Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com. Jūsų naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą. Kad galėtumėte naudotis visomis įmanomomis funkcijomis, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Tuo tarpu, siekdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę pateiksime be stilių ir „JavaScript“.
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) yra ankštinis augalas, naudojamas maisto gamybai ir dirvožemio gerinimui. Visuotinis NLL, kaip pasėlio, plitimas pritraukė daug patogeninių grybų, įskaitant lubinų antraknozę, kuri sukelia niokojančią antraknozės ligą. NLL veisimui buvo naudojami du aleliai, Lanr1 ir AnMan, kurie suteikia didesnį atsparumą, tačiau pagrindiniai molekuliniai mechanizmai lieka nežinomi. Šiame tyrime Lanr1 ir AnMan žymenys buvo naudojami Europos NLL mėginiams atrinkti. Vakcinos testavimas kontroliuojamoje aplinkoje patvirtino abiejų atsparių donorų veiksmingumą. Diferencinis genų raiškos profiliavimas buvo atliktas su reprezentatyviomis atspariomis ir jautriomis linijomis. Antraknozės atsparumas buvo susijęs su genų ontologijos terminų „GO:0006952 Gynybos atsakas“, „GO:0055114 Redokso procesas“ ir „GO:0015979 Fotosintezė“ perraiška. Be to, Lanr1(83A:476) linija po inokuliacijos parodė reikšmingą transkriptomo perprogramavimą greitai, o kitose linijose šis atsakas vėlavo maždaug 42 valandomis. Apsaugos atsakai siejami su TIR-NBS, CC-NBS-LRR ir NBS-LRR genais, 10 patogenezėje dalyvaujančių baltymų, lipidų pernašos baltymais, endogliukan-1,3-β-gliukozidaze, glicino turtingais ląstelės sienelės baltymais ir genais iš reaktyviojo deguonies kelio. Ankstyvieji atsakai į 83A:476, įskaitant kruopštų su fotosinteze susijusių genų slopinimą, sutapo su sėkminga apsauga grybelio biologijos vegetatyvinio augimo fazėje, o tai rodo, kad efektorius sukelia imunitetą. Mandeloopo reakcija sulėtėja, kaip ir bendras horizontalus pasipriešinimas.
Siauralapis lubinas (NLL, Lupinus angustifolius L.) yra daug baltymų turintis javas, kilęs iš vakarų Viduržemio jūros regiono1,2. Šiuo metu jis auginamas kaip maistinis augalas gyvūnams ir žmonėms. Dėl azoto fiksavimo simbiotinių azotą fiksuojančių bakterijų ir bendro dirvožemio struktūros pagerėjimo jis taip pat laikomas žaliąja trąša sėjomainos sistemose. Per pastarąjį šimtmetį NLL sparčiai prijaukino save ir vis dar patiria didelį veisimosi spaudimą3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Plačiai auginant NLL, patogeninių grybų seka sukūrė naujas žemės ūkio nišas ir sukėlė naujas pasėlius naikinančias ligas. Lubinų augintojams ir selekcininkams labiausiai įsiminė antraknozės, kurią sukelia patogeninis grybelis Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13, atsiradimas. Lubinų augintojams ir selekcininkams labiausiai įsiminė antraknozės, kurią sukelia patogeninis grybelis Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13, atsiradimas. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванногонконы памермеров (Bondaras) Nirenbergas, Feileris ir Hagedornas13. Lubinų augintojams ir selekcininkams labiausiai pastebimas buvo patogeninio grybelio Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 sukelta antraknozė.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是生病trichpin (Bondaras) Nirenbergas, Feileris ir Hagedornas13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是生病trichpin (Bondaras)嵵plaukuotas.1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызбонкогогоныватомого Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler ir Hagedorn13. Lubinų augintojams ir selekcininkams labiausiai stebina patogeninio grybelio Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 sukelta antraknozė.Ankstyviausi pranešimai apie ligą buvo gauti iš Brazilijos ir Jungtinių Amerikos Valstijų, o tipiški simptomai pasireiškė atitinkamai 1912 ir 1929 m. Tačiau po maždaug 30 metų patogenas buvo priskirtas Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorfa Glomerella cingulata (Akmenininkas) Spauld. & Sacc., teleomorfa Glomerella cingulata (Akmenininkas) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld teleomorfa. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld tikslinėje morfologijoje. & H. Schrenk,. ir H. Schrenk,.ir H. Šrenkas. ir H.施伦克，. ir H.施伦克，.ir H. Schlenk,.XX a. viduryje atliktas preliminarus ligos fenotipavimas parodė tam tikrą atsparumą NLL ir geltonųjų lubinų (L. luteus L.) atmainose, tačiau visos tirtos baltųjų lubinų (L. albus L.) atmainos buvo labai jautrios15,16. Tyrimai parodė, kad antraknozės vystymasis yra susijęs su padidėjusiu kritulių kiekiu (oro drėgme) ir temperatūra (12–28 °C diapazone), todėl esant aukštesnei temperatūrai atsparumas sumažėja17, 18. Iš tiesų, konidijoms sudygti ir ligai prasidėti reikalingas laikas esant 24 °C temperatūrai (4 valandos) buvo keturis kartus trumpesnis nei esant 12 °C temperatūrai (16 valandų) ir didelei drėgmei19. Taigi, nuolatinis visuotinis atšilimas lėmė antraknozės plitimą. Tačiau liga buvo pastebėta Prancūzijoje (1982 m.) ir Ukrainoje (1983 m.) kaip artėjančios grėsmės pranašas, tačiau tuo metu lubinų pramonė, matyt, jos ignoravo20,21. Po kelerių metų ši niokojanti liga išplito visame pasaulyje ir paveikė tokias pagrindines lubinus auginančias šalis kaip Australija, Lenkija ir Vokietija22,23,24. Po antraknozės protrūkio XX a. dešimtojo dešimtmečio viduryje atlikus išsamius tyrimus NLL19 mėginiuose buvo nustatyti keli atsparūs donorai. NLL atsparumą antraknozei kontroliuoja du atskiri dominuojantys aleliai, randami skirtinguose gemalo šaltiniuose: Lanr1 Tanjil veislėje ir Wonga bei AnMan Mandalay veislėje25, 26. Šie aleliai papildo molekulinius žymenis, kurie palaiko atsparios gemalo plazmos atranką veisimo programose25,26,27,28,29,30. Atspari veisimo linija 83A:476, turinti Lanr1 alelį, buvo kryžminta su jautria laukine linija P27255, siekiant gauti RIL populiaciją, besiskiriančią pagal atsparumą antraknozei, tai leido priskirti Lanr1 lokusą NLL-11 chromosomai31, 32, 33. Suderinus sąsajų žemėlapio žymenis nuo flankių atsparumo lokusų iki antraknozės su genominiu karkasu, NLL atskleidė visų trijų alelių vietą toje pačioje chromosomoje (NLL-11), bet skirtingose ​​pozicijose29,34,35. Tačiau dėl mažo RIL skaičiaus ir didelio genetinio atstumo tarp žymenų ir atitinkamų alelių negalima daryti patikimų išvadų apie jų pagrindinius genus. Kita vertus, atvirkštinės genetikos taikymas lubinams yra sudėtingas dėl labai mažo jų regeneracijos potencialo, todėl genetinė manipuliacija yra sudėtinga37.
Domesticizuotų gemalo ląstelių, turinčių norimą alelį homozigotinėje būsenoje, pvz., 83A:476 (Lanr1) ir Mandelup (AnMan), sukūrimas atvėrė duris antraknozės atsparumo tyrimams, esant priešingiems alelių deriniams laukinėse populiacijose. Molekulinių mechanizmų galimybės. Palyginkite specifinių genotipų sukeltus gynybos atsakus. Šiame tyrime buvo įvertintas ankstyvas NLL transkriptomo atsakas į C. lupini vakcinaciją. Pirmiausia, naudojant molekulinius žymenis, žyminčius Lanr1 ir AnMan alelius, buvo patikrinta Europos NLL gemalo ląstelių grupė, sudaryta iš 215 linijų. Tada kontroliuojamomis sąlygomis buvo atliktas antraknozės fenotipavimas 50 NLL linijų, anksčiau atrinktų molekuliniams žymenims. Remiantis šiais eksperimentais, buvo atrinktos keturios linijos, besiskiriančios antraknozės atsparumu ir Lanr1/AnMan alelių sudėtimi, diferencinės gynybos genų raiškos profiliavimui, naudojant du vienas kitą papildančius metodus: didelio našumo RNR sekoskaitą ir realaus laiko PGR kiekybinį nustatymą.
NLL gemalo plazmos rinkinio (N = 215) atranka su žymenimis Lanr1 (Anseq3 ir Anseq4) ir AnMan (Anseq4) bei AnMan (AnManM1) parodė, kad tik viena linija (95726, netoli Salamanca-b) amplifikuoja „atsparumo“ alelį visiems žymenims, o „jautrių“ alelių buvimas“ nustatė visų žymenų dalį 158 (~73,5 %) linijose. Trylika linijų išvedė du „atsparius“ Lanr1 žymens alelius, o 8 linijos – „atsparius“ Lanr1 alelius. Žymeklio „atsparumo“ alelis. AnMan žymens „atsparumo“ alelis (papildoma S1 lentelė). Dvi linijos buvo heterozigotinės Anseq3 žymeniui ir viena heterozigotinė AnManM1 žymeniui. 42 linijos (19,5 %) turėjo priešingas Anseq3 ir Anseq4 alelių fazes, o tai rodo didelį rekombinacijos dažnį tarp šių dviejų lokusų. Kontroliuojamomis sąlygomis tirti antraknozės fenotipai (papildoma S2 lentelė) atskleidė tirtų genotipų atsparumo kintamumą, kuris atsispindėjo antraknozės sunkume. Vidutinių balų skirtumai svyravo nuo 1,8 (vidutiniškai atsparus) iki 6,9 (jautrus), o augalų svorio skirtumai svyravo nuo 0,62 (jautrus) iki 4,45 g (atsparus). Nustatyta reikšminga koreliacija tarp verčių, gautų dviejuose eksperimento pakartojimuose (0,51 ligos sunkumo balams, P = 0,00017 ir 0,61 augalo svoriui, P < 0,0001), taip pat tarp šių dviejų parametrų (-0,59 ir -0,77, P < 0,0001). Nustatyta reikšminga koreliacija tarp dviejų eksperimento pakartojimų metu stebėtų verčių (0,51 ligos sunkumo balams, P = 0,00017 ir 0,61 augalo masei, P < 0,0001), taip pat tarp šių dviejų parametrų (-0,59 ir -0,77, P < 0,0001). Выявлена достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51) болезни, P = 0,00017 ir 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,57, Ри) 0,0001) 0,0001). Nustatyta reikšminga koreliacija tarp verčių, stebėtų dviejuose eksperimento pakartojimuose (0,51 ligos sunkumo balams, P = 0,00017 ir 0,61 augalo masei, P < 0,0001), taip pat tarp šių dviejų parametrų (-0,59 ir -0,77, P < 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评P =P0.51︌ 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77,00P <01)在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严 庺 程庆 评分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p < 0,0001） 以及 两 伪 参 数 之闈 ， 0,59 和 – 0,59 和 – 0,59 和 – 0,77, P < 0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях, Pовторностях, P51,0бости = 0,00017 ir масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 ir -0,0001) 0,77, P <0,0001 Nustatyta reikšminga koreliacija tarp dublikatuose gautomis reikšmėmis (ligos sunkumo balas 0,51, P = 0,00017 ir augalo masė 0,61, P < 0,0001), o tarp šių dviejų parametrų (-0,59 ir -0,0001) – 0,77, P < 0,0001. ).Tipiški jautriems augalams būdingi simptomai yra stiebo išlinkimas ir susisukimas, primenantis „piemens lanko“ struktūrą, po kurio seka ovalūs pažeidimai su oranžiniais/rausvais sporozoitais (papildomas 1 pav.). Australijos kopijos, turinčios Lanr1 (83A:476 ir Tanjil) ir AnMan (Mandelup) genus, yra vidutiniškai atsparios, 0,0331 ir 0,0036). Kai kurios linijos, kurios taip pat turi „atsparius“ Lanr1 ir (arba) AnMan alelius, rodo ligos simptomus.
Įdomu tai, kad kelios NLL linijos, neturinčios jokio „atsparaus“ žymens alelio, pasižymėjo dideliu atsparumu antraknozei (panašiu arba didesniu nei Lanr1 ar AnMan genotipai), tokios kaip Boregine (P vertė < 0,0001 abiem parametrams), Bojar (P vertė < 0,0001 balui ir 0,001 augalo svoriui) ir populiacija B-549/79b (P vertė < 0,0001 balui ir statistiškai nereikšminga svoriui). Įdomu tai, kad kelios NLL linijos, neturinčios jokio „atsparaus“ žymens alelio, pasižymėjo dideliu atsparumu antraknozei (panašiu arba didesniu nei Lanr1 ar AnMan genotipai), tokios kaip Boregine (P vertė < 0,0001 abiem parametrams), Bojar (P vertė < 0,0001 balui ir 0,001 augalo svoriui) ir populiacija B-549/79b (P vertė < 0,0001 balui ir statistiškai nereikšminga svoriui). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 b оценки и незначимо для массы). Įdomu tai, kad kelios NLL linijos, neturinčios jokių „atsparių“ žymenų alelių, pasižymėjo dideliu atsparumu antraknozei (panašiu arba didesniu nei Lanr1 ar AnMan genotipai), pvz., Boregine (P vertė < 0,0001 abiem parametrams), Bojar (P vertė < 0,0001 vertinimui ir 0,001 augalo svoriui) ir populiacija B-549/79b (P vertė < 0,0001 vertinimui ir statistiškai nereikšminga svoriui).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的位基因的位基因的位基因的位基因的位基因的位基因的位基因的位基因的位显示出高気平的缺気平的炭痊水平的炭疊或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分为0,0001，植物重量为0,001）和种群B-549/79b（得分P 值。睂渍重量丏 Įdomu tai, kad kai kurios NLL sistemos, neturinčios jokių „antigeninių“ žymenų, pasižymi dideliu horizontaliu atsparumu (atitinkančiu Lanr1 arba AnMan genus arba aukštesniu), tokios kaip Boregine (abu parametrai P < 0,0001), Bojar (P vertė < 0,0001, augalo svoris 0,001) ir B-549/79b padermė (P vertė < 0,0001, svoris statistiškai nereikšmingas). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высок к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих парамет00в1),
(значение P <0,0001, масса растения 0,001) ir популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначити). Įdomu tai, kad kai kurios NLL linijos, neturinčios jokių „atsparumo“ žymenų alelių, pasižymėjo dideliu atsparumu antraknozei (panašiu į Lanr1 arba AnMan genotipus arba didesniu nei jie), tokios kaip Boregine (abiejų parametrų P vertė <0,0001), Bojar (P vertė <0,0001, augalo svoris 0,001) ir populiacija B-549/79b (P vertė <0,0001, svoris statistiškai nereikšmingas).Šis reiškinys rodo galimybę egzistuoti naujam genetiniam atsparumo šaltiniui, paaiškinančiam pastebėtą koreliacijos nebuvimą tarp žymenų genotipų ir ligos fenotipų (P reikšmės nuo ~0,42 iki ~0,98). Taigi, Kolmogorovo-Smirnovo testas parodė, kad duomenys apie atsparumą antraknozei buvo maždaug normaliai pasiskirstę pagal balus (P reikšmės 0,25 ir 0,11) ir augalo masę (P reikšmės 0,47 ir 0,55), o tai leidžia man daryti prielaidą, kad dalyvauja daugiau alelių nei Lanr1 ir AnMan.
Remiantis antraknozės atsparumo atrankos rezultatais, transkriptomo analizei buvo pasirinktos 4 linijos: 83A:476, Boregine, Mandelup ir populiacija 22660. Šios linijos buvo pakartotinai patikrintos dėl atsparumo juodligei inokuliacijos eksperimentuose, naudojant RNR sekvenavimą, su sąlyga, kad jos buvo tokios pačios kaip ir ankstesniame bandyme. Balų vertės buvo tokios: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) ir populiacija 22660 (6,11 ± 1,29).
„Illumina NovaSeq 6000“ protokolas pasiekė vidutiniškai 40,5 M skaitymo porų vienam mėginiui (nuo 29,7 iki 54,4 M skaitymo) (papildoma S3 lentelė). Suderinimo balai etaloninėje sekoje svyravo nuo 75,5 % iki 88,6 %. Vidutinė skaitymo skaičiaus duomenų koreliacija tarp eksperimentinių variantų tarp biologinių pakartojimų svyravo nuo 0,812 iki 0,997 (vidurkis 0,959). Iš 35 170 analizuotų genų 2917 genų raiška nebuvo nustatyta, o kiti 4785 genai buvo ekspresuojami nereikšmingai (bazinis vidurkis < 5). Iš 35 170 analizuotų genų 2917 genų raiška nebuvo nustatyta, o kiti 4785 genai buvo ekspresuojami nereikšmingai (bazinis vidurkis < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались экспрессировались (базовое среднее <5). Iš 35 170 analizuotų genų 2917 neparodė jokios raiškos, o likę 4785 genai buvo ekspresuojami nereikšmingu lygiu (bazinis vidurkis <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）.35 170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительсюпо среднее значение <5). Iš 35 170 analizuotų genų 2917 nebuvo ekspresuoti, o likę 4785 genai turėjo nereikšmingą ekspresiją (bazinis vidurkis <5).Taigi, eksperimento metu išreikštų genų skaičius (bazinis vidurkis ≥ 5) buvo 27 468 (78, 1%) (papildoma S4 lentelė).
Nuo pirmojo laiko momento visos NLL linijos reagavo į C. lupini (Col-08 padermė) inokuliaciją perprogramuodamos transkriptomą (1 lentelė), tačiau tarp linijų buvo pastebėti reikšmingi skirtumai. Taigi, atsparumo linija 83A:476 (turinti Lanr1 geną) parodė reikšmingą transkriptomo perprogramavimą pirmuoju laiko momentu (6 hpi), kai izoliuotų „up“ ir „down“ genų skaičius padidėjo 31–69 kartus, palyginti su kitais laiko momentais. Be to, šis pikas buvo trumpalaikis, nes antruoju laiko momentu (12 hpi) tik kelių genų raiška išliko reikšmingai pakitusi. Įdomu tai, kad Boregine, kuri taip pat parodė aukštą atsparumo lygį transplantato teste, eksperimento metu nepatyrė tokio masinio transkripcijos perprogramavimo. Tačiau skirtingai ekspresuojamų genų (DEG) skaičius Boregine ir 83A:476 buvo toks pat 12 hpi. Ir Mandelup, ir 22660 populiacija parodė DEG pikus paskutiniu laiko momentu (48 l/s), o tai rodo santykinį gynybinių reakcijų vėlavimą.
Kadangi 83A:476 linijoje, reaguojant į C. lupini 6 HPI, palyginti su visomis kitomis linijomis, buvo atliktas didžiulis transkriptomo perprogramavimas, ~91 % šiuo metu stebėtų diferenciacijos pokyčių (DEG) buvo būdingi linijai (1 pav.). Tačiau ankstyvieji tyrimo linijų atsakai tam tikru mastu sutapo, nes atitinkamai 68,5 %, 50,9 % ir 52,6 % DEG Boregine, Mandelup ir 22660 populiacijoje sutapo su tam tikrais laiko momentais 83A:476 aptiktais DEG. Tačiau šie DEG sudarė tik nedidelę dalį (0,97–1,70 %) visų šiuo metu naudojant 83A:476 aptiktų DEG. Be to, šiuo metu 11 visų linijų diferenciacijos skirtumų (DEG) buvo koherentiniai (papildomos S4–S6 lentelės), įskaitant bendrus augalų apsaugos atsakų komponentus: lipidų pernašos baltymą (TanjilG_32225), endogliukan-1,3-β-gliukozido fermentą (TanjilG_23384), du streso indukuojamus baltymus, tokius kaip SAM22 (TanjilG_31528 ir TanjilG_31531), bazinį latekso baltymą (TanjilG_32352) ir du glicino turtingus struktūrinius ląstelės sienelės baltymus (TanjilG_19701 ir TanjilG_19702). Taip pat buvo gana didelis transkriptomų atsakų sutapimas tarp 83A:476 ir Boregino 24 HPI (iš viso 16–38 % DEG) ir tarp Mandelup ir populiacijos 22660 48 HPI (iš viso 14–20 % DEG).
Venno diagrama, rodanti skirtingai ekspresuojamų genų (DEG) skaičių siauralapių lubinų (NLL) linijose, inokuliuotose Colletotrichum lupini (Col-08 padermė, gauta iš lubinų laukų Verženicėse, Lenkijoje, 1999 m.). Analizuotos NLL linijos buvo: 83A:476 (atspari, turinti Lanr1 alelį), Boregine (atspari, genetinis fonas nežinomas), Mandelup (vidutiniškai atspari, turinti AnMan alelį) ir 22660 populiacija (labai jautri). Santrumpa hpi reiškia valandas po vakcinacijos. Siekiant supaprastinti grafiką, nulinės vertės buvo pašalintos.
6 hpi per daug ekspresuotų genų rinkinys buvo analizuojamas siekiant nustatyti kanoninių R geno domenų buvimą (papildoma S7 lentelė). Šis tyrimas atskleidė klasikinių ligų atsparumo genų transkriptomo indukciją tik su NBS-LRR domenais ties 83A:476. Šį rinkinį sudarė vienas TIR-NBS-LRR genas (tanjilg_05042), penki CC-NBS-LRR genai (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 ir tanjilg_16162), keturi NBS-LR (Tanjilg_16162) ir keturi NBS-LRRE (tanjilg_16162), taip pat keturi NBS-Lrr (tanjilg_16162) ir keturi NBS-LRR (TANJILG_16162). Visi šie genai turi kanoninius domenus, išdėstytus konservatyviomis sekomis. Be NBS-LRR domeno genų, kelios RLL kinazės buvo aktyvuotos 6 hpi, būtent viena Boregine (TanjilG_19877), dvi Mandelup (TanjilG_07141 ir TanjilG_19877) ir 22660 populiacijoje (TanjilG_09014 ir TanjilG_10361) ir dvi 83A 27:476.
Genai, kurių ekspresija reikšmingai pakito reaguojant į inokuliaciją C. lupini (Col-08 padermė), buvo tiriami genų ontologijos (GO) praturtinimo analize (papildoma S8 lentelė). Dažniausiai per daug reprezentuojamas biologinio proceso terminas buvo „GO:0006952 gynybinis atsakas“, kuris pasirodė 6 iš 16 (laiko × eilutė) derinių, turinčių didelę reikšmę (P vertė < 0, 001) (2 pav.). Dažniausiai per daug reprezentuojamas biologinio proceso terminas buvo „GO:0006952 gynybinis atsakas“, kuris pasirodė 6 iš 16 (laiko × eilutė) derinių, turinčių didelę reikšmę (P vertė < 0, 001) (2 pav.). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный», отковтоный появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Dažniausiai per daug reprezentuojamas biologinio proceso terminas buvo „GO:0006952 gynybinis atsakas“, kuris pasirodė 6 iš 16 (laikas × linija) derinių, turinčių didelę reikšmę (P vertė < 0,001) (2 pav.).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）. Tipiškiausias biologinio proceso terminas yra „GO:0006952 gynybinis atsakas“, kuris pasireiškia 6 iš 16 (时间×线) derinių, pasižymintis didele reikšmingumu (P reikšmė < 0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», копяры 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Dažniausiai per daug reprezentuojamas biologinio proceso terminas buvo „GO:0006952 Defense Response“, kuris pasirodė 6 iš 16 derinių (laikas × linija) su didele reikšmingumu (P reikšmė < 0,001) (2 pav.).Šis terminas buvo pernelyg išreikštas dviem laiko momentais 83A populiacijoje: 476 ir Boregine (6 ir 24 hpi) ir vienu laiko momentu Mandelup ir populiacijoje 22660 (atitinkamai 12 ir 6 hpi). Tai laukiamas rezultatas, pabrėžiantis atsparių linijų priešgrybelinį atsaką. Be to, 83A:476 reagavo į C. lupini greitai indukuodamas genus, susijusius su oksidaciniu pliūpsniu, kurį vaizduoja terminas „GO:0055114 redokso procesas“, rodantis specifinį gynybinį atsaką, o Boregine atskleidė specifinius gynybinius atsakus, susijusius su terminu „GO“. :0006950 Streso atsakas“. Populiacija 22660 aktyvavo horizontalųjį pasipriešinimo atsaką, apimantį antrinius metabolitus, pabrėžiant per didelį terminų „GO:0016104 Triterpenų biosintezės procesas“ ir „GO:0006722 Triterpenų metabolizmo procesas“ skaičių (abu terminai priklauso tam pačiam genų rinkiniui), atsižvelgiant į GO terminų praturtinimo analizės rezultatus, Mandelup reakcijos stabilumas buvo tarp Boregine ir populiacijos 22660. Be to, ankstyvoji reakcija 83A:476 (6 hpi) ir uždelstoji reakcija Mandelup ir populiacija 22660 apima terminą GO:0015979 „fotosintezė“ ir kitus susijusius biologinius procesus.
Anotuojant diferencijuotai ekspresuojamus genus siauralapio lubino (NLL), inokuliuoto juodligės lubinais (Col-08 padermė, gauta iš lubinų laukų Vierženicėse, Lenkijoje, 1999 m.), transkriptomo atsakų metu, pasirinkti bioprocesų genų ontologijos terminai yra labai perdėti. Analizuotos NLL linijos buvo: 83A:476 (atspari, turinti homozigotinį Lanr1 alelį), Boregine (atspari, nežinomas genetinis fonas), Mandelup (vidutiniškai atspari, turinti homozigotinį AnMan alelį) ir populiacija 22660 (jautri).
Kadangi šio tyrimo tikslas buvo nustatyti genus, prisidedančius prie atsparumo antraknozei, genai, priskirti terminams GO „GO: 0006952 Gynybiniai atsakai“ ir „GO: 0055114 Redokso procesai“, buvo analizuojami su ribinėmis vertėmis nuo pradinių vidurkių ≥ 30 su bent viena linija × laiko momentas, sujungiant statistiškai reikšmingas log2 vertes (kartų pokytis). Šiuos kriterijus atitiko 65 genai GO:0006952 atveju ir 524 genai GO:0055114 atveju.
83A:476 atskleidė du DEG pikus, pažymėtus terminu GO:0006952: pirmąjį – esant 6 genams colyje (64 genai, reguliavimas aukštyn ir žemyn), o antrąjį – esant 24 genams colyje (15 genų, tik reguliavimas aukštyn). Boregine taip pat parodė, kad GO:0006952 piką pasiekė tuo pačiu laiko momentu, bet su mažesniu DEG (11 ir 8) ir pirmenybiniu aktyvavimu. Mandeloop parodė du GO:0006952 pikus – esant 12 ir 48 HPI, abu turėjo po 12 genų (pirmąjį – su aktyvuojančiais genais, o antrąjį – tik su slopinančiais genais), o 22660 populiacijoje, esančioje 6 HPI (13 genų), didesnė reguliacijos padidėjimo piko dominavimas. Reikėtų pažymėti, kad 96,4 % GO:0006952 DEG šiuose pikuose turėjo to paties tipo atsaką (aukštyn arba žemyn), o tai rodo reikšmingą gynybinių reakcijų sutapimą, nepaisant skirtingų dalyvaujančių genų skaičiaus. Didžiausia su terminu GO:0006952 susijusių sekų grupė koduoja badavimo streso sukeltą pranešimo baltymą 22 (SAM22 tipo), kuris priklauso 10 klasės patogenezės sukelto baltymo (PR-10) baltymo kladui ir šerdies baltymo lateksui. Panašaus (MLP tipo) baltymo) baltymas (3 pav.). Abi grupės skyrėsi raiškos pobūdžiu ir atsako kryptimi. SAM22 tipo baltymus koduojantys genai parodė nuoseklią ir reikšmingą indukciją ankstyvaisiais laiko momentais (6 arba 12 hpi) ir paprastai nereagavo eksperimento pabaigoje (48 hpi), o MLP tipo baltymai parodė koordinaciją 6 hpi. 83A:476 ir Mandelup baltymai parodė koordinaciją 48 hpi, beveik visi kiti duomenų taškai nereagavo. Be to, SAM22 tipo baltymų genų raiškos profilių skirtumai atitiko pastebėtą antraknozės atsparumo kintamumą, nes atsparesnės linijos turėjo daugiau laiko momentų, kurie reikšmingai indukavo šiuos genus, nei jautresni genai. Kitas į LlR18A/B panašus PR-10 genas parodė labai panašų raiškos modelį kaip ir į SAM22 panašus baltymo genas.
Buvo nustatyti pagrindiniai biologinio proceso termino „GO:0006952 gynybos atsakas“ komponentai ir Lanr1 bei AnMan alelių kandidatų genų raiškos modeliai. Log2 skalė rodo log2 vertes (kartotinį pokytį) tarp inokuliuotų (Colletotrichum lupini, Col-08 padermė, gauta iš lubinų laukų, Viženicoje, Lenkijoje, 1999 m.) ir kontrolinių (kontrolinės inokuliacijos būdu) augalų tuo pačiu laiko momentu. Buvo analizuojamos šios siauralapių lubinų linijos: 83A:476 (atspari, turinti homozigotinį Lanr1 alelį), Boregine (atspari, genetinis fonas nežinomas), Mandelup (vidutiniškai atspari, turinti homozigotinį AnMan alelį) ir populiacija 22660 (jautri).
Be to, buvo įvertinti RNR sekoskaitos kandidatų genų Lanr1 (TanjilG_05042) ir AnMan (TanjilG_12861) raiškos profiliai (3 pav.). TanjilG_05042 genas parodė reikšmingą atsaką (aktyvaciją) ties 83A:476 tik pirmuoju laiko momentu (6 hpi), o TanjilG_12861 buvo reikšmingas Mandeloop raiškos metu tik dviem laiko momentais: 6 hpi (sumažėjusi reguliacija) ir 24 hpi (6 hpi). Su. (reguliuojamas) ).
Labiausiai per daug ekspresuoti genai termine GO:0055114 „redokso procese“ buvo citochromo P450 baltymus ir peroksidazę koduojantys genai (4 pav.). Mėginiams, išskirtiems iš 83A:476 po 6 HPI, didžiausios arba mažiausios log2 (kartotinio pokyčio) vertės (86,6 % genų) paprastai buvo stebimos tarp inokuliuotų ir kontrolinių augalų, o tai pabrėžia didelį šio genotipo atsaką į inokuliuojančią lytį. 83A:476 parodė reikšmingiausią GO:0055114 DEG po 6 HPI (503 genai), o likusios linijos – po 48 HPI (Boregine, 31 genas; Mandelup, 85 genai; ir Populiacija 22660, 78 genai). Daugumoje GO:0055114 šeimos genų buvo stebimi dviejų tipų atsakai į vakcinaciją (aktyvacija ir slopinimas). Įdomu tai, kad iki 97,6 % termino GO: 0055114 DEG, nustatytų Mandelupėje esant 48 AG galiai. Šie stebėjimai rodo, kad, nepaisant žymiai mažesnio masto (t. y. mutavusių redokso genų skaičiaus – 85, palyginti su 503), mandelupės uždelstų transkriptomų atsakų į antraknozę modelis yra panašus į ankstyvą 83A:476 atsaką. Boregine ir 22660 populiacijoje ši konvergencija yra mažesnė – atitinkamai 51,6 % ir 75,6 %.
Buvo atskleisti biologinio proceso „GO:0055114 Redokso procesas“ termino pagrindinių komponentų raiškos modeliai. Log2 skalė rodo log2 vertes (kartotinį pokytį) tarp inokuliuotų (Colletotrichum lupini, Col-08 padermė, gauta iš lubinų laukų, Viženicoje, Lenkijoje, 1999 m.) ir kontrolinių (kontrolinės inokuliacijos būdu) augalų tuo pačiu laiko momentu. Buvo analizuojamos šios siauralapių lubinų linijos: 83A:476 (atspari, turinti homozigotinį Lanr1 alelį), Boregine (atspari, genetinis fonas nežinomas), Mandelup (vidutiniškai atspari, turinti homozigotinį AnMan alelį) ir populiacija 22660 (jautri).
83A:476 Transkriptominės reakcijos į inokuliaciją C. lupini (Col-08 padermė) taip pat apėmė koordinuotą genų, priskiriamų terminui GO:0015979 „fotosintezei“ ir kitiems susijusiems biologiniams procesams, nutildymą (5 pav.). Šiame GO:0015979 DEG rinkinyje buvo 105 genai, kurie buvo reikšmingai represuoti 6 HPI ties 83A:476. Šiame pogrupyje 37 genai taip pat buvo sumažėję Mandelup 48 HPI ir 35 tuo pačiu laiko momentu 22660 populiacijoje, įskaitant 19 DEG, bendrų abiem genotipams. Jokie su terminu GO:0015979 susiję DEG nebuvo reikšmingai aktyvuoti jokiame derinyje (eilutė x laikas).
Buvo atskleisti biologinio proceso „GO:0015979 fotosintezės“ termino pagrindinių komponentų raiškos modeliai. Log2 skalė rodo log2 vertes (kartotinį pokytį) tarp inokuliuotų (Colletotrichum lupini, Col-08 padermė, gauta iš lubinų laukų, Viženicoje, Lenkijoje, 1999 m.) ir kontrolinių (kontrolinės inokuliacijos būdu) augalų tuo pačiu laiko momentu. Buvo analizuojamos šios siauralapių lubinų linijos: 83A:476 (atspari, turinti homozigotinį Lanr1 alelį), Boregine (atspari, genetinis fonas nežinomas), Mandelup (vidutiniškai atspari, turinti homozigotinį AnMan alelį) ir populiacija 22660 (jautri).
Remiantis diferencinės raiškos analizės rezultatais ir, tikėtina, dalyvaujant gynybiniuose atsakuose prieš patogeninius grybus, šis septynių genų rinkinys buvo pasirinktas raiškos profilių kiekybiniam nustatymui realaus laiko PGR metodu (papildoma S9 lentelė).
Tariamas baltymo genas TanjilG_10657 buvo reikšmingai indukuotas visose tirtose linijose ir laiko taškuose, palyginti su kontroliniais (mimikiniais) augalais (papildomos lentelės S10, S11). Be to, TanjilG_10657 raiškos profilis eksperimento metu visose linijose rodė didėjimo tendenciją. 22660 populiacija parodė didžiausią TanjilG_10657 jautrumą inokuliacijai, kai aktyvacija buvo 114 kartų didesnė, o santykinis raiškos lygis (4,4 ± 0,4) buvo pasiektas 24 HPI (6a pav.). PR10 LlR18A baltymo genas TanjilG_27015 taip pat parodė aktyvaciją visose linijose ir laiko taškuose, o statistiškai reikšmingas skirtumas buvo pasiektas daugumoje duomenų taškų (6b pav.). Panašiai kaip ir TanjilG_10657 atveju, didžiausias santykinis TanjilG_27015 raiškos lygis buvo pastebėtas 22660 inokuliuotoje populiacijoje 24 HPI (19,5 ± 2,4). Rūgštinės endochitinazės geno TanjilG_04706 raiška buvo reikšmingai padidėjusi visose linijose ir visais laiko momentais, išskyrus Boregine 6 hpi (6c pav.). Jis buvo stipriai indukuotas pirmajame laiko momente (6 hpi) ties 83A:476 (10,5 karto) ir vidutiniškai padidėjo kitose linijose (6,6–7,5 karto). Eksperimento metu TanjilG_04706 raiška išliko panašiame lygyje 83A:476 ir Boregine, o Mandelup ir 22660 populiacijoje ji reikšmingai padidėjo ir pasiekė santykinai aukštas vertes (atitinkamai 5,9 ± 1,5 ir 6,2 ± 1,5). Endogliukan-1,3-β-gliukozidazės tipo genas TanjilG_23384 parodė didelę aktyvaciją pirmaisiais dviem laiko momentais (6 ir 12 hpi) visose linijose, išskyrus 22660 populiaciją (6d pav.). Didžiausi santykiniai TanjilG_23384 raiškos lygiai buvo pastebėti antruoju laiko momentu (12 HPI) Mandelup (2,7 ± 0,3) ir 83A:476 (1,5 ± 0,1) linijose. 24 HPI metu TanjilG_23384 raiška visose tirtose linijose buvo santykinai maža (nuo 0,04 ± 0,009 iki 0,44 ± 0,12).
Pasirinktų genų (ag) raiškos profiliai, gauti kiekybine PGR metodu. Skaičiai 6, 12 ir 24 žymi valandas po vakcinacijos. LanDExH7 ir LanTUB6 genai buvo naudojami normalizavimui, o LanTUB6 – tarpserijų kalibravimui. Paklaidų juostos rodo standartinį nuokrypį, pagrįstą trimis biologiniais pakartojimais, kurių kiekvienas yra trijų techninių pakartojimų vidurkis. Statistinis reikšmingumas, skiriantis statistiškai reikšmingus skirtumus tarp užkrėstų (Colletotrichum lupini, Col-08 padermė, gauta 1999 m. iš lubinų lauko Vierženicoje, Lenkijoje) ir kontrolinių (kontrolinės inokuliacijos būdu užkrėstų) augalų raiškos lygių (*P reikšmė < 0,05, **P reikšmė ≤ 0,01, ***P reikšmė ≤ 0,001). Statistinis reikšmingumas, skiriantis statistiškai reikšmingus skirtumus tarp užkrėstų (Colletotrichum lupini, Col-08 padermė, gauta 1999 m. iš lubinų lauko Vierženicoje, Lenkijoje) ir kontrolinių (kontrolinės inokuliacijos būdu užkrėstų) augalų raiškos lygių (*P reikšmė < 0,05, **P reikšmė ≤ 0,01, ***P reikšmė ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штаменпо Col-08, 199 col. с поля люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Statistiškai reikšmingi raiškos lygių skirtumai tarp inokuliuotų (Colletotrichum lupini, Col-08 padermė, gauta 1999 m. iš lubinų lauko Vierženicėse, Lenkijoje) ir kontrolinių (kontrolinės inokuliuotos) augalų pažymėti virš duomenų taškų (*P reikšmė < 0,05, **P reikšmė ≤ 0,01, ***P reikšmė ≤ 0,001).接种 (Colletotrichum Lupini, Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性丧标记在数) 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， spalva-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对玤之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, **P ≤ 0,01, ***P.01) Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штаменный, Col-08, люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями (*нымхи отмечены над значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Statistiškai reikšmingi raiškos lygių skirtumai tarp inokuliuotų (Colletotrichum lupini, Col-08 padermė, gauta iš lubinų laukų Verženicėse, Lenkijoje, 1999 m.) ir kontrolinių (kontrolinės inokuliuotos) augalų pažymėti virš duomenų taškų (*P reikšmė < 0,05, **P reikšmė ≤ 0,01, ***P reikšmė ≤ 0,001).Analizuotos NLL linijos buvo šios: 83A:476 (atsparios, turinčios homozigotinį Lanr1 alelį), Mandelup (vidutiniškai atsparios, turinčios homozigotinį AnMan alelį), Boregine (atsparios, nežinomas genetinis fonas) ir populiacija 22660 (jautrios).
Kandidato geno TanjilG_05042 Lanr1 lokuse raiška gerokai skyrėsi nuo profilių, gautų atliekant RNR sekoskaitos tyrimus (6e pav.). Reikšmingas šio geno aktyvavimas pastebėtas Mandelup ir 22660 populiacijose (atitinkamai iki 39,7 ir 11,7 karto), dėl to ekspresijos lygis buvo santykinai aukštas (atitinkamai iki 1,4 ± 0,14 ir 7,2 ± 1,3). 83A:476 taip pat atskleidė tam tikrą TanjilG_05042 geno ekspresijos padidėjimą (iki 3,8 karto), tačiau pasiekti santykiniai ekspresijos lygiai (0,044 ± 0,002) buvo daugiau nei 30 kartų mažesni nei stebėti Mandelup ir 22660 populiacijose. KPGR analizė parodė reikšmingus ekspresijos lygių skirtumus tarp genotipų imitacinės vakcinacijos (kontrolinėse) variantuose, pasiekdama 58 kartų skirtumą tarp populiacijų 22660 ir 83A:476, taip pat tarp populiacijų 22660 ir 22660. Dvigubas skirtumas buvo pasiektas tarp Boregine ir Mandalup.
AnMan lokuse esantis kandidato genas TanjilG_12861 buvo aktyvuotas reaguojant į vakcinaciją 83A:476 ir Mandelup populiacijose, buvo neutralus 22660 populiacijoje ir buvo sumažintas Boregine populiacijoje (6f pav.). Santykinė TanjilG_12861 geno raiška buvo didžiausia inokuliuotoje 83A:476 populiacijoje (0,14±0,01). 17,4 kDa I klasės šilumos šoko baltymo genas TanjilG_05080 HSP17.4 parodė mažesnius santykinius raiškos lygius visose tirtose padermėse ir laiko momentuose (6g pav.). Didžiausia vertė pastebėta 24 dieną po vakcinacijos 22660 populiacijoje (0,14 ± 0,02, aštuonis kartus padidėjęs atsakas į vakcinaciją).
Palyginus genų raiškos profilius (7 pav.), nustatyta didelė koreliacija tarp TanjilG_10657 ir keturių kitų genų: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) ir TanjilG_04706 (r = 0,79). Tokie rezultatai gali rodyti šių genų koreguliaciją gynybinių reakcijų metu. TanjilG_12861 ir TanjilG_23384 genai parodė skirtingus raiškos profilius su mažesnėmis Pearsono koreliacijos koeficiento reikšmėmis (atitinkamai nuo 0,08 iki 0,43 ir nuo -0,19 iki 0,28), palyginti su kitais genais.
Koreliacijos tarp genų raiškos profilių buvo nustatytos naudojant kiekybinę PGR. Buvo analizuojamos šios siauralapių lubinų linijos: 83A:476 (atsparios, turinčios homozigotinį Lanr1 alelį), Mandelup (vidutiniškai atsparios, turinčios homozigotinį AnMan alelį), Boregine (atsparios, genetinis fonas nežinomas) ir populiacija 22660 (jautrios). Buvo apskaičiuoti trys laiko taškai (6, 12 ir 24 valandos po inokuliacijos), įskaitant inokuliuotus (Colletotrichum lupini, Col-08 padermė, gauta iš lubinų laukų Verženicėse, Lenkijoje, 1999 m.) ir kontrolinius (kontrolinės inokuliacijos) augalus. Skalė rodo Pearsono koreliacijos koeficiento vertę.
Remiantis duomenimis, gautais esant 6 arklio galioms colyje, WGCNA buvo atliktas su 9981 DEG, identifikuotu palyginus inokuliuotus ir kontrolinius augalus, siekiant sutelkti dėmesį į ankstyvuosius gynybinius atsakus (papildoma S12 lentelė). Buvo rasti dvidešimt du genų moduliai (klasteriai), kuriuose buvo koreliuojami (teigiami arba neigiami) genotipų ir eksperimentinių variantų raiškos profiliai. Vidutiniškai genų raiškos lygiai mažėjo tokia tvarka: 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populiacija 22660 (tačiau abiejuose variantuose ši tendencija buvo stipresnė kontroliniuose augaluose). Vidutiniškai genų raiškos lygiai mažėjo tokia tvarka: 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populiacija 22660 (tačiau abiejuose variantuose ši tendencija buvo stipresnė kontroliniuose augaluose). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Gyventojai 22660 была сильнее у контрольных растений). Vidutiniškai genų raiškos lygiai mažėjo tokia tvarka: 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populiacija 22660 (tačiau abiejuose variantuose ši tendencija buvo stipresnė kontroliniuose augaluose).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Gyventojų skaičius 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）.平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> gyventojų skaičius 22660 的 顺序 下降 （Ｇ 在在 在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。. В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Gyventojų skaičius 22660 сильнее у контрольных растений). Vidutiniškai genų raiškos lygis sumažėjo serijoje 83A:476 > Mandelup > Boregine > populiacija 22660 (tačiau abiejuose variantuose ši tendencija buvo stipresnė kontroliniuose augaluose).Vakcinacija lėmė genų ekspresijos padidėjimą, ypač 18, 19, 14, 6 ir 1 moduliuose (mažėjančia poveikio tvarka), neigiamą reguliaciją (pvz., 9 ir 20 moduliai) arba neutralų poveikį (pvz., 11, 22, 8 ir 13 moduliai). GO terminų praturtinimo analizė (papildoma S13 lentelė) atskleidė „GO: 0006952 apsaugines reakcijas“ inokuliuotame modulyje (18) su maksimaliu aktyvavimu, įskaitant genus, analizuotus kPGR metodu (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 ir TanjilG_27015), taip pat daugelyje labiausiai slopinamų fotosintezės modulių (9). 18 modulio koncentratorius (8 pav.) buvo identifikuotas kaip TanjilG_26536 genas, koduojantis PR-10 panašų LlR18B baltymą, o 9 modulio koncentratorius – kaip TanjilG_28955 genas, koduojantis fotosistemos II PsbQ baltymą. Antraknozės atsparumo genas Lanr1, TanjilG_05042, buvo rastas 22 modulyje (9 pav.), kuris yra susijęs su terminais „GO:0044260 Ląstelių makromolekuliniai metaboliniai procesai“ ir „GO:0006355 Transkripcijos reguliavimas, DNR šablonų sudarymas“, turintis TanjilG_01212 šakotį. Genas koduoja šiluminio streso transkripcijos faktorių A-4a (HSFA4a).
Svertinė tinklo analizė, atlikta su moduliais, kuriuose per daug atstovaujami biologinių procesų terminai „GO: 0006952 Gynybos atsakai“. Ligavimas buvo supaprastintas, siekiant paryškinti keturis genus, analizuotus naudojant kPGR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 ir TanjilG_27015).
Svertinė tinklo analizė, atlikta modulio, turinčio pernelyg reprezentuotą biologinio proceso terminą „GO: 0006355: Transkripcijos reguliavimas, DNR šablonų kūrimas“ ir turinčio antraknozės atsparumo geną Lanr1 TanjilG_05042, genų koekspresijos. Ligavimas buvo supaprastintas, siekiant išskirti TanjilG_05042 geną ir centrinį TanjilG_01212 geną.
Australijoje atliktas antraknozės atsparumo tyrimas parodė, kad dauguma anksti išleistų veislių buvo jautrios; Kalya, Coromup ir Mandelup apibūdintos kaip vidutiniškai atsparios, o Wonga, Tanjil ir 83A:476 – kaip labai atsparios26,27,31. turėjo tą patį atsparumo alelį, pažymėtą Lanr1, o Coromup ir Mandelup turėjo kitą alelį, pažymėtą AnMan10,26,39, o Kalya perdavė kitą alelį, Lanr2. Vokietijoje atliktas antraknozės atsparumo tyrimas lėmė atsparios linijos Bo7212 identifikavimą su kitu kandidato aleliu nei Lanr1, pažymėtu LanrBo36.
Mūsų tyrimas atskleidė labai mažą (apie 6 %) Lanr1 alelio dažnį tirtoje gemalo plazmoje. Šis stebėjimas atitinka Rytų Europos gemalo plazmos atrankos naudojant Anseq3 ir Anseq4 žymenis rezultatus, kurie parodė, kad Lanr1 alelis yra tik dviejose Baltarusijos linijose. Tai rodo, kad Lanr1 alelis dar nėra plačiai naudojamas vietinėse selekcijos programose, kitaip nei Australijoje, kur jis yra vienas iš pagrindinių alelių žymenimis paremtam selekcijai. Tai gali būti dėl mažesnio Lanr1 alelio užtikrinamo atsparumo lygio Europos lauko sąlygomis, palyginti su Australijos ataskaita. Be to, antraknozės tyrimai Australijos vietovėse, kuriose gausu kritulių, parodė, kad Lanr1 alelio sukeliami atsparumo atsakai gali būti neveiksmingi esant oro sąlygoms, kurios palankios patogeno augimui ir sparčiam vystymuisi19,42. Tiesą sakant, šiame tyrime kai kurie antraknozės simptomai buvo pastebėti ir genotipuose, turinčiuose Lanr1 alelį, o tai rodo, kad atsparumas gali išnykti optimaliomis C. lupini vystymosi sąlygomis. Be to, galimos klaidingai teigiamos Anseq3 ir Anseq4 žymenų, kurie yra maždaug 1 cM atstumu nuo Lanr1 lokuso, buvimo interpretacijos [28, 30, 43].
Mūsų tyrimas parodė, kad 83A:476, turintis Lanr1 alelį, į C. lupini inokuliaciją reagavo didelio masto transkriptomo perprogramavimu pirmuoju analizuotu laiko momentu (6 hpi), o Mandelup, turintis AnMan alelį, transkriptominiai atsakai buvo pastebėti daug vėliau (nuo 24 iki 48 hpi). Šie laikini gynybinių atsakų skirtumai yra susiję su ligos simptomų skirtumais, pabrėžiant ankstyvo patogeno atpažinimo svarbą sėkmingam atsakui į atsparumą. Kad užkrėstų augalo audinius, juodligės sporos šeimininko paviršiuje turi pereiti kelis vystymosi etapus, įskaitant dygimą, ląstelių dalijimąsi ir apresorijaus susidarymą. Ataugėlė yra infekcinė struktūra, kuri prisitvirtina prie šeimininko paviršiaus ir palengvina prasiskverbimą į šeimininko audinius. Taigi, žirnių ekstrakte esančios C. gloeosporioides sporos parodė pirmąjį branduolio dalijimąsi po 75–90 minučių inkubacijos, gemalo vamzdelio susidarymą po 90–120 minučių ir slopinimą po 4 valandų. Mango *C. gloeosporioides* po 3 valandų inkubacijos parodė daugiau nei 40 % konidijų sudygimo ir apie 20 % slopintojų susidarymo po 4 valandų. Su virulentiškumu susijęs *C. gloeosporioides* CAP20 genas parodė transkripcijos aktyvumą epifitus formuojančiose konidijose po 3,5 val. inkubacijos avokado paviršiaus vaške su didelėmis CAP20 baltymo koncentracijomis po 4 val. 46 min. Panašiai melanino biosintezės genų aktyvumas *C. trifolii* buvo indukuotas per 2 valandų inkubaciją, o po 1 valandos susiformavo apsiresorius. Lapų audinių tyrimai parodė, kad braškės, inokuliuotos *C. acutatum*, pirmą kartą slopinamos po 8 hpi, o pomidorai, inokuliuoti *C. coccodes*, pirmą kartą slopinami po 4 hpi48,49. Tai daugiausia atitinka *Colletotrichum spp.* infekcinio proceso laiko skalę. Greitos gynybinės reakcijos į 83A:476 rodo, kad šioje linijoje dalyvauja augalų atsparumo ir efektoriaus sužadinto imuniteto (ETI) genai, o Mandelup uždelstos reakcijos patvirtina su mikroelementais susijusio molekulinio modelio sužadinto imuniteto (MTI) hipotezę 50. Ankstyvosios reakcijos į 83A:476 ir Mandelup. Dalinis aukštyn arba žemyn reguliuojamų genų sutapimas uždelstoje reakcijoje taip pat patvirtina šią koncepciją, nes ETI dažnai laikomas pagreitėjusiu ir sustiprintu MTI atsaku, kuris kulminuoja užprogramuota ląstelių mirtimi infekcijos vietoje, vadinama anafilaksiniu šoku 51,52.
Dauguma genų, priskiriamų pernelyg reprezentuojamam terminui „Gene Ontology GO:0006952“ „Gynybos atsakas“, yra 11 streso sukelto badavimo signalo 22 baltymo (panašaus į SAM22) ir septynių pagrindinių latekso baltymo tipo (MLP) homologai. SAM22 tipo baltymai 31, 34, 43 ir 423 parodė sekos panašumą. SAM22 tipo genai parodė reikšmingą aktyvaciją, kuri truko ilgiau, parodydami padidėjusį atsparumą antraknozei (83A:476 ir Boregine). Tačiau MLP tipo genų ekspresija buvo sumažinta tik linijose, turinčiose kandidato atsparumo alelį (83A:476/Lanr1 6 hpi ir Mandelup/AnMan 24 hpi). Reikėtų pažymėti, kad visi identifikuoti SAM22 tipo homologai kilę iš maždaug 105 kb apimančio genų klasterio, o MLP tipo genai kilę iš atskirų genomo regionų. Koordinuotas tokių SAM22 tipo genų aktyvavimas taip pat buvo nustatytas ankstesniame mūsų tyrime apie NLL atsparumą Diaporthetoxica inokuliacijai, o tai rodo, kad jie dalyvauja horizontaliuose gynybinio atsako komponentuose. Šią išvadą taip pat patvirtina pranešimai apie teigiamą SAM22 tipo genų atsaką į sužalojimą ar gydymą salicilo rūgštimi, grybelių induktoriais arba vandenilio peroksidu.
Nustatyta, kad MLP tipo genai reaguoja į įvairius abiotinius ir biotinius stresorius, įskaitant bakterines, virusines ir patogenines grybelines infekcijas daugelyje augalų rūšių55. Reakcijos į tam tikras augalų ir patogenų sąveikas kryptys svyravo nuo stipraus padidėjimo (pvz., užkrėtus medvilnę Verticillium dahliae) iki reikšmingo sumažėjimo (pvz., užkrėtus obelį Alternaria spp.)56,57. Pastebėtas reikšmingas MLP tipo 423 geno sumažėjimas avokadų apsaugos nuo F. niger infekcijos metu ir užkrėtus obelį Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola ir Alternaria alternata yra obelų patotipai58,59. Be to, obelų kalviai, per daug ekspresuojantys MLP tipo 423 geną, turėjo mažesnę su atsparumu susijusių genų ekspresiją ir buvo jautresni grybelinei infekcijai59. Po Fusarium oxysporum f, MLP tipo 423 genas taip pat buvo slopinamas atsparių paprastųjų pupų gemalo plazmoje. cn. pupelių infekcija 60.
Kiti PR-10 šeimos nariai, identifikuoti mūsų RNR sekoskaitos tyrime, buvo LlR18A ir LlR18B genai, reaguojantys į padidėjusį ekspresiją, taip pat padidinto ekspresijos (1 genas) arba sumažinto ekspresijos (3 genai) genas, atsakingas už lipidų pernašos baltymą DIR1. Be to, WGCNA išskiria LlR18B geną kaip šio modulio centrą, kuris yra labai jautrus vakcinacijai ir turi keletą apsauginio atsako genų. LlR18A ir LlR18B genai buvo indukuoti geltonųjų lubinų lapuose, reaguojant į patogenines bakterijas, taip pat NLL stiebuose po D. toxica inokuliacijos, o šių genų ryžių homologas RSOsPR10 buvo greitai indukuotas grybelinės infekcijos, kuri, tikėtina, dalyvauja jazmono rūgšties signalizacijos kelyje53,61,62. DIR1 genas koduoja nespecifinius lipidų pernašos baltymus, kurie yra būtini sisteminio įgyto atsparumo (SAR) atsiradimui. Vystantis apsauginėms reakcijoms, DIR1 baltymas yra pernešamas iš infekcijos židinio per floemą, sukeldamas SAR tolimuose organuose. Įdomu tai, kad TanjilG_02313 DIR1 genas buvo reikšmingai indukuotas pirmuoju laiko momentu 84A:476 linijose ir 22660 populiacijoje, tačiau atsparumas antraknozei sėkmingai išsivystė tik 84A:476 linijoje. Tai gali rodyti tam tikrą DIR1 geno subfunkcionalizaciją NLL, nes likę trys homologai reagavo į inokuliaciją tik 83A:476 linijoje po 6 hpi, ir šis atsakas buvo nukreiptas žemyn.
Mūsų tyrime dažniausiai pasitaikantys komponentai, atitinkantys biologinį procesą, vadinamą „GO:0055114 Redokso procesu“, buvo citochromo P450 baltymas, peroksidazė, linolo rūgšties 9S-/13S-lipoksigenazė ir 1-aminociklopropan-1-karboksirūgšties oksidazė. Be to, mūsų WGCNA apibrėžia HSFA4a homologą kaip centrą, turintį tokius modulius kaip Lanr1 atsparumo geno kandidatas TanjilG_05042. HSFA4a yra redokso priklausomo branduolio transkripcijos reguliavimo augaluose komponentas.
Citochromo P450 baltymai yra oksidoreduktazės, kurios katalizuoja NADPH ir (arba) O2 priklausomas hidroksilinimo reakcijas pirminėje ir antrinėje metabolizme, įskaitant ksenobiotikų, taip pat hormonų, riebalų rūgščių, sterolių, ląstelės sienelės komponentų, biopolimerų ir apsauginių junginių biosintezės metabolizmą 69. Mūsų tyrime augalų citochromo P450 funkcijos kintamumas sumažėjo nuo -10,6 log2 (kartotinis pokytis) iki 5,7 dėl daugybės pakitusių homologų (37) ir skirtingų atsako modelių tarp specifinių genų, o tai rodo didesnę peržiūrą. Naudoti tik RNR sekoskaitos duomenis, siekiant išsiaiškinti galimą NLL genų biologinę funkciją tokioje didelėje baltymų superšeimoje, būtų labai spekuliatyvu. Tačiau verta paminėti, kad kai kurie citochromo P450 genai yra susiję su padidėjusiu atsparumu patogeniniams grybams ar bakterijoms, įskaitant indėlį į alergines reakcijas 69,70,71.
III klasės peroksidazės yra daugiafunkciai augalų fermentai, dalyvaujantys įvairiuose medžiagų apykaitos procesuose augalų augimo ir vystymosi metu, taip pat reaguojant į aplinkos stresus, tokius kaip druskingumas, sausra, didelis šviesos intensyvumas ir patogenų ataka72. Peroksidazės dalyvauja kelių augalų rūšių sąveikoje su Anthracis, įskaitant Stylosanthes humilis ir C. gloeosporioides, Lens culinaris ir C. truncatum, Phaseolus vulgaris ir C. lindemuthianum, Cucumis sativus ir C. lagenarium73,74,75,76. Reakcija būna labai greita, kartais net po 4 HPI, prieš grybeliui prasiskverbiant į augalo audinį73. Peroksidazės genas taip pat reagavo į D. toxica NLL inokuliaciją. Be savo įprastų funkcijų reguliuoti oksidacinį sprogimą arba pašalinti oksidacinį stresą, peroksidazės gali trukdyti patogenų augimui, sukurdamos fizinius barjerus, pagrįstus ląstelių sienelių sutvirtinimu specifinių junginių lignifikacijos, subvienetų jungimosi arba kryžminio sujungimo metu. Šią funkciją in silico galima priskirti TanjilG_03329 genui, koduojančiam tariamą ligniną formuojančią anijonų peroksidazę, kurios ekspresija mūsų tyrime buvo reikšmingai padidėjusi 83A:476 atsparioje linijoje 6 HPI, bet ne kitose padermėse ir laiko taškuose, kurie nereagavo.
Linolo rūgšties 9S-/13S-lipoksigenazė yra pirmasis lipidų biosintezės oksidacinio kelio žingsnis78. Šio kelio produktai atlieka daug funkcijų augalų apsaugoje, įskaitant ląstelės sienelės stiprinimą formuojant kaliozę ir pektino sankaupas, ir oksidacinio streso reguliavimą gaminant reaktyviąsias deguonies formas79,80,81,82,83. Šiame tyrime linolo rūgšties 9S-/13S-lipoksigenazės raiška buvo pakitusi visose padermėse, tačiau jautrioje 22660 populiacijoje skirtingais laiko momentais vyravo padidėjęs reguliavimas, o padermėse, turinčiose atsparų Lanr1 ir AnMan alelį, tai pabrėžia oksilipino sluoksnio diversifikaciją apsauginėse juodligės reakcijose tarp šių genotipų.
1-aminociklopropan-1-karboksilato oksidazės (ACO) homologo ekspresija buvo reikšmingai padidinta (9 genai) arba sumažinta (2 genai), kai jis buvo inokuliuojamas lubinais. Išskyrus dvi išimtis, visos šios reakcijos įvyko 6 AG, esant 83A:476. ACO baltymų tarpininkaujama fermentinė reakcija yra greitį ribojantis etileno gamybos etapas, todėl yra labai reguliuojama84. Etilenas yra augalų hormonas, atliekantis įvairius vaidmenis reguliuojant augalų vystymąsi ir atsaką į abiotines ir biotines streso sąlygas. ACO transkripcijos indukcija ir etileno signalizacijos kelio aktyvavimas yra susiję su ryžių atsparumo hemibiotrofiniam grybeliui oryzae oryzae didinimu, reguliuojant reaktyviųjų deguonies formų ir fitoaleksinų gamybą. Labai panašus lapų infekcijos procesas, nustatytas tarp M. oryzae ir C. lupini88,89, esant reikšmingam ACO homologų padidėjimui 83A:476 linijoje, apie kurį pranešta šiame tyrime, perkelia galimybę suteikti atsparumą NLL antraknozei etilenui, kuris yra pagrindinis signalinis molekulinių takų etapas.
Šiame tyrime 83A:476 populiacijoje 6 HPI ir Mandeloop bei 22660 populiacijose 48 HPI buvo pastebėtas didelio masto daugelio su fotosinteze susijusių genų slopinimas. Šių pokyčių mastas ir progresavimas yra proporcingi lygiui. Šiame eksperimente buvo pastebėtas atsparumas antraknozei. Neseniai keliuose augalų ir patogenų sąveikos modeliuose, įskaitant patogenines bakterijas ir grybelius, buvo pranešta apie stiprų ir ankstyvą su fotosinteze susijusių transkriptų slopinimą. Pagreitėjimas (kai kuriose sąveikose nuo 2 HPI) ir visuotinis su fotosinteze susijusių genų slopinimas reaguojant į infekciją gali sukelti augalų imunitetą, pagrįstą reaktyviųjų deguonies formų išsiskyrimu ir jų sąveika su salicilo rūgšties perdavimo keliu, siekiant tarpininkauti alerginėms reakcijoms [90,94].
Apibendrinant, atspariausios linijos (83A:476) gynybinio atsako mechanizmai apima greitą patogeno atpažinimą R geno pagalba (tikėtina, TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) ir alerginės reakcijos sukeltą salicilo rūgšties bei etileno signalizaciją, po kurios seka tolimojo nuotolio SAR sukūrimas. Šį poveikį palaiko DIR-1 baltymas. Reikėtų pažymėti, kad C. lupini infekcijos biotrofinis laikotarpis yra labai trumpas (maždaug 2 dienos), po kurio seka nekrotinis augimas95. Perėjimas tarp šių stadijų gali būti susijęs su nekroze ir etileno indukuojamų baltymų, kurie sukelia padidėjusio jautrumo reakcijas augaluose-šeimininkuose, raiška. Todėl laiko tarpas sėkmingam C. lupini pagavimui biotrofinėje stadijoje yra labai siauras. Su redoksu ir fotosinteze susijusių genų perprogramavimas, pastebėtas 83A:476 6 hpi, atitinka grybelinių hifų progresavimą ir rodo sėkmingo apsauginio atsako vystymąsi biotrofinėje stadijoje. Mandelup ir 22660 populiacijų transkriptominės reakcijos gali būti per daug uždelstos, kad būtų galima užfiksuoti grybelį prieš pereinant prie nekrozinio augimo, tačiau Mandelup gali būti veiksmingesnis nei 22660 populiacija, nes santykinai greita PR-10 baltymo reguliacija skatina horizontalų atsparumą.
ETI, kurį lemia kanoninis R genas, atrodo, yra įprastas pupelių atsparumo antraknozei mechanizmas. Taigi, modeliniame ankštiniame augale ‘Medicago truncatula’ atsparumą antraknozei suteikia RCT1 genas, priklausantis TIR-NBS-LRR97 augalo R genų klasei. Šis genas taip pat suteikia plataus spektro atsparumą antraknozei liucernoje, kai ji perkeliama į jautrius augalus. Paprastojoje pupelėje (P. vulgaris) iki šiol identifikuota daugiau nei dvi dešimtys antraknozės atsparumo genų. Kai kurie iš šių genų randami regionuose, kuriuose nėra jokių kanoninių R genų, tačiau daugelis kitų yra chromosomų, turinčių NBS-LRR genų klasterį, įskaitant TIR-NBS-LRR99, kraštuose. Viso genomo SSR tyrimas taip pat patvirtino NBS-LRR geno ryšį su paprastosios pupelės atsparumu antraknozei. Kanoninis R genas taip pat buvo rastas genomo regione, kuriame yra pagrindinis antraknozės atsparumo lokusas baltajame lubine 101.
Mūsų darbas rodo, kad neatidėliotina atsparumo reakcija, aktyvuojama ankstyvoje augalo infekcijos stadijoje (pageidautina ne vėliau kaip per 12 hpi), veiksmingai apsaugo siauralapius lubinus nuo antraknozės, kurią sukelia patogeninis grybelis Colletrichum lupini. Naudodami didelio našumo sekvenavimą, parodėme skirtingus antraknozės genų raiškos profilius NLL augaluose, kuriuos tarpininkauja Lanr1 ir AnMan atsparumo genai. Sėkminga gynyba apima kruopštų genų, susijusių su baltymais, dalyvaujančiais redokso, fotosintezės ir patogenezės procesuose, kūrimą per kelias valandas nuo pirmojo augalo kontakto su patogenu. Panašios apsauginės reakcijos, tik uždelstos laike, yra daug mažiau veiksmingos apsaugant augalus nuo ligų. Lanr1 geno tarpininkaujamas atsparumas juodligei primena tipišką greitą R geno atsaką (efektoriaus sukeltą imunitetą), o AnMan genas greičiausiai suteikia horizontalų atsaką (imunitetą, kurį sukelia su mikrobu susijęs molekulinis modelis), užtikrindamas vidutinį tvarumo lygį.
215 NLL linijų, naudotų antraknozės žymenų paieškai, sudarė 74 veislės, 60 linijų, gautų kryžminant arba veisiant, 5 mutantai ir 76 laukiniai arba originalūs gemalo mėginiai. Linijos buvo gautos iš 17 šalių, daugiausia iš Lenkijos (58), Ispanijos (47), Vokietijos (27), Australijos (26), Rusijos (19), Baltarusijos (7), Italijos (5) ir kitų linijų iš 10 šalių. Rinkinyje taip pat yra etaloninės atsparios linijos: 83A:476, Tanjil, Wonga, turinti Lanr1 alelį, ir Mandelup, turinti AnMan alelį. Linijos buvo gautos iš Europos lubinų genetinių išteklių duomenų bazės, kurią tvarko Poznanės augalų selekcijos Ltd., Viatrovas, Lenkija (papildoma S1 lentelė).
Augalai buvo auginami kontroliuojamomis sąlygomis (fotoperiodas 16 valandų, temperatūra 25 °C dieną ir 18 °C naktį). Buvo analizuojami du biologiniai pakartojimai. DNR buvo išskirta iš trijų savaičių amžiaus lapų, naudojant „DNeasy Plant Mini Kit“ (Qiagen, Hilden, Vokietija) pagal protokolą. Izoliuotos DNR kokybė ir koncentracija buvo įvertinta spektrofotometriniais metodais („NanoDrop 2000“; „Thermo Fisher Scientific“, Waltham, MA, JAV). Buvo analizuojamas žymuo AnManM1, žymintis antraknozės atsparumo geną AnMan (išvestą iš Mandelup veislės), ir žymenys Anseq3 bei Anseq4, esantys šalia geno Lanr1 (išvestą iš Tanjil veislės)11,26,28. Atsparumo alelio homozigotai buvo įvertinti „1“, jautrūs – „0“, o heterozigotai – 0,5.
Remiantis žymenų AnManM1, AnSeq3 ir AnSeq4 atrankos rezultatais ir turint sėklų galutiniams tolesniems eksperimentams, antraknozės atsparumo fenotipavimui buvo atrinktos 50 NLL linijų. Analizė atlikta dviem egzemplioriais kompiuteriu valdomame šiltnamyje, kurio fotoperiodas buvo 14 valandų, o temperatūra dieną – 22 °C, o naktį – 19 °C. Prieš sėją sėklos subraižomos (aštriu peiliuku nupjaunant sėklos luobelę priešingoje embriono pusėje), siekiant išvengti sėklų ramybės periodo dėl per kieto luobelės ir užtikrinti tolygų dygimą. Augalai buvo auginami vazonuose (11 × 11 × 21 cm) su steriliu dirvožemiu (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varšuva, Lenkija). Inokuliacija atlikta naudojant Colletotrichum lupini Col-08 padermę, išaugintą 1999 m. iš siauralapių lubinų augalų stiebų, augintų Verženicos lauke, Didžiojoje Lenkijoje (52° 27′ 42″ š. pl. 17° 04′ 05″ r. ilg.). Pasirinkite plotą. Izoliatai buvo kultivuojami SNA terpėje 20 °C temperatūroje, juodoje šviesoje, 21 dieną, siekiant sukelti sporuliaciją. Praėjus keturioms savaitėms po sėjos, kai augalai pasiekė 4–6 lapelių stadiją, inokuliacija atlikta purškiant konidijų suspensija, kurios koncentracija buvo 0,5 x 106 konidijų/ml. Po inokuliacijos augalai 24 valandas buvo laikomi tamsoje, esant maždaug 98 % drėgmei ir 25 °C temperatūrai, kad būtų lengviau sudygti konidijoms ir plisti infekcijai. Augalai buvo auginami 14 valandų fotoperiodu, esant 22 °C dienai / 19 °C naktiai ir 70 % drėgmei. Ligos balas buvo nustatytas praėjus 22 dienoms po inokuliacijos ir svyravo nuo 0 (imunizuotos) iki 9 (labai jautrios), priklausomai nuo nekrozinių pažeidimų buvimo ar nebuvimo ant stiebų ir lapų. Be to, po balų suskaičiavimo buvo išmatuotas augalų svoris. Ryšiai tarp žymenų genotipų ir ligos fenotipų buvo apskaičiuoti kaip dviejų taškų sekos koreliacijos (heterozigotinių žymenų nebuvimas antraknozės atsparumo fenotipo analizės linijų rinkinyje).