksperimint foar alle linen. Populaasje 22660 liet de heechste gefoelichheid fan TanjilG_10657 foar yninting sjen mei 114-fâldige aktivearring en it heechste relative ekspresjenivo (4.4 ± 0.4) by 24 HPI (Fig. 6a). It PR10 LlR18A proteïnegen TanjilG_27015 liet ek aktivearring sjen oer alle linen en tiidpunten, mei statistyske betsjutting by de measte datapunten (Fig. 6b). Fergelykber mei TanjilG_10657 waard it heechste relative ekspresjenivo fan TanjilG_27015 waarnommen yn 'e 22660 ynintingde populaasje by 24 HPI (19.5 ± 2.4). It soere endochitinase-gen TanjilG_04706 wie signifikant opregulearre yn alle linen en op alle tiidpunten útsein Boregine 6 hpi (Fig. 6c). It waard sterk ynducearre op it earste tiidpunt (6 HPI) by 83A:476 (mei 10,5 kear) en matich tanommen yn oare linen (mei 6,6-7,5 kear). Tidens it eksperimint bleau de ekspresje fan TanjilG_04706 op ferlykbere nivo's yn 83A:476 en Boregine, wylst it yn Mandelup en Populaasje 22660 signifikant tanommen is, en relatyf hege wearden berikt (respektyflik 5,9 ± 1,5 en 6,2 ± 1,5). It endoglucan-1,3-β-glucosidase-like gen TanjilG_23384 liet hege aktivearring sjen op 'e earste twa tiidpunten (6 en 12 hpi) yn alle linen útsein populaasje 22660 (Fig. 6d). De heechste relative ekspresjenivo's fan TanjilG_23384 waarden waarnommen op it twadde tiidpunt (12 hpi) yn Mandelup (2.7 ± 0.3) en 83A:476 (1.5 ± 0.1). By 24 HPI wie de ekspresje fan TanjilG_23384 relatyf leech yn alle bestudearre linen (fan 0.04 ± 0.009 oant 0.44 ± 0.12).
Ekspresjeprofilen fan selektearre genen (ag) oantoand troch kwantitative PCR. De sifers 6, 12 en 24 fertsjintwurdigje oeren nei faksinaasje. De LanDExH7- en LanTUB6-genen waarden brûkt foar normalisaasje en LanTUB6 waard brûkt foar kalibraasje tusken searjes. Foutbalken fertsjintwurdigje de standertôfwiking basearre op trije biologyske replikaten, elk dêrfan is it gemiddelde fan trije technyske replikaten. De statistyske betsjutting fan ferskillen yn 'e ekspresjenivo's tusken de ynintingde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, krigen yn 1999 út it lupinefjild yn Wierzenica, Poalen) en kontrôle (mock-yninting) planten binne boppe de gegevenspunten markearre (*P-wearde < 0.05, **P-wearde ≤ 0.01, ***P-wearde ≤ 0.001). De statistyske betsjutting fan ferskillen yn 'e ekspresjenivo's tusken de ynintingde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, krigen yn 1999 út it lupinefjild yn Wierzenica, Poalen) en kontrôle (mock-yninting) planten binne boppe de gegevenspunten markearre (*P-wearde < 0.05, **P-wearde ≤ 0.01, ***P-wearde ≤ 0.001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-09 maaie 19, 9. поля люпина в Верженице, Польша) en контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена надихными 0,05; Statistysk signifikante ferskillen yn ekspresjenivo's tusken yninte (Colletotrichum lupini, stam Col-08, krigen yn 1999 fan in lupinefjild yn Wierzhenice, Poalen) en kontrôle (sham-yninte) planten wurde boppe de datapunten neamd (*P-wearde < 0.05, **P-wearde ≤ 0.01, ***P-wearde ≤ 0.001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在繰标记在繰捈0.05, **P 值≤ 0.01, ***P 值≤ 0.001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 撌 鯹煤 秉水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤0.01) 。. Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полусч люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Statistysk signifikante ferskillen yn ekspresjenivo's tusken yninte (Colletotrichum lupini, stam Col-08, krigen fan lupinefjilden yn Verzhenice, Poalen, yn 1999) en kontrôle (sham-yninte) planten wurde boppe de datapunten neamd (*P-wearde < 0.05, **P-wearde ≤ 0.01, ***P-wearde ≤ 0.001).De analysearre NLL-linen wiene: 83A:476 (resistint, drager fan it homozygote Lanr1-allel), Mandelup (matig resistint, drager fan it homozygote AnMan-allel), Boregine (resistint, ûnbekende genetyske eftergrûn) en populaasje 22660 (gefoelich).
It kandidaatgen TanjilG_05042 op 'e Lanr1-lokus liet in dúdlik oars ekspresjepatroan sjen as de profilen dy't krigen binne út RNA-seq-stúdzjes (Fig. 6e). Signifikante aktivearring fan dit gen waard waarnommen yn Mandelup en de 22660-populaasje (oant respektivelik 39,7 en 11,7 kear), wat resultearre yn relatyf hege ekspresjenivo's (oant respektivelik 1,4 ± 0,14 en 7,2 ± 1,3). 83A:476 liet ek wat opregulearring fan it TanjilG_05042-gen sjen (oant 3,8-fâld), lykwols wiene de relative ekspresjenivo's dy't berikt waarden (0,044 ± 0,002) mear as 30-fâld leger as dy waarnommen yn Mandelup en de 22660-populaasje. Analyse troch qPCR liet wichtige ferskillen sjen yn ekspresjenivo's tusken genotypes yn mock-faksinearre (kontrôle) farianten, wêrby't in ferskil fan 58 kear berikt waard tusken populaasjes 22660 en 83A:476, lykas tusken populaasjes 22660 en 22660. In twafâldich ferskil waard berikt tusken Boregine en Mandalup.
It kandidaatgen op 'e AnMan-lokus, TanjilG_12861, waard aktivearre as reaksje op faksinaasje yn 83A:476 en Mandelup, wie neutraal yn 'e 22660-populaasje, en wie delregulearre yn Boregine (Fig. 6f). De relative ekspresje fan it TanjilG_12861-gen wie it heechst yn yninting 83A:476 (0.14±0.01). It 17.4 kDa klasse I waarmteskokproteïnegen TanjilG_05080 HSP17.4 liet legere relative ekspresjenivo's sjen yn alle bestudearre stammen en tiidpunten (Fig. 6g). De heechste wearde waard waarnommen by 24 HPI yn 'e 22660-populaasje (0.14 ± 0.02, in achtfâldige tanimming as reaksje op faksinaasje).
Ferliking fan genekspresjeprofilen (Fig. 7) liet in hege korrelaasje sjen tusken TanjilG_10657 en fjouwer oare genen: TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.80), en TanjilG_04706 (r = 0.79). Sokke resultaten kinne wize op ko-regeling fan dizze genen tidens ferdigeningsreaksjes. De TanjilG_12861- en TanjilG_23384-genen lieten ferskillende ekspresjeprofilen sjen mei legere Pearson-korrelaasjekoëffisjintwearden (fan 0.08 oant 0.43 en -0.19 oant 0.28, respektivelik) yn ferliking mei oare genen.
Korrelaasjes tusken genekspresjeprofilen waarden ûntdutsen mei kwantitative PCR. De folgjende smelblêdige lupinelinen waarden analysearre: 83A:476 (resistint, drager fan it homozygote Lanr1-allel), Mandelup (matig resistint, drager fan it homozygote AnMan-allel), Boregine (resistint, genetyske eftergrûn ûnbekend), en Populaasje 22660 (gefoelich). Trije tiidpunten waarden berekkene (6, 12 en 24 oeren nei yninting), ynklusyf yninte (Colletotrichum lupini, stam Col-08, krigen fan lupinefjilden yn Wierzhenice, Poalen, yn 1999) en kontrôle (sham-yninte) planten. De skaal lit de wearde fan 'e Pearson-korrelaasjekoëffisjint sjen.
Op basis fan gegevens dy't krigen binne by 6 pk per inch, waard WGCNA útfierd op 9981 DEG identifisearre troch it fergelykjen fan yninte en kontrôleplanten om te fokusjen op iere ferdigeningsreaksjes (Oanfoljende Tabel S12). Twaentweintich genmodules (klusters) waarden fûn mei korrelearre (positive of negative) ekspresjeprofilen tusken genotypes en eksperimintele farianten. Gemiddeld wiene de genekspresjenivo's ôfnimmend yn folchoarder 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populaasje 22660 (yn beide farianten wie dizze trend lykwols sterker yn kontrôleplanten). Gemiddeld wiene de genekspresjenivo's ôfnimmend yn folchoarder 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populaasje 22660 (yn beide farianten wie dizze trend lykwols sterker yn kontrôleplanten). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Befolking 22660 (в обоих вариантах, вариантах, тенденция была сильнее у контрольных растений). Gemiddeld namen de genekspresjenivo's ôf yn 'e oarder fan 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populaasje 22660 (yn beide farianten wie dizze trend lykwols sterker yn kontrôleplanten).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Befolking 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> befolking 22660 的 顺序 下降 （， ， 県 平均在 在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。... В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populaasje 22660 (однако в обоихантахтах была сильнее у контрольных растений). Gemiddeld namen de genekspresjenivo's ôf yn 'e searje 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populaasje 22660 (yn beide farianten wie dizze trend lykwols sterker yn kontrôleplanten).Faksinaasje resultearre yn opregulearring fan genekspresje, benammen yn modules 18, 19, 14, 6 en 1 (yn ôfnimmende folchoarder fan effekt), negative regeling (bygelyks modules 9 en 20) of mei neutrale effekten (bygelyks modules 11, 22, 8 en 13). GO-termferrikingsanalyse (Oanfoljende Tabel S13) liet "GO: 0006952 Beskermjende antwurden" sjen foar de yninte module (18) mei maksimale aktivearring, ynklusyf genen analysearre troch qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 en TanjilG_27015), lykas ek in protte fan 'e meast ûnderdrukte fotosyntezemodules fan Inoculate (9). Module 18-konsentrator (Fig. 8) waard identifisearre as it TanjilG_26536-gen dat kodearret foar it PR-10-like LlR18B-proteïne, en module 9-konsentrator waard identifisearre as it TanjilG_28955-gen dat kodearret foar it fotosysteem II PsbQ-proteïne. In kandidaat-antracnose-resistinsjegen Lanr1, TanjilG_05042, waard fûn yn module 22 (Fig. 9) en is assosjeare mei de termen "GO:0044260 Cellulêre makromolekulêre metabolike prosessen" en "GO:0006355 Transkripsjonele regeling, DNA-templating" mei de TanjilG_01212-hub. It gen kodearret foar waarmtestress-transkripsjefaktor A-4a (HSFA4a).
Gewogen netwurkanalyse fan gen-ko-ekspresje fan modules mei oerfertsjintwurdige biologyske prosestermen "GO: 0006952 Defense responses". Ligaasje waard ferienfâldige om de fjouwer genen te markearjen dy't analysearre binne troch qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 en TanjilG_27015).
Gewogen netwurkanalyse fan genko-ekspresje fan in module mei in oerfertsjintwurdige biologyske prosesterm "GO: 0006355: Transkripsjonele regeling, DNA-templating" en draachber fan in kandidaat-anthracnose-resistinsjegen Lanr1 TanjilG_05042. Ligaasje waard ferienfâldige om it TanjilG_05042-gen en it sintrale TanjilG_01212-gen te isolearjen.
Screening op antraknose-resistinsje sammele yn Austraalje liet sjen dat de measte fan 'e ier frijlitten cultivars gefoelich wiene; Kalya, Coromup en Mandelup binne omskreaun as matich resistint, wylst Wonga, Tanjil en 83A:476 binne omskreaun as heech resistint26,27,31. hiene itselde resistinsje-allel, oantsjutten as Lanr1, en Coromup en Mandelup hiene in oar allel, oantsjutten as AnMan10,26,39, wylst Kalya in oar allel trochjoech, Lanr2. Screening op antraknose-resistinsje yn Dútslân resultearre yn 'e identifikaasje fan in resistente line Bo7212 mei in kandidaat-allel oars as Lanr1, oantsjutten as LanrBo36.
Us stúdzje liet in tige lege frekwinsje (sawat 6%) fan it Lanr1-allel sjen yn it testte kiemplasma. Dizze observaasje komt oerien mei de resultaten fan it screenen fan East-Europeesk kiemplasma mei de Anseq3- en Anseq4-markers, dy't oantoanden dat it Lanr1-allel mar yn twa Wyt-Russyske linen oanwêzich is. Dit suggerearret dat it Lanr1-allel noch net breed brûkt wurdt troch lokale fokprogramma's, oars as yn Austraalje, dêr't it ien fan 'e wichtichste allelen is foar marker-assistearre fokkerij. Dit kin te tankjen wêze oan it legere nivo fan ferset dat it Lanr1-allel leveret yn Jeropeeske fjildomstannichheden yn ferliking mei it Australyske rapport. Derneist hawwe stúdzjes fan antraknose yn gebieten mei hege rein yn Austraalje oantoand dat fersetreaksjes bemiddele troch it Lanr1-allel miskien net effektyf binne yn waarsomstannichheden dy't de groei en rappe ûntwikkeling fan 'e patogeen befoarderje19,42. Eins waarden yn 'e hjoeddeiske stúdzje ek guon symptomen fan antraknose waarnommen yn genotypes dy't it Lanr1-allel drage, wat suggerearret dat ferset ûnder optimale omstannichheden foar de ûntwikkeling fan C. lupini kin ferdwine. Derneist binne falsk-positive ynterpretaasjes fan 'e oanwêzigens fan Anseq3- en Anseq4-markers, dy't sawat 1 cM fan 'e Lanr1-lokus lizze, mooglik 28,30,43.
Us stúdzje liet sjen dat 83A:476, mei it Lanr1-allel, reagearre op C. lupini-yninting mei grutskalige transkriptoom-reprogrammearring op it earste analysearre tiidspunt (6 hpi), wylst yn Mandelup, mei it AnMan-allel, transkriptomyske reaksjes folle letter waarnommen waarden (fan 24 oant 48 hp). Dizze tydlike fariaasjes yn ferdigeningsreaksjes binne assosjeare mei ferskillen yn syktesymptomen, wat it belang fan iere erkenning fan patogenen foar in suksesfolle reaksje op ferset beklammet. Om planteweefsel te ynfektearjen, moatte miltbrandsporen ferskate ûntwikkelingsstadia op it oerflak fan 'e gasthear trochrinne, ynklusyf kimen, seldieling en foarming fan in appressorium. In oanhingsel is in ynfektive struktuer dy't him hechtet oan it oerflak fan 'e gasthear en penetraasje yn it weefsel fan 'e gasthear fasilitearret. Sa lieten sporen fan C. gloeosporioides yn earte-ekstrakt de earste dieling fan 'e kearn sjen nei 75-90 minuten ynkubaasje, de foarming fan in kiembuis nei 90-120 minuten en ûnderdrukking nei 4 oeren. Mango C. gloeosporioides liet mear as 40% konidiale kimen sjen nei 3 oeren ynkubaasje en sawat 20% foarming fan appressoren nei 4 oeren. It virulinsje-assosjeare CAP20-gen fan C. gloeosporioides liet transkripsjonele aktiviteit sjen yn epifyt-foarmjende konidia nei 3,5 oeren ynkubaasje yn avocado-oerflakwaaks mei hege konsintraasjes fan CAP20-proteïne nei 4 oeren en 46 minuten. Op deselde wize waard de aktiviteit fan melaninebiosynthesegenen yn C. trifolii ynducearre tidens in 2-oere ynkubaasje folge troch de foarming fan in appressorium nei 1 oere. Undersyk nei blêdweefsels hat oantoand dat ierdbeien yninting mei C. acutatum earste ûnderdrukking hawwe by 8 hpi, wylst tomaten yninting mei C. coccodes earste ûnderdrukking hawwe by 4 hpi48,49. foar in grut part yn oerienstimming mei de tiidsskaal fan it ynfeksjeproses fan Colletotrichum spp. Snelle ferdigeningsreaksjes op 83A:476 suggerearje belutsenens fan plantresistinsje en effektor-triggerde immuniteit (ETI) genen yn dizze line, wylst de fertrage reaksjes fan Mandelup de mikro-assosjeare molekulêre patroan-triggerde immuniteit (MTI) hypoteze 50 stypje. Iere reaksjes op 83A:476 en Mandelup. De dielde oerlaap tusken omheech- of omleechregulearre genen yn fertrage reaksje stipet ek dit konsept, om't ETI faak beskôge wurdt as in fersnelde en ferbettere MTI-reaksje dy't kulminearret yn programmearre seldea op it plak fan ynfeksje, bekend as anafylaktyske skok 51,52.
De measte fan 'e genen dy't taskreaun wurde oan 'e oerfertsjintwurdige term Gene Ontology GO:0006952 "Defense Response" binne de 11 homologen fan it stress-induzearre fasting message 22-protein (fergelykber mei SAM22) en de sân wichtige latex-protein-likes (MLP's). -like proteinen 31, 34, 43 en 423 lieten sekwinsje-oerienkomst sjen. SAM22-like genen lieten wichtige aktivearring sjen dy't langer duorre, en ferhege nivo's fan anthracnose-resistinsje lieten sjen (83A:476 en Boregine). MLP-like genen waarden lykwols allinich delregulearre yn linen dy't it kandidaat-resistinsjeallel droegen (83A:476/Lanr1 by 6 hpi en Mandelup/AnMan by 24 hpi). It moat opmurken wurde dat alle identifisearre SAM22-like homologen ûntsteane út in genkluster dat sawat 105 kb beslacht, wylst MLP-like genen ûntsteane út aparte regio's fan it genoom. Koördinearre aktivearring fan sokke SAM22-like genen waard ek fûn yn ús eardere stúdzje fan NLL-resistinsje tsjin Diaporthetoxica-ynokulaasje, wat suggerearret dat se belutsen binne by de horizontale komponinten fan 'e ferdigeningsreaksje. Dizze konklúzje wurdt ek stipe troch rapporten fan in positive reaksje fan SAM22-like genen op ferwûning of behanneling mei salisylsoer, skimmelindusers of wetterstofperokside.
MLP-like genen hawwe sjen litten dat se reagearje op ferskate abiotyske en biotyske stressfaktoren, ynklusyf baktearjele, firale en patogene skimmelinfeksjes yn in protte plantesoarten55. De rjochtingen fan reaksje op bepaalde ynteraksjes tusken planten en patogenen fariearden fan sterk tanimmend (d.w.s. tidens ynfestaasje fan katoen mei Verticillium dahliae) oant signifikant ôfnimmend (d.w.s. nei ynfeksje fan appelbeam mei Alternaria spp.)56,57. Signifikante delregeling fan it MLP-like 423-gen is waarnommen tidens avocado-ferdigening tsjin F. niger-ynfeksje en tidens ynfeksje fan 'e appelbeam Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola en Alternaria alternata binne appelpatotypen58,59. Derneist hienen appelkalli dy't it MLP-like 423-gen oerekspressearren in legere ekspresje fan resistinsje-assosjeare genen en wiene se gefoeliger foar skimmelinfeksje59. Nei Fusarium oxysporum f waard it MLP-like 423-gen ek ûnderdrukt yn resistint gewoan beankiemplasma. cn. Beaninfeksje 60.
Oare leden fan 'e PR-10-famylje dy't identifisearre waarden yn ús RNA-seq-stúdzje wiene de LlR18A- en LlR18B-genen as reaksje op opregulearring, lykas it opregulearre (1 gen) of delregulearre (3 genen) gen foar it lipide-oerdrachtproteïne DIR1. Derneist markearret WGCNA it LlR18B-gen as in hub yn dizze module, dat tige gefoelich is foar faksinaasje en ferskate beskermjende responsgenen draacht. De LlR18A- en LlR18B-genen waarden ynducearre yn giele lupineblêden as reaksje op patogene baktearjes, lykas yn NLL-stielen nei D. toxica-ynokulaasje, wylst de ryshomolooch fan dizze genen, RSOsPR10, rap ynducearre waard troch in skimmelinfeksje dy't wierskynlik belutsen wie by it jasmonzuur-sinjalearingspaad53,61,62. It DIR1-gen kodearret net-spesifike lipide-transportproteïnen dy't nedich binne foar it begjin fan systemyske ferworven resistinsje (SAR). Mei de ûntwikkeling fan beskermjende reaksjes wurdt it DIR1-proteïne ferfierd fan it fokus fan ynfeksje troch it floëem om SAR yn fiere organen te ynducearjen. Nijsgjirrich is dat it TanjilG_02313 DIR1-gen signifikant ynducearre waard op it earste tiidpunt yn rigels 84A:476 en Populaasje 22660, mar antraknose-resistinsje ûntwikkele him allinich mei súkses yn rigel 84A:476. Dit kin wize op wat subfunksjonalisaasje fan it DIR1-gen yn NLL, om't de oerbleaune trije homologen allinich reagearren op ynokulaasje yn 'e 83A:476-line by 6 hpi, en dizze reaksje wie nei ûnderen rjochte.
Yn ús stúdzje wiene de meast foarkommende komponinten dy't oerienkomme mei it biologyske proses neamd "GO:0055114 Redox-proses" cytochroom P450-proteïne, peroxidase, linoleïnezuur 9S-/13S-lipoxygenase, en 1-aminocyclopropaan-1-karboksylzuuroxidase. Derneist definiearret ús WGCNA de HSFA4a-homolooch as in hub dy't modules draacht lykas de Lanr1-resistinsjegenkandidaat TanjilG_05042. HSFA4a is in komponint fan 'e redoks-ôfhinklike regeling fan nukleêre transkripsje yn planten.
Cytochroom P450-proteinen binne oksidoreduktasen dy't NADPH- en/of O2-ôfhinklike hydroksylaasjereaksjes yn primêr en sekundêr metabolisme katalysearje, ynklusyf it metabolisme fan xenobiotika, lykas hormonen, fettsoeren, sterolen, selwandkomponinten, biopolymeren en de biosynteze fan beskermjende ferbiningen 69. Yn ús stúdzje waard de fariabiliteit yn plant-cytochroom P450-funksje fermindere fan -10,6 log2 (fâldferoaring) nei 5,7 fanwegen in grut oantal feroare homologen (37) en ferskillen yn responspatroanen tusken spesifike genen, wat in opwaartse revisy reflektearret. It brûken fan allinich RNA-seq-gegevens om de fertochte biologyske funksje fan 'e NLL-genen yn sa'n grutte proteïne-superfamylje te ferdúdlikjen soe heul spekulatyf wêze. It is lykwols it neamen wurdich dat guon cytochroom P450-genen assosjeare binne mei ferhege wjerstân tsjin patogene skimmels of baktearjes, ynklusyf in bydrage oan allergyske reaksjes 69,70,71.
Klasse III peroxidasen binne multifunksjonele plantenzymen dy't belutsen binne by in breed skala oan metabolike prosessen tidens plantgroei en ûntwikkeling, lykas ek as reaksje op miljeustress lykas sâltgehalte, droechte, hege ljochtintensiteit en oanfal fan patogenen72. Peroxidasen binne belutsen by de ynteraksje fan ferskate plantesoarten mei Anthracis, ynklusyf Stylosanthes humilis en C. gloeosporioides, Lens culinaris en C. truncatum, Phaseolus vulgaris en C. lindemuthianum, Cucumis sativus en C. lagenarium73,74,75,76. De reaksje is tige rap, soms sels by 4 HPI, foardat de skimmel it plantweefsel penetrearret73. It peroxidase-gen reagearre ek op D. toxica NLL-inokulaasje. Neist har typyske funksjes om oksidative útbarsting te regeljen of oksidative stress te eliminearjen, kinne peroxidasen de groei fan patogenen bemuoie troch fysike barriêres te meitsjen basearre op selwandfersterking tidens lignifikaasje, subienheid of crosslinking fan spesifike ferbiningen. Dizze funksje kin in silico taskreaun wurde oan it TanjilG_03329-gen dat kodearret foar in fertochte lignine-foarmjende anionperoxidase dy't yn ús stúdzje signifikant opregulearre wie yn 'e 83A:476-resistente line by 6 HPI, mar net yn oare stammen en tiidpunten dy't net reagearren.
9S-/13S-lipoxygenase fan linoleïnezuur is de earste stap yn it oksidative paad fan lipidebiosynteze78. De produkten fan dit paad hawwe meardere funksjes yn plantferdigening, ynklusyf it fersterkjen fan selwanden troch de foarming fan kallose- en pektine-ôfsettings, en it regeljen fan oksidative stress troch de produksje fan reaktive soerstofsoarten79,80,81,82,83. Yn 'e hjoeddeiske stúdzje wie de ekspresje fan linoleïnezuur 9S-/13S-lipoxygenase feroare yn alle stammen, mar yn 'e gefoelige populaasje 22660 hearske opregulearring op ferskate tiidpunten, wylst it yn stammen dy't resistente Lanr1 en it AnMan-allel drage, de diversifikaasje fan 'e oxylipinelaach yn beskermjende miltbrânreaksjes tusken dizze genotypes beklammet.
De 1-aminocyclopropaan-1-carboxylaat oxidase (ACO) homolooch wie signifikant opregulearre (9 genen) of delregulearre (2 genen) doe't it yninting waard mei lupine. Mei twa útsûnderingen kamen al dizze reaksjes foar by 6 hp. by 83A:476. De enzymatyske reaksje bemiddele troch ACO-proteinen is de taryfbepalende stap yn etyleenproduksje en is dêrom tige regele84. Etyleen is in plantehormoan dat in ferskaat oan rollen spilet by it regeljen fan plantûntwikkeling en reaksje op abiotyske en biotyske stressomstannichheden. De ynduksje fan ACO-transkripsje en aktivearring fan it etyleensignalearingspaad binne belutsen by it ferheegjen fan 'e wjerstân fan rys tsjin de hemibiotrofyske skimmel oryzae oryzae troch it regeljen fan 'e produksje fan reaktive soerstofsoarten en fytoalexinen. In tige ferlykber blêdynfeksjeproses fûn tusken M. oryzae en C. lupini88,89, tsjin 'e eftergrûn fan in wichtige opregulearring fan ACO-homologen yn 'e 83A:476-line rapportearre yn dizze stúdzje, ferskowt de mooglikheid fan it jaan fan resistinsje tsjin NLL-anthracnose Ethyleen, in sintrale sinjaalstap yn molekulêre paden.
Yn 'e hjoeddeiske stúdzje waard grutskalige ûnderdrukking fan in protte genen dy't ferbûn binne mei fotosynteze waarnommen by 6 hpi yn 83A:476 en by 48 hpi yn Mandeloop en de 22660 populaasje. De omfang en foarútgong fan dizze feroarings binne evenredich mei it nivo. Antraknose-resistinsje waard waarnommen yn dit eksperimint. Koartlyn is sterke en iere ûnderdrukking fan fotosynteze-relatearre transkripten rapportearre yn ferskate modellen fan plant-patogeen-ynteraksjes, ynklusyf patogene baktearjes en skimmels. Hast (fan 2 HPI yn guon ynteraksjes) en wrâldwide ûnderdrukking fan genen dy't ferbûn binne mei fotosynteze as reaksje op ynfeksje kinne plantimmuniteit triggerje op basis fan 'e ynset fan reaktive soerstofsoarten en har ynteraksje mei it salisylsoerpaad om allergyske reaksjes te bemiddeljen 90,94.
Konklúzjend omfetsje ferdigeningsreaksjemeganismen dy't foarsteld binne foar de meast resistente lineage (83A:476) rappe patogeenherkenning troch it R-gen (wierskynlik TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) en allergyske reaksje-bemiddelde salisylsoer en etyleensignalisaasje, folge troch it fêstigjen fan lange-ôfstân SAR. De aksje wurdt stipe troch it DIR-1-proteïne. It moat opmurken wurde dat de biotrofyske perioade foar C. lupini-ynfeksje tige koart is (sawat 2 dagen), folge troch nekrotyske groei95. De oergong tusken dizze stadia kin assosjeare wurde mei nekrose en ekspresje fan etyleen-indusearbere proteïnen dy't fungearje as triggers foar hypersensitiviteitsreaksjes yn gasthearplanten. Dêrom is it tiidsfinster foar suksesfolle fangst fan C. lupini yn it biotrofyske stadium tige smel. De herprogrammearring fan genen dy't assosjeare binne mei redoks en fotosynteze waarnommen yn 83A:476 by 6 hpi is yn oerienstimming mei de foarútgong fan skimmelhyfen en foarspellet de ûntwikkeling fan in suksesfolle beskermjende reaksje yn it biotrofyske stadium. De transkriptomyske reaksjes fan Mandelup en de 22660-populaasje kinne te fertrage wêze om de skimmel te fangen foardat der oerskeakele wurdt nei nekrotyske groei, lykwols kin Mandelup effektiver wêze as de 22660-populaasje, om't de relatyf rappe regeling fan it PR-10-proteïne horizontale ferset befoarderet.
ETI, oandreaun troch it kanonike R-gen, liket in mienskiplik meganisme te wêzen foar beanresistinsje tsjin antraknose. Sa wurdt yn 'e model-peulvrucht Medicago truncatula resistinsje tsjin antraknose ferliend troch it RCT1-gen, in lid fan 'e TIR-NBS-LRR97 plant R-genklasse. Dit gen jout ek breedspektrum antraknoseresistinsje yn alfalfa as it oerdroegen wurdt oan gefoelige planten. Yn 'e gewoane bean (P. vulgaris) binne oant no ta mear as twa tsientallen antraknoseresistinsjegenen identifisearre. Guon fan dizze genen wurde fûn yn regio's sûnder kanonike R-genen, mar in protte oaren binne oan 'e rânen fan chromosomen dy't it NBS-LRR-genkluster drage, ynklusyf TIR-NBS-LRRs99. De genoomwide SSR-stúdzje befêstige ek de assosjaasje fan it NBS-LRR-gen mei antraknoseresistinsje yn 'e gewoane bean. It kanonike R-gen waard ek fûn yn 'e genomyske regio dy't de wichtichste antraknoseresistinsjelokus draacht yn wite lupine 101.
Us wurk lit sjen dat in direkte fersetreaksje, aktivearre yn in ier stadium fan plantynfeksje (leafst net letter as 12 hpi), smelblêdige lupine effektyf beskermet tsjin antraknose feroarsake troch de patogene skimmel Collelotrichum lupini. Mei help fan hege trochputsekwinsjearring hawwe wy ferskillende ekspresjeprofilen fan antraknose-resistinsjegenen yn NLL-planten oantoand, bemiddele troch de Lanr1- en AnMan-resistinsjegenen. Súksesfolle ferdigening omfettet it soarchfâldich ûntwerpen fan 'e genen foar aaiwiten dy't belutsen binne by redoks, fotosynteze en patogenese binnen oeren nei it earste kontakt fan 'e plant mei in patogeen. Ferlykbere beskermjende reaksjes, mar fertrage yn 'e tiid, binne folle minder effektyf yn it beskermjen fan planten tsjin sykten. Antraksresistinsje bemiddele troch it Lanr1-gen liket op 'e typyske rappe reaksje fan it R-gen (effektor-triggerde immuniteit), wylst it AnMan-gen wierskynlik in horizontale reaksje leveret (immuniteit triggere troch in mikrobe-assosjeare molekulêr patroan), wêrtroch in matich nivo fan duorsumens ûntstiet.
De 215 NLL-linen dy't brûkt waarden om te screenen op antraknosemarkers bestienen út 74 kultivars, 60 linen krigen troch krusing of fokken, 5 mutanten, en 76 wylde of orizjinele kiemplasma's. De linen kamen út 17 lannen, benammen út Poalen (58), Spanje (47), Dútslân (27), Austraalje (26), Ruslân (19), Wyt-Ruslân (7), Itaalje (5) en oare linen út 10 lannen. De set befettet ek referinsjeresistinte linen: 83A:476, Tanjil, Wonga dy't it Lanr1-allel drage, en Mandelup dy't it AnMan-allel drage. De linen waarden krigen fan 'e European Lupine Genetic Resource Database ûnderhâlden troch Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Poalen (Oanfoljende tabel S1).
Planten waarden ûnder kontroleare omstannichheden groeid (fotoperioade 16 oeren, temperatuer 25 °C oerdeis en 18 °C nachts). Twa biologyske replikaten waarden analysearre. DNA waard isolearre út trije wiken âlde blêden mei de DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Dútslân) neffens it protokol. De kwaliteit en konsintraasje fan it isolearre DNA waarden beoardiele troch spektrofotometryske metoaden (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Feriene Steaten). De AnManM1-marker dy't it antraknose-resistinsjegen AnMan markearret (ôflaat fan cv. Mandelup) en de markers Anseq3 en Anseq4 dy't it gen Lanr1 (ôflaat fan cv. Tanjil) flankearje, waarden analysearre 11,26,28. Homozygoten foar it resistente allel waarden skoard as "1", gefoelich - as "0", en heterozygoten - as 0.5.
Op basis fan 'e resultaten fan screening op markers AnManM1, AnSeq3 en AnSeq4 en de beskikberens fan sied foar definitive opfolgeksperiminten, waarden 50 NLL-linen selektearre foar fenotyping fan antracnose-resistinsje. De analyze waard yn duplikaat útfierd yn in kompjûterkontroleare kas mei in fotoperioade fan 14 oeren mei in temperatuerberik fan 22 °C oerdeis en 19 °C nachts. Siedden wurde krast (de siedmantel oan 'e tsjinoerstelde kant fan it embryo ôfsnien mei in skerp mes) foar it siedzjen om siedrant te foarkommen fanwegen in te hurde siedmantel en om unifoarme kimen te garandearjen. Planten waarden groeid yn potten (11 × 11 × 21 sm) mei sterile grûn (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warsjau, Poalen). Yninting waard útfierd mei de Colletotrichum lupini Col-08-stam, groeid yn 1999 út 'e stielen fan smelblêdige lupineplanten dy't groeid waarden yn in fjild yn Verzhenitsa, Grut-Poalen (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Kies in gebiet. De isolaten waarden 21 dagen kultivearre yn SNA-medium by 20° C ûnder swart ljocht om sporulaasje te indusearjen. Fjouwer wiken nei it siedzjen, doe't de planten it 4-6 blêdstadium berikt hiene, waard yninting útfierd troch te spuiten mei in suspensje fan konidia yn in konsintraasje fan 0,5 x 106 konidia per ml. Nei yninting waarden de planten 24 oeren yn it tsjuster hâlden by in fochtigens fan sawat 98% en in temperatuer fan 25°C om de kimen fan konidia en it ynfeksjeproses te fasilitearjen. De planten waarden doe groeid ûnder in fotoperioade fan 14 oeren by 22 °C dei / 19 °C nachts en 70% fochtigens. De sykteskoare waard 22 dagen nei yninting makke en fariearre fan 0 (ymmún) oant 9 (tige gefoelich) ôfhinklik fan 'e oanwêzigens of ôfwêzigens fan nekrotyske laesjes op stielen en blêden. Derneist waard nei it skoaren it gewicht fan 'e planten metten. Relaasjes tusken markergenotypen en syktefenotypen waarden berekkene as punt twa-sekwinsjekorrelaasjes (ôfwêzigens fan heterozygote markers yn 'e set rigels foar analyze fan it anthracnose-resistinsjefenotype).