Dankon pro via vizito al Nature.com. La retumilversio, kiun vi uzas, havas limigitan subtenon por CSS. Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu la Kongruecan Reĝimon en Internet Explorer). Dume, por certigi daŭran subtenon, ni prezentos la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) estas legumena planto uzata por nutraĵproduktado kaj grundplibonigo. La tutmonda ekspansio de NLL kiel kultivaĵo altiris multajn patogenajn fungojn, inkluzive de lupina antraknozo, kiu kaŭzas la detruan antraknozan malsanon. Du aleloj, Lanr1 kaj AnMan, kiuj donas pliigitan reziston, estis uzitaj en NLL-bredado, sed la subestaj molekulaj mekanismoj restas nekonataj. En ĉi tiu studo, la markiloj Lanr1 kaj AnMan estis uzitaj por ekzameni eŭropajn NLL-specimenojn. Testado de la vakcino en kontrolita medio konfirmis la efikecon de ambaŭ rezistemaj donantoj. Diferenca genekspresio-profilado estis farita sur reprezentaj rezistemaj kaj sentemaj linioj. Antraknozo-rezisto estis asociita kun troesprimo de la genaj ontologiaj terminoj "GO:0006952 Defenda Respondo", "GO:0055114 Redoks-Procezo", kaj "GO:0015979 Fotosintezo". Krome, la linio Lanr1(83A:476) montris signifan transkriptoman reprogramadon rapide post inokulado, dum la aliaj linioj montris prokraston en ĉi tiu respondo je ĉirkaŭ 42 horoj. Defendaj respondoj estas asociitaj kun la genoj TIR-NBS, CC-NBS-LRR kaj NBS-LRR, 10 proteinoj implikitaj en patogenezo, lipidaj translokigaj proteinoj, endoglukano-1,3-β-glukozidazo, glicin-riĉaj ĉelmuraj proteinoj, kaj genoj de la reaktiva vojo de oksigeno. Fruaj respondoj al 83A:476, inkluzive de zorgema subpremado de genoj asociitaj kun fotosintezo, koincidis kun sukcesa protekto dum la vegetativa kreskofazo de funga biologio, sugestante ke efektoro ekigas imunecon. La Mandeloop-reakcio estas malrapidigita, same kiel la ĝenerala horizontala treniĝo.
La mallarĝfolia lupino (NLL, Lupinus angustifolius L.) estas altproteina cerealo originanta de la okcidenta mediteranea regiono1,2. Ĝi nuntempe kultiviĝas kiel nutraĵkultivaĵo por bestoj kaj homoj. Ĝi ankaŭ estas konsiderata verda sterko en kultivrotaciaj sistemoj pro nitrogena fiksado fare de simbiozaj nitrogenfiksantaj bakterioj kaj ĝenerala plibonigo de grundstrukturo. NLL spertis rapidan procezon de malsovaĝigo en la lasta jarcento kaj ankoraŭ estas sub alta breda premo3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Kun la ĝeneraligita kultivado de NLL, la sinsekvo de patogenaj fungoj evoluigis novajn agrikulturajn niĉojn kaj kaŭzis novajn kultivaĵo-detruajn malsanojn. La plej rimarkinda por lupenkultivistoj kaj bredistoj estis la apero de antraknozo, kaŭzita de la patogena fungo, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. La plej rimarkinda por lupenkultivistoj kaj bredistoj estis la apero de antraknozo, kaŭzita de la patogena fungo, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракнозав, патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Plej rimarkinda por lupinkultivistoj kaj bredistoj estis la apero de antraknozo kaŭzita de la patogena fungo Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是现，它是现它是由眗腟真 者目的是炭目的是炭疽病的出现Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是现它是玟眗Colletohum (Bondar)嵵Haired。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракнозозакнозозонеров патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Plej frapa por lupinkultivistoj kaj bredistoj estas la apero de antraknozo kaŭzita de la patogena fungo Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.La plej fruaj raportoj pri la malsano venis el Brazilo kaj Usono, kun tipaj simptomoj aperantaj respektive en 1912 kaj 1929. Tamen, post ĉirkaŭ 30 jaroj, la patogeno estis nomita Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorfo Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfo Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Ŝtonisto) Spauld. & Sacc., teleomorfo de Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Ŝtonisto) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Ŝtonisto) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Ŝtonisto) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld en Celita Morfologio. & H. Schrenk,. & H. Schrenk,.kaj H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。kaj H. Schlenk,.Prepara malsanfenotipa analizo farita meze de la 20-a jarcento montris iom da rezisto en NLL kaj flava lupino (L. luteus L.) variaĵoj, sed ĉiuj testitaj blanka lupino (L. albus L.) variaĵoj estis tre sentemaj15,16. Studoj montris, ke la evoluo de antraknozo estas asociita kun pliigita precipitaĵo (aerhumideco) kaj temperaturo (en la intervalo de 12-28 °C), kondukante al malobservo de rezisto je pli altaj temperaturoj17, 18. Fakte, la tempo bezonata por ke konidioj ĝermu kaj la malsano komenciĝu estis kvar fojojn pli mallonga je 24 °C (4 horoj) ol je 12 °C (16 horoj) sub altaj humidecaj kondiĉoj19. Tiel, la daŭranta tutmonda varmiĝo kaŭzis la disvastiĝon de antraknozo. Tamen, la malsano estis observita en Francio (1982) kaj Ukrainio (1983) kiel antaŭsigno de urĝa minaco, sed ŝajne estis ignorita de la lupinindustrio tiutempe20,21. Kelkajn jarojn poste, ĉi tiu detruiga malsano disvastiĝis tra la mondo kaj ankaŭ influis gravajn lupin-produktantajn landojn kiel Aŭstralio, Pollando kaj Germanio22,23,24. Post epidemio de antraknozo meze de la 1990-aj jaroj, ampleksa ekzamenado rezultigis la identigon de pluraj rezistemaj donantoj en NLL19-specimenoj. NLL-rezisto al antraknozo estas kontrolita per du apartaj dominaj aleloj trovitaj en malsamaj ĝermo-plasmaj fontoj: Lanr1 en kulturvario Tanjil kaj Wonga kaj AnMan en kulturvario Mandalay 25, 26. Ĉi tiuj aleloj kompletigas la molekulajn markilojn, kiuj subtenas la selektadon de rezistema ĝermo-plasmo en bredaj programoj25,26,27,28,29,30. La rezistema bredlinio 83A:476 portanta la alelon Lanr1 estis krucita kun la sentema sovaĝa linio P27255 por akiri RIL-populacion apartigantan por antraknozorezisto, kio ebligis asigni la Lanr1-lokuson al kromosomo NLL-1131, 32, 33. Alĝustigo de liglokoj de flankaj rezistaj lokusoj al antraknozo per genomika kadro, NLL rivelis la lokon de ĉiuj tri aleloj sur la sama kromosomo (NLL-11), sed en malsamaj pozicioj29,34,35. Tamen, pro la malgranda nombro da RIL-oj kaj la granda genetika distanco inter markiloj kaj respondaj aleloj, neniuj fidindaj konkludoj povas esti faritaj pri iliaj subestaj genoj. Aliflanke, la uzo de inversa genetiko en lupenoj estas malfacila pro ilia tre malalta regenerada potencialo, kio igas genetikan manipuladon maloportuna37.
La disvolviĝo de malsovaĝigita ĝermo-plasmo portanta la deziratan alelon en la homozygota stato, kiel ekzemple 83A:476 (Lanr1) kaj Mandelup (AnMan), malfermis la pordon al studado de antraknozo-rezisto fronte al la ĉeesto de kontraŭaj kombinaĵoj de aleloj en sovaĝaj populacioj. Eblecoj de molekulaj mekanismoj. Komparu defendrespondojn generitajn de specifaj genotipoj. Ĉi tiu studo taksis la fruan transkriptoman respondon de NLL al vakcinado kontraŭ C. lupini. Unue, eŭropa NLL-ĝermo-plasma panelo enhavanta 215 liniojn estis ekzamenita uzante molekulajn markilojn, kiuj markas la Lanr1- kaj AnMan-alelojn. Antraknoza fenotipado estis poste farita sur 50 NLL-linioj, antaŭe selektitaj por molekulaj markiloj, sub kontrolitaj kondiĉoj. Surbaze de ĉi tiuj eksperimentoj, kvar linioj malsamaj laŭ antraknozo-rezisto kaj Lanr1/AnMan-alela konsisto estis selektitaj por diferenciga defenda genekspresio-profilado uzante du komplementajn alirojn: alt-traira RNA-sekvencado kaj realtempa PCR-kvantigado.
Rastrumo de aro de NLL-ĝermo-plasmo (N = 215) kun markiloj Lanr1 (Anseq3 kaj Anseq4) kaj AnMan (Anseq4) kaj AnMan (AnManM1) montris, ke nur unu linio (95726, proksime de Salamanca-b) plifortigas la "rezistan" alelon por ĉiuj markiloj, dum "Ĉeesto de 'sentemaj' aleloj" trovis la proporcion de ĉiuj markiloj en 158 (~73.5%) linioj. Dek tri linioj produktis du "rezistajn" alelojn de la markilo Lanr1, kaj 8 linioj produktis "rezistajn" alelojn de la markilo Lanr1. La "rezista" alelo de la markilo AnMan (Aldona Tabelo S1). Du linioj estis heterozygotaj por la markilo Anseq3 kaj unu heterozygota por la markilo AnManM1. 42 linioj (19.5%) portis kontraŭajn fazojn de la aleloj Anseq3 kaj Anseq4, indikante altan oftecon de rekombinado inter ĉi tiuj du lokusoj. Antraknozaj fenotipoj sub kontrolitaj kondiĉoj (Aldona Tabelo S2) montris ŝanĝiĝemon en la rezisto de la testitaj genotipoj, kio reflektiĝis en la severeco de antraknozo. Diferencoj en mezaj poentaroj variis de 1.8 (modere rezistema) ĝis 6.9 (sentema) kaj diferencoj en la pezo de plantoj variis de 0.62 (sentema) ĝis 4.45 g (rezistema). Estis signifa korelacio inter la valoroj observitaj en du ripetoj de la eksperimento (0,51 por malsanseverec-poentaroj, P = 0,00017 kaj 0,61 por plantpezo, P < 0,0001) kaj ankaŭ inter ĉi tiuj du parametroj (− 0,59 kaj − 0,77, P < 0,0001). Estis signifa korelacio inter la valoroj observitaj en du ripetoj de la eksperimento (0,51 por malsanaj severecpoentaroj, P = 0,00017 kaj 0,61 por plantpezo, P < 0,0001) kaj ankaŭ inter ĉi tiuj du parametroj (− 0,59 kaj − 0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция э0,слента э0 баллов тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между между эвтимимтрамд (-0,59 kaj -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Signifa korelacio estis trovita inter la valoroj observitaj en du ripetoj de la eksperimento (0,51 por malsansevereco-poentaroj, P = 0,00017 kaj 0,61 por plantpezo, P < 0,0001), kaj ankaŭ inter ĉi tiuj du parametroj (-0,59 kaj -0,77, P < 0,0001) 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分1︺0.P. 0.00017，植物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77。001)在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 诸为庈 诸分为 0.51 ， p = 0.00017 ， 植物 为 为 0.61 ， p <0.0001） 以及 两 个 参数 之（ （ 0.0001） 参数 之（ （ 9.–5. 0,59 和– 0,59 和– 0,59 和- 0.77，P <0.0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух постенкан ( тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 kaj масса растения 0,61, P <0,0001), kaj между этими двутими пара9ми (-0,5рами —0,0001) 0,77, P <0,0001. Estis signifa korelacio inter la valoroj observitaj duoble (malsangraveco-poentaro 0,51, P = 0,00017 kaj plantpezo 0,61, P < 0,0001) kaj inter ĉi tiuj du parametroj (-0,59 kaj -0,0001) 0,77, P<0,0001. ).Tipaj simptomoj vidataj en sentemaj plantoj inkluzivas kurbiĝon kaj tordiĝon de la tigo simila al strukturo de "paŝtista arko", sekvataj de ovalaj lezoj kun oranĝkoloraj/rozkoloraj sporozoitoj (Aldona Figuro 1). Aŭstraliaj aliroj portantaj la genojn Lanr1 (83A:476 kaj Tanjil) kaj AnMan (Mandelup) estas modere rezistemaj, 0.0331 kaj 0.0036). Kelkaj linioj, kiuj ankaŭ portas "rezistemajn" alelojn Lanr1 kaj/aŭ AnMan, montras simptomojn de la malsano.
Interese, kelkaj NLL-linioj malhavantaj iun ajn "rezistan" markilan alelon rivelis altan nivelon de antraknozorezisto (komparebla aŭ pli alta ol por Lanr1- aŭ AnMan-genotipoj), kiel ekzemple Boregine (P-valoro < 0.0001 por ambaŭ parametroj), Bojar (P-valoro < 0.0001 por poentaro kaj 0.001 por plantpezo) kaj Loĝantaro B-549/79b (P-valoro < 0.0001 por poentaro kaj nesignifa por pezo). Interese, kelkaj NLL-linioj malhavantaj iun ajn "rezistan" markilan alelon rivelis altan nivelon de antraknozorezisto (komparebla aŭ pli alta ol por Lanr1- aŭ AnMan-genotipoj), kiel ekzemple Boregine (P-valoro < 0.0001 por ambaŭ parametroj), Bojar (P-valoro < 0.0001 por poentaro kaj 0.001 por plantpezo) kaj Loĝantaro B-549/79b (P-valoro < 0.0001 por poentaro kaj nesignifa por pezo). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллокавы золекавы уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 илаи An BoManхь илаи высокий) (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Interese, pluraj NLL-linioj malhavantaj iun ajn "rezistan" markilan alelon montris altan nivelon de rezisto al antraknozo (komparebla al aŭ pli alta ol por Lanr1- aŭ AnMan-genotipoj), kiel ekzemple Boregine (P-valoro < 0.0001 por ambaŭ parametroj), Bojar (P-valoro < 0.0001 por taksado kaj 0.001 por plantpezo) kaj populacio B-549/79b (P-valoro < 0.0001 por taksado kaj ne signifa por pezo).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭水平的炭疽性的炭等位基因的NLL或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重显睂怍量睂 Estas interese, ke iuj NLL-sistemoj, kiuj ne havas iujn ajn "antigenajn" markilojn, montras altan horizontalan reziston (ekvivalentan al Lanr1- aŭ AnMan-genoj aŭ pli altan), kiel ekzemple Boregine (ambaŭ parametroj P < 0,0001), Bojar (P-valoro < 0,0001, plantpezo 0,001) kaj la trostreĉiĝo B-549/79b (P-valoro < 0,0001, pezo ne signifa). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентноста», спокикава уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие каник Boregine выше обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) kaj популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Interese, kelkaj NLL-linioj malhavantaj iujn ajn "rezistajn" markilajn alelojn montris altajn nivelojn de antraknozorezisto (komparebla al aŭ pli alta ol Lanr1- aŭ AnMan-genotipoj), kiel ekzemple Boregine (P-valoro por ambaŭ parametroj <0.0001), Bojar (P-valoro < 0.0001, plantpezo 0.001) kaj populacio B-549/79b (P-valoro < 0.0001, pezo ne signifa).Ĉi tiu fenomeno sugestas la eblecon de nova genetika fonto de rezisto, klarigante la observitan mankon de korelacio inter markilaj genotipoj kaj malsanfenotipoj (P-valoroj de ~0.42 ĝis ~0.98). Tiel, la testo de Kolmogorov-Smirnov montris, ke la datumoj pri rezisto al antraknozo estis proksimume normale distribuitaj por poentaroj (P-valoroj 0.25 kaj 0.11) kaj plantmaso (P-valoroj 0.47 kaj 0.55), sugestante, ke mi hipotezas, ke pli da aleloj ol Lanr1 kaj AnMan estas implikitaj.
Surbaze de la rezultoj de la ekzameno pri rezisto al antraknozo, 4 linioj estis elektitaj por transkriptoma analizo: 83A:476, Boregine, Mandelup, kaj Loĝantaro 22660. Ĉi tiuj linioj estis retestitaj pri rezisto al antrakso en inokuladaj eksperimentoj per RNA-sekvencado, kondiĉe ke ili estis la samaj kiel en la antaŭa testo. La poentarvaloroj estis jenaj: Boregine (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) kaj loĝantaro 22660 (6,11 ± 1,29).
La protokolo Illumina NovaSeq 6000 atingis averaĝe 40.5 M-lego-parojn por specimeno (29.7 ĝis 54.4 M-legoj) (Aldona Tabelo S3). La vicig-poentaroj en la referenca sekvenco variis de 75.5% ĝis 88.6%. La averaĝa korelacio de legkalkulaj datumoj inter eksperimentaj variaĵoj inter biologiaj ripetoj variis de 0.812 ĝis 0.997 (meznombro 0.959). El la 35 170 analizitaj genoj, 2917 montris neniun esprimon, kaj la aliaj 4785 genoj estis esprimitaj je nekonsiderinda nivelo (baza meznombro < 5). El la 35 170 analizitaj genoj, 2917 montris neniun esprimon, kaj la aliaj 4785 genoj estis esprimitaj je nekonsiderinda nivelo (baza meznombro < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов геслсиньров экспрессии незначительном уровне (базовое среднее <5). El la 35 170 analizitaj genoj, 2917 montris neniun esprimon, kaj la ceteraj 4785 genoj estis esprimitaj je nekonsiderinda nivelo (baza meznombro <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35,170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 геннов имелисуч имелись экспрессию (базовое среднее значение <5). El la 35 170 analizitaj genoj, 2917 ne estis esprimitaj kaj la ceteraj 4785 genoj havis nekonsiderindan esprimon (baza meznombro <5).Tiel, la nombro da genoj konsiderataj esprimitaj (baza meznombro ≥ 5) dum la eksperimento estis 27 468 (78,1%) (Aldona Tabelo S4).
Ekde la unua tempopunkto, ĉiuj NLL-linioj respondis al la inokulado de C. lupini (bakteriostreĉo Col-08) per reprogramado de la transkriptomo (Tabelo 1), tamen signifaj diferencoj estis observitaj inter la linioj. Tiel, la rezista linio 83A:476 (portanta la genon Lanr1) montris signifan transkriptoman reprogramadon ĉe la unua tempopunkto (6 hpi) kun 31-69-obla pliiĝo en la nombro de izolitaj supren- kaj malsupren-genoj kompare kun aliaj tempopunktoj ĉe ĉi tiu tempopunkto. Krome, ĉi tiu pinto estis mallongdaŭra, ĉar la esprimo de nur kelkaj genoj restis signife ŝanĝita ĉe la dua tempopunkto (12 hpi). Interese, Boregine, kiu ankaŭ montris altan nivelon de rezisto en la transplanta testo, ne spertis tian masivan transkrician reprogramadon dum la eksperimento. Tamen, la nombro de diference esprimitaj genoj (DEG) estis la sama por Boregine kaj 83A:476 je 12 HPI. Kaj Mandelup kaj populacio 22660 montris DEG-pintojn je la lasta tempopunkto (48 l/s), indikante relativan prokraston en defendrespondoj.
Ĉar 83A:476 spertis amasan transkriptoman reprogramadon reage al C. lupini je 6 HPI kompare kun ĉiuj aliaj linioj, ~91% de la DEG-oj observitaj je ĉi tiu tempo estis genlini-specifaj (Fig. 1). Tamen, ekzistis iu interkovro en fruaj respondoj inter studlinioj, ĉar 68.5%, 50.9% kaj 52.6% DEG en Boregine, Mandelup kaj populacio 22660, respektive, interkovris kun tiuj trovitaj en 83A:476 en certaj tempopunktoj. Tamen, ĉi tiuj DEG-oj konsistigis nur malgrandan frakcion (0.97–1.70%) de ĉiuj DEG-oj nuntempe detektitaj uzante 83A:476. Krome, 11 DEG-oj (Degrees Genes) el ĉiuj linioj estis koheraj tiutempe (Aldonaj Tabeloj S4-S6), inkluzive de komunaj komponantoj de plantaj defendrespondoj: lipida transiga proteino (TanjilG_32225), endoglukano-1,3-β-glukozida enzimo (TanjilG_23384), du streso-indukteblaj proteinoj kiel SAM22 (TanjilG_31528 kaj TanjilG_31531), baza lateksa proteino (TanjilG_32352), kaj du glicin-riĉaj strukturaj ĉelmuraj proteinoj (TanjilG_19701 kaj TanjilG_19702). Ankaŭ estis relative alta interkovro en transkriptomaj respondoj inter 83A:476 kaj Boregine je 24 HPI (entute 16-38% DEG) kaj inter Mandelup kaj Populacio 22660 je 48 HPI (entute 14-20% DEG).
Venn-diagramo montranta la nombron de diference esprimitaj genoj (DEG) en mallarĝfoliaj lupinlinioj (NLL) inokulitaj per Colletotrichum lupini (bakterio Col-08 akirita el lupinkampoj en Wierzhenice, Pollando, 1999). La analizitaj NLL-linioj estis: 83A:476 (rezistema, portanta la alelon Lanr1), Boregine (rezistema, genetika fono nekonata), Mandelup (modere rezistema, portanta la alelon AnMan) kaj populacio 22660 (tre sentema). La mallongigo hpi signifas horojn post vakcinado. Nulvaloroj estis forigitaj por simpligi la grafikaĵon.
La aro de troesprimitaj genoj je 6 hpi estis analizita por la ĉeesto de kanonaj R-genaj domajnoj (Aldona Tabelo S7). Ĉi tiu studo rivelis transkriptoman indukton de klasikaj malsanrezistemaj genoj kun NBS-LRR-domajnoj nur je 83A:476. Ĉi tiu aro konsistis el unu TIR-NBS-LRR-geno (tanjilg_05042), kvin CC-NBS-LRR-genoj (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, kaj tanjilg_16162), kaj kvar NBS-LR, Tanjilg_16162), kaj kvar NBS-LRRE (tanjilg_16162) same kiel kvar NBS-Lrr (tanjilg_16162) kaj kvar NBS-LRR (TANJILG_16162). Ĉiuj ĉi tiuj genoj havas kanonikajn domajnojn aranĝitajn en konservitaj sekvencoj. Aldone al la NBS-LRR domajnaj genoj, pluraj RLL-kinazoj estis aktivigitaj je 6 hpi, nome unu en Boregine (TanjilG_19877), du en Mandelup (TanjilG_07141 kaj TanjilG_19877) kaj en populacio 22660 (TanjilG_09014 kaj TanjilG_10361) kaj du en 83A 27:476.
Genoj kun signife ŝanĝita esprimo en respondo al inokulado kun C. lupini (trostreĉiĝo Col-08) estis submetitaj al Gene Ontology (GO) riĉiga analizo (Aldona Tabelo S8). La plej ofte troreprezentita termino pri biologiaj procezoj estis "GO:0006952 defendrespondo", kiu aperis en 6 el 16 (tempo × linio) kombinaĵoj kun alta signifo (P-valoro < 0,001) (Fig. 2). La plej ofte troreprezentita termino pri biologiaj procezoj estis "GO:0006952 defendrespondo", kiu aperis en 6 el 16 (tempo × linio) kombinaĵoj kun alta signifo (P-valoro < 0,001) (Fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952» который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P) (значение P) (0,истью). La plej ofte troreprezentita termino pri biologiaj procezoj estis 'GO:0006952 defendrespondo', kiu aperis en 6 el 16 (tempo × genlinio) kombinaĵoj kun alta signifo (P-valoro < 0,001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 La plej reprezenta termino por biologia procezo estas "GO:0006952 defendrespondo", kiu aperas en 6 el la 16 (时间×线) kombinaĵoj, kun alta signifo (P-valoro < 0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 00069552 Defense» появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис.2). La plej ofte troreprezentita termino pri biologiaj procezoj estis 'GO:0006952 Defenda Respondo', kiu aperis en 6 el 16 kombinaĵoj (tempo × linio) kun alta signifo (P-valoro < 0,001) (Fig. 2).Ĉi tiu termino estis troreprezentita je du tempopunktoj en 83A: 476 kaj Boregine (6 kaj 24 hpi) kaj je unu tempopunkto en Mandelup kaj Loĝantaro 22660 (12 kaj 6 hpi, respektive). Ĉi tio estas atendata rezulto, kiu elstarigas la kontraŭfungan respondon de la rezistemaj linioj. Krome, 83A:476 respondis al C. lupini per rapida induktado de genoj rilataj al la oksidativa eksplodo reprezentita per la termino "GO:0055114 redoksa procezo", indikante specifan defendrespondon, dum Boregine rivelis specifajn defendrespondojn, rilatajn al la termino 'GO'. :0006950 Stresa respondo”. Loĝantaro 22660 aktivigis la horizontalan rezistan respondon implikante sekundarajn metabolitojn, elstarigante la troan nombron da terminoj “GO:0016104 Proceso de triterpena biosintezo” kaj “GO:0006722 Proceso de triterpena metabolo” (ambaŭ terminoj apartenas al la sama aro de genoj), konsiderante la rezultojn de la GO-termina riĉiga analizo, la stabileco de la Mandelup-reakcio estis inter Boregine kaj Loĝantaro 22660. Krome, frua reakcio 83A:476 (6 hpi) kaj malfrua reakcio Mandelup kaj Loĝantaro 22660 inkluzivas la terminon GO:0015979 'fotosintezo' kaj aliajn rilatajn biologiajn procezojn.
La terminoj de la ontologio de bioprocesaj genoj elektitaj en la priskribo de diference esprimitaj genoj dum transkriptomaj respondoj de mallarĝfolia lupino (NLL) inokulita per antraksa lupino (Col-08-bakterio akirita el lupenkampoj en Wierzhenice, Pollando, en 1999) estas tre troigitaj. La analizitaj NLL-linioj estis: 83A:476 (rezistema, portanta la homozygotan Lanr1-alelon), Boregine (rezistema, nekonata genetika fono), Mandelup (modere rezistema, portanta la homozygotan AnMan-alelon) kaj populacio 22660 (sentema).
Ĉar ĉi tiu studo celis identigi genojn, kiuj kontribuas al rezisto al antraknozo, la genoj asignitaj al la terminoj GO "GO: 0006952 Defensive responses" kaj "GO: 0055114 Redox processes" estis analizitaj kun limoj, ĉar bazaj mezumoj estis ≥ 30 kun almenaŭ unu linio × tempopunkto, kombinante statistike signifajn valorojn de log2 (faldŝanĝo). La nombro de genoj plenumantaj ĉi tiujn kriteriojn estis 65 por GO:0006952 kaj 524 por GO:0055114.
83A:476 rivelis du DEG-pintojn prinotitajn per la termino GO:0006952, la unua je 6 genoj po colo (64 genoj, suprena kaj malsuprena reguligo) kaj la dua je 24 genoj po colo (15 genoj, nur suprena reguligo). Boregine ankaŭ montris, ke GO:0006952 pintis je la sama tempopunkto, sed kun malpli da DEG (11 kaj 8) kaj prefera aktivigo. Mandeloop montris du pintojn de GO:0006952 je 12 kaj 48 HPI, ambaŭ portante 12 genojn (la unua kun aktivigaj genoj, kaj la dua kun nur subpremaj genoj), dum la populacio 22660 je 6 HPI (13 genoj) havis pli grandan superregon de la pliiĝa pinto-reguligo. Notindas, ke 96.4% de GO:0006952 DEG en ĉi tiuj pintoj havis la saman tipon de respondo (suprena aŭ malsuprena), indikante signifan interkovron en defendaj respondoj malgraŭ diferencoj en la nombro da implikitaj genoj. La plej granda grupo de sekvencoj rilataj al la termino GO:0006952 ĉifras la Malsato-Streso-Asociitan Mesaĝo-Proteinon 22 (SAM22-similan), kiu apartenas al la proteinklado de klaso 10 patogenez-asociita proteino (PR-10) kaj la kerna proteino lateks-simila (MLP-simila) proteino (Fig. 3). La du grupoj diferencis laŭ la naturo de esprimo kaj la direkto de la respondo. La genoj kodantaj SAM22-similajn proteinojn montris konstantan kaj signifan indukton je fruaj tempopunktoj (6 aŭ 12 hpi) kaj ĝenerale ne respondis ĉe la fino de la eksperimento (48 hpi), dum MLP-similaj proteinoj montris kunordigon je 6 hpi. Kun 83A:476 kaj Mandelup je 48 hp/in, preskaŭ ĉiuj aliaj datenpunktoj ne respondis. Krome, diferencoj en esprimaj profiloj de SAM22-similaj proteingenoj sekvis la observitan ŝanĝiĝemon en antraknozo-rezisto, ĉar pli rezistemaj linioj havis pli da tempopunktoj signife induktante ĉi tiujn genojn ol pli sentemaj genoj. Alia LlR18A/B-simila PR-10-geno montris tre similan esprimpadronon al la SAM22-simila proteingeno.
La ĉefaj komponantoj de la biologia proceztermino "GO:0006952 Defenda Respondo" kaj la esprimaj ŝablonoj de kandidatgenoj de la aleloj Lanr1 kaj AnMan estis identigitaj. La Log2-skalo reprezentas log2-valorojn (faldŝanĝon) inter inokulitaj (Colletotrichum lupini, trostreĉiĝo Col-08, akirita el lupenkampoj, Wizhenica, Pollando, 1999) kaj kontrolaj (ŝajninokulitaj) plantoj en la sama tempopunkto. La jenaj mallarĝfoliaj lupinlinioj estis analizitaj: 83A:476 (rezistema, portanta la homozygotan Lanr1-alelon), Boregine (rezistema, genetika fono nekonata), Mandelup (modere rezistema, portanta la homozygotan AnMan-alelon), kaj Loĝantaro 22660 (sentema).
Krome, la esprimaj profiloj de RNA-seq kandidatgenoj Lanr1 (TanjilG_05042) kaj AnMan (TanjilG_12861) estis taksitaj (Fig. 3). La geno TanjilG_05042 montris signifan respondon (aktivigon) ĉe 83A:476 nur ĉe la unua tempopunkto (6 hpi), dum TanjilG_12861 estis signifa en Mandeloop nur ĉe du tempopunktoj: 6 hpi (malsuprenreguligo) kaj 24 hpi (6 hpi). Kun.). alĝustigebla)).
La plej troesprimitaj genoj en la termino GO:0055114 "redoksa procezo" estis genoj kodantaj citokromo P450-proteinojn kaj peroksidazon (Fig. 4). Por specimenoj izolitaj de 83A:476 je 6 HPI, maksimumaj aŭ minimumaj log2 (faldŝanĝo) valoroj (por 86.6% de la genoj) estis ĝenerale observitaj inter inokulitaj kaj kontrolplantoj, elstarigante la altan respondon de ĉi tiu genotipo al la inokulanta sekso. 83A:476 montris la plej signifan GO:0055114 DEG je 6 hpi (503 genoj), dum la ceteraj linioj je 48 hpi (Boregine, 31 genoj; Mandelup, 85 genoj; kaj Population 22660, 78 genoj)). En la plej multaj genoj de la GO:0055114-familio, du specoj de respondoj al vakcinado (aktivigo kaj inhibicio) estis observitaj. Interese, ĝis 97.6% de la DEG-oj identigitaj por la termino GO: 0055114 en Mandelupe je 48 ĉp. Ĉi tiuj observoj sugestas, ke malgraŭ la signife pli malgranda skalo (t.e., la nombro da mutaciitaj redoksaj genoj, 85 kontraŭ 503), la ŝablono de malfruaj transkriptomaj respondoj de mandelupo al antraknozo similas al la frua respondo de 83A:476. En Boregine kaj Populacio 22660, ĉi tiu konverĝo estas pli malalta je 51.6% kaj 75.6%, respektive.
La esprimo-ŝablonoj de la ĉefaj komponantoj de la termino de la biologia procezo "GO:0055114 Redox-procezo" estis rivelitaj. La Log2-skalo reprezentas log2-valorojn (faldŝanĝon) inter inokulitaj (Colletotrichum lupini, trostreĉiĝo Col-08, akirita el lupenkampoj, Wizhenica, Pollando, 1999) kaj kontrolaj (ŝajninokulitaj) plantoj en la sama tempo. La jenaj mallarĝfoliaj lupenlinioj estis analizitaj: 83A:476 (rezistema, portanta la homozygotan Lanr1-alelon), Boregine (rezistema, genetika fono nekonata), Mandelup (modere rezistema, portanta la homozygotan AnMan-alelon), kaj Loĝantaro 22660 (sentema).
83A:476 Transkriptomaj respondoj al inokulado kun C. lupini (trostreĉo Col-08) ankaŭ inkluzivis kunordigitan silentigon de genoj atribuitaj al la termino GO:0015979 "fotosintezo" kaj aliaj rilataj biologiaj procezoj (FIG. 5). Ĉi tiu GO:0015979 DEG-aro enhavis 105 genojn, kiuj estis signife subpremitaj je 6 hpi ĉe 83A:476. En ĉi tiu subaro, 37 genoj ankaŭ estis malsuprenreguligitaj en Mandelup je 48 HPI kaj 35 samtempe en la 22660-populacio, inkluzive de 19 DEG-oj komunaj al ambaŭ genotipoj. Neniuj DEG-oj rilataj al la termino GO:0015979 estis signife aktivigitaj en iu ajn kombinaĵo (linio x tempo).
La esprimo-ŝablonoj de la ĉefaj komponantoj de la termino de la biologia procezo "GO:0015979 Fotosintezo" estis rivelitaj. La Log2-skalo reprezentas log2-valorojn (faldŝanĝon) inter inokulitaj (Colletotrichum lupini, trostreĉiĝo Col-08, akirita el lupenkampoj, Wizhenica, Pollando, 1999) kaj kontrolaj (ŝajninokulitaj) plantoj en la sama tempo. La jenaj mallarĝfoliaj lupinlinioj estis analizitaj: 83A:476 (rezistema, portanta la homozygotan Lanr1-alelon), Boregine (rezistema, genetika fono nekonata), Mandelup (modere rezistema, portanta la homozygotan AnMan-alelon), kaj Loĝantaro 22660 (sentema).
Surbaze de la rezultoj de analizo de diferenciga esprimo kaj supozeble implikitaj en defendaj respondoj kontraŭ patogenaj fungoj, ĉi tiu aro de sep genoj estis elektita por kvantigo de esprimprofiloj per realtempa PCR (Aldona Tabelo S9).
La supozebla proteina geno TanjilG_10657 estis signife induktita en ĉiuj studitaj linioj kaj tempopunktoj kompare kun kontrolaj (imitistaj) plantoj (Aldonaj Tabeloj S10, S11). Krome, la esprima profilo de TanjilG_10657 montris kreskantan tendencon dum la eksperimento por ĉiuj linioj. La populacio 22660 montris la plej altan sentemon de TanjilG_10657 al inokulado kun 114-obla aktivigo kaj la plej alta relativa esprima nivelo (4.4 ± 0.4) je 24 HPI (Fig. 6a). La PR10 LlR18A proteina geno TanjilG_27015 ankaŭ montris aktivigon trans ĉiuj linioj kaj tempopunktoj, kun statistika signifo ĉe plej multaj datenpunktoj (Fig. 6b). Simile al TanjilG_10657, la plej alta relativa esprima nivelo de TanjilG_27015 estis observita en la inokulita populacio 22660 je 24 HPI (19.5 ± 2.4). La acida endokitinaza geno TanjilG_04706 estis signife suprenreguligita en ĉiuj linioj kaj je ĉiuj tempopunktoj krom Boregine 6 hpi (Fig. 6c). Ĝi estis forte induktita je la unua tempopunkto (6 HPI) je 83A:476 (je 10.5 fojojn) kaj modere pliiĝis en aliaj linioj (je 6.6-7.5 fojojn). Dum la eksperimento, la esprimo de TanjilG_04706 restis je similaj niveloj en 83A:476 kaj Boregine, dum en Mandelup kaj Populacio 22660 ĝi signife pliiĝis, atingante relative altajn valorojn (5.9 ± 1.5 kaj 6.2 ± 1.5, respektive). La endoglukano-1,3-β-glukozidazo-simila geno TanjilG_23384 montris altan aktivigon je la unuaj du tempopunktoj (6 kaj 12 hpi) en ĉiuj linioj krom populacio 22660 (Fig. 6d). La plej altaj relativaj esprimniveloj de TanjilG_23384 estis observitaj je la dua tempopunkto (12 hpi) en Mandelup (2.7 ± 0.3) kaj 83A:476 (1.5 ± 0.1). Je 24 HPI, la esprimo de TanjilG_23384 estis relative malalta en ĉiuj studitaj linioj (de 0.04 ± 0.009 ĝis 0.44 ± 0.12).
Esprimaj profiloj de elektitaj genoj (ag) rivelitaj per kvanta PCR. La nombroj 6, 12 kaj 24 reprezentas horojn post vakcinado. La genoj LanDExH7 kaj LanTUB6 estis uzitaj por normaligo kaj LanTUB6 estis uzita por interseria kalibrado. Erarstangoj reprezentas la norman devion bazitan sur tri biologiaj ripetoj, ĉiu el kiuj estas la averaĝo de tri teknikaj ripetoj. La statistika signifo de diferencoj en la esprimniveloj inter la inokulitaj (Colletotrichum lupini, trostreĉiĝo Col-08, akirita en 1999 de la lupenkampo en Wierzenica, Pollando) kaj kontrolaj (imit-inokulitaj) plantoj estas markitaj super datenpunktoj (*P-valoro < 0,05, **P-valoro ≤ 0,01, ***P-valoro ≤ 0,001). La statistika signifo de diferencoj en la esprimniveloj inter la inokulitaj (Colletotrichum lupini, trostreĉiĝo Col-08, akirita en 1999 de la lupenkampo en Wierzenica, Pollando) kaj kontrolaj (imit-inokulitaj) plantoj estas markitaj super datenpunktoj (*P-valoro < 0,05, **P-valoro ≤ 0,01, ***P-valoro ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, м Статистическая) получен в 1999 г с поля люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулиров) отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Statistike signifaj diferencoj en esprimniveloj inter inokulitaj (Colletotrichum lupini, trostreĉiĝo Col-08, akirita en 1999 el lupenkampo en Wierzhenice, Pollando) kaj kontrolaj (ŝajninokulitaj) plantoj estas notitaj super la datenpunktoj (*P-valoro < 0.05, **P-valoro ≤ 0.01, ***P-valoro ≤ 0.001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在敹之间表达水平差异的统计学显着性标记在敹乼渍在敹伈水平差0.05, **P 值≤ 0.01, ***P 值≤ 0.001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照秉 波兰水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 001)。001)。0. Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, ш08там, полученный с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно ирно инокаули) отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Statistike signifaj diferencoj en esprimniveloj inter inokulitaj (Colletotrichum lupini, trostreĉiĝo Col-08, akirita el lupenkampoj en Verzhenice, Pollando, en 1999) kaj kontrolaj (ŝajninokulitaj) plantoj estas notitaj super la datenpunktoj (*P-valoro < 0.05, **P-valoro ≤ 0.01, ***P-valoro ≤ 0.001).La analizitaj NLL-linioj estis: 83A:476 (rezistema, portanta la homozygotan Lanr1-alelon), Mandelup (modere rezistema, portanta la homozygotan AnMan-alelon), Boregine (rezistema, nekonata genetika fono) kaj populacio 22660 (sentema).
La kandidatgeno TanjilG_05042 ĉe la Lanr1-lokuso montris klare malsaman esprimpadronon kompare kun la profiloj akiritaj per RNA-sekvencaj studoj (Fig. 6e). Signifa aktivigo de ĉi tiu geno estis observita en Mandelup kaj la populacio 22660 (ĝis 39,7 kaj 11,7 fojojn, respektive), rezultante en relative altaj esprimniveloj (ĝis 1,4 ± 0,14 kaj 7,2 ± 1,3, respektive). 83A:476 ankaŭ rivelis iom da suprenreguligo de la geno TanjilG_05042 (ĝis 3,8-obla), tamen, la relativaj atingitaj esprimniveloj (0,044 ± 0,002) estis pli ol 30-obla pli malaltaj ol tiuj observitaj en Mandelup kaj la populacio 22660. analizitaj per qPCR montris signifajn diferencojn en esprimniveloj inter genotipoj en imit-vakcinitaj (kontrolaj) variaĵoj, atingante 58-oblan diferencon inter la populacioj 22660 kaj 83A:476, same kiel inter la populacioj 22660 kaj 22660. Duobla diferenco estis atingita inter Boregine kaj Mandalup.
La kandidatgeno ĉe la AnMan-lokuso, TanjilG_12861, estis aktivigita reage al vakcinado en 83A:476 kaj Mandelup, estis neŭtrala en la 22660-populacio, kaj estis malsuprenreguligita en Boregine (Fig. 6f). La relativa esprimo de la geno TanjilG_12861 estis la plej alta en inokulita 83A:476 (0.14±0.01). La 17.4 kDa klaso I varmoŝoka proteingeno TanjilG_05080 HSP17.4 montris pli malaltajn relativajn esprimnivelojn en ĉiuj studitaj trostreĉoj kaj tempopunktoj (Fig. 6g). La plej alta valoro estis observita je 24 HPI en la 22660-populacio (0.14 ± 0.02, okobla pliiĝo reage al vakcinado).
Komparo de genaj esprimaj profiloj (Fig. 7) rivelis altan korelacion inter TanjilG_10657 kaj kvar aliaj genoj: TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.80), kaj TanjilG_04706 (r = 0.79). Tiaj rezultoj povas indiki kunreguliĝon de ĉi tiuj genoj dum defendaj respondoj. La genoj TanjilG_12861 kaj TanjilG_23384 montris malsamajn esprimajn profilojn kun pli malaltaj valoroj de la korelacia koeficiento de Pearson (de 0.08 ĝis 0.43 kaj -0.19 ĝis 0.28, respektive) kompare kun aliaj genoj.
Korelacioj inter genaj esprimaj profiloj estis detektitaj per kvanta PCR. La jenaj mallarĝfoliaj lupinlinioj estis analizitaj: 83A:476 (rezistema, portanta la homozygotan Lanr1-alelon), Mandelup (modere rezistema, portanta la homozygotan AnMan-alelon), Boregine (rezistema, genetika fono nekonata), kaj Populacio 22660 (sentema). Tri tempopunktoj estis kalkulitaj (6, 12 kaj 24 horojn post inokulado), inkluzive de inokulitaj (Colletotrichum lupini, trostreĉiĝo Col-08, akirita de lupinkampoj en Wierzhenice, Pollando, en 1999) kaj kontrolaj (ŝajninokulitaj) plantoj. La skalo montras la valoron de la Pearson-korelacia koeficiento.
Surbaze de datumoj akiritaj je 6 ĉevalfortoj po colo, WGCNA estis farita sur 9981 DEG identigitaj per komparo de inokulitaj kaj kontrolplantoj por fokusiĝi sur fruaj defendaj respondoj (Aldona Tabelo S12). Dudek du genmoduloj (aretoj) estis trovitaj kun korelaciitaj (pozitivaj aŭ negativaj) esprimaj profiloj inter genotipoj kaj eksperimentaj variaĵoj. Averaĝe, la niveloj de genekspresio malkreskis laŭ ordo 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacio 22660 (en ambaŭ variaĵoj, tamen, ĉi tiu tendenco estis pli forta en kontrolplantoj). Averaĝe, la niveloj de genekspresio malkreskis laŭ ordo 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacio 22660 (en ambaŭ variaĵoj, tamen, ĉi tiu tendenco estis pli forta en kontrolplantoj). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Loĝantaro 22660 (в обоих, надава эта тенденция была сильнее у контрольных растений). Averaĝe, la niveloj de genekspresio malpliiĝis en la ordo 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacio 22660 (en ambaŭ variaĵoj, tamen, ĉi tiu tendenco estis pli forta en kontrolplantoj).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Loĝantaro 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> populacio 22660 的 顺序 下降 （， ， 在翭 ， 在 筌 ９在 在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Loĝantaro 22660 тенденция была сильнее у контрольных растений). Averaĝe, la niveloj de genekspresio malpliiĝis en la serio 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacio 22660 (tamen, en ambaŭ variaĵoj, ĉi tiu tendenco estis pli forta en kontrolplantoj).Vakcinado rezultigis pliigon de genekspresio, precipe en moduloj 18, 19, 14, 6 kaj 1 (en descenda ordo de efiko), negativan reguligon (ekz. moduloj 9 kaj 20) aŭ kun neŭtralaj efikoj (ekz. moduloj 11, 22, 8 kaj 13). Analizo de GO-termina riĉigo (Aldona Tabelo S13) rivelis "GO: 0006952 Protektajn respondojn" por la inokulita modulo (18) kun maksimuma aktivigo, inkluzive de genoj analizitaj per qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 kaj TanjilG_27015), same kiel multajn plej subpremitajn fotosintezajn modulojn (9). La koncentrilo de modulo 18 (Fig. 8) estis identigita kiel la geno TanjilG_26536, kiu ĉifras la PR-10-similan proteinon LlR18B, kaj la koncentrilo de modulo 9 estis identigita kiel la geno TanjilG_28955, kiu ĉifras la proteinon PsbQ de la fotosistemo II. Kandidata geno Lanr1, TanjilG_05042, por rezisto al antraknozo, estis trovita en modulo 22 (Fig. 9) kaj estas asociita kun la terminoj "GO:0044260 Cellular macromolecular metabolic processes" kaj "GO:0006355 Transcriptional regulation, DNA templating" portantaj la TanjilG_01212-nubon. La geno ĉifras la varmostresan transkripcifaktoron A-4a (HSFA4a).
Pezita retanalizo de gena kunesprimo de moduloj kun troreprezentitaj biologiaj procezterminoj "GO: 0006952 Defendaj respondoj". Ligaturo estis simpligita por reliefigi la kvar genojn analizitajn per qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 kaj TanjilG_27015).
Pezigita retanalizo de gena kunesprimo de modulo kun troreprezentita biologia proceztermino "GO: 0006355: Transskriba reguligo, DNA-ŝablonado" kaj portanta kandidatan antraknozo-rezistan genon Lanr1 TanjilG_05042. Ligaturo estis simpligita por izoli la genon TanjilG_05042 kaj la centran genon TanjilG_01212.
Rezisto-testoj kolektitaj en Aŭstralio montris, ke la plej multaj el la frue liberigitaj kulturvarioj estis sentemaj; Kalya, Coromup kaj Mandelup estis priskribitaj kiel modere rezistemaj, dum Wonga, Tanjil kaj 83A:476 estis priskribitaj kiel tre rezistemaj26,27,31. havis la saman rezistalelon, nomitan Lanr1, kaj Coromup kaj Mandelup havis malsaman alelon, nomitan AnMan10, 26, 39, dum Kalya transdonis malsaman alelon, Lanr2. Testoj por rezisto al antraknozo en Germanio rezultigis la identigon de rezistema linio Bo7212 kun kandidata alelo krom Lanr1, nomita LanrBo36.
Nia studo rivelis tre malaltan oftecon (ĉirkaŭ 6%) de la Lanr1-alelo en la testita ĝermo-plasmo. Ĉi tiu observado kongruas kun la rezultoj de ekzamenado de orienteŭropa ĝermo-plasmo uzante la markilojn Anseq3 kaj Anseq4, kiuj montris, ke la Lanr1-alelo ĉeestas nur en du belorusaj linioj. Ĉi tio sugestas, ke la Lanr1-alelo ankoraŭ ne estas vaste uzata de lokaj bredprogramoj, male al Aŭstralio, kie ĝi estas unu el la ŝlosilaj aleloj por markil-helpata bredado. Ĉi tio povas ŝuldiĝi al la pli malalta nivelo de rezisto provizita de la Lanr1-alelo en eŭropaj kampaj kondiĉoj kompare kun la aŭstralia raporto. Krome, studoj pri antraknozo en pluvokvantaj areoj en Aŭstralio montris, ke rezistaj respondoj mediaciitaj de la Lanr1-alelo eble ne estas efikaj en veterkondiĉoj, kiuj favoras kreskon kaj rapidan disvolviĝon de la patogeno19,42. Fakte, en la nuna studo, iuj simptomoj de antraknozo ankaŭ estis observitaj en genotipoj portantaj la Lanr1-alelon, sugestante, ke rezisto povas malaperi sub optimumaj kondiĉoj por la disvolviĝo de C. lupini. Krome, eblaj estas falspozitivaj interpretoj pri la ĉeesto de Anseq3 kaj Anseq4-signoj, kiuj estas proksimume 1 cM for de la Lanr1-lokuso 28,30,43.
Nia studo montris, ke 83A:476, portanta la alelon Lanr1, respondis al inokulado de C. lupini per grandskala transkriptoma reprogramado je la unua analizita tempopunkto (6 hpi), dum ĉe Mandelup, portanta la alelon AnMan, transkriptomaj respondoj estis observitaj multe pli poste (de 24 ĝis 48 hp). Ĉi tiuj tempaj varioj en defendaj respondoj estas asociitaj kun diferencoj en malsansimptomoj, elstarigante la gravecon de frua patogenrekono por sukcesa respondo al rezisto. Por infekti planthiston, antraksaj sporoj devas trairi plurajn evoluajn stadiojn sur la gastiganta surfaco, inkluzive de ĝermado, ĉeldividiĝo kaj formado de apresorio. Alpendaĵo estas infekta strukturo, kiu alkroĉiĝas al la surfaco de la gastiganto kaj faciligas penetron en la gastigajn histojn. Tiel, sporoj de C. gloeosporioides en pizekstrakto montris la unuan dividiĝon de la nukleo post 75-90 minutoj da inkubacio, la formadon de ĝermtubo post 90-120 minutoj, kaj subpremadon post 4 horoj. Manga C. gloeosporioides montris pli ol 40% da konidioj ĝermantaj post 3 horoj da inkubacio kaj ĉirkaŭ 20% da formado de apresoroj post 4 horoj. La virulence-asociita geno CAP20 de C. gloeosporioides montris transskriban agadon en epifito-formantaj konidioj post 3,5 horoj da inkubacio en avokada surfaca vakso kun altaj koncentriĝoj de CAP20-proteino post 4 horoj kaj 46 minutoj. Simile, la aktiveco de melanin-biosintezaj genoj en C. trifolii estis induktita dum 2-hora inkubacio sekvata de la formado de apresorio post 1 horo. Studoj de foliaj histoj montris, ke fragoj inokulitaj kun C. acutatum havas unuan subpremadon je 8 hpi, dum tomatoj inokulitaj kun C. coccodes havas unuan subpremadon je 4 hpi48,49. plejparte kongrua kun la temposkalo de la infekta procezo de Colletotrichum spp. Rapidaj defendrespondoj al 83A:476 sugestas implikiĝon de plantrezisto kaj efektoro-ekigitaj imuneco (ETI) genoj en ĉi tiu linio, dum la malfruaj respondoj de Mandelup subtenas la hipotezon pri mikro-asociita molekula padron-ekigita imuneco (MTI) 50. Fruaj respondoj al 83A: 476 kaj Mandelup. La parta interkovro inter supren- aŭ malsupren-reguligitaj genoj en malfrua respondo ankaŭ subtenas ĉi tiun koncepton, ĉar ETI ofte estas konsiderata kiel akcelita kaj plifortigita MTI-respondo, kiu kulminas per programita ĉelmorto ĉe la loko de infekto, konata kiel anafilakta ŝoko 51,52.
La plej multaj el la genoj atribuitaj al la troreprezentita termino Gene Ontology GO:0006952 "Defenda Respondo" estas la 11 homologoj de la stres-induktita fasta mesaĝo 22 proteino (simila al SAM22) kaj la sep ĉefaj lateksaj protein-similaj (MLP-similaj proteinoj 31, 34, 43 kaj 423 montris sekvencsimilecon. SAM22-similaj genoj montris signifan aktivigon, kiu daŭris pli longe, montrante pliigitajn nivelojn de antraknozorezisto (83A:476 kaj Boregine). Tamen, MLP-similaj genoj estis malsuprenreguligitaj nur en linioj portantaj la kandidatan rezistan alelon (83A:476/Lanr1 je 6 hpi kaj Mandelup/AnMan je 24 hpi). Notindas, ke ĉiuj identigitaj SAM22-similaj homologoj originas de gena aro ampleksanta ĉirkaŭ 105 kb, dum MLP-similaj genoj originas de apartaj regionoj de la genaro. Kunordigita aktivigo de tiaj SAM22-similaj genoj ankaŭ estis trovita en nia antaŭa studo pri NLL-rezisto al Diaporthetoxica inokulado, sugestante ke ili estas implikitaj en la horizontalaj komponantoj de la defendrespondo. Ĉi tiun konkludon ankaŭ subtenas raportoj pri pozitiva respondo de SAM22-similaj genoj al vundo aŭ traktado per salicila acido, fungaj induktantoj aŭ hidrogena peroksido.
MLP-similaj genoj montriĝis respondi al diversaj abiotaj kaj biotaj stresoj, inkluzive de bakteriaj, virusaj kaj patogenaj fungaj infektoj en multaj plantospecioj55. La direktoj de respondo al certaj interagoj inter plantoj kaj patogenoj variis de forte kreskantaj (ekz., dum infestiĝo de kotono kun Verticillium dahliae) ĝis signife malpliiĝantaj (ekz., post infekto de pomarbo kun Alternaria spp.)56,57. Signifa malsuprenregulado de la MLP-simila 423 geno estis observita dum avokadaj defendoj kontraŭ F. niger infekto kaj dum infekto de la pomarbo Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola kaj Alternaria alternata estas pompatotipoj58,59. Krome, pomkaloj troesprimantaj la MLP-similan 423 genon havis pli malaltan esprimon de rezistec-asociitaj genoj kaj estis pli sentemaj al funga infekto59. Sekvante Fusarium oxysporum f, la MLP-simila 423 geno ankaŭ estis subpremita en rezistema ordinara faba ĝermo-plasmo. cn. Faba infekto 60.
Aliaj membroj de la PR-10-familio identigitaj en nia RNA-sekvenca studo estis la genoj LlR18A kaj LlR18B en respondo al suprenregulado, same kiel la suprenregulata (1 geno) aŭ malsuprenregulata (3 genoj) geno por la lipida transiga proteino DIR1. Krome, WGCNA elstarigas la genon LlR18B kiel centron en ĉi tiu modulo, kiu estas tre sentema al vakcinado kaj portas plurajn protektajn respondgenojn. La genoj LlR18A kaj LlR18B estis induktitaj en flavaj lupenfolioj en respondo al patogenaj bakterioj, same kiel en NLL-tigoj post D. toxica inokulado, dum la riza homologo de ĉi tiuj genoj, RSOsPR10, estis rapide induktita de funga infekto supozeble implikita en la jasmonacida signala vojo53,61,62. La DIR1-geno ĉifras nespecifajn lipidajn transportproteinojn, kiuj estas necesaj por la komenco de ĉiea lernita rezisto (SAR). Kun la disvolviĝo de protektaj reagoj, la DIR1-proteino estas transportata de la infektofokuso tra la floemo por indukti SAR en malproksimaj organoj. Interese, la TanjilG_02313 DIR1-geno estis signife induktita je la unua tempopunkto en linioj 84A:476 kaj Loĝantaro 22660, sed antraknozorezisto disvolviĝis sukcese nur en linio 84A:476. Ĉi tio povas indiki iun subfunkciigon de la DIR1-geno en NLL, ĉar la ceteraj tri homologoj respondis al inokulado nur en la linio 83A:476 je 6 hpi, kaj ĉi tiu respondo estis direktita malsupren.
En nia studo, la plej oftaj komponantoj respondantaj al la biologia procezo nomata "GO:0055114 Redoks-procezo" estis citokromo P450-proteino, peroksidazo, linolea acido 9S-/13S-lipoksigenazo, kaj 1-aminociklopropano-1-karboksila acido-oksidazo. Krome, nia WGCNA difinas la HSFA4a-homologon kiel nabon portantan modulojn kiel ekzemple la Lanr1-rezistan genkandidaton TanjilG_05042. HSFA4a estas komponanto de la redoks-dependa reguligo de nuklea transskribo en plantoj.
Citokromaj P450-proteinoj estas oksidoriduktazoj, kiuj katalizas NADPH kaj/aŭ O2-dependajn hidroksiligajn reakciojn en primara kaj sekundara metabolo, inkluzive de la metabolo de ksenobiotikoj, same kiel hormonoj, grasacidoj, steroloj, ĉelmuraj komponantoj, biopolimeroj, kaj la biosintezo de protektaj kombinaĵoj 69. En nia studo, la ŝanĝiĝemo en planta citokroma P450-funkcio estis reduktita de -10.6 log2 (obla ŝanĝo) al 5.7 pro granda nombro da ŝanĝitaj homologoj (37) kaj diferencoj en respondpadronoj inter specifaj genoj, reflektante supreniran revizion. Uzi nur RNA-sekvencajn datumojn por klarigi la supozeblan biologian funkcion de la NLL-genoj en tia granda proteina superfamilio estus tre konjekta. Tamen, indas rimarki, ke iuj citokromaj P450-genoj estas asociitaj kun pliigita rezisto al patogenaj fungoj aŭ bakterioj, inkluzive de kontribuo al alergiaj reagoj 69,70,71.
Klaso III peroksidazoj estas multfunkciaj plantenzimoj implikitaj en vasta gamo de metabolaj procezoj dum plantkresko kaj disvolviĝo, same kiel en respondo al mediaj stresoj kiel saleco, sekeco, alta lumintenseco kaj patogenatako72. Peroksidazoj estas implikitaj en la interagado de pluraj plantspecioj kun Anthracis, inkluzive de Stylosanthes humilis kaj C. gloeosporioides, Lens culinaris kaj C. truncatum, Phaseolus vulgaris kaj C. lindemuthianum, Cucumis sativus kaj C. lagenarium73,74,75,76. La respondo estas tre rapida, foje eĉ je 4 HPI, antaŭ ol la fungo penetras la planthiston73. La peroksidaza geno ankaŭ respondis al D. toxica NLL-inokulado. Aldone al siaj tipaj funkcioj por reguligi oksidativan eksplodon aŭ elimini oksidativan streson, peroksidazoj povas interrompi patogenkreskon kreante fizikajn barojn bazitajn sur ĉelmura plifortigo dum lignifikado, subunuo aŭ krucligado de specifaj kombinaĵoj. Ĉi tiu funkcio povas esti atribuita in silico al la geno TanjilG_03329, kiu ĉifras supozeblan lignin-formantan anjonan peroksidazon, kiu estis signife suprenreguligita en nia studo en la rezistema linio 83A:476 je 6 HPI, sed ne en aliaj trostreĉoj kaj tempopunktoj, kiuj ne respondis.
9S-/13S-lipoksigenazo de linolea acido estas la unua paŝo en la oksidativa vojo de lipida biosintezo78. La produktoj de ĉi tiu vojo havas multajn funkciojn en planta defendo, inkluzive de fortigo de ĉelaj muroj per la formado de kalozaj kaj pektinaj deponaĵoj, kaj reguligo de oksidativa streso per la produktado de reaktivaj oksigenaj specioj79,80,81,82,83. En la nuna studo, la esprimo de linolea acido 9S-/13S-lipoksigenazo estis ŝanĝita en ĉiuj trostreĉoj, sed en la sentema populacio 22660, suprenregulado superregis je malsamaj tempopunktoj, dum ĉe trostreĉoj portantaj rezisteman Lanr1 kaj la AnMan alelon, ĝi emfazas la diversiĝon de la oksilipina tavolo en protektaj antraksaj reagoj inter ĉi tiuj genotipoj.
La homologo de 1-aminociklopropano-1-karboksilatoksidazo (ACO) estis signife suprenreguligita (9 genoj) aŭ malsuprenreguligita (2 genoj) kiam inokulita per lupino. Kun du esceptoj, ĉiuj ĉi tiuj respondoj okazis je 6 hp. ĉe 83A:476. La enzima reakcio mediaciita de ACO-proteinoj estas la limiganta paŝo en etilena produktado kaj tial estas tre reguligita84. Etileno estas planthormono, kiu ludas diversajn rolojn en la reguligo de plantevoluo kaj respondo al abiotaj kaj biotaj streskondiĉoj. La indukto de ACO-transskribo kaj aktivigo de la etilena signalvojo partoprenas en la pliigo de la rezisto de rizo al la hemibiotrofa fungo oryzae oryzae per reguligo de la produktado de reaktivaj oksigenaj specioj kaj fitoaleksinoj. Tre simila foliinfektoprocezo trovita inter M. oryzae kaj C. lupini88,89, kontraŭ la fono de signifa suprenregulado de ACO-homologoj en la 83A:476 linio raportita en ĉi tiu studo, ŝovas la eblecon doni reziston al NLL-antraknozo (etileno) kiel centran signalan paŝon en molekulaj vojoj.
En la nuna studo, grandskala subpremado de multaj genoj asociitaj kun fotosintezo estis observita je 6 hpi en 83A:476 kaj je 48 hpi en Mandeloop kaj la populacio 22660. La amplekso kaj progreso de ĉi tiuj ŝanĝoj estas proporciaj al la nivelo. Rezisto al antraknozo estis observita en ĉi tiu eksperimento. Lastatempe, forta kaj frua subpremado de fotosintez-rilataj transskribaĵoj estis raportita en pluraj modeloj de planto-patogenaj interagoj, inkluzive de patogenaj bakterioj kaj fungoj. Hasto (de 2 HPI en iuj interagoj) kaj tutmonda subpremado de genoj asociitaj kun fotosintezo en respondo al infekto povas ekigi plantimunecon bazitan sur la deplojo de reaktivaj oksigenaj specioj kaj ilia interagado kun la salicila acida vojo por mediacii alergiajn reagojn 90,94.
Konklude, la defendrespondaj mekanismoj proponitaj por la plej rezistema stirpo (83A:476) inkluzivas rapidan patogenrekonon fare de la R-geno (supozeble TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) kaj alergirespond-mediaciitan salicilan acidon kaj etilenan signaladon, sekvatan de establado de longdistanca SAR. La agado estas subtenata de la DIR-1-proteino. Notindas, ke la biotrofa periodo por C. lupini-infekto estas tre mallonga (ĉirkaŭ 2 tagoj), sekvata de nekroza kresko95. La transiro inter ĉi tiuj stadioj povas esti asociita kun nekrozo kaj esprimo de etilen-indukteblaj proteinoj, kiuj agas kiel ellasiloj por alergiaj reagoj en gastigaj plantoj. Tial, la tempofenestro por sukcesa kapto de C. lupini ĉe la biotrofa stadio estas tre mallarĝa. La reprogramado de genoj asociitaj kun redokso kaj fotosintezo observita en 83A:476 je 6 hpi kongruas kun la progresado de fungaj hifoj kaj anoncas la disvolviĝon de sukcesa protekta respondo ĉe la biotrofa stadio. La transkriptomaj respondoj de Mandelup kaj la 22660 populacio eble estas tro malfruaj por kapti la fungon antaŭ ol ŝanĝi al nekroza kresko, tamen, Mandelup eble estas pli efika ol la 22660 populacio ĉar la relative rapida reguligo de la PR-10 proteino antaŭenigas horizontalan reziston.
ETI, pelita de la kanonika R-geno, ŝajnas esti ofta mekanismo por rezisto de faboj al antraknozo. Tiel, en la modela guŝo Medicago truncatula, rezisto al antraknozo estas donita de la RCT1-geno, membro de la TIR-NBS-LRR97 planta R-gena klaso. Ĉi tiu geno ankaŭ donas larĝspektran antraknozoreziston en luzerno kiam transdonita al sentemaj plantoj. En la ordinara fabo (P. vulgaris), pli ol duodek antraknozorezistogenoj estis identigitaj ĝis nun. Kelkaj el ĉi tiuj genoj troviĝas en regionoj malhavantaj iujn ajn kanonikajn R-genojn, tamen multaj aliaj situas ĉe la randoj de kromosomoj portantaj la NBS-LRR-genan areton, inkluzive de TIR-NBS-LRRs99. La tutgenoma SSR-studo ankaŭ konfirmis la asocion de la NBS-LRR-geno kun antraknozorezisto en la ordinara fabo. La kanonika R-geno ankaŭ estis trovita en la genomika regiono portanta la ĉefan antraknozorezistolokuson en blanka lupino 101.
Nia laboro montras, ke tuja rezistanca reago, aktivigita en frua stadio de plantinfekto (prefere ne pli malfrue ol 12 horoj post instalado), efike protektas mallarĝfolian lupinon kontraŭ antraknozo kaŭzita de la patogena fungo *Collelotrichum lupini*. Uzante alt-trairan sekvencadon, ni montris diferencigajn esprimajn profilojn de antraknozaj rezistancaj genoj en NLL-plantoj mediaciitaj de la rezistancaj genoj Lanr1 kaj AnMan. Sukcesa defendo implikas zorgeman desegni la genojn por proteinoj implikitaj en redokso, fotosintezo kaj patogenezo ene de horoj post la unua kontakto de la planto kun patogeno. Similaj protektaj reagoj, sed prokrastitaj en la tempo, estas multe malpli efikaj en protektado de plantoj kontraŭ malsanoj. Antraksa rezisto mediaciita de la geno Lanr1 similas al la tipa rapida respondo de la geno R (efektoro-ekigita imuneco), dum la geno AnMan plej verŝajne provizas horizontalan respondon (imuneco ekigita de mikrobo-asociita molekula padrono), provizante moderan nivelon de daŭripovo.
La 215 NLL-linioj uzitaj por ekzameni antraknozajn markilojn konsistis el 74 kulturvarioj, 60 linioj akiritaj per krucado aŭ bredado, 5 mutaciuloj, kaj 76 sovaĝaj aŭ originalaj ĝermo-plasmoj. La linioj venis el 17 landoj, ĉefe el Pollando (58), Hispanio (47), Germanio (27), Aŭstralio (26), Rusio (19), Belorusio (7), Italio (5) kaj aliaj linioj el 10 landoj. La aro ankaŭ inkluzivas referencajn rezistemajn liniojn: 83A:476, Tanjil, Wonga portanta la alelon Lanr1, kaj Mandelup portanta la alelon AnMan. La linioj estis akiritaj el la Eŭropa Lupina Genetika Rimeda Datumbazo konservata de Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Pollando (Aldona Tabelo S1).
Plantoj estis kultivitaj sub kontrolitaj kondiĉoj (fotoperiodo 16 horoj, temperaturo 25°C dumtage kaj 18°C ​​nokte). Du biologiaj ripetoj estis analizitaj. DNA estis izolita el trisemajnaj folioj uzante la DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germanio) laŭ la protokolo. La kvalito kaj koncentriĝo de la izolita DNA estis taksitaj per spektrofotometriaj metodoj (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Usono). La markilo AnManM1, kiu markas la genon AnMan (derivita de la kultivaĵo Mandelup), kaj la markiloj Anseq3 kaj Anseq4, kiuj flankigas la genon Lanr1 (derivita de la kultivaĵo Tanjil), estis analizitaj 11, 26, 28. Homozigotoj por la rezistema alelo estis taksitaj kiel "1", sentemaj - kiel "0", kaj heterozigotoj - kiel 0.5.
Surbaze de la rezultoj de ekzamenado de markiloj AnManM1, AnSeq3 kaj AnSeq4 kaj la havebleco de semoj por finaj sekvaj eksperimentoj, 50 NLL-linioj estis selektitaj por fenotipa difino de rezisto al antraknozo. La analizo estis farita duoble en komputile kontrolita forcejo kun 14-hora fotoperiodo kun temperaturintervalo de 22 °C dumtage kaj 19 °C nokte. Semoj estas skrapitaj (fortranĉante la semŝelon sur la kontraŭa flanko de la embrio per akra klingo) antaŭ semado por malhelpi semdormanton pro tro malmola semŝelo kaj por certigi unuforman ĝermadon. Plantoj estis kultivitaj en potoj (11 × 11 × 21 cm) kun sterila grundo (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsovio, Pollando). Inokulado estis efektivigita per la trostreĉiĝo *Colletotrichum lupini Col-08*, kultivita en 1999 el la tigoj de mallarĝfoliaj lupenplantoj kultivitaj en kampo en Verĵenica, Granda Pollando (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Prenu areon. La izolitaĵoj estis kultivitaj en SNA-medio je 20°C sub nigra lumo dum 21 tagoj por indukti sporuliĝon. Kvar semajnojn post semado, kiam la plantoj atingis la 4-6-folian stadion, inokulado estis efektivigita per ŝprucado per suspendo de konidioj je koncentriĝo de 0,5 x 10⁶ konidioj por ml. Post inokulado, la plantoj estis tenataj en mallumo dum 24 horoj je humideco de ĉirkaŭ 98% kaj temperaturo de 25°C por faciligi la ĝermadon de konidioj kaj la infektoprocezon. La plantoj estis poste kultivitaj sub 14-hora fotoperiodo je 22°C tage/19°C nokte kaj 70% humideco. La malsanpoentaro estis farita 22 tagojn post inokulado kaj variis de 0 (imuna) ĝis 9 (tre sentema) depende de la ĉeesto aŭ foresto de nekrozaj lezoj sur tigoj kaj folioj. Krome, post poentado, la pezo de la plantoj estis mezurita. Rilatoj inter markilaj genotipoj kaj malsanfenotipoj estis kalkulitaj kiel punktaj du-sekvencaj korelacioj (foresto de heterozigotaj markiloj en la aro de linioj por analizo de la antraknoza rezisteca fenotipo).