Ви благодариме што ја посетивте Nature.com. Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS. За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer). Во меѓувреме, за да обезбедиме континуирана поддршка, ќе ја прикажеме страницата без стилови и JavaScript.
Лупинот Angustifolius (NLL, Lupinus angustifolius L.) е мешункасто растение кое се користи за производство на храна и подобрување на почвата. Глобалната експанзија на NLL како култура привлече многу патогени габи, вклучувајќи ја и лупинската антракноза, која ја предизвикува разорната болест антракноза. Два алела, Lanr1 и AnMan, кои даваат зголемена отпорност, се користени во одгледувањето на NLL, но основните молекуларни механизми остануваат непознати. Во оваа студија, маркерите Lanr1 и AnMan беа користени за скрининг на европски примероци од NLL. Тестирањето на вакцината во контролирана средина ја потврди ефикасноста на двата резистентни донори. Диференцијално профилирање на генската експресија беше извршено на репрезентативни резистентни и осетливи линии. Отпорноста на антракноза беше поврзана со прекумерна експресија на термините за генска онтологија „GO:0006952 Одбранбен одговор“, „GO:0055114 Редокс процес“ и „GO:0015979 Фотосинтеза“. Покрај тоа, линијата Lanr1(83A:476) покажа значително брзо репрограмирање на транскриптомите по инокулацијата, додека другите линии покажаа доцнење во овој одговор за околу 42 часа. Одбранбените одговори се поврзани со гените TIR-NBS, CC-NBS-LRR и NBS-LRR, 10 протеини вклучени во патогенезата, протеини за трансфер на липиди, ендоглукан-1,3-β-глукозидаза, протеини на клеточниот ѕид богати со глицин и гени од реактивниот пат на кислород. Раните одговори на 83A:476, вклучувајќи внимателна супресија на гените поврзани со фотосинтезата, се совпаднаа со успешна заштита за време на фазата на вегетативен раст на габичната биологија, што сугерира дека ефекторот го активира имунитетот. Реакцијата Манделоп е забавена, како и целокупното хоризонтално влечење.
Теснолисниот лупин (NLL, Lupinus angustifolius L.) е високопротеинска житарка со потекло од западниот медитерански регион1,2. Моментално се одгледува како прехранбена култура за животни и луѓе. Исто така, се смета за зелено ѓубриво во системите за ротација на плодоред поради фиксацијата на азот од страна на симбиотски бактерии кои го фиксираат азотот и целокупното подобрување на структурата на почвата. NLL помина низ брз процес на припитомување во последниот век и сè уште е под висок притисок за размножување3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Со широкото одгледување на NLL, низата патогени габи разви нови земјоделски ниши и предизвика нови болести што ги уништуваат посевите. Највпечатливо за одгледувачите и одгледувачите на лупин беше појавата на антракноза, предизвикана од патогената габа Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Највпечатливо за одгледувачите и одгледувачите на лупин беше појавата на антракноза, предизвикана од патогената габа Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Најзначајно за одгледувачите и одгледувачите на лупин беше појавата на антракноза предизвикана од патогената габа Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是猱itopinrich (Бондар) Ниренберг, Фејлер и Хагедорн13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是猱itopinrich (Бондар) со коса. 1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Највпечатливо за одгледувачите и одгледувачите на лупин е појавата на антракноза предизвикана од патогената габа Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Најраните извештаи за болеста доаѓаат од Бразил и Соединетите Американски Држави, со типични симптоми кои се појавиле во 1912 и 1929 година, соодветно. Сепак, по околу 30 години, патогенот бил означен како Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Стоунмен) Сполд. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Стоунмен) Сполд. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф на Glomerella cingulata (Стоунмен) Сполд. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Стоунмен) Сполд во Целна морфологија. и Х. Шренк,. и Х. Шренк,.и Х. Шренк. & H.施伦克，. & H.施伦克，.и Х. Шленк.Прелиминарното фенотипизирање на болеста направено во средината на 20 век покажа одреден отпор кај NLL и жолтите лупини (L. luteus L.), но сите тестирани бел лупин (L. albus L.) беа многу осетливи15,16. Студиите покажаа дека развојот на антракноза е поврзан со зголемени врнежи (влажност на воздухот) и температура (во опсег од 12-28°C), што доведува до нарушување на отпорноста на повисоки температури17, 18. Всушност, времето потребно за 'ртење на конидиите и почеток на болеста беше четири пати пократко на 24°C (4 часа) отколку на 12°C (16 часа) во услови на висока влажност19. Така, континуираното глобално затоплување доведе до ширење на антракнозата. Сепак, болеста беше забележана во Франција (1982) и Украина (1983) како предвесник на претстојна закана, но очигледно беше игнорирана од индустријата за лупин во тоа време20,21. Неколку години подоцна, оваа катастрофална болест се прошири низ целиот свет и ги зафати и главните земји производители на лупин, како што се Австралија, Полска и Германија22,23,24. По епидемијата на антракноза во средината на 1990-тите, обемното скрининг резултираше со идентификација на неколку резистентни донори во примероците од NLL19. Отпорноста на NLL на антракноза е контролирана од два одделни доминантни алели пронајдени во различни извори на герминативна плазма: Lanr1 во сортата Tanjil и Wonga и AnMan во сортата. Mandalay 25, 26. Овие алели ги надополнуваат молекуларните маркери кои ја поддржуваат селекцијата на резистентна герминативна плазма во програмите за размножување25,26,27,28,29,30. Резистентната линија за размножување 83A:476 што го носи алелот Lanr1 беше вкрстена со осетливата дива линија P27255 за да се добие RIL популација што се сегрегира за отпорност на антракноза, што овозможи локусот Lanr1 да се додели на хромозомот NLL-1131, 32, 33. Со усогласување на маркерите на мапата на поврзување од страничните локуси на отпорност до антракнозата со геномска рамка, NLL ја откри локацијата на сите три алели на истиот хромозом (NLL-11), но на различни позиции29,34,35. Сепак, поради малиот број на RIL и големото генетско растојание помеѓу маркерите и соодветните алели, не можат да се извлечат сигурни заклучоци за нивните основни гени. Од друга страна, употребата на обратна генетика кај лупините е тешка поради нивниот многу низок потенцијал за регенерација, што ја прави генетската манипулација незгодна37.
Развојот на припитомена герминативна плазма што го носи посакуваниот алел во хомозиготна состојба, како што се 83A:476 (Lanr1) и Mandelup (AnMan), отвори врата за проучување на отпорноста на антракноза во услови на присуство на спротивставени комбинации на алели во дивите популации. Можности за молекуларни механизми. Споредете ги одбранбените одговори генерирани од специфични генотипови. Оваа студија го оцени раниот транскриптомски одговор на NLL на вакцинација со C. lupini. Прво, европски панел на NLL герминативна плазма што содржи 215 линии беше скриниран со употреба на молекуларни маркери што ги означуваат алелите Lanr1 и AnMan. Потоа беше извршено фенотипизирање на антракноза на 50 NLL линии, претходно избрани за молекуларни маркери, под контролирани услови. Врз основа на овие експерименти, четири линии што се разликуваат во отпорноста на антракноза и алелниот состав на Lanr1/AnMan беа избрани за диференцијално одбранбено профилирање на генска експресија користејќи два комплементарни пристапи: секвенционирање на РНК со висок проток и квантификација на PCR во реално време.
Скринингот на сет од NLL герминативна плазма (N = 215) со маркери Lanr1 (Anseq3 и Anseq4) и AnMan (Anseq4) и AnMan (AnManM1) покажа дека само една линија (95726, во близина на Саламанка-б) го засилува алелот „отпор“ за сите маркери, додека „Присуство на „осетливи“ алели“ го пронајде процентот на сите маркери во 158 (~73,5%) линии. Тринаесет линии произведоа два „резистентни“ алели на маркерот Lanr1, а 8 линии произведоа „резистентни“ алели на маркерот Lanr1. Алелот „отпор“ на маркерот AnMan (Дополнителна табела S1). Две линии беа хетерозиготни за маркерот Anseq3 и една хетерозиготна за маркерот AnManM1. 42 линии (19,5%) носеа спротивни фази на алелите Anseq3 и Anseq4, што укажува на висока фреквенција на рекомбинација помеѓу овие два локуси. Фенотиповите на антрахнозата под контролирани услови (Дополнителна табела S2) открија варијабилност во отпорноста на тестираните генотипови, што се одрази во сериозноста на антракнозата. Разликите во средните резултати се движеа од 1,8 (умерено отпорни) до 6,9 (осетливи), а разликите во тежината на растенијата се движеа од 0,62 (осетливи) до 4,45 g (отпорни). Постоеше значајна корелација помеѓу вредностите забележани во две повторувања на експериментот (0,51 за оценки за сериозност на болеста, P = 0,00017 и 0,61 за тежина на растението, P < 0,0001), како и помеѓу овие два параметри (− 0,59 и − 0,77, P < 0,0001). Постоеше значајна корелација помеѓу вредностите забележани во две повторувања на експериментот (0,51 за оценки за сериозност на болеста, P = 0,00017 и 0,61 за тежина на растението, P < 0,0001), како и помеѓу овие два параметри (− 0,59 и − 0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми во двух повторностях эксперименти (0,51 од баллов тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для масси <1,0,00 ден. етими двумя параметри (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Беше пронајдена значајна корелација помеѓу вредностите забележани во две повторувања на експериментот (0,51 за оценки за сериозност на болеста, P = 0,00017 и 0,61 за тежина на растението, P < 0,0001), како и помеѓу овие два параметри (- 0,59 и -0,77, P < 0,0001) 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分严0. 0,00017，植物重量为0,61，P <0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77，00P <.。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程庈 䆄 在分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之鈑，，，，，，，， 0,59 和 - 0,59 和 - 0,59 - 0,77, P < 0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми во двух повторностях (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0001, мемдуми, парами, 5,0001), и -0,0001) 0,77, P <0,0001. Постоеше значајна корелација помеѓу вредностите забележани во дупликат (резултат на сериозност на болеста 0,51, P = 0,00017 и тежина на растението 0,61, P < 0,0001) и помеѓу овие два параметри (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001. ).Типични симптоми што се забележуваат кај осетливи растенија вклучуваат свиткување и извиткување на стеблото што личи на структура на „овчарски лак“, проследено со овални лезии со портокалово-розоити (Дополнителна слика 1). Австралиските придружни растенија што ги носат гените Lanr1 (83A:476 и Tanjil) и AnMan (Mandelup) се умерено отпорни, 0,0331 и 0,0036). Некои линии што исто така носат „резистентни“ алели Lanr1 и/или AnMan покажуваат симптоми на болеста.
Интересно е што неколку NLL линии на кои им недостасуваше никаков „резистентен“ маркерски алел открија високо ниво на отпорност на антракноза (споредливо или повисоко отколку кај генотиповите Lanr1 или AnMan), како што се Boregine (P вредност < 0,0001 за двата параметри), Bojar (P вредност < 0,0001 за скор и 0,001 за тежина на растението) и популацијата B-549/79b (P вредност < 0,0001 за скор и несигнификантно за тежина). Интересно е што неколку NLL линии на кои им недостасуваше никаков „резистентен“ маркерски алел открија високо ниво на отпорност на антракноза (споредливо или повисоко отколку кај генотиповите Lanr1 или AnMan), како што се Boregine (P вредност < 0,0001 за двата параметри), Bojar (P вредност < 0,0001 за скор и 0,001 за тежина на растението) и популацијата B-549/79b (P вредност < 0,0001 за скор и несигнификантно за тежина). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для канцер), Борегин (значение P <0,0001 для обоих параметров), Бојар (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и популација B-549/79b (значение P <0,0001 для незначимо для массы). Интересно е што неколку NLL линии на кои им недостасуваше никаков „резистентен“ маркерски алел покажаа високо ниво на отпорност на антракноза (споредливо или повисоко отколку за генотиповите Lanr1 или AnMan), како што се Boregine (P вредност < 0,0001 за двата параметри), Bojar (P вредност < 0,0001 за евалуација и 0,001 за тежина на растението) и популацијата B-549/79b (P вредност < 0,0001 за евалуација и не е значајна за тежина).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭 抗性或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分为0,0001，植物重量为0,001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重阇为 Интересно е што некои NLL системи кои немаат никакви „антигенски“ маркери покажуваат висок хоризонтален отпор (еквивалентен на гените Lanr1 или AnMan или повисок), како што се Boregine (двата параметри P < 0,0001), Bojar (P вредност < 0,0001, тежина на растението 0,001) и сојот B-549/79b (P вредност < 0,0001, тежина незначителна). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1, какине или AnM). обоих параметров <0,0001), Бојар (значение P <0,0001, масса растения 0,001) и популарност B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначителна). Интересно е што некои NLL линии на кои им недостасуваат алели за „отпорност“ покажаа високи нивоа на отпорност на антракноза (споредливи со или повисоки од генотиповите Lanr1 или AnMan), како што се Boregine (P-вредност за двата параметри <0,0001), Bojar (P-вредност < 0,0001, тежина на растението 0,001) и популацијата B-549/79b (P-вредност < 0,0001, тежина незначителна).Овој феномен укажува на можноста за нов генетски извор на отпорност, објаснувајќи го забележаниот недостаток на корелација помеѓу маркер генотиповите и фенотиповите на болести (P вредности од ~0,42 до ~0,98). Така, тестот Колмогоров-Смирнов покажа дека податоците за отпорноста на антракноза беа приближно нормално распределени за резултатите (P-вредности 0,25 и 0,11) и масата на растението (P-вредности 0,47 и 0,55), што сугерира дека претпоставувам дека се вклучени повеќе алели од Lanr1 и AnMan.
Врз основа на резултатите од скринингот за отпорност на антракноза, беа избрани 4 линии за транскриптомска анализа: 83A:476, Борегин, Манделуп и популација 22660. Овие линии беа повторно тестирани за отпорност на антракс во експерименти за инокулација со секвенционирање на РНК, под услов да бидат исти како и во претходниот тест. Вредностите на резултатот беа следниве: Борегин (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Манделуп (3,82 ± 1,42) и популација 22660 (6,11 ± 1,29).
Протоколот Illumina NovaSeq 6000 постигна просек од 40,5 Mread парови по примерок (29,7 до 54,4 Mreads) (Дополнителна табела S3). Резултатите за усогласување во референтната секвенца се движеа од 75,5% до 88,6%. Просечната корелација на податоците од бројот на прочитани вредности помеѓу експерименталните варијанти помеѓу биолошките реплики се движеше од 0,812 до 0,997 (просек 0,959). Од анализираните 35.170 гени, 2917 не покажаа експресија, а другите 4785 гени беа експресирани на занемарливо ниво (основна средна вредност < 5). Од анализираните 35.170 гени, 2917 не покажаа експресија, а другите 4785 гени беа експресирани на занемарливо ниво (основна средна вредност < 5). Из 35 170 проанализирани генови 2917 не се пројавляли експрессии, а остальные 4785 генови експресировались на незначителен уровне (базовое среднее <5). Од анализираните 35.170 гени, 2917 не покажаа експресија, а преостанатите 4785 гени беа експресирани на занемарливо ниво (основна средна вредност <5).在分析的35.170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35.170 Из 35 170 проанализированных генови 2917 не експресировались, а ональные 4785 генови имели незначительную экспрессию (базовое среднее значење <5). Од анализираните 35.170 гени, 2917 не беа експресирани, а преостанатите 4785 гени имаа занемарлива експресија (основна средна вредност <5).Така, бројот на гени кои се сметаа за експресирани (основна средна вредност ≥ 5) за време на експериментот беше 27.468 (78,1%) (Дополнителна табела S4).
Од првата временска точка, сите NLL линии одговорија на инокулацијата на C. lupini (сој Col-08) со репрограмирање на транскриптомот (Табела 1), меѓутоа, беа забележани значајни разлики помеѓу линиите. Така, линијата на отпорност 83A:476 (која го носи генот Lanr1) покажа значително репрограмирање на транскриптомот во првата временска точка (6 hpi) со 31-69-кратно зголемување на бројот на изолирани горе- и долу-гени во споредба со другите временски точки во оваа временска точка. Покрај тоа, овој врв беше краткотраен, бидејќи експресијата на само неколку гени остана значително изменета во втората временска точка (12 hpi). Интересно е што Boregine, кој исто така покажа високо ниво на отпорност во тестот на графт, не претрпе такво масовно транскрипциско репрограмирање за време на експериментот. Сепак, бројот на диференцијално експресирани гени (DEG) беше ист за Boregine и 83A:476 на 12 HPI. И Манделуп и популацијата 22660 покажаа DEG врвови во последната временска точка (48 l/s), што укажува на релативно доцнење во одбранбените одговори.
Бидејќи 83A:476 претрпе масовно репрограмирање на транскриптомите како одговор на C. lupini на 6 HPI во споредба со сите други линии, ~91% од DEG забележани во овој временски момент беа специфични за лозата (Сл. 1). Сепак, имаше одредено преклопување во раните одговори помеѓу линиите на студијата, бидејќи 68,5%, 50,9% и 52,6% DEG во Бореџин, Манделуп и популацијата 22660, соодветно, се преклопуваа со оние пронајдени во 83A:476 во одредени временски точки. Сепак, овие DEG сочинуваат само мал дел (0,97–1,70%) од сите DEG моментално откриени со користење на 83A:476. Покрај тоа, 11 DEG од сите линии беа кохерентни во овој момент (Дополнителни табели S4-S6), вклучувајќи ги и заедничките компоненти на одбранбените одговори на растенијата: протеин за трансфер на липиди (TanjilG_32225), ензим ендоглукан-1,3-β-глукозид (TanjilG_23384), два протеини индуцирани од стрес како SAM22 (TanjilG_31528 и TanjilG_31531), основен латекс протеин (TanjilG_32352) и два структурни протеини на клеточниот ѕид богати со глицин (TanjilG_19701 и TanjilG_19702). Исто така, имаше релативно високо преклопување во транскриптомските одговори помеѓу 83A:476 и Boregine на 24 HPI (вкупно 16-38% DEG) и помеѓу Mandelup и популацијата 22660 на 48 HPI (вкупно 14-20% DEG).
Вен дијаграм што го прикажува бројот на диференцијално експресирани гени (DEG) кај теснолисни лупински линии (NLL) инокулирани со Colletotrichum lupini (сој Col-08 добиен од лупинските полиња во Виерженице, Полска, 1999 година). Анализираните NLL линии беа: 83A:476 (резистентен, носител на алелот Lanr1), Boregine (резистентен, непозната генетска позадина), Mandelup (умерено отпорен, носител на алелот AnMan) и популација 22660 (многу осетлива). Кратенката hpi означува часови по вакцинацијата. Нултите вредности се отстранети за да се поедностави графиконот.
Групата на прекумерно експресирани гени на 6 hpi беше анализирана за присуство на канонски R генски домени (Дополнителна табела S7). Оваа студија откри транскриптомска индукција на класични гени за отпорност на болести само со NBS-LRR домени на 83A:476. Овој сет се состоеше од еден TIR-NBS-LRR ген (tanjilg_05042), пет CC-NBS-LRR гени (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 и tanjilg_16162), и четири NBS-LR, Tanjilg_16162, и четири NBS-LRRE (tanjilg_16162), како и четири NBS-Lrr (tanjilg_16162) и четири NBS-LRR (TANJILG_16162). Сите овие гени имаат канонски домени распоредени во конзервирани секвенци. Покрај гените на доменот NBS-LRR, неколку RLL кинази беа активирани на 6 hpi, имено една кај Boregine (TanjilG_19877), две кај Mandelup (TanjilG_07141 и TanjilG_19877) и во популацијата 22660 (TanjilG_09014 и TanjilG_10361) и две во 83A 27:476.
Гените со значително изменета експресија како одговор на инокулација со C. lupini (сој Col-08) беа подложени на анализа за збогатување со генска онтологија (GO) (Дополнителна табела S8). Најчесто презастапениот термин за биолошки процес беше „GO:0006952 одбранбен одговор“ кој се појави во 6 од 16 (време × линија) комбинации со висока значајност (P вредност < 0,001) (Сл. 2). Најчесто презастапениот термин за биолошки процес беше „GO:0006952 одбранбен одговор“ кој се појави во 6 од 16 (време × линија) комбинации со висока значајност (P вредност < 0,001) (Сл. 2). Наиболее часто черезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся во 6 из 16 (время × линия) комбинација со высоко (0006952). Најчесто презастапениот термин за биолошки процес беше „GO:0006952 одбранбен одговор“, кој се појави во 6 од 16 комбинации (време × лоза) со висока значајност (P вредност < 0,001) (Сл. 2).最常被过度代表的生物过程术语是„GO:0006952 防御反应“，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 Најрепрезентативниот термин за биолошки процес е „GO:0006952 одбранбен одговор“, кој се појавува во 6 од 16-те (时间×线) комбинации, со висока значајност (P вредност < 0,001) (图2). Наиболее часто черезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», который появлялся во 6 из 16 комбинаций (время × линия) со высокой значимостью (000ние) со <0.000. Најчесто презастапениот термин за биолошки процес беше „GO:0006952 Одбранбен одговор“, кој се појави во 6 од 16 комбинации (време × линија) со висока значајност (P вредност < 0,001) (Сл. 2).Овој термин беше презастапен во две временски точки во 83A: 476 и Boregine (6 и 24 hpi) и во еден временски момент во Mandelup и популацијата 22660 (12 и 6 hpi, соодветно). Ова е очекуван резултат, кој го истакнува антифунгалниот одговор на резистентните линии. Покрај тоа, 83A:476 одговори на C. lupini со брзо индуцирање на гени поврзани со оксидативниот наплив претставен со терминот „GO:0055114 редокс процес“, што укажува на специфичен одбранбен одговор, додека Boregine откри специфични одбранбени одговори, поврзани со терминот „GO“. :0006950 Одговор на стрес“. Популацијата 22660 го активираше хоризонталниот одговор на отпор што вклучува секундарни метаболити, истакнувајќи го прекумерниот број на термини „GO:0016104 Процес на биосинтеза на тритерпен“ и „GO:0006722 Процес на метаболизам на тритерпен“ (двата термина припаѓаат на истиот сет на гени), земајќи ги предвид резултатите од анализата на збогатување на терминот GO, стабилноста на реакцијата на Манделуп беше помеѓу Борегин и популацијата 22660. Покрај тоа, раната реакција 83A:476 (6 hpi) и одложената реакција на Манделуп и популацијата 22660 го вклучуваат терминот GO:0015979 „фотосинтеза“ и други поврзани биолошки процеси.
Термините за онтологија на биопроцесни гени избрани во анотацијата на диференцијално експресирани гени за време на транскриптомските одговори на теснолисниот лупин (NLL) инокулиран со антракс лупин (сој Col-08 добиен од лупинските полиња во Вјерженице, Полска, во 1999 година) се значително претерани. Анализираните NLL линии беа: 83A:476 (резистентна, носител на хомозиготниот алел Lanr1), Boregine (резистентна, непозната генетска позадина), Mandelup (умерено резистентна, носител на хомозиготниот алел AnMan) и популација 22660 (осетлива).
Бидејќи целта на оваа студија беше да се идентификуваат гени кои придонесуваат за отпорност на антракноза, гените доделени на термините GO „GO: 0006952 Дефанзивни одговори“ и „GO: 0055114 Редокс процеси“ беа анализирани со гранични вредности бидејќи основните средни вредности ≥ 30 со најмалку една линија. × момент во времето што комбинира статистички значајни вредности на log2 (промена на превиткувања). Бројот на гени што ги исполнуваат овие критериуми беше 65 за GO:0006952 и 524 за GO:0055114.
83A:476 откри два DEG врвови обележани со терминот GO:0006952, првиот на 6 гени на инч (64 гени, регулација нагоре и надолу) и вториот на 24 гени на инч (15 гени, само регулација нагоре). Бореџин, исто така, покажа дека GO:0006952 достигна врв во истата временска точка, но со помалку DEG (11 и 8) и преференцијална активација. Манделоп покажа два врва на GO:0006952 на 12 и 48 HPI, двата носејќи 12 гени (првиот со активирачки гени, а вториот само со супресивни гени), додека популацијата 22660 на 6 HPI (13 гени) имаше поголема преваленца на регулацијата на зголемување на врвот. Треба да се напомене дека 96,4% од GO:0006952 DEG во овие врвови имаа ист тип на одговор (нагоре или надолу), што укажува на значително преклопување во одбранбените одговори и покрај разликите во бројот на вклучени гени. Најголемата група секвенци поврзани со терминот GO:0006952 го кодира протеинот за порака поврзан со стрес предизвикан од гладување 22 (сличен на SAM22), кој припаѓа на протеинскиот клад од класа 10 (протеин поврзан со патогенеза (PR-10)) и протеинот од јадрото (сличен на MLP) (Сл. 3). Двете групи се разликуваа во природата на експресијата и насоката на одговорот. Гените што кодираат протеини слични на SAM22 покажаа конзистентна и значајна индукција во раните временски точки (6 или 12 hpi) и генерално не реагираа на крајот од експериментот (48 hpi), додека протеините слични на MLP покажаа координација на 6 hpi (83A:476 и Mandelup на 48 hpi/in), речиси сите други точки на податоци не реагираа. Покрај тоа, разликите во профилите на експресија на гените за протеини слични на SAM22 ја следеа забележаната варијабилност во отпорноста на антракноза, бидејќи поотпорните линии имаа повеќе временски точки што значително ги индуцираа овие гени отколку поосетливите гени. Друг ген PR-10 сличен на LlR18A/B покажа многу сличен модел на експресија како и генот за протеин сличен на SAM22.
Идентификувани се главните компоненти на терминот за биолошки процес „GO:0006952 Defense Response“ и моделите на експресија на кандидатските гени на алелите Lanr1 и AnMan. Скалата Log2 ги претставува log2 вредностите (промена на преклопот) помеѓу инокулираните (Colletotrichum lupini, сој Col-08, добиен од полиња со лупин, Виженица, Полска, 1999) и контролните (лажно инокулирани) растенија во иста временска точка. Анализирани се следните теснолисни линии на лупин: 83A:476 (резистентна, носител на хомозиготниот алел Lanr1), Бореџин (резистентна, генетска позадина непозната), Манделуп (умерено отпорна, носител на хомозиготниот алел AnMan) и Популација 22660 (осетлива).
Дополнително, беа евалуирани профилите на експресија на гените кандидати за RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) и AnMan (TanjilG_12861) (Сл. 3). Генот TanjilG_05042 покажа значаен одговор (активација) на 83A:476 само во првата временска точка (6 hpi), додека TanjilG_12861 беше значаен во Манделоп само во две временски точки: 6 hpi (надолна регулација) и 24 hpi (6 hpi). Со.). прилагодливо) ).
Најпреекспресираните гени во терминот GO:0055114 „редокс процес“ беа гените што кодираат протеини на цитохром P450 и пероксидаза (Сл. 4). За примероци изолирани од 83A:476 на 6 HPI, максимални или минимални вредности на log2 (промена на преклопување) (за 86,6% од гените) генерално беа забележани помеѓу инокулираните и контролните растенија, истакнувајќи го високиот одговор на овој генотип на инокулирачкиот пол. 83A:476 покажа најзначаен GO: 0055114 DEG на 6 hpi (503 гени), додека останатите линии на 48 hpi (Boregine, 31 гени; Mandelup, 85 гени; и Population 22660, 78 гени). Кај повеќето гени од семејството GO:0055114, беа забележани два вида одговори на вакцинација (активација и инхибиција). Интересно е што до 97,6% од DEG идентификувани за терминот GO: 0055114 кај Манделуп со 48 hp. Овие набљудувања сугерираат дека, и покрај значително помалата скала (т.е. бројот на мутирани редокс гени, 85 наспроти 503), моделот на одложени транскриптомски одговори на манделуп на антракноза е сличен на раниот одговор на 83A:476. Кај Бореџин и популацијата 22660, оваа конвергенција е помала на 51,6% и 75,6%, соодветно.
Беа откриени моделите на експресија на главните компоненти на терминот на биолошкиот процес „GO:0055114 Редокс процес“. Скалата Log2 ги претставува log2 вредностите (промена на преклопување) помеѓу инокулираните (Colletotrichum lupini, сој Col-08, добиен од полиња со лупин, Виженица, Полска, 1999) и контролните (лажно инокулирани) растенија во иста временска точка. Анализирани беа следните теснолисни линии на лупин: 83A:476 (резистентна, носител на хомозиготниот алел Lanr1), Бореџин (резистентна, генетска позадина непозната), Манделуп (умерено отпорна, носител на хомозиготниот алел AnMan) и Популација 22660 (осетлива).
83A:476 Транскриптомските одговори на инокулација со C. lupini (сој Col-08), исто така, вклучуваа координирано замолчување на гените што се припишуваат на терминот GO:0015979 „фотосинтеза“ и други сродни биолошки процеси (Сл. 5). Овој сет GO:0015979 DEG содржеше 105 гени кои беа значително потиснати на 6 hpi на 83A:476. Во овој подмножество, 37 гени беа исто така намалени во Манделуп на 48 HPI и 35 во истата временска точка во популацијата 22660, вклучувајќи 19 DEG заеднички за двата генотипови. Ниеден DEG поврзан со терминот GO: 0015979 не беше значително активиран во која било комбинација (линија x време).
Беа откриени моделите на експресија на главните компоненти на терминот на биолошкиот процес „GO:0015979 Фотосинтеза“. Скалата Log2 ги претставува log2 вредностите (промена на преклопот) помеѓу инокулираните (Colletotrichum lupini, сој Col-08, добиен од полиња со лупин, Виженица, Полска, 1999) и контролните (лажно инокулирани) растенија во иста временска точка. Анализирани беа следните теснолисни линии на лупин: 83A:476 (резистентна, носител на хомозиготниот алел Lanr1), Бореџин (резистентна, генетска позадина непозната), Манделуп (умерено отпорна, носител на хомозиготниот алел AnMan) и Популација 22660 (осетлива).
Врз основа на резултатите од анализата на диференцијалната експресија и веројатно вклученоста во одбранбените одговори против патогени габи, овој сет од седум гени беше избран за квантификација на профилите на експресија со PCR во реално време (Дополнителна табела S9).
Претпоставениот протеински ген TanjilG_10657 беше значително индуциран во сите проучувани линии и временски точки во споредба со контролните (мимички) растенија (Дополнителни табели S10, S11). Покрај тоа, профилот на експресија на TanjilG_10657 покажа тренд на зголемување во текот на експериментот за сите линии. Популацијата 22660 покажа највисока чувствителност на TanjilG_10657 на инокулација со 114-кратна активација и највисоко релативно ниво на експресија (4,4 ± 0,4) на 24 HPI (Сл. 6a). Протеинскиот ген PR10 LlR18A TanjilG_27015 исто така покажа активација низ сите линии и временски точки, со статистичка значајност во повеќето точки на податоци (Сл. 6b). Слично на TanjilG_10657, највисокото релативно ниво на експресија на TanjilG_27015 беше забележано кај инокулираната популација од 22660 на 24 HPI (19,5 ± 2,4). Генот на кисела ендохитиназа TanjilG_04706 беше значително зголемен во сите линии и во сите временски точки освен кај Boregine 6 hpi (Сл. 6c). Тој беше силно индуциран во првата временска точка (6 HPI) на 83A:476 (за 10,5 пати) и умерено зголемен во другите линии (за 6,6-7,5 пати). За време на експериментот, експресијата на TanjilG_04706 остана на слични нивоа кај 83A:476 и Boregine, додека кај Mandelup и популацијата 22660 значително се зголеми, достигнувајќи релативно високи вредности (5,9 ± 1,5 и 6,2 ± 1,5, соодветно). Генот сличен на ендоглукан-1,3-β-глукозидаза TanjilG_23384 покажа висока активација во првите две временски точки (6 и 12 hpi) во сите линии освен кај популацијата 22660 (Сл. 6d). Највисоките релативни нивоа на експресија на TanjilG_23384 беа забележани во втората временска точка (12 hpi) кај Mandelup (2,7 ± 0,3) и 83A:476 (1,5 ± 0,1). На 24 HPI, експресијата на TanjilG_23384 беше релативно ниска во сите проучувани линии (од 0,04 ± 0,009 до 0,44 ± 0,12).
Профили на експресија на одбрани гени (ag) откриени со квантитативна PCR. Броевите 6, 12 и 24 претставуваат часови по вакцинацијата. Гените LanDExH7 и LanTUB6 беа користени за нормализација, а LanTUB6 беше користен за калибрација меѓу сериите. Лентите за грешка ја претставуваат стандардната девијација врз основа на три биолошки реплики, од кои секоја е просек од три технички реплики. Статистичката значајност на разликите во нивоата на експресија помеѓу инокулираните (Colletotrichum lupini, сој Col-08, добиен во 1999 година од полето со лупин во Виерженица, Полска) и контролните (лажни инокулирани) растенија се означени над точките на податоци (*P вредност < 0,05, **P вредност ≤ 0,01, ***P вредност ≤ 0,001). Статистичката значајност на разликите во нивоата на експресија помеѓу инокулираните (Colletotrichum lupini, сој Col-08, добиен во 1999 година од полето со лупин во Виерженица, Полска) и контролните (лажни инокулирани) растенија се означени над точките на податоци (*P вредност < 0,05, **P вредност ≤ 0,01, ***P вредност ≤ 0,001). Статистическая значитемость различий во уровнях експрессии меѓу инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен во 1999 г. точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Статистички значајни разлики во нивоата на експресија помеѓу инокулираните (Colletotrichum lupini, сој Col-08, добиен во 1999 година од поле со лупин во Виерженице, Полска) и контролните (лажно инокулирани) растенија се забележани над точките на податоците (*P вредност < 0,05, **P-вредност ≤ 0,01, ***P-вредност ≤ 0,001).接种 (Colletotrichum лупини，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在敼木0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对煎）之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***0P. Статистически расте значителни различија во уровнях експрессии меѓу инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный со полей люпина во Верженице, Польша, во 1999 г.) отмечены над точките данных (* значење P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Статистички значајни разлики во нивоата на експресија помеѓу инокулираните (Colletotrichum lupini, сој Col-08, добиен од полиња со лупин во Верженице, Полска, во 1999 година) и контролните (лажно инокулирани) растенија се забележани над точките на податоците (*P вредност < 0,05, **P-вредност ≤ 0,01, ***P-вредност ≤ 0,001).Анализираните NLL линии беа: 83A:476 (резистентна, носител на хомозиготниот алел Lanr1), Mandelup (умерено резистентна, носител на хомозиготниот алел AnMan), Boregine (резистентна, непозната генетска позадина) и популација 22660 (осетлива).
Кандидатскиот ген TanjilG_05042 на локусот Lanr1 покажа значително различен модел на експресија од профилите добиени од RNA-seq студиите (Сл. 6e). Значителна активација на овој ген беше забележана кај Mandelup и популацијата 22660 (до 39,7 и 11,7 пати, соодветно), што резултираше со релативно високи нивоа на експресија (до 1,4 ± 0,14 и 7,2 ± 1,3, соодветно). 83A:476, исто така, откри одредена зголемена регулација на генот TanjilG_05042 (до 3,8 пати), меѓутоа, постигнатите релативни нивоа на експресија (0,044 ± 0,002) беа повеќе од 30 пати пониски од оние забележани кај Mandelup и популацијата 22660. Анализирано со qPCR покажа значајни разлики во нивоата на експресија помеѓу генотиповите кај лажно вакцинираните (контролни) варијанти, достигнувајќи 58-кратна разлика помеѓу популациите 22660 и 83A:476, како и помеѓу популациите 22660 и 22660. Двојна разлика беше постигната помеѓу Бореџин и Мандалуп.
Кандидатскиот ген на локусот AnMan, TanjilG_12861, беше активиран како одговор на вакцинацијата кај 83A:476 и Mandelup, беше неутрален во популацијата 22660 и беше намален кај Boregine (Сл. 6f). Релативната експресија на генот TanjilG_12861 беше највисока кај инокулираната 83A: 476 (0,14 ± 0,01). Генот за протеинот на топлотен шок од класа I TanjilG_05080 HSP17.4 од 17,4 kDa покажа пониски нивоа на релативни експресии кај сите проучувани соеви и временски точки (Сл. 6g). Највисоката вредност беше забележана на 24 HPI кај популацијата 22660 (0,14 ± 0,02, осумкратно зголемување на одговорот на вакцинацијата).
Споредбата на профилите на генската експресија (Сл. 7) откри висока корелација помеѓу TanjilG_10657 и четири други гени: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) и TanjilG_04706 (r = 0,79). Ваквите резултати може да укажуваат на ко-регулација на овие гени за време на одбранбените одговори. Гените TanjilG_12861 и TanjilG_23384 покажаа различни профили на експресија со пониски вредности на Пирсоновиот коефициент на корелација (од 0,08 до 0,43 и од -0,19 до 0,28, соодветно) во споредба со другите гени.
Корелациите помеѓу профилите на генска експресија беа откриени со помош на квантитативна PCR. Анализирани беа следните теснолисни лупински линии: 83A:476 (резистентна, носител на хомозиготниот алел Lanr1), Mandelup (умерено резистентна, носител на хомозиготниот алел AnMan), Boregine (резистентна, генетска позадина непозната) и Популација 22660 (осетлива). Пресметани се три временски точки (6, 12 и 24 часа по инокулацијата), вклучувајќи инокулирани (Colletotrichum lupini, сој Col-08, добиен од полиња со лупин во Виерженице, Полска, во 1999 година) и контролни (лажно инокулирани) растенија. Скалата ја покажува вредноста на Пирсоновиот коефициент на корелација.
Врз основа на податоците добиени со 6 коњски сили на инч, WGCNA беше извршена на 9981 DEG идентификувана со споредување на инокулирани и контролни растенија за да се фокусира на раните одбранбени одговори (Дополнителна табела S12). Пронајдени се дваесет и два генски модули (кластери) со корелирани (позитивни или негативни) профили на експресија помеѓу генотиповите и експерименталните варијанти. Во просек, нивоата на генска експресија се намалуваа по редослед 83A:476 > Манделуп > Бореџин > Популација 22660 (меѓутоа, кај обете варијанти овој тренд беше посилен кај контролните растенија). Во просек, нивоата на генска експресија се намалуваа по редослед 83A:476 > Манделуп > Бореџин > Популација 22660 (меѓутоа, кај обете варијанти овој тренд беше посилен кај контролните растенија). В среднем уровни експрессии генов снижались во порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Население 22660 (во обоих варијантах, однако, ета тенденция была сильнее у контрольных растений). Во просек, нивоата на генска експресија се намалија по редослед 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (меѓутоа, кај обете варијанти овој тренд беше посилен кај контролните растенија).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Население 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> популација 22660 的 顺序 下降 （， 下降 （， 圸在 在 植物 中 更）………………………….. В среднем уровни експресии генови снижались во ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Население 22660 (однако во обоих варијантах ета тенденция была сильнее у контрольных растений). Во просек, нивоата на генска експресија се намалија во серијата 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (сепак, во обете варијанти, овој тренд беше посилен кај контролните растенија).Вакцинацијата резултираше со зголемена регулација на генската експресија, особено во модулите 18, 19, 14, 6 и 1 (во опаѓачки редослед на ефектот), негативна регулација (на пр. модули 9 и 20) или со неутрални ефекти (на пр. модули 11, 22, 8 и 13). Анализата на збогатување на терминот GO (Дополнителна табела S13) откри „GO: 0006952 Заштитни одговори“ за инокулираниот модул (18) со максимална активација, вклучувајќи гени анализирани со qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 и TanjilG_27015), како и многу модули за фотосинтеза со инокулација кои ја потиснуваат фотосинтезата (9). Концентраторот на модул 18 (сл. 8) беше идентификуван како генот TanjilG_26536 што го кодира протеинот LlR18B сличен на PR-10, а концентраторот на модул 9 беше идентификуван како генот TanjilG_28955 што го кодира протеинот PsbQ на фотосистемот II. Кандидат за ген за отпорност на антракноза Lanr1, TanjilG_05042, беше пронајден во модул 22 (сл. 9) и е поврзан со термините „GO:0044260 Клеточни макромолекуларни метаболички процеси“ и „GO:0006355 Транскрипциска регулација, шаблонирање на ДНК“ што го носи центарот TanjilG_01212. Генот го кодира транскрипцискиот фактор на топлински стрес A-4a (HSFA4a).
Пондерирана мрежна анализа на генска коекспресија на модули со презастапени термини на биолошки процес „GO: 0006952 Одбранбени одговори“. Лигацијата беше поедноставена за да се истакнат четирите гени анализирани со qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 и TanjilG_27015).
Пондерирана мрежна анализа на генска коекспресија на модул со презастапен термин за биолошки процес „GO: 0006355: Транскрипциска регулација, шаблонирање на ДНК“ и носител на кандидат ген за отпорност на антракноза Lanr1 TanjilG_05042. Лигацијата беше поедноставена за да се изолира генот TanjilG_05042 и централниот ген TanjilG_01212.
Скринингот за отпорност на антрахноза собран во Австралија покажа дека повеќето од рано ослободените сорти се осетливи; Kalya, Coromup и Mandelup се опишани како умерено отпорни, додека Wonga, Tanjil и 83A:476 се опишани како високо отпорни26,27,31. кои имале ист алел на отпорност, означен Lanr1, а Coromup и Mandelup имале различен алел, означен AnMan10, 26, 39, додека Kalya пренел различен алел, Lanr2. Скринингот за отпорност на антракноза во Германија резултираше со идентификација на резистентна линија Bo7212 со кандидат алел различен од Lanr1, означен LanrBo36.
Нашето истражување откри многу ниска фреквенција (околу 6%) на алелот Lanr1 во тестираната герминативна плазма. Ова набљудување е во согласност со резултатите од скринингот на источноевропската герминативна плазма со користење на маркерите Anseq3 и Anseq4, кои покажаа дека алелот Lanr1 е присутен само во две белоруски линии. Ова сугерира дека алелот Lanr1 сè уште не е широко користен од локалните програми за размножување, за разлика од Австралија, каде што е еден од клучните алели за размножување потпомогнато од маркери. Ова може да се должи на пониското ниво на отпорност што го обезбедува алелот Lanr1 во европските теренски услови во споредба со австралискиот извештај. Покрај тоа, студиите за антракноза во области со големи врнежи од дожд во Австралија покажаа дека одговорите на отпорност посредувани од алелот Lanr1 може да не бидат ефикасни во временски услови што го фаворизираат растот и брзиот развој на патогенот19,42. Всушност, во оваа студија, некои симптоми на антракноза беа забележани и кај генотипови што го носат алелот Lanr1, што укажува дека отпорноста може да исчезне под оптимални услови за развој на C. lupini. Покрај тоа, можни се лажно позитивни толкувања на присуството на маркери Anseq3 и Anseq4, кои се оддалечени приближно 1 cM од локусот Lanr1 28,30,43.
Нашето истражување покажа дека 83A:476, кој го носи алелот Lanr1, одговорил на инокулација на C. lupini со репрограмирање на транскриптом во голем обем во првата анализирана временска точка (6 hpi), додека кај Mandelup, кој го носи алелот AnMan, транскриптомските одговори биле забележани многу подоцна (од 24 до 48 hp). Овие временски варијации во одбранбените одговори се поврзани со разлики во симптомите на болеста, истакнувајќи ја важноста на раното препознавање на патогенот за успешен одговор на отпорноста. За да инфицираат растително ткиво, спорите на антракс мора да поминат низ неколку развојни фази на површината на домаќинот, вклучувајќи ртење, клеточна делба и формирање на апресориум. Додатокот е инфективна структура која се прицврстува на површината на домаќинот и го олеснува пенетрацијата во ткивата на домаќинот. Така, спорите на C. gloeosporioides во екстракт од грашок ја покажале првата делба на јадрото по 75-90 минути инкубација, формирање на герминативна цевка по 90-120 минути и супресија по 4 часа 45. Мангото C. gloeosporioides покажа повеќе од 40% конидијално ртење по 3 часа инкубација и околу 20% формирање на апресори по 4 часа. Генот CAP20 поврзан со вирулентноста на C. gloeosporioides покажа транскрипциска активност во конидии што формираат епифити по 3,5 часа инкубација во површински восок од авокадо со високи концентрации на протеин CAP20 по 4 часа и 46 минути. Слично на тоа, активноста на гените за биосинтеза на меланин во C. trifolii беше индуцирана за време на 2-часовна инкубација, проследена со формирање на апресориум по 1 час. Студиите на ткивата на листот покажаа дека јагодите инокулирани со C. acutatum имаат прва супресија на 8 hpi, додека доматите инокулирани со C. coccodes имаат прва супресија на 4 hpi48,49. што во голема мера е во согласност со временската скала на инфективниот процес на Colletotrichum spp. Брзите одбранбени одговори на 83A:476 укажуваат на вклучување на гените за отпорност на растенијата и ефекторно-активираниот имунитет (ETI) во оваа линија, додека одложените одговори на Манделуп ја поддржуваат хипотезата за микро-поврзан молекуларен модел-активиран имунитет (MTI) 50. Рани одговори на 83A: 476 и Манделуп. Делумното преклопување помеѓу гените со зголемена или намалена регулација во одложениот одговор исто така го поддржува овој концепт, бидејќи ETI често се смета за забрзан и подобрен MTI одговор што кулминира со програмирана клеточна смрт на местото на инфекцијата, познато како анафилактичен шок 51,52.
Повеќето од гените што се припишуваат на презастапениот термин Gene Ontology GO:0006952 „Одбранбен одговор“ се 11-те хомолози на протеинот 22 за порака на постење предизвикан од стрес (сличен на SAM22) и седумте главни протеини слични на латекс (MLP). Протеините слични на латекс 31, 34, 43 и 423 покажаа сличност во секвенцата. Гените слични на SAM22 покажаа значајна активација што траеше подолго, покажувајќи зголемени нивоа на отпорност на антракноза (83A:476 и Boregine). Сепак, гените слични на MLP беа намалени само во линиите што го носат алелот за отпорност на кандидат (83A:476/Lanr1 на 6 hpi и Mandelup/AnMan на 24 hpi). Треба да се напомене дека сите идентификувани хомолози слични на SAM22 потекнуваат од генски кластер што се протега на приближно 105 kb, додека гени слични на MLP потекнуваат од одделни региони на геномот. Координирана активација на вакви гени слични на SAM22 беше пронајдена и во нашата претходна студија за отпорност на NLL на инокулација со Diaporthetoxica, што укажува дека тие се вклучени во хоризонталните компоненти на одбранбениот одговор. Овој заклучок е поткрепен и со извештаи за позитивен одговор на гени слични на SAM22 на повреда или третман со салицилна киселина, габични индуктори или водород пероксид.
Докажано е дека MLP-сличните гени реагираат на различни абиотски и биотски стресови, вклучувајќи бактериски, вирусни и патогени габични инфекции кај многу растителни видови55. Насоките на одговор на одредени интеракции помеѓу растенијата и патогените се движеа од силно зголемување (т.е. за време на инфестација на памук со Verticillium dahliae) до значително намалување (т.е. по инфекција на јаболкницата со Alternaria spp.)56,57. Значително намалување на MLP-сличниот ген 423 е забележано за време на одбраната од авокадо од инфекција со F. niger и за време на инфекција на јаболкницата. Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola и Alternaria alternata се патотипови на јаболка58,59. Покрај тоа, калите на јаболката кои го преекспресираат MLP-сличниот ген 423 имале помала експресија на гени поврзани со отпорност и биле поподложни на габична инфекција59. По Fusarium oxysporum f, MLP-сличниот ген 423 бил потиснат и во резистентната герминативна плазма на обичниот грав. cn. Инфекција со грав 60.
Други членови на семејството PR-10 идентификувани во нашата RNA-seq студија беа гените LlR18A и LlR18B како одговор на зголемена регулација, како и генот зголемена (1 ген) или намалена регулација (3 гени) за протеинот за пренос на липиди DIR1. Покрај тоа, WGCNA го истакнува генот LlR18B како центар во овој модул, кој е многу подложен на вакцинација и носи неколку гени за заштитен одговор. Гените LlR18A и LlR18B беа индуцирани во лисја од жолт лупин како одговор на патогени бактерии, како и во стебла од NLL по инокулација на D. toxica, додека хомологот на ориз на овие гени, RSOsPR10, беше брзо индуциран од габична инфекција веројатно вклучена во сигналниот пат на јасмонска киселина53,61, 62. Генот DIR1 кодира неспецифични протеини за транспорт на липиди кои се потребни за појава на системска стекната резистенција (SAR). Со развојот на заштитни реакции, протеинот DIR1 се транспортира од фокусот на инфекцијата преку флоемот за да предизвика SAR во далечните органи. Интересно е што генот TanjilG_02313 DIR1 беше значително индуциран во првата временска точка во линиите 84A:476 и популацијата 22660, но отпорноста на антракноза се разви успешно само во линијата 84A:476. Ова може да укажува на одредена субфункционализација на генот DIR1 кај NLL, бидејќи преостанатите три хомолози реагираа на инокулација само во линијата 83A:476 на 6 hpi, а овој одговор беше насочен надолу.
Во нашата студија, најчестите компоненти што одговараат на биолошкиот процес наречен „GO:0055114 Редокс процес“ беа протеинот цитохром P450, пероксидазата, линолната киселина 9S-/13S-липоксигеназата и 1-аминоциклопропан-1-карбоксилна киселина оксидазата. Покрај тоа, нашата WGCNA го дефинира хомологот на HSFA4a како модули што носат јазол, како што е кандидатот за ген за отпорност на Lanr1 TanjilG_05042. HSFA4a е компонента на редокс-зависната регулација на нуклеарната транскрипција кај растенијата.
Протеините на цитохром P450 се оксидоредуктази кои катализираат NADPH и/или O2-зависни реакции на хидроксилација во примарниот и секундарниот метаболизам, вклучувајќи го метаболизмот на ксенобиотиците, како и хормоните, масните киселини, стеролите, компонентите на клеточниот ѕид, биополимерите и биосинтезата на заштитни соединенија 69. Во нашата студија, варијабилноста во функцијата на растителниот цитохром P450 беше намалена од -10,6 log2 (промена на преклоп) на 5,7 поради голем број изменети хомолози (37) и разлики во моделите на одговор помеѓу специфични гени, што одразува нагорна ревизија. Користењето само на RNA-seq податоци за разјаснување на претпоставената биолошка функција на NLL гените во толку големо протеинско суперсемејство би било многу шпекулативно. Сепак, вреди да се напомене дека некои гени на цитохром P450 се поврзани со зголемена отпорност на патогени габи или бактерии, вклучувајќи придонес кон алергиски реакции 69,70,71.
Пероксидазите од класа III се мултифункционални растителни ензими вклучени во широк спектар на метаболички процеси за време на растот и развојот на растенијата, како и како одговор на стресови од животната средина како што се соленоста, сушата, високиот интензитет на светлина и нападот на патогени72. Пероксидазите се вклучени во интеракцијата на неколку растителни видови со Anthracis, вклучувајќи Stylosanthes humilis и C. gloeosporioides, Lens culinaris и C. truncatum, Phaseolus vulgaris и C. lindemuthianum, Cucumis sativus и C. lagenarium73,74,75,76. Одговорот е многу брз, понекогаш дури и на 4 HPI, пред габата да навлезе во растителното ткиво73. Генот на пероксидаза, исто така, реагираше на инокулација на D. toxica NLL. Покрај нивните типични функции за регулирање на оксидативниот наплив или елиминирање на оксидативниот стрес, пероксидазите можат да се мешаат во растот на патогените со создавање физички бариери врз основа на зајакнување на клеточниот ѕид за време на лигнификација, подединица или вкрстено поврзување на специфични соединенија. Оваа функција може in silico да се припише на генот TanjilG_03329 кој кодира претпоставена лигнин-формирачка анјонска пероксидаза, која беше значително зголемена во нашата студија во резистентната линија 83A:476 на 6 HPI, но не и кај други соеви и временски точки кои не одговорија.
9S-/13S-липоксигеназата на линолната киселина е првиот чекор во оксидативниот пат на липидната биосинтеза78. Производите од овој пат имаат повеќекратни функции во одбраната на растенијата, вклучувајќи зајакнување на клеточниот ѕид преку формирање на наслаги од калоза и пектин и регулирање на оксидативниот стрес преку производство на реактивни кислородни видови79,80,81,82,83. Во оваа студија, експресијата на линолната киселина 9S-/13S-липоксигеназата беше изменета кај сите соеви, но кај подложната популација 22660, преовладуваше зголемена регулација во различни временски точки, додека кај соевите што носат отпорен Lanr1 и алелот AnMan, таа го нагласува диверзификацијата на оксилипинскиот слој во заштитните реакции на антракс помеѓу овие генотипови.
Хомологот на 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат оксидаза (ACO) беше значително зголемен (9 гени) или намален (2 гени) кога беше инокулиран со лупин. Со два исклучоци, сите овие одговори се случија на 6 hp. на 83A:476. Ензимската реакција посредувана од ACO протеините е чекор што ја ограничува брзината во производството на етилен и затоа е високо регулирана84. Етиленот е растителен хормон кој игра различни улоги во регулирањето на развојот на растенијата и одговорот на абиотски и биотски стресни услови. Индукцијата на ACO транскрипцијата и активирањето на сигналниот пат на етилен се вклучени во зголемувањето на отпорноста на оризот кон хемибиотрофната габа oryzae oryzae преку регулирање на производството на реактивни кислородни видови и фитоалексини. Многу сличен процес на инфекција на листовите пронајден помеѓу M. oryzae и C. lupini88,89, наспроти позадината на значително зголемување на ACO хомолозите во линијата 83A:476 објавена во оваа студија, ја поместува можноста за стекнување отпорност на NLL антракноза. Етиленот е централен сигнален чекор во молекуларните патишта.
Во оваа студија, големо супресирање на многу гени поврзани со фотосинтезата беше забележано на 6 hpi во 83A:476 и на 48 hpi во Манделоп и популацијата 22660. Степенот и прогресијата на овие промени се пропорционални на нивото. Во овој експеримент беше забележана отпорност на антракноза. Неодамна, силна и рана супресија на транскриптите поврзани со фотосинтезата е пријавена во неколку модели на интеракции растение-патоген, вклучувајќи патогени бактерии и габи. Брзината (од 2 HPI во некои интеракции) и глобалното супресирање на гените поврзани со фотосинтезата како одговор на инфекцијата може да предизвика имунитет на растенијата врз основа на распоредувањето на реактивни кислородни видови и нивната интеракција со патеката на салицилна киселина за посредување на алергиски реакции 90,94.
Како заклучок, механизмите за одбранбен одговор предложени за најрезистентната лоза (83A:476) вклучуваат брзо препознавање на патогенот од страна на генот R (веројатно TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) и сигнализација со салицилна киселина и етилен посредувана од алергиски одговор, проследено со воспоставување на долгорочно дејство на SAR. Дејството е поддржано од протеинот DIR-1. Треба да се напомене дека биотрофниот период за инфекција со C. lupini е многу краток (приближно 2 дена), проследен со некротичен раст95. Транзицијата помеѓу овие фази може да биде поврзана со некроза и експресија на протеини индуцибилни од етилен кои дејствуваат како предизвикувачи за реакции на преосетливост кај растенијата домаќини. Затоа, временскиот прозорец за успешно зафаќање на C. lupini во биотрофната фаза е многу тесен. Репрограмирањето на гените поврзани со редокс и фотосинтеза забележано во 83A:476 на 6 hpi е во согласност со прогресијата на габичните хифи и го најавува развојот на успешен заштитен одговор во биотрофната фаза. Транскриптомските одговори на Mandelup и популацијата 22660 може да бидат премногу одложени за да ја заробат габата пред да преминат на некротичен раст, меѓутоа, Mandelup може да биде поефикасен од популацијата 22660 бидејќи релативно брзата регулација на протеинот PR-10 промовира хоризонтален отпор.
ETI, поттикнат од канонскиот R ген, се чини дека е вообичаен механизам за отпорност на грав на антракноза. Така, кај моделната мешункаст легумин Medicago truncatula, отпорноста на антракноза се пренесува преку генот RCT1, член на класата на R гени на растението TIR-NBS-LRR97. Овој ген, исто така, дава отпорност на антракноза со широк спектар кај луцерката кога се пренесува на осетливи растенија. Кај обичниот грав (P. vulgaris), досега се идентификувани повеќе од дваесет гени за отпорност на антракноза. Некои од овие гени се наоѓаат во региони каде што недостасуваат канонски R гени, но многу други се наоѓаат на рабовите на хромозомите што го носат кластерот на гени NBS-LRR, вклучувајќи го и TIR-NBS-LRRs99. Студијата SSR на целиот геном, исто така, ја потврди поврзаноста на генот NBS-LRR со отпорноста на антракноза кај обичниот грав. Канонскиот R ген беше пронајден и во геномскиот регион што го носи главниот локус на отпорност на антракноза кај белиот лупин 101.
Нашата работа покажува дека непосредната реакција на отпорност, активирана во рана фаза на инфекција на растението (по можност не подоцна од 12 hpi), ефикасно го штити теснолисниот лупин од антрахноза предизвикана од патогената габа Collelotrichum lupini. Користејќи секвенционирање со висок проток, демонстриравме диференцијални профили на експресија на гените за отпорност на антракноза кај NLL растенијата посредувани од гените за отпорност Lanr1 и AnMan. Успешната одбрана вклучува внимателно дизајнирање на гените за протеини вклучени во редокс, фотосинтеза и патогенеза во рок од неколку часа од првиот контакт на растението со патоген. Слични заштитни реакции, но одложени во времето, се многу помалку ефикасни во заштитата на растенијата од болести. Отпорноста на антракс посредувана од генот Lanr1 наликува на типичниот брз одговор на генот R (имунитет предизвикан од ефекторот), додека генот AnMan најверојатно обезбедува хоризонтален одговор (имунитет предизвикан од молекуларен модел поврзан со микроб), обезбедувајќи умерено ниво на одржливост.
215-те NLL линии што се користеа за скрининг на маркери на антракноза се состоеја од 74 сорти, 60 линии добиени со вкрстување или размножување, 5 мутанти и 76 диви или оригинални герминативни плазми. Линиите доаѓаа од 17 земји, главно од Полска (58), Шпанија (47), Германија (27), Австралија (26), Русија (19), Белорусија (7), Италија (5) и други линии од 10 земји. Сетот, исто така, вклучува референтни отпорни линии: 83A:476, Tanjil, Wonga што го носат алелот Lanr1 и Mandelup што го носат алелот AnMan. Линиите се добиени од Европската база на податоци за генетски ресурси на лупин што ја одржува Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Полска (Дополнителна табела S1).
Растенијата беа одгледувани под контролирани услови (фотопериод 16 часа, температура 25°C преку ден и 18°C ​​​​ноќе). Анализирани беа две биолошки реплики. ДНК беше изолирана од лисја стари три недели со помош на DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германија) според протоколот. Квалитетот и концентрацијата на изолираната ДНК беа оценети со спектрофотометриски методи (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, САД). Анализирани беа маркерот AnManM1 што го означува генот за отпорност на антракноза AnMan (добиен од cv. Mandelup) и маркерите Anseq3 и Anseq4 што го опкружуваат генот Lanr1 (добиен од cv. Tanjil) 11,26,28. Хомозиготите за резистентниот алел беа оценети како „1“, осетливите – како „0“, а хетерозиготите – како 0,5.
Врз основа на резултатите од скринингот за маркерите AnManM1, AnSeq3 и AnSeq4 и достапноста на семиња за конечни контролни експерименти, 50 NLL линии беа избрани за фенотипизација на отпорност на антракноза. Анализата беше извршена во дупликат во компјутерски контролирана стаклена градина со 14-часовен фотопериод со температурен опсег од 22°C во текот на денот и 19°C ноќе. Семето се гребе (сечејќи ја обвивката на семето од спротивната страна на ембрионот со остар нож) пред сеидбата за да се спречи мирување на семето поради тоа што обвивката на семето е премногу тврда и за да се обезбеди униформно ртење. Растенијата беа одгледувани во саксии (11 × 11 × 21 cm) со стерилна почва (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Варшава, Полска). Инокулацијата беше извршена со сојот Colletotrichum lupini Col-08, одгледан во 1999 година од стеблата на теснолисни растенија лупин одгледувани на поле во Верженица, Голема Полска (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Земете површина. Изолатите беа култивирани во SNA медиум на 20°C под црна светлина 21 ден за да се индуцира спорулација. Четири недели по сеидбата, кога растенијата ја достигнаа фазата од 4-6 листа, инокулацијата беше извршена со прскање со суспензија од конидии со концентрација од 0,5 x 106 конидии на мл. По инокулацијата, растенијата беа чувани во темница 24 часа на влажност од околу 98% и температура од 25°C за да се олесни ртењето на конидиите и процесот на инфекција. Потоа растенијата беа одгледувани под 14-часовен фотопериод на 22°C ден/19°C ноќ и 70% влажност. Бодувањето на болеста беше направено 22 дена по инокулацијата и се движеше од 0 (имунитет) до 9 (многу осетливи) во зависност од присуството или отсуството на некротични лезии на стеблата и листовите. Дополнително, по бодувањето, беше измерена и тежината на растенијата. Односите помеѓу маркер генотиповите и фенотиповите на болеста беа пресметани како корелации од точка два во низа (отсуство на хетерозиготни маркери во сетот линии за анализа на фенотипот на отпорност на антракноза).