Tak fordi du besøger Nature.com. Den browserversion, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse. For at få den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer). I mellemtiden, for at sikre fortsat support, vil vi gengive webstedet uden typografier og JavaScript.
Angustifolius lupin (NLL, Lupinus angustifolius L.) er en bælgplante, der anvendes til fødevareproduktion og jordforbedring. Den globale udbredelse af NLL som afgrøde har tiltrukket mange patogene svampe, herunder lupin-anthracnose, som forårsager den ødelæggende anthracnose-sygdom. To alleler, Lanr1 og AnMan, som giver øget resistens, er blevet brugt i NLL-avl, men de underliggende molekylære mekanismer forbliver ukendte. I denne undersøgelse blev Lanr1- og AnMan-markørerne brugt til at screene europæiske NLL-prøver. Test af vaccinen i et kontrolleret miljø bekræftede effektiviteten af ​​begge resistente donorer. Differentiel genekspressionsprofilering blev udført på repræsentative resistente og modtagelige linjer. Anthracnose-resistens var forbundet med overekspression af genontologitermerne "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process" og "GO:0015979 Photosynthesis". Derudover viste Lanr1(83A:476)-linjen signifikant transkriptom-reprogrammering hurtigt efter inokulering, mens de andre linjer viste en forsinkelse i dette respons på omkring 42 timer. Forsvarsresponser er forbundet med TIR-NBS-, CC-NBS-LRR- og NBS-LRR-generne, 10 proteiner involveret i patogenese, lipidoverføringsproteiner, endoglucan-1,3-β-glucosidase, glycinrige cellevægsproteiner og gener fra iltens reaktive vej. Tidlige responser på 83A:476, herunder omhyggelig undertrykkelse af gener forbundet med fotosyntese, faldt sammen med vellykket beskyttelse under den vegetative vækstfase af svampebiologien, hvilket tyder på, at en effektor udløser immunitet. Mandeloop-reaktionen er langsommere, ligesom den samlede horisontale modstand.
Smalbladet lupin (NLL, Lupinus angustifolius L.) er en proteinrig kornsort, der stammer fra den vestlige Middelhavsregion1,2. Den dyrkes i øjeblikket som fødevareafgrøde til dyr og mennesker. Den betragtes også som grøngødning i sædskiftesystemer på grund af kvælstoffiksering af symbiotiske kvælstoffikserende bakterier og en generel forbedring af jordstrukturen. NLL har gennemgået en hurtig domesticeringsproces i det sidste århundrede og er stadig under højt avlspres3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Med den udbredte dyrkning af NLL udviklede rækken af ​​patogene svampe nye landbrugsnicher og forårsagede nye afgrødeødelæggende sygdomme. Det mest bemærkelsesværdige for lupinavlere og -forædlere var fremkomsten af ​​anthracnose, forårsaget af den patogene svamp Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Det mest bemærkelsesværdige for lupinavlere og -forædlere var fremkomsten af ​​anthracnose, forårsaget af den patogene svamp Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогного LU (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Mest bemærkelsesværdigt for lupinavlere og -forædlere var fremkomsten af ​​anthracnose forårsaget af den patogene svamp Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由眀引人注目的是炭疽病的出现，它是由県它是由県(Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由眀引人注目的是炭疽病的出现，它是由県它是由県(Bondar)嵵Håret。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенты lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Det mest slående for lupinavlere og -forædlere er fremkomsten af ​​anthracnose forårsaget af den patogene svamp Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.De tidligste rapporter om sygdommen kom fra Brasilien og USA, med typiske symptomer, der opstod i henholdsvis 1912 og 1929. Efter omkring 30 år blev patogenet dog betegnet som Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf af Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stenemand) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld i målrettet morfologi. & H. Schrenk. & H. Schrenk.og H. Schrenk. & H.施伦克，. & H.施伦克，.og H. Schlenk.Indledende fænotypning af sygdomme udført i midten af ​​det 20. århundrede viste en vis resistens i NLL- og gul lupin (L. luteus L.)-tilføjelser, men alle testede hvide lupin (L. albus L.)-tilføjelser var meget modtagelige15,16. Undersøgelser har vist, at udviklingen af ​​anthracnose er forbundet med øget nedbør (luftfugtighed) og temperatur (i området 12-28 °C), hvilket fører til en krænkelse af resistensen ved højere temperaturer17, 18. Faktisk var den tid, det tog for konidier at spire og sygdommen at begynde, fire gange kortere ved 24 °C (4 timer) end ved 12 °C (16 timer) under forhold med høj luftfugtighed19. Den igangværende globale opvarmning har således ført til spredning af anthracnose. Sygdommen blev dog observeret i Frankrig (1982) og Ukraine (1983) som en varsel om en forestående trussel, men blev tilsyneladende ignoreret af lupinindustrien på det tidspunkt20,21. Få år senere spredte denne ødelæggende sygdom sig over hele verden og ramte også store lupinproducerende lande som Australien, Polen og Tyskland22,23,24. Efter et anthracnoseudbrud i midten af ​​1990'erne resulterede omfattende screening i identifikationen af ​​adskillige resistente donorer i NLL19-prøver. NLL-resistens over for anthracnose kontrolleres af to separate dominante alleler, der findes i forskellige kimplasmakilder: Lanr1 i kultivaren Tanjil og Wonga og AnMan i kultivaren Mandalay25,26. Disse alleler supplerer de molekylære markører, der understøtter udvælgelsen af ​​resistent kimplasma i avlsprogrammer25,26,27,28,29,30. Den resistente avlslinje 83A:476, der bar Lanr1-allelen, blev krydset med den modtagelige vilde linje P27255 for at opnå en RIL-population, der segregerede for anthracnose-resistens, hvilket gjorde det muligt at tildele Lanr1-locuset til kromosom NLL-1131, 32, 33. Justering af koblingskortmarkører fra flankerende resistensloci til anthracnose med en genomisk ramme, NLL afslørede placeringen af ​​alle tre alleler på det samme kromosom (NLL-11), men i forskellige positioner 29, 34, 35. På grund af det lille antal RIL'er og den store genetiske afstand mellem markører og tilsvarende alleler kan der imidlertid ikke drages pålidelige konklusioner om deres underliggende gener. På den anden side er brugen af ​​revers genetik i lupiner vanskelig på grund af deres meget lave regenereringspotentiale, hvilket gør genetisk manipulation besværlig 37.
Udviklingen af ​​domesticeret kimplasma, der bærer den ønskede allel i homozygote tilstand, såsom 83A:476 (Lanr1) og Mandelup (AnMan), har åbnet døren for at studere anthracnose-resistens i lyset af tilstedeværelsen af ​​modsatrettede kombinationer af alleler i vilde populationer. Muligheder for molekylære mekanismer. Sammenlign forsvarsresponser genereret af specifikke genotyper. Denne undersøgelse evaluerede den tidlige transkriptomrespons af NLL på C. lupini-vaccination. Først blev et europæisk NLL-kimplasmapanel indeholdende 215 linjer screenet ved hjælp af molekylære markører, der markerer Lanr1- og AnMan-allelerne. Anthracnose-fænotypning blev derefter udført på 50 NLL-linjer, der tidligere var udvalgt til molekylære markører, under kontrollerede forhold. Baseret på disse eksperimenter blev fire linjer, der adskilte sig i anthracnose-resistens og Lanr1/AnMan-allelsammensætning, udvalgt til differentiel forsvarsgenekspressionsprofilering ved hjælp af to komplementære tilgange: højkapacitets RNA-sekventering og realtids-PCR-kvantificering.
Screening af et sæt NLL-kimplasma (N = 215) med markørerne Lanr1 (Anseq3 og Anseq4) og AnMan (Anseq4) og AnMan (AnManM1) viste, at kun én linje (95726, nær Salamanca-b) amplifikerer "resistens"-allelen for alle markører, mens "Tilstedeværelse af 'modtagelige' alleler" fandt andelen af ​​alle markører i 158 (~73,5%) linjer. Tretten linjer producerede to "resistente" alleler af Lanr1-markøren, og 8 linjer producerede "resistente" alleler af Lanr1-markøren. "Resistens"-allelen af ​​AnMan-markøren (Supplerende Tabel S1). To linjer var heterozygote for Anseq3-markøren og én heterozygot for AnManM1-markøren. 42 linjer (19,5%) bar modsatte faser af Anseq3- og Anseq4-allelerne, hvilket indikerer en høj rekombinationsfrekvens mellem disse to loci. Anthracnose-fænotyper under kontrollerede forhold (Supplerende Tabel S2) viste variation i resistensen af ​​de testede genotyper, hvilket afspejledes i sværhedsgraden af ​​anthracnose. Forskelle i gennemsnitsscorer varierede fra 1,8 (moderat resistent) til 6,9 (modtagelig), og forskellene i plantevægt varierede fra 0,62 (modtagelig) til 4,45 g (resistent). Der var en signifikant korrelation mellem de observerede værdier i to gentagelser af eksperimentet (0,51 for sygdomssværhedsgrad, P = 0,00017 og 0,61 for plantevægt, P < 0,0001) samt mellem disse to parametre (-0,59 og -0,77, P < 0,0001). Der var en signifikant korrelation mellem værdier observeret i to gentagelser af eksperimentet (0,51 for sygdomssværhedsgrad, P = 0,00017 og 0,61 for plantevægt, P < 0,0001) samt mellem disse to parametre (-0,59 og -0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 til salgs) болезни, P = 0,00017 og 0,61 for массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,70, Р) (-0,59,0и) 0.0001). Der blev fundet en signifikant korrelation mellem de værdier, der blev observeret i to gentagelser af eksperimentet (0,51 for sygdomssværhedsgrad, P = 0,00017 og 0,61 for plantevægt, P < 0,0001), samt mellem disse to parametre (-0,59 og -0,77, P < 0,0001) .在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分1︌P. 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77。01)P在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 为庈度 诟分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 为（鈼（，，（，（，７ 0,59 和–0,59 和– 0,59 和-0,77，P < 0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценколи тявиях, 5, 0, 5. = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0001), og между этими двумя параметрами (-0,59 og -0,0001) 0,77, P <0,000. Der var en signifikant korrelation mellem de observerede værdier i duplikat (sygdomssværhedsgrad 0,51, P = 0,00017 og plantevægt 0,61, P < 0,0001) og mellem disse to parametre (-0,59 og -0,0001) 0,77, P<0,0001. ).Typiske symptomer set hos modtagelige planter inkluderer knæk og vridning af stilken, der ligner en "hyrdebue"-struktur, efterfulgt af ovale læsioner med orange/lyserøde sporozoiter (Supplerende Fig. 1). Australske accessioner, der bærer Lanr1- (83A:476 og Tanjil) og AnMan (Mandelup)-generne, er moderat resistente, 0,0331 og 0,0036). Nogle linjer, der også bærer "resistente" Lanr1- og/eller AnMan-alleler, viser symptomer på sygdommen.
Interessant nok viste et par NLL-linjer, der manglede nogen form for "resistente" markøralleler, et højt niveau af anthracnose-resistens (sammenlignelig med eller højere end for Lanr1- eller AnMan-genotyper), såsom Boregine (P-værdi < 0,0001 for begge parametre), Bojar (P-værdi < 0,0001 for score og 0,001 for plantevægt) og population B-549/79b (P-værdi < 0,0001 for score og ikke-signifikant for vægt). Interessant nok viste et par NLL-linjer, der manglede nogen form for "resistente" markøralleler, et højt niveau af anthracnose-resistens (sammenlignelig med eller højere end for Lanr1- eller AnMan-genotyper), såsom Boregine (P-værdi < 0,0001 for begge parametre), Bojar (P-værdi < 0,0001 for score og 0,001 for plantevægt) og population B-549/79b (P-værdi < 0,0001 for score og ikke-signifikant for vægt). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, покасусаливый устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (sen. параметров), Bojar (tidspunkt P < 0,0001 til оценки и 0,001 для массы растения) og популяции B-549/79b (tidspunkt P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Interessant nok viste adskillige NLL-linjer, der manglede 'resistente' markøralleler, et højt niveau af resistens over for anthracnose (sammenlignelig med eller højere end for Lanr1- eller AnMan-genotyper), såsom Boregine (P-værdi < 0,0001 for begge parametre), Bojar (P-værdi < 0,0001 for evaluering og 0,001 for plantevægt) og population B-549/79b (P-værdi < 0,0001 for evaluering og ikke signifikant for vægt).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的瀅疈1或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分为0,0001，植物重量为0,001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，逍量れ逍量 Det er interessant, at nogle NLL-systemer, der ikke har nogen "antigeniske" markører, viser høj horisontal resistens (svarende til Lanr1- eller AnMan-gener eller højere), såsom Boregine (begge parametre P < 0,0001), Bojar (P-værdi < 0,0001, plantevægt 0,001) og stamme B-549/79b (P-værdi < 0,0001, vægt ikke signifikant). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», покасазаливи устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P обоих,00рпаов), (tidspunkt P <0,0001, maks. 0,001) og forsyning B-549/79b (P-tidspunkt <0,0001, масса незначительна). Interessant nok viste nogle NLL-linjer, der manglede 'resistens'-markøralleler, høje niveauer af anthracnose-resistens (sammenlignelig med eller højere end Lanr1- eller AnMan-genotyperne), såsom Boregine (P-værdi for begge parametre <0,0001), Bojar (P-værdi < 0,0001, plantevægt 0,001) og population B-549/79b (P-værdi < 0,0001, vægt ikke signifikant).Dette fænomen antyder muligheden for en ny genetisk kilde til resistens, hvilket forklarer den observerede mangel på korrelation mellem markørgenotyper og sygdomsfænotyper (P-værdier fra ~0,42 til ~0,98). Kolmogorov-Smirnov-testen viste således, at dataene om anthracnose-resistens var omtrent normalfordelt for scorer (P-værdier 0,25 og 0,11) og plantemasse (P-værdier 0,47 og 0,55), hvilket antyder, at jeg antager, at flere alleler end Lanr1 og AnMan er involveret.
Baseret på resultaterne af screening for anthracnose-resistens blev 4 linjer udvalgt til transkriptomanalyse: 83A:476, Boregine, Mandelup og population 22660. Disse linjer blev testet igen for miltbrandresistens i inokuleringsforsøg ved hjælp af RNA-sekventering, forudsat at de var de samme som i den foregående test. Scorværdierne var som følger: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) og population 22660 (6,11 ± 1,29).
Illumina NovaSeq 6000-protokollen opnåede et gennemsnit på 40,5 Mread-par pr. prøve (29,7 til 54,4 Mreads) (Supplerende tabel S3). Justeringsscorer i referencesekvensen varierede fra 75,5 % til 88,6 %. Den gennemsnitlige korrelation af læsetællingsdata mellem eksperimentelle varianter mellem biologiske replikater varierede fra 0,812 til 0,997 (gennemsnit 0,959). Ud af de 35.170 analyserede gener udviste 2917 ingen ekspression, og de andre 4785 gener blev udtrykt på et ubetydeligt niveau (basismiddelværdi < 5). Ud af de 35.170 analyserede gener udviste 2917 ingen ekspression, og de andre 4785 gener blev udtrykt på et ubetydeligt niveau (basismiddelværdi < 5). Fra 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались уровне (базовое среднее <5). Ud af de 35.170 analyserede gener viste 2917 ingen ekspression, og de resterende 4785 gener blev udtrykt på et ubetydeligt niveau (basisgennemsnit <5).在分析的35.170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）.35.170 Fra 35 170 millioner kroner 2917 er ikke tilgængelige, og mere end 4785 millioner dollars. среднее значение <5). Ud af de 35.170 analyserede gener blev 2917 ikke udtrykt, og de resterende 4785 gener havde ubetydelig ekspression (basisgennemsnit <5).Antallet af gener, der blev betragtet som udtrykt (basisgennemsnit ≥ 5) under eksperimentet, var således 27.468 (78,1%) (Supplerende tabel S4).
Fra det første tidspunkt reagerede alle NLL-linjer på inokuleringen af ​​C. lupini (stamme Col-08) ved at omprogrammere transkriptomet (Tabel 1). Der blev dog observeret signifikante forskelle mellem linjerne. Således viste resistenslinjen 83A:476 (som bærer Lanr1-genet) signifikant transkriptom-reprogrammering ved det første tidspunkt (6 hpi) med en 31-69 gange stigning i antallet af isolerede op- og nedgener sammenlignet med andre tidspunkter på dette tidspunkt. Derudover var denne top kortvarig, da ekspressionen af ​​kun få gener forblev signifikant ændret ved det andet tidspunkt (12 hpi). Interessant nok gennemgik Boregine, som også viste et højt niveau af resistens i grafttesten, ikke en så massiv transkriptionel omprogrammering under eksperimentet. Antallet af differentielt udtrykte gener (DEG) var dog det samme for Boregine og 83A:476 ved 12 hpi. Både Mandelup og population 22660 viste DEG-toppe på det sidste tidspunkt (48 l/s), hvilket indikerer en relativ forsinkelse i forsvarsreaktionerne.
Fordi 83A:476 gennemgik massiv transkriptom-reprogrammering som reaktion på C. lupini ved 6 HPI sammenlignet med alle andre linjer, var ~91% af de DEG'er, der blev observeret på dette tidspunkt, afstamningsspecifikke (fig. 1). Der var dog en vis overlapning i tidlige responser mellem studielinjer, da 68,5%, 50,9% og 52,6% DEG i henholdsvis Boregine, Mandelup og population 22660 overlappede med dem, der blev fundet i 83A:476 på bestemte tidspunkter. Disse DEG'er tegnede sig dog kun for en lille brøkdel (0,97-1,70%) af alle DEG'er, der i øjeblikket detekteres ved hjælp af 83A:476. Derudover var 11 DEG'er fra alle linjer kohærente på dette tidspunkt (Supplerende Tabeller S4-S6), inklusive fælles komponenter i planters forsvarsresponser: lipidoverføringsprotein (TanjilG_32225), endoglucan-1,3-β-glucosidenzym (TanjilG_23384), to stress-inducerbare proteiner som SAM22 (TanjilG_31528 og TanjilG_31531), basisk latexprotein (TanjilG_32352) og to glycinrige strukturelle cellevægsproteiner (TanjilG_19701 og TanjilG_19702). Der var også en relativt høj overlapning i transkriptomresponser mellem 83A:476 og Boregine ved 24 HPI (i alt 16-38% DEG) og mellem Mandelup og Population 22660 ved 48 HPI (i alt 14-20% DEG).
Venn-diagram, der viser antallet af differentielt udtrykte gener (DEG) i smalbladede lupinlinjer (NLL) inokuleret med Colletotrichum lupini (stamme Col-08 opnået fra lupinmarker i Wierzhenice, Polen, 1999). De analyserede NLL-linjer var: 83A:476 (resistent, bærer Lanr1-allelen), Boregine (resistent, genetisk baggrund ukendt), Mandelup (moderat resistent, bærer AnMan-allelen) og population 22660 (meget modtagelig). Forkortelsen hpi står for timer efter vaccination. Nulværdier er fjernet for at forenkle grafen.
Sættet af overudtrykte gener ved 6 hpi blev analyseret for tilstedeværelsen af ​​kanoniske R-gendomæner (Supplerende Tabel S7). Denne undersøgelse afslørede transkriptominduktion af klassiske sygdomsresistensgener med NBS-LRR-domæner kun ved 83A:476. Dette sæt bestod af ét TIR-NBS-LRR-gen (tanjilg_05042), fem CC-NBS-LRR-gener (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 og tanjilg_16162), og fire NBS-LR, Tanjilg_16162), og fire NBS-LRRE (tanjilg_16162) samt fire NBS-Lrr (tanjilg_16162) og fire NBS-LRR (TANJILG_16162). Alle disse gener har kanoniske domæner arrangeret i konserverede sekvenser. Ud over NBS-LRR-domænegenerne blev adskillige RLL-kinaser aktiveret ved 6 hpi, nemlig én i Boregine (TanjilG_19877), to i Mandelup (TanjilG_07141 og TanjilG_19877) og i population 22660 (TanjilG_09014 og TanjilG_10361) og to i 83A 27:476.
Gener med signifikant ændret ekspression som reaktion på podning med C. lupini (stamme Col-08) blev underkastet genontologi (GO) berigelsesanalyse (Supplerende Tabel S8). Den hyppigst overrepræsenterede biologiske procesterm var "GO:0006952 defense response", som forekom i 6 ud af 16 (tid × linje) kombinationer med høj signifikans (P-værdi < 0,001) (fig. 2). Den hyppigst overrepræsenterede biologiske procesterm var "GO:0006952 defense response", som forekom i 6 ud af 16 (tid × linje) kombinationer med høj signifikans (P-værdi < 0,001) (fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитнеты», ved появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (tidspunkt P <0.001) (r. 2). Den hyppigst overrepræsenterede biologiske procesterm var 'GO:0006952 defense response', som forekom i 6 ud af 16 (tid × afstamning) kombinationer med høj signifikans (P-værdi < 0,001) (fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）. Det mest repræsentative biologiske procesudtryk er "GO:0006952 defense response", som optræder i 6 ud af de 16 (时间×线) kombinationer med høj signifikans (P-værdi < 0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», косторвыв 16 af 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Den hyppigst overrepræsenterede biologiske procesterm var 'GO:0006952 Defense Response', som forekom i 6 ud af 16 kombinationer (tid × linje) med høj signifikans (P-værdi < 0,001) (fig. 2).Dette udtryk var overrepræsenteret på to tidspunkter i 83A: 476 og Boregine (6 og 24 hpi) og på ét tidspunkt i Mandelup og Population 22660 (henholdsvis 12 og 6 hpi). Dette er et forventet resultat, der fremhæver den svampedræbende respons hos de resistente linjer. Derudover reagerede 83A:476 på C. lupini ved hurtigt at inducere gener relateret til det oxidative udbrud repræsenteret af udtrykket "GO:0055114 redoxproces", hvilket indikerer et specifikt forsvarsrespons, mens Boregine udviste specifikke forsvarsresponser relateret til udtrykket 'GO'. :0006950 Stressrespons”. Population 22660 aktiverede den horisontale resistensrespons, der involverede sekundære metabolitter, hvilket fremhæver det store antal termer “GO:0016104 Process of triterpene biosynthesis” og “GO:0006722 Process of triterpene metabolism” (begge termer tilhører det samme sæt af gener). Under hensyntagen til resultaterne af GO-termberigelsesanalysen var Mandelup-reaktionens stabilitet mellem Boregine og Population 22660. Derudover inkluderer tidlig reaktion 83A:476 (6 hpi) og forsinket reaktion Mandelup og Population 22660 termen GO:0015979 'fotosyntese' og andre relaterede biologiske processer.
De bioprocesgenontologitermer, der blev valgt i annotationen af ​​differentielt udtrykte gener under transkriptomresponser hos smalbladet lupin (NLL) inokuleret med miltbrandslupin (Col-08-stamme opnået fra lupinmarker i Wierzhenice, Polen, i 1999), er stærkt overdrevne. De analyserede NLL-linjer var: 83A:476 (resistent, bærer den homozygote Lanr1-allel), Boregine (resistent, ukendt genetisk baggrund), Mandelup (moderat resistent, bærer den homozygote AnMan-allel) og population 22660 (modtagelig).
Da dette studie havde til formål at identificere gener, der bidrager til anthracnose-resistens, blev generne tildelt termerne GO "GO: 0006952 Defensive responses" og "GO: 0055114 Redox-processer" analyseret med cut-offs, da baseline-gennemsnit ≥ 30 med mindst én linje × tidspunkt kombineret med statistisk signifikante værdier af log2 (fold change). Antallet af gener, der opfyldte disse kriterier, var 65 for GO:0006952 og 524 for GO:0055114.
83A:476 afslørede to DEG-toppe annoteret med udtrykket GO:0006952, den første ved 6 gener pr. tomme (64 gener, op- og nedregulering) og den anden ved 24 gener pr. tomme (15 gener, kun opregulering). Boregine viste også, at GO:0006952 toppede på samme tidspunkt, men med mindre DEG (11 og 8) og præferentiel aktivering. Mandeloop viste to toppe af GO:0006952 ved 12 og 48 HPI, begge med 12 gener (den første med aktiverende gener, og den anden med kun undertrykkende gener), mens 22660-populationen ved 6 HPI (13 gener) havde en større overvægt af den stigende toppregulering. Det skal bemærkes, at 96,4% af GO:0006952 DEG i disse toppe havde den samme type respons (op eller ned), hvilket indikerer en signifikant overlapning i forsvarsresponser på trods af forskelle i antallet af involverede gener. Den største gruppe af sekvenser relateret til termen GO:0006952 koder for Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-lignende), som tilhører klasse 10 patogenese-associeret protein (PR-10) proteinklade og kerneproteinlatexen. lignende (MLP-lignende) protein) protein (fig. 3). De to grupper adskilte sig i ekspressionens natur og responsretningen. Generne, der koder for SAM22-lignende proteiner, viste konsistent og signifikant induktion på tidlige tidspunkter (6 eller 12 hpi) og var generelt ikke-responsive ved slutningen af ​​eksperimentet (48 hpi), mens MLP-lignende proteiner viste koordination ved 6 hpi. hpi. 83A:476 og Mandelup ved 48 hp/in, var næsten alle andre datapunkter ikke-responsive. Derudover fulgte forskelle i ekspressionsprofiler af SAM22-lignende proteingener observeret variation i anthracnose-resistens, da mere resistente linjer havde flere tidspunkter, der signifikant inducerede disse gener, end mere modtagelige gener. Et andet LlR18A/B-lignende PR-10-gen viste et meget lignende ekspressionsmønster som det SAM22-lignende proteingen.
Hovedkomponenterne i den biologiske procesbetegnelse "GO:0006952 Defense Response" og ekspressionsmønstrene for kandidatgener for Lanr1- og AnMan-allelerne blev identificeret. Log2-skalaen repræsenterer log2-værdier (fold-ændring) mellem inokulerede (Colletotrichum lupini, stamme Col-08, opnået fra lupinmarker, Wizhenica, Polen, 1999) og kontrolplanter (sham-inokulerede) på samme tidspunkt. Følgende smalbladede lupinlinjer blev analyseret: 83A:476 (resistent, bærer den homozygote Lanr1-allel), Boregine (resistent, genetisk baggrund ukendt), Mandelup (moderat resistent, bærer den homozygote AnMan-allel) og population 22660 (modtagelig).
Derudover blev ekspressionsprofilerne af RNA-seq-kandidatgenerne Lanr1 (TanjilG_05042) og AnMan (TanjilG_12861) evalueret (fig. 3). TanjilG_05042-genet viste kun en signifikant respons (aktivering) ved 83A:476 på det første tidspunkt (6 hpi), mens TanjilG_12861 kun var signifikant i Mandeloop på to tidspunkter: 6 hpi (nedregulering) og 24 hpi (6 hpi). Med.). justerbar) ).
De mest overudtrykte gener i termen GO:0055114 "redoxproces" var gener, der koder for cytokrom P450-proteiner og peroxidase (fig. 4). For prøver isoleret fra 83A:476 ved 6 HPI blev der generelt observeret maksimale eller minimale log2-værdier (fold change) (for 86,6% af generne) mellem inokulerede planter og kontrolplanter, hvilket fremhæver denne genotypes høje respons på inokuleret køn. 83A:476 viste den mest signifikante GO:0055114 DEG ved 6 hpi (503 gener), mens resten af ​​linjerne viste den ved 48 hpi (Boregine, 31 gener; Mandelup, 85 gener; og Population 22660, 78 gener). I de fleste gener i GO:0055114-familien blev der observeret to typer responser på vaccination (aktivering og hæmning). Interessant nok blev op til 97,6% af de DEG'er, der blev identificeret for termen GO: 0055114 i Mandelupe ved 48 hp. Disse observationer tyder på, at mønsteret af forsinkede transkriptomresponser hos mandeloup på anthracnose, på trods af den signifikant mindre skala (dvs. antallet af muterede redoxgener, 85 versus 503), ligner det tidlige respons hos 83A:476. I Boregine og Population 22660 er denne konvergens lavere, henholdsvis 51,6% og 75,6%.
Ekspressionsmønstrene for hovedkomponenterne i termen "GO:0055114 Redox-proces" blev afsløret. Log2-skalaen repræsenterer log2-værdier (fold-ændring) mellem inokulerede (Colletotrichum lupini, stamme Col-08, opnået fra lupinmarker, Wizhenica, Polen, 1999) og kontrolplanter (sham-inokulerede) på samme tidspunkt. Følgende smalbladede lupinlinjer blev analyseret: 83A:476 (resistent, bærer den homozygote Lanr1-allel), Boregine (resistent, genetisk baggrund ukendt), Mandelup (moderat resistent, bærer den homozygote AnMan-allel) og population 22660 (modtagelig).
83A:476 Transkriptomiske responser på inokulering med C. lupini (stamme Col-08) omfattede også koordineret silencing af gener tilskrevet termen GO:0015979 "fotosyntese" og andre relaterede biologiske processer (FIG. 5). Dette GO:0015979 DEG-sæt indeholdt 105 gener, der var signifikant undertrykte ved 6 hpi ved 83A:476. I denne delmængde var 37 gener også nedreguleret i Mandelup ved 48 HPI og 35 på samme tidspunkt i 22660-populationen, inklusive 19 DEG'er, der var fælles for begge genotyper. Ingen DEG'er relateret til termen GO: 0015979 blev signifikant aktiveret i nogen kombination (linje x tid).
Ekspressionsmønstrene for hovedkomponenterne i termen for den biologiske proces "GO:0015979 Fotosyntese" blev afsløret. Log2-skalaen repræsenterer log2-værdier (foldændring) mellem inokulerede (Colletotrichum lupini, stamme Col-08, opnået fra lupinmarker, Wizhenica, Polen, 1999) og kontrolplanter (sham-inokulerede) på samme tidspunkt. Følgende smalbladede lupinlinjer blev analyseret: 83A:476 (resistent, bærer den homozygote Lanr1-allel), Boregine (resistent, genetisk baggrund ukendt), Mandelup (moderat resistent, bærer den homozygote AnMan-allel) og population 22660 (modtagelig).
Baseret på resultaterne af differentiel ekspressionsanalyse og formodentlig involveret i forsvarsresponser mod patogene svampe, blev dette sæt af syv gener udvalgt til kvantificering af ekspressionsprofiler ved realtids-PCR (Supplerende Tabel S9).
Det formodede proteingen TanjilG_10657 blev signifikant induceret i alle undersøgte linjer og tidspunkter sammenlignet med kontrol- (efterlignings-) planter (Supplerende Tabeller S10, S11). Derudover viste ekspressionsprofilen af ​​TanjilG_10657 en stigende tendens i løbet af eksperimentet for alle linjer. Population 22660 viste den højeste følsomhed af TanjilG_10657 over for inokulering med 114-fold aktivering og det højeste relative ekspressionsniveau (4,4 ± 0,4) ved 24 HPI (Fig. 6a). PR10 LlR18A-proteingenet TanjilG_27015 viste også aktivering på tværs af alle linjer og tidspunkter, med statistisk signifikans ved de fleste datapunkter (Fig. 6b). I lighed med TanjilG_10657 blev det højeste relative ekspressionsniveau af TanjilG_27015 observeret i den 22660 inokulerede population ved 24 HPI (19,5 ± 2,4). Syreendokitinasegenet TanjilG_04706 var signifikant opreguleret i alle linjer og på alle tidspunkter undtagen Boregine 6 hpi (fig. 6c). Det blev kraftigt induceret ved det første tidspunkt (6 HPI) ved 83A:476 (med 10,5 gange) og moderat øget i andre linjer (med 6,6-7,5 gange). Under eksperimentet forblev ekspressionen af ​​TanjilG_04706 på lignende niveauer i 83A:476 og Boregine, mens den i Mandelup og population 22660 steg signifikant og nåede relativt høje værdier (henholdsvis 5,9 ± 1,5 og 6,2 ± 1,5). Det endoglucan-1,3-β-glucosidase-lignende gen TanjilG_23384 viste høj aktivering ved de første to tidspunkter (6 og 12 hpi) i alle linjer undtagen population 22660 (fig. 6d). De højeste relative ekspressionsniveauer af TanjilG_23384 blev observeret ved det andet tidspunkt (12 hpi) i Mandelup (2,7 ± 0,3) og 83A:476 (1,5 ± 0,1). Ved 24 HPI var TanjilG_23384-ekspressionen relativt lav i alle undersøgte linjer (fra 0,04 ± 0,009 til 0,44 ± 0,12).
Ekspressionsprofiler af udvalgte gener (ag) afsløret ved kvantitativ PCR. Tallene 6, 12 og 24 repræsenterer timer efter vaccination. LanDExH7- og LanTUB6-generne blev brugt til normalisering, og LanTUB6 blev brugt til kalibrering mellem serier. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen baseret på tre biologiske replikater, som hver er gennemsnittet af tre tekniske replikater. Den statistiske signifikans af forskellene i ekspressionsniveauerne mellem de inokulerede (Colletotrichum lupini, stamme Col-08, opnået i 1999 fra lupinmarken i Wierzenica, Polen) og kontrolplanter (prøveinokulerede) er markeret ovenfor datapunkter (*P-værdi < 0,05, **P-værdi ≤ 0,01, ***P-værdi ≤ 0,001). Den statistiske signifikans af forskellene i ekspressionsniveauerne mellem de inokulerede (Colletotrichum lupini, stamme Col-08, opnået i 1999 fra lupinmarken i Wierzenica, Polen) og kontrolplanter (prøveinokulerede) er markeret ovenfor datapunkter (*P-værdi < 0,05, **P-værdi ≤ 0,01, ***P-værdi ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08. september 9. december. поля люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена надихными (*pr. 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Statistisk signifikante forskelle i ekspressionsniveauer mellem inokulerede (Colletotrichum lupini, stamme Col-08, opnået i 1999 fra en lupinmark i Wierzhenice, Polen) og kontrolplanter (sham-inokulerede) er angivet ovenfor datapunkterne (*P-værdi < 0,05, **P-værdi ≤ 0,01, ***P-værdi ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在繰标记在繰（ 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 撌 鯹煤照 缈水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤01)。. Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полусч люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмеченными (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Statistisk signifikante forskelle i ekspressionsniveauer mellem inokulerede (Colletotrichum lupini, stamme Col-08, opnået fra lupinmarker i Verzhenice, Polen, i 1999) og kontrolplanter (sham-inokulerede) er angivet ovenfor datapunkterne (*P-værdi < 0,05, **P-værdi ≤ 0,01, ***P-værdi ≤ 0,001).De analyserede NLL-linjer var: 83A:476 (resistent, bærer den homozygote Lanr1-allel), Mandelup (moderat resistent, bærer den homozygote AnMan-allel), Boregine (resistent, ukendt genetisk baggrund) og population 22660 (modtagelige).
Kandidatgenet TanjilG_05042 på Lanr1-locuset viste et markant anderledes ekspressionsmønster end de profiler, der blev opnået fra RNA-seq-studier (fig. 6e). Signifikant aktivering af dette gen blev observeret i Mandelup og 22660-populationen (op til henholdsvis 39,7 og 11,7 gange), hvilket resulterede i relativt høje ekspressionsniveauer (op til henholdsvis 1,4 ± 0,14 og 7,2 ± 1,3). 83A:476 afslørede også en vis opregulering af TanjilG_05042-genet (op til 3,8 gange), men de opnåede relative ekspressionsniveauer (0,044 ± 0,002) var mere end 30 gange lavere end dem, der blev observeret i Mandelup og 22660-populationen. Analyseret ved qPCR viste signifikante forskelle i ekspressionsniveauer mellem genotyper i mock-vaccinerede (kontrol) varianter, med en 58-fold forskel mellem populationerne 22660 og 83A:476, samt mellem populationerne 22660 og 22660. En dobbelt forskel blev opnået mellem Boregine og Mandalup.
Kandidatgenet ved AnMan-locuset, TanjilG_12861, blev aktiveret som reaktion på vaccination i 83A:476 og Mandelup, var neutral i 22660-populationen og var nedreguleret i Boregine (fig. 6f). Den relative ekspression af TanjilG_12861-genet var den højeste i den inokulerede 83A:476 (0,14 ± 0,01). Det 17,4 kDa store klasse I-varmechokproteingen TanjilG_05080 HSP17.4 viste lavere relative ekspressionsniveauer i alle undersøgte stammer og tidspunkter (fig. 6g). Den højeste værdi blev observeret ved 24 HPI i 22660-populationen (0,14 ± 0,02, en otte gange stigning som reaktion på vaccination).
Sammenligning af genekspressionsprofiler (fig. 7) afslørede en høj korrelation mellem TanjilG_10657 og fire andre gener: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) og TanjilG_04706 (r = 0,79). Sådanne resultater kan indikere samregulering af disse gener under forsvarsresponser. TanjilG_12861- og TanjilG_23384-generne viste forskellige ekspressionsprofiler med lavere Pearson-korrelationskoefficientværdier (fra henholdsvis 0,08 til 0,43 og -0,19 til 0,28) sammenlignet med andre gener.
Korrelationer mellem genekspressionsprofiler blev detekteret ved hjælp af kvantitativ PCR. Følgende smalbladede lupinlinjer blev analyseret: 83A:476 (resistent, bærende den homozygote Lanr1-allel), Mandelup (moderat resistent, bærende den homozygote AnMan-allel), Boregine (resistent, genetisk baggrund ukendt) og population 22660 (modtagelig). Tre tidspunkter blev beregnet (6, 12 og 24 timer efter inokulering), inklusive inokulerede (Colletotrichum lupini, stamme Col-08, opnået fra lupinmarker i Wierzhenice, Polen, i 1999) og kontrolplanter (sham-inokulerede). Skalaen viser værdien af ​​Pearson-korrelationskoefficienten.
Baseret på data opnået ved 6 hestekræfter pr. tomme, blev WGCNA udført på 9981 DEG identificeret ved at sammenligne inokulerede og kontrolplanter for at fokusere på tidlige forsvarsresponser (Supplerende Tabel S12). Der blev fundet 22 genmoduler (klynger) med korrelerede (positive eller negative) ekspressionsprofiler mellem genotyper og eksperimentelle varianter. I gennemsnit var genekspressionsniveauerne faldende i rækkefølge 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (i begge varianter var denne tendens dog stærkere i kontrolplanterne). I gennemsnit var genekspressionsniveauerne faldende i rækkefølge 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (i begge varianter var denne tendens dog stærkere i kontrolplanterne). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Befolkning 22660 (в обоих вариантах, вариантах тенденция была сильнее у контрольных растений). I gennemsnit faldt genekspressionsniveauerne i størrelsesordenen 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (i begge varianter var denne tendens dog stærkere i kontrolplanterne).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Befolkning 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> befolkning 22660 的 顺序 下降 （， ， 県 平均在 在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。…… В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Befolkning 22660 была сильнее у контрольных растений). I gennemsnit faldt genekspressionsniveauerne i serien 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (dog var denne tendens stærkere i kontrolplanterne i begge varianter).Vaccination resulterede i opregulering af genekspression, især i modulerne 18, 19, 14, 6 og 1 (i faldende rækkefølge efter effekt), negativ regulering (f.eks. modulerne 9 og 20) eller med neutrale effekter (f.eks. modulerne 11, 22, 8 og 13). GO-termberigelsesanalyse (Supplerende Tabel S13) afslørede "GO: 0006952 Protective responses" for det inokulerede modul (18) med maksimal aktivering, inklusive gener analyseret ved qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 og TanjilG_27015), såvel som mange af de mest undertrykte fotosyntesemoduler (9). Modul 18-koncentratoren (fig. 8) blev identificeret som TanjilG_26536-genet, der koder for det PR-10-lignende LlR18B-protein, og modul 9-koncentratoren blev identificeret som TanjilG_28955-genet, der koder for fotosystem II PsbQ-proteinet. Et kandidat-anthracnose-resistensgen, Lanr1, TanjilG_05042, blev fundet i modul 22 (fig. 9) og er forbundet med termerne "GO:0044260 Cellular macromolecular metabolic processes" og "GO:0006355 Transcriptional regulation, DNA templating", der bærer TanjilG_01212-hubben. Genet koder for varmestress-transkriptionsfaktor A-4a (HSFA4a).
Vægtet netværksanalyse af gen-co-ekspression af moduler med overrepræsenterede biologiske procestermer "GO: 0006952 Forsvarsresponser". Ligering blev forenklet for at fremhæve de fire gener analyseret ved qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 og TanjilG_27015).
Vægtet netværksanalyse af gen-co-ekspression af et modul med en overrepræsenteret biologisk procesterm "GO: 0006355: Transkriptionel regulering, DNA-templatering" og bærende et kandidat-anthracnose-resistensgen Lanr1 TanjilG_05042. Ligering blev forenklet for at isolere TanjilG_05042-genet og det centrale TanjilG_01212-gen.
Screening for anthracnose-resistens indsamlet i Australien viste, at de fleste af de tidligt frigivne sorter var modtagelige; Kalya, Coromup og Mandelup er blevet beskrevet som moderat resistente, mens Wonga, Tanjil og 83A:476 er blevet beskrevet som meget resistente26,27,31. havde den samme resistensallel, betegnet Lanr1, og Coromup og Mandelup havde en anden allel, betegnet AnMan10,26,39, mens Kalya videregav en anden allel, Lanr2. Screening for anthracnose-resistens i Tyskland resulterede i identifikationen af ​​en resistent linje Bo7212 med en anden kandidatallel end Lanr1, betegnet LanrBo36.
Vores undersøgelse viste en meget lav frekvens (ca. 6%) af Lanr1-allelen i den testede kimplasma. Denne observation stemmer overens med resultaterne af screening af østeuropæisk kimplasma ved hjælp af Anseq3- og Anseq4-markørerne, som viste, at Lanr1-allelen kun er til stede i to hviderussiske linjer. Dette tyder på, at Lanr1-allelen endnu ikke er bredt anvendt i lokale avlsprogrammer, i modsætning til i Australien, hvor den er en af ​​nøgleallelerne til markørassisteret avl. Dette kan skyldes det lavere niveau af resistens, som Lanr1-allelen giver under europæiske feltforhold sammenlignet med den australske rapport. Derudover har undersøgelser af anthracnose i områder med høj nedbør i Australien vist, at resistensresponser medieret af Lanr1-allelen muligvis ikke er effektive under vejrforhold, der favoriserer vækst og hurtig udvikling af patogenet19,42. Faktisk blev der i den foreliggende undersøgelse også observeret nogle symptomer på anthracnose i genotyper, der bærer Lanr1-allelen, hvilket tyder på, at resistens kan forsvinde under optimale forhold for udviklingen af ​​C. lupini. Derudover er falsk positive fortolkninger af tilstedeværelsen af ​​Anseq3- og Anseq4-markørerne, som er cirka 1 cM fra Lanr1-locuset, mulige 28,30,43.
Vores undersøgelse viste, at 83A:476, der bar Lanr1-allelen, reagerede på C. lupini-inokulering med storstilet transkriptomprogrammering på det første analyserede tidspunkt (6 hpi), mens transkriptomiske responser blev observeret meget senere i Mandelup, der bar AnMan-allelen (fra 24 til 48 hpi). Disse tidsmæssige variationer i forsvarsresponser er forbundet med forskelle i sygdomssymptomer, hvilket understreger vigtigheden af ​​tidlig patogengenkendelse for en vellykket reaktion på resistens. For at inficere plantevæv skal miltbrandsporer gennemgå flere udviklingsstadier på værtens overflade, herunder spiring, celledeling og dannelse af et appressorium. Et vedhæng er en infektiøs struktur, der fæstner sig til værtens overflade og letter penetration ind i værtens væv. Således viste sporer af C. gloeosporioides i ærteekstrakt den første deling af kernen efter 75-90 minutters inkubation, dannelse af et kimrør efter 90-120 minutter og undertrykkelse efter 4 timer. Mango C. gloeosporioides viste mere end 40% konidiel spiring efter 3 timers inkubation og ca. 20% dannelse af appressorer efter 4 timer. Det virulensassocierede CAP20-gen fra C. gloeosporioides viste transkriptionel aktivitet i epifytdannende konidier efter 3,5 timers inkubation i avocado-overfladevoks med høje koncentrationer af CAP20-protein efter 4 timer og 46 minutter. Tilsvarende blev aktiviteten af ​​melaninbiosyntesegener i C. trifolii induceret under en 2-timers inkubation efterfulgt af dannelsen af ​​et appressorium efter 1 time. Undersøgelser af bladvæv har vist, at jordbær inokuleret med C. acutatum har første undertrykkelse ved 8 hpi, mens tomater inokuleret med C. coccodes har første undertrykkelse ved 4 hpi48,49. Dette er stort set i overensstemmelse med tidsskalaen for Colletotrichum spp.'s infektiøse proces. Hurtige forsvarsresponser på 83A:476 antyder involvering af planteresistens og effektor-udløst immunitet (ETI) gener i denne linje, mens Mandelups forsinkede responser understøtter hypotesen om mikroassocieret molekylær mønster-udløst immunitet (MTI) 50. Tidlige responser på 83A:476 og Mandelup. Den delvise overlapning mellem op- eller nedregulerede gener i forsinket respons understøtter også dette koncept, da ETI ofte betragtes som en accelereret og forstærket MTI-respons, der kulminerer i programmeret celledød på infektionsstedet, kendt som anafylaktisk shock 51,52.
De fleste af de gener, der tilskrives det overrepræsenterede udtryk Gene Ontology GO:0006952 "Defense Response", er de 11 homologer af det stressinducerede faste-budskab 22-protein (svarende til SAM22) og de syv store latexproteinlignende (MLP'er). -lignende proteiner 31, 34, 43 og 423 udviste sekvenslighed. SAM22-lignende gener udviste signifikant aktivering, der varede længere, hvilket viste øgede niveauer af anthracnose-resistens (83A:476 og Boregine). MLP-lignende gener var dog kun nedreguleret i linjer, der bærer kandidatresistensallelen (83A:476/Lanr1 ved 6 hpi og Mandelup/AnMan ved 24 hpi). Det skal bemærkes, at alle identificerede SAM22-lignende homologer stammer fra en genklynge, der strækker sig over cirka 105 kb, mens MLP-lignende gener stammer fra separate regioner af genomet. Koordineret aktivering af sådanne SAM22-lignende gener blev også fundet i vores tidligere undersøgelse af NLL-resistens over for Diaporthetoxica-inokulation, hvilket tyder på, at de er involveret i de horisontale komponenter af forsvarsresponset. Denne konklusion understøttes også af rapporter om en positiv respons af SAM22-lignende gener på skade eller behandling med salicylsyre, svampeinducere eller hydrogenperoxid.
MLP-lignende gener har vist sig at reagere på forskellige abiotiske og biotiske stressfaktorer, herunder bakterielle, virale og patogene svampeinfektioner i mange plantearter55. Reaktionsretningerne på visse interaktioner mellem planter og patogener varierede fra stærkt stigende (dvs. under angreb af bomuld med Verticillium dahliae) til signifikant faldende (dvs. efter infektion af æbletræet med Alternaria spp.)56,57. Signifikant nedregulering af det MLP-lignende 423-gen er blevet observeret under avocadoforsvar mod F. niger-infektion og under infektion af æbletræet Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola og Alternaria alternata er æblepatotyper58,59. Derudover havde æblekalli, der overudtrykte det MLP-lignende 423-gen, lavere ekspression af resistensassocierede gener og var mere modtagelige for svampeinfektion59. Efter Fusarium oxysporum f blev det MLP-lignende 423-gen også undertrykt i resistent almindelig bønne-kimplasma. cn. Bønneinfektion 60.
Andre medlemmer af PR-10-familien, der blev identificeret i vores RNA-seq-undersøgelse, var LlR18A- og LlR18B-generne som reaktion på opregulering, såvel som det opregulerede (1 gen) eller nedregulerede (3 gener) gen for lipidoverføringsproteinet DIR1. Derudover fremhæver WGCNA LlR18B-genet som et knudepunkt i dette modul, som er meget modtageligt for vaccination og bærer adskillige beskyttende responsgener. LlR18A- og LlR18B-generne blev induceret i gule lupinblade som reaktion på patogene bakterier, såvel som i NLL-stængler efter D. toxica-inokulering, mens rishomologen af ​​disse gener, RSOsPR10, hurtigt blev induceret af en svampeinfektion, der formodentlig er involveret i jasmonsyresignalvejen53,61,62. DIR1-genet koder for uspecifikke lipidtransportproteiner, der er nødvendige for starten af ​​systemisk erhvervet resistens (SAR). Med udviklingen af ​​beskyttende reaktioner transporteres DIR1-proteinet fra infektionsfokus gennem floemet for at inducere SAR i fjerne organer. Interessant nok blev TanjilG_02313 DIR1-genet signifikant induceret på det første tidspunkt i linje 84A:476 og population 22660, men anthracnose-resistens udviklede sig kun med succes i linje 84A:476. Dette kan indikere en vis subfunktionalisering af DIR1-genet i NLL, da de resterende tre homologer kun reagerede på inokulering i 83A:476-linjen ved 6 hpi, og denne respons var rettet nedad.
I vores undersøgelse var de mest almindelige komponenter, der svarer til den biologiske proces kaldet "GO:0055114 Redox-processen", cytochrom P450-protein, peroxidase, linolsyre 9S-/13S-lipoxygenase og 1-aminocyclopropan-1-carboxylsyreoxidase. Derudover definerer vores WGCNA HSFA4a-homologen som et centralt element, der bærer moduler såsom Lanr1-resistensgenkandidaten TanjilG_05042. HSFA4a er en komponent i den redoxafhængige regulering af nuklear transkription i planter.
Cytochrom P450-proteiner er oxidoreduktaser, der katalyserer NADPH- og/eller O2-afhængige hydroxyleringsreaktioner i primær og sekundær metabolisme, herunder metabolismen af ​​xenobiotika, såvel som hormoner, fedtsyrer, steroler, cellevægskomponenter, biopolymerer og biosyntesen af ​​beskyttende forbindelser 69. I vores undersøgelse blev variabiliteten i plante-cytochrom P450-funktion reduceret fra -10,6 log2 (fold change) til 5,7 på grund af et stort antal ændrede homologer (37) og forskelle i responsmønstre mellem specifikke gener, hvilket afspejler en opjustering. Det ville være meget spekulativt kun at bruge RNA-sekvenseringsdata til at belyse den formodede biologiske funktion af NLL-generne i en så stor protein-superfamilie. Det er dog værd at bemærke, at nogle cytochrom P450-gener er forbundet med øget resistens over for patogene svampe eller bakterier, herunder et bidrag til allergiske reaktioner 69,70,71.
Klasse III peroxidaser er multifunktionelle planteenzymer, der er involveret i en bred vifte af metaboliske processer under planters vækst og udvikling, samt som reaktion på miljømæssige stressfaktorer såsom saltindhold, tørke, høj lysintensitet og patogenangreb72. Peroxidaser er involveret i interaktionen mellem adskillige plantearter og Anthracis, herunder Stylosanthes humilis og C. gloeosporioides, Lens culinaris og C. truncatum, Phaseolus vulgaris og C. lindemuthianum, Cucumis sativus og C. lagenarium73,74,75,76. Responsen er meget hurtig, nogle gange endda ved 4 HPI, før svampen trænger ind i plantevævet73. Peroxidasegenet reagerede også på D. toxica NLL-inokulering. Ud over deres typiske funktioner til at regulere oxidativ udbrud eller eliminere oxidativ stress, kan peroxidaser interferere med patogenvækst ved at skabe fysiske barrierer baseret på cellevægsforstærkning under lignificering, subunit- eller tværbinding af specifikke forbindelser. Denne funktion kan in silico tilskrives TanjilG_03329-genet, der koder for en formodet lignindannende anionperoxidase, som var signifikant opreguleret i vores undersøgelse i den 83A:476-resistente linje ved 6 HPI, men ikke i andre stammer og tidspunkter, der ikke responderede.
9S-/13S-lipoxygenase af linolsyre er det første trin i den oxidative lipidbiosyntesevej78. Produkterne fra denne vej har flere funktioner i planteforsvar, herunder styrkelse af cellevægge gennem dannelsen af ​​callose- og pektinaflejringer og regulering af oxidativ stress gennem produktion af reaktive iltarter79,80,81,82,83. I den foreliggende undersøgelse var ekspressionen af ​​linolsyre 9S-/13S-lipoxygenase ændret i alle stammer, men i den modtagelige population 22660 herskede opregulering på forskellige tidspunkter, mens det i stammer, der bærer resistent Lanr1 og AnMan-allelen, understreger diversificeringen af ​​oxylipinlaget i beskyttende miltbrandreaktioner mellem disse genotyper.
1-aminocyclopropan-1-carboxylatoxidase (ACO)-homologen var signifikant opreguleret (9 gener) eller nedreguleret (2 gener), når den blev inokuleret med lupin. Med to undtagelser forekom alle disse responser ved 6 hp ved 83A:476. Den enzymatiske reaktion medieret af ACO-proteiner er det hastighedsbegrænsende trin i ethylenproduktion og er derfor stærkt reguleret84. Ethylen er et plantehormon, der spiller en række roller i reguleringen af ​​planters udvikling og respons på abiotiske og biotiske stressforhold. Induktionen af ​​ACO-transkription og aktivering af ethylensignalvejen er involveret i at øge risens resistens over for den hemibiotrofiske svamp oryzae oryzae ved at regulere produktionen af ​​reaktive iltarter og fytoalexiner. En meget lignende bladinfektionsproces fundet mellem M. oryzae og C. lupini88,89, på baggrund af en signifikant opregulering af ACO-homologer i 83A:476-linjen rapporteret i dette studie, ændrer muligheden for at give resistens over for NLL-anthracnoseethylen, et centralt signaleringstrin i molekylære signalveje.
I den foreliggende undersøgelse blev der observeret storstilet undertrykkelse af mange gener forbundet med fotosyntese ved 6 hpi i 83A:476 og ved 48 hpi i Mandeloop og 22660-populationen. Omfanget og progressionen af ​​disse ændringer er proportional med niveauet. Anthracnose-resistens blev observeret i dette eksperiment. For nylig er der rapporteret om stærk og tidlig undertrykkelse af fotosyntese-relaterede transkripter i flere modeller af plante-patogen-interaktioner, herunder patogene bakterier og svampe. Hastighed (fra 2 HPI i nogle interaktioner) og global undertrykkelse af gener forbundet med fotosyntese som reaktion på infektion kan udløse planteimmunitet baseret på udbredelsen af ​​reaktive iltarter og deres interaktion med salicylsyrevejen for at mediere allergiske reaktioner 90,94.
Afslutningsvis inkluderer de foreslåede forsvarsresponsmekanismer for den mest resistente afstamning (83A:476) hurtig patogengenkendelse af R-genet (formodentlig TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) og allergisk responsmedieret salicylsyre- og ethylensignalering, efterfulgt af etablering af langtrækkende SAR. Virkningen understøttes af DIR-1-proteinet. Det skal bemærkes, at den biotrofiske periode for C. lupini-infektion er meget kort (ca. 2 dage), efterfulgt af nekrotisk vækst95. Overgangen mellem disse stadier kan være forbundet med nekrose og ekspression af ethylen-inducerbare proteiner, der fungerer som udløsere for overfølsomhedsreaktioner i værtsplanter. Derfor er tidsvinduet for vellykket indfangning af C. lupini i det biotrofiske stadie meget smalt. Omprogrammeringen af ​​gener forbundet med redox og fotosyntese observeret i 83A:476 ved 6 hpi er i overensstemmelse med progressionen af ​​svampehyfer og varsler udviklingen af ​​en vellykket beskyttende respons i det biotrofiske stadie. De transkriptomiske responser hos Mandelup og 22660-populationen kan være for forsinkede til at fange svampen, før den skifter til nekrotisk vækst. Mandelup kan dog være mere effektiv end 22660-populationen, fordi den relativt hurtige regulering af PR-10-proteinet fremmer horisontal resistens.
ETI, drevet af det kanoniske R-gen, synes at være en almindelig mekanisme for bønneresistens over for anthracnose. I modelbælgplanten Medicago truncatula gives resistens over for anthracnose således af RCT1-genet, et medlem af TIR-NBS-LRR97-plantens R-genklasse. Dette gen giver også bredspektret anthracnose-resistens i lucerne, når det overføres til modtagelige planter. I den almindelige bønne (P. vulgaris) er der til dato blevet identificeret mere end to dusin anthracnose-resistensgener. Nogle af disse gener findes i regioner, der mangler kanoniske R-gener, men mange andre er placeret i kanterne af kromosomer, der bærer NBS-LRR-genklyngen, herunder TIR-NBS-LRRs99. Det genomomfattende SSR-studie bekræftede også sammenhængen mellem NBS-LRR-genet og anthracnose-resistens i den almindelige bønne. Det kanoniske R-gen blev også fundet i den genomiske region, der bærer det primære anthracnose-resistenslocus i hvid lupin 101.
Vores arbejde viser, at en øjeblikkelig resistensreaktion, aktiveret på et tidligt stadie af planteinfektion (helst senest 12 hpi), effektivt beskytter smalbladet lupin mod anthracnose forårsaget af den patogene svamp Collelotrichum lupini. Ved hjælp af højkapacitetssekventering demonstrerede vi differentielle ekspressionsprofiler af anthracnose-resistensgener i NLL-planter medieret af Lanr1- og AnMan-resistensgenerne. Succesfuldt forsvar involverer omhyggeligt design af generne for proteiner involveret i redox, fotosyntese og patogenese inden for timer efter plantens første kontakt med et patogen. Lignende beskyttende reaktioner, men forsinkede i tid, er meget mindre effektive til at beskytte planter mod sygdomme. Miltbrandresistens medieret af Lanr1-genet ligner den typiske hurtige respons fra R-genet (effektorudløst immunitet), mens AnMan-genet højst sandsynligt giver en horisontal respons (immunitet udløst af et mikrobe-associeret molekylært mønster), hvilket giver et moderat niveau af bæredygtighed.
De 215 NLL-linjer, der blev brugt til at screene for anthracnose-markører, bestod af 74 kultivarer, 60 linjer opnået ved krydsning eller avl, 5 mutanter og 76 vilde eller originale kimplasmer. Linjerne kom fra 17 lande, primært fra Polen (58), Spanien (47), Tyskland (27), Australien (26), Rusland (19), Hviderusland (7), Italien (5) og andre linjer fra 10 lande. Sættet inkluderer også referenceresistente linjer: 83A:476, Tanjil, Wonga, der bærer Lanr1-allelen, og Mandelup, der bærer AnMan-allelen. Linjerne blev hentet fra European Lupine Genetic Resource Database, der vedligeholdes af Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polen (Supplerende Tabel S1).
Planterne blev dyrket under kontrollerede forhold (fotoperiode 16 timer, temperatur 25°C om dagen og 18°C ​​om natten). To biologiske replikater blev analyseret. DNA blev isoleret fra tre uger gamle blade ved hjælp af DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til protokollen. Kvaliteten og koncentrationen af ​​det isolerede DNA blev vurderet ved hjælp af spektrofotometriske metoder (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). AnManM1-markøren, der markerer anthracnose-resistensgenet AnMan (afledt af cv. Mandelup), og markørerne Anseq3 og Anseq4, der flankerer genet Lanr1 (afledt af cv. Tanjil), blev analyseret11,26,28. Homozygoter for den resistente allel blev scoret som "1", modtagelige – som "0" og heterozygoter – som 0,5.
Baseret på resultaterne af screening for markørerne AnManM1, AnSeq3 og AnSeq4 og tilgængeligheden af ​​frø til endelige opfølgende forsøg, blev 50 NLL-linjer udvalgt til fænotypning af anthracnose-resistens. Analysen blev udført i duplikat i et computerstyret drivhus med en 14 timers fotoperiode med et temperaturinterval på 22 °C om dagen og 19 °C om natten. Frøene skrabes (frøskallen på den modsatte side af embryoet skæres af med et skarpt blad) før såning for at forhindre frødvale på grund af for hård frøskalle og for at sikre ensartet spiring. Planterne blev dyrket i potter (11 × 11 × 21 cm) med steril jord (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warszawa, Polen). Inokulering blev udført med Colletotrichum lupini Col-08-stammen, dyrket i 1999 fra stilkene af smalbladede lupinplanter dyrket på en mark i Verzhenitsa, Storpolen (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ Ø). Find et område. Isolaterne blev dyrket i SNA-medium ved 20° C under sort lys i 21 dage for at inducere sporulering. Fire uger efter såning, da planterne havde nået 4-6 bladstadiet, blev inokulering udført ved sprøjtning med en suspension af konidier i en koncentration på 0,5 x 106 konidier pr. ml. Efter inokulering blev planterne holdt i mørke i 24 timer ved en luftfugtighed på ca. 98% og en temperatur på 25°C for at lette spiringen af ​​konidier og infektionsprocessen. Planterne blev derefter dyrket under en 14-timers fotoperiode ved 22 °C dag/19 °C nat og 70 % luftfugtighed. Sygdomsscoren blev foretaget 22 dage efter podning og varierede fra 0 (immun) til 9 (meget modtagelig) afhængigt af tilstedeværelsen eller fraværet af nekrotiske læsioner på stængler og blade. Derudover blev planternes vægt målt efter scoring. Forholdet mellem markørgenotyper og sygdomsfænotyper blev beregnet som punkt to-sekvenskorrelationer (fravær af heterozygote markører i sættet af linjer til analyse af anthracnose-resistensfænotypen).