Σας ευχαριστούμε που επισκεφθήκατε το Nature.com. Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη CSS. Για την καλύτερη δυνατή εμπειρία, σας συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη Λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer). Εν τω μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα αποδώσουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Το λούπινο Angustifolius (NLL, Lupinus angustifolius L.) είναι ένα ψυχανθές φυτό που χρησιμοποιείται για την παραγωγή τροφίμων και τη βελτίωση του εδάφους. Η παγκόσμια εξάπλωση του NLL ως καλλιέργεια έχει προσελκύσει πολλούς παθογόνους μύκητες, συμπεριλαμβανομένης της ανθράκωσης του λούπινου, η οποία προκαλεί την καταστροφική ασθένεια της ανθράκωσης. Δύο αλληλόμορφα, το Lanr1 και το AnMan, τα οποία προσδίδουν αυξημένη αντοχή, έχουν χρησιμοποιηθεί στην αναπαραγωγή NLL, αλλά οι υποκείμενοι μοριακοί μηχανισμοί παραμένουν άγνωστοι. Σε αυτή τη μελέτη, οι δείκτες Lanr1 και AnMan χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο ευρωπαϊκών δειγμάτων NLL. Η δοκιμή του εμβολίου σε ελεγχόμενο περιβάλλον επιβεβαίωσε την αποτελεσματικότητα και των δύο ανθεκτικών δοτών. Πραγματοποιήθηκε διαφορική ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης σε αντιπροσωπευτικές ανθεκτικές και ευαίσθητες σειρές. Η αντοχή στην ανθράκωση συσχετίστηκε με την υπερέκφραση των όρων οντολογίας γονιδίων "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process" και "GO:0015979 Photosynthesis". Επιπλέον, η σειρά Lanr1(83A:476) έδειξε σημαντικό επαναπρογραμματισμό μεταγραφώματος γρήγορα μετά τον εμβολιασμό, ενώ οι άλλες σειρές έδειξαν καθυστέρηση σε αυτήν την απόκριση κατά περίπου 42 ώρες. Οι αμυντικές αποκρίσεις σχετίζονται με τα γονίδια TIR-NBS, CC-NBS-LRR και NBS-LRR, 10 πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην παθογένεση, πρωτεΐνες μεταφοράς λιπιδίων, ενδογλυκάνη-1,3-β-γλυκοσιδάση, πρωτεΐνες κυτταρικού τοιχώματος πλούσιες σε γλυκίνη και γονίδια από την αντιδραστική οδό οξυγόνου. Οι πρώιμες αποκρίσεις στο 83A:476, συμπεριλαμβανομένης της προσεκτικής καταστολής γονιδίων που σχετίζονται με τη φωτοσύνθεση, συνέπεσαν με την επιτυχή προστασία κατά τη φάση βλαστικής ανάπτυξης της μυκητιακής βιολογίας, υποδηλώνοντας ότι ένας τελεστής ενεργοποιεί την ανοσία. Η αντίδραση Mandeloop επιβραδύνεται, όπως και η συνολική οριζόντια αντίσταση.
Το στενόφυλλο λούπινο (NLL, Lupinus angustifolius L.) είναι ένα δημητριακό υψηλής πρωτεΐνης που προέρχεται από την περιοχή της δυτικής Μεσογείου1,2. Σήμερα καλλιεργείται ως τροφή για ζώα και ανθρώπους. Θεωρείται επίσης πράσινη λίπανση σε συστήματα αμειψισποράς λόγω της δέσμευσης αζώτου από συμβιωτικά βακτήρια που δεσμεύουν άζωτο και της συνολικής βελτίωσης της δομής του εδάφους. Το NLL έχει υποστεί μια ταχεία διαδικασία εξημέρωσης τον τελευταίο αιώνα και εξακολουθεί να βρίσκεται υπό υψηλή αναπαραγωγική πίεση3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Με την ευρεία καλλιέργεια του NLL, η διαδοχή παθογόνων μυκήτων ανέπτυξε νέες γεωργικές θέσεις και προκάλεσε νέες ασθένειες που καταστρέφουν τις καλλιέργειες. Η πιο αξιοσημείωτη για τους καλλιεργητές και τους κτηνοτρόφους λούπινου ήταν η εμφάνιση ανθρακνόζης, η οποία προκλήθηκε από τον παθογόνο μύκητα Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Η πιο αξιοσημείωτη για τους καλλιεργητές και τους κτηνοτρόφους λούπινου ήταν η εμφάνιση ανθρακνόζης, η οποία προκλήθηκε από τον παθογόνο μύκητα Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Το πιο αξιοσημείωτο γεγονός για τους καλλιεργητές και τους κτηνοτρόφους λούπινου ήταν η εμφάνιση ανθρακνόζης που προκλήθηκε από τον παθογόνο μύκητα Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是猱lleumtricht (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是猱lleumtricht (Bondar)嵵Haired. 1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Το πιο εντυπωσιακό για τους καλλιεργητές και τους κτηνοτρόφους λούπινου είναι η εμφάνιση ανθρακνόζης που προκαλείται από τον παθογόνο μύκητα Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Οι πρώτες αναφορές της νόσου προήλθαν από τη Βραζιλία και τις Ηνωμένες Πολιτείες, με τυπικά συμπτώματα να εμφανίζονται το 1912 και το 1929 αντίστοιχα. Ωστόσο, μετά από περίπου 30 χρόνια, το παθογόνο ονομάστηκε Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., τελομορφή Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., τελομορφή Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., τελομορφή του Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld στην Στοχευμένη Μορφολογία. & Χ. Σρενκ,. & Χ. Σρενκ, .και Χ. Σρενκ. & H.施伦克，. & H.施伦克，.και Χ. Σλενκ, .Η προκαταρκτική φαινοτυπική ανάλυση της νόσου που έγινε στα μέσα του 20ού αιώνα έδειξε κάποια ανθεκτικότητα στις προσθήκες NLL και κίτρινου λούπινου (L. luteus L.), αλλά όλες οι προσθήκες λευκού λούπινου (L. albus L.) που εξετάστηκαν ήταν ιδιαίτερα ευαίσθητες15,16. Μελέτες έχουν δείξει ότι η ανάπτυξη της ανθράκωσης σχετίζεται με αυξημένη βροχόπτωση (υγρασία αέρα) και θερμοκρασία (στην περιοχή των 12-28°C), οδηγώντας σε παραβίαση της ανθεκτικότητας σε υψηλότερες θερμοκρασίες17, 18. Στην πραγματικότητα, ο χρόνος που απαιτείται για να βλαστήσουν τα κονίδια και να ξεκινήσει η ασθένεια ήταν τέσσερις φορές μικρότερος στους 24°C (4 ώρες) από ό,τι στους 12°C (16 ώρες) υπό συνθήκες υψηλής υγρασίας19. Έτσι, η συνεχιζόμενη υπερθέρμανση του πλανήτη οδήγησε στην εξάπλωση της ανθράκωσης. Ωστόσο, η ασθένεια παρατηρήθηκε στη Γαλλία (1982) και την Ουκρανία (1983) ως προάγγελος μιας επικείμενης απειλής, αλλά προφανώς αγνοήθηκε από τη βιομηχανία λούπινου εκείνη την εποχή20,21. Λίγα χρόνια αργότερα, αυτή η καταστροφική ασθένεια εξαπλώθηκε σε όλο τον κόσμο και επηρέασε επίσης σημαντικές χώρες παραγωγής λούπινου, όπως η Αυστραλία, η Πολωνία και η Γερμανία22,23,24. Μετά από ένα ξέσπασμα ανθρακνόζης στα μέσα της δεκαετίας του 1990, ο εκτεταμένος έλεγχος είχε ως αποτέλεσμα την αναγνώριση αρκετών ανθεκτικών δοτών σε δείγματα NLL19. Η αντοχή του NLL στην ανθρακνόζη ελέγχεται από δύο ξεχωριστά κυρίαρχα αλληλόμορφα που βρίσκονται σε διαφορετικές πηγές γενετικού υλικού: το Lanr1 στην ποικιλία Tanjil και Wonga και το AnMan στην ποικιλία Mandalay 25, 26. Αυτά τα αλληλόμορφα συμπληρώνουν τους μοριακούς δείκτες που υποστηρίζουν την επιλογή ανθεκτικού γενετικού υλικού σε προγράμματα αναπαραγωγής25,26,27,28,29,30. Η ανθεκτική αναπαραγωγική σειρά 83A:476 που φέρει το αλληλόμορφο Lanr1 διασταυρώθηκε με την ευαίσθητη άγρια ​​σειρά P27255 για να ληφθεί ένας πληθυσμός RIL που διαχωρίζεται για αντοχή στην ανθρακνόζη, γεγονός που κατέστησε δυνατή την αντιστοίχιση του τόπου Lanr1 στο χρωμόσωμα NLL-1131, 32, 33. Η ευθυγράμμιση των δεικτών του χάρτη σύνδεσης από τους πλευρικούς τόπους αντοχής στην ανθρακνόζη με ένα γονιδιωματικό πλαίσιο, η NLL αποκάλυψε τη θέση και των τριών αλληλόμορφων στο ίδιο χρωμόσωμα (NLL-11), αλλά σε διαφορετικές θέσεις29,34,35. Ωστόσο, λόγω του μικρού αριθμού RIL και της μεγάλης γενετικής απόστασης μεταξύ των δεικτών και των αντίστοιχων αλληλόμορφων, δεν μπορούν να εξαχθούν αξιόπιστα συμπεράσματα σχετικά με τα υποκείμενα γονίδιά τους. Από την άλλη πλευρά, η χρήση της αντίστροφης γενετικής στα λούπινα είναι δύσκολη λόγω του πολύ χαμηλού δυναμικού αναγέννησής τους, γεγονός που καθιστά τον γενετικό χειρισμό δυσκίνητο37.
Η ανάπτυξη εξημερωμένου γενετικού υλικού που φέρει το επιθυμητό αλληλόμορφο σε ομόζυγη κατάσταση, όπως το 83A:476 (Lanr1) και το Mandelup (AnMan), άνοιξε την πόρτα στη μελέτη της αντοχής στην ανθρακνόζη ενόψει της παρουσίας αντίθετων συνδυασμών αλληλόμορφων σε άγριους πληθυσμούς. Δυνατότητες μοριακών μηχανισμών. Συγκρίνετε τις αμυντικές αποκρίσεις που δημιουργούνται από συγκεκριμένους γονότυπους. Αυτή η μελέτη αξιολόγησε την πρώιμη μεταγραφική απόκριση του NLL στον εμβολιασμό με C. lupini. Αρχικά, ένα ευρωπαϊκό πάνελ γενετικού υλικού NLL που περιείχε 215 γραμμές εξετάστηκε χρησιμοποιώντας μοριακούς δείκτες που σηματοδοτούν τα αλληλόμορφα Lanr1 και AnMan. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε φαινοτυποποίηση ανθρακνόζης σε 50 γραμμές NLL, οι οποίες είχαν επιλεγεί προηγουμένως για μοριακούς δείκτες, υπό ελεγχόμενες συνθήκες. Με βάση αυτά τα πειράματα, τέσσερις γραμμές που διέφεραν στην αντοχή στην ανθρακνόζη και στη σύνθεση αλληλόμορφων Lanr1/AnMan επιλέχθηκαν για διαφορικό αμυντικό προφίλ γονιδιακής έκφρασης χρησιμοποιώντας δύο συμπληρωματικές προσεγγίσεις: αλληλούχιση RNA υψηλής απόδοσης και ποσοτικοποίηση PCR σε πραγματικό χρόνο.
Η διαλογή ενός συνόλου γενετικού υλικού NLL (N = 215) με δείκτες Lanr1 (Anseq3 και Anseq4) και AnMan (Anseq4) και AnMan (AnManM1) έδειξε ότι μόνο μία γραμμή (95726, κοντά στη Σαλαμάνκα-b) ενισχύει το αλληλόμορφο «αντίστασης» για όλους τους δείκτες, ενώ η «Παρουσία «ευαίσθητων» αλληλόμορφων» βρήκε την αναλογία όλων των δεικτών σε 158 (~73,5%) γραμμές. Δεκατρείς γραμμές παρήγαγαν δύο «ανθεκτικά» αλληλόμορφα του δείκτη Lanr1 και 8 γραμμές παρήγαγαν «ανθεκτικά» αλληλόμορφα του δείκτη Lanr1. Το αλληλόμορφο «αντίστασης» του δείκτη AnMan (Συμπληρωματικός Πίνακας S1). Δύο γραμμές ήταν ετερόζυγες για τον δείκτη Anseq3 και μία ετερόζυγη για τον δείκτη AnManM1. 42 γραμμές (19,5%) έφεραν αντίθετες φάσεις των αλληλόμορφων Anseq3 και Anseq4, υποδεικνύοντας υψηλή συχνότητα ανασυνδυασμού μεταξύ αυτών των δύο τόπων. Οι φαινότυποι της ανθρακνόζης υπό ελεγχόμενες συνθήκες (Συμπληρωματικός Πίνακας S2) αποκάλυψαν μεταβλητότητα στην αντοχή των δοκιμασμένων γονότυπων, η οποία αντικατοπτρίστηκε στη σοβαρότητα της ανθρακνόζης. Οι διαφορές στις μέσες βαθμολογίες κυμαίνονταν από 1,8 (μέτρια ανθεκτικό) έως 6,9 (ευαίσθητο) και οι διαφορές βάρους των φυτών κυμαίνονταν από 0,62 (ευαίσθητο) έως 4,45 g (ανθεκτικό). Υπήρξε σημαντική συσχέτιση μεταξύ των τιμών που παρατηρήθηκαν σε δύο επαναλήψεις του πειράματος (0,51 για τις βαθμολογίες σοβαρότητας της νόσου, P = 0,00017 και 0,61 για το βάρος του φυτού, P < 0,0001) καθώς και μεταξύ αυτών των δύο παραμέτρων (-0,59 και -0,77, P < 0,0001). Υπήρξε σημαντική συσχέτιση μεταξύ των τιμών που παρατηρήθηκαν σε δύο επαναλήψεις του πειράματος (0,51 για τις βαθμολογίες σοβαρότητας της νόσου, P = 0,00017 και 0,61 για το βάρος του φυτού, P < 0,0001) καθώς και μεταξύ αυτών των δύο παραμέτρων (-0,59 και -0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​‎достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эksperimenta (0,51 για μπαλλό тяжести болезни, P = 0,00017 και 0,61 για κάθε μάσο, 0,51 ανά μάσο, 0,00017 και 0,61 για κάθε μάσο <0,0,00,00,00,00,00,00,00,00,00,00 €, 0,00,00,00,00,00,00,00,00,00 €, 0,00,00,00,00,00,00 €, 0,00 0,61 0,00 00017 και 0,61 ανά μάζα <0,00,00,00 € этими двумя параметри (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Διαπιστώθηκε σημαντική συσχέτιση μεταξύ των τιμών που παρατηρήθηκαν σε δύο επαναλήψεις του πειράματος (0,51 για τις βαθμολογίες σοβαρότητας της νόσου, P = 0,00017 και 0,61 για το βάρος του φυτού, P < 0,0001), καθώς και μεταξύ αυτών των δύο παραμέτρων (- 0,59 και -0,77, P < 0,0001) 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分严0. 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77，001，P < 0,77，P <)在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程庈 严重 度 踄分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之鈑，，，，，，，，，，， 0,59 和 – 0,59 和- 0,59 - 0,77, P < 0,0001). Πραγματοποιήστε πρόσβαση σε πολλά άλλα στοιχεία и -0,0001) 0,77, P <0,0001. Υπήρξε σημαντική συσχέτιση μεταξύ των τιμών που παρατηρήθηκαν σε διπλότυπα (βαθμολογία σοβαρότητας ασθένειας 0,51, P = 0,00017 και βάρος φυτού 0,61, P < 0,0001) και μεταξύ αυτών των δύο παραμέτρων (-0,59 και -0,0001) 0,77, P<0,0001. ).Τυπικά συμπτώματα που παρατηρούνται σε ευπαθή φυτά περιλαμβάνουν στρέβλωση και καμπύλωση του στελέχους που μοιάζει με δομή «τόξου βοσκού», ακολουθούμενη από οβάλ αλλοιώσεις με πορτοκαλί/ροζ σποροζωίδια (Συμπληρωματικό Σχήμα 1). Οι αυστραλιανές ποικιλίες που φέρουν τα γονίδια Lanr1 (83A:476 και Tanjil) και AnMan (Mandelup) είναι μέτρια ανθεκτικές, 0,0331 και 0,0036). Ορισμένες σειρές που φέρουν επίσης «ανθεκτικά» αλληλόμορφα Lanr1 ή/και AnMan παρουσιάζουν συμπτώματα της νόσου.
Είναι ενδιαφέρον ότι μερικές σειρές NLL που δεν είχαν κανένα «ανθεκτικό» αλληλόμορφο δείκτη αποκάλυψαν υψηλό επίπεδο αντοχής στην ανθρακνόζη (συγκρίσιμο ή υψηλότερο από ό,τι για τους γονότυπους Lanr1 ή AnMan), όπως η Boregine (τιμή P < 0,0001 και για τις δύο παραμέτρους), η Bojar (τιμή P < 0,0001 για τη βαθμολογία και 0,001 για το βάρος του φυτού) και ο Πληθυσμός B-549/79b (τιμή P < 0,0001 για τη βαθμολογία και μη σημαντική για το βάρος). Είναι ενδιαφέρον ότι μερικές σειρές NLL που δεν είχαν κανένα «ανθεκτικό» αλληλόμορφο δείκτη αποκάλυψαν υψηλό επίπεδο αντοχής στην ανθρακνόζη (συγκρίσιμο ή υψηλότερο από ό,τι για τους γονότυπους Lanr1 ή AnMan), όπως η Boregine (τιμή P < 0,0001 και για τις δύο παραμέτρους), η Bojar (τιμή P < 0,0001 για τη βαθμολογία και 0,001 για το βάρος του φυτού) και ο Πληθυσμός B-549/79b (τιμή P < 0,0001 για τη βαθμολογία και μη σημαντική για το βάρος). Interesno, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного αλέλλя, показали высокий уровень устойчивости к antraknozu (сопоставимый или более высокий, чем для кагента), Boregine (σημασία P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (σημασία P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) και δημοτικότητα B-549/79b (σημασία P <0,0001 для незначимо для массы). Είναι ενδιαφέρον ότι αρκετές σειρές NLL που δεν είχαν κανένα «ανθεκτικό» αλληλόμορφο δείκτη έδειξαν υψηλό επίπεδο αντοχής στην ανθρακνόζη (συγκρίσιμο ή υψηλότερο από ό,τι για τους γονότυπους Lanr1 ή AnMan), όπως η Boregine (τιμή P < 0,0001 και για τις δύο παραμέτρους), η Bojar (τιμή P < 0,0001 για την αξιολόγηση και 0,001 για το βάρος του φυτού) και ο πληθυσμός B-549/79b (τιμή P < 0,0001 για την αξιολόγηση και μη σημαντική για το βάρος).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭 抗性或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001「重阾为 Είναι ενδιαφέρον ότι ορισμένα συστήματα NLL που δεν έχουν «αντιγονικούς» δείκτες εμφανίζουν υψηλή οριζόντια αντοχή (ισοδύναμη με τα γονίδια Lanr1 ή AnMan ή υψηλότερη), όπως το Boregine (και οι δύο παράμετροι P < 0,0001), το Bojar (τιμή P < 0,0001, βάρος φυτού 0,001) και το στέλεχος B-549/79b (τιμή P < 0,0001, βάρος μη σημαντικό). Interesno, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уровни устойчивости к antraknozu (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 ή AnM). обоих параметров <0,0001), Bojar (σημασία P <0,0001, масса растения 0,001) και δημοφιλής B-549/79b (оценка P-σημείωση <0,0001, масса незначительна). Είναι ενδιαφέρον ότι ορισμένες σειρές NLL που δεν είχαν κανένα αλληλόμορφο δείκτη «αντίστασης» εμφάνισαν υψηλά επίπεδα αντοχής στην ανθρακνόζη (συγκρίσιμα ή υψηλότερα από τους γονότυπους Lanr1 ή AnMan), όπως η Boregine (τιμή P και για τις δύο παραμέτρους <0,0001), η Bojar (τιμή P < 0,0001, βάρος φυτού 0,001) και ο πληθυσμός B-549/79b (τιμή P < 0,0001, βάρος μη σημαντικό).Αυτό το φαινόμενο υποδηλώνει την πιθανότητα μιας νέας γενετικής πηγής αντοχής, εξηγώντας την παρατηρούμενη έλλειψη συσχέτισης μεταξύ των γονότυπων δεικτών και των φαινοτύπων ασθενειών (τιμές P από ~0,42 έως ~0,98). Έτσι, η δοκιμή Kolmogorov-Smirnov έδειξε ότι τα δεδομένα σχετικά με την αντοχή στην ανθρακνόζη ήταν περίπου κανονικά κατανεμημένα για τις βαθμολογίες (τιμές P 0,25 και 0,11) και τη μάζα των φυτών (τιμές P 0,47 και 0,55), υποδηλώνοντας ότι υποθέτω ότι εμπλέκονται περισσότερα αλληλόμορφα από τα Lanr1 και AnMan.
Με βάση τα αποτελέσματα του ελέγχου αντοχής στην ανθρακνόζη, επιλέχθηκαν 4 σειρές για ανάλυση μεταγραφώματος: 83A:476, Boregine, Mandelup και Πληθυσμός 22660. Αυτές οι σειρές επανεξετάστηκαν για αντοχή στον άνθρακα σε πειράματα εμβολιασμού με προσδιορισμό αλληλουχίας RNA, υπό την προϋπόθεση ότι ήταν οι ίδιες με την προηγούμενη δοκιμή. Οι τιμές βαθμολογίας ήταν οι εξής: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) και πληθυσμός 22660 (6,11 ± 1,29).
Το πρωτόκολλο Illumina NovaSeq 6000 πέτυχε κατά μέσο όρο 40,5 ζεύγη Mread ανά δείγμα (29,7 έως 54,4 Mreads) (Συμπληρωματικός Πίνακας S3). Οι βαθμολογίες ευθυγράμμισης στην αλληλουχία αναφοράς κυμαίνονταν από 75,5% έως 88,6%. Η μέση συσχέτιση των δεδομένων μέτρησης ανάγνωσης μεταξύ πειραματικών παραλλαγών μεταξύ βιολογικών αντιγράφων κυμαινόταν από 0,812 έως 0,997 (μέσος όρος 0,959). Από τα 35.170 γονίδια που αναλύθηκαν, τα 2917 δεν παρουσίασαν καμία έκφραση και τα υπόλοιπα 4785 γονίδια εκφράστηκαν σε αμελητέο επίπεδο (μέσος όρος βάσης < 5). Από τα 35.170 γονίδια που αναλύθηκαν, τα 2917 δεν παρουσίασαν καμία έκφραση και τα υπόλοιπα 4785 γονίδια εκφράστηκαν σε αμελητέο επίπεδο (μέσος όρος βάσης < 5). Από 35 170 proanalyzirovannыh genov 2917 ne proyavlyali эkspresssii, a ostalьnыe 4785 genov эkspressirovalisь на незначительном уровне (базовое среднее <5). Από τα 35.170 γονίδια που αναλύθηκαν, τα 2917 δεν έδειξαν καμία έκφραση και τα υπόλοιπα 4785 γονίδια εκφράστηκαν σε αμελητέο επίπεδο (μέσος όρος βάσης <5).在分析的35.170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35.170 Από 35 170 αναλυόμενοι γενόμοι 2917 δεν εκφράζουν, και 4785 γενόμετρα δεν έχουν ονομασθεί ως εκφραστής (βασική μέση τιμή <5). Από τα 35.170 γονίδια που αναλύθηκαν, τα 2917 δεν εκφράστηκαν και τα υπόλοιπα 4785 γονίδια είχαν αμελητέα έκφραση (μέσος όρος βάσης <5).Έτσι, ο αριθμός των γονιδίων που θεωρήθηκαν ότι εκφράστηκαν (βασικός μέσος όρος ≥ 5) κατά τη διάρκεια του πειράματος ήταν 27.468 (78,1%) (Συμπληρωματικός Πίνακας S4).
Από το πρώτο χρονικό σημείο, όλες οι σειρές NLL ανταποκρίθηκαν στον εμβολιασμό με C. lupini (στέλεχος Col-08) επαναπρογραμματίζοντας το μεταγραφόγραμμα (Πίνακας 1), ωστόσο, παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των γραμμών. Έτσι, η σειρά αντοχής 83A:476 (που φέρει το γονίδιο Lanr1) έδειξε σημαντικό επαναπρογραμματισμό μεταγραφώματος στο πρώτο χρονικό σημείο (6 hpi) με 31-69 φορές αύξηση στον αριθμό των απομονωμένων γονιδίων άνω και κάτω σε σύγκριση με άλλα χρονικά σημεία σε αυτό το χρονικό σημείο. Επιπλέον, αυτή η κορυφή ήταν βραχύβια, καθώς η έκφραση μόνο μερικών γονιδίων παρέμεινε σημαντικά μεταβληθείσα στο δεύτερο χρονικό σημείο (12 hpi). Είναι ενδιαφέρον ότι το Boregine, το οποίο επίσης έδειξε υψηλό επίπεδο αντοχής στη δοκιμή μοσχεύματος, δεν υπέστη τόσο μαζικό μεταγραφικό επαναπρογραμματισμό κατά τη διάρκεια του πειράματος. Ωστόσο, ο αριθμός των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων (DEG) ήταν ο ίδιος για το Boregine και το 83A:476 στα 12 HPI. Τόσο ο Mandelup όσο και ο πληθυσμός 22660 εμφάνισαν κορυφές DEG στο τελευταίο χρονικό σημείο (48 l/s), υποδεικνύοντας μια σχετική καθυστέρηση στις αμυντικές αποκρίσεις.
Επειδή η 83A:476 υποβλήθηκε σε μαζικό επαναπρογραμματισμό μεταγραφώματος σε απόκριση στο C. lupini στα 6 HPI σε σύγκριση με όλες τις άλλες σειρές, ~91% των DEG που παρατηρήθηκαν σε αυτό το χρονικό σημείο ήταν ειδικές για την γενεαλογία (Εικ. 1). Ωστόσο, υπήρξε κάποια επικάλυψη στις πρώιμες αποκρίσεις μεταξύ των σειρών μελέτης, καθώς το 68,5%, 50,9% και 52,6% των DEG στις σειρές Boregine, Mandelup και 22660, αντίστοιχα, επικαλύπτονταν με εκείνες που βρέθηκαν στην 83A:476 σε ορισμένα χρονικά σημεία. Ωστόσο, αυτές οι DEG αντιπροσώπευαν μόνο ένα μικρό κλάσμα (0,97–1,70%) όλων των DEG που ανιχνεύθηκαν αυτήν τη στιγμή χρησιμοποιώντας την 83A:476. Επιπλέον, 11 DEG από όλες τις σειρές ήταν συνεκτικές αυτή τη στιγμή (Συμπληρωματικοί Πίνακες S4-S6), συμπεριλαμβανομένων κοινών συστατικών των αποκρίσεων άμυνας των φυτών: πρωτεΐνη μεταφοράς λιπιδίων (TanjilG_32225), ένζυμο ενδογλυκάνης-1,3-β-γλυκοζίτη (TanjilG_23384), δύο πρωτεΐνες που επάγονται από στρες όπως η SAM22 (TanjilG_31528 και TanjilG_31531), βασική πρωτεΐνη λάτεξ (TanjilG_32352) και δύο πλούσιες σε γλυκίνη δομικές πρωτεΐνες κυτταρικού τοιχώματος (TanjilG_19701 και TanjilG_19702). Υπήρξε επίσης σχετικά υψηλή επικάλυψη στις αποκρίσεις μεταγραφώματος μεταξύ 83A:476 και Boregine στα 24 HPI (σύνολο 16-38% DEG) και μεταξύ Mandelup και Πληθυσμού 22660 στα 48 HPI (σύνολο 14-20% DEG).
Διάγραμμα Venn που δείχνει τον αριθμό των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων (DEG) σε σειρές στενόφυλλου λούπινου (NLL) εμβολιασμένες με Colletotrichum lupini (στέλεχος Col-08 που ελήφθη από χωράφια λούπινου στο Wierzhenice της Πολωνίας, 1999). Οι σειρές NLL που αναλύθηκαν ήταν: 83A:476 (ανθεκτική, φέρουσα το αλληλόμορφο Lanr1), Boregine (ανθεκτική, άγνωστο γενετικό υπόβαθρο), Mandelup (μέτρια ανθεκτική, φέρουσα το αλληλόμορφο AnMan) και πληθυσμός 22660 (πολύ ευαίσθητος). Η συντομογραφία hpi σημαίνει ώρες μετά τον εμβολιασμό. Οι μηδενικές τιμές έχουν αφαιρεθεί για την απλοποίηση του γραφήματος.
Το σύνολο των υπερεκφρασμένων γονιδίων στα 6 hpi αναλύθηκε για την παρουσία κανονικών γονιδίων R (Συμπληρωματικός Πίνακας S7). Αυτή η μελέτη αποκάλυψε επαγωγή μεταγραφώματος κλασικών γονιδίων αντοχής σε ασθένειες μόνο με τομείς NBS-LRR στο 83A:476. Αυτό το σύνολο αποτελούνταν από ένα γονίδιο TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), πέντε γονίδια CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 και tanjilg_16162), και τέσσερα NBS-LR, Tanjilg_16162), και τέσσερα NBS-LRRE (tanjilg_16162), καθώς και τέσσερα NBS-Lrr (tanjilg_16162) και τέσσερα NBS-LRR (TANJILG_16162). Όλα αυτά τα γονίδια έχουν κανονικούς τομείς διατεταγμένους σε διατηρημένες αλληλουχίες. Εκτός από τα γονίδια του τομέα NBS-LRR, αρκετές κινάσες RLL ενεργοποιήθηκαν στα 6 hpi, συγκεκριμένα μία στο Boregine (TanjilG_19877), δύο στο Mandelup (TanjilG_07141 και TanjilG_19877) και στον πληθυσμό 22660 (TanjilG_09014 και TanjilG_10361) και δύο στο 83A 27:476.
Τα γονίδια με σημαντικά αλλοιωμένη έκφραση σε απόκριση στον εμβολιασμό με C. lupini (στέλεχος Col-08) υποβλήθηκαν σε ανάλυση εμπλουτισμού με Οντολογία Γονιδίων (GO) (Συμπληρωματικός Πίνακας S8). Ο όρος βιολογικής διεργασίας που υπερεκπροσωπήθηκε περισσότερο ήταν ο όρος «GO:0006952 αμυντική απόκριση», ο οποίος εμφανίστηκε σε 6 από τους 16 συνδυασμούς (χρόνος × γραμμή) με υψηλή σημαντικότητα (τιμή P < 0,001) (Εικ. 2). Ο όρος βιολογικής διεργασίας που υπερεκπροσωπήθηκε περισσότερο ήταν ο όρος «GO:0006952 αμυντική απόκριση», ο οποίος εμφανίστηκε σε 6 από τους 16 συνδυασμούς (χρόνος × γραμμή) με υψηλή σημαντικότητα (τιμή P < 0,001) (Εικ. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся σε 6 από 16 (време × линя) συνδιασμός με высокой (0006952). Ο πιο συχνά υπερεκπροσωπούμενος όρος βιολογικής διεργασίας ήταν η «GO:0006952 αμυντική απόκριση», η οποία εμφανίστηκε σε 6 από τους 16 συνδυασμούς (χρόνος × γενεαλογία) με υψηλή σημαντικότητα (τιμή P < 0,001) (Εικ. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 Ο πιο αντιπροσωπευτικός όρος βιολογικής διεργασίας είναι η «GO:0006952 αμυντική απόκριση», η οποία εμφανίζεται σε 6 από τους 16 συνδυασμούς (时间×线), με υψηλή σημαντικότητα (τιμή P < 0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defence Response», который появлялся во 6 из 16 συνδυασμούς (время × линя) со высокой значимостью (σημαίνει 1). Ο πιο συχνά υπερεκπροσωπούμενος όρος βιολογικής διεργασίας ήταν ο «GO:0006952 Αμυντική Απόκριση», ο οποίος εμφανίστηκε σε 6 από τους 16 συνδυασμούς (χρόνος × γραμμή) με υψηλή σημαντικότητα (τιμή P < 0,001) (Εικ. 2).Αυτός ο όρος υπερεκπροσωπήθηκε σε δύο χρονικά σημεία στο 83A: 476 και Boregine (6 και 24 hpi) και σε ένα χρονικό σημείο στο Mandelup και τον Πληθυσμό 22660 (12 και 6 hpi, αντίστοιχα). Αυτό είναι ένα αναμενόμενο αποτέλεσμα, που υπογραμμίζει την αντιμυκητιασική απόκριση των ανθεκτικών σειρών. Επιπλέον, το 83A:476 ανταποκρίθηκε στο C. lupini επάγοντας γρήγορα γονίδια που σχετίζονται με την οξειδωτική έκρηξη που αντιπροσωπεύεται από τον όρο «GO:0055114 οξειδοαναγωγική διαδικασία», υποδεικνύοντας μια συγκεκριμένη αμυντική απόκριση, ενώ το Boregine αποκάλυψε συγκεκριμένες αμυντικές αποκρίσεις, που σχετίζονται με τον όρο «GO». :0006950 Απόκριση στο στρες». Ο πληθυσμός 22660 ενεργοποίησε την οριζόντια απόκριση αντίστασης που περιλαμβάνει δευτερογενείς μεταβολίτες, υπογραμμίζοντας τον υπερβολικό αριθμό όρων «GO:0016104 Διαδικασία βιοσύνθεσης τριτερπενίων» και «GO:0006722 Διαδικασία μεταβολισμού τριτερπενίων» (και οι δύο όροι ανήκουν στο ίδιο σύνολο γονιδίων), λαμβάνοντας υπόψη τα αποτελέσματα της ανάλυσης εμπλουτισμού του όρου GO, η σταθερότητα της αντίδρασης Mandelup ήταν μεταξύ Boregine και Πληθυσμού 22660. Επιπλέον, η πρώιμη αντίδραση 83A:476 (6 hpi) και η καθυστερημένη αντίδραση Mandelup και Πληθυσμού 22660 περιλαμβάνουν τον όρο GO:0015979 «φωτοσύνθεση» και άλλες σχετικές βιολογικές διεργασίες.
Οι όροι οντολογίας γονιδίων βιοδιεργασίας που επιλέχθηκαν στη σχολίαση διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων κατά τη διάρκεια των μεταγραφικών αποκρίσεων του στενόφυλλου λούπινου (NLL) εμβολιασμένου με λούπινο άνθρακα (στέλεχος Col-08 που ελήφθη από χωράφια λούπινου στο Wierzhenice της Πολωνίας το 1999) είναι υπερβολικοί. Οι σειρές NLL που αναλύθηκαν ήταν: 83A:476 (ανθεκτική, που φέρει το ομόζυγο αλληλόμορφο Lanr1), Boregine (ανθεκτική, άγνωστο γενετικό υπόβαθρο), Mandelup (μέτρια ανθεκτική, που φέρει το ομόζυγο αλληλόμορφο AnMan) και πληθυσμός 22660 (ευαίσθητος).
Επειδή η παρούσα μελέτη στόχευε στον εντοπισμό γονιδίων που συμβάλλουν στην αντοχή στην ανθρακνόζη, τα γονίδια που αντιστοιχούν στους όρους GO "GO: 0006952 Αμυντικές αποκρίσεις" και "GO: 0055114 Οξειδοαναγωγικές διεργασίες" αναλύθηκαν με αποκοπές, καθώς οι μέσες τιμές αναφοράς ≥ 30 με τουλάχιστον μία γραμμή × χρονικό σημείο που συνδυάζει στατιστικά σημαντικές τιμές log2 (αλλαγή φορές). Ο αριθμός των γονιδίων που πληρούσαν αυτά τα κριτήρια ήταν 65 για το GO:0006952 και 524 για το GO:0055114.
Το 83A:476 αποκάλυψε δύο κορυφές DEG που σχολιάστηκαν με τον όρο GO:0006952, η πρώτη στα 6 γονίδια ανά ίντσα (64 γονίδια, ρύθμιση προς τα πάνω και προς τα κάτω) και η δεύτερη στα 24 γονίδια ανά ίντσα (15 γονίδια, μόνο ρύθμιση προς τα πάνω). Ο Boregine έδειξε επίσης ότι το GO:0006952 έφτασε στο ίδιο χρονικό σημείο, αλλά με λιγότερη DEG (11 και 8) και προτιμησιακή ενεργοποίηση. Ο Mandeloop έδειξε δύο κορυφές του GO:0006952 στα 12 και 48 HPI, και οι δύο φέροντας 12 γονίδια (η πρώτη με ενεργοποιητικά γονίδια και η δεύτερη μόνο με κατασταλτικά γονίδια), ενώ ο πληθυσμός 22660 στα 6 HPI (13 γονίδια) είχε μεγαλύτερη κυριαρχία της ρύθμισης της κορυφής αύξησης. Πρέπει να σημειωθεί ότι το 96,4% του GO:0006952 DEG σε αυτές τις κορυφές είχε τον ίδιο τύπο απόκρισης (προς τα πάνω ή προς τα κάτω), υποδεικνύοντας μια σημαντική επικάλυψη στις αμυντικές αποκρίσεις παρά τις διαφορές στον αριθμό των εμπλεκόμενων γονιδίων. Η μεγαλύτερη ομάδα αλληλουχιών που σχετίζεται με τον όρο GO:0006952 κωδικοποιεί την Πρωτεΐνη Μηνύματος που Σχετίζεται με το Στρες Αστοχίας 22 (SAM22-like), η οποία ανήκει στην πρωτεϊνική συστάδα πρωτεΐνης που σχετίζεται με την παθογένεση (PR-10) κλάσης 10 και στην πρωτεΐνη πυρήνα latex (MLP-like) (Εικ. 3). Οι δύο ομάδες διέφεραν ως προς τη φύση της έκφρασης και την κατεύθυνση της απόκρισης. Τα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που μοιάζουν με SAM22 έδειξαν συνεπή και σημαντική επαγωγή σε πρώιμα χρονικά σημεία (6 ή 12 hpi) και γενικά δεν ανταποκρίθηκαν στο τέλος του πειράματος (48 hpi), ενώ οι πρωτεΐνες που μοιάζουν με MLP έδειξαν συντονισμό στα 6 hpi. hpi. 83A:476 και Mandelup στα 48 hp/in, σχεδόν όλα τα άλλα σημεία δεδομένων δεν ανταποκρίθηκαν. Επιπλέον, οι διαφορές στα προφίλ έκφρασης των γονιδίων πρωτεΐνης που μοιάζουν με SAM22 ακολούθησαν την παρατηρούμενη μεταβλητότητα στην αντοχή στην ανθρακνόζη, καθώς οι πιο ανθεκτικές σειρές είχαν περισσότερα χρονικά σημεία που επήγαγαν σημαντικά αυτά τα γονίδια από τα πιο ευαίσθητα γονίδια. Ένα άλλο γονίδιο PR-10 τύπου LlR18A/B έδειξε ένα πολύ παρόμοιο πρότυπο έκφρασης με το γονίδιο πρωτεΐνης τύπου SAM22.
Τα κύρια συστατικά του όρου βιολογικής διεργασίας «GO:0006952 Defense Response» και τα πρότυπα έκφρασης των υποψήφιων γονιδίων των αλληλόμορφων Lanr1 και AnMan προσδιορίστηκαν. Η κλίμακα Log2 αντιπροσωπεύει τις τιμές log2 (αλλαγή φορές) μεταξύ εμβολιασμένων (Colletotrichum lupini, στέλεχος Col-08, που ελήφθη από χωράφια λούπινου, Wizhenica, Πολωνία, 1999) και φυτών ελέγχου (ψευδοεμβολιασμένα) στο ίδιο χρονικό σημείο. Αναλύθηκαν οι ακόλουθες σειρές λούπινου στενόφυλλου: 83A:476 (ανθεκτική, που φέρει το ομόζυγο αλληλόμορφο Lanr1), Boregine (ανθεκτική, άγνωστο γενετικό υπόβαθρο), Mandelup (μέτρια ανθεκτική, που φέρει το ομόζυγο αλληλόμορφο AnMan) και Πληθυσμός 22660 (ευαίσθητη).
Επιπλέον, αξιολογήθηκαν τα προφίλ έκφρασης των υποψήφιων γονιδίων RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) και AnMan (TanjilG_12861) (Εικ. 3). Το γονίδιο TanjilG_05042 έδειξε σημαντική απόκριση (ενεργοποίηση) στο 83A:476 μόνο στο πρώτο χρονικό σημείο (6 hpi), ενώ το TanjilG_12861 ήταν σημαντικό στο Mandeloop μόνο σε δύο χρονικά σημεία: 6 hpi (καθοδική ρύθμιση) και 24 hpi (6 hpi). Με.). ρυθμιζόμενο) ).
Τα γονίδια που υπερεκφράζονται περισσότερο στον όρο GO:0055114 «οξειδοαναγωγική διαδικασία» ήταν γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες του κυτοχρώματος P450 και υπεροξειδάση (Εικ. 4). Για δείγματα που απομονώθηκαν από το 83A:476 στα 6 HPI, παρατηρήθηκαν γενικά μέγιστες ή ελάχιστες τιμές log2 (αλλαγή φορές) (για το 86,6% των γονιδίων) μεταξύ των εμβολιασμένων και των φυτών ελέγχου, υπογραμμίζοντας την υψηλή απόκριση αυτού του γονότυπου στον εμβολιασμό του φύλου. Το 83A:476 έδειξε το πιο σημαντικό GO:0055114 DEG στα 6 hpi (503 γονίδια), ενώ οι υπόλοιπες σειρές στα 48 hpi (Boregine, 31 γονίδια, Mandelup, 85 γονίδια και Πληθυσμός 22660, 78 γονίδια). Στα περισσότερα γονίδια της οικογένειας GO:0055114, παρατηρήθηκαν δύο τύποι αποκρίσεων στον εμβολιασμό (ενεργοποίηση και αναστολή). Είναι ενδιαφέρον ότι έως και 97,6% των DEG που εντοπίστηκαν για τον όρο GO: 0055114 στο Mandelupe στα 48 hp. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι, παρά τη σημαντικά μικρότερη κλίμακα (δηλαδή, τον αριθμό των μεταλλαγμένων οξειδοαναγωγικών γονιδίων, 85 έναντι 503), το πρότυπο των καθυστερημένων μεταγραφικών αποκρίσεων του mandeloup στην ανθρακνόζη είναι παρόμοιο με την πρώιμη απόκριση του 83A:476. Στο Boregine και τον Πληθυσμό 22660, αυτή η σύγκλιση είναι χαμηλότερη στο 51,6% και 75,6%, αντίστοιχα.
Αποκαλύφθηκαν τα πρότυπα έκφρασης των κύριων συστατικών του όρου της βιολογικής διαδικασίας «GO:0055114 Οξειδοαναγωγική διαδικασία». Η κλίμακα Log2 αντιπροσωπεύει τις τιμές log2 (αλλαγή φορές) μεταξύ εμβολιασμένων (Colletotrichum lupini, στέλεχος Col-08, που ελήφθη από χωράφια λούπινου, Wizhenica, Πολωνία, 1999) και φυτών ελέγχου (ψευδοεμβολιασμένα) στο ίδιο χρονικό σημείο. Αναλύθηκαν οι ακόλουθες σειρές λούπινου στενόφυλλου: 83A:476 (ανθεκτική, που φέρει το ομόζυγο αλληλόμορφο Lanr1), Boregine (ανθεκτική, άγνωστο γενετικό υπόβαθρο), Mandelup (μέτρια ανθεκτική, που φέρει το ομόζυγο αλληλόμορφο AnMan) και Πληθυσμός 22660 (ευαίσθητη).
83A:476 Οι μεταγραφικές αποκρίσεις στον εμβολιασμό με C. lupini (στέλεχος Col-08) περιελάμβαναν επίσης συντονισμένη σίγηση γονιδίων που αποδίδονται στον όρο GO:0015979 «φωτοσύνθεση» και άλλες σχετικές βιολογικές διεργασίες (ΣΧ. 5). Αυτό το σύνολο DEG GO:0015979 περιείχε 105 γονίδια που καταστάλθηκαν σημαντικά στα 6 hpi στο 83A:476. Σε αυτό το υποσύνολο, 37 γονίδια υπορυθμίστηκαν επίσης στο Mandelup στα 48 HPI και 35 στο ίδιο χρονικό σημείο στον πληθυσμό 22660, συμπεριλαμβανομένων 19 DEG κοινών και στους δύο γονότυπους. Κανένα DEG που σχετίζεται με τον όρο GO: 0015979 δεν ενεργοποιήθηκε σημαντικά σε κανέναν συνδυασμό (γραμμή x χρόνος).
Αποκαλύφθηκαν τα πρότυπα έκφρασης των κύριων συστατικών του όρου της βιολογικής διαδικασίας «GO:0015979 Φωτοσύνθεση». Η κλίμακα Log2 αντιπροσωπεύει τις τιμές log2 (αλλαγή φορές) μεταξύ εμβολιασμένων (Colletotrichum lupini, στέλεχος Col-08, που ελήφθη από χωράφια λούπινου, Wizhenica, Πολωνία, 1999) και φυτών ελέγχου (ψευδοεμβολιασμένα) στο ίδιο χρονικό σημείο. Αναλύθηκαν οι ακόλουθες σειρές λούπινου στενόφυλλου: 83A:476 (ανθεκτική, που φέρει το ομόζυγο αλληλόμορφο Lanr1), Boregine (ανθεκτική, άγνωστο γενετικό υπόβαθρο), Mandelup (μέτρια ανθεκτική, που φέρει το ομόζυγο αλληλόμορφο AnMan) και Πληθυσμός 22660 (ευαίσθητη).
Με βάση τα αποτελέσματα της διαφορικής ανάλυσης έκφρασης και πιθανώς εμπλέκονται σε αμυντικές αποκρίσεις έναντι παθογόνων μυκήτων, αυτό το σύνολο επτά γονιδίων επιλέχθηκε για ποσοτικοποίηση των προφίλ έκφρασης με PCR σε πραγματικό χρόνο (Συμπληρωματικός Πίνακας S9).
Το υποτιθέμενο γονίδιο πρωτεΐνης TanjilG_10657 επήχθη σημαντικά σε όλες τις μελετηθείσες γραμμές και χρονικά σημεία σε σύγκριση με τα φυτά ελέγχου (μιμητικά) (Συμπληρωματικοί Πίνακες S10, S11). Επιπλέον, το προφίλ έκφρασης του TanjilG_10657 έδειξε αυξητική τάση κατά τη διάρκεια του πειράματος για όλες τις γραμμές. Ο πληθυσμός 22660 έδειξε την υψηλότερη ευαισθησία του TanjilG_10657 στον εμβολιασμό με 114πλάσια ενεργοποίηση και το υψηλότερο σχετικό επίπεδο έκφρασης (4,4 ± 0,4) στα 24 HPI (Εικ. 6α). Το γονίδιο πρωτεΐνης PR10 LlR18A TanjilG_27015 έδειξε επίσης ενεργοποίηση σε όλες τις γραμμές και χρονικά σημεία, με στατιστική σημαντικότητα στα περισσότερα σημεία δεδομένων (Εικ. 6b). Παρόμοια με το TanjilG_10657, το υψηλότερο σχετικό επίπεδο έκφρασης του TanjilG_27015 παρατηρήθηκε στον πληθυσμό 22660 εμβολιασμένων στα 24 HPI (19,5 ± 2,4). Το γονίδιο της όξινης ενδοχιτινάσης TanjilG_04706 αυξήθηκε σημαντικά σε όλες τις σειρές και σε όλα τα χρονικά σημεία εκτός από την Boregine 6 hpi (Εικ. 6c). Επήχθη έντονα στο πρώτο χρονικό σημείο (6 HPI) στο 83A:476 (κατά 10,5 φορές) και αυξήθηκε μέτρια σε άλλες σειρές (κατά 6,6-7,5 φορές). Κατά τη διάρκεια του πειράματος, η έκφραση του TanjilG_04706 παρέμεινε σε παρόμοια επίπεδα στην 83A:476 και την Boregine, ενώ στον Mandelup και στον Πληθυσμό 22660 αυξήθηκε σημαντικά, φτάνοντας σε σχετικά υψηλές τιμές (5,9 ± 1,5 και 6,2 ± 1,5, αντίστοιχα). Το γονίδιο TanjilG_23384 που μοιάζει με ενδογλυκάνη-1,3-β-γλυκοσιδάση έδειξε υψηλή ενεργοποίηση στα δύο πρώτα χρονικά σημεία (6 και 12 hpi) σε όλες τις σειρές εκτός από τον πληθυσμό 22660 (Εικ. 6d). Τα υψηλότερα σχετικά επίπεδα έκφρασης του TanjilG_23384 παρατηρήθηκαν στο δεύτερο χρονικό σημείο (12 hpi) στο Mandelup (2,7 ± 0,3) και στο 83A:476 (1,5 ± 0,1). Στα 24 HPI, η έκφραση του TanjilG_23384 ήταν σχετικά χαμηλή σε όλες τις μελετηθείσες σειρές (από 0,04 ± 0,009 έως 0,44 ± 0,12).
Προφίλ έκφρασης επιλεγμένων γονιδίων (ag) που αποκαλύφθηκαν με ποσοτική PCR. Οι αριθμοί 6, 12 και 24 αντιπροσωπεύουν ώρες μετά τον εμβολιασμό. Τα γονίδια LanDExH7 και LanTUB6 χρησιμοποιήθηκαν για ομαλοποίηση και το LanTUB6 χρησιμοποιήθηκε για βαθμονόμηση μεταξύ σειρών. Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση με βάση τρία βιολογικά αντίγραφα, καθένα από τα οποία είναι ο μέσος όρος τριών τεχνικών αντιγράφων. Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών στα επίπεδα έκφρασης μεταξύ των εμβολιασμένων φυτών (Colletotrichum lupini, στέλεχος Col-08, που ελήφθη το 1999 από το χωράφι με λούπινο στη Wierzenica της Πολωνίας) και των φυτών ελέγχου (ψευδοεμβολιασμένα) σημειώνεται πάνω από τα σημεία δεδομένων (*Τιμή P < 0,05, **Τιμή P ≤ 0,01, ***Τιμή P ≤ 0,001). Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών στα επίπεδα έκφρασης μεταξύ των εμβολιασμένων φυτών (Colletotrichum lupini, στέλεχος Col-08, που ελήφθη το 1999 από το χωράφι με λούπινο στη Wierzenica της Πολωνίας) και των φυτών ελέγχου (ψευδοεμβολιασμένα) σημειώνεται πάνω από τα σημεία δεδομένων (*Τιμή P < 0,05, **Τιμή P ≤ 0,01, ***Τιμή P ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, poluchen το 1999 γ. со поля люпина в Верженице, Польша) και ελέγχεται точками данных (*σημασία P < 0,05, **σημασία P ≤ 0,01, ***σημασία P ≤ 0,001). Στατιστικά σημαντικές διαφορές στα επίπεδα έκφρασης μεταξύ των εμβολιασμένων (Colletotrichum lupini, στέλεχος Col-08, που ελήφθη το 1999 από χωράφι με λούπινο στο Wierzhenice της Πολωνίας) και των φυτών ελέγχου (ψευδοεμβολιασμένα) σημειώνονται πάνω από τα σημεία δεδομένων (*Τιμή P < 0,05, **Τιμή P ≤ 0,01, ***Τιμή P ≤ 0,001).接种 (Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在敼数0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对煎） 和 对煎）之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***0P. Статистически расте значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный со полей люпина во Верженице, Πολωνία, το 1999 г.) отмечены над точкими данных (* σημασία P < 0,05, ** P-σημασία ≤ 0,01, ***P-σημασία ≤ 0,001). Στατιστικά σημαντικές διαφορές στα επίπεδα έκφρασης μεταξύ των εμβολιασμένων (Colletotrichum lupini, στέλεχος Col-08, που ελήφθη από χωράφια λούπινου στο Verzhenice της Πολωνίας, το 1999) και των φυτών ελέγχου (ψευδοεμβολιασμένα) σημειώνονται πάνω από τα σημεία δεδομένων (*Τιμή P < 0,05, **Τιμή P ≤ 0,01, ***Τιμή P ≤ 0,001).Οι σειρές NLL που αναλύθηκαν ήταν: 83A:476 (ανθεκτική, φέρουσα το ομόζυγο αλληλόμορφο Lanr1), Mandelup (μέτρια ανθεκτική, φέρουσα το ομόζυγο αλληλόμορφο AnMan), Boregine (ανθεκτική, άγνωστο γενετικό υπόβαθρο) και πληθυσμός 22660 (ευαίσθητος).
Το υποψήφιο γονίδιο TanjilG_05042 στον τόπο Lanr1 έδειξε ένα σημαντικά διαφορετικό πρότυπο έκφρασης από τα προφίλ που ελήφθησαν από μελέτες RNA-seq (Εικ. 6ε). Σημαντική ενεργοποίηση αυτού του γονιδίου παρατηρήθηκε στον Mandelup και στον πληθυσμό 22660 (έως 39,7 και 11,7 φορές αντίστοιχα), με αποτέλεσμα σχετικά υψηλά επίπεδα έκφρασης (έως 1,4 ± 0,14 και 7,2 ± 1,3 αντίστοιχα). Το 83A:476 αποκάλυψε επίσης κάποια ανοδική ρύθμιση του γονιδίου TanjilG_05042 (έως 3,8 φορές), ωστόσο, τα σχετικά επίπεδα έκφρασης που επιτεύχθηκαν (0,044 ± 0,002) ήταν περισσότερο από 30 φορές χαμηλότερα από αυτά που παρατηρήθηκαν στον Mandelup και στον πληθυσμό 22660. Η ανάλυση με qPCR έδειξε σημαντικές διαφορές στα επίπεδα έκφρασης μεταξύ των γονότυπων σε ψευδοεμβολιασμένες (μάρτυρες) παραλλαγές, φτάνοντας σε 58πλάσια διαφορά μεταξύ των πληθυσμών 22660 και 83A:476, καθώς και μεταξύ των πληθυσμών 22660 και 22660. Επιτεύχθηκε διπλάσια διαφορά μεταξύ του Boregine και του Mandalup.
Το υποψήφιο γονίδιο στον τόπο AnMan, TanjilG_12861, ενεργοποιήθηκε σε απόκριση στον εμβολιασμό στα 83A:476 και Mandelup, ήταν ουδέτερο στον πληθυσμό 22660 και υπορυθμίστηκε στο Boregine (Εικ. 6f). Η σχετική έκφραση του γονιδίου TanjilG_12861 ήταν η υψηλότερη στο εμβολιασμένο 83A:476 (0,14±0,01). Το γονίδιο πρωτεΐνης θερμικού σοκ τάξης Ι TanjilG_05080 HSP17.4 με μέγεθος 17,4 kDa έδειξε χαμηλότερα σχετικά επίπεδα έκφρασης σε όλα τα μελετηθέντα στελέχη και χρονικά σημεία (Εικ. 6g). Η υψηλότερη τιμή παρατηρήθηκε στα 24 HPI στον πληθυσμό 22660 (0,14 ± 0,02, μια οκταπλάσια αύξηση στην απόκριση στον εμβολιασμό).
Η σύγκριση των προφίλ γονιδιακής έκφρασης (Εικ. 7) αποκάλυψε υψηλή συσχέτιση μεταξύ του TanjilG_10657 και τεσσάρων άλλων γονιδίων: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) και TanjilG_04706 (r = 0,79). Τέτοια αποτελέσματα μπορεί να υποδηλώνουν συρρύθμιση αυτών των γονιδίων κατά τη διάρκεια αμυντικών αποκρίσεων. Τα γονίδια TanjilG_12861 και TanjilG_23384 έδειξαν διαφορετικά προφίλ έκφρασης με χαμηλότερες τιμές συντελεστή συσχέτισης Pearson (από 0,08 έως 0,43 και -0,19 έως 0,28, αντίστοιχα) σε σύγκριση με άλλα γονίδια.
Οι συσχετίσεις μεταξύ των προφίλ γονιδιακής έκφρασης ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR. Αναλύθηκαν οι ακόλουθες σειρές στενόφυλλου λούπινου: 83A:476 (ανθεκτική, που φέρει το ομόζυγο αλληλόμορφο Lanr1), Mandelup (μέτρια ανθεκτική, που φέρει το ομόζυγο αλληλόμορφο AnMan), Boregine (ανθεκτική, άγνωστο γενετικό υπόβαθρο) και Πληθυσμός 22660 (ευαίσθητος). Υπολογίστηκαν τρία χρονικά σημεία (6, 12 και 24 ώρες μετά τον εμβολιασμό), συμπεριλαμβανομένων των εμβολιασμένων (Colletotrichum lupini, στέλεχος Col-08, που ελήφθη από χωράφια λούπινου στο Wierzhenice της Πολωνίας, το 1999) και των φυτών ελέγχου (ψευδοεμβολιασμένα). Η κλίμακα δείχνει την τιμή του συντελεστή συσχέτισης Pearson.
Με βάση τα δεδομένα που ελήφθησαν με ισχύ 6 ίππων ανά ίντσα, πραγματοποιήθηκε WGCNA σε 9981 DEG που ταυτοποιήθηκε συγκρίνοντας τα εμβολιασμένα φυτά και τα φυτά ελέγχου για να επικεντρωθεί στις πρώιμες αμυντικές αποκρίσεις (Συμπληρωματικός Πίνακας S12). Βρέθηκαν είκοσι δύο γονιδιακές μονάδες (συστάδες) με συσχετισμένα (θετικά ή αρνητικά) προφίλ έκφρασης μεταξύ γονότυπων και πειραματικών παραλλαγών. Κατά μέσο όρο, τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης ήταν φθίνουσας τάξης 83A:476 > Mandelup > Boregine > Πληθυσμός 22660 (και στις δύο παραλλαγές, ωστόσο, αυτή η τάση ήταν ισχυρότερη στα φυτά ελέγχου). Κατά μέσο όρο, τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης ήταν φθίνουσας τάξης 83A:476 > Mandelup > Boregine > Πληθυσμός 22660 (και στις δύο παραλλαγές, ωστόσο, αυτή η τάση ήταν ισχυρότερη στα φυτά ελέγχου). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Πληθυσμός 22660 (в обоих варијантах, однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). Κατά μέσο όρο, τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης μειώθηκαν κατά σειρά 83A:476 > Mandelup > Boregine > Πληθυσμός 22660 (και στις δύο παραλλαγές, ωστόσο, αυτή η τάση ήταν ισχυρότερη στα φυτά ελέγχου).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Πληθυσμός 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> πληθυσμός 22660 的 顺序 下降 （， 下降 （， 圸在 在 植物 中 更）…..…………………………………… В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Πληθυσμός 22660 (однако в обоих варијантах эта тенденция была сильнее у контрольных растений). Κατά μέσο όρο, τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης μειώθηκαν στη σειρά 83A:476 > Mandelup > Boregine > Πληθυσμός 22660 (ωστόσο, και στις δύο παραλλαγές, αυτή η τάση ήταν ισχυρότερη στα φυτά ελέγχου).Ο εμβολιασμός είχε ως αποτέλεσμα την ανοδική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, ειδικά στις ενότητες 18, 19, 14, 6 και 1 (κατά φθίνουσα σειρά επίδρασης), αρνητική ρύθμιση (π.χ. ενότητες 9 και 20) ή με ουδέτερες επιδράσεις (π.χ. ενότητες 11, 22, 8 και 13). Η ανάλυση εμπλουτισμού όρων GO (Συμπληρωματικός Πίνακας S13) αποκάλυψε "GO: 0006952 Προστατευτικές αποκρίσεις" για την εμβολιασμένη ενότητα (18) με μέγιστη ενεργοποίηση, συμπεριλαμβανομένων γονιδίων που αναλύθηκαν με qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 και TanjilG_27015), καθώς και πολλές ενότητες φωτοσύνθεσης με την μεγαλύτερη καταστολή εμβολιασμού (9). Ο συμπυκνωτής της ενότητας 18 (Εικ. 8) ταυτοποιήθηκε ως το γονίδιο TanjilG_26536 που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη LlR18B τύπου PR-10, και ο συμπυκνωτής της ενότητας 9 ταυτοποιήθηκε ως το γονίδιο TanjilG_28955 που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη PsbQ του φωτοσυστήματος II. Ένα υποψήφιο γονίδιο αντοχής στην ανθρακνόζη Lanr1, TanjilG_05042, βρέθηκε στην ενότητα 22 (Εικ. 9) και σχετίζεται με τους όρους «GO:0044260 Κυτταρικές μακρομοριακές μεταβολικές διεργασίες» και «GO:0006355 Ρύθμιση μεταγραφής, καθιέρωση DNA» που φέρει τον κόμβο TanjilG_01212. Το γονίδιο κωδικοποιεί τον παράγοντα μεταγραφής θερμικού στρες A-4a (HSFA4a).
Σταθμισμένη ανάλυση δικτύου της γονιδιακής συνέκφρασης μονάδων με υπερεκπροσωπούμενους όρους βιολογικής διεργασίας "GO: 0006952 Αμυντικές αποκρίσεις". Η σύνδεση απλοποιήθηκε για να επισημανθούν τα τέσσερα γονίδια που αναλύθηκαν με qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 και TanjilG_27015).
Σταθμισμένη ανάλυση δικτύου της γονιδιακής συνέκφρασης μιας ενότητας με έναν υπερεκπροσωπούμενο όρο βιολογικής διεργασίας "GO: 0006355: Μεταγραφική ρύθμιση, πρότυπο DNA" και που φέρει ένα υποψήφιο γονίδιο αντοχής στην ανθρακνόζη Lanr1 TanjilG_05042. Η σύνδεση απλοποιήθηκε για την απομόνωση του γονιδίου TanjilG_05042 και του κεντρικού γονιδίου TanjilG_01212.
Ο έλεγχος αντοχής στην ανθρακνόζη που συλλέχθηκε στην Αυστραλία έδειξε ότι οι περισσότερες από τις πρώιμα απελευθερωμένες ποικιλίες ήταν ευαίσθητες. Οι Kalya, Coromup και Mandelup έχουν περιγραφεί ως μέτρια ανθεκτικές, ενώ οι Wonga, Tanjil και 83A:476 έχουν περιγραφεί ως εξαιρετικά ανθεκτικές26,27,31. είχαν το ίδιο αλληλόμορφο αντοχής, που ονομάζεται Lanr1, και οι Coromup και Mandelup είχαν διαφορετικό αλληλόμορφο, που ονομάζεται AnMan10,26,39, ενώ η Kalya μετέδωσε διαφορετικό αλληλόμορφο, Lanr2. Ο έλεγχος για αντοχή στην ανθρακνόζη στη Γερμανία είχε ως αποτέλεσμα την αναγνώριση μιας ανθεκτικής σειράς Bo7212 με ένα υποψήφιο αλληλόμορφο διαφορετικό από το Lanr1, που ονομάζεται LanrBo36.
Η μελέτη μας αποκάλυψε πολύ χαμηλή συχνότητα (περίπου 6%) του αλληλόμορφου Lanr1 στο εξεταζόμενο γενετικό υλικό. Αυτή η παρατήρηση είναι σύμφωνη με τα αποτελέσματα της διαλογής γενετικού υλικού της Ανατολικής Ευρώπης χρησιμοποιώντας τους δείκτες Anseq3 και Anseq4, τα οποία έδειξαν ότι το αλληλόμορφο Lanr1 υπάρχει μόνο σε δύο λευκορωσικές σειρές. Αυτό υποδηλώνει ότι το αλληλόμορφο Lanr1 δεν χρησιμοποιείται ακόμη ευρέως από τοπικά προγράμματα αναπαραγωγής, σε αντίθεση με την Αυστραλία, όπου είναι ένα από τα βασικά αλληλόμορφα για αναπαραγωγή με υποβοήθηση δεικτών. Αυτό μπορεί να οφείλεται στο χαμηλότερο επίπεδο αντοχής που παρέχει το αλληλόμορφο Lanr1 σε ευρωπαϊκές συνθήκες πεδίου σε σύγκριση με την αυστραλιανή έκθεση. Επιπλέον, μελέτες για την ανθράκωση σε περιοχές με υψηλές βροχοπτώσεις στην Αυστραλία έχουν δείξει ότι οι αντιδράσεις αντοχής που προκαλούνται από το αλληλόμορφο Lanr1 μπορεί να μην είναι αποτελεσματικές σε καιρικές συνθήκες που ευνοούν την ανάπτυξη και την ταχεία ανάπτυξη του παθογόνου19,42. Στην πραγματικότητα, στην παρούσα μελέτη, ορισμένα συμπτώματα ανθράκωσης παρατηρήθηκαν επίσης σε γονότυπους που φέρουν το αλληλόμορφο Lanr1, υποδηλώνοντας ότι η αντοχή μπορεί να εξαφανιστεί υπό βέλτιστες συνθήκες για την ανάπτυξη του C. lupini. Επιπλέον, είναι πιθανές ψευδώς θετικές ερμηνείες της παρουσίας δεικτών Anseq3 και Anseq4, οι οποίοι απέχουν περίπου 1 cM από τον τόπο Lanr1 28,30,43.
Η μελέτη μας έδειξε ότι το 83A:476, που φέρει το αλληλόμορφο Lanr1, ανταποκρίθηκε στον εμβολιασμό με C. lupini με επαναπρογραμματισμό μεταγραφώματος μεγάλης κλίμακας στο πρώτο χρονικό σημείο που αναλύθηκε (6 hpi), ενώ στο Mandelup, που φέρει το αλληλόμορφο AnMan, οι μεταγραφικές αποκρίσεις παρατηρήθηκαν πολύ αργότερα (από 24 έως 48 hp). Αυτές οι χρονικές διακυμάνσεις στις αμυντικές αποκρίσεις σχετίζονται με διαφορές στα συμπτώματα της νόσου, υπογραμμίζοντας τη σημασία της έγκαιρης αναγνώρισης παθογόνων για μια επιτυχημένη απόκριση στην αντοχή. Για να μολύνουν τον φυτικό ιστό, τα σπόρια του άνθρακα πρέπει να περάσουν από διάφορα αναπτυξιακά στάδια στην επιφάνεια του ξενιστή, συμπεριλαμβανομένης της βλάστησης, της κυτταρικής διαίρεσης και του σχηματισμού ενός appressorium. Ένα προσάρτημα είναι μια μολυσματική δομή που προσκολλάται στην επιφάνεια του ξενιστή και διευκολύνει τη διείσδυση στους ιστούς του ξενιστή. Έτσι, τα σπόρια του C. gloeosporioides σε εκχύλισμα μπιζελιού εμφάνισαν την πρώτη διαίρεση του πυρήνα μετά από 75-90 λεπτά επώασης, τον σχηματισμό ενός βλαστικού σωλήνα μετά από 90-120 λεπτά και την καταστολή μετά από 4 ώρες 45. Το μάνγκο C. gloeosporioides έδειξε περισσότερο από 40% βλάστηση κονιδίων μετά από 3 ώρες επώασης και περίπου 20% σχηματισμό καταστολέων μετά από 4 ώρες. Το γονίδιο CAP20 του C. gloeosporioides που σχετίζεται με τη λοιμογόνο δράση έδειξε μεταγραφική δραστηριότητα σε κονίδια που σχηματίζουν επίφυτα μετά από 3,5 ώρες επώασης σε επιφανειακό κερί αβοκάντο με υψηλές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης CAP20 μετά από 4 ώρες και 46 λεπτά. Ομοίως, η δραστηριότητα των γονιδίων βιοσύνθεσης μελανίνης στο C. trifolii προκλήθηκε κατά τη διάρκεια επώασης 2 ωρών, ακολουθούμενη από τον σχηματισμό ενός καταστολέα μετά από 1 ώρα. Μελέτες ιστών φύλλων έχουν δείξει ότι οι φράουλες που εμβολιάστηκαν με C. acutatum έχουν πρώτη καταστολή στα 8 hpi, ενώ οι ντομάτες που εμβολιάστηκαν με C. coccodes έχουν πρώτη καταστολή στα 4 hpi48,49. Αυτό σε μεγάλο βαθμό συνάδει με τη χρονική κλίμακα της μολυσματικής διαδικασίας του Colletotrichum spp. Οι ταχείες αμυντικές αποκρίσεις στο 83A:476 υποδηλώνουν τη συμμετοχή γονιδίων ανθεκτικότητας των φυτών και ανοσίας που πυροδοτείται από τελεστές (ETI) σε αυτή τη σειρά, ενώ οι καθυστερημένες αποκρίσεις του Mandelup υποστηρίζουν την υπόθεση της μικρο-σχετιζόμενης ανοσίας που πυροδοτείται από μοριακά πρότυπα (MTI) 50. Πρώιμες αποκρίσεις στο 83A:476 και το Mandelup. Η μερική επικάλυψη μεταξύ γονιδίων που ρυθμίζονται προς τα πάνω ή προς τα κάτω στην καθυστερημένη απόκριση υποστηρίζει επίσης αυτή την έννοια, καθώς το ETI συχνά θεωρείται ως μια επιταχυνόμενη και ενισχυμένη απόκριση MTI που κορυφώνεται με προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο στο σημείο της μόλυνσης, γνωστό ως αναφυλακτικό σοκ 51,52.
Τα περισσότερα από τα γονίδια που αποδίδονται στον υπερεκπροσωπούμενο όρο Gene Ontology GO:0006952 «Απόκριση Άμυνας» είναι τα 11 ομόλογα της πρωτεΐνης μηνύματος νηστείας που προκαλείται από στρες 22 (παρόμοια με την SAM22) και των επτά κύριων πρωτεϊνών-likes latex (MLPs). Οι πρωτεΐνες 31, 34, 43 και 423 έδειξαν ομοιότητα αλληλουχίας. Τα γονίδια που μοιάζουν με SAM22 έδειξαν σημαντική ενεργοποίηση που διήρκεσε περισσότερο, δείχνοντας αυξημένα επίπεδα αντοχής στην ανθρακνόζη (83A:476 και Boregine). Ωστόσο, τα γονίδια που μοιάζουν με MLP υποεκφράστηκαν μόνο σε σειρές που φέρουν το υποψήφιο αλληλόμορφο αντοχής (83A:476/Lanr1 στα 6 hpi και Mandelup/AnMan στα 24 hpi). Πρέπει να σημειωθεί ότι όλα τα ταυτοποιημένα ομόλογα που μοιάζουν με SAM22 προέρχονται από μια συστάδα γονιδίων που εκτείνεται σε περίπου 105 kb, ενώ τα γονίδια που μοιάζουν με MLP προέρχονται από ξεχωριστές περιοχές του γονιδιώματος. Συντονισμένη ενεργοποίηση τέτοιων γονιδίων τύπου SAM22 βρέθηκε επίσης σε προηγούμενη μελέτη μας για την αντοχή των μη λευκών λεμφαδένων (NLL) στον εμβολιασμό με Diaporthetoxica, γεγονός που υποδηλώνει ότι εμπλέκονται στα οριζόντια συστατικά της αμυντικής απόκρισης. Αυτό το συμπέρασμα υποστηρίζεται επίσης από αναφορές για θετική απόκριση γονιδίων τύπου SAM22 σε τραυματισμό ή θεραπεία με σαλικυλικό οξύ, μυκητιακούς επαγωγείς ή υπεροξείδιο του υδρογόνου.
Έχει αποδειχθεί ότι τα γονίδια τύπου MLP ανταποκρίνονται σε διάφορες αβιοτικές και βιοτικές πιέσεις, συμπεριλαμβανομένων βακτηριακών, ιικών και παθογόνων μυκητιασικών λοιμώξεων σε πολλά φυτικά είδη55. Οι κατευθύνσεις απόκρισης σε ορισμένες αλληλεπιδράσεις μεταξύ φυτών και παθογόνων κυμαίνονταν από έντονη αύξηση (δηλαδή, κατά τη διάρκεια της προσβολής του βαμβακιού με Verticillium dahliae) έως σημαντική μείωση (δηλαδή, μετά από μόλυνση της μηλιάς με Alternaria spp.)56,57. Σημαντική μείωση της ρύθμισης του γονιδίου 423 τύπου MLP έχει παρατηρηθεί κατά τη διάρκεια της άμυνας του αβοκάντο στη μόλυνση από F. niger και κατά τη διάρκεια της μόλυνσης της μηλιάς. Τα Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola και Alternaria alternata είναι παθότυποι μήλου58,59. Επιπλέον, οι κάλοι των μήλων που υπερεκφράζουν το γονίδιο 423 τύπου MLP είχαν χαμηλότερη έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την ανθεκτικότητα και ήταν πιο ευάλωτοι σε μυκητιασικές λοιμώξεις59. Μετά το Fusarium oxysporum f, το γονίδιο 423 τύπου MLP καταστάλθηκε επίσης στο ανθεκτικό γενετικό υλικό του κοινού φασολιού. cn. Μόλυνση από φασόλια 60.
Άλλα μέλη της οικογένειας PR-10 που εντοπίστηκαν στη μελέτη RNA-seq μας ήταν τα γονίδια LlR18A και LlR18B σε απόκριση στην ανοδική ρύθμιση, καθώς και το ανοδικά ρυθμισμένο (1 γονίδιο) ή κατωτερικά ρυθμισμένο (3 γονίδια) γονίδιο για την πρωτεΐνη μεταφοράς λιπιδίων DIR1. Επιπλέον, το WGCNA αναδεικνύει το γονίδιο LlR18B ως κόμβο σε αυτήν την ενότητα, η οποία είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη στον εμβολιασμό και φέρει πολλά γονίδια προστατευτικής απόκρισης. Τα γονίδια LlR18A και LlR18B επήχθησαν σε κίτρινα φύλλα λούπινου σε απόκριση σε παθογόνα βακτήρια, καθώς και σε στελέχη NLL μετά από εμβολιασμό με D. toxica, ενώ το ομόλογο ρυζιού αυτών των γονιδίων, RSOsPR10, επήχθη ταχέως από μια μυκητιασική λοίμωξη που πιθανώς εμπλέκεται στην οδό σηματοδότησης του ιασμονικού οξέος53,61, 62. Το γονίδιο DIR1 κωδικοποιεί μη ειδικές πρωτεΐνες μεταφοράς λιπιδίων που απαιτούνται για την έναρξη συστηματικής επίκτητης αντοχής (SAR). Με την ανάπτυξη προστατευτικών αντιδράσεων, η πρωτεΐνη DIR1 μεταφέρεται από την εστία της μόλυνσης μέσω του φλοιώματος για να προκαλέσει SAR σε απομακρυσμένα όργανα. Είναι ενδιαφέρον ότι το γονίδιο TanjilG_02313 DIR1 επήχθη σημαντικά στο πρώτο χρονικό σημείο στις σειρές 84A:476 και στον Πληθυσμό 22660, αλλά η αντοχή στην ανθρακνόζη αναπτύχθηκε με επιτυχία μόνο στη σειρά 84A:476. Αυτό μπορεί να υποδηλώνει κάποια υπολειτουργικοποίηση του γονιδίου DIR1 στο NLL, καθώς τα υπόλοιπα τρία ομόλογα ανταποκρίθηκαν στον εμβολιασμό μόνο στη σειρά 83A:476 στα 6 hpi, και αυτή η απόκριση κατευθύνθηκε προς τα κάτω.
Στη μελέτη μας, τα πιο συνηθισμένα συστατικά που αντιστοιχούν στη βιολογική διαδικασία που ονομάζεται «διαδικασία οξειδοαναγωγής GO:0055114» ήταν η πρωτεΐνη κυτοχρώματος P450, η υπεροξειδάση, η 9S-/13S-λιποξυγενάση του λινολεϊκού οξέος και η οξειδάση του 1-αμινοκυκλοπροπανίου-1-καρβοξυλικού οξέος. Επιπλέον, το WGCNA μας ορίζει το ομόλογο HSFA4a ως έναν κόμβο που φέρει μονάδες όπως το υποψήφιο γονίδιο αντοχής Lanr1 TanjilG_05042. Το HSFA4a είναι ένα συστατικό της οξειδοαναγωγικά εξαρτώμενης ρύθμισης της πυρηνικής μεταγραφής στα φυτά.
Οι πρωτεΐνες του κυτοχρώματος P450 είναι οξειδοαναγωγάσες που καταλύουν αντιδράσεις υδροξυλίωσης NADPH και/ή O2-εξαρτώμενες στον πρωτογενή και δευτερογενή μεταβολισμό, συμπεριλαμβανομένου του μεταβολισμού των ξενοβιοτικών, καθώς και των ορμονών, των λιπαρών οξέων, των στερολών, των συστατικών του κυτταρικού τοιχώματος, των βιοπολυμερών και της βιοσύνθεσης προστατευτικών ενώσεων 69. Σε μια μελέτη μας, η μεταβλητότητα στη λειτουργία του φυτικού κυτοχρώματος P450 μειώθηκε από -10,6 log2 (αλλαγή φορές) σε 5,7 λόγω μεγάλου αριθμού τροποποιημένων ομολόγων (37) και διαφορών στα πρότυπα απόκρισης μεταξύ συγκεκριμένων γονιδίων, αντανακλώντας μια ανοδική αναθεώρηση. Η χρήση μόνο δεδομένων RNA-seq για την αποσαφήνιση της πιθανής βιολογικής λειτουργίας των γονιδίων NLL σε μια τόσο μεγάλη υπεροικογένεια πρωτεϊνών θα ήταν εξαιρετικά εικασία. Ωστόσο, αξίζει να σημειωθεί ότι ορισμένα γονίδια του κυτοχρώματος P450 σχετίζονται με αυξημένη αντοχή σε παθογόνους μύκητες ή βακτήρια, συμπεριλαμβανομένης μιας συμβολής σε αλλεργικές αντιδράσεις 69,70,71.
Οι υπεροξειδάσες κατηγορίας III είναι πολυλειτουργικά φυτικά ένζυμα που εμπλέκονται σε ένα ευρύ φάσμα μεταβολικών διεργασιών κατά την ανάπτυξη και εξέλιξη των φυτών, καθώς και σε απόκριση σε περιβαλλοντικές πιέσεις όπως η αλατότητα, η ξηρασία, η υψηλή ένταση φωτός και η προσβολή από παθογόνα72. Οι υπεροξειδάσες εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση αρκετών φυτικών ειδών με τον Anthracis, συμπεριλαμβανομένων των Stylosanthes humilis και C. gloeosporioides, Lens culinaris και C. truncatum, Phaseolus vulgaris και C. lindemuthianum, Cucumis sativus και C. lagenarium73,74,75,76. Η απόκριση είναι πολύ γρήγορη, μερικές φορές ακόμη και στα 4 HPI, πριν ο μύκητας διεισδύσει στον φυτικό ιστό73. Το γονίδιο της υπεροξειδάσης ανταποκρίθηκε επίσης στον εμβολιασμό με D. toxica NLL. Εκτός από τις τυπικές λειτουργίες τους για τη ρύθμιση της οξειδωτικής έκρηξης ή την εξάλειψη του οξειδωτικού στρες, οι υπεροξειδάσες μπορούν να επηρεάσουν την ανάπτυξη παθογόνων δημιουργώντας φυσικά φράγματα που βασίζονται στην ενίσχυση του κυτταρικού τοιχώματος κατά τη διάρκεια της λιγνιτοποίησης, της υπομονάδας ή της διασταυρούμενης σύνδεσης συγκεκριμένων ενώσεων. Αυτή η λειτουργία μπορεί να αποδοθεί in silico στο γονίδιο TanjilG_03329 που κωδικοποιεί μια πιθανή υπεροξειδάση ανιόντων που σχηματίζει λιγνίνη, η οποία αυξήθηκε σημαντικά στη μελέτη μας στην ανθεκτική γραμμή 83A:476 στα 6 HPI, αλλά όχι σε άλλα στελέχη και χρονικά σημεία που δεν ανταποκρίθηκαν.
Η 9S-/13S-λιποξυγενάση του λινολεϊκού οξέος είναι το πρώτο βήμα στην οξειδωτική οδό της βιοσύνθεσης λιπιδίων78. Τα προϊόντα αυτής της οδού έχουν πολλαπλές λειτουργίες στην άμυνα των φυτών, συμπεριλαμβανομένης της ενίσχυσης του κυτταρικού τοιχώματος μέσω του σχηματισμού αποθέσεων καλλόζης και πηκτίνης, και της ρύθμισης του οξειδωτικού στρες μέσω της παραγωγής δραστικών ειδών οξυγόνου79,80,81,82,83. Στην παρούσα μελέτη, η έκφραση της 9S-/13S-λιποξυγενάσης του λινολεϊκού οξέος μεταβλήθηκε σε όλα τα στελέχη, αλλά στον ευαίσθητο πληθυσμό 22660, επικράτησε ανοδική ρύθμιση σε διαφορετικά χρονικά σημεία, ενώ σε στελέχη που φέρουν ανθεκτικό Lanr1 και το αλληλόμορφο AnMan, δίνει έμφαση στη διαφοροποίηση του στρώματος οξυλιπίνης σε προστατευτικές αντιδράσεις άνθρακα μεταξύ αυτών των γονότυπων.
Το ομόλογο της 1-αμινοκυκλοπροπανο-1-καρβοξυλικής οξειδάσης (ACO) ήταν σημαντικά ανοδικά (9 γονίδια) ή κατωτερικά (2 γονίδια) όταν εμβολιάστηκε με λούπινο. Με δύο εξαιρέσεις, όλες αυτές οι αποκρίσεις εμφανίστηκαν στα 6 hp στο 83A:476. Η ενζυμική αντίδραση που προκαλείται από τις πρωτεΐνες ACO είναι το βήμα που περιορίζει τον ρυθμό στην παραγωγή αιθυλενίου και επομένως ρυθμίζεται σε μεγάλο βαθμό84. Το αιθυλένιο είναι μια φυτική ορμόνη που παίζει ποικίλους ρόλους στη ρύθμιση της ανάπτυξης των φυτών και στην απόκριση σε αβιοτικές και βιοτικές συνθήκες στρες. Η επαγωγή της μεταγραφής του ACO και η ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης του αιθυλενίου εμπλέκονται στην αύξηση της αντοχής του ρυζιού στον ημιβιοτροφικό μύκητα oryzae oryzae ρυθμίζοντας την παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου και φυτοαλεξινών. Μια πολύ παρόμοια διαδικασία μόλυνσης των φύλλων που παρατηρήθηκε μεταξύ των M. oryzae και C. lupini88,89, στο πλαίσιο μιας σημαντικής ανοδικής ρύθμισης των ομολόγων ACO στη σειρά 83A:476 που αναφέρθηκε σε αυτή τη μελέτη, μεταθέτει την πιθανότητα να προσδοθεί αντοχή στην ανθρακνόζη NLL. Το αιθυλένιο είναι ένα κεντρικό βήμα σηματοδότησης στις μοριακές οδούς.
Στην παρούσα μελέτη, παρατηρήθηκε μεγάλης κλίμακας καταστολή πολλών γονιδίων που σχετίζονται με τη φωτοσύνθεση στα 6 hpi στο 83A:476 και στα 48 hpi στο Mandeloop και στον πληθυσμό 22660. Η έκταση και η εξέλιξη αυτών των αλλαγών είναι ανάλογες με το επίπεδο. Σε αυτό το πείραμα παρατηρήθηκε αντοχή στην ανθρακνόζη. Πρόσφατα, έχει αναφερθεί ισχυρή και πρώιμη καταστολή μεταγραφών που σχετίζονται με τη φωτοσύνθεση σε διάφορα μοντέλα αλληλεπιδράσεων φυτού-παθογόνου, συμπεριλαμβανομένων παθογόνων βακτηρίων και μυκήτων. Η βιασύνη (από 2 HPI σε ορισμένες αλληλεπιδράσεις) και η συνολική καταστολή γονιδίων που σχετίζονται με τη φωτοσύνθεση σε απόκριση σε μόλυνση μπορεί να πυροδοτήσει την ανοσία των φυτών με βάση την ανάπτυξη δραστικών ειδών οξυγόνου και την αλληλεπίδρασή τους με την οδό του σαλικυλικού οξέος για τη μεσολάβηση αλλεργικών αντιδράσεων 90,94.
Συμπερασματικά, οι μηχανισμοί αμυντικής απόκρισης που προτείνονται για την πιο ανθεκτική γενεαλογία (83A:476) περιλαμβάνουν την ταχεία αναγνώριση παθογόνων από το γονίδιο R (πιθανώς TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) και την αλλεργική απόκριση μέσω σηματοδότησης σαλικυλικού οξέος και αιθυλενίου, ακολουθούμενη από την καθιέρωση μακροχρόνιας δράσης SAR. Η δράση υποστηρίζεται από την πρωτεΐνη DIR-1. Πρέπει να σημειωθεί ότι η βιοτροφική περίοδος για τη μόλυνση από C. lupini είναι πολύ σύντομη (περίπου 2 ημέρες), ακολουθούμενη από νεκρωτική ανάπτυξη95. Η μετάβαση μεταξύ αυτών των σταδίων μπορεί να σχετίζεται με νέκρωση και έκφραση πρωτεϊνών που επάγονται από αιθυλένιο και δρουν ως εναύσματα για αντιδράσεις υπερευαισθησίας στα φυτά ξενιστές. Επομένως, το χρονικό παράθυρο για την επιτυχή σύλληψη του C. lupini στο βιοτροφικό στάδιο είναι πολύ στενό. Ο επαναπρογραμματισμός των γονιδίων που σχετίζονται με την οξειδοαναγωγή και τη φωτοσύνθεση που παρατηρείται στο 83A:476 στα 6 hpi είναι συνεπής με την εξέλιξη των μυκητιακών υφών και προαναγγέλλει την ανάπτυξη μιας επιτυχούς προστατευτικής απόκρισης στο βιοτροφικό στάδιο. Οι μεταγραφικές αποκρίσεις του Mandelup και του πληθυσμού 22660 μπορεί να καθυστερήσουν πολύ για να συλλάβουν τον μύκητα πριν μεταβούν σε νεκρωτική ανάπτυξη, ωστόσο, το Mandelup μπορεί να είναι πιο αποτελεσματικό από τον πληθυσμό 22660 επειδή η σχετικά γρήγορη ρύθμιση της πρωτεΐνης PR-10 προάγει την οριζόντια αντίσταση.
Η ETI, που καθοδηγείται από το κανονικό γονίδιο R, φαίνεται να είναι ένας κοινός μηχανισμός για την ανθεκτικότητα των φασολιών στην ανθρακνόζη. Έτσι, στο μοντέλο ψυχανθών Medicago truncatula, η ανθεκτικότητα στην ανθρακνόζη προσδίδεται από το γονίδιο RCT1, ένα μέλος της κατηγορίας γονιδίων R του φυτού TIR-NBS-LRR97. Αυτό το γονίδιο προσδίδει επίσης ανθεκτικότητα ευρέος φάσματος στην ανθρακνόζη στην μηδική όταν μεταφέρεται σε ευαίσθητα φυτά. Στο κοινό φασόλι (P. vulgaris), έχουν εντοπιστεί μέχρι σήμερα περισσότερες από δύο δωδεκάδες γονίδια ανθεκτικότητας στην ανθρακνόζη. Μερικά από αυτά τα γονίδια βρίσκονται σε περιοχές που δεν έχουν κανονικά γονίδια R, ωστόσο πολλά άλλα βρίσκονται στις άκρες των χρωμοσωμάτων που φέρουν τη συστάδα γονιδίων NBS-LRR, συμπεριλαμβανομένων των TIR-NBS-LRRs99. Η μελέτη SSR σε ολόκληρο το γονιδίωμα επιβεβαίωσε επίσης τη συσχέτιση του γονιδίου NBS-LRR με την ανθεκτικότητα στην ανθρακνόζη στο κοινό φασόλι. Το κανονικό γονίδιο R βρέθηκε επίσης στην γονιδιωματική περιοχή που φέρει τον κύριο τόπο αντοχής στην ανθρακνόζη στο λευκό λούπινο 101.
Η εργασία μας δείχνει ότι μια άμεση αντίδραση αντοχής, που ενεργοποιείται σε πρώιμο στάδιο της μόλυνσης των φυτών (κατά προτίμηση όχι αργότερα από 12 hpi), προστατεύει αποτελεσματικά το στενόφυλλο λούπινο από την ανθρακνόζη που προκαλείται από τον παθογόνο μύκητα Collelotrichum lupini. Χρησιμοποιώντας αλληλούχιση υψηλής απόδοσης, καταδείξαμε διαφορικά προφίλ έκφρασης γονιδίων αντοχής στην ανθρακνόζη σε φυτά NLL που προκαλούνται από τα γονίδια αντοχής Lanr1 και AnMan. Η επιτυχής άμυνα περιλαμβάνει τον προσεκτικό σχεδιασμό των γονιδίων για πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην οξειδοαναγωγή, τη φωτοσύνθεση και την παθογένεση εντός ωρών από την πρώτη επαφή του φυτού με ένα παθογόνο. Παρόμοιες προστατευτικές αντιδράσεις, αλλά με χρονική καθυστέρηση, είναι πολύ λιγότερο αποτελεσματικές στην προστασία των φυτών από ασθένειες. Η αντοχή στον άνθρακα που προκαλείται από το γονίδιο Lanr1 μοιάζει με την τυπική ταχεία απόκριση του γονιδίου R (ανοσία που ενεργοποιείται από τον τελεστή), ενώ το γονίδιο AnMan πιθανότατα παρέχει μια οριζόντια απόκριση (ανοσία που ενεργοποιείται από ένα μοριακό πρότυπο που σχετίζεται με μικρόβια), παρέχοντας ένα μέτριο επίπεδο βιωσιμότητας.
Οι 215 γραμμές NLL που χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο δεικτών ανθρακνόζης αποτελούνταν από 74 ποικιλίες, 60 γραμμές που ελήφθησαν με διασταύρωση ή αναπαραγωγή, 5 μεταλλαγμένες ποικιλίες και 76 άγρια ​​ή πρωτότυπα γενετικά πλακίδια. Οι γραμμές προέρχονταν από 17 χώρες, κυρίως από την Πολωνία (58), την Ισπανία (47), τη Γερμανία (27), την Αυστραλία (26), τη Ρωσία (19), τη Λευκορωσία (7), την Ιταλία (5) και άλλες γραμμές από 10 χώρες. Το σύνολο περιλαμβάνει επίσης γραμμές αναφοράς ανθεκτικών: 83A:476, Tanjil, Wonga που φέρουν το αλληλόμορφο Lanr1 και Mandelup που φέρουν το αλληλόμορφο AnMan. Οι γραμμές ελήφθησαν από την Ευρωπαϊκή Βάση Δεδομένων Γενετικών Πόρων Λούπινου που διατηρείται από την Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Πολωνία (Συμπληρωματικός Πίνακας S1).
Τα φυτά αναπτύχθηκαν υπό ελεγχόμενες συνθήκες (φωτοπερίοδος 16 ώρες, θερμοκρασία 25°C κατά τη διάρκεια της ημέρας και 18°C ​​τη νύχτα). Αναλύθηκαν δύο βιολογικά αντίγραφα. Το DNA απομονώθηκε από φύλλα τριών εβδομάδων χρησιμοποιώντας το DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Γερμανία) σύμφωνα με το πρωτόκολλο. Η ποιότητα και η συγκέντρωση του απομονωμένου DNA αξιολογήθηκαν με φασματοφωτομετρικές μεθόδους (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ΗΠΑ). Αναλύθηκαν ο δείκτης AnManM1 που σηματοδοτεί το γονίδιο αντοχής στην ανθρακνόζη AnMan (προέρχεται από το cv. Mandelup) και οι δείκτες Anseq3 και Anseq4 που πλαισιώνουν το γονίδιο Lanr1 (προέρχεται από το cv. Tanjil). Οι ομοζυγώτες για το ανθεκτικό αλληλόμορφο βαθμολογήθηκαν με "1", οι ευαίσθητοι - με "0" και οι ετεροζυγώτες - με 0,5.
Με βάση τα αποτελέσματα της διαλογής για τους δείκτες AnManM1, AnSeq3 και AnSeq4 και τη διαθεσιμότητα σπόρων για τα τελικά πειράματα παρακολούθησης, επιλέχθηκαν 50 σειρές NLL για φαινοτυπική ανάλυση αντοχής στην ανθρακνόζη. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε εις διπλούν σε θερμοκήπιο ελεγχόμενο από υπολογιστή με φωτοπερίοδο 14 ωρών με εύρος θερμοκρασίας 22°C κατά τη διάρκεια της ημέρας και 19°C τη νύχτα. Οι σπόροι ξύνονται (κόβοντας το περίβλημα του σπόρου στην αντίθετη πλευρά του εμβρύου με μια κοφτερή λεπίδα) πριν από τη σπορά για να αποφευχθεί η αδράνεια του σπόρου λόγω της πολύ σκληρής του επικάλυψης και για να διασφαλιστεί η ομοιόμορφη βλάστηση. Τα φυτά αναπτύχθηκαν σε γλάστρες (11 × 11 × 21 cm) με αποστειρωμένο χώμα (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Βαρσοβία, Πολωνία). Ο εμβολιασμός πραγματοποιήθηκε με το στέλεχος Colletotrichum lupini Col-08, το οποίο αναπτύχθηκε το 1999 από τους μίσχους στενόφυλλων φυτών λούπινου που καλλιεργήθηκαν σε χωράφι στη Βερζενίτσα της Μεγάλης Πολωνίας (52° 27′ 42″ Β 17° 04′ 05″ Α). Λαμβάνεται μια περιοχή. Τα απομονωμένα στελέχη καλλιεργήθηκαν σε μέσο SNA στους 20° C υπό μαύρο φως για 21 ημέρες για την πρόκληση σποριογένεσης. Τέσσερις εβδομάδες μετά τη σπορά, όταν τα φυτά είχαν φτάσει στο στάδιο των 4-6 φύλλων, ο εμβολιασμός πραγματοποιήθηκε με ψεκασμό με εναιώρημα κονιδίων σε συγκέντρωση 0,5 x 106 κονίδια ανά ml. Μετά τον εμβολιασμό, τα φυτά διατηρήθηκαν στο σκοτάδι για 24 ώρες σε υγρασία περίπου 98% και θερμοκρασία 25°C για να διευκολυνθεί η βλάστηση των κονιδίων και η διαδικασία μόλυνσης. Στη συνέχεια, τα φυτά αναπτύχθηκαν υπό φωτοπερίοδο 14 ωρών στους 22°C ημέρας/19°C νύχτας και 70% υγρασία. Η βαθμολογία της νόσου έγινε 22 ημέρες μετά τον εμβολιασμό και κυμαινόταν από 0 (άνοσο) έως 9 (πολύ ευαίσθητο) ανάλογα με την παρουσία ή απουσία νεκρωτικών αλλοιώσεων σε μίσχους και φύλλα. Επιπλέον, μετά τη βαθμολόγηση, μετρήθηκε το βάρος των φυτών. Οι σχέσεις μεταξύ των γονότυπων δεικτών και των φαινοτύπων της νόσου υπολογίστηκαν ως συσχετίσεις σημείου δύο αλληλουχιών (απουσία ετερόζυγων δεικτών στο σύνολο των γραμμών για την ανάλυση του φαινοτύπου αντοχής στην ανθρακνόζη).