Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi peramban yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan peramban yang lebih baru (atau menonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Lupinus angustifolius (NLL, Lupinus angustifolius L.) adalah tanaman legum yang digunakan untuk produksi pangan dan perbaikan tanah. Ekspansi global NLL sebagai tanaman pangan telah menarik banyak jamur patogen, termasuk antraknosa lupin, yang menyebabkan penyakit antraknosa yang merusak. Dua alel, Lanr1 dan AnMan, yang memberikan peningkatan resistensi, telah digunakan dalam pemuliaan NLL, tetapi mekanisme molekuler yang mendasarinya masih belum diketahui. Dalam penelitian ini, penanda Lanr1 dan AnMan digunakan untuk menyaring sampel NLL Eropa. Pengujian vaksin dalam lingkungan terkontrol mengkonfirmasi kemanjuran kedua donor resisten. Profiling ekspresi gen diferensial dilakukan pada galur resisten dan rentan yang representatif. Resistensi antraknosa dikaitkan dengan ekspresi berlebihan dari istilah ontologi gen “GO:0006952 Respons Pertahanan”, “GO:0055114 Proses Redoks”, dan “GO:0015979 Fotosintesis”. Selain itu, galur Lanr1(83A:476) menunjukkan pemrograman ulang transkriptom yang signifikan dengan cepat setelah inokulasi, sementara galur lain menunjukkan keterlambatan respons ini sekitar 42 jam. Respons pertahanan dikaitkan dengan gen TIR-NBS, CC-NBS-LRR dan NBS-LRR, 10 protein yang terlibat dalam patogenesis, protein transfer lipid, endoglukan-1,3-β-glukosidase, protein dinding sel kaya glisin, dan gen dari jalur reaktif oksigen. Respons awal terhadap 83A:476, termasuk penekanan gen yang terkait dengan fotosintesis secara hati-hati, bertepatan dengan perlindungan yang berhasil selama fase pertumbuhan vegetatif biologi jamur, menunjukkan bahwa efektor memicu imunitas. Reaksi Mandeloop melambat, begitu pula dengan hambatan horizontal secara keseluruhan.
Lupin berdaun sempit (NLL, Lupinus angustifolius L.) adalah serealia berprotein tinggi yang berasal dari wilayah Mediterania barat1,2. Saat ini, tanaman ini ditanam sebagai tanaman pangan untuk hewan dan manusia. Tanaman ini juga dianggap sebagai pupuk hijau dalam sistem rotasi tanaman karena fiksasi nitrogen oleh bakteri pengikat nitrogen simbiotik dan peningkatan struktur tanah secara keseluruhan. NLL telah mengalami proses domestikasi yang cepat dalam abad terakhir dan masih berada di bawah tekanan pemuliaan yang tinggi3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Dengan budidaya NLL yang meluas, suksesi jamur patogen mengembangkan ceruk pertanian baru dan menyebabkan penyakit perusak tanaman baru. Hal yang paling mencolok bagi petani dan penangkar lupin adalah munculnya penyakit antraknosa, yang disebabkan oleh jamur patogen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Hal yang paling mencolok bagi petani dan penangkar lupin adalah munculnya penyakit antraknosa, yang disebabkan oleh jamur patogen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Layanan Penting dan Layanan yang Dapat Diperoleh патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Hal yang paling penting bagi petani dan penangkar lupin adalah munculnya penyakit antraknosa yang disebabkan oleh jamur patogen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的。Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Berambut。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Hal yang paling mencolok bagi petani dan penangkar lupin adalah munculnya penyakit antraknosa yang disebabkan oleh jamur patogen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Laporan paling awal tentang penyakit ini berasal dari Brasil dan Amerika Serikat, dengan gejala khas muncul masing-masing pada tahun 1912 dan 1929. Namun, setelah sekitar 30 tahun, patogen tersebut ditetapkan sebagai Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf dari Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.,有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.,有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld dalam Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld dalam Targeted Morphology. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .dan H. Schrenk. & H.施伦克,。 & H.施伦克,。dan H. Schlenk, .Fenotipe penyakit awal yang dilakukan pada pertengahan abad ke-20 menunjukkan beberapa resistensi pada aksesi NLL dan lupin kuning (L. luteus L.), tetapi semua aksesi lupin putih (L. albus L.) yang diuji sangat rentan15,16. Studi menunjukkan bahwa perkembangan antraknosa dikaitkan dengan peningkatan curah hujan (kelembapan udara) dan suhu (dalam kisaran 12-28°C), yang menyebabkan pelanggaran resistensi pada suhu yang lebih tinggi17, 18. Bahkan, waktu yang dibutuhkan untuk konidia berkecambah dan penyakit dimulai, empat kali lebih singkat pada 24°C (4 jam) daripada pada 12°C (16 jam) dalam kondisi kelembapan tinggi19. Dengan demikian, pemanasan global yang sedang berlangsung telah menyebabkan penyebaran antraknosa. Namun, penyakit ini diamati di Prancis (1982) dan Ukraina (1983) sebagai pertanda ancaman yang akan datang, tetapi tampaknya diabaikan oleh industri lupin pada saat itu20,21. Beberapa tahun kemudian, penyakit yang merusak ini menyebar ke seluruh dunia dan juga mempengaruhi negara-negara penghasil lupin utama seperti Australia, Polandia, dan Jerman22,23,24. Menyusul wabah antraknosa pada pertengahan tahun 1990-an, penyaringan ekstensif menghasilkan identifikasi beberapa donor resisten dalam sampel NLL19. Resistensi NLL terhadap antraknosa dikendalikan oleh dua alel dominan terpisah yang ditemukan dalam sumber plasma nutfah yang berbeda: Lanr1 pada kultivar Tanjil dan Wonga dan AnMan pada kultivar Mandalay 25, 26. Alel-alel ini melengkapi penanda molekuler yang mendukung seleksi plasma nutfah resisten dalam program pemuliaan25,26,27,28,29,30. Galur pemuliaan resisten 83A:476 yang membawa alel Lanr1 disilangkan dengan galur liar rentan P27255 untuk mendapatkan populasi RIL yang bersegregasi untuk resistensi antraknosa, yang memungkinkan untuk menetapkan lokus Lanr1 ke kromosom NLL-1131, 32, 33. Penyelarasan penanda peta tautan dari lokus resistensi yang mengapit antraknosa dengan kerangka genomik, NLL mengungkapkan lokasi ketiga alel pada kromosom yang sama (NLL-11), tetapi pada posisi yang berbeda29,34,35. Namun, karena jumlah RIL yang kecil dan jarak genetik yang besar antara penanda dan alel yang sesuai, tidak ada kesimpulan yang dapat diandalkan yang dapat ditarik tentang gen yang mendasarinya. Di sisi lain, penggunaan genetika terbalik pada lupin sulit dilakukan karena potensi regenerasinya yang sangat rendah, yang membuat manipulasi genetik menjadi rumit37.
Pengembangan plasma nutfah domestik yang membawa alel yang diinginkan dalam keadaan homozigot, seperti 83A:476 (Lanr1) dan Mandelup (AnMan), telah membuka pintu untuk mempelajari resistensi antraknosa dalam menghadapi kombinasi alel yang berlawanan pada populasi liar. Kemungkinan mekanisme molekuler. Membandingkan respons pertahanan yang dihasilkan oleh genotipe spesifik. Studi ini mengevaluasi respons transkriptom awal NLL terhadap vaksinasi C. lupini. Pertama, panel plasma nutfah NLL Eropa yang berisi 215 galur disaring menggunakan penanda molekuler yang menandai alel Lanr1 dan AnMan. Fenotipe antraknosa kemudian dilakukan pada 50 galur NLL, yang sebelumnya dipilih berdasarkan penanda molekuler, dalam kondisi terkontrol. Berdasarkan eksperimen ini, empat galur yang berbeda dalam resistensi antraknosa dan komposisi alel Lanr1/AnMan dipilih untuk profil ekspresi gen pertahanan diferensial menggunakan dua pendekatan komplementer: pengurutan RNA berkecepatan tinggi dan kuantifikasi PCR waktu nyata.
Penyaringan sejumlah plasma nutfah NLL (N = 215) dengan penanda Lanr1 (Anseq3 dan Anseq4) dan AnMan (Anseq4) dan AnMan (AnManM1) menunjukkan bahwa hanya satu galur (95726, dekat Salamanca-b) yang mengamplifikasi alel "resistensi" untuk semua penanda, sedangkan "Kehadiran alel 'rentan'" menemukan proporsi semua penanda pada 158 (~73,5%) galur. Tiga belas galur menghasilkan dua alel "resistensi" dari penanda Lanr1, dan 8 galur menghasilkan alel "resistensi" dari penanda Lanr1. Alel "resistensi" dari penanda AnMan (Tabel Tambahan S1). Dua galur bersifat heterozigot untuk penanda Anseq3 dan satu bersifat heterozigot untuk penanda AnManM1. Sebanyak 42 galur (19,5%) membawa fase berlawanan dari alel Anseq3 dan Anseq4, menunjukkan frekuensi rekombinasi yang tinggi antara kedua lokus ini. Fenotipe antraknosa dalam kondisi terkontrol (Tabel Tambahan S2) mengungkapkan variabilitas dalam ketahanan genotipe yang diuji, yang tercermin dalam tingkat keparahan antraknosa. Perbedaan skor rata-rata berkisar dari 1,8 (agak tahan) hingga 6,9 (rentan) dan perbedaan berat tanaman berkisar dari 0,62 (rentan) hingga 4,45 g (tahan). Terdapat korelasi signifikan antara nilai yang diamati dalam dua replikasi percobaan (0,51 untuk skor keparahan penyakit, P = 0,00017 dan 0,61 untuk berat tanaman, P < 0,0001) serta antara kedua parameter ini (− 0,59 dan − 0,77, P < 0,0001). Terdapat korelasi signifikan antara nilai yang diamati dalam dua replikasi percobaan (0,51 untuk skor keparahan penyakit, P = 0,00017 dan 0,61 untuk berat tanaman, P < 0,0001) serta antara kedua parameter ini (− 0,59 dan − 0,77, P < 0,0001). Perusahaan yang Menguntungkan Anda, yang Menguntungkan dan Merugikan Anda эксперимента (0,51 hari lebih banyak, P = 0,00017 dan 0,61 массы растения, P < 0,0001), dan акже между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Korelasi signifikan ditemukan antara nilai yang diamati dalam dua pengulangan percobaan (0,51 untuk skor keparahan penyakit, P = 0,00017 dan 0,61 untuk berat tanaman, P < 0,0001), serta antara kedua parameter ini (-0,59 dan -0,77, P < 0,0001).0,51,P = .在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为分为 0,51 , p = 0,00017 , 植物 为 为 0,61 , p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0,59 和– 0,59和– 0,59 和– 0,59 和- 0,77,P < 0,0001)。 Pentingnya Mengelola Bisnis yang Dapat Dilakukan di Rumah Anda (nilai rata-rata 0,51, P = 0,00017 dan lebih banyak lagi растения 0,61, P <0,0001), dan rata-rata 0,77, P <0,0001. Terdapat korelasi signifikan antara nilai yang diamati secara duplikat (skor keparahan penyakit 0,51, P = 0,00017 dan berat tanaman 0,61, P < 0,0001) dan antara kedua parameter ini (-0,59 dan -0,0001) 0,77, P<0,0001. ).Gejala khas yang terlihat pada tanaman yang rentan meliputi pembengkokan dan puntiran batang yang menyerupai struktur "busur gembala", diikuti oleh lesi oval dengan sporozoit berwarna oranye/merah muda (Gambar Tambahan 1). Aksesi Australia yang membawa gen Lanr1 (83A:476 dan Tanjil) dan AnMan (Mandelup) memiliki ketahanan sedang (0,0331 dan 0,0036). Beberapa galur yang juga membawa alel Lanr1 dan/atau AnMan yang "tahan" menunjukkan gejala penyakit tersebut.
Menariknya, beberapa galur NLL yang tidak memiliki alel penanda "resisten" menunjukkan tingkat resistensi antraknosa yang tinggi (sebanding atau lebih tinggi daripada genotipe Lanr1 atau AnMan), seperti Boregine (nilai P < 0,0001 untuk kedua parameter), Bojar (nilai P < 0,0001 untuk skor dan 0,001 untuk berat tanaman) dan Populasi B-549/79b (nilai P < 0,0001 untuk skor dan tidak signifikan untuk berat). Menariknya, beberapa galur NLL yang tidak memiliki alel penanda "resisten" menunjukkan tingkat resistensi antraknosa yang tinggi (sebanding atau lebih tinggi daripada genotipe Lanr1 atau AnMan), seperti Boregine (nilai P < 0,0001 untuk kedua parameter), Bojar (nilai P < 0,0001 untuk skor dan 0,001 untuk berat tanaman) dan Populasi B-549/79b (nilai P < 0,0001 untuk skor dan tidak signifikan untuk berat). Selain itu, ini adalah NLL yang tidak dapat dijelaskan, yang mana adalah "резистентного" sebagai pengganti yang lebih baik, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый atau более высокий, чем для генотипов Lanr1 atau AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки dan 0,001 массы растения) dan популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и tidak ada gunanya). Menariknya, beberapa galur NLL yang tidak memiliki alel penanda 'resisten' menunjukkan tingkat resistensi yang tinggi terhadap antraknosa (sebanding atau lebih tinggi daripada genotipe Lanr1 atau AnMan), seperti Boregine (nilai P < 0,0001 untuk kedua parameter), Bojar (nilai P < 0,0001 untuk evaluasi dan 0,001 untuk berat tanaman) dan populasi B-549/79b (nilai P < 0,0001 untuk evaluasi dan tidak signifikan untuk berat).有趣的是,一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与 Lanr1或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001,植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）。 Menariknya, beberapa sistem NLL yang tidak memiliki penanda "antigenik" menunjukkan resistensi horizontal yang tinggi (setara dengan gen Lanr1 atau AnMan atau lebih tinggi), seperti Boregine (kedua parameter P < 0,0001), Bojar (nilai P < 0,0001, berat tanaman 0,001) dan strain B-549/79b (nilai P < 0,0001, berat tidak signifikan). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые atau выше, чем у генотипов Lanr1 atau AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) dan B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Menariknya, beberapa galur NLL yang tidak memiliki alel penanda 'resistensi' menunjukkan tingkat resistensi antraknosa yang tinggi (sebanding atau lebih tinggi daripada genotipe Lanr1 atau AnMan), seperti Boregine (nilai P untuk kedua parameter <0,0001), Bojar (nilai P < 0,0001, berat tanaman 0,001) dan populasi B-549/79b (nilai P < 0,0001, berat tidak signifikan).Fenomena ini menunjukkan kemungkinan adanya sumber genetik resistensi baru, yang menjelaskan kurangnya korelasi yang diamati antara genotipe penanda dan fenotipe penyakit (nilai P dari ~0,42 hingga ~0,98). Dengan demikian, uji Kolmogorov-Smirnov menunjukkan bahwa data resistensi antraknosa terdistribusi secara normal untuk skor (nilai P 0,25 dan 0,11) dan massa tanaman (nilai P 0,47 dan 0,55), yang menunjukkan hipotesis saya bahwa lebih banyak alel selain Lanr1 dan AnMan yang terlibat.
Berdasarkan hasil penyaringan resistensi antraknosa, 4 galur dipilih untuk analisis transkriptom: 83A:476, Boregine, Mandelup, dan Populasi 22660. Galur-galur ini diuji ulang resistensinya terhadap antraks dalam percobaan inokulasi dengan sekuensing RNA, dengan syarat galur-galur tersebut sama seperti pada pengujian sebelumnya. Nilai skornya adalah sebagai berikut: Boregine (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) dan populasi 22660 (6,11 ± 1,29).
Protokol Illumina NovaSeq 6000 mencapai rata-rata 40,5 pasangan Mread per sampel (29,7 hingga 54,4 Mread) (Tabel Tambahan S3). Skor keselarasan dalam urutan referensi berkisar dari 75,5% hingga 88,6%. Korelasi rata-rata data jumlah bacaan antara varian eksperimental antara replikasi biologis berkisar dari 0,812 hingga 0,997 (rata-rata 0,959). Dari 35.170 gen yang dianalisis, 2917 gen tidak menunjukkan ekspresi, dan 4785 gen lainnya diekspresikan pada tingkat yang sangat rendah (rata-rata dasar < 5). Dari 35.170 gen yang dianalisis, 2917 gen tidak menunjukkan ekspresi, dan 4785 gen lainnya diekspresikan pada tingkat yang sangat rendah (rata-rata dasar < 5). Pada 35 170 bulan yang lalu 2917 tidak ada laporan, dan 4785 bulan lalu экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5). Dari 35.170 gen yang dianalisis, 2917 tidak menunjukkan ekspresi, dan 4785 gen sisanya diekspresikan pada tingkat yang sangat rendah (rata-rata dasar <5).在分析的35,170 orang,2917 orang, 4785 orang个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35.170 Pada 35 170 bulan yang lalu 2917 bukan tahun yang lalu, dan tahun 4785 tahun yang lalu незначительную экспрессию (базовое среднее значение <5). Dari 35.170 gen yang dianalisis, 2917 tidak diekspresikan dan 4785 gen sisanya memiliki ekspresi yang dapat diabaikan (rata-rata dasar <5).Dengan demikian, jumlah gen yang dianggap terekspresi (rata-rata dasar ≥ 5) selama percobaan adalah 27.468 (78,1%) (Tabel Tambahan S4).
Dari titik waktu pertama, semua galur NLL merespons inokulasi C. lupini (galur Col-08) dengan memprogram ulang transkriptom (Tabel 1), namun, perbedaan signifikan diamati antar galur. Dengan demikian, galur resisten 83A:476 (yang membawa gen Lanr1) menunjukkan pemrograman ulang transkriptom yang signifikan pada titik waktu pertama (6 jam pasca-inokulasi) dengan peningkatan 31-69 kali lipat dalam jumlah gen yang teridentifikasi naik dan turun dibandingkan dengan titik waktu lainnya pada titik waktu ini. Selain itu, puncak ini berumur pendek, karena ekspresi hanya beberapa gen yang tetap berubah secara signifikan pada titik waktu kedua (12 jam pasca-inokulasi). Menariknya, Boregine, yang juga menunjukkan tingkat resistensi yang tinggi dalam uji cangkok, tidak mengalami pemrograman ulang transkripsional yang masif selama percobaan. Namun, jumlah gen yang diekspresikan secara berbeda (DEG) sama untuk Boregine dan 83A:476 pada 12 jam pasca-inokulasi. Baik Mandelup maupun populasi 22660 menunjukkan puncak DEG pada titik waktu terakhir (48 l/s), yang mengindikasikan keterlambatan relatif dalam respons pertahanan.
Karena 83A:476 mengalami pemrograman ulang transkriptom secara masif sebagai respons terhadap C. lupini pada 6 HPI dibandingkan dengan semua galur lainnya, ~91% dari DEG yang diamati pada titik waktu ini bersifat spesifik garis keturunan (Gambar 1). Namun, terdapat beberapa tumpang tindih dalam respons awal antar galur penelitian, karena 68,5%, 50,9%, dan 52,6% DEG pada Boregine, Mandelup, dan populasi 22660, masing-masing, tumpang tindih dengan yang ditemukan pada 83A:476 pada titik waktu tertentu. Namun, DEG ini hanya menyumbang sebagian kecil (0,97–1,70%) dari semua DEG yang saat ini terdeteksi menggunakan 83A:476. Selain itu, 11 DEG dari semua lini menunjukkan koherensi pada saat ini (Tabel Tambahan S4-S6), termasuk komponen umum dari respons pertahanan tanaman: protein transfer lipid (TanjilG_32225), enzim endoglukan-1,3-β-glukosida (TanjilG_23384), dua protein yang diinduksi stres seperti SAM22 (TanjilG_31528 dan TanjilG_31531), protein lateks dasar (TanjilG_32352), dan dua protein dinding sel struktural kaya glisin (TanjilG_19701 dan TanjilG_19702). Terdapat pula tumpang tindih yang relatif tinggi dalam respons transkriptom antara 83A:476 dan Boregine pada 24 HPI (total 16-38% DEG) dan antara Mandelup dan Populasi 22660 pada 48 HPI (total 14-20% DEG).
Diagram Venn yang menunjukkan jumlah gen yang diekspresikan secara berbeda (DEG) pada galur lupin berdaun sempit (NLL) yang diinokulasi dengan Colletotrichum lupini (galur Col-08 yang diperoleh dari lahan lupin di Wierzhenice, Polandia, 1999). Galur NLL yang dianalisis adalah: 83A:476 (resisten, membawa alel Lanr1), Boregine (resisten, latar belakang genetik tidak diketahui), Mandelup (resisten sedang, membawa alel AnMan) dan populasi 22660 (sangat rentan). Singkatan hpi berarti jam setelah vaksinasi. Nilai nol telah dihilangkan untuk menyederhanakan grafik.
Kumpulan gen yang diekspresikan secara berlebihan pada 6 hpi dianalisis untuk keberadaan domain gen R kanonik (Tabel Tambahan S7). Studi ini mengungkapkan induksi transkriptom gen resistensi penyakit klasik dengan domain NBS-LRR hanya pada 83A:476. Kumpulan ini terdiri dari satu gen TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), lima gen CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, dan tanjilg_16162), dan empat NBS-LR (tanjilg_16162), dan empat NBS-LRRE (tanjilg_16162) serta empat NBS-Lrr (tanjilg_16162) dan empat NBS-LRR (TANJILG_16162). Semua gen ini memiliki domain kanonik yang tersusun dalam sekuens yang terlestarikan. Selain gen domain NBS-LRR, beberapa kinase RLL diaktifkan pada 6 jam pasca infeksi (hpi), yaitu satu di Boregine (TanjilG_19877), dua di Mandelup (TanjilG_07141 dan TanjilG_19877) dan di populasi 22660 (TanjilG_09014 dan TanjilG_10361) dan dua di 83A 27:476.
Gen-gen dengan ekspresi yang berubah secara signifikan sebagai respons terhadap inokulasi dengan C. lupini (strain Col-08) dianalisis menggunakan Gene Ontology (GO) enrichment analysis (Tabel Tambahan S8). Istilah proses biologis yang paling sering muncul secara berlebihan adalah “GO:0006952 respons pertahanan” yang muncul dalam 6 dari 16 kombinasi (waktu × baris) dengan signifikansi tinggi (nilai P < 0,001) (Gambar 2). Istilah proses biologis yang paling sering muncul secara berlebihan adalah “GO:0006952 respons pertahanan” yang muncul dalam 6 dari 16 kombinasi (waktu × baris) dengan signifikansi tinggi (nilai P < 0,001) (Gambar 2). Anda perlu menghubungi kami melalui telepon «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся pada 6 atau 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Istilah proses biologis yang paling sering muncul secara berlebihan adalah 'GO:0006952 respons pertahanan', yang muncul dalam 6 dari 16 kombinasi (waktu × garis keturunan) dengan signifikansi tinggi (nilai P < 0,001) (Gambar 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 Istilah proses biologis yang paling representatif adalah “GO:0006952 respons pertahanan”, yang muncul dalam 6 dari 16 kombinasi (waktu×garis), dengan signifikansi tinggi (nilai P < 0,001) (Gambar 2). Anda perlu menggunakan aplikasi ini untuk mengaktifkan "GO: 0006952 Defense Response", yang berarti "GO: 0006952 Defense Response". появлялся в 6 atau 16 kolom (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Istilah proses biologis yang paling sering muncul adalah 'GO:0006952 Respons Pertahanan', yang muncul dalam 6 dari 16 kombinasi (waktu × baris) dengan signifikansi tinggi (nilai P < 0,001) (Gambar 2).Istilah ini terwakili secara berlebihan pada dua titik waktu di 83A: 476 dan Boregine (6 dan 24 hpi) dan pada satu titik waktu di Mandelup dan Populasi 22660 (12 dan 6 hpi, masing-masing). Ini adalah hasil yang diharapkan, yang menyoroti respons antijamur dari galur resisten. Selain itu, 83A:476 merespons C. lupini dengan cepat menginduksi gen yang terkait dengan ledakan oksidatif yang diwakili oleh istilah "GO:0055114 proses redoks", menunjukkan respons pertahanan spesifik, sementara Boregine mengungkapkan respons pertahanan spesifik, terkait dengan istilah 'GO'. :0006950 Respons stres”. Populasi 22660 mengaktifkan respons resistensi horizontal yang melibatkan metabolit sekunder, menyoroti jumlah istilah yang berlebihan “GO:0016104 Proses biosintesis triterpen” dan “GO:0006722 Proses metabolisme triterpen” (kedua istilah tersebut termasuk dalam himpunan gen yang sama), dengan mempertimbangkan hasil analisis pengayaan istilah GO, stabilitas reaksi Mandelup berada di antara Boregine dan Populasi 22660. Selain itu, reaksi awal 83A:476 (6 hpi) dan reaksi tertunda Mandelup dan Populasi 22660 mencakup istilah GO:0015979 'fotosintesis' dan proses biologis terkait lainnya.
Istilah ontologi gen bioproses yang dipilih dalam anotasi gen yang diekspresikan secara berbeda selama respons transkriptom lupin berdaun sempit (NLL) yang diinokulasi dengan lupin antraks (galur Col-08 yang diperoleh dari ladang lupin di Wierzhenice, Polandia, pada tahun 1999) sangat dilebih-lebihkan. Galur NLL yang dianalisis adalah: 83A:476 (resisten, membawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (resisten, latar belakang genetik tidak diketahui), Mandelup (agak resisten, membawa alel AnMan homozigot) dan populasi 22660 (rentan).
Karena penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi gen yang berkontribusi terhadap resistensi antraknosa, gen yang ditetapkan pada istilah GO “GO: 0006952 Respons pertahanan” dan “GO: 0055114 Proses redoks” dianalisis dengan ambang batas karena nilai rata-rata dasar ≥ 30 dengan setidaknya satu garis × titik waktu yang menggabungkan nilai log2 (perubahan lipat) yang signifikan secara statistik. Jumlah gen yang memenuhi kriteria ini adalah 65 untuk GO:0006952 dan 524 untuk GO:0055114.
83A:476 mengungkapkan dua puncak DEG yang diberi anotasi dengan istilah GO:0006952, yang pertama pada 6 gen per inci (64 gen, regulasi naik dan turun) dan yang kedua pada 24 gen per inci (15 gen, hanya regulasi naik). Boregine juga menunjukkan bahwa GO:0006952 mencapai puncaknya pada titik waktu yang sama, tetapi dengan DEG yang lebih sedikit (11 dan 8) dan aktivasi preferensial. Mandeloop menunjukkan dua puncak GO:0006952 pada 12 dan 48 HPI, keduanya membawa 12 gen (yang pertama dengan gen pengaktif, dan yang kedua hanya dengan gen penekan), sementara populasi 22660 pada 6 HPI (13 gen) memiliki dominasi yang lebih besar dari puncak regulasi naik. Perlu dicatat bahwa 96,4% dari GO:0006952 DEG pada puncak-puncak ini memiliki jenis respons yang sama (naik atau turun), menunjukkan tumpang tindih yang signifikan dalam respons pertahanan meskipun terdapat perbedaan dalam jumlah gen yang terlibat. Kelompok sekuens terbesar yang terkait dengan istilah GO:0006952 mengkodekan Protein Pesan Terkait Stres Kelaparan 22 (SAM22-like), yang termasuk dalam kelas 10 protein terkait patogenesis (PR-10) dan protein inti lateks. protein serupa (MLP-like) (Gambar 3). Kedua kelompok tersebut berbeda dalam sifat ekspresi dan arah respons. Gen yang mengkodekan protein SAM22-like menunjukkan induksi yang konsisten dan signifikan pada titik waktu awal (6 atau 12 hpi) dan umumnya tidak responsif pada akhir percobaan (48 hpi), sementara protein MLP-like menunjukkan koordinasi pada 6 hpi. Pada 83A:476 dan Mandelup pada 48 hp/in, hampir semua titik data lainnya tidak responsif. Selain itu, perbedaan profil ekspresi gen protein mirip SAM22 mengikuti variabilitas yang diamati dalam resistensi antraknosa, karena galur yang lebih resisten memiliki lebih banyak titik waktu yang secara signifikan menginduksi gen-gen ini daripada galur yang lebih rentan. Gen PR-10 mirip LlR18A/B lainnya menunjukkan pola ekspresi yang sangat mirip dengan gen protein mirip SAM22.
Komponen utama dari istilah proses biologis “GO:0006952 Respons Pertahanan” dan pola ekspresi gen kandidat dari alel Lanr1 dan AnMan diidentifikasi. Skala Log2 mewakili nilai log2 (perubahan lipat) antara tanaman yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, diperoleh dari lahan lupin, Wizhenica, Polandia, 1999) dan tanaman kontrol (diinokulasi semu) pada titik waktu yang sama. Galur lupin berdaun sempit berikut dianalisis: 83A:476 (resisten, membawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (resisten, latar belakang genetik tidak diketahui), Mandelup (agak resisten, membawa alel AnMan homozigot), dan Populasi 22660 (rentan).
Selain itu, profil ekspresi gen kandidat RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) dan AnMan (TanjilG_12861) dievaluasi (Gambar 3). Gen TanjilG_05042 menunjukkan respons signifikan (aktivasi) pada 83A:476 hanya pada titik waktu pertama (6 hpi), sedangkan TanjilG_12861 signifikan di Mandeloop hanya pada dua titik waktu: 6 hpi (penurunan regulasi) dan 24 hpi (6 hpi). Dengan.). dapat disesuaikan).
Gen yang paling banyak diekspresikan dalam istilah GO:0055114 “proses redoks” adalah gen yang mengkode protein sitokrom P450 dan peroksidase (Gambar 4). Untuk sampel yang diisolasi dari 83A:476 pada 6 HPI, nilai log2 (perubahan lipatan) maksimum atau minimum (untuk 86,6% gen) umumnya diamati antara tanaman yang diinokulasi dan kontrol, menyoroti respons tinggi genotipe ini terhadap inokulasi. 83A:476 menunjukkan DEG GO:0055114 yang paling signifikan pada 6 hpi (503 gen), sedangkan galur lainnya pada 48 hpi (Boregine, 31 gen; Mandelup, 85 gen; dan Populasi 22660, 78 gen)). Pada sebagian besar gen dari famili GO:0055114, dua jenis respons terhadap vaksinasi (aktivasi dan inhibisi) diamati. Menariknya, hingga 97,6% DEG yang diidentifikasi untuk istilah GO: 0055114 di Mandelupe pada 48 hp. Pengamatan ini menunjukkan bahwa, meskipun skalanya jauh lebih kecil (yaitu, jumlah gen redoks yang bermutasi, 85 dibandingkan 503), pola respons transkriptom yang tertunda pada mandelupe terhadap antraknosa mirip dengan respons awal 83A:476. Di Boregine dan Populasi 22660, konvergensi ini lebih rendah, masing-masing sebesar 51,6% dan 75,6%.
Pola ekspresi komponen utama dari istilah proses biologis “GO:0055114 Proses Redoks” telah terungkap. Skala Log2 mewakili nilai log2 (perubahan lipat) antara tanaman yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, diperoleh dari lahan lupin, Wizhenica, Polandia, 1999) dan tanaman kontrol (tanpa inokulasi) pada titik waktu yang sama. Galur lupin berdaun sempit berikut dianalisis: 83A:476 (resisten, membawa alel homozigot Lanr1), Boregine (resisten, latar belakang genetik tidak diketahui), Mandelup (agak resisten, membawa alel homozigot AnMan), dan Populasi 22660 (rentan).
Respons transkriptomik terhadap inokulasi dengan C. lupini (strain Col-08) juga mencakup pembungkaman terkoordinasi gen yang dikaitkan dengan istilah GO:0015979 “fotosintesis” dan proses biologis terkait lainnya (GAMBAR 5). Kumpulan DEG GO:0015979 ini berisi 105 gen yang ditekan secara signifikan pada 6 jam pasca-inokulasi (hpi) pada 83A:476. Dalam subset ini, 37 gen juga mengalami penurunan ekspresi di Mandelup pada 48 HPI dan 35 pada titik waktu yang sama di populasi 22660, termasuk 19 DEG yang umum untuk kedua genotipe. Tidak ada DEG yang terkait dengan istilah GO:0015979 yang diaktifkan secara signifikan dalam kombinasi apa pun (garis x waktu).
Pola ekspresi komponen utama dari istilah proses biologis “GO:0015979 Fotosintesis” telah diungkapkan. Skala Log2 mewakili nilai log2 (perubahan lipat) antara tanaman yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, diperoleh dari lahan lupin, Wizhenica, Polandia, 1999) dan tanaman kontrol (tanpa inokulasi) pada titik waktu yang sama. Galur lupin berdaun sempit berikut dianalisis: 83A:476 (resisten, membawa alel homozigot Lanr1), Boregine (resisten, latar belakang genetik tidak diketahui), Mandelup (agak resisten, membawa alel homozigot AnMan), dan Populasi 22660 (rentan).
Berdasarkan hasil analisis ekspresi diferensial dan diduga terlibat dalam respons pertahanan terhadap jamur patogen, tujuh gen ini dipilih untuk kuantifikasi profil ekspresi dengan PCR waktu nyata (Tabel Tambahan S9).
Gen protein TanjilG_10657 yang diduga terinduksi secara signifikan di semua galur dan titik waktu yang dipelajari dibandingkan dengan tanaman kontrol (mirip) (Tabel Tambahan S10, S11). Selain itu, profil ekspresi TanjilG_10657 menunjukkan tren peningkatan selama percobaan untuk semua galur. Populasi 22660 menunjukkan sensitivitas tertinggi TanjilG_10657 terhadap inokulasi dengan aktivasi 114 kali lipat dan tingkat ekspresi relatif tertinggi (4,4 ± 0,4) pada 24 HPI (Gambar 6a). Gen protein PR10 LlR18A TanjilG_27015 juga menunjukkan aktivasi di semua galur dan titik waktu, dengan signifikansi statistik pada sebagian besar titik data (Gambar 6b). Mirip dengan TanjilG_10657, tingkat ekspresi relatif tertinggi TanjilG_27015 diamati pada populasi yang diinokulasi 22660 pada 24 HPI (19,5 ± 2,4). Gen endokitinase asam TanjilG_04706 secara signifikan meningkat pada semua galur dan pada semua titik waktu kecuali untuk Boregine 6 hpi (Gambar 6c). Gen ini sangat terinduksi pada titik waktu pertama (6 HPI) pada 83A:476 (sebanyak 10,5 kali) dan meningkat secara moderat pada galur lain (sebanyak 6,6-7,5 kali). Selama percobaan, ekspresi TanjilG_04706 tetap pada tingkat yang serupa di 83A:476 dan Boregine, sedangkan di Mandelup dan Populasi 22660 meningkat secara signifikan, mencapai nilai yang relatif tinggi (5,9 ± 1,5 dan 6,2 ± 1,5, masing-masing). Gen endoglukan-1,3-β-glukosidase-like TanjilG_23384 menunjukkan aktivasi tinggi pada dua titik waktu pertama (6 dan 12 hpi) di semua galur kecuali populasi 22660 (Gambar 6d). Tingkat ekspresi relatif tertinggi TanjilG_23384 diamati pada titik waktu kedua (12 hpi) di Mandelup (2,7 ± 0,3) dan 83A:476 (1,5 ± 0,1). Pada 24 HPI, ekspresi TanjilG_23384 relatif rendah di semua lini yang diteliti (dari 0,04 ± 0,009 hingga 0,44 ± 0,12).
Profil ekspresi gen terpilih (ag) yang diungkapkan oleh PCR kuantitatif. Angka 6, 12, dan 24 mewakili jam setelah vaksinasi. Gen LanDExH7 dan LanTUB6 digunakan untuk normalisasi dan LanTUB6 digunakan untuk kalibrasi antar seri. Batang kesalahan mewakili deviasi standar berdasarkan tiga replikasi biologis, yang masing-masing merupakan rata-rata dari tiga replikasi teknis. Signifikansi statistik perbedaan tingkat ekspresi antara tanaman yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, diperoleh pada tahun 1999 dari lahan lupin di Wierzenica, Polandia) dan tanaman kontrol (diinokulasi palsu) ditandai di atas titik data (*nilai P < 0,05, **nilai P ≤ 0,01, ***nilai P ≤ 0,001). Signifikansi statistik perbedaan tingkat ekspresi antara tanaman yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, diperoleh pada tahun 1999 dari lahan lupin di Wierzenica, Polandia) dan tanaman kontrol (diinokulasi palsu) ditandai di atas titik data (*nilai P < 0,05, **nilai P ≤ 0,01, ***nilai P ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между и Companiesулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен pada tahun 1999 поля люпина в Верженице, Польша) dan контрольными (ложно иSomeулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***nilai P ≤ 0,001). Perbedaan tingkat ekspresi yang signifikan secara statistik antara tanaman yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, diperoleh pada tahun 1999 dari ladang lupin di Wierzhenice, Polandia) dan tanaman kontrol (tanpa inokulasi) dicatat di atas titik data (*nilai P < 0,05, **nilai P ≤ 0,01, ***nilai P ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini,Kol-08株,1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001)。接种 （colletotrichum lupini , color-08 株 , 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物 之间水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между и Companiesулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно иSomeулированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-nilai ≤ 0,001). Perbedaan tingkat ekspresi yang signifikan secara statistik antara tanaman yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, diperoleh dari ladang lupin di Verzhenice, Polandia, pada tahun 1999) dan tanaman kontrol (tanpa inokulasi) dicatat di atas titik data (*nilai P < 0,05, **nilai P ≤ 0,01, ***nilai P ≤ 0,001).Galur NLL yang dianalisis adalah: 83A:476 (resisten, membawa alel Lanr1 homozigot), Mandelup (resisten sedang, membawa alel AnMan homozigot), Boregine (resisten, latar belakang genetik tidak diketahui) dan populasi 22660 (rentan).
Gen kandidat TanjilG_05042 pada lokus Lanr1 menunjukkan pola ekspresi yang sangat berbeda dari profil yang diperoleh dari studi RNA-seq (Gambar 6e). Aktivasi signifikan gen ini diamati pada populasi Mandelup dan 22660 (masing-masing hingga 39,7 dan 11,7 kali), menghasilkan tingkat ekspresi yang relatif tinggi (masing-masing hingga 1,4 ± 0,14 dan 7,2 ± 1,3). 83A:476 juga menunjukkan beberapa peningkatan ekspresi gen TanjilG_05042 (hingga 3,8 kali lipat), namun, tingkat ekspresi relatif yang dicapai (0,044 ± 0,002) lebih dari 30 kali lebih rendah daripada yang diamati pada populasi Mandelup dan 22660. Analisis menggunakan qPCR menunjukkan perbedaan signifikan dalam tingkat ekspresi antar genotipe pada varian yang divaksinasi palsu (kontrol), mencapai perbedaan 58 kali lipat antara populasi 22660 dan 83A:476, serta antara populasi 22660 dan 22660. Perbedaan dua kali lipat dicapai antara Boregine dan Mandalup.
Gen kandidat pada lokus AnMan, TanjilG_12861, diaktifkan sebagai respons terhadap vaksinasi pada 83A:476 dan Mandelup, bersifat netral pada populasi 22660, dan mengalami penurunan ekspresi pada Boregine (Gambar 6f). Ekspresi relatif gen TanjilG_12861 tertinggi pada 83A:476 yang diinokulasi (0,14±0,01). Gen protein kejut panas kelas I 17,4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 menunjukkan tingkat ekspresi relatif yang lebih rendah pada semua strain dan titik waktu yang dipelajari (Gambar 6g). Nilai tertinggi diamati pada 24 HPI pada populasi 22660 (0,14 ± 0,02, peningkatan delapan kali lipat sebagai respons terhadap vaksinasi).
Perbandingan profil ekspresi gen (Gambar 7) menunjukkan korelasi yang tinggi antara TanjilG_10657 dan empat gen lainnya: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80), dan TanjilG_04706 (r = 0,79). Hasil tersebut mungkin menunjukkan ko-regulasi gen-gen ini selama respons pertahanan. Gen TanjilG_12861 dan TanjilG_23384 menunjukkan profil ekspresi yang berbeda dengan nilai koefisien korelasi Pearson yang lebih rendah (masing-masing dari 0,08 hingga 0,43 dan -0,19 hingga 0,28) dibandingkan dengan gen lainnya.
Korelasi antara profil ekspresi gen dideteksi menggunakan PCR kuantitatif. Galur lupin berdaun sempit berikut dianalisis: 83A:476 (resisten, membawa alel Lanr1 homozigot), Mandelup (resisten sedang, membawa alel AnMan homozigot), Boregine (resisten, latar belakang genetik tidak diketahui), dan Populasi 22660 (rentan). Tiga titik waktu dihitung (6, 12 dan 24 jam setelah inokulasi), termasuk tanaman yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, diperoleh dari lahan lupin di Wierzhenice, Polandia, pada tahun 1999) dan tanaman kontrol (inokulasi semu). Skala menunjukkan nilai koefisien korelasi Pearson.
Berdasarkan data yang diperoleh pada 6 tenaga kuda per inci, WGCNA dilakukan pada 9981 DEG yang diidentifikasi dengan membandingkan tanaman yang diinokulasi dan tanaman kontrol untuk fokus pada respons pertahanan awal (Tabel Tambahan S12). Dua puluh dua modul gen (kluster) ditemukan dengan profil ekspresi yang berkorelasi (positif atau negatif) antara genotipe dan varian eksperimental. Secara rata-rata, tingkat ekspresi gen menurun dalam urutan 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (namun, pada kedua varian, tren ini lebih kuat pada tanaman kontrol). Secara rata-rata, tingkat ekspresi gen menurun dalam urutan 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (namun, pada kedua varian, tren ini lebih kuat pada tanaman kontrol). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (в обоих вариантах, tentu saja, ini adalah hal yang perlu Anda lakukan контрольных растений). Secara rata-rata, tingkat ekspresi gen menurun dalam urutan 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (namun, pada kedua varian, tren ini lebih kuat pada tanaman kontrol).平均而言,基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660的顺序下降（然而,在两种变体中,这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 , 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> populasi 22660 的 顺序 下降 （, 在 种 中 , 这 种 在 在植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (однако в обоих вариантах Apa yang Perlu Diperhatikan dan Dikontrol растений). Secara rata-rata, tingkat ekspresi gen menurun pada seri 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (namun, pada kedua varian, tren ini lebih kuat pada tanaman kontrol).Vaksinasi menghasilkan peningkatan ekspresi gen, terutama pada modul 18, 19, 14, 6 dan 1 (dalam urutan efek menurun), regulasi negatif (misalnya modul 9 dan 20) atau dengan efek netral (misalnya modul 11, 22, 8 dan 13). Analisis pengayaan istilah GO (Tabel Tambahan S13) mengungkapkan “GO: 0006952 Respons protektif” untuk modul yang diinokulasi (18) dengan aktivasi maksimum, termasuk gen yang dianalisis dengan qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 dan TanjilG_27015), serta banyak modul fotosintesis yang paling tertekan (9). Konsentrator modul 18 (Gambar 8) diidentifikasi sebagai gen TanjilG_26536 yang mengkode protein LlR18B mirip PR-10, dan konsentrator modul 9 diidentifikasi sebagai gen TanjilG_28955 yang mengkode protein PsbQ fotosistem II. Gen kandidat resistensi antraknosa Lanr1, TanjilG_05042, ditemukan di modul 22 (Gambar 9) dan terkait dengan istilah “GO:0044260 Proses metabolisme makromolekul seluler” dan “GO:0006355 Regulasi transkripsi, templat DNA” yang membawa hub TanjilG_01212. Gen tersebut mengkode faktor transkripsi stres panas A-4a (HSFA4a).
Analisis jaringan berbobot dari ko-ekspresi gen modul dengan istilah proses biologis yang berlebihan “GO: 0006952 Respons pertahanan”. Ligasi disederhanakan untuk menyoroti empat gen yang dianalisis dengan qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 dan TanjilG_27015).
Analisis jaringan berbobot dari ko-ekspresi gen suatu modul dengan istilah proses biologis yang terwakili secara berlebihan “GO: 0006355: Regulasi transkripsi, templat DNA” dan membawa gen kandidat resistensi antraknosa Lanr1 TanjilG_05042. Ligasi disederhanakan untuk mengisolasi gen TanjilG_05042 dan gen pusat TanjilG_01212.
Penyaringan ketahanan terhadap antraknosa yang dikumpulkan di Australia menunjukkan bahwa sebagian besar kultivar yang dirilis lebih awal rentan; Kalya, Coromup, dan Mandelup digambarkan sebagai kultivar yang cukup tahan, sedangkan Wonga, Tanjil, dan 83A:476 digambarkan sebagai kultivar yang sangat tahan26,27,31. memiliki alel ketahanan yang sama, yang diberi nama Lanr1, dan Coromup serta Mandelup memiliki alel yang berbeda, yang diberi nama AnMan10, 26, 39, sedangkan Kalya mewariskan alel yang berbeda, Lanr2. Penyaringan ketahanan terhadap antraknosa di Jerman menghasilkan identifikasi galur tahan Bo7212 dengan alel kandidat selain Lanr1, yang diberi nama LanrBo36.
Studi kami mengungkapkan frekuensi yang sangat rendah (sekitar 6%) dari alel Lanr1 dalam plasma nutfah yang diuji. Pengamatan ini konsisten dengan hasil penyaringan plasma nutfah Eropa Timur menggunakan penanda Anseq3 dan Anseq4, yang menunjukkan bahwa alel Lanr1 hanya terdapat pada dua galur Belarusia. Hal ini menunjukkan bahwa alel Lanr1 belum banyak digunakan oleh program pemuliaan lokal, tidak seperti di Australia, di mana alel ini merupakan salah satu alel kunci untuk pemuliaan berbantuan penanda. Hal ini mungkin disebabkan oleh tingkat resistensi yang lebih rendah yang diberikan oleh alel Lanr1 dalam kondisi lapangan Eropa dibandingkan dengan laporan Australia. Selain itu, studi tentang antraknosa di daerah dengan curah hujan tinggi di Australia telah menunjukkan bahwa respons resistensi yang dimediasi oleh alel Lanr1 mungkin tidak efektif dalam kondisi cuaca yang mendukung pertumbuhan dan perkembangan patogen yang cepat19,42. Bahkan, dalam penelitian ini, beberapa gejala antraknosa juga diamati pada genotipe yang membawa alel Lanr1, menunjukkan bahwa resistensi dapat menghilang dalam kondisi optimal untuk perkembangan C. lupini. Selain itu, interpretasi positif palsu dari keberadaan penanda Anseq3 dan Anseq4, yang berjarak sekitar 1 cM dari lokus Lanr1, dimungkinkan 28,30,43.
Studi kami menunjukkan bahwa 83A:476, yang membawa alel Lanr1, merespons inokulasi C. lupini dengan pemrograman ulang transkriptom skala besar pada titik waktu analisis pertama (6 jam pasca-infeksi), sedangkan pada Mandelup, yang membawa alel AnMan, respons transkriptomik diamati jauh kemudian (dari 24 hingga 48 jam pasca-infeksi). Variasi temporal dalam respons pertahanan ini terkait dengan perbedaan gejala penyakit, yang menyoroti pentingnya pengenalan patogen dini untuk keberhasilan respons terhadap resistensi. Untuk menginfeksi jaringan tanaman, spora antraks harus melalui beberapa tahap perkembangan pada permukaan inang, termasuk perkecambahan, pembelahan sel, dan pembentukan apresorium. Appendiks adalah struktur infektif yang menempel pada permukaan inang dan memfasilitasi penetrasi ke dalam jaringan inang. Dengan demikian, spora C. gloeosporioides dalam ekstrak kacang polong menunjukkan pembelahan nukleus pertama setelah inkubasi 75-90 menit, pembentukan tabung kecambah setelah 90-120 menit, dan penekanan setelah 4 jam 45. C. gloeosporioides mangga menunjukkan lebih dari 40% perkecambahan konidia setelah inkubasi 3 jam dan sekitar 20% pembentukan apresor setelah 4 jam. Gen CAP20 yang terkait dengan virulensi C. gloeosporioides menunjukkan aktivitas transkripsi pada konidia pembentuk epifit setelah inkubasi 3,5 jam dalam lilin permukaan alpukat dengan konsentrasi protein CAP20 yang tinggi setelah 4 jam 46 menit. Demikian pula, aktivitas gen biosintesis melanin pada C. trifolii diinduksi selama inkubasi 2 jam diikuti oleh pembentukan apresorium setelah 1 jam. Studi jaringan daun menunjukkan bahwa stroberi yang diinokulasi dengan C. acutatum memiliki penekanan pertama pada 8 hpi, sedangkan tomat yang diinokulasi dengan C. coccodes memiliki penekanan pertama pada 4 hpi48,49, yang sebagian besar konsisten dengan skala waktu proses infeksi Colletotrichum spp. Respons pertahanan cepat terhadap 83A:476 menunjukkan keterlibatan gen resistensi tanaman dan imunitas yang dipicu efektor (ETI) pada galur ini, sementara respons tertunda Mandelup mendukung hipotesis imunitas yang dipicu pola molekuler mikro-asosiasi (MTI) 50. Respons awal terhadap 83A:476 dan Mandelup. Tumpang tindih sebagian antara gen yang diatur naik atau turun dalam respons tertunda juga mendukung konsep ini, karena ETI sering dianggap sebagai respons MTI yang dipercepat dan ditingkatkan yang berpuncak pada kematian sel terprogram di tempat infeksi, yang dikenal sebagai syok anafilaksis 51,52.
Sebagian besar gen yang dikaitkan dengan istilah yang terlalu banyak diwakili dalam Gene Ontology GO:0006952 “Respons Pertahanan” adalah 11 homolog dari protein pesan puasa yang diinduksi stres 22 (mirip dengan SAM22) dan tujuh protein mirip lateks utama (MLP). Protein mirip 31, 34, 43, dan 423 menunjukkan kemiripan sekuens. Gen mirip SAM22 menunjukkan aktivasi signifikan yang berlangsung lebih lama, menunjukkan peningkatan tingkat resistensi antraknosa (83A:476 dan Boregine). Namun, gen mirip MLP hanya mengalami penurunan regulasi pada galur yang membawa alel resistensi kandidat (83A:476/Lanr1 pada 6 hpi dan Mandelup/AnMan pada 24 hpi). Perlu dicatat bahwa semua homolog mirip SAM22 yang diidentifikasi berasal dari gugus gen yang membentang sekitar 105 kb, sedangkan gen mirip MLP berasal dari wilayah genom yang terpisah. Aktivasi terkoordinasi dari gen-gen mirip SAM22 tersebut juga ditemukan dalam penelitian kami sebelumnya tentang resistensi NLL terhadap inokulasi Diaporthetoxica, yang menunjukkan bahwa gen-gen tersebut terlibat dalam komponen horizontal dari respons pertahanan. Kesimpulan ini juga didukung oleh laporan tentang respons positif gen-gen mirip SAM22 terhadap cedera atau pengobatan dengan asam salisilat, penginduksi jamur, atau hidrogen peroksida.
Gen MLP-like telah terbukti merespons berbagai stres abiotik dan biotik, termasuk infeksi bakteri, virus, dan jamur patogen pada banyak spesies tanaman55. Arah respons terhadap interaksi tertentu antara tanaman dan patogen berkisar dari peningkatan yang kuat (misalnya, selama infestasi kapas dengan Verticillium dahliae) hingga penurunan yang signifikan (misalnya, setelah infeksi pohon apel dengan Alternaria spp.)56,57. Penurunan regulasi gen MLP-like 423 yang signifikan telah diamati selama pertahanan alpukat terhadap infeksi F. niger dan selama infeksi pohon apel Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola dan Alternaria alternata adalah patotipe apel58,59. Selain itu, kalus apel yang mengekspresikan gen MLP-like 423 secara berlebihan memiliki ekspresi gen terkait resistensi yang lebih rendah dan lebih rentan terhadap infeksi jamur59. Setelah Fusarium oxysporum f. cn., gen MLP-like 423 juga ditekan pada plasma nutfah kacang buncis yang resisten. Infeksi kacang 60.
Anggota lain dari famili PR-10 yang diidentifikasi dalam studi RNA-seq kami adalah gen LlR18A dan LlR18B sebagai respons terhadap peningkatan ekspresi, serta gen yang mengalami peningkatan ekspresi (1 gen) atau penurunan ekspresi (3 gen) untuk protein transfer lipid DIR1. Selain itu, WGCNA menyoroti gen LlR18B sebagai pusat dalam modul ini, yang sangat rentan terhadap vaksinasi dan membawa beberapa gen respons protektif. Gen LlR18A dan LlR18B diinduksi pada daun lupin kuning sebagai respons terhadap bakteri patogen, serta pada batang NLL setelah inokulasi D. toxica, sementara homolog padi dari gen ini, RSOsPR10, dengan cepat diinduksi oleh infeksi jamur yang diduga terlibat dalam jalur pensinyalan asam jasmonat53,61, 62. Gen DIR1 mengkode protein transpor lipid nonspesifik yang diperlukan untuk timbulnya resistensi yang didapat secara sistemik (SAR). Dengan perkembangan reaksi perlindungan, protein DIR1 diangkut dari fokus infeksi melalui floem untuk menginduksi SAR di organ yang jauh. Menariknya, gen DIR1 TanjilG_02313 secara signifikan terinduksi pada titik waktu pertama pada galur 84A:476 dan Populasi 22660, tetapi resistensi antraknosa hanya berhasil dikembangkan pada galur 84A:476. Hal ini mungkin menunjukkan beberapa subfungsionalisasi gen DIR1 di NLL, karena tiga homolog lainnya hanya merespons inokulasi pada galur 83A:476 pada 6 jam pasca-infeksi, dan respons ini diarahkan ke bawah.
Dalam penelitian kami, komponen yang paling umum terkait dengan proses biologis yang disebut “GO:0055114 Proses Redoks” adalah protein sitokrom P450, peroksidase, linoleat asam 9S-/13S-lipoksigenase, dan 1-aminosiklopropana-1-asam karboksilat oksidase. Selain itu, WGCNA kami mendefinisikan homolog HSFA4a sebagai hub yang membawa modul seperti kandidat gen resistensi Lanr1 TanjilG_05042. HSFA4a adalah komponen dari regulasi transkripsi nuklir yang bergantung pada redoks pada tumbuhan.
Protein sitokrom P450 adalah oksidoreduktase yang mengkatalisis reaksi hidroksilasi yang bergantung pada NADPH dan/atau O2 dalam metabolisme primer dan sekunder, termasuk metabolisme xenobiotik, serta hormon, asam lemak, sterol, komponen dinding sel, biopolimer, dan biosintesis senyawa pelindung 69. Dalam penelitian kami, variabilitas fungsi sitokrom P450 pada tumbuhan berkurang dari -10,6 log2 (perubahan lipat) menjadi 5,7 karena banyaknya homolog yang berubah (37) dan perbedaan pola respons antara gen spesifik, yang mencerminkan revisi ke atas. Menggunakan hanya data RNA-seq untuk menjelaskan fungsi biologis gen NLL dalam superfamili protein yang besar tersebut akan sangat spekulatif. Namun, perlu dicatat bahwa beberapa gen sitokrom P450 dikaitkan dengan peningkatan resistensi terhadap jamur atau bakteri patogen, termasuk kontribusi terhadap reaksi alergi69,70,71.
Peroksidase kelas III adalah enzim tanaman multifungsi yang terlibat dalam berbagai proses metabolisme selama pertumbuhan dan perkembangan tanaman, serta dalam menanggapi tekanan lingkungan seperti salinitas, kekeringan, intensitas cahaya tinggi, dan serangan patogen72. Peroksidase terlibat dalam interaksi beberapa spesies tanaman dengan Anthracis, termasuk Stylosanthes humilis dan C. gloeosporioides, Lens culinaris dan C. truncatum, Phaseolus vulgaris dan C. lindemuthianum, Cucumis sativus dan C. lagenarium73,74,75,76. Responsnya sangat cepat, terkadang bahkan pada 4 HPI, sebelum jamur menembus jaringan tanaman73. Gen peroksidase juga merespons inokulasi D. toxica NLL. Selain fungsi khasnya untuk mengatur ledakan oksidatif atau menghilangkan stres oksidatif, peroksidase dapat mengganggu pertumbuhan patogen dengan menciptakan penghalang fisik berdasarkan penguatan dinding sel selama lignifikasi, subunit atau ikatan silang senyawa spesifik. Fungsi ini dapat dikaitkan secara in silico dengan gen TanjilG_03329 yang mengkodekan anion peroksidase pembentuk lignin yang diduga mengalami peningkatan ekspresi secara signifikan dalam penelitian kami pada galur resisten 83A:476 pada 6 HPI, tetapi tidak pada galur dan titik waktu lain yang tidak memberikan respons.
9S-/13S-lipoxygenase asam linoleat merupakan langkah pertama dalam jalur oksidatif biosintesis lipid78. Produk dari jalur ini memiliki banyak fungsi dalam pertahanan tanaman, termasuk penguatan dinding sel melalui pembentukan endapan kalosa dan pektin, dan pengaturan stres oksidatif melalui produksi spesies oksigen reaktif79,80,81,82,83. Dalam penelitian ini, ekspresi 9S-/13S-lipoxygenase asam linoleat berubah pada semua strain, tetapi pada populasi rentan 22660, peningkatan ekspresi lebih dominan pada berbagai titik waktu, sedangkan pada strain yang membawa alel resisten Lanr1 dan AnMan, hal ini menekankan diversifikasi lapisan oksilipin dalam reaksi perlindungan terhadap antraks di antara genotipe-genotipe ini.
Homolog 1-aminosiklopropana-1-karboksilat oksidase (ACO) secara signifikan mengalami peningkatan (9 gen) atau penurunan (2 gen) ketika diinokulasi dengan lupin. Dengan dua pengecualian, semua respons ini terjadi pada 6 hp. pada 83A:476. Reaksi enzimatik yang dimediasi oleh protein ACO merupakan langkah pembatas laju dalam produksi etilen dan oleh karena itu sangat diatur84. Etilen adalah hormon tumbuhan yang memainkan berbagai peran dalam mengatur perkembangan tanaman dan respons terhadap kondisi stres abiotik dan biotik. Induksi transkripsi ACO dan aktivasi jalur pensinyalan etilen terlibat dalam meningkatkan ketahanan padi terhadap jamur hemibiotrofik oryzae oryzae dengan mengatur produksi spesies oksigen reaktif dan fitoaleksin. Proses infeksi daun yang sangat mirip ditemukan antara M. oryzae dan C. lupini88,89, dengan latar belakang peningkatan signifikan homolog ACO pada galur 83A:476 yang dilaporkan dalam penelitian ini, menggeser kemungkinan pemberian resistensi terhadap antraknosa NLL. Etilen merupakan langkah sentral dalam jalur molekuler.
Dalam penelitian ini, penekanan skala besar pada banyak gen yang terkait dengan fotosintesis diamati pada 6 jam pasca infeksi (hpi) pada 83A:476 dan pada 48 hpi pada Mandeloop dan populasi 22660. Tingkat dan perkembangan perubahan ini sebanding dengan levelnya. Resistensi antraknosa diamati dalam percobaan ini. Baru-baru ini, penekanan kuat dan dini pada transkrip yang terkait dengan fotosintesis telah dilaporkan dalam beberapa model interaksi tanaman-patogen, termasuk bakteri dan jamur patogen. Kecepatan (dari 2 hpi dalam beberapa interaksi) dan penekanan global gen yang terkait dengan fotosintesis sebagai respons terhadap infeksi dapat memicu imunitas tanaman berdasarkan pelepasan spesies oksigen reaktif dan interaksinya dengan jalur asam salisilat untuk memediasi reaksi alergi 90,94.
Kesimpulannya, mekanisme respons pertahanan yang diusulkan untuk garis keturunan yang paling resisten (83A:476) meliputi pengenalan patogen yang cepat oleh gen R (kemungkinan TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) dan pensinyalan asam salisilat dan etilen yang dimediasi respons alergi, diikuti oleh pembentukan aksi SAR jarak jauh yang didukung oleh protein DIR-1. Perlu dicatat bahwa periode biotrofik untuk infeksi C. lupini sangat singkat (sekitar 2 hari), diikuti oleh pertumbuhan nekrotik95. Transisi antara tahapan ini mungkin terkait dengan nekrosis dan ekspresi protein yang diinduksi etilen yang bertindak sebagai pemicu reaksi hipersensitivitas pada tanaman inang. Oleh karena itu, jendela waktu untuk keberhasilan penangkapan C. lupini pada tahap biotrofik sangat sempit. Pemrograman ulang gen yang terkait dengan redoks dan fotosintesis yang diamati pada 83A:476 pada 6 jam pasca infeksi konsisten dengan perkembangan hifa jamur dan menandai perkembangan respons perlindungan yang berhasil pada tahap biotrofik. Respons transkriptomik Mandelup dan populasi 22660 mungkin terlalu lambat untuk menangkap jamur sebelum beralih ke pertumbuhan nekrotik, namun, Mandelup mungkin lebih efektif daripada populasi 22660 karena regulasi protein PR-10 yang relatif cepat mendorong resistensi horizontal.
ETI, yang didorong oleh gen R kanonik, tampaknya merupakan mekanisme umum untuk ketahanan kacang terhadap antraknosa. Dengan demikian, pada tanaman legum model Medicago truncatula, ketahanan terhadap antraknosa diberikan oleh gen RCT1, anggota dari kelas gen R tanaman TIR-NBS-LRR97. Gen ini juga memberikan ketahanan antraknosa spektrum luas pada alfalfa ketika ditransfer ke tanaman yang rentan. Pada kacang buncis (P. vulgaris), lebih dari dua lusin gen ketahanan antraknosa telah diidentifikasi hingga saat ini. Beberapa gen ini ditemukan di daerah yang tidak memiliki gen R kanonik, namun banyak gen lainnya terletak di tepi kromosom yang membawa gugus gen NBS-LRR, termasuk TIR-NBS-LRRs99. Studi SSR di seluruh genom juga mengkonfirmasi hubungan gen NBS-LRR dengan ketahanan antraknosa pada kacang buncis. Gen R kanonik juga ditemukan di wilayah genom yang membawa lokus resistensi antraknosa utama pada lupin putih 101.
Penelitian kami menunjukkan bahwa reaksi resistensi langsung, yang diaktifkan pada tahap awal infeksi tanaman (sebaiknya tidak lebih dari 12 jam setelah infeksi), secara efektif melindungi lupin berdaun sempit dari antraknosa yang disebabkan oleh jamur patogen Collelotrichum lupini. Dengan menggunakan sekuensing berkecepatan tinggi, kami mendemonstrasikan profil ekspresi diferensial gen resistensi antraknosa pada tanaman NLL yang dimediasi oleh gen resistensi Lanr1 dan AnMan. Pertahanan yang berhasil melibatkan perancangan gen yang cermat untuk protein yang terlibat dalam redoks, fotosintesis, dan patogenesis dalam beberapa jam setelah kontak pertama tanaman dengan patogen. Reaksi perlindungan serupa, tetapi tertunda, jauh kurang efektif dalam melindungi tanaman dari penyakit. Resistensi antraks yang dimediasi oleh gen Lanr1 menyerupai respons cepat khas gen R (imunitas yang dipicu oleh efektor), sementara gen AnMan kemungkinan besar memberikan respons horizontal (imunitas yang dipicu oleh pola molekuler terkait mikroba), memberikan tingkat keberlanjutan yang moderat.
Sebanyak 215 galur NLL yang digunakan untuk penyaringan penanda antraknosa terdiri dari 74 kultivar, 60 galur yang diperoleh melalui persilangan atau pemuliaan, 5 mutan, dan 76 plasma nutfah liar atau asli. Galur-galur tersebut berasal dari 17 negara, terutama dari Polandia (58), Spanyol (47), Jerman (27), Australia (26), Rusia (19), Belarus (7), Italia (5) dan galur lainnya dari 10 negara. Set ini juga mencakup galur resisten referensi: 83A:476, Tanjil, Wonga yang membawa alel Lanr1, dan Mandelup yang membawa alel AnMan. Galur-galur tersebut diperoleh dari Basis Data Sumber Daya Genetik Lupine Eropa yang dikelola oleh Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polandia (Tabel Tambahan S1).
Tanaman ditanam dalam kondisi terkontrol (fotoperiode 16 jam, suhu 25°C pada siang hari dan 18°C ​​pada malam hari). Dua replikasi biologis dianalisis. DNA diisolasi dari daun berumur tiga minggu menggunakan DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Jerman) sesuai protokol. Kualitas dan konsentrasi DNA yang diisolasi dinilai dengan metode spektrofotometri (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Penanda AnManM1 yang menandai gen resistensi antraknosa AnMan (berasal dari kultivar Mandelup) dan penanda Anseq3 dan Anseq4 yang mengapit gen Lanr1 (berasal dari kultivar Tanjil) dianalisis 11,26,28. Homozigot untuk alel resisten diberi skor “1”, rentan – “0”, dan heterozigot – 0,5.
Berdasarkan hasil penyaringan penanda AnManM1, AnSeq3, dan AnSeq4 serta ketersediaan benih untuk percobaan tindak lanjut akhir, 50 galur NLL dipilih untuk fenotipe ketahanan antraknosa. Analisis dilakukan secara duplikat di rumah kaca yang dikendalikan komputer dengan fotoperiod 14 jam dengan kisaran suhu 22°C pada siang hari dan 19°C pada malam hari. Benih digores (memotong kulit biji di sisi berlawanan dari embrio dengan pisau tajam) sebelum disemai untuk mencegah dormansi benih karena kulit biji terlalu keras dan untuk memastikan perkecambahan yang seragam. Tanaman ditanam dalam pot (11 × 11 × 21 cm) dengan tanah steril (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warsawa, Polandia). Inokulasi dilakukan dengan strain Colletotrichum lupini Col-08, yang dikultur pada tahun 1999 dari batang tanaman lupin berdaun sempit yang tumbuh di lahan di Verzhenitsa, Polandia Raya (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Isolat dikultur dalam media SNA pada suhu 20°C di bawah lampu hitam selama 21 hari untuk menginduksi sporulasi. Empat minggu setelah penyemaian, ketika tanaman telah mencapai tahap 4-6 daun, inokulasi dilakukan dengan penyemprotan suspensi konidia pada konsentrasi 0,5 x 10⁶ konidia per ml. Setelah inokulasi, tanaman disimpan dalam gelap selama 24 jam pada kelembaban sekitar 98% dan suhu 25°C untuk memfasilitasi perkecambahan konidia dan proses infeksi. Tanaman kemudian ditanam di bawah fotoperiod 14 jam pada suhu 22°C siang/19°C malam dan kelembapan 70%. Skor penyakit dibuat 22 hari setelah inokulasi dan berkisar dari 0 (imun) hingga 9 (sangat rentan) tergantung pada ada atau tidaknya lesi nekrotik pada batang dan daun. Selain itu, setelah pemberian skor, berat tanaman diukur. Hubungan antara genotipe penanda dan fenotipe penyakit dihitung sebagai korelasi titik dua-urutan (tidak adanya penanda heterozigot dalam rangkaian garis untuk analisis fenotipe ketahanan antraknosa).