Matur nuwun sampun ngunjungi Nature.com. Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan CSS sing winates. Kanggo pengalaman sing paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing wis dianyari (utawa mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer). Kangge, kanggo njamin dhukungan sing terus-terusan, kita bakal nampilake situs tanpa gaya lan JavaScript.
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) iku tanduran polong-polongan sing digunakake kanggo produksi pangan lan perbaikan lemah. Ekspansi global NLL minangka tanduran wis narik kawigaten akeh jamur patogen, kalebu lupine antraknosa, sing nyebabake penyakit antraknosa sing ngrusak. Rong alel, Lanr1 lan AnMan, sing menehi tambah resistensi, wis digunakake ing pembiakan NLL, nanging mekanisme molekuler sing ndasari isih durung dingerteni. Ing panliten iki, penanda Lanr1 lan AnMan digunakake kanggo nyaring sampel NLL Eropa. Pengujian vaksin ing lingkungan sing dikontrol ngonfirmasi efektifitas saka loro donor sing tahan. Profil ekspresi gen diferensial ditindakake ing garis tahan lan rentan sing representatif. Resistensi antraknosa digandhengake karo ekspresi berlebihan saka istilah ontologi gen "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process", lan "GO:0015979 Photosynthesis". Kajaba iku, garis Lanr1 (83A:476) nuduhake pemrograman ulang transkriptom sing signifikan kanthi cepet sawise inokulasi, dene garis liyane nuduhake wektu tundha ing respon iki udakara 42 jam. Respon pertahanan digandhengake karo gen TIR-NBS, CC-NBS-LRR lan NBS-LRR, 10 protein sing melu patogenesis, protein transfer lipid, endoglucan-1,3-β-glukosidase, protein dinding sel sing sugih glisin, lan gen saka jalur reaktif oksigen. Respon awal kanggo 83A:476, kalebu penekanan gen sing ana gandhengane karo fotosintesis, bebarengan karo perlindungan sing sukses sajrone fase pertumbuhan vegetatif biologi jamur, sing nuduhake yen efektor micu kekebalan. Reaksi Mandeloop saya alon, kaya dene hambatan horisontal sakabèhé.
Lupin godhong sempit (NLL, Lupinus angustifolius L.) minangka sereal protein dhuwur sing asale saka wilayah Mediterania sisih kulon1,2. Saiki ditandur minangka tanduran pangan kanggo kewan lan manungsa. Uga dianggep minangka pupuk ijo ing sistem rotasi tanduran amarga fiksasi nitrogen dening bakteri pengikat nitrogen simbiotik lan perbaikan struktur lemah sakabèhé. NLL wis ngalami proses domestikasi sing cepet ing abad pungkasan lan isih ana ing tekanan pembiakan sing dhuwur3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Kanthi budidaya NLL sing nyebar, suksesi jamur patogen ngembangake ceruk pertanian anyar lan nyebabake penyakit anyar sing ngrusak tanduran. Sing paling nggumunake kanggo para petani lan peternak lupin yaiku munculé antraknosa, sing disebabake dening jamur patogen, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Sing paling nggumunake kanggo para petani lan peternak lupin yaiku munculé antraknosa, sing disebabake dening jamur patogen, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, селекционеров люпина было появление антракноза, селекционеров люпина было появление антракноза, селекционеров (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Sing paling misuwur kanggo para petani lan peternak lupin yaiku munculé antraknosa sing disebabake dening jamur patogen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真由病原真菌 Lunenbergi Hagedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌菌真菌 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемогего пtricмато lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Sing paling narik kawigaten para petani lan peternak lupin yaiku munculé antraknosa sing disebabake dening jamur patogen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Laporan paling awal babagan penyakit iki asale saka Brasil lan Amerika Serikat, kanthi gejala khas katon ing taun 1912 lan 1929. Nanging, sawise udakara 30 taun, patogen kasebut ditetepake minangka Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf saka Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld ing Morfologi sing Ditargetake. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .lan H. Schrenk. & H. 施伦克，. & H. 施伦克，.lan H. Schlenk,.Fenotipe penyakit awal sing ditindakake ing pertengahan abad kaping-20 nuduhake sawetara resistensi ing aksesi NLL lan lupin kuning (L. luteus L.), nanging kabeh aksesi lupin putih (L. albus L.) sing dites rentan banget15,16. Panliten nuduhake yen perkembangan antraknosa ana gandhengane karo tambahing presipitasi (kelembapan udara) lan suhu (ing kisaran 12-28 °C), sing nyebabake pelanggaran resistensi ing suhu sing luwih dhuwur17, 18. Nyatane, wektu sing dibutuhake kanggo konidia kanggo thukul lan penyakit kasebut diwiwiti, kaping papat luwih cendhek ing 24 °C (4 jam) tinimbang ing 12 °C (16 jam) ing kahanan kelembapan sing dhuwur19. Mangkono, pemanasan global sing terus-terusan wis nyebabake panyebaran antraknosa. Nanging, penyakit kasebut diamati ing Prancis (1982) lan Ukraina (1983) minangka pertanda ancaman sing bakal teka, nanging ketoke ora digatekake dening industri lupin ing wektu kasebut20,21. Sawetara taun sabanjure, penyakit sing ngrusak iki nyebar ing saindenging jagad lan uga mengaruhi negara-negara penghasil lupin utama kayata Australia, Polandia lan Jerman22,23,24. Sawise wabah antraknosa ing pertengahan taun 1990-an, skrining ekstensif ngasilake identifikasi sawetara donor resisten ing sampel NLL19. Resistensi NLL marang antraknosa dikontrol dening rong alel dominan sing kapisah sing ditemokake ing sumber plasma nutfah sing beda: Lanr1 ing kultivar Tanjil lan Wonga lan AnMan ing kultivar. Mandalay 25, 26. Alel iki nglengkapi penanda molekuler sing ndhukung pemilihan plasma nutfah resisten ing program pemuliaan25,26,27,28,29,30. Garis pemuliaan tahan 83A:476 sing nggawa alel Lanr1 disilangkan karo garis liar rentan P27255 kanggo entuk populasi RIL sing misahake kanggo resistensi antraknosa, sing ndadekake bisa menehi lokus Lanr1 menyang kromosom NLL-1131, 32, 33. Penyelarasan penanda peta keterkaitan saka lokus resistensi flanking menyang antraknosa kanthi kerangka genomik, NLL mbukak lokasi kabeh telung alel ing kromosom sing padha (NLL-11), nanging ing posisi sing beda29,34,35. Nanging, amarga jumlah RIL sing sithik lan jarak genetik sing gedhe antarane penanda lan alel sing cocog, ora ana kesimpulan sing bisa dipercaya babagan gen sing ndasari. Ing sisih liya, panggunaan genetika terbalik ing lupin angel amarga potensial regenerasi sing sithik banget, sing ndadekake manipulasi genetik rumit37.
Pangembangan plasma nutfah sing dijinakkan sing nggawa alel sing dikarepake ing kahanan homozigot, kayata 83A:476 (Lanr1) lan Mandelup (AnMan), wis mbukak lawang kanggo nyinaoni resistensi antraknosa nalika ana kombinasi alel sing berlawanan ing populasi liar. Kemungkinan mekanisme molekuler. Bandhingake respon pertahanan sing diasilake dening genotipe tartamtu. Panliten iki ngevaluasi respon transkriptom awal NLL kanggo vaksinasi C. lupini. Kaping pisanan, panel plasma nutfah NLL Eropa sing ngemot 215 garis disaring nggunakake penanda molekuler sing nandhani alel Lanr1 lan AnMan. Fenotipe antraknosa banjur ditindakake ing 50 garis NLL, sing sadurunge dipilih kanggo penanda molekuler, ing kahanan sing dikontrol. Adhedhasar eksperimen kasebut, papat garis sing beda-beda ing resistensi antraknosa lan komposisi alelik Lanr1/AnMan dipilih kanggo profil ekspresi gen pertahanan diferensial nggunakake rong pendekatan komplementer: sekuensing RNA throughput dhuwur lan kuantifikasi PCR wektu nyata.
Panyaringan sakumpulan plasma nutfah NLL (N = 215) nganggo penanda Lanr1 (Anseq3 lan Anseq4) lan AnMan (Anseq4) lan AnMan (AnManM1) nuduhake yen mung siji garis (95726, cedhak Salamanca-b) sing nguatake alel "resistensi" kanggo kabeh penanda, dene "Anane alel 'rentan'" nemokake proporsi kabeh penanda ing 158 garis (~73,5%). Telulas garis ngasilake rong alel "tahan" saka penanda Lanr1, lan 8 garis ngasilake alel "tahan" saka penanda Lanr1. Alel "resistensi" saka penanda AnMan (Tabel Tambahan S1). Rong garis heterozigot kanggo penanda Anseq3 lan siji heterozigot kanggo penanda AnManM1. 42 garis (19,5%) nggawa fase sing ngelawan saka alel Anseq3 lan Anseq4, sing nuduhake frekuensi rekombinasi sing dhuwur antarane rong lokus iki. Fenotipe antraknosa ing kahanan sing dikontrol (Tabel Tambahan S2) nuduhake variabilitas ing resistensi genotipe sing dites, sing katon ing keruwetan antraknosa. Bedane skor rata-rata wiwit saka 1,8 (tahan sedheng) nganti 6,9 (rentan) lan bedane bobot tanduran wiwit saka 0,62 (rentan) nganti 4,45 g (tahan). Ana korelasi sing signifikan antarane nilai sing diamati ing rong replikasi eksperimen (0,51 kanggo skor keruwetan penyakit, P = 0,00017 lan 0,61 kanggo bobot tanduran, P < 0,0001) uga antarane rong parameter iki (− 0,59 lan − 0,77, P < 0,0001). Ana korelasi sing signifikan antarane nilai sing diamati ing rong replikasi eksperimen (0,51 kanggo skor keruwetan penyakit, P = 0,00017 lan 0,61 kanggo bobot tanduran, P < 0,0001) uga antarane rong parameter kasebut (− 0,59 lan − 0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для тля = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, 01 < 0,0). Korelasi sing signifikan ditemokake antarane nilai sing diamati ing rong pengulangan eksperimen (0,51 kanggo skor keruwetan penyakit, P = 0,00017 lan 0,61 kanggo bobot tanduran, P < 0,0001), uga antarane rong parameter kasebut (- 0,59 lan -0,77, P < 0,0001) 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为 =0. 0.00017，植物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P <0.0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 了 评 庆 了0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（ 和 9–5 . 0.59 nganti 0.59 0.77, P < 0.0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести ва, 0,0,0,0,0,0,0 и масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001. Ana korelasi sing signifikan antarane nilai sing diamati ing duplikat (skor keruwetan penyakit 0,51, P = 0,00017 lan bobot tanduran 0,61, P < 0,0001) lan antarane rong parameter iki (-0,59 lan -0 .0001) 0,77, P<0,0001. ).Gejala khas sing katon ing tanduran sing rentan kalebu bengkong lan mlengkung ing batang sing meh padha karo struktur "gandhewa pangon", banjur ana lesi oval kanthi sporozoit oranye/jambon (Gambar Tambahan 1). Aksesi Australia sing nggawa gen Lanr1 (83A:476 lan Tanjil) lan AnMan (Mandelup) cukup tahan, 0,0331 lan 0,0036). Sawetara garis sing uga nggawa alel Lanr1 lan/utawa AnMan sing "tahan" nuduhake gejala penyakit kasebut.
Menariknya, sawetara galur NLL sing ora duwe alel penanda "tahan" nuduhake tingkat resistensi antraknosa sing dhuwur (bisa dibandhingake utawa luwih dhuwur tinimbang genotipe Lanr1 utawa AnMan), kayata Boregine (nilai P < 0,0001 kanggo kaloro parameter), Bojar (nilai P < 0,0001 kanggo skor lan 0,001 kanggo bobot tanduran) lan Populasi B-549/79b (nilai P < 0,0001 kanggo skor lan ora signifikan kanggo bobot). Menariknya, sawetara galur NLL sing ora duwe alel penanda "tahan" nuduhake tingkat resistensi antraknosa sing dhuwur (bisa dibandhingake utawa luwih dhuwur tinimbang genotipe Lanr1 utawa AnMan), kayata Boregine (nilai P < 0,0001 kanggo kaloro parameter), Bojar (nilai P < 0,0001 kanggo skor lan 0,001 kanggo bobot tanduran) lan Populasi B-549/79b (nilai P < 0,0001 kanggo skor lan ora signifikan kanggo bobot). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокний урость антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для пробраба) (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) lan популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Menariknya, sawetara galur NLL sing ora duwe alel penanda 'tahan' nuduhake tingkat resistensi sing dhuwur marang antraknosa (bisa dibandhingake utawa luwih dhuwur tinimbang genotipe Lanr1 utawa AnMan), kayata Boregine (nilai P < 0,0001 kanggo kaloro parameter kasebut), Bojar (nilai P < 0,0001 kanggo evaluasi lan 0,001 kanggo bobot tanduran) lan populasi B-549/79b (nilai P < 0,0001 kanggo evaluasi lan ora signifikan kanggo bobot).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗他他基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显。 Menarik yen sawetara sistem NLL sing ora duwe penanda "antigenik" nuduhake resistensi horisontal sing dhuwur (padha karo gen Lanr1 utawa AnMan utawa luwih dhuwur), kayata Boregine (loro parameter P < 0,0001), Bojar (nilai P < 0,0001, bobot tanduran 0,001) lan galur B-549/79b (nilai P < 0,0001, bobot ora signifikan). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уостоичить антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001, Bojar <0,0001), Boregine масса растения 0,001) lan популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Menariknya, sawetara galur NLL sing ora duwe alel penanda 'resistensi' nuduhake tingkat resistensi antraknosa sing dhuwur (bisa dibandhingake utawa luwih dhuwur tinimbang genotipe Lanr1 utawa AnMan), kayata Boregine (nilai P kanggo loro parameter <0,0001), Bojar (nilai P <0,0001, bobot tanduran 0,001) lan populasi B-549/79b (nilai P <0,0001, bobot ora signifikan).Fenomena iki nuduhake kemungkinan sumber resistensi genetik anyar, sing njelasake kekurangan korelasi antarane genotipe penanda lan fenotipe penyakit (nilai P saka ~0,42 nganti ~0,98). Dadi, tes Kolmogorov-Smirnov nuduhake yen data babagan resistensi antraknosa meh padha distribusi normal kanggo skor (nilai-P 0,25 lan 0,11) lan massa tanduran (nilai-P 0,47 lan 0,55), sing nuduhake yen aku duwe hipotesis yen luwih akeh alel tinimbang Lanr1 lan AnMan sing terlibat.
Adhedhasar asil skrining resistensi antraknosa, 4 galur dipilih kanggo analisis transkriptom: 83A:476, Boregine, Mandelup, lan Populasi 22660. Galur-galur iki diuji maneh kanggo resistensi antraks ing eksperimen inokulasi kanthi sekuensing RNA, anggere padha karo ing tes sadurunge. Nilai skor kaya ing ngisor iki: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) lan populasi 22660 (6,11 ± 1,29).
Protokol Illumina NovaSeq 6000 entuk rata-rata 40,5 pasangan Mread saben sampel (29,7 nganti 54,4 Mreads) (Tabel Tambahan S3). Skor alignment ing urutan referensi kisarane saka 75,5% nganti 88,6%. Korelasi rata-rata data cacah maca antarane varian eksperimen antarane replikasi biologis kisarane saka 0,812 nganti 0,997 (rata-rata 0,959). Saka 35.170 gen sing dianalisis, 2917 ora nuduhake ekspresi apa-apa, lan 4785 gen liyane diekspresikan ing tingkat sing bisa diabaikan (rata-rata dhasar < 5). Saka 35.170 gen sing dianalisis, 2917 ora nuduhake ekspresi apa-apa, lan 4785 gen liyane diekspresikan ing tingkat sing bisa diabaikan (rata-rata dhasar < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспресировались темирон (kaping pindho <5). Saka 35.170 gen sing dianalisis, 2917 ora nuduhake ekspresi, lan 4785 gen liyane diekspresikan ing tingkat sing bisa diabaikan (rata-rata dhasar <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以忽略不基5）.35.170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительнупюба среднее значение <5). Saka 35.170 gen sing dianalisis, 2917 ora diekspresikan lan 4785 gen liyane nduweni ekspresi sing bisa diabaikan (rata-rata dhasar <5).Dadi, jumlah gen sing dianggep diekspresikan (rata-rata dhasar ≥ 5) sajrone eksperimen yaiku 27.468 (78,1%) (Tabel Tambahan S4).
Saka titik wektu pisanan, kabeh galur NLL nanggapi inokulasi C. lupini (galur Col-08) kanthi mrogram ulang transkriptom (Tabel 1), nanging, beda sing signifikan diamati antarane galur kasebut. Dadi, galur resistensi 83A:476 (nggawa gen Lanr1) nuduhake pemrograman ulang transkriptom sing signifikan ing titik wektu pisanan (6 hpi) kanthi peningkatan 31-69 kali lipat ing jumlah gen munggah lan mudhun sing diisolasi dibandhingake karo titik wektu liyane ing titik wektu iki. Kajaba iku, puncak iki umure cendhak, amarga ekspresi mung sawetara gen sing tetep owah sacara signifikan ing titik wektu kapindho (12 hpi). Menariknya, Boregine, sing uga nuduhake tingkat resistensi sing dhuwur ing tes cangkokan, ora ngalami pemrograman ulang transkripsi sing gedhe banget sajrone eksperimen. Nanging, jumlah gen sing diekspresikan kanthi beda (DEG) padha kanggo Boregine lan 83A:476 ing 12 HPI. Mandelup lan populasi 22660 nuduhake puncak DEG ing titik wektu pungkasan (48 l/s), sing nuduhake wektu tundha relatif ing respon pertahanan.
Amarga 83A:476 ngalami pemrograman ulang transkriptom massal minangka respon marang C. lupini ing 6 HPI dibandhingake karo kabeh garis liyane, ~91% saka DEG sing diamati ing wektu iki spesifik garis keturunan (Gambar 1). Nanging, ana sawetara tumpang tindih ing respon awal antarane garis studi, amarga 68,5%, 50,9%, lan 52,6% DEG ing Boregine, Mandelup, lan populasi 22660, masing-masing, tumpang tindih karo sing ditemokake ing 83A:476 ing titik-titik tartamtu. Nanging, DEG iki mung nyumbang sebagian cilik (0,97–1,70%) saka kabeh DEG sing saiki dideteksi nggunakake 83A:476. Kajaba iku, 11 DEG saka kabeh galur koheren ing wektu iki (Tabel Tambahan S4-S6), kalebu komponen umum saka respon pertahanan tanduran: protein transfer lipid (TanjilG_32225), enzim endoglucan-1,3-β-glukosida (TanjilG_23384), rong protein sing bisa diinduksi stres kaya SAM22 (TanjilG_31528 lan TanjilG_31531), protein lateks dhasar (TanjilG_32352), lan rong protein dinding sel struktural sing sugih glisin (TanjilG_19701 lan TanjilG_19702). Ana uga tumpang tindih sing relatif dhuwur ing respon transkriptom antarane 83A:476 lan Boregine ing 24 HPI (total 16-38% DEG) lan antarane Mandelup lan Populasi 22660 ing 48 HPI (total 14-20% DEG).
Diagram Venn sing nuduhake jumlah gen sing diekspresikan kanthi beda (DEG) ing galur lupin godhong sempit (NLL) sing diinokulasi karo Colletotrichum lupini (galur Col-08 sing dipikolehi saka lapangan lupin ing Wierzhenice, Polandia, 1999). Galur NLL sing dianalisis yaiku: 83A:476 (tahan, nggawa alel Lanr1), Boregine (tahan, latar mburi genetik ora dingerteni), Mandelup (tahan sedheng, nggawa alel AnMan) lan populasi 22660 (rentan banget). Singkatan hpi tegese pirang-pirang jam sawise vaksinasi. Nilai nol wis dibusak kanggo nyederhanakake grafik.
Kumpulan gen sing diekspresikan kanthi berlebihan ing 6 hpi dianalisis kanggo anané domain gen R kanonik (Tabel Tambahan S7). Panliten iki nuduhake induksi transkriptom gen resistensi penyakit klasik kanthi domain NBS-LRR mung ing 83A:476. Kumpulan iki kasusun saka siji gen TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), limang gen CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, lan tanjilg_16162), lan Papat NBS-LR, Tanjilg_16162), lan Papat NBS-LRRE (tanjilg_16162) uga Papat NBS-Lrr (tanjilg_16162) lan Papat NBS-LRR (TANJILG_16162). Kabeh gen iki duwe domain kanonik sing disusun ing urutan sing dilestarikan. Saliyané gen domain NBS-LRR, ana uga sawetara kinase RLL sing diaktifake ing 6 hpi, yaiku siji ing Boregine (TanjilG_19877), loro ing Mandelup (TanjilG_07141 lan TanjilG_19877) lan ing populasi 22660 (TanjilG_09014 lan TanjilG_10361) lan loro ing 83A 27:476.
Gen-gen kanthi ekspresi sing owah sacara signifikan minangka respon marang inokulasi karo C. lupini (galur Col-08) ditindakake analisis pengayaan Gene Ontology (GO) (Tabel Tambahan S8). Istilah proses biologis sing paling kerep dituduhake yaiku "respon pertahanan GO:0006952" sing muncul ing 6 saka 16 kombinasi (wektu × garis) kanthi signifikansi dhuwur (nilai P < 0,001) (Gambar 2). Istilah proses biologis sing paling kerep dituduhake yaiku "respon pertahanan GO:0006952" sing muncul ing 6 saka 16 kombinasi (wektu × garis) kanthi signifikansi dhuwur (nilai P < 0,001) (Gambar 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответный» 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Istilah proses biologis sing paling kerep dituduhake yaiku 'GO:0006952 respon pertahanan', sing muncul ing 6 saka 16 kombinasi (wektu × garis keturunan) kanthi signifikansi dhuwur (nilai P < 0,001) (Gambar 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（时间中一一一一一上个中，具有高显着性（P ‼< 0.001）（Gambar 2）. Istilah proses biologis sing paling representatif yaiku "GO:0006952 respon pertahanan", sing katon ing 6 saka 16 kombinasi (时间 ×线), kanthi signifikansi sing dhuwur (nilai P < 0,001) (Gambar 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», 6 menit 6 saka 6 kanggo комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Istilah proses biologis sing paling kerep diwakili yaiku 'GO:0006952 Defense Response', sing muncul ing 6 saka 16 kombinasi (wektu × garis) kanthi signifikansi dhuwur (nilai P < 0,001) (Gambar 2).Istilah iki kakehan diwakili ing rong titik wektu ing 83A: 476 lan Boregine (6 lan 24 hpi) lan ing siji titik wektu ing Mandelup lan Populasi 22660 (12 lan 6 hpi, masing-masing). Iki minangka asil sing diarepake, sing nyoroti respon antijamur saka garis resisten. Kajaba iku, 83A:476 nanggapi C. lupini kanthi cepet ngindhuksi gen sing ana gandhengane karo ledakan oksidatif sing diwakili dening istilah "GO:0055114 proses redoks", sing nuduhake respon pertahanan tartamtu, dene Boregine nuduhake respon pertahanan tartamtu, sing ana gandhengane karo istilah 'GO'. :0006950 Respon stres”. Populasi 22660 ngaktifake respon resistensi horisontal sing nglibatake metabolit sekunder, sing nyoroti jumlah istilah sing akeh banget "GO:0016104 Proses biosintesis triterpen" lan "GO:0006722 Proses metabolisme triterpen" (loro-lorone istilah kasebut kalebu ing set gen sing padha), kanthi nganggep asil analisis pengayaan istilah GO, stabilitas reaksi Mandelup ana ing antarane Boregine lan Populasi 22660. Kajaba iku, reaksi awal 83A:476 (6 hpi) lan reaksi sing ditundha Mandelup lan Populasi 22660 kalebu istilah GO:0015979 'fotosintesis' lan proses biologis liyane sing ana gandhengane.
Istilah ontologi gen bioproses sing dipilih ing anotasi gen sing diekspresikan kanthi beda sajrone respon transkriptom lupin godhong sempit (NLL) sing diinokulasi karo antraks lupin (galur Col-08 sing dipikolehi saka lapangan lupin ing Wierzhenice, Polandia, ing taun 1999) dilebih-lebihkan banget. Garis NLL sing dianalisis yaiku: 83A:476 (tahan, nggawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar mburi genetik sing ora dingerteni), Mandelup (tahan cukup, nggawa alel AnMan homozigot) lan populasi 22660 (rentan).
Amarga panliten iki tujuane kanggo ngenali gen-gen sing nyumbang kanggo resistensi antraknosa, gen-gen sing ditugasake kanggo istilah GO "GO: 0006952 Respon pertahanan" lan "GO: 0055114 Proses redoks" dianalisis nganggo cut-off amarga rata-rata garis dasar ≥ 30 kanthi paling ora siji baris. × titik wektu sing nggabungake nilai log2 sing signifikan sacara statistik (owah-owahan lipatan). Jumlah gen sing memenuhi kriteria kasebut yaiku 65 kanggo GO:0006952 lan 524 kanggo GO:0055114.
83A:476 nuduhake rong puncak DEG sing diwenehi anotasi istilah GO:0006952, sing pertama ing 6 gen per inci (64 gen, regulasi munggah lan mudhun) lan sing nomer loro ing 24 gen per inci (15 gen, regulasi munggah wae). Boregine uga nuduhake yen GO:0006952 memuncak ing titik wektu sing padha, nanging kanthi DEG sing luwih sithik (11 lan 8) lan aktivasi preferensial. Mandeloop nuduhake rong puncak GO:0006952 ing 12 lan 48 HPI, loro-lorone nggawa 12 gen (sing pertama kanthi gen pengaktif, lan sing nomer loro mung kanthi gen penekan), dene populasi 22660 ing 6 HPI (13 gen) duwe dominasi sing luwih gedhe saka regulasi puncak. Perlu dicathet yen 96,4% saka GO:0006952 DEG ing puncak kasebut duwe jinis respon sing padha (munggah utawa mudhun), sing nuduhake tumpang tindih sing signifikan ing respon pertahanan sanajan ana bedane jumlah gen sing terlibat. Klompok urutan paling gedhé sing ana gandhèngané karo istilah GO:0006952 ngode Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (kaya SAM22), sing kalebu klad protein patogenesis-associated protein (PR-10) kelas 10 lan protein inti lateks. protein sing padha (kaya MLP) (Gambar 3). Kaloro klompok kasebut béda ing sifat èksprèsi lan arah rèspon. Gen sing ngode protein kaya SAM22 nuduhaké induksi sing konsisten lan signifikan ing titik wektu awal (6 utawa 12 hpi) lan umumé ora nanggapi ing pungkasan eksperimen (48 hpi), déné protein kaya MLP nuduhaké koordinasi ing 6 hpi. hpi. 83A:476 lan Mandelup ing 48 hp/in, meh kabèh titik data liyané ora nanggapi. Kajaba iku, bédané profil èksprèsi gen protein kaya SAM22 ngetutaké variabilitas sing diamati ing resistensi antraknosa, amarga garis sing luwih tahan duwé titik wektu sing luwih akèh sing ngindhuksi gen kasebut sacara signifikan tinimbang gen sing luwih rentan. Gen PR-10 liyané sing mèmper karo LlR18A/B nuduhaké pola èksprési sing mèmper banget karo gen protein sing mèmper karo SAM22.
Komponen utama saka istilah proses biologis "GO:0006952 Defense Response" lan pola ekspresi gen kandidat alel Lanr1 lan AnMan wis diidentifikasi. Skala Log2 makili nilai log2 (owah-owahan lipatan) antarane tanduran sing diinokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, sing dipikolehi saka lapangan lupin, Wizhenica, Polandia, 1999) lan kontrol (inokulasi palsu) ing titik wektu sing padha. Galur lupin godhong sempit ing ngisor iki dianalisis: 83A:476 (tahan, nggawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar mburi genetik ora dingerteni), Mandelup (tahan cukup, nggawa alel AnMan homozigot), lan Populasi 22660 (rentan).
Kajaba iku, profil ekspresi gen kandidat RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) lan AnMan (TanjilG_12861) dievaluasi (Gambar 3). Gen TanjilG_05042 nuduhake respon sing signifikan (aktivasi) ing 83A:476 mung ing titik wektu pisanan (6 hpi), dene TanjilG_12861 signifikan ing Mandeloop mung ing rong titik wektu: 6 hpi (regulasi mudhun) lan 24 hpi (6 hpi). Kanthi.). bisa diatur) ).
Gen sing paling akeh diekspresikan ing istilah "proses redoks" GO:0055114 yaiku gen sing ngode protein sitokrom P450 lan peroksidase (Gambar 4). Kanggo sampel sing diisolasi saka 83A:476 ing 6 HPI, nilai log2 maksimum utawa minimum (owah-owahan lipatan) (kanggo 86,6% gen) umume diamati antarane tanduran sing diinokulasi lan kontrol, sing nuduhake respon dhuwur saka genotipe iki kanggo jinis inokulasi. 83A:476 nuduhake GO: 0055114 DEG sing paling signifikan ing 6 hpi (503 gen), dene garis liyane ing 48 hpi (Boregine, 31 gen; Mandelup, 85 gen; lan Populasi 22660, 78 gen)). Ing umume gen saka kulawarga GO:0055114, rong jinis respon kanggo vaksinasi (aktivasi lan inhibisi) diamati. Menariknya, nganti 97,6% DEG sing diidentifikasi kanggo istilah GO: 0055114 ing Mandelupe kanthi 48 hp. Pengamatan iki nuduhake yen, sanajan skalane luwih cilik (yaiku, jumlah gen redoks sing dimutasi, 85 lawan 503), pola respon transkriptom mandeloup sing telat marang antraknosa padha karo respon awal 83A:476. Ing Boregine lan Populasi 22660, konvergensi iki luwih murah ing 51,6% lan 75,6%, masing-masing.
Pola ekspresi komponen utama saka istilah proses biologis "GO:0055114 Proses Redoks" wis diungkap. Skala Log2 makili nilai log2 (owah-owahan lipatan) antarane tanduran sing diinokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, sing dipikolehi saka lapangan lupin, Wizhenica, Polandia, 1999) lan kontrol (inokulasi palsu) ing titik wektu sing padha. Garis lupin godhong sempit ing ngisor iki dianalisis: 83A:476 (tahan, nggawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar mburi genetik ora dingerteni), Mandelup (tahan cukup, nggawa alel AnMan homozigot), lan Populasi 22660 (rentan).
83A:476 Respon transkriptomik kanggo inokulasi karo C. lupini (galur Col-08) uga kalebu pembungkaman gen sing dikoordinasikake sing dihubungake karo istilah GO:0015979 "fotosintesis" lan proses biologis liyane sing gegandhengan (Gambar 5). Set DEG GO:0015979 iki ngemot 105 gen sing direpresi sacara signifikan ing 6 hpi ing 83A:476. Ing subkumpulan iki, 37 gen uga mudhun regulasi ing Mandelup ing 48 HPI lan 35 ing titik wektu sing padha ing populasi 22660, kalebu 19 DEG sing umum kanggo kaloro genotipe kasebut. Ora ana DEG sing ana gandhengane karo istilah GO: 0015979 sing diaktifake sacara signifikan ing kombinasi apa wae (baris x wektu).
Pola ekspresi komponen utama saka istilah proses biologis "GO:0015979 Fotosintesis" wis diungkap. Skala Log2 makili nilai log2 (owah-owahan lipatan) antarane tanduran sing diinokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, sing dipikolehi saka lapangan lupin, Wizhenica, Polandia, 1999) lan kontrol (inokulasi palsu) ing titik wektu sing padha. Garis lupin godhong sempit ing ngisor iki dianalisis: 83A:476 (tahan, nggawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar mburi genetik ora dingerteni), Mandelup (tahan cukup, nggawa alel AnMan homozigot), lan Populasi 22660 (rentan).
Adhedhasar asil analisis ekspresi diferensial lan mbokmenawa melu respon pertahanan nglawan jamur patogen, set pitu gen iki dipilih kanggo kuantifikasi profil ekspresi kanthi PCR wektu nyata (Tabel Tambahan S9).
Gen protein putatif TanjilG_10657 diinduksi sacara signifikan ing kabeh garis lan titik wektu sing ditliti dibandhingake karo tanduran kontrol (mimik) (Tabel Tambahan S10, S11). Kajaba iku, profil ekspresi TanjilG_10657 nuduhake tren sing saya tambah sajrone eksperimen kanggo kabeh garis. Populasi 22660 nuduhake sensitivitas paling dhuwur saka TanjilG_10657 kanggo inokulasi kanthi aktivasi 114 kali lipat lan tingkat ekspresi relatif paling dhuwur (4,4 ± 0,4) ing 24 HPI (Gambar 6a). Gen protein PR10 LlR18A TanjilG_27015 uga nuduhake aktivasi ing kabeh garis lan titik wektu, kanthi signifikansi statistik ing paling akeh titik data (Gambar 6b). Padha karo TanjilG_10657, tingkat ekspresi relatif paling dhuwur saka TanjilG_27015 diamati ing 22660 populasi sing diinokulasi ing 24 HPI (19,5 ± 2,4). Gen endochitinase asam TanjilG_04706 diregulasi kanthi signifikan ing kabeh garis lan ing kabeh titik wektu kajaba Boregine 6 hpi (Gambar 6c). Iki diinduksi kanthi kuat ing titik wektu pisanan (6 HPI) ing 83A:476 (10,5 kali) lan tambah moderat ing garis liyane (6,6-7,5 kali). Sajrone eksperimen, ekspresi TanjilG_04706 tetep ing tingkat sing padha ing 83A:476 lan Boregine, dene ing Mandelup lan Populasi 22660 tambah sacara signifikan, tekan nilai sing relatif dhuwur (5,9 ± 1,5 lan 6,2 ± 1,5). Gen kaya endoglucan-1,3-β-glukosidase TanjilG_23384 nuduhake aktivasi sing dhuwur ing rong titik wektu pisanan (6 lan 12 hpi) ing kabeh garis kajaba populasi 22660 (Gambar 6d). Tingkat ekspresi relatif paling dhuwur saka TanjilG_23384 diamati ing titik wektu kapindho (12 hpi) ing Mandelup (2,7 ± 0,3) lan 83A:476 (1,5 ± 0,1). Ing 24 HPI, ekspresi TanjilG_23384 relatif kurang ing kabeh garis sing ditliti (saka 0,04 ± 0,009 nganti 0,44 ± 0,12).
Profil ekspresi gen sing dipilih (ag) sing diungkapake dening PCR kuantitatif. Angka 6, 12 lan 24 makili jam sawise vaksinasi. Gen LanDExH7 lan LanTUB6 digunakake kanggo normalisasi lan LanTUB6 digunakake kanggo kalibrasi antar seri. Batang kesalahan makili standar deviasi adhedhasar telung replikasi biologis, sing saben-saben minangka rata-rata saka telung replikasi teknis. Signifikansi statistik saka bedane tingkat ekspresi antarane tanduran sing diinokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, sing dipikolehi ing taun 1999 saka lapangan lupin ing Wierzenica, Polandia) lan kontrol (inokulasi tiruan) ditandhani ing ndhuwur titik data (*Nilai P < 0,05, **Nilai P ≤ 0,01, ***Nilai P ≤ 0,001). Signifikansi statistik saka bedane tingkat ekspresi antarane tanduran sing diinokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, sing dipikolehi ing taun 1999 saka lapangan lupin ing Wierzenica, Polandia) lan kontrol (inokulasi tiruan) ditandhani ing ndhuwur titik data (*Nilai P < 0,05, **Nilai P ≤ 0,01, ***Nilai P ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен гля 1999 гля в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*знач0,нич 5 P/ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Bentenane tingkat ekspresi sing signifikan sacara statistik antarane tanduran sing diinokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, sing dipikolehi ing taun 1999 saka lapangan lupin ing Wierzhenice, Polandia) lan kontrol (inokulasi palsu) dicathet ing ndhuwur titik data (*Nilai P < 0,05, **Nilai P ≤ 0,01, ***Nilai P ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据為0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （ 接秗水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001). Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученплый спод Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками (* , 0,0 * * * * * * P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Bentenane tingkat ekspresi sing signifikan sacara statistik antarane tanduran sing diinokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, sing dipikolehi saka lapangan lupin ing Verzhenice, Polandia, ing taun 1999) lan kontrol (inokulasi palsu) dicathet ing ndhuwur titik data (*Nilai P < 0,05, **Nilai P ≤ 0,01, ***Nilai P ≤ 0,001).Garis NLL sing dianalisis yaiku: 83A:476 (tahan, nggawa alel Lanr1 homozigot), Mandelup (tahan cukup, nggawa alel AnMan homozigot), Boregine (tahan, latar mburi genetik ora dingerteni) lan populasi 22660 (rentan).
Gen kandidat TanjilG_05042 ing lokus Lanr1 nuduhake pola ekspresi sing beda banget karo profil sing dipikolehi saka panliten RNA-seq (Gambar 6e). Aktivasi gen iki sing signifikan diamati ing Mandelup lan populasi 22660 (nganti 39,7 lan 11,7 kali, masing-masing), sing nyebabake tingkat ekspresi sing relatif dhuwur (nganti 1,4 ± 0,14 lan 7,2 ± 1,3, masing-masing). 83A:476 uga nuduhake sawetara upregulasi gen TanjilG_05042 (nganti 3,8 kali lipat), nanging, tingkat ekspresi relatif sing digayuh (0,044 ± 0,002) luwih saka 30 kali lipat luwih murah tinimbang sing diamati ing Mandelup lan populasi 22660. sing dianalisis nganggo qPCR nuduhake beda sing signifikan ing tingkat ekspresi antarane genotipe ing varian sing divaksinasi tiruan (kontrol), tekan beda 58 kali lipat antarane populasi 22660 lan 83A:476, uga antarane populasi 22660 lan 22660. Bedane kaping pindho digayuh antarane Boregine lan Mandalup.
Gen kandidat ing lokus AnMan, TanjilG_12861, diaktifake minangka respon kanggo vaksinasi ing 83A:476 lan Mandelup, netral ing populasi 22660, lan mudhun regulasi ing Boregine (Gambar 6f). Ekspresi relatif gen TanjilG_12861 paling dhuwur ing 83A: 476 sing diinokulasi (0,14 ± 0,01). Gen protein kejut panas kelas I 17,4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 nuduhake tingkat ekspresi relatif sing luwih murah ing kabeh galur lan titik wektu sing ditliti (Gambar 6g). Nilai paling dhuwur diamati ing 24 HPI ing populasi 22660 (0,14 ± 0,02, peningkatan wolung kali lipat ing respon kanggo vaksinasi).
Perbandingan profil ekspresi gen (Gambar 7) nuduhake korelasi sing dhuwur antarane TanjilG_10657 lan papat gen liyane: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80), lan TanjilG_04706 (r = 0,79). Asil kasebut bisa nuduhake ko-regulasi gen kasebut sajrone respon pertahanan. Gen TanjilG_12861 lan TanjilG_23384 nuduhake profil ekspresi sing beda kanthi nilai koefisien korelasi Pearson sing luwih murah (saka 0,08 nganti 0,43 lan -0,19 nganti 0,28) dibandhingake karo gen liyane.
Korelasi antarane profil ekspresi gen dideteksi nggunakake PCR kuantitatif. Galur lupin godhong sempit ing ngisor iki dianalisis: 83A:476 (tahan, nggawa alel Lanr1 homozigot), Mandelup (tahan cukup, nggawa alel AnMan homozigot), Boregine (tahan, latar mburi genetik ora dingerteni), lan Populasi 22660 (rentan). Telung titik wektu diitung (6, 12 lan 24 jam sawise inokulasi), kalebu tanduran sing diinokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, sing dipikolehi saka lapangan lupin ing Wierzhenice, Polandia, ing taun 1999) lan kontrol (inokulasi palsu). Skala kasebut nuduhake nilai koefisien korelasi Pearson.
Adhedhasar data sing dipikolehi kanthi daya 6 tenaga kuda saben inci, WGCNA ditindakake ing 9981 DEG sing diidentifikasi kanthi mbandhingake tanduran sing diinokulasi lan kontrol kanggo fokus ing respon pertahanan awal (Tabel Tambahan S12). Rong puluh loro modul gen (klaster) ditemokake kanthi profil ekspresi sing berkorelasi (positif utawa negatif) antarane genotipe lan varian eksperimen. Rata-rata, tingkat ekspresi gen mudhun miturut urutan 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (nanging, ing kaloro varian kasebut, tren iki luwih kuwat ing tanduran kontrol). Rata-rata, tingkat ekspresi gen mudhun miturut urutan 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (nanging, ing kaloro varian kasebut, tren iki luwih kuwat ing tanduran kontrol). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (в обоих вариантах, одтанакод, бел сильнее у контрольных растений). Rata-rata, tingkat ekspresi gen mudhun ing urutan 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (nanging ing kaloro varian kasebut, tren iki luwih kuwat ing tanduran kontrol).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> populasi 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中植物 中 更） . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 контрольных растений). Rata-rata, tingkat ekspresi gen mudhun ing seri 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (nanging, ing kaloro varian kasebut, tren iki luwih kuwat ing tanduran kontrol).Vaksinasi nyebabake peningkatan regulasi ekspresi gen, utamane ing modul 18, 19, 14, 6 lan 1 (kanthi urutan efek mudhun), regulasi negatif (kayata modul 9 lan 20) utawa kanthi efek netral (kayata modul 11, 22, 8 lan 13). Analisis pengayaan istilah GO (Tabel Tambahan S13) nuduhake "GO: 0006952 Respon Protektif" kanggo modul sing diinokulasi (18) kanthi aktivasi maksimal, kalebu gen sing dianalisis dening qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 lan TanjilG_27015), uga akeh modul fotosintesis Inokulasi sing paling ditekan (9). Konsentrator Modul 18 (Gambar 8) diidentifikasi minangka gen TanjilG_26536 sing ngode protein LlR18B kaya PR-10, lan konsentrator modul 9 diidentifikasi minangka gen TanjilG_28955 sing ngode protein fotosistem II PsbQ. Kandidat gen resistensi antraknosa Lanr1, TanjilG_05042, ditemokake ing modul 22 (Gambar 9) lan digandhengake karo istilah "GO:0044260 Proses metabolisme makromolekul seluler" lan "GO:0006355 Regulasi transkripsi, templating DNA" sing nggawa hub TanjilG_01212. gen kasebut ngode faktor transkripsi stres panas A-4a (HSFA4a).
Analisis jaringan tertimbang saka ko-ekspresi gen modul kanthi istilah proses biologis sing kakehan diwakili "GO: 0006952 Respon Pertahanan". Ligasi disederhanakake kanggo nyorot papat gen sing dianalisis dening qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 lan TanjilG_27015).
Analisis jaringan tertimbang saka ko-ekspresi gen saka modul kanthi istilah proses biologis sing akeh banget "GO: 0006355: Regulasi transkripsi, templating DNA" lan nggawa calon gen resistensi antraknosa Lanr1 TanjilG_05042. Ligasi disederhanakake kanggo ngisolasi gen TanjilG_05042 lan gen TanjilG_01212 pusat.
Skrining resistensi antraknosa sing diklumpukake ing Australia nuduhake yen umume kultivar sing dirilis awal rentan; Kalya, Coromup lan Mandelup wis diterangake minangka tahan moderat, dene Wonga, Tanjil lan 83A:476 wis diterangake minangka tahan banget26,27,31. nduweni alel resistensi sing padha, sing diarani Lanr1, lan Coromup lan Mandelup nduweni alel sing beda, sing diarani AnMan10, 26, 39, dene Kalya ngliwati alel sing beda., Lanr2. Skrining kanggo resistensi antraknosa ing Jerman ngasilake identifikasi garis tahan Bo7212 kanthi alel kandidat liyane saka Lanr1, sing diarani LanrBo36.
Panliten kita nuduhake frekuensi sing sithik banget (udakara 6%) saka alel Lanr1 ing plasma nutfah sing dites. Pengamatan iki konsisten karo asil skrining plasma nutfah Eropa Timur nggunakake penanda Anseq3 lan Anseq4, sing nuduhake yen alel Lanr1 mung ana ing rong garis Belarusia. Iki nuduhake yen alel Lanr1 durung digunakake sacara wiyar dening program pemuliaan lokal, ora kaya ing Australia, ing ngendi iku minangka salah sawijining alel kunci kanggo pemuliaan sing dibantu penanda. Iki bisa uga amarga tingkat resistensi sing luwih murah sing diwenehake dening alel Lanr1 ing kahanan lapangan Eropa dibandhingake karo laporan Australia. Kajaba iku, panliten antraknosa ing wilayah udan sing dhuwur ing Australia nuduhake yen respon resistensi sing dimediasi dening alel Lanr1 bisa uga ora efektif ing kahanan cuaca sing ndhukung pertumbuhan lan perkembangan patogen sing cepet19,42. Nyatane, ing panliten saiki, sawetara gejala antraknosa uga diamati ing genotipe sing nggawa alel Lanr1, sing nuduhake yen resistensi bisa ilang ing kahanan optimal kanggo perkembangan C. lupini. Kajaba iku, interpretasi positif palsu babagan anané penanda Anseq3 lan Anseq4, sing kira-kira 1 cM saka lokus Lanr1, bisa uga 28,30,43.
Panliten kita nuduhake yen 83A:476, sing nggawa alel Lanr1, nanggapi inokulasi C. lupini kanthi pemrograman ulang transkriptom skala gedhe ing titik wektu sing dianalisis pisanan (6 hpi), dene ing Mandelup, sing nggawa alel AnMan, respon transkriptomik diamati luwih suwe (saka 24 nganti 48 hp). Variasi temporal ing respon pertahanan iki ana gandhengane karo bedane gejala penyakit, sing nyoroti pentinge pangenalan patogen awal kanggo respon sing sukses marang resistensi. Kanggo nginfeksi jaringan tanduran, spora antraks kudu ngliwati sawetara tahapan perkembangan ing permukaan inang, kalebu perkecambahan, pembelahan sel, lan pembentukan appressorium. Apendiks minangka struktur infeksi sing nempel ing permukaan inang lan nggampangake penetrasi menyang jaringan inang. Dadi, spora C. gloeosporioides ing ekstrak kacang polong nuduhake pembelahan pertama nukleus sawise 75-90 menit inkubasi, pembentukan tabung kuman sawise 90-120 menit, lan penekanan sawise 4 jam 45. Mango C. gloeosporioides nuduhake luwih saka 40% perkecambahan konidia sawise 3 jam inkubasi lan udakara 20% pembentukan apresor sawise 4 jam. Gen CAP20 sing ana gandhengane karo virulensi saka C. gloeosporioides nuduhake aktivitas transkripsi ing konidia sing mbentuk epifit sawise inkubasi 3,5 jam ing lilin permukaan alpukat kanthi konsentrasi protein CAP20 sing dhuwur sawise 4 jam 46 menit. Kajaba iku, aktivitas gen biosintesis melanin ing C. trifolii diinduksi sajrone inkubasi 2 jam diikuti pembentukan apresorium sawise 1 jam. Panliten jaringan godhong nuduhake yen stroberi sing diinokulasi karo C. acutatum duwe penekanan pertama ing 8 hpi, dene tomat sing diinokulasi karo C. coccodes duwe penekanan pertama ing 4 hpi48,49. umume konsisten karo skala wektu proses infeksi Colletotrichum spp. Respon pertahanan cepet marang 83A:476 nuduhake keterlibatan resistensi tanduran lan gen kekebalan sing dipicu efektor (ETI) ing garis iki, dene respon Mandelup sing telat ndhukung hipotesis kekebalan sing dipicu pola molekuler (MTI) sing ana gandhengane karo mikro 50. Respon awal marang 83A: 476 lan Mandelup. Tumpang tindih parsial antarane gen sing diatur munggah utawa mudhun ing respon sing telat uga ndhukung konsep iki, amarga ETI asring dianggep minangka respon MTI sing dipercepat lan ditingkatake sing puncaknya yaiku pati sel sing diprogram ing situs infeksi, sing dikenal minangka syok anafilaksis 51,52.
Sebagéan gedhé gen sing dihubungaké karo istilah Gene Ontology GO:0006952 "Respon Pertahanan" sing kakehan diwakili yaiku 11 homolog saka protein pesen pasa 22 sing diinduksi stres (padha karo SAM22) lan pitung protein lateks utama (MLP). Protein kaya 31, 34, 43 lan 423 nuduhake kamiripan urutan. Gen kaya SAM22 nuduhake aktivasi sing signifikan sing tahan luwih suwe, nuduhake tingkat resistensi antraknosa sing tambah (83A:476 lan Boregine). Nanging, gen kaya MLP mung dikurangi regulasi ing garis sing nggawa alel resistensi kandidat (83A:476/Lanr1 ing 6 hpi lan Mandelup/AnMan ing 24 hpi). Perlu dicathet yen kabeh homolog kaya SAM22 sing diidentifikasi asalé saka kluster gen sing jembaré kira-kira 105 kb, dene gen kaya MLP asalé saka wilayah genom sing kapisah. Aktivasi gen-gen kaya SAM22 sing terkoordinasi uga ditemokake ing panliten sadurunge babagan resistensi NLL marang inokulasi Diaporthetoxica, sing nuduhake manawa gen-gen kasebut melu komponen horisontal saka respon pertahanan. Kesimpulan iki uga didhukung dening laporan babagan respon positif gen-gen kaya SAM22 marang cedera utawa perawatan nganggo asam salisilat, penginduksi jamur, utawa hidrogen peroksida.
Gen-gen kaya MLP wis dituduhake nanggepi macem-macem stres abiotik lan biotik, kalebu infeksi bakteri, virus, lan jamur patogen ing akeh spesies tanduran55. Arah respon kanggo interaksi tartamtu antarane tanduran lan patogen wiwit saka tambah akeh banget (yaiku, sajrone infestasi kapas karo Verticillium dahliae) nganti mudhun sacara signifikan (yaiku, sawise infeksi wit apel karo Alternaria spp.)56,57. Downregulation sing signifikan saka gen 423 kaya MLP wis diamati sajrone pertahanan alpukat kanggo infeksi F. niger lan sajrone infeksi wit apel Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola lan Alternaria alternata minangka patotipe apel58,59. Kajaba iku, kalus apel sing ngekspresikake gen 423 kaya MLP duwe ekspresi gen sing ana gandhengane karo resistensi sing luwih murah lan luwih rentan marang infeksi jamur59. Sawise Fusarium oxysporum f, gen 423 kaya MLP uga ditekan ing plasma nutfah kacang umum sing tahan. cn. Infeksi kacang 60.
Anggota kulawarga PR-10 liyané sing diidentifikasi ing panliten RNA-seq kita yaiku gen LlR18A lan LlR18B minangka respon kanggo upregulasi, uga gen sing upregulasi (1 gen) utawa downregulasi (3 gen) kanggo protein transfer lipid DIR1. Kajaba iku, WGCNA nyoroti gen LlR18B minangka pusat ing modul iki, sing rentan banget kanggo vaksinasi lan nggawa sawetara gen respon protèktif. Gen LlR18A lan LlR18B diinduksi ing godhong lupin kuning minangka respon kanggo bakteri patogen, uga ing batang NLL sawise inokulasi D. toxica, dene homolog beras saka gen kasebut, RSOsPR10, kanthi cepet diinduksi dening infeksi jamur sing mbokmenawa melu ing jalur sinyal asam jasmonat53,61, 62. Gen DIR1 ngode protein transportasi lipid nonspesifik sing dibutuhake kanggo wiwitan resistensi sing dipikolehi sistemik (SAR). Kanthi perkembangan reaksi protèktif, protein DIR1 diangkut saka fokus infeksi liwat floem kanggo ngindhuksi SAR ing organ sing adoh. Menariknya, gen TanjilG_02313 DIR1 diinduksi sacara signifikan ing titik pisanan ing baris 84A:476 lan Populasi 22660, nanging resistensi antraknosa mung berkembang kanthi sukses ing baris 84A:476. Iki bisa uga nuduhake sawetara subfungsionalisasi gen DIR1 ing NLL, amarga telung homolog sing isih ana nanggapi inokulasi mung ing baris 83A:476 ing 6 hpi, lan respon iki ditujokake mudhun.
Ing panliten kita, komponen sing paling umum sing cocog karo proses biologis sing diarani "GO:0055114 Proses Redoks" yaiku protein sitokrom P450, peroksidase, asam linoleat 9S-/13S-lipoksigenase, lan 1-aminosiklopropana-1-karboksilat oksidase. Kajaba iku, WGCNA kita netepake homolog HSFA4a minangka modul sing nggawa hub kayata kandidat gen resistensi Lanr1 TanjilG_05042. HSFA4a minangka komponen regulasi transkripsi nuklir sing gumantung karo redoks ing tanduran.
Protein sitokrom P450 yaiku oksidoreduktase sing ngatalisis reaksi hidroksilasi sing gumantung karo NADPH lan/utawa O2 ing metabolisme primer lan sekunder, kalebu metabolisme xenobiotik, uga hormon, asam lemak, sterol, komponen dinding sel, biopolimer, lan biosintesis senyawa pelindung 69. Ing panliten kita, variabilitas fungsi sitokrom P450 tanduran dikurangi saka -10,6 log2 (owah-owahan lipatan) dadi 5,7 amarga akeh homolog sing diganti (37) lan beda pola respon antarane gen tartamtu, sing nuduhake revisi munggah. . Nggunakake mung data RNA-seq kanggo njlentrehake fungsi biologis putatif gen NLL ing superfamili protein sing gedhe banget bakal dadi spekulatif banget. Nanging, perlu dicathet yen sawetara gen sitokrom P450 digandhengake karo tambah resistensi marang jamur utawa bakteri patogen, kalebu kontribusi kanggo reaksi alergi 69,70,71.
Peroksidase Kelas III minangka enzim tanduran multifungsi sing melu macem-macem proses metabolisme sajrone pertumbuhan lan perkembangan tanduran, uga minangka respon kanggo tekanan lingkungan kayata salinitas, kekeringan, intensitas cahya sing dhuwur, lan serangan patogen72. Peroksidase melu interaksi sawetara spesies tanduran karo Anthracis, kalebu Stylosanthes humilis lan C. gloeosporioides, Lens culinaris lan C. truncatum, Phaseolus vulgaris lan C. lindemuthianum, Cucumis sativus lan C. lagenarium73,74,75,76. Respon kasebut cepet banget, kadhangkala malah ing 4 HPI, sadurunge jamur nembus jaringan tanduran73. Gen peroksidase uga nanggapi inokulasi D. toxica NLL. Saliyane fungsi khas kanggo ngatur ledakan oksidatif utawa ngilangi stres oksidatif, peroksidase bisa ngganggu pertumbuhan patogen kanthi nggawe alangan fisik adhedhasar penguatan dinding sel sajrone lignifikasi, subunit utawa cross-linking senyawa tartamtu. Fungsi iki bisa dihubungake in silico karo gen TanjilG_03329 sing ngode anion peroksidase pembentuk lignin putatif sing diregulasi sacara signifikan ing panliten kita ing garis tahan 83A:476 ing 6 HPI, nanging ora ing galur lan titik wektu liyane sing ora nanggapi.
9S-/13S-lipoxygenase saka asam linoleat minangka langkah pertama ing jalur oksidatif biosintesis lipid78. Produk saka jalur iki nduweni pirang-pirang fungsi ing pertahanan tanduran, kalebu nguatake dinding sel liwat pembentukan deposit callose lan pektin, lan regulasi stres oksidatif liwat produksi spesies oksigen reaktif79,80,81,82,83. Ing panliten iki, ekspresi asam linoleat 9S-/13S-lipoxygenase diganti ing kabeh galur, nanging ing populasi sing rentan 22660, upregulasi ana ing titik wektu sing beda, dene ing galur sing nggawa alel Lanr1 lan AnMan sing tahan, iki nandheske diversifikasi lapisan oxylipin ing reaksi antraks protèktif antarane genotipe kasebut.
Homolog 1-aminosiklopropana-1-karboksilat oksidase (ACO) sacara signifikan mundhak (9 gen) utawa mudhun (2 gen) nalika diinokulasi nganggo lupin. Kajaba rong pangecualian, kabeh respon iki kedadeyan ing 6 hp. ing 83A:476. Reaksi enzimatik sing dimediasi dening protein ACO minangka langkah sing mbatesi laju ing produksi etilen lan mulane diatur banget84. Etilen minangka hormon tanduran sing nduweni macem-macem peran ing ngatur perkembangan tanduran lan respon kanggo kahanan stres abiotik lan biotik. Induksi transkripsi ACO lan aktivasi jalur sinyal etilen melu nambah resistensi pari menyang jamur hemibiotrofik oryzae oryzae kanthi ngatur produksi spesies oksigen reaktif lan fitoaleksin. Proses infeksi godhong sing meh padha ditemokake antarane M. oryzae lan C. lupini88,89, kanthi latar mburi peningkatan homolog ACO sing signifikan ing garis 83A:476 sing dilapurake ing panliten iki, ngowahi kemungkinan menehi resistensi marang NLL antraknosa Etilena minangka langkah pusat sinyal ing jalur molekuler.
Ing panliten iki, penekanan skala gedhe saka akeh gen sing ana gandhengane karo fotosintesis diamati ing 6 hpi ing 83A:476 lan ing 48 hpi ing Mandeloop lan populasi 22660. Tingkat lan kemajuan owah-owahan kasebut sebanding karo tingkat kasebut. Resistensi antraknosa diamati ing eksperimen iki. Bubar, penindasan transkrip sing ana gandhengane karo fotosintesis sing kuwat lan awal wis dilaporake ing sawetara model interaksi tanduran-patogen, kalebu bakteri patogen lan jamur. Kecepetan (saka 2 HPI ing sawetara interaksi) lan penekanan global gen sing ana gandhengane karo fotosintesis minangka respon kanggo infeksi bisa micu kekebalan tanduran adhedhasar penyebaran spesies oksigen reaktif lan interaksi karo jalur asam salisilat kanggo mediasi reaksi alergi 90,94.
Kesimpulane, mekanisme respon pertahanan sing diusulake kanggo garis keturunan sing paling tahan (83A:476) kalebu pangenalan patogen kanthi cepet dening gen R (mungkin TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) lan sinyal asam salisilat lan etilen sing dimediasi respon alergi, banjur digawe SAR jarak jauh. Aksi kasebut didhukung dening protein DIR-1. Perlu dicathet yen periode biotrofik kanggo infeksi C. lupini cendhak banget (kurang luwih 2 dina), banjur tuwuh nekrotik95. Transisi antarane tahapan kasebut bisa uga ana gandhengane karo nekrosis lan ekspresi protein sing bisa diinduksi etilen sing tumindak minangka pemicu reaksi hipersensitivitas ing tanduran inang. Mulane, wektu kanggo nyekel C. lupini kanthi sukses ing tahap biotrofik sempit banget. Pemrograman ulang gen sing ana gandhengane karo redoks lan fotosintesis sing diamati ing 83A:476 ing 6 hpi konsisten karo perkembangan hifa jamur lan menehi tandha perkembangan respon protèktif sing sukses ing tahap biotrofik. Respon transkriptomik Mandelup lan populasi 22660 bisa uga kasep banget kanggo nangkep jamur sadurunge ngalih menyang pertumbuhan nekrotik, nanging, Mandelup bisa uga luwih efektif tinimbang populasi 22660 amarga regulasi protein PR-10 sing relatif cepet ningkatake resistensi horisontal.
ETI, sing didorong dening gen R kanonik, katon minangka mekanisme umum kanggo resistensi kacang buncis marang antraknosa. Dadi, ing model legum Medicago truncatula, resistensi marang antraknosa diwenehake dening gen RCT1, anggota kelas gen R tanduran TIR-NBS-LRR97. Gen iki uga menehi resistensi antraknosa spektrum sing amba ing alfalfa nalika ditransfer menyang tanduran sing rentan. Ing kacang buncis biasa (P. vulgaris), luwih saka rong lusin gen resistensi antraknosa wis diidentifikasi nganti saiki. Sawetara gen kasebut ditemokake ing wilayah sing ora duwe gen R kanonik, nanging akeh liyane sing dumunung ing pinggir kromosom sing nggawa kluster gen NBS-LRR, kalebu TIR-NBS-LRRs99. Panliten SSR sak genom uga ngonfirmasi hubungan gen NBS-LRR karo resistensi antraknosa ing kacang buncis biasa. Gen R kanonik uga ditemokake ing wilayah genom sing nggawa lokus resistensi antraknosa utama ing lupin putih 101.
Karya kita nuduhake yen reaksi resistensi langsung, sing diaktifake ing tahap awal infeksi tanduran (luwih becik ora luwih saka 12 hpi), kanthi efektif nglindhungi lupin godhong sempit saka antraknosa sing disebabake dening jamur patogen Collelotrichum lupini. Nggunakake sekuensing throughput sing dhuwur, kita nduduhake profil ekspresi diferensial gen resistensi antraknosa ing tanduran NLL sing dimediasi dening gen resistensi Lanr1 lan AnMan. Pertahanan sing sukses kalebu ngrancang gen kanthi ati-ati kanggo protein sing melu redoks, fotosintesis, lan patogenesis sajrone sawetara jam sawise kontak pertama tanduran karo patogen. Reaksi protèktif sing padha, nanging telat wektu, kurang efektif kanggo nglindhungi tanduran saka penyakit. Resistensi antraks sing dimediasi dening gen Lanr1 meh padha karo respon cepet khas gen R (kekebalan sing dipicu efektor), dene gen AnMan kemungkinan gedhe menehi respon horisontal (kekebalan sing dipicu dening pola molekul sing ana gandhengane karo mikroba), nyedhiyakake tingkat keberlanjutan sing moderat.
215 galur NLL sing digunakake kanggo nyaring penanda antraknosa kasusun saka 74 kultivar, 60 galur sing dipikolehi kanthi cara nyilang utawa pembiakan, 5 mutan, lan 76 plasma nutfah liar utawa asli. Galur kasebut asale saka 17 negara, utamane saka Polandia (58), Spanyol (47), Jerman (27), Australia (26), Rusia (19), Belarus (7), Italia (5) lan galur liyane saka 10 negara. Kumpulan kasebut uga kalebu galur tahan referensi: 83A:476, Tanjil, Wonga sing nggawa alel Lanr1, lan Mandelup sing nggawa alel AnMan. Galur kasebut dipikolehi saka Basis Data Sumber Daya Genetik Lupin Eropa sing dikelola dening Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polandia (Tabel Tambahan S1).
Tanduran ditandur ing kahanan sing dikontrol (fotoperiode 16 jam, suhu 25°C ing wayah awan lan 18°C ​​ing wayah wengi). Rong replika biologis dianalisis. DNA diisolasi saka godhong umur telung minggu nggunakake DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Jerman) miturut protokol. Kualitas lan konsentrasi DNA sing diisolasi ditaksir kanthi metode spektrofotometri (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Penanda AnManM1 sing nandhani gen resistensi antraknosa AnMan (asal saka cv. Mandelup) lan penanda Anseq3 lan Anseq4 sing ngapit gen Lanr1 (asal saka cv. Tanjil) dianalisis 11,26,28. Homozigot kanggo alel resisten diwenehi skor "1", rentan - minangka "0", lan heterozigot - minangka 0,5.
Adhedhasar asil skrining kanggo penanda AnManM1, AnSeq3 lan AnSeq4 lan kasedhiyan wiji kanggo eksperimen tindak lanjut pungkasan, 50 galur NLL dipilih kanggo fenotipe resistensi antraknosa. Analisis kasebut ditindakake kaping pindho ing omah kaca sing dikontrol komputer kanthi fotoperiode 14 jam kanthi kisaran suhu 22°C ing wayah awan lan 19°C ing wayah wengi. Wiji dikerok (motong kulit wiji ing sisih ngelawan embrio nganggo piso sing landhep) sadurunge disebar kanggo nyegah dormansi wiji amarga kulit wiji sing atos banget lan kanggo njamin perkecambahan sing seragam. Tanduran ditandur ing pot (11 × 11 × 21 cm) nganggo lemah steril (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warsawa, Polandia). Inokulasi ditindakake nganggo galur Colletotrichum lupini Col-08, sing ditandur ing taun 1999 saka batang tanduran lupin godhong sempit sing ditandur ing lapangan ing Verzhenitsa, Polandia Raya (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Golekana area. Isolat dibudidayakake ing medium SNA ing suhu 20° C ing sangisore cahya ireng sajrone 21 dina kanggo ngindhuksi sporulasi. Patang minggu sawise ditandur, nalika tanduran wis tekan tahap 4-6 godhong, inokulasi ditindakake kanthi nyemprotake suspensi konidia kanthi konsentrasi 0,5 x 106 konidia saben ml. Sawise inokulasi, tanduran disimpen ing peteng sajrone 24 jam kanthi kelembapan udakara 98% lan suhu 25°C kanggo nggampangake perkecambahan konidia lan proses infeksi. Tanduran-tanduran kasebut banjur ditandur ing sangisore fotoperiode 14 jam ing suhu 22°C awan/19°C wengi lan kelembapan 70%. Skor penyakit digawe 22 dina sawise inokulasi lan kisarane saka 0 (kebal) nganti 9 (rentan banget) gumantung saka anane utawa ora anane lesi nekrotik ing batang lan godhong. Kajaba iku, sawise menehi skor, bobot tanduran diukur. Hubungan antarane genotipe penanda lan fenotipe penyakit diitung minangka korelasi titik rong urutan (ora anane penanda heterozigot ing sakumpulan garis kanggo analisis fenotipe resistensi antraknosa).