Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau nonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) adalah tanaman polong-polongan yang digunakan untuk produksi pangan dan perbaikan tanah. Perluasan global NLL sebagai tanaman pangan telah menarik banyak jamur patogen, termasuk lupine anthracnose, yang menyebabkan penyakit antraknosa yang mematikan. Dua alel, Lanr1 dan AnMan, yang memberikan peningkatan resistensi, telah digunakan dalam pemuliaan NLL, tetapi mekanisme molekuler yang mendasarinya masih belum diketahui. Dalam penelitian ini, penanda Lanr1 dan AnMan digunakan untuk menyaring sampel NLL Eropa. Pengujian vaksin dalam lingkungan yang terkendali mengonfirmasi kemanjuran kedua donor yang resistan. Profil ekspresi gen diferensial dilakukan pada galur yang resistan dan rentan yang representatif. Resistensi antraknosa dikaitkan dengan ekspresi berlebih dari istilah ontologi gen “GO:0006952 Respon Pertahanan”, “GO:0055114 Proses Redoks”, dan “GO:0015979 Fotosintesis”. Selain itu, galur Lanr1(83A:476) menunjukkan pemrograman ulang transkriptom yang signifikan dengan cepat setelah inokulasi, sementara galur lainnya menunjukkan penundaan respons ini sekitar 42 jam. Respons pertahanan dikaitkan dengan gen TIR-NBS, CC-NBS-LRR dan NBS-LRR, 10 protein yang terlibat dalam patogenesis, protein transfer lipid, endoglukan-1,3-β-glukosidase, protein dinding sel yang kaya glisin, dan gen dari jalur oksigen reaktif. Respons awal terhadap 83A:476, termasuk penekanan gen yang terkait dengan fotosintesis secara hati-hati, bertepatan dengan perlindungan yang berhasil selama fase pertumbuhan vegetatif biologi jamur, yang menunjukkan bahwa efektor memicu kekebalan. Reaksi Mandeloop diperlambat, seperti halnya hambatan horizontal secara keseluruhan.
Lupin berdaun sempit (NLL, Lupinus angustifolius L.) adalah serealia berprotein tinggi yang berasal dari wilayah Mediterania barat1,2. Saat ini, tanaman ini ditanam sebagai tanaman pangan untuk hewan dan manusia. Tanaman ini juga dianggap sebagai pupuk hijau dalam sistem rotasi tanaman karena fiksasi nitrogen oleh bakteri pengikat nitrogen simbiotik dan perbaikan keseluruhan struktur tanah. NLL telah mengalami proses domestikasi yang cepat dalam satu abad terakhir dan masih berada di bawah tekanan pengembangbiakan yang tinggi3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Dengan meluasnya budidaya NLL, suksesi jamur patogen mengembangkan ceruk pertanian baru dan menyebabkan penyakit perusak tanaman baru. Yang paling luar biasa bagi petani dan pemulia lupin adalah munculnya penyakit antraknosa, yang disebabkan oleh jamur patogen, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Yang paling luar biasa bagi petani dan pemulia lupin adalah munculnya penyakit antraknosa, yang disebabkan oleh jamur patogen, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Layanan Penting dan Layanan yang Dapat Diperoleh патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Yang paling menonjol bagi petani dan pemulia lupin adalah munculnya penyakit antraknosa yang disebabkan oleh jamur patogen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的。Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Berambut。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Yang paling mengejutkan bagi petani dan pemulia lupin adalah munculnya penyakit antraknosa yang disebabkan oleh jamur patogen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Laporan awal penyakit ini berasal dari Brasil dan Amerika Serikat, dengan gejala khas yang muncul masing-masing pada tahun 1912 dan 1929. Namun, setelah sekitar 30 tahun, patogen tersebut diberi nama Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf dari Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.,有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.,有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld dalam Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld dalam Morfologi yang Ditargetkan. dan H. Schrenk,. dan H. Schrenk, .dan H. Schrenk. & H.施伦克,。 & H.施伦克,。dan H. Schlenk, .Fenotipe penyakit awal yang dilakukan pada pertengahan abad ke-20 menunjukkan beberapa resistensi pada aksesi NLL dan lupin kuning (L. luteus L.), tetapi semua aksesi lupin putih (L. albus L.) yang diuji sangat rentan15,16. Penelitian telah menunjukkan bahwa perkembangan antraknosa dikaitkan dengan peningkatan presipitasi (kelembapan udara) dan suhu (dalam kisaran 12-28 ° C), yang mengarah pada pelanggaran resistensi pada suhu yang lebih tinggi17, 18. Faktanya, waktu yang dibutuhkan konidia untuk berkecambah dan penyakit untuk dimulai, empat kali lebih pendek pada 24 ° C (4 jam) daripada pada 12 ° C (16 jam) dalam kondisi kelembaban tinggi19. Dengan demikian, pemanasan global yang sedang berlangsung telah menyebabkan penyebaran antraknosa. Namun, penyakit ini diamati di Prancis (1982) dan Ukraina (1983) sebagai pertanda ancaman yang akan datang, tetapi tampaknya diabaikan oleh industri lupin pada saat itu20,21. Beberapa tahun kemudian, penyakit yang menghancurkan ini menyebar ke seluruh dunia dan juga mempengaruhi negara-negara penghasil lupin utama seperti Australia, Polandia dan Jerman22,23,24. Menyusul wabah antraknosa pada pertengahan 1990-an, skrining ekstensif menghasilkan identifikasi beberapa donor yang resistan dalam sampel NLL19. Resistensi NLL terhadap antraknosa dikendalikan oleh dua alel dominan terpisah yang ditemukan dalam sumber plasma nutfah yang berbeda: Lanr1 dalam kultivar Tanjil dan Wonga dan AnMan dalam kultivar. Mandalay 25, 26. Alel-alel ini melengkapi penanda molekuler yang mendukung pemilihan plasma nutfah yang resistan dalam program pemuliaan25,26,27,28,29,30. Galur pemuliaan resistan 83A:476 yang membawa alel Lanr1 disilangkan dengan galur liar rentan P27255 untuk memperoleh populasi RIL yang memisahkan diri untuk ketahanan terhadap antraknosa, yang memungkinkan untuk menetapkan lokus Lanr1 ke kromosom NLL-1131, 32, 33. Penyelarasan penanda peta keterkaitan dari lokus ketahanan terhadap antraknosa dengan kerangka genomik, NLL mengungkapkan lokasi ketiga alel pada kromosom yang sama (NLL-11), tetapi pada posisi yang berbeda29,34,35. Namun, karena jumlah RIL yang kecil dan jarak genetik yang besar antara penanda dan alel yang sesuai, tidak ada kesimpulan yang dapat diandalkan yang dapat ditarik tentang gen yang mendasarinya. Di sisi lain, penggunaan genetika terbalik pada lupin sulit dilakukan karena potensi regenerasinya yang sangat rendah, yang membuat manipulasi genetik menjadi rumit37.
Perkembangan plasma nutfah yang dijinakkan yang membawa alel yang diinginkan dalam keadaan homozigot, seperti 83A:476 (Lanr1) dan Mandelup (AnMan), telah membuka pintu untuk mempelajari ketahanan terhadap antraknosa dalam menghadapi keberadaan kombinasi alel yang berlawanan dalam populasi liar. Kemungkinan mekanisme molekuler. Bandingkan respons pertahanan yang dihasilkan oleh genotipe tertentu. Studi ini mengevaluasi respons transkriptom awal NLL terhadap vaksinasi C. lupini. Pertama, panel plasma nutfah NLL Eropa yang berisi 215 galur disaring menggunakan penanda molekuler yang menandai alel Lanr1 dan AnMan. Fenotipe antraknosa kemudian dilakukan pada 50 galur NLL, yang sebelumnya dipilih untuk penanda molekuler, dalam kondisi terkendali. Berdasarkan percobaan ini, empat galur yang berbeda dalam ketahanan terhadap antraknosa dan komposisi alel Lanr1/AnMan dipilih untuk profil ekspresi gen pertahanan diferensial menggunakan dua pendekatan komplementer: sekuensing RNA throughput tinggi dan kuantifikasi PCR waktu nyata.
Penyaringan sekumpulan plasma nutfah NLL (N = 215) dengan penanda Lanr1 (Anseq3 dan Anseq4) dan AnMan (Anseq4) dan AnMan (AnManM1) menunjukkan bahwa hanya satu galur (95726, dekat Salamanca-b) yang mengamplifikasi alel “resistensi” untuk semua penanda, sementara “Keberadaan alel 'rentan'” menemukan proporsi semua penanda dalam 158 (~73,5%) galur. Tiga belas galur menghasilkan dua alel “resistensi” penanda Lanr1, dan 8 galur menghasilkan alel “resistensi” penanda Lanr1. Alel “resistensi” penanda AnMan (Tabel Tambahan S1). Dua galur bersifat heterozigot untuk penanda Anseq3 dan satu heterozigot untuk penanda AnManM1. 42 galur (19,5%) membawa fase berlawanan dari alel Anseq3 dan Anseq4, yang menunjukkan frekuensi rekombinasi yang tinggi antara kedua lokus ini. Fenotipe antraknosa dalam kondisi terkendali (Tabel Tambahan S2) menunjukkan variabilitas dalam ketahanan genotipe yang diuji, yang tercermin dalam tingkat keparahan antraknosa. Perbedaan skor rata-rata berkisar antara 1,8 (cukup tahan) hingga 6,9 (rentan) dan perbedaan berat tanaman berkisar antara 0,62 (rentan) hingga 4,45 g (tahan). Terdapat korelasi signifikan antara nilai yang diamati dalam dua replikasi percobaan (0,51 untuk skor keparahan penyakit, P = 0,00017 dan 0,61 untuk berat tanaman, P < 0,0001) serta antara kedua parameter ini (− 0,59 dan − 0,77, P < 0,0001). Terdapat korelasi yang signifikan antara nilai yang diamati pada dua replikasi percobaan (0,51 untuk skor keparahan penyakit, P = 0,00017 dan 0,61 untuk berat tanaman, P < 0,0001) serta antara kedua parameter ini (- 0,59 dan - 0,77, P < 0,0001). Perusahaan yang Menguntungkan Anda, yang Menguntungkan dan Merugikan Anda эксперимента (0,51 hari, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Korelasi yang signifikan ditemukan antara nilai yang diamati pada dua kali pengulangan percobaan (0,51 untuk skor keparahan penyakit, P = 0,00017 dan 0,61 untuk berat tanaman, P < 0,0001), serta antara kedua parameter ini (- 0,59 dan -0,77, P < 0,0001 (0,0001).0,51,P = .在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为分为 0,51 , p = 0,00017 , 植物 为 为 0,61 , p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0,59 和– 0,59和– 0,59 inci – 0,59 inci - 0,77,P < 0,0001)。 Pentingnya Mengelola Bisnis yang Dapat Dilakukan di Rumah Anda (nilai rata-rata 0,51, P = 0,00017 dan масса растения 0,61, P <0,0001), dan между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001. Terdapat korelasi yang signifikan antara nilai yang diamati secara duplo (skor keparahan penyakit 0,51, P=0,00017 dan berat tanaman 0,61, P<0,0001) dan antara kedua parameter tersebut (-0,59 dan -0,0001) 0,77, P<0,0001. ).Gejala khas yang terlihat pada tanaman yang rentan meliputi batang yang tertekuk dan terpelintir menyerupai struktur "busur gembala", diikuti oleh lesi oval dengan sporozoit oranye/merah muda (Gambar Tambahan 1). Aksesi Australia yang membawa gen Lanr1 (83A:476 dan Tanjil) dan AnMan (Mandelup) cukup tahan, 0,0331 dan 0,0036). Beberapa galur yang juga membawa alel Lanr1 dan/atau AnMan yang "tahan" menunjukkan gejala penyakit.
Menariknya, beberapa galur NLL yang tidak memiliki alel penanda "resisten" apa pun menunjukkan tingkat resistensi antraknosa yang tinggi (sebanding atau lebih tinggi dibandingkan genotipe Lanr1 atau AnMan), seperti Boregine (nilai P < 0,0001 untuk kedua parameter), Bojar (nilai P < 0,0001 untuk skor dan 0,001 untuk berat tanaman) dan Populasi B-549/79b (nilai P < 0,0001 untuk skor dan tidak signifikan untuk berat). Menariknya, beberapa galur NLL yang tidak memiliki alel penanda "resisten" apa pun menunjukkan tingkat resistensi antraknosa yang tinggi (sebanding atau lebih tinggi dibandingkan genotipe Lanr1 atau AnMan), seperti Boregine (nilai P < 0,0001 untuk kedua parameter), Bojar (nilai P < 0,0001 untuk skor dan 0,001 untuk berat tanaman) dan Populasi B-549/79b (nilai P < 0,0001 untuk skor dan tidak signifikan untuk berat). Selain itu, ini adalah NLL yang tidak dapat dijelaskan, yang mana adalah "резистентного" sebagai pengganti yang lebih baik, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый atau более высокий, чем для генотипов Lanr1 atau AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки dan 0,001 массы растения) dan популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и tidak ada gunanya). Menariknya, beberapa garis NLL yang kekurangan alel penanda 'resisten' menunjukkan tingkat resistensi yang tinggi terhadap antraknosa (sebanding dengan atau lebih tinggi daripada genotipe Lanr1 atau AnMan), seperti Boregine (nilai P < 0,0001 untuk kedua parameter), Bojar (nilai P < 0,0001 untuk evaluasi dan 0,001 untuk berat tanaman) dan populasi B-549/79b (nilai P < 0,0001 untuk evaluasi dan tidak signifikan untuk berat).有趣的是,一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与 Lanr1或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001,植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）。 Yang menarik adalah beberapa sistem NLL yang tidak memiliki penanda “antigenik” menunjukkan resistensi horizontal yang tinggi (setara dengan gen Lanr1 atau AnMan atau lebih tinggi), seperti Boregine (kedua parameter P < 0,0001), Bojar (nilai P < 0,0001, berat tanaman 0,001) dan strain B-549/79b (nilai P < 0,0001, berat tidak signifikan). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые atau выше, чем у генотипов Lanr1 atau AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) dan B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Menariknya, beberapa garis NLL yang kekurangan alel penanda 'resistensi' menunjukkan tingkat resistensi antraknosa yang tinggi (sebanding dengan atau lebih tinggi daripada genotipe Lanr1 atau AnMan), seperti Boregine (nilai P untuk kedua parameter <0,0001), Bojar (nilai P <0,0001, berat tanaman 0,001) dan populasi B-549/79b (nilai P <0,0001, berat tidak signifikan).Fenomena ini menunjukkan kemungkinan adanya sumber genetik resistensi yang baru, yang menjelaskan kurangnya korelasi yang diamati antara genotipe penanda dan fenotipe penyakit (nilai P dari ~0,42 hingga ~0,98). Dengan demikian, uji Kolmogorov-Smirnov menunjukkan bahwa data tentang resistensi antraknosa terdistribusi secara normal untuk skor (nilai P 0,25 dan 0,11) dan massa tanaman (nilai P 0,47 dan 0,55), yang menunjukkan bahwa saya berhipotesis bahwa lebih banyak alel daripada Lanr1 dan AnMan yang terlibat.
Berdasarkan hasil skrining ketahanan antraknosa, dipilih 4 galur untuk analisis transkriptom: 83A:476, Boregine, Mandelup, dan Population 22660. Galur-galur tersebut diuji ulang ketahanannya terhadap antraks dalam percobaan inokulasi dengan RNA sequencing, dengan syarat sama dengan pengujian sebelumnya. Nilai skornya adalah sebagai berikut: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) dan Population 22660 (6,11 ± 1,29).
Protokol Illumina NovaSeq 6000 mencapai rata-rata 40,5 pasangan Mread per sampel (29,7 hingga 54,4 Mread) (Tabel Tambahan S3). Skor penyelarasan dalam urutan referensi berkisar antara 75,5% hingga 88,6%. Korelasi rata-rata data jumlah pembacaan antara varian eksperimen antara replikasi biologis berkisar antara 0,812 hingga 0,997 (rata-rata 0,959). Dari 35.170 gen yang dianalisis, 2917 tidak menunjukkan ekspresi, dan 4785 gen lainnya diekspresikan pada tingkat yang dapat diabaikan (rata-rata dasar < 5). Dari 35.170 gen yang dianalisis, 2917 tidak menunjukkan ekspresi, dan 4785 gen lainnya diekspresikan pada tingkat yang dapat diabaikan (rata-rata dasar < 5). Pada 35 170 bulan yang lalu 2917 tidak ada laporan, dan 4785 bulan lalu kesalahan yang tidak perlu (базовое среднее <5). Dari 35.170 gen yang dianalisis, 2917 tidak menunjukkan ekspresi, dan 4785 gen sisanya diekspresikan pada tingkat yang dapat diabaikan (rata-rata dasar <5).在分析的35,170 orang,2917 orang, 4785 orang个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35.170 orang Pada 35 170 bulan yang lalu 2917 bukan tahun yang lalu, dan tahun 4785 tahun yang lalu незначительную экспрессию (базовое среднее catatan <5). Dari 35.170 gen yang dianalisis, 2917 tidak diekspresikan dan 4785 gen sisanya memiliki ekspresi yang dapat diabaikan (rata-rata dasar <5).Dengan demikian, jumlah gen yang dianggap diekspresikan (rata-rata dasar ≥ 5) selama percobaan adalah 27.468 (78,1%) (Tabel Tambahan S4).
Dari titik waktu pertama, semua galur NLL merespons inokulasi C. lupini (galur Col-08) dengan memprogram ulang transkriptom (Tabel 1), namun, perbedaan signifikan diamati antara galur-galur tersebut. Dengan demikian, galur resistensi 83A:476 (yang membawa gen Lanr1) menunjukkan pemrograman ulang transkriptom yang signifikan pada titik waktu pertama (6 jam pasca infeksi) dengan peningkatan 31-69 kali lipat dalam jumlah gen naik dan turun yang diisolasi dibandingkan dengan titik waktu lain pada titik waktu ini. Selain itu, puncak ini berumur pendek, karena ekspresi hanya beberapa gen yang tetap berubah secara signifikan pada titik waktu kedua (12 jam pasca infeksi). Menariknya, Boregine, yang juga menunjukkan tingkat resistensi yang tinggi dalam uji cangkokan, tidak mengalami pemrograman ulang transkripsi yang masif selama percobaan. Namun, jumlah gen yang diekspresikan secara diferensial (DEG) adalah sama untuk Boregine dan 83A:476 pada 12 jam pasca infeksi. Baik Mandelup maupun populasi 22660 menunjukkan puncak DEG pada titik waktu terakhir (48 l/s), yang mengindikasikan penundaan relatif dalam respons pertahanan.
Karena 83A:476 mengalami pemrograman ulang transkriptom besar-besaran sebagai respons terhadap C. lupini pada 6 HPI dibandingkan dengan semua galur lainnya, ~91% DEG yang diamati pada titik waktu ini bersifat spesifik galur (Gbr. 1). Namun, ada beberapa tumpang tindih dalam respons awal antara galur studi, karena 68,5%, 50,9%, dan 52,6% DEG di Boregine, Mandelup, dan populasi 22660, masing-masing, tumpang tindih dengan yang ditemukan di 83A:476 pada titik waktu tertentu. Namun, DEG ini hanya mencakup sebagian kecil (0,97–1,70%) dari semua DEG yang saat ini terdeteksi menggunakan 83A:476. Selain itu, 11 DEG dari semua lini koheren saat ini (Tabel Tambahan S4-S6), termasuk komponen umum respons pertahanan tanaman: protein transfer lipid (TanjilG_32225), enzim endoglukan-1,3-β-glukosa (TanjilG_23384), dua protein yang dapat diinduksi stres seperti SAM22 (TanjilG_31528 dan TanjilG_31531), protein lateks dasar (TanjilG_32352), dan dua protein dinding sel struktural kaya glisin (TanjilG_19701 dan TanjilG_19702). Ada juga tumpang tindih yang relatif tinggi dalam respons transkriptom antara 83A:476 dan Boregine pada 24 HPI (total 16-38% DEG) dan antara Mandelup dan Populasi 22660 pada 48 HPI (total 14-20% DEG).
Diagram Venn yang menunjukkan jumlah gen yang diekspresikan secara berbeda (DEG) pada galur lupin berdaun sempit (NLL) yang diinokulasi dengan Colletotrichum lupini (galur Col-08 yang diperoleh dari ladang lupin di Wierzhenice, Polandia, 1999). Galur NLL yang dianalisis adalah: 83A:476 (tahan, membawa alel Lanr1), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui), Mandelup (cukup tahan, membawa alel AnMan) dan populasi 22660 (sangat rentan). Singkatan hpi adalah singkatan dari jam setelah vaksinasi. Nilai nol telah dihilangkan untuk menyederhanakan grafik.
Kumpulan gen yang diekspresikan berlebihan pada 6 jam pasca infeksi dianalisis untuk mengetahui keberadaan domain gen R kanonik (Tabel Tambahan S7). Studi ini mengungkap induksi transkriptom gen resistensi penyakit klasik dengan domain NBS-LRR hanya pada 83A:476. Kumpulan ini terdiri dari satu gen TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), lima gen CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, dan tanjilg_16162), dan empat NBS-LR, Tanjilg_16162), dan empat NBS-LRRE (tanjilg_16162) serta empat NBS-Lrr (tanjilg_16162) dan empat NBS-LRR (TANJILG_16162). Semua gen ini memiliki domain kanonik yang tersusun dalam urutan yang dilestarikan. Selain gen domain NBS-LRR, beberapa kinase RLL diaktifkan pada 6 jam pasca infeksi, yaitu satu di Boregine (TanjilG_19877), dua di Mandelup (TanjilG_07141 dan TanjilG_19877) dan pada populasi 22660 (TanjilG_09014 dan TanjilG_10361) dan dua di 83A 27:476.
Gen dengan ekspresi yang berubah secara signifikan sebagai respons terhadap inokulasi dengan C. lupini (galur Col-08) dikenakan analisis pengayaan Gene Ontology (GO) (Tabel Tambahan S8). Istilah proses biologis yang paling sering muncul adalah “respons pertahanan GO:0006952” yang muncul dalam 6 dari 16 kombinasi (waktu × garis) dengan signifikansi tinggi (nilai P < 0,001) (Gbr. 2). Istilah proses biologis yang paling sering muncul adalah “respons pertahanan GO:0006952” yang muncul dalam 6 dari 16 kombinasi (waktu × garis) dengan signifikansi tinggi (nilai P < 0,001) (Gbr. 2). Anda perlu menghubungi kami melalui telepon «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся pada 6 atau 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Istilah proses biologis yang paling sering muncul adalah 'respons pertahanan GO:0006952', yang muncul dalam 6 dari 16 kombinasi (waktu × garis keturunan) dengan signifikansi tinggi (nilai P < 0,001) (Gbr. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 Istilah proses biologis yang paling representatif adalah “respons pertahanan GO:0006952”, yang muncul dalam 6 dari 16 kombinasi (时间×线), dengan signifikansi tinggi (nilai P < 0,001) (图2). Anda perlu menggunakan aplikasi ini untuk mengaktifkan "GO: 0006952 Defense Response", yang berarti "GO: 0006952 Defense Response". появлялся в 6 dan 16 bulan (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Istilah proses biologis yang paling sering muncul adalah 'GO:0006952 Respon Pertahanan', yang muncul dalam 6 dari 16 kombinasi (waktu × garis) dengan signifikansi tinggi (nilai P < 0,001) (Gbr. 2).Istilah ini terwakili secara berlebihan pada dua titik waktu di 83A: 476 dan Boregine (6 dan 24 jam pasca infeksi) dan pada satu titik waktu di Mandelup dan Populasi 22660 (masing-masing 12 dan 6 jam pasca infeksi). Ini adalah hasil yang diharapkan, yang menyoroti respons antijamur dari galur yang resistan. Selain itu, 83A:476 merespons C. lupini dengan cepat menginduksi gen yang terkait dengan ledakan oksidatif yang direpresentasikan oleh istilah “proses redoks GO:0055114”, yang menunjukkan respons pertahanan spesifik, sementara Boregine mengungkapkan respons pertahanan spesifik, yang terkait dengan istilah 'GO'. :0006950 Respons stres”. Populasi 22660 mengaktifkan respons resistensi horizontal yang melibatkan metabolit sekunder, menyoroti jumlah istilah yang berlebihan “GO:0016104 Proses biosintesis triterpena” dan “GO:0006722 Proses metabolisme triterpena” (kedua istilah tersebut termasuk dalam set gen yang sama), dengan mempertimbangkan hasil analisis pengayaan istilah GO, stabilitas reaksi Mandelup berada di antara Boregine dan Populasi 22660. Selain itu, reaksi awal 83A:476 (6 jam pasca infeksi) dan reaksi tertunda Mandelup dan Populasi 22660 mencakup istilah GO:0015979 'fotosintesis' dan proses biologis terkait lainnya.
Istilah ontologi gen bioproses yang dipilih dalam anotasi gen yang diekspresikan secara berbeda selama respons transkriptom lupin berdaun sempit (NLL) yang diinokulasi dengan lupin antraks (galur Col-08 yang diperoleh dari ladang lupin di Wierzhenice, Polandia, pada tahun 1999) sangat dibesar-besarkan. Lini NLL yang dianalisis adalah: 83A:476 (tahan, membawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui), Mandelup (cukup tahan, membawa alel AnMan homozigot) dan populasi 22660 (rentan).
Karena penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi gen yang berkontribusi terhadap ketahanan terhadap antraknosa, gen yang ditetapkan pada istilah GO “GO: 0006952 Respons defensif” dan “GO: 0055114 Proses redoks” dianalisis dengan batas karena nilai dasar ≥ 30 dengan setidaknya satu garis. × titik waktu yang menggabungkan nilai log2 (perubahan lipat) yang signifikan secara statistik. Jumlah gen yang memenuhi kriteria ini adalah 65 untuk GO:0006952 dan 524 untuk GO:0055114.
83A:476 mengungkap dua puncak DEG yang diberi anotasi dengan istilah GO:0006952, yang pertama pada 6 gen per inci (64 gen, regulasi naik dan turun) dan yang kedua pada 24 gen per inci (15 gen, hanya regulasi naik). Boregine juga menunjukkan bahwa GO:0006952 mencapai puncaknya pada titik waktu yang sama, tetapi dengan DEG yang lebih sedikit (11 dan 8) dan aktivasi preferensial. Mandeloop menunjukkan dua puncak GO:0006952 pada 12 dan 48 HPI, keduanya membawa 12 gen (yang pertama dengan gen pengaktif, dan yang kedua hanya dengan gen penekan), sementara populasi 22660 pada 6 HPI (13 gen) memiliki dominasi yang lebih besar pada puncak peningkatan regulasi. Perlu dicatat bahwa 96,4% dari GO:0006952 DEG pada puncak-puncak ini memiliki jenis respons yang sama (naik atau turun), yang menunjukkan tumpang tindih yang signifikan dalam respons pertahanan meskipun ada perbedaan dalam jumlah gen yang terlibat. Kelompok urutan terbesar yang terkait dengan istilah GO:0006952 mengodekan Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (mirip SAM22), yang termasuk dalam klade protein patogenesis-associated protein (PR-10) kelas 10 dan protein inti lateks. protein serupa (mirip MLP) (Gbr. 3). Kedua kelompok berbeda dalam sifat ekspresi dan arah respons. Gen yang mengode protein mirip SAM22 menunjukkan induksi yang konsisten dan signifikan pada titik waktu awal (6 atau 12 jam pasca infeksi) dan secara umum tidak responsif pada akhir percobaan (48 jam pasca infeksi), sementara protein mirip MLP menunjukkan koordinasi pada 6 jam pasca infeksi. 83A:476 dan Mandelup pada 48 hp/in, hampir semua titik data lainnya tidak responsif. Selain itu, perbedaan dalam profil ekspresi gen protein mirip SAM22 mengikuti variabilitas yang diamati dalam ketahanan terhadap antraknosa, karena galur yang lebih resisten memiliki lebih banyak titik waktu yang secara signifikan menginduksi gen ini daripada gen yang lebih rentan. Gen PR-10 mirip LlR18A/B lainnya menunjukkan pola ekspresi yang sangat mirip dengan gen protein mirip SAM22.
Komponen utama dari istilah proses biologis “GO:0006952 Defense Response” dan pola ekspresi gen kandidat alel Lanr1 dan AnMan diidentifikasi. Skala Log2 menunjukkan nilai log2 (perubahan lipat) antara tanaman yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, yang diperoleh dari ladang lupin, Wizhenica, Polandia, 1999) dan tanaman kontrol (yang diinokulasi semu) pada titik waktu yang sama. Galur lupin berdaun sempit berikut dianalisis: 83A:476 (tahan, membawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui), Mandelup (cukup tahan, membawa alel AnMan homozigot), dan Populasi 22660 (rentan).
Selain itu, profil ekspresi gen kandidat RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) dan AnMan (TanjilG_12861) dievaluasi (Gbr. 3). Gen TanjilG_05042 menunjukkan respons signifikan (aktivasi) pada 83A:476 hanya pada titik waktu pertama (6 jam pasca infeksi), sementara TanjilG_12861 signifikan di Mandeloop hanya pada dua titik waktu: 6 jam pasca infeksi (down regulation) dan 24 jam pasca infeksi (6 jam pasca infeksi). Dengan.). dapat disesuaikan) ).
Gen yang paling banyak diekspresikan dalam istilah GO:0055114 “proses redoks” adalah gen yang mengkode protein sitokrom P450 dan peroksidase (Gbr. 4). Untuk sampel yang diisolasi dari 83A:476 pada 6 HPI, nilai log2 (perubahan lipat) maksimum atau minimum (untuk 86,6% gen) umumnya diamati antara tanaman yang diinokulasi dan kontrol, yang menyoroti respons tinggi genotipe ini terhadap jenis kelamin yang diinokulasi. 83A:476 menunjukkan GO: 0055114 DEG yang paling signifikan pada 6 HPI (503 gen), sedangkan galur lainnya pada 48 HPI (Boregine, 31 gen; Mandelup, 85 gen; dan Population 22660, 78 gen)). Pada sebagian besar gen famili GO:0055114, dua jenis respons terhadap vaksinasi (aktivasi dan inhibisi) diamati. Menariknya, hingga 97,6% DEG diidentifikasi untuk istilah GO: 0055114 di Mandelupe pada 48 hp Pengamatan ini menunjukkan bahwa, meskipun skalanya jauh lebih kecil (yaitu, jumlah gen redoks yang bermutasi, 85 versus 503), pola respons transkriptom yang tertunda dari Mandelup terhadap antraknosa mirip dengan respons awal 83A:476. Pada Boregine dan Population 22660, konvergensi ini lebih rendah pada 51,6% dan 75,6%, masing-masing.
Pola ekspresi komponen utama dari istilah proses biologis “GO:0055114 Proses redoks” terungkap. Skala Log2 menunjukkan nilai log2 (perubahan lipat) antara tanaman yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, yang diperoleh dari ladang lupin, Wizhenica, Polandia, 1999) dan tanaman kontrol (yang diinokulasi semu) pada titik waktu yang sama. Galur lupin berdaun sempit berikut dianalisis: 83A:476 (tahan, membawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui), Mandelup (cukup tahan, membawa alel AnMan homozigot), dan Populasi 22660 (rentan).
83A:476 Respons transkriptomik terhadap inokulasi dengan C. lupini (galur Col-08) juga mencakup pembungkaman terkoordinasi gen yang dikaitkan dengan istilah GO:0015979 “fotosintesis” dan proses biologis terkait lainnya (Gbr. 5). Set DEG GO:0015979 ini berisi 105 gen yang ditekan secara signifikan pada 6 jam pasca infeksi pada 83A:476. Dalam subset ini, 37 gen juga mengalami penurunan regulasi di Mandelup pada 48 jam pasca infeksi dan 35 pada titik waktu yang sama dalam populasi 22660, termasuk 19 DEG yang umum untuk kedua genotipe. Tidak ada DEG yang terkait dengan istilah GO: 0015979 yang diaktifkan secara signifikan dalam kombinasi apa pun (garis x waktu).
Pola ekspresi komponen utama dari istilah proses biologis “GO:0015979 Fotosintesis” terungkap. Skala Log2 menunjukkan nilai log2 (perubahan lipat) antara tanaman yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, yang diperoleh dari ladang lupin, Wizhenica, Polandia, 1999) dan tanaman kontrol (yang diinokulasi semu) pada titik waktu yang sama. Galur lupin berdaun sempit berikut dianalisis: 83A:476 (tahan, membawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui), Mandelup (cukup tahan, membawa alel AnMan homozigot), dan Populasi 22660 (rentan).
Berdasarkan hasil analisis ekspresi diferensial dan mungkin terlibat dalam respons pertahanan terhadap jamur patogen, rangkaian tujuh gen ini dipilih untuk kuantifikasi profil ekspresi dengan PCR waktu nyata (Tabel Tambahan S9).
Gen protein dugaan TanjilG_10657 diinduksi secara signifikan di semua galur dan titik waktu yang dipelajari dibandingkan dengan tanaman kontrol (tiruan) (Tabel Tambahan S10, S11). Selain itu, profil ekspresi TanjilG_10657 menunjukkan tren peningkatan selama percobaan untuk semua galur. Populasi 22660 menunjukkan sensitivitas tertinggi TanjilG_10657 terhadap inokulasi dengan aktivasi 114 kali lipat dan tingkat ekspresi relatif tertinggi (4,4 ± 0,4) pada 24 HPI (Gbr. 6a). Gen protein PR10 LlR18A TanjilG_27015 juga menunjukkan aktivasi di semua galur dan titik waktu, dengan signifikansi statistik di sebagian besar titik data (Gbr. 6b). Mirip dengan TanjilG_10657, tingkat ekspresi relatif tertinggi dari TanjilG_27015 diamati pada populasi yang diinokulasi sebanyak 22660 pada 24 HPI (19,5 ± 2,4). Gen asam endochitinase TanjilG_04706 meningkat secara signifikan pada semua galur dan pada semua titik waktu kecuali untuk Boregine 6 HPI (Gbr. 6c). Gen ini diinduksi secara kuat pada titik waktu pertama (6 HPI) pada 83A:476 (sebesar 10,5 kali) dan meningkat secara moderat pada galur lain (sebesar 6,6-7,5 kali). Selama percobaan, ekspresi TanjilG_04706 tetap pada tingkat yang sama di 83A:476 dan Boregine, sementara di Mandelup dan Populasi 22660 meningkat secara signifikan, mencapai nilai yang relatif tinggi (masing-masing 5,9 ± 1,5 dan 6,2 ± 1,5). Gen mirip endoglukan-1,3-β-glukosidase TanjilG_23384 menunjukkan aktivasi tinggi pada dua titik waktu pertama (6 dan 12 jam pasca infeksi) di semua galur kecuali populasi 22660 (Gbr. 6d). Tingkat ekspresi relatif tertinggi TanjilG_23384 diamati pada titik waktu kedua (12 jam pasca infeksi) di Mandelup (2,7 ± 0,3) dan 83A:476 (1,5 ± 0,1). Pada 24 HPI, ekspresi TanjilG_23384 relatif rendah di semua galur yang diteliti (dari 0,04 ± 0,009 hingga 0,44 ± 0,12).
Profil ekspresi gen terpilih (ag) terungkap melalui PCR kuantitatif. Angka 6, 12, dan 24 mewakili jam setelah vaksinasi. Gen LanDExH7 dan LanTUB6 digunakan untuk normalisasi dan LanTUB6 digunakan untuk kalibrasi antar seri. Batang galat mewakili deviasi standar berdasarkan tiga replikasi biologis, yang masing-masing merupakan rata-rata dari tiga replikasi teknis. Signifikansi statistik dari perbedaan tingkat ekspresi antara tanaman yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, diperoleh pada tahun 1999 dari ladang lupin di Wierzenica, Polandia) dan tanaman kontrol (tanaman yang diinokulasi tiruan) ditandai di atas titik data (*nilai P < 0,05, **nilai P ≤ 0,01, ***nilai P ≤ 0,001). Signifikansi statistik dari perbedaan tingkat ekspresi antara tanaman yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, diperoleh pada tahun 1999 dari ladang lupin di Wierzenica, Polandia) dan tanaman kontrol (tanaman yang diinokulasi tiruan) ditandai di atas titik data (*nilai P < 0,05, **nilai P ≤ 0,01, ***nilai P ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между и Companiesулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен pada tahun 1999 поля люпина в Верженице, Польша) dan контрольными (ложно иSomeулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***nilai P ≤ 0,001). Perbedaan yang signifikan secara statistik dalam tingkat ekspresi antara tanaman yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, diperoleh pada tahun 1999 dari ladang lupin di Wierzhenice, Polandia) dan tanaman kontrol (yang diinokulasi semu) dicatat di atas titik data (*nilai P < 0,05, **nilai P ≤ 0,01, ***nilai P ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini,Kol-08株,1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001)。接种 （colletotrichum lupini , color-08 株 , 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物 之间水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между и Companiesулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно иSomeулированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-nilai ≤ 0,001). Perbedaan yang signifikan secara statistik dalam tingkat ekspresi antara tanaman yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, diperoleh dari ladang lupin di Verzhenice, Polandia, pada tahun 1999) dan kontrol (tanaman yang diinokulasi semu) dicatat di atas titik data (*nilai P < 0,05, **nilai P ≤ 0,01, ***nilai P ≤ 0,001).Garis NLL yang dianalisis adalah: 83A:476 (tahan, membawa alel Lanr1 homozigot), Mandelup (cukup tahan, membawa alel AnMan homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui) dan populasi 22660 (rentan).
Gen kandidat TanjilG_05042 pada lokus Lanr1 menunjukkan pola ekspresi yang sangat berbeda dari profil yang diperoleh dari studi RNA-seq (Gbr. 6e). Aktivasi gen ini yang signifikan diamati pada populasi Mandelup dan 22660 (masing-masing hingga 39,7 dan 11,7 kali), yang menghasilkan tingkat ekspresi yang relatif tinggi (masing-masing hingga 1,4 ± 0,14 dan 7,2 ± 1,3). 83A:476 juga mengungkapkan beberapa peningkatan regulasi gen TanjilG_05042 (hingga 3,8 kali lipat), namun, tingkat ekspresi relatif yang dicapai (0,044 ± 0,002) lebih dari 30 kali lipat lebih rendah daripada yang diamati pada populasi Mandelup dan 22660. yang dianalisis dengan qPCR menunjukkan perbedaan signifikan dalam tingkat ekspresi antar genotipe pada varian yang divaksinasi tiruan (kontrol), mencapai perbedaan 58 kali lipat antara populasi 22660 dan 83A:476, serta antara populasi 22660 dan 22660. Perbedaan dua kali lipat dicapai antara Boregine dan Mandalup.
Gen kandidat pada lokus AnMan, TanjilG_12861, diaktifkan sebagai respons terhadap vaksinasi pada 83A:476 dan Mandelup, bersifat netral pada populasi 22660, dan mengalami penurunan regulasi pada Boregine (Gbr. 6f). Ekspresi relatif gen TanjilG_12861 adalah yang tertinggi pada 83A:476 yang diinokulasi (0,14±0,01). Gen protein syok panas kelas I 17,4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 menunjukkan tingkat ekspresi relatif yang lebih rendah pada semua galur dan titik waktu yang dipelajari (Gbr. 6g). Nilai tertinggi diamati pada 24 HPI pada populasi 22660 (0,14 ± 0,02, peningkatan delapan kali lipat sebagai respons terhadap vaksinasi).
Perbandingan profil ekspresi gen (Gambar 7) menunjukkan korelasi tinggi antara TanjilG_10657 dengan empat gen lainnya: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80), dan TanjilG_04706 (r = 0,79). Hasil tersebut dapat mengindikasikan adanya koregulasi gen-gen ini selama respons pertahanan. Gen TanjilG_12861 dan TanjilG_23384 menunjukkan profil ekspresi yang berbeda dengan nilai koefisien korelasi Pearson yang lebih rendah (masing-masing dari 0,08 hingga 0,43 dan -0,19 hingga 0,28) dibandingkan dengan gen lainnya.
Korelasi antara profil ekspresi gen dideteksi menggunakan PCR kuantitatif. Galur lupin berdaun sempit berikut dianalisis: 83A:476 (tahan, membawa alel Lanr1 homozigot), Mandelup (cukup tahan, membawa alel AnMan homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui), dan Populasi 22660 (rentan). Tiga titik waktu dihitung (6, 12 dan 24 jam setelah inokulasi), termasuk tanaman yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, galur Col-08, yang diperoleh dari ladang lupin di Wierzhenice, Polandia, pada tahun 1999) dan tanaman kontrol (yang diinokulasi semu). Skala menunjukkan nilai koefisien korelasi Pearson.
Berdasarkan data yang diperoleh pada 6 tenaga kuda per inci, WGCNA dilakukan pada 9981 DEG yang diidentifikasi dengan membandingkan tanaman yang diinokulasi dan tanaman kontrol untuk fokus pada respons pertahanan awal (Tabel Tambahan S12). Dua puluh dua modul gen (kluster) ditemukan dengan profil ekspresi yang berkorelasi (positif atau negatif) antara genotipe dan varian eksperimental. Rata-rata, tingkat ekspresi gen menurun dalam urutan 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (namun, pada kedua varian, tren ini lebih kuat pada tanaman kontrol). Rata-rata, tingkat ekspresi gen menurun dalam urutan 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (namun, pada kedua varian, tren ini lebih kuat pada tanaman kontrol). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (в обоих вариантах, tentu saja, ini adalah hal yang perlu Anda lakukan контрольных растений). Rata-rata, tingkat ekspresi gen menurun dalam urutan 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (namun, pada kedua varian, tren ini lebih kuat pada tanaman kontrol).平均而言,基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660的顺序下降（然而,在两种变体中,这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 , 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> populasi 22660 的 顺序 下降 （, 在 种 中 , 这 种 在 在植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (однако в обоих вариантах Apa yang Perlu Diperhatikan dan Dikontrol (Rencana). Rata-rata, tingkat ekspresi gen menurun dalam seri 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (namun, pada kedua varian, tren ini lebih kuat pada tanaman kontrol).Vaksinasi mengakibatkan peningkatan regulasi ekspresi gen, terutama dalam modul 18, 19, 14, 6 dan 1 (dalam urutan efek menurun), regulasi negatif (misalnya modul 9 dan 20) atau dengan efek netral (misalnya modul 11, 22, 8 dan 13). Analisis pengayaan istilah GO (Tabel Tambahan S13) mengungkapkan “GO: 0006952 Respons protektif” untuk modul yang diinokulasi (18) dengan aktivasi maksimum, termasuk gen yang dianalisis oleh qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 dan TanjilG_27015), serta banyak modul fotosintesis yang paling ditekan (9). Konsentrator modul 18 (Gbr. 8) diidentifikasi sebagai gen TanjilG_26536 yang mengkode protein LlR18B mirip PR-10, dan konsentrator modul 9 diidentifikasi sebagai gen TanjilG_28955 yang mengkode protein PsbQ fotosistem II. Kandidat gen resistensi antraknosa Lanr1, TanjilG_05042, ditemukan dalam modul 22 (Gbr. 9) dan dikaitkan dengan istilah “GO:0044260 Proses metabolisme makromolekul seluler” dan “GO:0006355 Regulasi transkripsi, pembuatan templat DNA” yang membawa hub TanjilG_01212. Gen tersebut mengkode faktor transkripsi stres panas A-4a (HSFA4a).
Analisis jaringan tertimbang dari ko-ekspresi gen modul dengan istilah proses biologis yang terwakili secara berlebihan “GO: 0006952 Respons pertahanan”. Ligasi disederhanakan untuk menyorot empat gen yang dianalisis oleh qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 dan TanjilG_27015).
Analisis jaringan tertimbang dari ko-ekspresi gen dari suatu modul dengan istilah proses biologis yang terwakili secara berlebihan “GO: 0006355: Pengaturan transkripsi, pembuatan pola DNA” dan membawa kandidat gen ketahanan antraknosa Lanr1 TanjilG_05042. Ligasi disederhanakan untuk mengisolasi gen TanjilG_05042 dan gen TanjilG_01212 sentral.
Pemeriksaan ketahanan terhadap antraknosa yang dikumpulkan di Australia menunjukkan bahwa sebagian besar kultivar yang dirilis awal rentan; Kalya, Coromup dan Mandelup telah dideskripsikan sebagai cukup tahan, sementara Wonga, Tanjil dan 83A:476 telah dideskripsikan sebagai sangat tahan26,27,31. memiliki alel ketahanan yang sama, yang disebut Lanr1, dan Coromup dan Mandelup memiliki alel yang berbeda, yang disebut AnMan10, 26, 39, sementara Kalya mewariskan alel yang berbeda. , Lanr2. Pemeriksaan ketahanan terhadap antraknosa di Jerman menghasilkan identifikasi galur tahan Bo7212 dengan alel kandidat selain Lanr1, yang disebut LanrBo36.
Studi kami mengungkap frekuensi yang sangat rendah (sekitar 6%) dari alel Lanr1 dalam plasma nutfah yang diuji. Pengamatan ini konsisten dengan hasil penyaringan plasma nutfah Eropa Timur menggunakan penanda Anseq3 dan Anseq4, yang menunjukkan bahwa alel Lanr1 hanya terdapat pada dua galur Belarusia. Hal ini menunjukkan bahwa alel Lanr1 belum banyak digunakan oleh program pemuliaan lokal, tidak seperti di Australia, yang merupakan salah satu alel kunci untuk pemuliaan dengan bantuan penanda. Hal ini mungkin disebabkan oleh tingkat resistensi yang lebih rendah yang diberikan oleh alel Lanr1 dalam kondisi lapangan Eropa dibandingkan dengan laporan Australia. Selain itu, studi antraknosa di daerah dengan curah hujan tinggi di Australia telah menunjukkan bahwa respons resistensi yang dimediasi oleh alel Lanr1 mungkin tidak efektif dalam kondisi cuaca yang mendukung pertumbuhan dan perkembangan patogen yang cepat19,42. Faktanya, dalam penelitian ini, beberapa gejala antraknosa juga diamati pada genotipe pembawa alel Lanr1, yang menunjukkan bahwa resistensi dapat menghilang dalam kondisi optimal untuk perkembangan C. lupini. Selain itu, interpretasi positif palsu dari keberadaan penanda Anseq3 dan Anseq4, yang berjarak sekitar 1 cM dari lokus Lanr1, mungkin terjadi 28,30,43 .
Studi kami menunjukkan bahwa 83A:476, yang membawa alel Lanr1, merespons inokulasi C. lupini dengan pemrograman ulang transkriptom skala besar pada titik waktu pertama yang dianalisis (6 jam pasca infeksi), sementara pada Mandelup, yang membawa alel AnMan, respons transkriptomik diamati jauh kemudian. (dari 24 hingga 48 jam pasca infeksi). Variasi temporal dalam respons pertahanan ini dikaitkan dengan perbedaan gejala penyakit, yang menyoroti pentingnya pengenalan patogen dini untuk respons yang berhasil terhadap resistensi. Untuk menginfeksi jaringan tanaman, spora antraks harus melalui beberapa tahap perkembangan pada permukaan inang, termasuk perkecambahan, pembelahan sel, dan pembentukan apresorium. Apendiks adalah struktur infeksius yang menempel pada permukaan inang dan memfasilitasi penetrasi ke dalam jaringan inang. Dengan demikian, spora C. gloeosporioides dalam ekstrak kacang polong menunjukkan pembelahan pertama nukleus setelah 75-90 menit inkubasi, pembentukan tabung kecambah setelah 90-120 menit, dan penekanan setelah 4 jam 45 . Mangga C. gloeosporioides menunjukkan lebih dari 40% perkecambahan konidia setelah 3 jam inkubasi dan sekitar 20% pembentukan apresor setelah 4 jam. Gen CAP20 yang berasosiasi dengan virulensi dari C. gloeosporioides menunjukkan aktivitas transkripsi dalam konidia pembentuk epifit setelah 3,5 jam inkubasi dalam lilin permukaan alpukat dengan konsentrasi tinggi protein CAP20 setelah 4 jam 46 menit. Demikian pula, aktivitas gen biosintesis melanin dalam C. trifolii diinduksi selama inkubasi 2 jam diikuti oleh pembentukan apresorium setelah 1 jam. Studi jaringan daun telah menunjukkan bahwa stroberi yang diinokulasi dengan C. acutatum memiliki penekanan pertama pada 8 jam pasca infeksi, sementara tomat yang diinokulasi dengan C. coccodes memiliki penekanan pertama pada 4 jam pasca infeksi48,49. sebagian besar konsisten dengan skala waktu proses infeksi Colletotrichum spp. Respons pertahanan cepat terhadap 83A:476 menunjukkan keterlibatan gen resistensi tanaman dan imunitas yang dipicu efektor (ETI) dalam galur ini, sementara respons tertunda Mandelup mendukung hipotesis imunitas yang dipicu pola molekuler (MTI) yang berasosiasi mikro50. Respons awal terhadap 83A:476 dan Mandelup. Tumpang tindih parsial antara gen yang diatur naik atau turun dalam respons tertunda juga mendukung konsep ini, karena ETI sering dianggap sebagai respons MTI yang dipercepat dan ditingkatkan yang berpuncak pada kematian sel terprogram di tempat infeksi, yang dikenal sebagai syok anafilaksis51,52.
Sebagian besar gen yang dikaitkan dengan istilah yang terlalu terwakili Gene Ontology GO:0006952 “Defense Response” adalah 11 homolog dari protein pesan puasa yang diinduksi stres 22 (mirip dengan SAM22) dan tujuh protein-seperti lateks utama (MLP). protein-seperti 31, 34, 43 dan 423 menunjukkan kesamaan urutan. Gen-gen seperti SAM22 menunjukkan aktivasi signifikan yang berlangsung lebih lama, menunjukkan peningkatan kadar resistensi antraknosa (83A:476 dan Boregine). Namun, gen-gen seperti MLP hanya mengalami penurunan regulasi pada garis yang membawa alel resistensi kandidat (83A:476/Lanr1 pada 6 jam pasca infeksi dan Mandelup/AnMan pada 24 jam pasca infeksi). Perlu dicatat bahwa semua homolog seperti SAM22 yang teridentifikasi berasal dari gugus gen yang mencakup sekitar 105 kb, sedangkan gen-gen seperti MLP berasal dari daerah genom yang terpisah. Aktivasi terkoordinasi dari gen-gen seperti SAM22 juga ditemukan dalam penelitian kami sebelumnya tentang resistensi NLL terhadap inokulasi Diaporthetoxica, yang menunjukkan bahwa gen-gen tersebut terlibat dalam komponen horizontal respons pertahanan. Kesimpulan ini juga didukung oleh laporan respons positif gen-gen seperti SAM22 terhadap cedera atau pengobatan dengan asam salisilat, pemicu jamur, atau hidrogen peroksida.
Gen mirip MLP telah terbukti merespons berbagai stres abiotik dan biotik, termasuk infeksi bakteri, virus, dan jamur patogen pada banyak spesies tanaman55. Arah respons terhadap interaksi tertentu antara tanaman dan patogen berkisar dari peningkatan yang kuat (yaitu, selama infestasi kapas dengan Verticillium dahliae) hingga penurunan yang signifikan (yaitu, setelah infeksi pohon apel dengan Alternaria spp.)56,57. Penurunan regulasi yang signifikan dari gen mirip MLP 423 telah diamati selama pertahanan alpukat terhadap infeksi F. niger dan selama infeksi pohon apel Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola dan Alternaria alternata adalah patotipe apel58,59. Selain itu, kalus apel yang mengekspresikan gen mirip MLP 423 secara berlebihan memiliki ekspresi gen terkait resistensi yang lebih rendah dan lebih rentan terhadap infeksi jamur59. Setelah Fusarium oxysporum f, gen mirip MLP 423 juga ditekan dalam plasma nutfah kacang umum yang resisten. cn. Infeksi kacang 60
Anggota lain dari keluarga PR-10 yang diidentifikasi dalam studi RNA-seq kami adalah gen LlR18A dan LlR18B sebagai respons terhadap peningkatan regulasi, serta gen yang meningkat regulasinya (1 gen) atau menurun regulasinya (3 gen) untuk protein transfer lipid DIR1. . Selain itu, WGCNA menyoroti gen LlR18B sebagai hub dalam modul ini, yang sangat rentan terhadap vaksinasi dan membawa beberapa gen respons protektif. Gen LlR18A dan LlR18B diinduksi dalam daun lupin kuning sebagai respons terhadap bakteri patogen, serta dalam batang NLL setelah inokulasi D. toxica, sementara homolog padi dari gen-gen ini, RSOsPR10, dengan cepat diinduksi oleh infeksi jamur yang mungkin terlibat dalam jalur pensinyalan asam jasmonat53,61, 62. Gen DIR1 mengkodekan protein transpor lipid nonspesifik yang diperlukan untuk timbulnya resistensi yang didapat sistemik (SAR). Dengan berkembangnya reaksi protektif, protein DIR1 diangkut dari fokus infeksi melalui floem untuk menginduksi SAR pada organ yang jauh. Menariknya, gen TanjilG_02313 DIR1 diinduksi secara signifikan pada titik waktu pertama pada galur 84A:476 dan Populasi 22660, tetapi ketahanan terhadap antraknosa hanya berhasil berkembang pada galur 84A:476. Hal ini mungkin menunjukkan beberapa subfungsionalisasi gen DIR1 pada NLL, karena tiga homolog yang tersisa merespons inokulasi hanya pada galur 83A:476 pada 6 jam pasca infeksi, dan respons ini diarahkan ke bawah.
Dalam penelitian kami, komponen yang paling umum yang berhubungan dengan proses biologis yang disebut “GO:0055114 Redox process” adalah protein sitokrom P450, peroksidase, lipoksigenase asam linoleat 9S-/13S, dan oksidase asam karboksilat 1-aminosiklopropana-1. Selain itu, WGCNA kami mendefinisikan homolog HSFA4a sebagai modul pembawa hub seperti kandidat gen resistensi Lanr1 TanjilG_05042. HSFA4a merupakan komponen regulasi transkripsi nuklir yang bergantung pada redoks pada tanaman.
Protein sitokrom P450 adalah oksidoreduktase yang mengkatalisis reaksi hidroksilasi yang bergantung pada NADPH dan/atau O2 dalam metabolisme primer dan sekunder, termasuk metabolisme xenobiotik, serta hormon, asam lemak, sterol, komponen dinding sel, biopolimer, dan biosintesis senyawa pelindung 69. Dalam Dalam sebuah penelitian, variabilitas fungsi sitokrom P450 tanaman berkurang dari -10,6 log2 (perubahan lipat) menjadi 5,7 karena sejumlah besar homolog yang berubah (37) dan perbedaan dalam pola respons antara gen-gen tertentu, yang mencerminkan revisi ke atas. . Hanya menggunakan data RNA-seq untuk menjelaskan fungsi biologis putatif gen NLL dalam superfamili protein yang begitu besar akan sangat spekulatif. Namun, perlu dicatat bahwa beberapa gen sitokrom P450 dikaitkan dengan peningkatan resistensi terhadap jamur atau bakteri patogen, termasuk kontribusi terhadap reaksi alergi69,70,71.
Peroksidase Kelas III adalah enzim tanaman multifungsi yang terlibat dalam berbagai proses metabolisme selama pertumbuhan dan perkembangan tanaman, serta sebagai respons terhadap stres lingkungan seperti salinitas, kekeringan, intensitas cahaya tinggi, dan serangan patogen72. Peroksidase terlibat dalam interaksi beberapa spesies tanaman dengan Anthracis, termasuk Stylosanthes humilis dan C. gloeosporioides, Lens culinaris dan C. truncatum, Phaseolus vulgaris dan C. lindemuthianum, Cucumis sativus dan C. lagenarium73,74,75,76. Responsnya sangat cepat, kadang-kadang bahkan pada 4 HPI, sebelum jamur menembus jaringan tanaman73. Gen peroksidase juga merespons inokulasi D. toxica NLL. Selain fungsi khasnya untuk mengatur ledakan oksidatif atau menghilangkan stres oksidatif, peroksidase dapat mengganggu pertumbuhan patogen dengan menciptakan penghalang fisik berdasarkan penguatan dinding sel selama lignifikasi, subunit atau ikatan silang senyawa tertentu. Fungsi ini dapat dikaitkan secara silico dengan gen TanjilG_03329 yang mengkodekan anion peroksidase pembentuk lignin yang meningkat secara signifikan dalam penelitian kami pada galur resisten 83A:476 pada 6 HPI, tetapi tidak pada galur dan titik waktu lain yang tidak merespons.
9S-/13S-lipoksigenase asam linoleat merupakan langkah pertama dalam jalur oksidatif biosintesis lipid78. Produk dari jalur ini memiliki banyak fungsi dalam pertahanan tanaman, termasuk penguatan dinding sel melalui pembentukan endapan kalosa dan pektin, dan pengaturan stres oksidatif melalui produksi spesies oksigen reaktif79,80,81,82,83. Dalam penelitian ini, ekspresi 9S-/13S-lipoksigenase asam linoleat diubah pada semua galur, tetapi pada populasi rentan 22660, peningkatan regulasi terjadi pada titik waktu yang berbeda, sementara pada galur pembawa Lanr1 resisten dan alel AnMan, hal ini menekankan diversifikasi lapisan oksilipin dalam reaksi antraks protektif antara genotipe ini.
Homolog 1-aminosiklopropana-1-karboksilat oksidase (ACO) mengalami peningkatan regulasi yang signifikan (9 gen) atau penurunan regulasi (2 gen) ketika diinokulasi dengan lupin. Dengan dua pengecualian, semua respons ini terjadi pada 6 jam pada 83A:476. Reaksi enzimatik yang dimediasi oleh protein ACO merupakan langkah pembatas laju dalam produksi etilen dan karenanya sangat diatur84. Etilen adalah hormon tanaman yang memainkan berbagai peran dalam mengatur perkembangan tanaman dan respons terhadap kondisi stres abiotik dan biotik. Induksi transkripsi ACO dan aktivasi jalur pensinyalan etilen terlibat dalam peningkatan ketahanan padi terhadap jamur hemibiotrofik oryzae oryzae dengan mengatur produksi spesies oksigen reaktif dan fitoaleksin. Proses infeksi daun yang sangat mirip ditemukan antara M. oryzae dan C. lupini88,89, dengan latar belakang peningkatan regulasi homolog ACO yang signifikan dalam garis 83A:476 yang dilaporkan dalam penelitian ini, menggeser kemungkinan pemberian resistensi terhadap antraknosa NLL Etilen sebuah langkah sinyal sentral dalam jalur molekuler.
Dalam penelitian ini, penekanan skala besar pada banyak gen yang terkait dengan fotosintesis diamati pada 6 jam pasca infeksi pada 83A:476 dan pada 48 jam pasca infeksi pada Mandeloop dan populasi 22660. Tingkat dan perkembangan perubahan ini sebanding dengan levelnya. Resistensi antraknosa diamati dalam percobaan ini. Baru-baru ini, penekanan kuat dan awal pada transkrip terkait fotosintesis telah dilaporkan dalam beberapa model interaksi tanaman-patogen, termasuk bakteri dan jamur patogen. Tergesa-gesa (dari 2 jam pasca infeksi pada beberapa interaksi) dan penekanan global pada gen yang terkait dengan fotosintesis sebagai respons terhadap infeksi dapat memicu kekebalan tanaman berdasarkan penyebaran spesies oksigen reaktif dan interaksinya dengan jalur asam salisilat untuk memediasi reaksi alergi 90,94.
Sebagai kesimpulan, mekanisme respons pertahanan yang diusulkan untuk garis keturunan yang paling resistan (83A:476) mencakup pengenalan patogen cepat oleh gen R (mungkin TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) dan respons alergi yang dimediasi oleh asam salisilat dan sinyal etilen, diikuti oleh pembentukan SAR jarak jauh. Tindakan ini didukung oleh protein DIR-1. Perlu dicatat bahwa periode biotropik untuk infeksi C. lupini sangat singkat (sekitar 2 hari), diikuti oleh pertumbuhan nekrotik95. Transisi antara tahap-tahap ini dapat dikaitkan dengan nekrosis dan ekspresi protein yang dapat diinduksi etilen yang bertindak sebagai pemicu reaksi hipersensitivitas pada tanaman inang. Oleh karena itu, jendela waktu untuk penangkapan C. lupini yang berhasil pada tahap biotropik sangat sempit. Pemrograman ulang gen yang terkait dengan redoks dan fotosintesis yang diamati pada 83A:476 pada 6 jam pasca infeksi konsisten dengan perkembangan hifa jamur dan menandai perkembangan respons perlindungan yang berhasil pada tahap biotropik. Respons transkriptomik Mandelup dan populasi 22660 mungkin terlalu lambat untuk menangkap jamur sebelum beralih ke pertumbuhan nekrotik, namun, Mandelup mungkin lebih efektif daripada populasi 22660 karena regulasi protein PR-10 yang relatif cepat mendorong resistensi horizontal.
ETI, didorong oleh gen R kanonik, tampaknya menjadi mekanisme umum untuk ketahanan kacang terhadap antraknosa. Dengan demikian, pada legum model Medicago truncatula, ketahanan terhadap antraknosa diberikan oleh gen RCT1, anggota kelas gen R tanaman TIR-NBS-LRR97. Gen ini juga memberikan ketahanan antraknosa spektrum luas pada alfalfa ketika dipindahkan ke tanaman yang rentan. Pada kacang biasa (P. vulgaris), lebih dari dua lusin gen ketahanan antraknosa telah diidentifikasi hingga saat ini. Beberapa gen ini ditemukan di daerah yang tidak memiliki gen R kanonik, namun banyak lainnya terletak di tepi kromosom yang membawa gugus gen NBS-LRR, termasuk TIR-NBS-LRRs99. Studi SSR di seluruh genom juga mengonfirmasi hubungan gen NBS-LRR dengan ketahanan antraknosa pada kacang biasa. Gen R kanonik juga ditemukan di wilayah genom yang membawa lokus utama ketahanan terhadap antraknosa pada lupin putih 101.
Pekerjaan kami menunjukkan bahwa reaksi resistensi langsung, yang diaktifkan pada tahap awal infeksi tanaman (sebaiknya tidak lebih dari 12 jam pasca infeksi), secara efektif melindungi lupin berdaun sempit dari antraknosa yang disebabkan oleh jamur patogen Collelotrichum lupini. Dengan menggunakan sekuensing throughput tinggi, kami menunjukkan profil ekspresi diferensial gen resistensi antraknosa pada tanaman NLL yang dimediasi oleh gen resistensi Lanr1 dan AnMan. Pertahanan yang berhasil melibatkan perancangan gen yang cermat untuk protein yang terlibat dalam redoks, fotosintesis, dan patogenesis dalam beberapa jam setelah kontak pertama tanaman dengan patogen. Reaksi perlindungan yang serupa, tetapi tertunda dalam waktu, jauh kurang efektif dalam melindungi tanaman dari penyakit. Resistensi antraks yang dimediasi oleh gen Lanr1 menyerupai respons cepat khas gen R (imunitas yang dipicu oleh efektor), sedangkan gen AnMan kemungkinan besar memberikan respons horizontal (imunitas yang dipicu oleh pola molekuler yang terkait dengan mikroba), yang memberikan tingkat keberlanjutan yang sedang.
215 galur NLL yang digunakan untuk menyaring penanda antraknosa terdiri dari 74 kultivar, 60 galur yang diperoleh melalui persilangan atau pembiakan, 5 mutan, dan 76 plasma nutfah liar atau asli. Galur-galur tersebut berasal dari 17 negara, terutama dari Polandia (58), Spanyol (47), Jerman (27), Australia (26), Rusia (19), Belarus (7), Italia (5) dan galur-galur lainnya dari 10 negara. Kumpulan tersebut juga mencakup galur-galur tahan referensi: 83A:476, Tanjil, Wonga yang membawa alel Lanr1, dan Mandelup yang membawa alel AnMan. Galur-galur tersebut diperoleh dari European Lupine Genetic Resource Database yang dikelola oleh Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polandia (Tabel Tambahan S1).
Tanaman tumbuh dalam kondisi terkendali (periode cahaya 16 jam, suhu 25°C pada siang hari dan 18°C ​​pada malam hari). Dua replikasi biologis dianalisis. DNA diisolasi dari daun berumur tiga minggu menggunakan DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Jerman) sesuai dengan protokol. Kualitas dan konsentrasi DNA yang diisolasi dinilai dengan metode spektrofotometri (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AS). Penanda AnManM1 yang menandai gen resistensi antraknosa AnMan (berasal dari cv. Mandelup) dan penanda Anseq3 dan Anseq4 yang mengapit gen Lanr1 (berasal dari cv. Tanjil) dianalisis 11,26,28. Homozigot untuk alel resisten diberi skor “1″, rentan – sebagai “0″, dan heterozigot – sebagai 0,5.
Berdasarkan hasil penyaringan untuk penanda AnManM1, AnSeq3 dan AnSeq4 dan ketersediaan benih untuk percobaan tindak lanjut akhir, 50 galur NLL dipilih untuk fenotipe ketahanan antraknosa. Analisis dilakukan secara duplikasi di rumah kaca yang dikontrol komputer dengan periode cahaya 14 jam dengan kisaran suhu 22°C pada siang hari dan 19°C pada malam hari. Benih digores (memotong kulit benih pada sisi berlawanan dari embrio dengan bilah tajam) sebelum disemai untuk mencegah dormansi benih karena kulit benih terlalu keras dan untuk memastikan perkecambahan yang seragam. Tanaman ditanam dalam pot (11 × 11 × 21 cm) dengan tanah steril (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warsawa, Polandia). Inokulasi dilakukan dengan strain Colletotrichum lupini Col-08, yang tumbuh pada tahun 1999 dari batang tanaman lupin berdaun sempit yang tumbuh di ladang di Verzhenitsa, Polandia Besar (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E ). Dapatkan suatu area. Isolat dikultur dalam medium SNA pada suhu 20° C. di bawah cahaya hitam selama 21 hari untuk menginduksi sporulasi. Empat minggu setelah penaburan, ketika tanaman telah mencapai tahap 4-6 daun, inokulasi dilakukan dengan menyemprotkan suspensi konidia pada konsentrasi 0,5 x 106 konidia per ml. Setelah inokulasi, tanaman disimpan dalam gelap selama 24 jam pada kelembaban sekitar 98% dan suhu 25°C untuk memfasilitasi perkecambahan konidia dan proses infeksi. Tanaman kemudian ditanam di bawah periode cahaya 14 jam pada suhu 22°C siang/19°C malam dan kelembapan 70%. Skor penyakit dibuat 22 hari setelah inokulasi dan berkisar dari 0 (imun) hingga 9 (sangat rentan) tergantung pada ada atau tidaknya lesi nekrotik pada batang dan daun. Selain itu, setelah penilaian, berat tanaman diukur. Hubungan antara genotipe penanda dan fenotipe penyakit dihitung sebagai korelasi titik dua sekuens (tidak adanya penanda heterozigot dalam rangkaian galur untuk analisis fenotipe ketahanan antraknosa).