Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz foydalanayotgan brauzer versiyasida CSS qo'llab-quvvatlashi cheklangan. Eng yaxshi tajriba uchun sizga yangilangan brauzerdan foydalanishingizni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da moslik rejimini o'chirib qo'ying). Shu bilan birga, uzluksiz qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublar va JavaScriptsiz renderlaymiz.
Angustifolius lupin (NLL, Lupinus angustifolius L.) oziq-ovqat ishlab chiqarish va tuproqni yaxshilash uchun ishlatiladigan dukkakli o'simlikdir. NLLning ekin sifatida global miqyosda kengayishi ko'plab patogen zamburug'larni, jumladan, halokatli antraknoz kasalligini keltirib chiqaradigan lupin antraknozini o'ziga tortdi. NLL selektsiyasida yuqori qarshilik ko'rsatadigan ikkita allel, Lanr1 va AnMan ishlatilgan, ammo asosiy molekulyar mexanizmlar noma'lumligicha qolmoqda. Ushbu tadqiqotda Yevropa NLL namunalarini skrining qilish uchun Lanr1 va AnMan markerlari ishlatilgan. Vaksinani nazorat ostidagi muhitda sinovdan o'tkazish ikkala chidamli donorning samaradorligini tasdiqladi. Differentsial gen ekspressiyasi profili vakillik qiluvchi chidamli va sezgir liniyalarda amalga oshirildi. Antraknozga chidamlilik "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redoks jarayoni" va "GO:0015979 Fotosintez" gen ontologiyasi atamalarining haddan tashqari ifodalanishi bilan bog'liq edi. Bundan tashqari, Lanr1(83A:476) liniyasi emlashdan keyin transkriptomning tez qayta dasturlanishini sezilarli darajada ko'rsatdi, boshqa chiziqlar esa bu javobda taxminan 42 soatga kechikishni ko'rsatdi. Himoya javoblari TIR-NBS, CC-NBS-LRR va NBS-LRR genlari, patogenezda ishtirok etadigan 10 ta oqsil, lipidlarni uzatish oqsillari, endoglukan-1,3-β-glyukozidaza, glitsinga boy hujayra devori oqsillari va kislorodning reaktiv yo'lidan genlar bilan bog'liq. 83A:476 ga dastlabki javoblar, jumladan, fotosintez bilan bog'liq genlarni ehtiyotkorlik bilan bostirish, qo'ziqorin biologiyasining vegetativ o'sish bosqichida muvaffaqiyatli himoya bilan bir vaqtga to'g'ri keldi, bu esa effektor immunitetni ishga tushirishini ko'rsatadi. Mandeloop reaksiyasi, umumiy gorizontal qarshilik kabi, sekinlashadi.
Tor bargli lupin (NLL, Lupinus angustifolius L.) - bu g'arbiy O'rta yer dengizi mintaqasida paydo bo'lgan yuqori proteinli donli o'simlik1,2. Hozirda u hayvonlar va odamlar uchun oziq-ovqat ekinlari sifatida yetishtiriladi. Shuningdek, u simbiotik azotni fiksatsiya qiluvchi bakteriyalar tomonidan azotni fiksatsiya qilish va tuproq tuzilishining umumiy yaxshilanishi tufayli almashlab ekish tizimlarida yashil go'ng hisoblanadi. NLL o'tgan asrda tez uylashtirish jarayonidan o'tdi va hali ham yuqori ko'payish bosimi ostida3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. NLLning keng tarqalgan yetishtirilishi bilan patogen zamburug'larning ketma-ketligi yangi qishloq xo'jaligi yo'nalishlarini rivojlantirdi va hosilni yo'q qiladigan yangi kasalliklarni keltirib chiqardi. Lupin yetishtiruvchilar va selektsionerlar uchun eng diqqatga sazovor narsa patogen qo'ziqorin, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 keltirib chiqaradigan antraknozning paydo bo'lishi edi. Lupin yetishtiruvchilar va selektsionerlar uchun eng diqqatga sazovor narsa patogen qo'ziqorin, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 keltirib chiqaradigan antraknozning paydo bo'lishi edi. Naibolee primechatelnym uchun fermerov va selektsionerlar lyupina bylo poyavlenie antraknoza, vyzvannogo patogennym gribkom Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Lupin dehqonlari va selektsionerlari uchun eng diqqatga sazovor narsa Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 patogen qo'ziqorini keltirib chiqaradigan antraknozning paydo bo'lishi edi.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feyler va Xagedorn13对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar)sochli。1 Naibolee porazitelnym uchun fermerov va selektsionerlar lyupina yavlyaetsya poyavlenie antraknoza, vyzyvaemo patohennym gribkom Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Lupin dehqonlari va selektsionerlari uchun eng hayratlanarlisi bu patogen qo'ziqorin Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 tomonidan qo'zg'atilgan antraknozning paydo bo'lishi.Kasallik haqida dastlabki xabarlar Braziliya va Qo'shma Shtatlardan kelgan bo'lib, odatiy alomatlar mos ravishda 1912 va 1929 yillarda paydo bo'lgan. Biroq, taxminan 30 yildan so'ng, patogen Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz deb belgilandi. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld teleomorfi. Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld v Tselenapravlennoy morfologii. & Sacc., Maqsadli Morfologiyada Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. va H. Schrenk,. va H. Schrenk, .va H. Schrenk. & H.mínąng,。 & H.mínąng,。va H. Schlenk,.20-asrning o'rtalarida o'tkazilgan dastlabki kasallik fenotipini aniqlash NLL va sariq lupin (L. luteus L.) namunalarida ma'lum bir qarshilikni ko'rsatdi, ammo sinovdan o'tgan barcha oq lupin (L. albus L.) namunalari juda sezgir edi15,16. Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, antraknozning rivojlanishi yog'ingarchilikning (havo namligi) va haroratning (12-28°C oralig'ida) ko'payishi bilan bog'liq bo'lib, yuqori haroratlarda qarshilikning buzilishiga olib keladi17, 18. Darhaqiqat, konidiyalarning unib chiqishi va kasallikning boshlanishi uchun zarur bo'lgan vaqt yuqori namlik sharoitida 12°C (16 soat) ga nisbatan 24°C (4 soat) da to'rt baravar qisqaroq edi19. Shunday qilib, davom etayotgan global isish antraknozning tarqalishiga olib keldi. Biroq, kasallik Fransiyada (1982) va Ukrainada (1983) yaqinlashib kelayotgan tahdidning xabarchisi sifatida kuzatilgan, ammo o'sha paytda lupin sanoati tomonidan e'tiborsiz qoldirilgan ko'rinadi20,21. Bir necha yil o'tgach, bu halokatli kasallik butun dunyoga tarqaldi va Avstraliya, Polsha va Germaniya kabi yirik lupin ishlab chiqaruvchi mamlakatlarga ham ta'sir ko'rsatdi22,23,24. 1990-yillarning o'rtalarida antraknoz epidemiyasidan so'ng, keng ko'lamli skrining natijasida NLL19 namunalarida bir nechta chidamli donorlar aniqlandi. Antraknozga NLL qarshiligi turli germplazma manbalarida topilgan ikkita alohida dominant allellar tomonidan nazorat qilinadi: Tanjil va Wonga navlarida Lanr1 va Mandalay navlarida AnMan. 25, 26. Bu allellar selektsiya dasturlarida chidamli germplazmani tanlashni qo'llab-quvvatlaydigan molekulyar markerlarni to'ldiradi25,26,27,28,29,30. Lanr1 allelini olib yuruvchi rezistent naslchilik liniyasi 83A:476 antraknozga chidamlilik uchun ajratilgan RIL populyatsiyasini olish uchun sezgir yovvoyi P27255 liniyasi bilan chatishtirildi, bu esa Lanr1 lokusini NLL-1131, 32, 33 xromosomasiga belgilash imkonini berdi. Bog'lanish xaritasi markerlarini yon tomondagi qarshilik lokuslaridan antraknozgacha genom doirasi bilan moslashtirish orqali NLL uchta allelning barchasining bir xil xromosomada (NLL-11) joylashishini aniqladi, ammo turli pozitsiyalarda29,34,35. Biroq, RILlarning kam soni va markerlar bilan mos keladigan allellar orasidagi katta genetik masofa tufayli ularning asosiy genlari haqida ishonchli xulosalar chiqarish mumkin emas. Boshqa tomondan, lupinlarda teskari genetikadan foydalanish ularning juda past regeneratsiya salohiyati tufayli qiyin, bu esa genetik manipulyatsiyani noqulay qiladi37.
Gomozigota holatida kerakli allelni tashuvchi 83A:476 (Lanr1) va Mandelup (AnMan) kabi uy sharoitida ishlab chiqilgan germplazmaning rivojlanishi yovvoyi populyatsiyalarda qarama-qarshi allel kombinatsiyalari mavjudligi sharoitida antraknozga chidamlilikni o'rganish uchun eshik ochdi. Molekulyar mexanizmlarning imkoniyatlari. Muayyan genotiplar tomonidan yaratilgan himoya javoblarini taqqoslang. Ushbu tadqiqotda NLLning C. lupini emlashiga dastlabki transkriptom javobi baholandi. Birinchidan, 215 chiziqdan iborat Yevropa NLL germplazma paneli Lanr1 va AnMan allellarini belgilaydigan molekulyar markerlar yordamida skrining qilindi. Keyin antraknoz fenotiplanishi nazorat ostida molekulyar markerlar uchun oldindan tanlangan 50 ta NLL chiziqlarida amalga oshirildi. Ushbu tajribalar asosida antraknozga chidamlilik va Lanr1/AnMan allel tarkibi jihatidan farq qiluvchi to'rtta chiziq ikkita qo'shimcha yondashuv yordamida differentsial himoya genlari ekspressiyasini profillash uchun tanlandi: yuqori o'tkazuvchanlikdagi RNK ketma-ketligi va real vaqt rejimida PZR miqdorini aniqlash.
Lanr1 (Anseq3 va Anseq4) va AnMan (Anseq4) hamda AnMan (AnManM1) markerlari bilan NLL gerplazmasi to'plamini (N = 215) skrining qilish shuni ko'rsatdiki, faqat bitta chiziq (95726, Salamanca-b yaqinida) barcha markerlar uchun "qarshilik" allelini kuchaytiradi, "'Sezgir' allellarning mavjudligi" esa 158 (~73,5%) chiziqlardagi barcha markerlarning ulushini aniqladi. O'n uchta chiziq Lanr1 markerining ikkita "chidamli" allelini va 8 ta chiziq Lanr1 markerining "chidamli" allellarini hosil qildi. AnMan markerining "qarshilik" alleli (S1 qo'shimcha jadvali). Anseq3 marker uchun ikkita chiziq va AnManM1 marker uchun bitta heterozigot edi. 42 ta chiziq (19,5%) Anseq3 va Anseq4 allellarining qarama-qarshi fazalarini olib yurgan, bu esa bu ikki lokus o'rtasida rekombinatsiyaning yuqori chastotasini ko'rsatadi. Nazorat ostidagi antraknoz fenotiplari (S2 qo'shimcha jadvali) sinovdan o'tgan genotiplarning qarshiligida o'zgaruvchanlikni aniqladi, bu esa antraknozning og'irligida aks etdi. O'rtacha ballardagi farqlar 1,8 (o'rtacha chidamli) dan 6,9 gacha (sezgir) va o'simlik vaznidagi farqlar 0,62 (sezgir) dan 4,45 g gacha (chidamli) oralig'ida bo'ldi. Tajribaning ikkita replikatsiyasida kuzatilgan qiymatlar (kasallikning og'irlik ballari uchun 0,51, P = 0,00017 va o'simlik vazni uchun 0,61, P < 0,0001), shuningdek, bu ikki parametr (− 0,59 va − 0,77, P < 0,0001) o'rtasida sezilarli korrelyatsiya mavjud edi. Tajribaning ikkita replikatsiyasida kuzatilgan qiymatlar (kasallikning og'irlik ballari uchun 0,51, o'simlik vazni uchun P = 0,00017 va 0,61, P < 0,0001), shuningdek, bu ikki parametr (− 0,59 va − 0,77, P < 0,0001) o'rtasida sezilarli korrelyatsiya mavjud edi. Vyavlena  dostovernaya korrelyatsiya mejdu znacheniyami, nablyudaemymi v dux povtornostyax eksperimenta (0,51 uchun ballov tyajesti bolezni, P = 0,00017 va 0,61 uchun massy rasteniya, P < 0,0001 parametr parametrlari, P < 0,0001), a takje-9 -0,77, R < 0,0001) 0,0001). Tajribaning ikkita takrorlanishida kuzatilgan qiymatlar (kasallikning og'irlik ballari uchun 0,51, o'simlik vazni uchun P = 0,00017 va 0,61, P < 0,0001), shuningdek, bu ikki parametr (- 0,59 va -0,77, P < 0,0001) 0,0001) o'rtasida sezilarli korrelyatsiya aniqlandi.lngjngjngjngjngjngjngjngjngjngjngjngjngjngjngjngjngjngjngjngpngjngpngjngpngpngjngpngpng =51.png. 0,00017，māngīnīnī0.61，P < 0.0001）līngīngīngīngīngīnīnjīngjīngjīngjīngjīnjīngjīnjīnjīnjīng (- 0.59- 0.77＀0.0) P <1)chíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngín 0,51, p = 0,00017, 0,61, p <0,0001, 0,0001, p = 0,00017, p <0,0001, 0,0001, 5-0,0000 0,59-0,59-0,59-0,77, P <0,0001)。 Nablyudalas znachitelnaya korrelyatsiya mejdu znacheniyami, nablyudaemymi v dvux povtornostyax (otsenka tyajesti zabolevaniya 0,51, P = 0,00017 va massa rasteniya 0,61, P <0,0001), i medviumya9 parametrlari -0,0001) 0,77, P <0,0001. Ikki nusxada kuzatilgan qiymatlar (kasallikning og'irlik darajasi 0,51, P = 0,00017 va o'simlik og'irligi 0,61, P < 0,0001) va bu ikki parametr (-0,59 va -0,0001) 0,77, P<0,0001 o'rtasida sezilarli korrelyatsiya mavjud edi. ).Sezgir o'simliklarda kuzatiladigan odatiy alomatlar orasida "cho'pon kamoni" tuzilishiga o'xshash poyaning egilishi va burishishi, so'ngra to'q sariq/pushti sporozoitlar bilan oval lezyonlar mavjud (1-qo'shimcha rasm). Lanr1 (83A:476 va Tanjil) va AnMan (Mandelup) genlarini tashuvchi Avstraliya namunalari o'rtacha darajada chidamli, 0,0331 va 0,0036). "Chidamli" Lanr1 va/yoki AnMan allellarini ham tashuvchi ba'zi liniyalar kasallik alomatlarini ko'rsatadi.
Qizig'i shundaki, "chidamli" marker alleliga ega bo'lmagan bir nechta NLL chiziqlari antraknozga yuqori darajada chidamlilikni ko'rsatdi (Lanr1 yoki AnMan genotiplari uchun taqqoslanadigan yoki undan yuqori), masalan, Boregine (P qiymati ikkala parametr uchun ham < 0,0001), Bojar (P qiymati ball uchun < 0,0001 va o'simlik og'irligi uchun 0,001) va Population B-549/79b (P qiymati ball uchun < 0,0001 va vazn uchun ahamiyatsiz). Qizig'i shundaki, "chidamli" marker alleliga ega bo'lmagan bir nechta NLL chiziqlari antraknozga yuqori darajada chidamlilikni ko'rsatdi (Lanr1 yoki AnMan genotiplari uchun taqqoslanadigan yoki undan yuqori), masalan, Boregine (P qiymati ikkala parametr uchun ham < 0,0001), Bojar (P qiymati ball uchun < 0,0001 va o'simlik og'irligi uchun 0,001) va Population B-549/79b (P qiymati ball uchun < 0,0001 va vazn uchun ahamiyatsiz). Interesno, chto neskolko liniy NLL, lishennyx kakogo-libo «rezistentnogo» markernogo allelya, pokazali vysokiy uroven ustachivosti k antraknozu (soposstavimyy yoki bolee vysokiy, chem uchun genotipov Lanr1 yoki AnMan kakregine), taki 0, <0, oboix parametrov), Bojar (znachenie P < 0,0001 uchun otsenki va 0,001 uchun massy rasteniya) va mashhur B-549/79b (znachenie P <0,0001 uchun otsenki va massy uchun neznachimo). Qizig'i shundaki, "chidamli" marker alleliga ega bo'lmagan bir nechta NLL liniyalari antraknozga yuqori darajadagi qarshilikni ko'rsatdi (Lanr1 yoki AnMan genotiplari bilan taqqoslanadigan yoki undan yuqori), masalan, Boregine (P qiymati ikkala parametr uchun ham <0,0001), Bojar (P qiymati baholash uchun <0,0001 va o'simlik og'irligi uchun 0,001) va B-549/79b populyatsiyasi (P qiymati baholash uchun <0,0001 va vazn uchun ahamiyatli emas).língíngínlínlínlínlínlínlínlínlínlínlínlínlínlíngínlínlínlínlíngínlínlíngínlínlínlínlínglínlínlínlínlínlínlínlínlínglínlínlínlínlínlínlínlínglínlínlínlínlínlínlínlínlínlínlínlínlnl AnMan chàngjàngāngāngāngīngīngī, mīngēng Boregine（shīngjīngjīmīlīpīp< 0.0001）、Bojar（P chàngàng 0.0001， māngāngīnī 0.001） yāngībīn B-549/79b（yāngīpīp< 0,0001，重jīngčičiči）。 Qizig'i shundaki, hech qanday "antigenik" markerlarga ega bo'lmagan ba'zi NLL tizimlari yuqori gorizontal qarshilik ko'rsatadi (Lanr1 yoki AnMan genlariga teng yoki undan yuqori), masalan, Boregine (ikkala parametr P < 0.0001), Bojar (P qiymati < 0.0001, o'simlik og'irligi 0.001) va B-549/79b shtammi (P qiymati < 0.0001, og'irligi ahamiyatsiz). Interesno, chto nekotorye linii NLL, lishennye kakix-libo markernyx allleley «rezistentnosti», pokazali vysokie urovni ustachivosti k antraknozu (sravnimye ili vyshe, chem u genotipov Lanr1 yoki AnMan), takie kakix-libo markernyx alleley (sravnimye yoki vyshe), obznachenie kak Boregov01 (obznachenie Pr. Bojar (znachenie P <0,0001, massa rasteniya 0,001) va populyatsiya B-549/79b (otsenka P-znachenie <0,0001, massa neznachitelna). Qizig'i shundaki, "qarshilik" marker allellariga ega bo'lmagan ba'zi NLL liniyalari antraknozga yuqori darajada qarshilik ko'rsatdi (Lanr1 yoki AnMan genotiplariga o'xshash yoki undan yuqori), masalan, Boregine (ikkala parametr uchun ham P qiymati <0.0001), Bojar (P-qiymati <0.0001, o'simlik og'irligi 0.001) va B-549/79b populyatsiyasi (P-qiymati <0.0001, og'irligi ahamiyatsiz).Bu hodisa qarshilikning yangi genetik manbai mavjudligini ko'rsatadi, bu marker genotiplari va kasallik fenotiplari o'rtasida kuzatilgan korrelyatsiyaning yo'qligini tushuntiradi (P qiymatlari ~0,42 dan ~0,98 gacha). Shunday qilib, Kolmogorov-Smirnov testi antraknoz qarshiligi haqidagi ma'lumotlar ballar (P-qiymatlari 0,25 va 0,11) va o'simlik massasi (P-qiymatlari 0,47 va 0,55) bo'yicha taxminan normal taqsimlanganligini ko'rsatdi, bu esa Lanr1 va AnManga qaraganda ko'proq allellar ishtirok etgan degan gipotezani bildiradi.
Antraknozga chidamlilik skriningi natijalariga ko'ra, transkriptom tahlili uchun 4 ta chiziq tanlandi: 83A:476, Boregine, Mandelup va Population 22660. Ushbu chiziqlar, avvalgi testdagi kabi bo'lsa, RNK ketma-ketligi orqali emlash tajribalarida kuydirgiga chidamlilik uchun qayta sinovdan o'tkazildi. Ball qiymatlari quyidagicha edi: Boregin (1.71 ± 1.39), 83A: 476 (2.09 ± 1.38), Mandelup (3.82 ± 1.42) va populyatsiya 22660 (6.11 ± 1.29).
Illumina NovaSeq 6000 protokoli har bir namunada o'rtacha 40,5 Mread juftligiga erishdi (29,7 dan 54,4 Mreadgacha) (Qo'shimcha jadval S3). Malumot ketma-ketligidagi moslashtirish ballari 75,5% dan 88,6% gacha bo'lgan. Biologik replikatsiyalar orasidagi eksperimental variantlar o'rtasidagi o'qish soni ma'lumotlarining o'rtacha korrelyatsiyasi 0,812 dan 0,997 gacha bo'lgan (o'rtacha 0,959). Tahlil qilingan 35 170 gendan 2917 tasida ekspressiya kuzatilmadi, qolgan 4785 gen esa ahamiyatsiz darajada ifodalandi (asosiy o'rtacha <5). Tahlil qilingan 35 170 gendan 2917 tasida ekspressiya kuzatilmadi, qolgan 4785 gen esa ahamiyatsiz darajada ifodalandi (asosiy o'rtacha <5). Iz 35 170 proanalizirovannyh genov 2917 ne proyavlyali ekspressii, a ostalnye 4785 genov ekspressirovalis na neznachitelnom urovne (bazovoe srednee <5). Tahlil qilingan 35 170 gendan 2917 tasida ekspressiya kuzatilmadi, qolgan 4785 gen esa ahamiyatsiz darajada ifodalandi (bazaviy o'rtacha qiymat <5).35 170 yàngíngín, 2917 yàngíngínín, 4785 shngjngjngjngjnjnzhnjngjnjngjngjngjngjngjngjngjngjngdng< 5）。35,170 Iz 35 170 proanalizirovannyh genov 2917 ekspressiv emas, a ostalnye 4785 genov imeli neznachitelnuyu ekspressyu (bazovoe srednee znachenie <5). Tahlil qilingan 35 170 gendan 2917 tasi ifodalanmagan va qolgan 4785 ta genning ifodasi ahamiyatsiz bo'lgan (asosiy o'rtacha <5).Shunday qilib, tajriba davomida ifodalangan deb hisoblangan genlar soni (asosiy o'rtacha ≥ 5) 27 468 tani (78,1%) tashkil etdi (S4 qo'shimcha jadval).
Birinchi vaqt nuqtasidan boshlab, barcha NLL chiziqlari transkriptomani qayta dasturlash orqali C. lupini (Col-08 shtammi) ning emlanishiga javob berdi (1-jadval), ammo chiziqlar o'rtasida sezilarli farqlar kuzatildi. Shunday qilib, 83A:476 qarshilik chizig'i (Lanr1 genini olib yuruvchi) birinchi vaqt nuqtasida (6 hpi) sezilarli transkriptom qayta dasturlashni ko'rsatdi, bu vaqt nuqtasidagi boshqa vaqt nuqtalariga nisbatan izolyatsiya qilingan yuqoriga va pastga genlar soni 31-69 baravar oshdi. Bundan tashqari, bu cho'qqi qisqa muddatli bo'ldi, chunki ikkinchi vaqt nuqtasida (12 hpi) faqat bir nechta genlarning ifodasi sezilarli darajada o'zgargan holda qoldi. Qizig'i shundaki, transplantatsiya testida ham yuqori darajadagi qarshilik ko'rsatgan Boregine tajriba davomida bunday katta transkripsiya qayta dasturlashdan o'tmadi. Biroq, differentsial ifodalangan genlar (DEG) soni Boregine va 83A:476 uchun 12 HPI da bir xil edi. Mandelup va 22660 populyatsiyasi oxirgi vaqt nuqtasida DEG cho'qqilarini (48 l/s) ko'rsatdi, bu esa himoya reaksiyalarining nisbatan kechikishini ko'rsatadi.
83A:476 boshqa barcha chiziqlarga nisbatan 6 HPI da C. lupini ga javoban katta transkriptom qayta dasturlashdan o'tganligi sababli, bu vaqtda kuzatilgan DEGlarning ~91% naslga xos edi (1-rasm). Biroq, tadqiqot chiziqlari o'rtasida dastlabki javoblarda ba'zi bir o'xshashliklar mavjud edi, chunki Boregine, Mandelup va 22660 populyatsiyasida mos ravishda 68,5%, 50,9% va 52,6% DEG ma'lum vaqt oralig'ida 83A:476 da topilganlar bilan bir-biriga mos keldi. Biroq, bu DEGlar hozirda 83A:476 yordamida aniqlangan barcha DEGlarning atigi kichik bir qismini (0,97–1,70%) tashkil etdi. Bundan tashqari, barcha liniyalardan 11 ta DEG bu vaqtda izchil edi (S4-S6 qo'shimcha jadvallari), jumladan, o'simliklarni himoya qilish reaksiyalarining umumiy komponentlari: lipidlarni uzatish oqsili (TanjilG_32225), endoglukan-1,3-β-glyukozid fermenti (TanjilG_23384), SAM22 (TanjilG_31528 va TanjilG_31531) kabi ikkita stressga qarshi oqsil, asosiy lateks oqsili (TanjilG_32352) va ikkita glitsinga boy strukturaviy hujayra devori oqsillari (TanjilG_19701 va TanjilG_19702). Shuningdek, 24 HPI da 83A:476 va Boregine o'rtasida (jami 16-38% DEG) va 48 HPI da Mandelup va 22660 populyatsiyasi o'rtasida (jami 14-20% DEG) transkriptom reaksiyalarida nisbatan yuqori o'xshashlik mavjud edi.
Venn diagrammasi 1999-yilda Polshaning Verjenitse shahridagi lupin dalalaridan olingan Colletotrichum lupini (Col-08 shtammi) bilan emlangan tor bargli lupin (NLL) liniyalarida differentsial ifodalangan genlar (DEG) sonini ko'rsatadi. Tahlil qilingan NLL liniyalari: 83A:476 (chidamli, Lanr1 allelini olib yuruvchi), Boregine (chidamli, genetik kelib chiqishi noma'lum), Mandelup (o'rtacha chidamli, AnMan allelini olib yuruvchi) va 22660 populyatsiya (juda sezgir). hpi qisqartmasi emlashdan keyingi soatlarni anglatadi. Grafikni soddalashtirish uchun nol qiymatlar olib tashlandi.
6 hpi da ortiqcha ifodalangan genlar to'plami kanonik R gen domenlarining mavjudligi uchun tahlil qilindi (S7 qo'shimcha jadvali). Ushbu tadqiqotda faqat 83A:476 da NBS-LRR domenlari bilan klassik kasalliklarga chidamlilik genlarining transkriptom induksiyasi aniqlandi. Ushbu to'plam bitta TIR-NBS-LRR genidan (tanjilg_05042), beshta CC-NBS-LRR genidan (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 va tanjilg_16162) va to'rtta NBS-LR, Tanjilg_16162) va to'rtta NBS-LRRE (tanjilg_16162), shuningdek, to'rtta NBS-Lrr (tanjilg_16162) va to'rtta NBS-LRR (TANJILG_16162) dan iborat edi. Bu genlarning barchasi saqlangan ketma-ketliklarda joylashgan kanonik domenlarga ega. NBS-LRR domen genlaridan tashqari, bir nechta RLL kinazalari 6 hpi da faollashdi, ya'ni bittasi Boregine (TanjilG_19877) da, ikkitasi Mandelup (TanjilG_07141 va TanjilG_19877) da va 22660 populyatsiyasida (TanjilG_09014 va TanjilG_10361) va ikkitasi 83A 27:476 da.
C. lupini (Col-08 shtammi) bilan emlashga javoban sezilarli darajada o'zgargan ifodaga ega genlar Gen Ontologiyasi (GO) bilan boyitish tahlilidan o'tkazildi (S8 qo'shimcha jadvali). Eng ko'p ifodalangan biologik jarayon atamasi "GO:0006952 himoya javobi" bo'lib, u 16 ta (vaqt × chiziq) kombinatsiyalardan 6 tasida yuqori ahamiyatga ega (P qiymati <0,001) ko'rindi (2-rasm). Eng ko'p ifodalangan biologik jarayon atamasi "GO:0006952 himoya javobi" bo'lib, u 16 ta (vaqt × chiziq) kombinatsiyalardan 6 tasida yuqori ahamiyatga ega (P qiymati <0,001) ko'rindi (2-rasm). Naibolee chasto chrezmerno predstavlennym terminom biologicheskogo protsess byl «GO: 0006952 zashchitnyy otvet», kotoryy poyavlyalsya v 6 iz 16 (vremyya × liniya) kombinatsiy s vysokoy znachimostyu (znachenie P <0,001). Eng ko'p ifodalangan biologik jarayon atamasi "GO:0006952 himoya javobi" bo'lib, u 16 ta (vaqt × nasl-nasab) kombinatsiyalardan 6 tasida yuqori ahamiyatga ega (P qiymati <0,001) ko'rindi (2-rasm).língīngīngīngīngīngīngīngīngīngīngyīngīngīngīngīnjīngi “GO: 0006952 līngīngīng”， 16 dīngīngīng míngjíngjínjínín6 yíngínín, díngíngíngíníní (P díng< 0.001）（2）。 Biologik jarayonning eng vakillik qiluvchi atamasi “GO:0006952 himoya javobi” boʻlib, u 16 ta (时间×线) kombinatsiyadan 6 tasida uchraydi va yuqori ahamiyatga ega (P qiymati <0,001) (图2). Naibolee chasto chrezmerno predstavlennym terminom biologik protsessual byl «GO: 0006952 Defense Response», kotoryy poyavlyalsya v 6 iz 16 kombinatsi (vremya × liniya) s vysokoy znachimostyu (znachenie P <0.001) (). Eng ko'p ifodalangan biologik jarayon atamasi "GO:0006952 Defense Response" bo'lib, u 16 ta kombinatsiyadan 6 tasida (vaqt × chiziq) yuqori ahamiyatga ega (P qiymati <0,001) paydo bo'ldi (2-rasm).Bu atama 83A da ikki vaqt nuqtasida: 476 va Boregine (6 va 24 hpi) va Mandelup va 22660 populyatsiyasida bir vaqt nuqtasida (mos ravishda 12 va 6 hpi) ortiqcha ifodalangan. Bu kutilgan natija bo'lib, chidamli liniyalarning antifungal javobini ta'kidlaydi. Bundan tashqari, 83A:476 C. lupini ga "GO:0055114 redoks jarayoni" atamasi bilan ifodalangan oksidlovchi portlash bilan bog'liq genlarni tez induktsiya qilish orqali javob berdi, bu esa o'ziga xos himoya javobini ko'rsatdi, Boregine esa "GO" atamasi bilan bog'liq o'ziga xos himoya javoblarini ochib berdi. :0006950 Stressga javob”. 22660 populyatsiyasi ikkilamchi metabolitlarni o'z ichiga olgan gorizontal qarshilik javobini faollashtirdi, bu “GO:0016104 Triterpen biosintezi jarayoni” va “GO:0006722 Triterpen metabolizmi jarayoni” (ikkala atama ham bir xil genlar to'plamiga tegishli) atamalarining haddan tashqari ko'pligini ta'kidladi, GO atamasini boyitish tahlili natijalarini hisobga olgan holda, Mandelup reaksiyasining barqarorligi Boregine va 22660 populyatsiyasi o'rtasida edi. Bundan tashqari, 83A:476 erta reaksiyasi (6 hpi) va Mandelup va 22660 populyatsiyasining kechiktirilgan reaksiyasi GO:0015979 “fotosintez” atamasini va boshqa tegishli biologik jarayonlarni o'z ichiga oladi.
Kuydirgi lupini (1999-yilda Polshaning Verjenitse shahridagi lupin dalalaridan olingan Col-08 shtammi) bilan emlangan tor bargli lupin (NLL) transkriptom reaksiyalari paytida differentsial ifodalangan genlar annotatsiyasida tanlangan bioprosess gen ontologiyasi atamalari juda bo'rttirilgan. Tahlil qilingan NLL liniyalari: 83A:476 (chidamli, gomozigota Lanr1 allelini olib yuruvchi), Boregine (chidamli, noma'lum genetik kelib chiqishi), Mandelup (o'rtacha chidamli, gomozigota AnMan allelini olib yuruvchi) va 22660 populyatsiya (sezgir).
Ushbu tadqiqot antraknozga chidamlilikka hissa qo'shadigan genlarni aniqlashga qaratilganligi sababli, GO “GO: 0006952 Himoyaviy javoblar” va “GO: 0055114 Redoks jarayonlari” atamalariga tayinlangan genlar chegaraviy qiymatlar bilan tahlil qilindi, chunki boshlang'ich qiymat kamida bitta chiziq bilan ≥ 30 ni anglatadi. × log2 ning statistik jihatdan ahamiyatli qiymatlarini birlashtirgan vaqt nuqtasi (katlama o'zgarishi). Ushbu mezonlarga javob beradigan genlar soni GO:0006952 uchun 65 ta va GO:0055114 uchun 524 tani tashkil etdi.
83A:476 da GO:0006952 atamasi bilan izohlangan ikkita DEG cho'qqisi aniqlandi, birinchisi dyuymda 6 gen (64 gen, yuqoriga va pastga regulyatsiya) va ikkinchisi dyuymda 24 gen (15 gen, faqat yuqoriga regulyatsiya). Boregine shuningdek, GO:0006952 bir vaqtning o'zida cho'qqiga chiqqanini, ammo DEG kamroq (11 va 8) va imtiyozli faollashuv bilan ekanligini ko'rsatdi. Mandeloop 12 va 48 HPI da GO:0006952 ning ikkita cho'qqisini ko'rsatdi, ikkalasi ham 12 ta genni o'z ichiga olgan (birinchisi faollashtiruvchi genlar bilan, ikkinchisi esa faqat bostiruvchi genlar bilan), 6 HPI (13 gen) da 22660 populyatsiyada esa o'sish cho'qqisi regulyatsiyasi ustunlik qilgan. Shuni ta'kidlash kerakki, ushbu cho'qqilardagi GO:0006952 DEG ning 96,4% bir xil turdagi javobga ega edi (yuqoriga yoki pastga), bu esa ishtirok etgan genlar sonidagi farqlarga qaramay, himoya javoblarida sezilarli darajada o'xshashlikni ko'rsatadi. GO:0006952 atamasi bilan bog'liq ketma-ketliklarning eng katta guruhi 10-sinf patogenezi bilan bog'liq oqsil (PR-10) oqsil kladasi va yadro oqsili lateksga tegishli bo'lgan Ochlik Stressi bilan bog'liq xabar oqsili 22 (SAM22 ga o'xshash) ni kodlaydi. o'xshash (MLP ga o'xshash) oqsil) oqsili (3-rasm). Ikkala guruh ifoda tabiati va javob yo'nalishi bo'yicha farq qildi. SAM22 ga o'xshash oqsillarni kodlovchi genlar dastlabki vaqt nuqtalarida (6 yoki 12 hpi) izchil va sezilarli induksiyani ko'rsatdi va tajriba oxirida odatda javob bermadi (48 hpi), MLP ga o'xshash oqsillar esa 6 hpi da koordinatsiyani ko'rsatdi. hpi. 83A:476 va Mandelup 48 ot kuchi/dyuym tezlikda deyarli barcha boshqa ma'lumotlar nuqtalari javob bermadi. Bundan tashqari, SAM22 ga o'xshash oqsil genlarining ekspressiya profillaridagi farqlar antraknozga chidamlilikning o'zgaruvchanligini kuzatgandan so'ng kuzatildi, chunki ko'proq chidamli liniyalarda bu genlarni sezgirroq genlarga qaraganda sezilarli darajada induktsiya qiluvchi vaqt nuqtalari ko'proq edi. Boshqa bir LlR18A/B ga o'xshash PR-10 geni SAM22 ga o'xshash oqsil geniga juda o'xshash ekspressiya naqshini ko'rsatdi.
“GO:0006952 Mudofaa Javobi” biologik jarayon atamasining asosiy komponentlari va Lanr1 va AnMan allellarining nomzod genlarining ifodalanish naqshlari aniqlandi. Log2 shkalasi bir vaqtning o'zida emlangan (Colletotrichum lupini, Col-08 shtammi, lupin dalalaridan olingan, Wizhenica, Polsha, 1999) va nazorat (soxta emlangan) o'simliklar o'rtasidagi log2 qiymatlarini (katlama o'zgarishi) ifodalaydi. Quyidagi tor bargli lupin liniyalari tahlil qilindi: 83A:476 (chidamli, gomozigota Lanr1 allelini olib yuradi), Boregine (chidamli, genetik kelib chiqishi noma'lum), Mandelup (o'rtacha chidamli, gomozigota AnMan allelini olib yuradi) va 22660 populyatsiyasi (sezgir).
Bundan tashqari, RNK-sek nomzod genlari Lanr1 (TanjilG_05042) va AnMan (TanjilG_12861) ning ekspressiya profillari baholandi (3-rasm). TanjilG_05042 geni 83A:476 da faqat birinchi vaqt nuqtasida (6 hpi) sezilarli javob (faollashuv) ko'rsatdi, TanjilG_12861 esa Mandeloopda faqat ikkita vaqt nuqtasida sezilarli edi: 6 hpi (pastga regulyatsiya) va 24 hpi (6 hpi). Bilan.). sozlanishi) ).
GO:0055114 “redoks jarayoni” atamasida eng koʻp ifodalangan genlar sitoxrom P450 oqsillari va peroksidazani kodlovchi genlar edi (4-rasm). 83A:476 dan 6 HPI da ajratilgan namunalar uchun, odatda, emlangan va nazorat oʻsimliklari oʻrtasida maksimal yoki minimal log2 (katlama oʻzgarishi) qiymatlari (genlarning 86,6% uchun) kuzatildi, bu esa ushbu genotipning emlangan jinsga yuqori javobini taʼkidlaydi. 83A:476 eng muhim GO: 0055114 DEG ni 6 hpi da koʻrsatdi (503 gen), qolgan chiziqlar esa 48 hpi da (Boregine, 31 gen; Mandelup, 85 gen; va Populyatsiya 22660, 78 gen)). GO:0055114 oilasining koʻpgina genlarida emlashga ikki xil javob (aktivatsiya va inhibisyon) kuzatildi. Qizig'i shundaki, Mandelupeda 48 ot kuchida GO: 0055114 atamasi uchun aniqlangan DEGlarning 97,6% gacha. Bu kuzatishlar shuni ko'rsatadiki, sezilarli darajada kichikroq miqyosga qaramay (ya'ni, mutatsiyaga uchragan redoks genlari soni, 85 va 503), mandelupaning antraknozga kechiktirilgan transkriptom javoblari naqshlari 83A:476 ning dastlabki javobiga o'xshash. Boregine va 22660 populyatsiyasida bu konvergensiya mos ravishda 51,6% va 75,6% ni tashkil qiladi.
“GO:0055114 Redoks jarayoni” biologik jarayoni atamasining asosiy komponentlarining ifodalanish naqshlari aniqlandi. Log2 shkalasi bir vaqtning o'zida emlangan (Colletotrichum lupini, Col-08 shtammi, lupin dalalaridan olingan, Wizhenica, Polsha, 1999) va nazorat (soxta emlangan) o'simliklar o'rtasidagi log2 qiymatlarini (katlama o'zgarishi) ifodalaydi. Quyidagi tor bargli lupin liniyalari tahlil qilindi: 83A:476 (chidamli, gomozigota Lanr1 allelini olib yuradi), Boregine (chidamli, genetik kelib chiqishi noma'lum), Mandelup (o'rtacha chidamli, gomozigota AnMan allelini olib yuradi) va 22660 populyatsiyasi (sezgir).
83A:476 C. lupini (Col-08 shtammi) bilan emlashga transkriptomik javoblar, shuningdek, GO:0015979 "fotosintez" atamasiga tegishli genlarni muvofiqlashtirilgan sustlashtirishni va boshqa tegishli biologik jarayonlarni ham o'z ichiga olgan (5-rasm). Ushbu GO:0015979 DEG to'plami 83A:476 da 6 ot kuchida sezilarli darajada repressiya qilingan 105 ta genni o'z ichiga olgan. Ushbu kichik guruhda, Mandelupda 22660 populyatsiyada bir vaqtning o'zida 48 HPI va 35 ta gen, shu jumladan ikkala genotipga xos bo'lgan 19 ta DEG ham pasaygan. GO: 0015979 atamasi bilan bog'liq hech qanday DEG biron bir kombinatsiyada sezilarli darajada faollashmagan (chiziq x vaqt).
“GO:0015979 Fotosintez” biologik jarayoni atamasining asosiy komponentlarining ifodalanish naqshlari aniqlandi. Log2 shkalasi bir vaqtning o'zida emlangan (Colletotrichum lupini, Col-08 shtammi, lupin dalalaridan olingan, Wizhenica, Polsha, 1999) va nazorat (soxta emlangan) o'simliklar o'rtasidagi log2 qiymatlarini (katlama o'zgarishi) ifodalaydi. Quyidagi tor bargli lupin liniyalari tahlil qilindi: 83A:476 (chidamli, gomozigota Lanr1 allelini olib yuradi), Boregine (chidamli, genetik kelib chiqishi noma'lum), Mandelup (o'rtacha chidamli, gomozigota AnMan allelini olib yuradi) va 22660 populyatsiyasi (sezgir).
Differentsial ifoda tahlili natijalariga asoslanib va ​​patogen zamburug'larga qarshi himoya reaksiyalarida ishtirok etgan deb taxmin qilinadigan ushbu yetti gen to'plami real vaqt rejimidagi PCR orqali ifoda profillarini miqdoriy aniqlash uchun tanlandi (S9 qo'shimcha jadval).
Taxminiy oqsil geni TanjilG_10657 barcha o'rganilgan chiziqlar va vaqt nuqtalarida nazorat (taqlid qiluvchi) o'simliklar bilan solishtirganda sezilarli darajada induktsiyalangan (Qo'shimcha jadvallar S10, S11). Bundan tashqari, TanjilG_10657 ning ekspressiya profili barcha chiziqlar uchun tajriba davomida ortib borayotgan tendentsiyani ko'rsatdi. 22660 populyatsiyasi TanjilG_10657 ning emlashga eng yuqori sezgirligini 114 marta faollashtirish va 24 HPI da eng yuqori nisbiy ifoda darajasini (4,4 ± 0,4) ko'rsatdi (6a-rasm). PR10 LlR18A oqsil geni TanjilG_27015 ham barcha chiziqlar va vaqt nuqtalarida faollashuvni ko'rsatdi, ko'pgina ma'lumotlar nuqtalarida statistik ahamiyatga ega edi (6b-rasm). TanjilG_10657 ga o'xshash, TanjilG_27015 ning eng yuqori nisbiy ifoda darajasi 22660 emlangan populyatsiyada 24 HPI (19,5 ± 2,4) da kuzatildi. TanjilG_04706 kislota endoxitinaza geni Boregine 6 hpi dan tashqari barcha chiziqlarda va barcha vaqt nuqtalarida sezilarli darajada oshdi (6c-rasm). U birinchi vaqt nuqtasida (6 HPI) 83A:476 da kuchli induktsiya qilindi (10,5 marta) va boshqa chiziqlarda o'rtacha darajada oshdi (6,6-7,5 marta). Tajriba davomida TanjilG_04706 ning ifodasi 83A:476 va Boregine da shunga o'xshash darajalarda qoldi, Mandelup va 22660 populyatsiyasida esa u sezilarli darajada oshdi va nisbatan yuqori qiymatlarga yetdi (mos ravishda 5,9 ± 1,5 va 6,2 ± 1,5). Endoglukan-1,3-β-glyukozidazaga o'xshash TanjilG_23384 geni 22660 populyatsiyasidan tashqari barcha liniyalarda dastlabki ikki vaqt nuqtasida (6 va 12 hpi) yuqori faollashuvni ko'rsatdi (6d-rasm). TanjilG_23384 ning eng yuqori nisbiy ifoda darajalari Mandelup (2,7 ± 0,3) va 83A:476 (1,5 ± 0,1) da ikkinchi vaqt nuqtasida (12 hpi) kuzatildi. 24 HPI da TanjilG_23384 ifodasi barcha o'rganilgan liniyalarda nisbatan past edi (0,04 ± 0,009 dan 0,44 ± 0,12 gacha).
Miqdoriy PZR orqali aniqlangan tanlangan genlarning ekspressiya profillari (ag). 6, 12 va 24 raqamlari emlashdan keyingi soatlarni bildiradi. LanDExH7 va LanTUB6 genlari normallashtirish uchun, LanTUB6 esa ketma-ket kalibrlash uchun ishlatilgan. Xato satrlari uchta biologik replikatsiyaga asoslangan standart og'ishni ifodalaydi, ularning har biri uchta texnik replikatsiyaning o'rtacha qiymatiga teng. Emlangan (Colletotrichum lupini, Col-08 shtammi, 1999-yilda Polshaning Wierzenica shahridagi lupin maydonidan olingan) va nazorat (soxta emlangan) o'simliklari o'rtasidagi ifoda darajalaridagi farqlarning statistik ahamiyati ma'lumotlar nuqtalari ustida belgilangan (*P qiymati < 0,05, **P qiymati ≤ 0,01, ***P qiymati ≤ 0,001). Emlangan (Colletotrichum lupini, Col-08 shtammi, 1999-yilda Polshaning Wierzenica shahridagi lupin maydonidan olingan) va nazorat (soxta emlangan) o'simliklari o'rtasidagi ifoda darajalaridagi farqlarning statistik ahamiyati ma'lumotlar nuqtalari ustida belgilangan (*P qiymati < 0,05, **P qiymati ≤ 0,01, ***P qiymati ≤ 0,001). Statistika znachimost razlichiy v urovnyax ekspressii mejdu inokulirovannymi (Colletotrichum lupini, shtmm Col-08, poluchen v 1999 g. s polya lyupina v Verjenitse, Polsha) va nazorat qilish (lojno inochenichme nadixme nadichnich inokulirovannymi) (*znachenie P <0,05, **znachenie P ≤ 0,01, ***znachenie P ≤ 0,001). Ma'lumotlar nuqtalari ustida emlangan (Colletotrichum lupini, Col-08 shtammi, 1999-yilda Polshaning Verjenice shahridagi lupin maydonidan olingan) va nazorat (soxta emlangan) o'simliklar o'rtasidagi ifoda darajasidagi statistik jihatdan sezilarli farqlar qayd etilgan (*P qiymati < 0,05, **P-qiymati ≤ 0,01, ***P-qiymati ≤ 0,001).míči (Colletotrichum lupini，Col-08mīn，1999jīngwēngwiwiwierzenicačičičičičng ）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P h≤ 0,01, ***P h≤ 0,001)。colletotrichum lupini (colletotrichum lupini ， color-08 mī), 1999 yil língíngííííí líníííííííííííííínííníníníngyíní*p yíngyí*p <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.01 Statistika razlichiya v urovnyax ekspressii mejdu inokulirovannymi (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, poluchennyy s poley lyupina v Verjenitse, Polsha, v 1999 g.) znachenie P < 0,05, ** P-znachenie ≤ 0,01, ***P-znachenie ≤ 0,001). Ma'lumotlar nuqtalari ustida emlangan (Colletotrichum lupini, Col-08 shtammi, 1999-yilda Polshaning Verjenice shahridagi lupin dalalaridan olingan) va nazorat (soxta emlangan) o'simliklar o'rtasidagi ifoda darajasidagi statistik jihatdan sezilarli farqlar qayd etilgan (*P qiymati < 0,05, **P-qiymati ≤ 0,01, ***P-qiymati ≤ 0,001).Tahlil qilingan NLL chiziqlari quyidagilar edi: 83A:476 (rezistent, gomozigota Lanr1 allelini olib yuruvchi), Mandelup (o'rtacha chidamli, gomozigota AnMan allelini olib yuruvchi), Boregine (rezistent, noma'lum genetik kelib chiqishi) va 22660 populyatsiya (sezgir).
Lanr1 lokusidagi nomzod TanjilG_05042 geni RNK-sek tadqiqotlaridan olingan profillardan sezilarli darajada farq qiluvchi ifoda naqshini ko'rsatdi (6e-rasm). Ushbu genning sezilarli darajada faollashishi Mandelup va 22660 populyatsiyasida kuzatildi (mos ravishda 39,7 va 11,7 martagacha), natijada nisbatan yuqori ifoda darajasiga erishildi (mos ravishda 1,4 ± 0,14 va 7,2 ± 1,3 gacha). 83A:476 shuningdek, TanjilG_05042 genining ba'zi bir yuqori regulyatsiyasini (3,8 baravargacha) aniqladi, ammo erishilgan nisbiy ifoda darajalari (0,044 ± 0,002) Mandelup va 22660 populyatsiyasida kuzatilganlarga qaraganda 30 baravardan ko'proq past edi. qPCR yordamida tahlil qilinganida, soxta emlangan (nazorat) variantlardagi genotiplar orasidagi ifoda darajasida sezilarli farqlar ko'rsatildi, bu 22660 va 83A:476 populyatsiyalari, shuningdek, 22660 va 22660 populyatsiyalari o'rtasida 58 baravar farqga erishildi. Boregine va Mandalup o'rtasida ikki baravar farqga erishildi.
AnMan lokusidagi nomzod geni TanjilG_12861 83A:476 va Mandelupda emlashga javoban faollashdi, 22660 populyatsiyasida neytral edi va Boregineda pasaygan (6f-rasm). TanjilG_12861 genining nisbiy ifodasi emlangan 83A: 476 da eng yuqori bo'ldi (0,14±0,01). 17,4 kDa I sinf issiqlik zarbasi oqsili geni TanjilG_05080 HSP17.4 barcha o'rganilgan shtammlar va vaqt nuqtalarida pastroq nisbiy ifoda darajasini ko'rsatdi (6g-rasm). Eng yuqori qiymat 22660 populyatsiyasida 24 HPI da kuzatildi (0,14 ± 0,02, emlashga javoban sakkiz baravar ko'payish).
Gen ekspressiya profillarini taqqoslash (7-rasm) TanjilG_10657 va boshqa to'rtta gen: TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.80) va TanjilG_04706 (r = 0.79) o'rtasida yuqori korrelyatsiyani aniqladi. Bunday natijalar himoya reaksiyalari paytida ushbu genlarning birgalikda regulyatsiyasini ko'rsatishi mumkin. TanjilG_12861 va TanjilG_23384 genlari boshqa genlarga nisbatan pastroq Pearson korrelyatsiya koeffitsienti qiymatlari (mos ravishda 0.08 dan 0.43 gacha va -0.19 dan 0.28 gacha) bilan turli xil ekspressiya profillarini ko'rsatdi.
Gen ekspressiya profillari o'rtasidagi korrelyatsiyalar miqdoriy PZR yordamida aniqlandi. Quyidagi tor bargli lupin chiziqlari tahlil qilindi: 83A:476 (chidamli, gomozigota Lanr1 allelini olib yuruvchi), Mandelup (o'rtacha chidamli, gomozigota AnMan allelini olib yuruvchi), Boregine (chidamli, genetik kelib chiqishi noma'lum) va Populyatsiya 22660 (sezgir). Uchta vaqt nuqtasi hisoblandi (emlashdan keyin 6, 12 va 24 soat), jumladan, emlangan (Colletotrichum lupini, Col-08 shtammi, 1999 yilda Polshaning Verjenice shahridagi lupin dalalaridan olingan) va nazorat (soxta emlangan) o'simliklar. Shkala Pearson korrelyatsiya koeffitsientining qiymatini ko'rsatadi.
Dyuymga 6 ot kuchida olingan ma'lumotlarga asoslanib, WGCNA erta himoya javoblariga e'tibor qaratish uchun emlangan va nazorat o'simliklarini taqqoslash orqali aniqlangan 9981 DEGda amalga oshirildi (Qo'shimcha jadval S12). Genotiplar va eksperimental variantlar o'rtasida o'zaro bog'liq (ijobiy yoki salbiy) ifoda profillariga ega bo'lgan yigirma ikkita gen moduli (klasterlar) topildi. O'rtacha hisobda, gen ekspressiyasi darajasi 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populyatsiya 22660 tartibida pasayib bordi (ammo ikkala variantda ham bu tendentsiya nazorat o'simliklarida kuchliroq edi). O'rtacha hisobda, gen ekspressiyasi darajasi 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populyatsiya 22660 tartibida pasayib bordi (ammo ikkala variantda ham bu tendentsiya nazorat o'simliklarida kuchliroq edi). V srednem urovni ekspressi genov snijalis v poryadke 83A:476 > Mandelup > Boregine > Aholisi 22660 (oboix variant, odnako, eta tendentsiya byla silnee u nazorat qilish rasteniy). O'rtacha hisobda, gen ekspressiyasi darajasi 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populyatsiya 22660 tartibida pasaygan (ammo ikkala variantda ham bu tendentsiya nazorat o'simliklarida kuchliroq bo'lgan).míngīngīngīngīngīnīgī83A:476 > Mandelup > Boregine > Aholi 22660 língíngíngínč（yīngīngī, dīngīngīnīdī, dīngīīngīngīng, dīngīngīngīngīngjīngīngīngīngīnglíngín yín ， chàn lín yì 83a: 476> mandelup> boregine> aholi soni 22660 língíngíngínínín l l y y y y y y y y y i）。. V srednem urovni ekspressii genov snijalis v ryadu 83A:476 > Mandelup > Boregine > Aholisi 22660 (odnako va oboix variantax eta tendentsiya byla silnee u nazorat qilish rasteniy). O'rtacha hisobda, 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populyatsiya 22660 seriyasida gen ekspressiyasi darajasi pasaygan (ammo, ikkala variantda ham bu tendentsiya nazorat o'simliklarida kuchliroq bo'lgan).Emlash natijasida gen ekspressiyasining yuqori darajada regulyatsiyasi kuzatildi, ayniqsa 18, 19, 14, 6 va 1-modullarda (ta'sirning kamayish tartibida), salbiy regulyatsiya (masalan, 9 va 20-modullar) yoki neytral ta'sirlar bilan (masalan, 11, 22, 8 va 13-modullar). GO terminini boyitish tahlili (S13 qo'shimcha jadvali) emlangan modul (18) uchun maksimal faollashuvga ega "GO: 0006952 Himoyaviy javoblar" ni aniqladi, jumladan, qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 va TanjilG_27015) yordamida tahlil qilingan genlar, shuningdek, ko'plab emlangan fotosintez modullari (9) ham. 18-modul konsentratori (8-rasm) PR-10 ga o'xshash LlR18B oqsilini kodlovchi TanjilG_26536 geni, 9-modul konsentratori esa fotosistema II PsbQ oqsilini kodlovchi TanjilG_28955 geni sifatida aniqlandi. Antraknozga chidamlilik nomzodi Lanr1 geni TanjilG_05042 22-modulda topilgan (9-rasm) va TanjilG_01212 markazini olib yuruvchi “GO:0044260 Hujayra makromolekulyar metabolik jarayonlari” va “GO:0006355 Transkripsiya regulyatsiyasi, DNK shablonlash” atamalari bilan bog'liq. Gen issiqlik stressi transkripsiya omili A-4a (HSFA4a) ni kodlaydi.
"GO: 0006952 Himoya javoblari" biologik jarayon atamalari bilan modullarning genlarning birgalikda ifodalanishining og'irlikdagi tarmoq tahlili. qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 va TanjilG_27015) tomonidan tahlil qilingan to'rtta genni ajratib ko'rsatish uchun bog'lash soddalashtirildi.
"GO: 0006355: Transkripsiya regulyatsiyasi, DNK shablonlash" biologik jarayon atamasi yuqori darajada ifodalangan va antraknozga chidamlilik nomzodi Lanr1 TanjilG_05042 genini olib yuruvchi modulning genlarning birgalikda ifodalanishining og'irlikdagi tarmoq tahlili. TanjilG_05042 genini va markaziy TanjilG_01212 genini ajratish uchun bog'lash soddalashtirildi.
Avstraliyada to'plangan antraknozga chidamlilik skriningi shuni ko'rsatdiki, dastlabki chiqarilgan navlarning aksariyati sezgir edi; Kalya, Coromup va Mandelup o'rtacha darajada chidamli deb ta'riflangan, Wonga, Tanjil va 83A:476 esa yuqori darajada chidamli deb ta'riflangan26,27,31. bir xil qarshilik alleliga, Lanr1 deb belgilangan va Coromup va Mandelup boshqa allelga, AnMan10, 26, 39 deb belgilangan, Kalya esa boshqa allelga o'tgan., Lanr2. Germaniyada antraknozga chidamlilik skriningi natijasida Lanr1 dan boshqa nomzod alleli, LanrBo36 deb belgilangan Bo7212 chidamli liniyasi aniqlandi.
Bizning tadqiqotimiz sinovdan o'tgan germ plazmasida Lanr1 allelining juda past chastotasini (taxminan 6%) aniqladi. Ushbu kuzatuv Anseq3 va Anseq4 markerlaridan foydalangan holda Sharqiy Yevropa germ plazmasini skrining qilish natijalariga mos keladi, bu Lanr1 allelining faqat ikkita Belarus liniyasida mavjudligini ko'rsatdi. Bu shuni ko'rsatadiki, Lanr1 alleli Avstraliyadan farqli o'laroq, mahalliy selektsiya dasturlari tomonidan hali keng qo'llanilmaydi, u yerda u marker yordamida selektsiya qilish uchun asosiy allellardan biridir. Bu Avstraliya hisobotiga nisbatan Yevropa dala sharoitida Lanr1 alleli tomonidan ta'minlangan qarshilik darajasining pastligi bilan bog'liq bo'lishi mumkin. Bundan tashqari, Avstraliyadagi yuqori yog'ingarchilikli hududlarda antraknoz bo'yicha tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, Lanr1 alleli vositachiligidagi qarshilik javoblari patogenning o'sishi va tez rivojlanishiga yordam beradigan ob-havo sharoitida samarali bo'lmasligi mumkin19,42. Darhaqiqat, ushbu tadqiqotda Lanr1 allelini olib yuradigan genotiplarda ham antraknozning ba'zi belgilari kuzatildi, bu esa C. lupini rivojlanishi uchun optimal sharoitlarda qarshilik yo'qolishi mumkinligini ko'rsatadi. Bundan tashqari, Lanr1 lokusidan taxminan 1 sm masofada joylashgan Anseq3 va Anseq4 markerlarining mavjudligini noto'g'ri ijobiy talqin qilish mumkin 28,30,43.
Bizning tadqiqotimiz shuni ko'rsatdiki, Lanr1 allelini tashuvchi 83A:476 birinchi tahlil qilingan vaqt nuqtasida (6 ot kuchi) C. lupini emlashga keng ko'lamli transkriptom qayta dasturlash bilan javob bergan, AnMan allelini tashuvchi Mandelupda esa transkriptomik javoblar ancha keyinroq (24 dan 48 ot kuchigacha) kuzatilgan. Himoya javoblaridagi bu vaqtinchalik o'zgarishlar kasallik alomatlaridagi farqlar bilan bog'liq bo'lib, qarshilikka muvaffaqiyatli javob berish uchun patogenni erta aniqlashning muhimligini ta'kidlaydi. O'simlik to'qimasini yuqtirish uchun kuydirgi sporalari xo'jayin yuzasida bir nechta rivojlanish bosqichlaridan o'tishi kerak, jumladan, unib chiqish, hujayra bo'linishi va appressorium hosil bo'lishi. Qo'shimcha - bu xo'jayin yuzasiga yopishib, xo'jayin to'qimalariga kirishni osonlashtiradigan infektsion tuzilish. Shunday qilib, no'xat ekstraktidagi C. gloeosporioides sporalari yadroning birinchi bo'linishini 75-90 daqiqa inkubatsiyadan keyin, 90-120 daqiqadan so'ng jinsiy naycha hosil bo'lishini va 4 soatdan keyin bostirilishini ko'rsatdi 45. Mango C. gloeosporioides 3 soatlik inkubatsiyadan so'ng 40% dan ortiq konidial unib chiqishni va 4 soatdan keyin taxminan 20% ga susaytiruvchi moddalar hosil bo'lishini ko'rsatdi. C. gloeosporioides ning virulentlik bilan bog'liq CAP20 geni avokado sirt mumida 4 soat 46 daqiqadan so'ng CAP20 oqsilining yuqori konsentratsiyasi bilan 3,5 soatlik inkubatsiyadan so'ng epifit hosil qiluvchi konidiyalarda transkripsiya faolligini ko'rsatdi. Xuddi shunday, C. trifolii dagi melanin biosintezi genlarining faolligi 2 soatlik inkubatsiya paytida, keyin 1 soatdan keyin appressorium hosil bo'lishi bilan induktsiya qilindi. Barg to'qimalarini o'rganish shuni ko'rsatdiki, C. acutatum bilan emlangan qulupnay 8 ot kuchida birinchi bostirishga ega, C. coccodes bilan emlangan pomidor esa 4 ot kuchida birinchi bostirishga ega, bu asosan Colletotrichum spp. yuqumli jarayonining vaqt shkalasiga mos keladi. 83A:476 ga tezkor himoya reaksiyalari bu chiziqda o'simlik qarshiligi va effektor tomonidan qo'zg'atilgan immunitet (ETI) genlarining ishtirok etishini ko'rsatadi, Mandelupning kechiktirilgan reaksiyalari esa mikro-assosiatsiyalangan molekulyar naqsh bilan qo'zg'atilgan immunitet (MTI) gipotezasini 50 qo'llab-quvvatlaydi. 83A:476 va Mandelupga erta reaksiyalar. Kechiktirilgan reaksiyada yuqoriga yoki pastga regulyatsiya qilingan genlar o'rtasidagi qisman mos kelish ham bu kontseptsiyani qo'llab-quvvatlaydi, chunki ETI ko'pincha anafilaktik shok deb nomlanuvchi infeksiya joyida dasturlashtirilgan hujayra o'limi bilan yakunlanadigan tezlashtirilgan va kuchaytirilgan MTI reaksiyasi deb hisoblanadi 51,52.
Gen Ontologiyasi GO:0006952 “Himoya reaksiyasi” deb nomlangan haddan tashqari ifodalangan atamaga tegishli genlarning aksariyati stress keltirib chiqaradigan ro'za tutish xabari 22 oqsilining (SAM22 ga o'xshash) va yettita asosiy lateks oqsilga o'xshash (MLP) 11 ta gomologidir. 31, 34, 43 va 423-o'xshash oqsillar ketma-ketlik o'xshashligini ko'rsatdi. SAM22-o'xshash genlar uzoqroq davom etgan sezilarli faollashuvni ko'rsatdi va antraknozga qarshilik darajasining oshganligini ko'rsatdi (83A:476 va Boregine). Biroq, MLP-o'xshash genlar faqat nomzod qarshilik allelini olib yuruvchi chiziqlarda kamaytirildi (83A:476/Lanr1 6 ot kuchida va Mandelup/AnMan 24 ot kuchida). Shuni ta'kidlash kerakki, aniqlangan barcha SAM22-o'xshash gomologlar taxminan 105 kb ni qamrab oluvchi gen klasteridan kelib chiqadi, MLP-o'xshash genlar esa genomning alohida mintaqalaridan kelib chiqadi. Bunday SAM22 ga o'xshash genlarning muvofiqlashtirilgan faollashuvi Diaporthetoxica emlashga NLL qarshiligini o'rganish bo'yicha avvalgi tadqiqotimizda ham aniqlangan bo'lib, ular himoya javobining gorizontal komponentlarida ishtirok etishini ko'rsatadi. Bu xulosa, shuningdek, SAM22 ga o'xshash genlarning shikastlanishga yoki salitsil kislotasi, qo'ziqorin induktorlari yoki vodorod peroksid bilan davolanishga ijobiy javobi haqidagi xabarlar bilan ham tasdiqlanadi.
MLPga o'xshash genlar ko'plab o'simlik turlarida bakterial, virusli va patogen zamburug'li infeksiyalar kabi turli abiotik va biotik stresslarga javob berishi ko'rsatilgan55. O'simliklar va patogenlar o'rtasidagi muayyan o'zaro ta'sirlarga javob yo'nalishlari kuchli o'sishdan (ya'ni, paxta Verticillium dahliae bilan zararlanganda) sezilarli darajada pasayishigacha (ya'ni, olma daraxti Alternaria spp. bilan zararlangandan keyin)56,57 bo'lgan. MLPga o'xshash 423 genining sezilarli darajada pasayishi avokado himoyasi paytida F. niger infeksiyasigacha va olma daraxti Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola va Alternaria alternata infektsiyasi paytida olma patotiplari hisoblanadi58,59. Bundan tashqari, MLPga o'xshash 423 genini haddan tashqari ifodalovchi olma kalluslari qarshilik bilan bog'liq genlarning pastroq ifodasiga ega edi va qo'ziqorin infektsiyasiga ko'proq moyil edi59. Fusarium oxysporum f dan keyin MLPga o'xshash 423 geni ham chidamli keng tarqalgan loviya gerplazmasida bostirildi. cn. Loviya infeksiyasi 60.
Bizning RNK-seq tadqiqotimizda aniqlangan PR-10 oilasining boshqa a'zolari yuqori regulyatsiyaga javoban LlR18A va LlR18B genlari, shuningdek, DIR1 lipid transfer oqsili uchun yuqori regulyatsiyaga uchragan (1 gen) yoki pastga regulyatsiyaga uchragan (3 gen) geni edi. Bundan tashqari, WGCNA ushbu modulda LlR18B genini markaz sifatida ta'kidlaydi, u emlashga juda moyil va bir nechta himoya javob genlarini o'z ichiga oladi. LlR18A va LlR18B genlari patogen bakteriyalarga javoban sariq lupin barglarida, shuningdek, D. toxica emlashdan keyin NLL poyalarida induktsiya qilingan, bu genlarning guruch gomologi RSOsPR10 esa jasmonik kislota signalizatsiya yo'lida ishtirok etgan qo'ziqorin infektsiyasi tomonidan tezda induktsiya qilingan53,61,62. DIR1 geni tizimli orttirilgan qarshilik (SAR) boshlanishi uchun zarur bo'lgan o'ziga xos bo'lmagan lipid transport oqsillarini kodlaydi. Himoya reaksiyalari rivojlanishi bilan DIR1 oqsili infeksiya markazidan floema orqali uzoq organlarda SARni qo'zg'atish uchun tashiladi. Qizig'i shundaki, TanjilG_02313 DIR1 geni birinchi vaqt nuqtasida 84A:476 va 22660 populyatsiyalarida sezilarli darajada induktsiyalangan, ammo antraknozga chidamlilik faqat 84A:476 qatorida muvaffaqiyatli rivojlangan. Bu NLLda DIR1 genining ba'zi subfunksionalizatsiyasini ko'rsatishi mumkin, chunki qolgan uchta gomolog emlashga faqat 83A:476 qatorida 6 ot kuchida javob bergan va bu javob pastga yo'naltirilgan.
Bizning tadqiqotimizda “GO:0055114 Redoks jarayoni” deb nomlangan biologik jarayonga mos keladigan eng keng tarqalgan komponentlar sitoxrom P450 oqsili, peroksidaza, linoleik kislota 9S-/13S-lipoksigenaza va 1-aminotsiklopropan-1-karboksilik kislota oksidazasi edi. Bundan tashqari, bizning WGCNA HSFA4a gomologini Lanr1 qarshilik gen nomzodi TanjilG_05042 kabi modullarni tashuvchi markaz sifatida belgilaydi. HSFA4a o'simliklarda yadro transkripsiyasining oksidlanish-qaytarilishga bog'liq regulyatsiyasining tarkibiy qismidir.
Sitokrom P450 oqsillari ksenobiotiklar, shuningdek, gormonlar, yog 'kislotalari, sterollar, hujayra devori komponentlari, biopolimerlar va himoya birikmalarining biosintezi kabi birlamchi va ikkilamchi metabolizmda NADPH va/yoki O2 ga bog'liq gidroksillanish reaksiyalarini katalizlovchi oksidoreduktazalardir 69. Bizning In tadqiqotimizda o'simlik sitoxromi P450 funktsiyasining o'zgaruvchanligi ko'p sonli o'zgartirilgan gomologlar (37) va ma'lum genlar orasidagi javob shakllaridagi farqlar tufayli -10,6 log2 dan (katlama o'zgarishi) 5,7 gacha kamaydi, bu yuqoriga qarab qayta ko'rib chiqishni aks ettiradi. . Bunday katta oqsil superoilasida NLL genlarining taxminiy biologik funktsiyasini tushuntirish uchun faqat RNK-seq ma'lumotlaridan foydalanish juda spekulyativ bo'lar edi. Biroq, shuni ta'kidlash kerakki, ba'zi sitoxrom P450 genlari patogen zamburug'lar yoki bakteriyalarga qarshilikning ortishi bilan bog'liq, jumladan, allergik reaktsiyalarga hissa qo'shadi69,70,71.
III sinf peroksidazalari o'simliklarning o'sishi va rivojlanishi davomida turli xil metabolik jarayonlarda, shuningdek, sho'rlanish, qurg'oqchilik, yuqori yorug'lik intensivligi va patogenlar hujumi kabi atrof-muhit stresslariga javoban ishtirok etadigan ko'p funksiyali o'simlik fermentlaridir72. Peroksidazalar bir nechta o'simlik turlarining, jumladan, Stylosanthes humilis va C. gloeosporioides, Lens culinaris va C. truncatum, Phaseolus vulgaris va C. lindemuthianum, Cucumis sativus va C. lagenariumning Anthracis bilan o'zaro ta'sirida ishtirok etadi73,74,75,76. Reaksiya juda tez, ba'zan hatto 4 HPI da, qo'ziqorin o'simlik to'qimalariga kirishidan oldin73. Peroksidaza geni D. toxica NLL emlashga ham javob berdi. Oksidlanish portlashini tartibga solish yoki oksidlanish stressini yo'q qilishning odatiy funktsiyalaridan tashqari, peroksidazalar ma'lum birikmalarni lignifikatsiya, subbirlik yoki o'zaro bog'lash paytida hujayra devorini mustahkamlashga asoslangan jismoniy to'siqlar yaratish orqali patogen o'sishiga xalaqit berishi mumkin. Bu funksiyani in silico ga bog'lash mumkin, bu taxminiy lignin hosil qiluvchi anion peroksidazani kodlovchi TanjilG_03329 geniga bog'liq bo'lishi mumkin, bu bizning tadqiqotimizda 6 HPI da 83A:476 chidamli liniyada sezilarli darajada yuqori regulyatsiya qilingan, ammo javob bermagan boshqa shtammlar va vaqt nuqtalarida emas.
Linoleik kislotaning 9S-/13S-lipoksigenazasi lipid biosintezining oksidlanish yo'lidagi birinchi bosqichdir78. Ushbu yo'l mahsulotlari o'simliklarni himoya qilishda ko'p funktsiyalarga ega, jumladan, kalloza va pektin konlarini hosil qilish orqali hujayra devorini mustahkamlash va reaktiv kislorod turlarini ishlab chiqarish orqali oksidlanish stressini boshqarish79,80,81,82,83. Ushbu tadqiqotda linoleik kislota 9S-/13S-lipoksigenaza ekspressiyasi barcha shtammlarda o'zgargan, ammo sezgir 22660 populyatsiyasida turli vaqt nuqtalarida yuqori regulyatsiya ustunlik qilgan, chidamli Lanr1 va AnMan allelini olib yuradigan shtammlarda esa bu genotiplar orasidagi himoya kuydirgi reaksiyalarida oksilipin qatlamining diversifikatsiyasini ta'kidlaydi.
1-aminotsiklopropan-1-karboksilat oksidaza (ACO) gomologi lupin bilan emlanganda sezilarli darajada yuqoriga ko'tarilgan (9 ta gen) yoki pastga ko'tarilgan (2 ta gen). Ikkita istisnodan tashqari, bu javoblarning barchasi 6 ot kuchida 83A:476 da sodir bo'lgan. ACO oqsillari vositachiligidagi fermentativ reaksiya etilen ishlab chiqarishda tezlikni cheklovchi bosqich bo'lib, shuning uchun yuqori darajada tartibga solinadi84. Etilen o'simlik gormoni bo'lib, o'simliklarning rivojlanishini va abiotik va biotik stress sharoitlariga javobini tartibga solishda turli rol o'ynaydi. ACO transkripsiyasini induktsiya qilish va etilen signalizatsiya yo'lini faollashtirish reaktiv kislorod turlari va fitoaleksinlar ishlab chiqarishni tartibga solish orqali guruchning gemibiotrofik qo'ziqorin oryzae oryzae ga chidamliligini oshirishda ishtirok etadi. Ushbu tadqiqotda xabar qilingan 83A:476 liniyasida ACO gomologlarining sezilarli darajada ko'tarilishi fonida M. oryzae va C. lupini88,89 o'rtasida topilgan juda o'xshash barg infektsiyasi jarayoni, NLL antraknoziga qarshilik ko'rsatish imkoniyatini o'zgartiradi. Etilen molekulyar yo'llarda signalizatsiya markaziy bosqichidir.
Ushbu tadqiqotda, fotosintez bilan bog'liq ko'plab genlarning keng ko'lamli bostirilishi 83A:476 da 6 ot kuchida va Mandeloop va 22660 populyatsiyasida 48 ot kuchida kuzatildi. Bu o'zgarishlarning darajasi va rivojlanishi darajaga mutanosibdir. Ushbu tajribada antraknozga chidamlilik kuzatildi. Yaqinda o'simlik-patogen o'zaro ta'sirining bir nechta modellarida, jumladan, patogen bakteriyalar va zamburug'larda fotosintez bilan bog'liq transkriptlarning kuchli va erta bostirilishi haqida xabar berilgan. Shoshqaloqlik (ba'zi o'zaro ta'sirlarda 2 HPI dan) va infeksiyaga javoban fotosintez bilan bog'liq genlarning global bostirilishi reaktiv kislorod turlarining joylashishi va ularning allergik reaktsiyalarni vositachilik qilish uchun salitsil kislotasi yo'li bilan o'zaro ta'siri asosida o'simlik immunitetini qo'zg'atishi mumkin 90,94.
Xulosa qilib aytganda, eng chidamli nasl uchun taklif qilingan himoya javob mexanizmlari (83A:476) R geni (taxminan TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) tomonidan patogenni tez aniqlash va allergik javob vositasida salitsil kislotasi va etilen signalizatsiyasini o'z ichiga oladi, undan keyin uzoq masofali SAR ta'sirini o'rnatish DIR-1 oqsili tomonidan qo'llab-quvvatlanadi. Shuni ta'kidlash kerakki, C. lupini infektsiyasining biotrofik davri juda qisqa (taxminan 2 kun), undan keyin nekrotik o'sish95 kuzatiladi. Bu bosqichlar orasidagi o'tish nekroz va mezbon o'simliklarda yuqori sezuvchanlik reaktsiyalari uchun qo'zg'atuvchi sifatida ishlaydigan etilen bilan induktsiyalanadigan oqsillarning ifodalanishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin. Shuning uchun, C. lupini ni biotrofik bosqichda muvaffaqiyatli ushlash uchun vaqt oralig'i juda tor. 83A:476 da 6 ot kuchida kuzatilgan oksidlanish-qaytarilish va fotosintez bilan bog'liq genlarning qayta dasturlanishi qo'ziqorin gifalarining rivojlanishiga mos keladi va biotrofik bosqichda muvaffaqiyatli himoya javobining rivojlanishini anglatadi. Mandelup va 22660 populyatsiyasining transkriptomik javoblari nekrotik o'sishga o'tishdan oldin qo'ziqorinni ushlash uchun juda kechikishi mumkin, ammo Mandelup 22660 populyatsiyasiga qaraganda samaraliroq bo'lishi mumkin, chunki PR-10 oqsilining nisbatan tez regulyatsiyasi gorizontal qarshilikni kuchaytiradi.
Kanonik R geni tomonidan boshqariladigan ETI, loviyaning antraknozga chidamliligining keng tarqalgan mexanizmi bo'lib ko'rinadi. Shunday qilib, Medicago truncatula model dukkaklisida antraknozga chidamlilik TIR-NBS-LRR97 o'simlik R gen sinfining a'zosi bo'lgan RCT1 geni tomonidan beriladi. Ushbu gen, shuningdek, bedada sezgir o'simliklarga o'tkazilganda keng spektrli antraknozga chidamlilikni beradi. Oddiy loviyada (P. vulgaris) bugungi kunga qadar yigirmatadan ortiq antraknozga chidamlilik genlari aniqlangan. Ushbu genlarning ba'zilari kanonik R genlari bo'lmagan mintaqalarda uchraydi, ammo boshqalari ko'p, jumladan, TIR-NBS-LRRs99, NBS-LRR gen klasterini olib yuradigan xromosomalarning chekkalarida joylashgan. Genom bo'ylab SSR tadqiqoti shuningdek, NBS-LRR genining oddiy loviyadagi antraknozga chidamlilik bilan bog'liqligini tasdiqladi. Kanonik R geni oq lupin 101 da asosiy antraknoz qarshilik lokusini olib yuradigan genom mintaqasida ham topilgan.
Bizning ishimiz shuni ko'rsatadiki, o'simlik infektsiyasining dastlabki bosqichida (afzalroq 12 ot kuchidan kechiktirmasdan) faollashtirilgan tezkor qarshilik reaktsiyasi tor bargli lupinni Collelotrichum lupini patogen qo'ziqorini keltirib chiqaradigan antraknozdan samarali himoya qiladi. Yuqori o'tkazuvchanlik ketma-ketligidan foydalanib, biz Lanr1 va AnMan qarshilik genlari vositachiligida NLL o'simliklarida antraknoz qarshilik genlarining differentsial ekspressiya profillarini namoyish etdik. Muvaffaqiyatli himoya o'simlik patogen bilan birinchi aloqasidan keyin bir necha soat ichida oksidlanish-qaytarilish, fotosintez va patogenezda ishtirok etadigan oqsillar uchun genlarni diqqat bilan loyihalashni o'z ichiga oladi. Shunga o'xshash himoya reaktsiyalari, ammo vaqt o'tishi bilan kechiktirilib, o'simliklarni kasalliklardan himoya qilishda ancha kam samaralidir. Lanr1 geni vositachiligida kuydirgi qarshiligi R genining odatiy tezkor javobiga o'xshaydi (effektor tomonidan qo'zg'atilgan immunitet), AnMan geni esa, ehtimol, gorizontal javobni (mikrob bilan bog'liq molekulyar naqsh tomonidan qo'zg'atilgan immunitet) ta'minlaydi va o'rtacha darajadagi barqarorlikni ta'minlaydi.
Antraknoz markerlarini skrining qilish uchun ishlatiladigan 215 ta NLL liniyalari 74 ta nav, chatishtirish yoki selektsiya yo'li bilan olingan 60 ta liniya, 5 ta mutant va 76 ta yovvoyi yoki asl germplazmalardan iborat edi. Liniyalar 17 ta mamlakatdan, asosan Polsha (58), Ispaniya (47), Germaniya (27), Avstraliya (26), Rossiya (19), Belarus (7), Italiya (5) va boshqa liniyalardan, 10 ta mamlakatdan kelgan. To'plamga shuningdek, referansga chidamli liniyalar ham kiradi: 83A:476, Tanjil, Lanr1 allelini tashuvchi Wonga va AnMan allelini tashuvchi Mandelup. Liniyalar Polshaning Wiatrowo shahridagi Poznań Plant Breeding Ltd. tomonidan yuritiladigan Yevropa Lupin Genetik Resurslari Ma'lumotlar Bazasidan olingan (S1 qo'shimcha jadval).
O'simliklar nazorat ostida sharoitlarda o'stirildi (fotoperiod 16 soat, kunduzi harorat 25°C va kechasi 18°C). Ikki biologik replika tahlil qilindi. Protokolga muvofiq DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germaniya) yordamida uch haftalik barglardan DNK ajratildi. Ajratilgan DNKning sifati va konsentratsiyasi spektrofotometrik usullar bilan baholandi (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AQSh). Antraknozga chidamlilik genini belgilovchi AnManM1 markeri (cv. Mandelup dan olingan) va Lanr1 genini yon tomonga qo'ygan Anseq3 va Anseq4 markerlari (cv. Tanjil dan olingan) 11,26,28 tahlil qilindi. Chidamli allel uchun gomozigotalar “1”, sezgir – “0” va geterozigotalar – 0,5 deb baholandi.
AnManM1, AnSeq3 va AnSeq4 markerlarini skrining qilish natijalari va yakuniy kuzatuv tajribalari uchun urug'larning mavjudligi asosida antraknozga chidamlilik fenotipini aniqlash uchun 50 ta NLL liniyalari tanlab olindi. Tahlil kompyuter tomonidan boshqariladigan issiqxonada ikki nusxada, kunduzi 22°C va kechasi 19°C harorat oralig'ida 14 soatlik fotoperiod bilan o'tkazildi. Urug' qobig'i juda qattiq bo'lgani uchun urug'larning uyqu holatini oldini olish va bir xil unib chiqishini ta'minlash uchun urug'lar ekishdan oldin tirnaladi (embrionning qarama-qarshi tomonidagi urug' qobig'i o'tkir pichoq bilan kesiladi). O'simliklar steril tuproqli (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varshava, Polsha) idishlarda (11 × 11 × 21 sm) o'stirildi. Emlash 1999-yilda Buyuk Polshaning Verjenitsa shahridagi dala sharoitida (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E) yetishtirilgan tor bargli lupin o'simliklarining poyalaridan yetishtirilgan Colletotrichum lupini Col-08 shtammi bilan amalga oshirildi. Maydonni oling. Izolyatlar sporulyatsiyani qo'zg'atish uchun 21 kun davomida qora yorug'lik ostida 20°C haroratda SNA muhitida yetishtirildi. Ekilgandan to'rt hafta o'tgach, o'simliklar 4-6 barg bosqichiga yetganida, emlash ml ga 0,5 x 106 konidiya konsentratsiyasida konidiya suspenziyasi bilan purkash orqali amalga oshirildi. Emlashdan so'ng, o'simliklar konidiyalarning unib chiqishi va infektsiya jarayonini osonlashtirish uchun 24 soat davomida taxminan 98% namlik va 25°C haroratda qorong'i joyda saqlandi. Keyin o'simliklar 14 soatlik fotoperiod sharoitida kunduzi 22°C/kechasi 19°C va 70% namlikda o'stirildi. Kasallik balli emlashdan 22 kun o'tgach aniqlandi va poyalar va barglarda nekrotik lezyonlarning mavjudligi yoki yo'qligiga qarab 0 (immunitet) dan 9 gacha (juda sezgir) o'zgarib turdi. Bundan tashqari, ballar aniqlangandan so'ng, o'simliklarning vazni o'lchandi. Marker genotiplari va kasallik fenotiplari o'rtasidagi munosabatlar nuqta ikki ketma-ketlik korrelyatsiyalari sifatida hisoblandi (antraknoz qarshiligi fenotipini tahlil qilish uchun chiziqlar to'plamida heterozigota markerlarning yo'qligi).