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El lupino angustifolius (NLL, Lupinus angustifolius L.) es una planta leguminosa utilizada para la producción de alimentos y la mejora del suelo. La expansión global del NLL como cultivo ha atraído a muchos hongos patógenos, incluido el de la antracnosis del lupino, que causa la devastadora enfermedad de la antracnosis. Dos alelos, Lanr1 y AnMan, que confieren mayor resistencia, se han utilizado en el mejoramiento genético del NLL, pero los mecanismos moleculares subyacentes siguen siendo desconocidos. En este estudio, se utilizaron los marcadores Lanr1 y AnMan para analizar muestras europeas de NLL. Las pruebas de la vacuna en un entorno controlado confirmaron la eficacia de ambos donantes resistentes. Se realizó un perfil de expresión génica diferencial en líneas resistentes y susceptibles representativas. La resistencia a la antracnosis se asoció con la sobreexpresión de los términos de ontología génica "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process" y "GO:0015979 Photosynthesis". Además, la línea Lanr1(83A:476) mostró una reprogramación transcriptómica significativa rápidamente después de la inoculación, mientras que las otras líneas mostraron un retraso en esta respuesta de aproximadamente 42 horas. Las respuestas de defensa están asociadas con los genes TIR-NBS, CC-NBS-LRR y NBS-LRR, 10 proteínas involucradas en la patogénesis, proteínas de transferencia de lípidos, endoglucano-1,3-β-glucosidasa, proteínas de la pared celular ricas en glicina y genes de la vía reactiva del oxígeno. Las respuestas tempranas a 83A:476, incluida la supresión cuidadosa de genes asociados con la fotosíntesis, coincidieron con una protección exitosa durante la fase de crecimiento vegetativo de la biología del hongo, lo que sugiere que un efector desencadena la inmunidad. La reacción de Mandeloop se ralentiza, al igual que el arrastre horizontal general.
El altramuz de hoja estrecha (Lupinus angustifolius L.) es un cereal rico en proteínas originario de la región mediterránea occidental1,2. Actualmente se cultiva como alimento para animales y humanos. También se considera abono verde en sistemas de rotación de cultivos debido a la fijación de nitrógeno por bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno y a la mejora general de la estructura del suelo. El altramuz de hoja estrecha ha experimentado un rápido proceso de domesticación en el último siglo y aún se encuentra bajo una alta presión de mejoramiento genético3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Con el cultivo generalizado del altramuz de hoja estrecha, la sucesión de hongos patógenos desarrolló nuevos nichos agrícolas y causó nuevas enfermedades que destruyen los cultivos. Lo más destacable para los agricultores y mejoradores de lupino fue la aparición de la antracnosis, causada por el hongo patógeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Lo más destacable para los agricultores y mejoradores de lupino fue la aparición de la antracnosis, causada por el hongo patógeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler y Hagedorn13. Lo más destacable para los agricultores y criadores de lupino fue la aparición de la antracnosis causada por el hongo patógeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler y Hagedorn13.Colletotrichum lupini (Bondar) 嵵Peludo。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Lo más llamativo para los agricultores y mejoradores de lupino es la aparición de antracnosis causada por el hongo patógeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Los primeros informes de la enfermedad procedían de Brasil y Estados Unidos, y los síntomas típicos aparecieron en 1912 y 1929 respectivamente. Sin embargo, después de unos 30 años, el patógeno fue designado como Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorfo Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfo Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfo de Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., 有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., 有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld en Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld en Morfología Dirigida. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .y H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。y H. Schlenk, .La fenotipificación preliminar de la enfermedad realizada a mediados del siglo XX mostró cierta resistencia en accesiones de lupino NLL y amarillo (L. luteus L.), pero todas las accesiones de lupino blanco (L. albus L.) analizadas fueron altamente susceptibles15,16. Los estudios han demostrado que el desarrollo de la antracnosis está asociado con un aumento de la precipitación (humedad del aire) y la temperatura (en el rango de 12-28 °C), lo que lleva a una violación de la resistencia a temperaturas más altas17, 18. De hecho, el tiempo requerido para que las conidias germinen y la enfermedad comience, fue cuatro veces más corto a 24 °C (4 horas) que a 12 °C (16 horas) en condiciones de alta humedad19. Por lo tanto, el calentamiento global en curso ha llevado a la propagación de la antracnosis. Sin embargo, la enfermedad se observó en Francia (1982) y Ucrania (1983) como un presagio de una amenaza inminente, pero aparentemente fue ignorada por la industria del lupino en ese momento20,21. Unos años más tarde, esta devastadora enfermedad se extendió por todo el mundo y también afectó a importantes países productores de lupino como Australia, Polonia y Alemania22,23,24. Tras un brote de antracnosis a mediados de la década de 1990, un cribado exhaustivo dio como resultado la identificación de varios donantes resistentes en muestras de NLL19. La resistencia de NLL a la antracnosis está controlada por dos alelos dominantes distintos que se encuentran en diferentes fuentes de germoplasma: Lanr1 en el cultivar Tanjil y Wonga y AnMan en el cultivar Mandalay 25, 26. Estos alelos complementan los marcadores moleculares que apoyan la selección de germoplasma resistente en programas de mejoramiento25,26,27,28,29,30. La línea de mejoramiento resistente 83A:476 portadora del alelo Lanr1 se cruzó con la línea silvestre susceptible P27255 para obtener una población RIL segregante para resistencia a la antracnosis, lo que permitió asignar el locus Lanr1 al cromosoma NLL-1131, 32, 33. La alineación de marcadores de mapas de ligamiento de loci de resistencia flanqueantes a la antracnosis con un marco genómico, NLL reveló la ubicación de los tres alelos en el mismo cromosoma (NLL-11), pero en diferentes posiciones29,34,35. Sin embargo, debido al pequeño número de RIL y la gran distancia genética entre marcadores y alelos correspondientes, no se pueden extraer conclusiones fiables sobre sus genes subyacentes. Por otro lado, el uso de genética inversa en lupinos es difícil debido a su muy bajo potencial de regeneración, lo que hace que la manipulación genética sea engorrosa37.
El desarrollo de germoplasma domesticado que porta el alelo deseado en estado homocigoto, como 83A:476 (Lanr1) y Mandelup (AnMan), ha abierto la puerta al estudio de la resistencia a la antracnosis frente a la presencia de combinaciones opuestas de alelos en poblaciones silvestres. Posibilidades de mecanismos moleculares. Comparar las respuestas de defensa generadas por genotipos específicos. Este estudio evaluó la respuesta transcriptómica temprana de NLL a la vacunación con C. lupini. Primero, se examinó un panel de germoplasma europeo de NLL que contenía 215 líneas utilizando marcadores moleculares que marcan los alelos Lanr1 y AnMan. Luego se realizó la fenotipificación de antracnosis en 50 líneas de NLL, previamente seleccionadas por marcadores moleculares, bajo condiciones controladas. Con base en estos experimentos, se seleccionaron cuatro líneas que diferían en resistencia a la antracnosis y composición alélica Lanr1/AnMan para el perfil de expresión diferencial de genes de defensa utilizando dos enfoques complementarios: secuenciación de ARN de alto rendimiento y cuantificación por PCR en tiempo real.
El cribado de un conjunto de germoplasma NLL (N = 215) con marcadores Lanr1 (Anseq3 y Anseq4) y AnMan (Anseq4) y AnMan (AnManM1) mostró que solo una línea (95726, cerca de Salamanca-b) amplifica el alelo de “resistencia” para todos los marcadores, mientras que “Presencia de alelos 'susceptibles'” encontró la proporción de todos los marcadores en 158 (~73,5%) líneas. Trece líneas produjeron dos alelos “resistentes” del marcador Lanr1, y 8 líneas produjeron alelos “resistentes” del marcador Lanr1. El alelo de “resistencia” del marcador AnMan (Tabla suplementaria S1). Dos líneas fueron heterocigotas para el marcador Anseq3 y una heterocigota para el marcador AnManM1. 42 líneas (19,5 %) presentaban fases opuestas de los alelos Anseq3 y Anseq4, lo que indica una alta frecuencia de recombinación entre estos dos loci. Los fenotipos de antracnosis en condiciones controladas (Tabla suplementaria S2) revelaron variabilidad en la resistencia de los genotipos evaluados, lo que se reflejó en la gravedad de la antracnosis. Las diferencias en las puntuaciones medias oscilaron entre 1,8 (moderadamente resistente) y 6,9 (susceptible), y las diferencias en el peso de las plantas oscilaron entre 0,62 (susceptible) y 4,45 g (resistente). Hubo una correlación significativa entre los valores observados en dos réplicas del experimento (0,51 para las puntuaciones de gravedad de la enfermedad, P = 0,00017 y 0,61 para el peso de la planta, P < 0,0001), así como entre estos dos parámetros (− 0,59 y − 0,77, P < 0,0001). Hubo una correlación significativa entre los valores observados en dos réplicas del experimento (0,51 para las puntuaciones de gravedad de la enfermedad, P = 0,00017 y 0,61 para el peso de la planta, P < 0,0001), así como entre estos dos parámetros (− 0,59 y − 0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 y 0,61 para la mayoría de los parámetros, P < 0,0001), y también hay otros parámetros para (-0,59 y -0,77, P < 0,0001) 0,0001). Se encontró una correlación significativa entre los valores observados en dos repeticiones del experimento (0,51 para las puntuaciones de gravedad de la enfermedad, P = 0,00017 y 0,61 para el peso de la planta, P < 0,0001), así como entre estos dos parámetros (- 0,59 y -0,77, P < 0,0001) 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为0.51, P = 0,00017, 植物重量为0,61, P < 0,0001) (- 0,59 y - 0,77, P < 0,0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为分为 0.51 ， p = 0.00017 ， 植物 为 为 0.61 ， p <0.0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0.59 和– 0.59和– 0,59 和– 0,59 和- 0,77，P < 0,0001)。 Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 y masa растения 0,61, P <0,0001), y entre otros parámetros (-0,59 y -0,0001) 0,77, P <0,0001. Hubo una correlación significativa entre los valores observados por duplicado (puntuación de gravedad de la enfermedad 0,51, P = 0,00017 y peso de la planta 0,61, P < 0,0001) y entre estos dos parámetros (-0,59 y -0,0001) 0,77, P<0,0001. ).Los síntomas típicos observados en plantas susceptibles incluyen el retorcimiento y la torsión del tallo, que se asemejan a una estructura de "arco de pastor", seguidos de lesiones ovaladas con esporozoítos de color naranja/rosa (Figura suplementaria 1). Las accesiones australianas que portan los genes Lanr1 (83A:476 y Tanjil) y AnMan (Mandelup) presentan una resistencia moderada (0,0331 y 0,0036, respectivamente). Algunas líneas que también portan alelos "resistentes" Lanr1 y/o AnMan muestran síntomas de la enfermedad.
Curiosamente, algunas líneas NLL que carecían de cualquier alelo marcador de "resistencia" revelaron un alto nivel de resistencia a la antracnosis (comparable o superior al de los genotipos Lanr1 o AnMan), como Boregine (valor P < 0,0001 para ambos parámetros), Bojar (valor P < 0,0001 para la puntuación y 0,001 para el peso de la planta) y la población B-549/79b (valor P < 0,0001 para la puntuación y no significativo para el peso). Curiosamente, algunas líneas NLL que carecían de cualquier alelo marcador de "resistencia" revelaron un alto nivel de resistencia a la antracnosis (comparable o superior al de los genotipos Lanr1 o AnMan), como Boregine (valor P < 0,0001 para ambos parámetros), Bojar (valor P < 0,0001 para la puntuación y 0,001 para el peso de la planta) y la población B-549/79b (valor P < 0,0001 para la puntuación y no significativo para el peso). Interesante, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости k антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) y популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Curiosamente, varias líneas NLL que carecían de cualquier alelo marcador de "resistencia" mostraron un alto nivel de resistencia a la antracnosis (comparable o superior al de los genotipos Lanr1 o AnMan), como Boregine (valor P < 0,0001 para ambos parámetros), Bojar (valor P < 0,0001 para la evaluación y 0,001 para el peso de la planta) y la población B-549/79b (valor P < 0,0001 para la evaluación y no significativo para el peso).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）。 Es interesante que algunos sistemas NLL que no tienen marcadores “antigénicos” muestren una alta resistencia horizontal (equivalente a los genes Lanr1 o AnMan o superior), como Boregine (ambos parámetros P < 0,0001), Bojar (valor P < 0,0001, peso de la planta 0,001) y la cepa B-549/79b (valor P < 0,0001, peso no significativo). Interesantemente, estas líneas no relacionadas con NLL, marcas de libros de marca registradas y «resistentnostias» de uso exclusivo de los usuarios антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) y la población B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Curiosamente, algunas líneas NLL que carecían de alelos marcadores de "resistencia" mostraron altos niveles de resistencia a la antracnosis (comparables o superiores a los genotipos Lanr1 o AnMan), como Boregine (valor P para ambos parámetros <0,0001), Bojar (valor P < 0,0001, peso de la planta 0,001) y la población B-549/79b (valor P < 0,0001, peso no significativo).Este fenómeno sugiere la posibilidad de una nueva fuente genética de resistencia, lo que explica la falta de correlación observada entre los genotipos de los marcadores y los fenotipos de la enfermedad (valores P de ~0,42 a ~0,98). Por lo tanto, la prueba de Kolmogorov-Smirnov mostró que los datos sobre la resistencia a la antracnosis se distribuyeron aproximadamente de forma normal para las puntuaciones (valores P de 0,25 y 0,11) y la masa de la planta (valores P de 0,47 y 0,55), lo que sugiere que planteo la hipótesis de que hay más alelos involucrados que Lanr1 y AnMan.
Con base en los resultados de la selección de resistencia a la antracnosis, se seleccionaron 4 líneas para el análisis del transcriptoma: 83A:476, Boregine, Mandelup y la población 22660. Estas líneas se volvieron a probar para la resistencia al ántrax en experimentos de inoculación por secuenciación de ARN, siempre que fueran las mismas que en la prueba anterior. Los valores de puntuación fueron los siguientes: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) y población 22660 (6,11 ± 1,29).
El protocolo Illumina NovaSeq 6000 alcanzó un promedio de 40,5 Mread pares por muestra (29,7 a 54,4 Mreads) (Tabla complementaria S3). Las puntuaciones de alineación en la secuencia de referencia oscilaron entre el 75,5 % y el 88,6 %. La correlación promedio de los datos de recuento de lecturas entre variantes experimentales entre réplicas biológicas osciló entre 0,812 y 0,997 (media de 0,959). De los 35.170 genes analizados, 2917 no mostraron expresión y los otros 4785 genes se expresaron a un nivel insignificante (media base < 5). De los 35.170 genes analizados, 2917 no mostraron expresión y los otros 4785 genes se expresaron a un nivel insignificante (media base < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5). De los 35.170 genes analizados, 2917 no mostraron expresión y los 4785 genes restantes se expresaron a un nivel insignificante (media base <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35.170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительную экспрессию (bazovoe среднее significado <5). De los 35.170 genes analizados, 2917 no se expresaron y los 4785 genes restantes tuvieron una expresión insignificante (media base <5).Así, el número de genes considerados expresados ​​(media base ≥ 5) durante el experimento fue de 27.468 (78,1%) (Tabla complementaria S4).
Desde el primer punto de tiempo, todas las líneas NLL respondieron a la inoculación de C. lupini (cepa Col-08) mediante la reprogramación del transcriptoma (Tabla 1); sin embargo, se observaron diferencias significativas entre las líneas. Así, la línea de resistencia 83A:476 (portadora del gen Lanr1) mostró una reprogramación significativa del transcriptoma en el primer punto de tiempo (6 hpi) con un aumento de 31 a 69 veces en el número de genes elevados y disminuidos aislados en comparación con otros puntos de tiempo en este punto de tiempo. Además, este pico fue de corta duración, ya que la expresión de solo unos pocos genes permaneció significativamente alterada en el segundo punto de tiempo (12 hpi). Curiosamente, Boregine, que también mostró un alto nivel de resistencia en la prueba de injerto, no experimentó una reprogramación transcripcional tan masiva durante el experimento. Sin embargo, el número de genes diferencialmente expresados ​​(GDE) fue el mismo para Boregine y 83A:476 a las 12 HPI. Tanto Mandelup como la población 22660 mostraron picos de DEG en el último punto de tiempo (48 l/s), lo que indica un retraso relativo en las respuestas de defensa.
Debido a que 83A:476 experimentó una reprogramación masiva del transcriptoma en respuesta a C. lupini a las 6 HPI en comparación con todas las demás líneas, ~91% de los DEGs observados en este punto temporal fueron específicos del linaje (Fig. 1). Sin embargo, hubo cierta superposición en las respuestas tempranas entre las líneas de estudio, ya que el 68,5%, el 50,9% y el 52,6% de los DEGs en Boregine, Mandelup y la población 22660, respectivamente, se superpusieron con los encontrados en 83A:476 en ciertos momentos. No obstante, estos DEGs representaron solo una pequeña fracción (0,97–1,70%) de todos los DEGs detectados actualmente utilizando 83A:476. Además, 11 DEGs de todas las líneas fueron coherentes en este momento (Tablas suplementarias S4-S6), incluidos componentes comunes de las respuestas de defensa de las plantas: proteína de transferencia de lípidos (TanjilG_32225), enzima endoglucano-1,3-β-glucósido (TanjilG_23384), dos proteínas inducibles por estrés como SAM22 (TanjilG_31528 y TanjilG_31531), proteína básica del látex (TanjilG_32352) y dos proteínas estructurales de la pared celular ricas en glicina (TanjilG_19701 y TanjilG_19702). También hubo una superposición relativamente alta en las respuestas del transcriptoma entre 83A:476 y Boregine a las 24 HPI (16-38% DEG total) y entre Mandelup y la Población 22660 a las 48 HPI (14-20% DEG total).
Diagrama de Venn que muestra el número de genes diferencialmente expresados ​​(GDE) en líneas de lupino de hoja estrecha (LNE) inoculadas con Colletotrichum lupini (cepa Col-08 obtenida de campos de lupino en Wierzhenice, Polonia, 1999). Las líneas de LNE analizadas fueron: 83A:476 (resistente, portadora del alelo Lanr1), Boregine (resistente, fondo genético desconocido), Mandelup (moderadamente resistente, portadora del alelo AnMan) y población 22660 (muy susceptible). La abreviatura hpi significa horas después de la vacunación. Se han eliminado los valores cero para simplificar el gráfico.
El conjunto de genes sobreexpresados ​​a las 6 hpi se analizó para detectar la presencia de dominios canónicos de genes R (Tabla suplementaria S7). Este estudio reveló la inducción del transcriptoma de genes clásicos de resistencia a enfermedades con dominios NBS-LRR solo en 83A:476. Este conjunto consistió en un gen TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), cinco genes CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 y tanjilg_16162), y cuatro NBS-LR, Tanjilg_16162), y cuatro NBS-LRRE (tanjilg_16162), así como cuatro NBS-Lrr (tanjilg_16162) y cuatro NBS-LRR (TANJILG_16162). Todos estos genes tienen dominios canónicos dispuestos en secuencias conservadas. Además de los genes del dominio NBS-LRR, varias quinasas RLL se activaron a las 6 hpi, concretamente una en Boregine (TanjilG_19877), dos en Mandelup (TanjilG_07141 y TanjilG_19877) y en la población 22660 (TanjilG_09014 y TanjilG_10361) y dos en 83A 27:476.
Los genes cuya expresión se vio significativamente alterada en respuesta a la inoculación con C. lupini (cepa Col-08) fueron sometidos a un análisis de enriquecimiento de ontología génica (GO) (Tabla complementaria S8). El término de proceso biológico más frecuentemente sobrerrepresentado fue “GO:0006952 respuesta de defensa”, que apareció en 6 de 16 combinaciones (tiempo × línea) con alta significancia (valor P < 0,001) (Fig. 2). El término de proceso biológico más frecuentemente sobrerrepresentado fue “GO:0006952 respuesta de defensa”, que apareció en 6 de 16 combinaciones (tiempo × línea) con alta significancia (valor P < 0,001) (Fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). El término de proceso biológico más frecuentemente sobrerrepresentado fue 'GO:0006952 respuesta de defensa', que apareció en 6 de 16 combinaciones (tiempo × linaje) con alta significancia (valor P < 0,001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 El término de proceso biológico más representativo es “GO:0006952 respuesta de defensa”, que aparece en 6 de las 16 combinaciones (tiempo × línea), con alta significancia (valor P < 0,001) (Figura 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», который появлялся в 6 и 16 combinado (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). El término de proceso biológico más frecuentemente sobrerrepresentado fue 'GO:0006952 Defense Response', que apareció en 6 de 16 combinaciones (tiempo × línea) con alta significancia (valor P < 0,001) (Fig. 2).Este término estuvo sobrerrepresentado en dos momentos en 83A: 476 y Boregine (6 y 24 hpi) y en un momento en Mandelup y Population 22660 (12 y 6 hpi, respectivamente). Este es un resultado esperado, que resalta la respuesta antifúngica de las líneas resistentes. Además, 83A:476 respondió a C. lupini induciendo rápidamente genes relacionados con el estallido oxidativo representado por el término “GO:0055114 redox process”, lo que indica una respuesta de defensa específica, mientras que Boregine reveló respuestas de defensa específicas, relacionadas con el término “GO”. :0006950 Respuesta al estrés”. La población 22660 activó la respuesta de resistencia horizontal que involucra metabolitos secundarios, destacando el número excesivo de términos “GO:0016104 Proceso de biosíntesis de triterpenos” y “GO:0006722 Proceso de metabolismo de triterpenos” (ambos términos pertenecen al mismo conjunto de genes), teniendo en cuenta los resultados del análisis de enriquecimiento de términos GO, la estabilidad de la reacción de Mandelup fue entre Boregine y la población 22660. Además, la reacción temprana 83A:476 (6 hpi) y la reacción tardía de Mandelup y la población 22660 incluyen el término GO:0015979 'fotosíntesis' y otros procesos biológicos relacionados.
Los términos de ontología génica de bioprocesos seleccionados en la anotación de genes expresados ​​diferencialmente durante las respuestas transcriptómicas del lupino de hoja estrecha (NLL) inoculado con lupino con ántrax (cepa Col-08 obtenida de campos de lupino en Wierzhenice, Polonia, en 1999) están muy exagerados. Las líneas de NLL analizadas fueron: 83A:476 (resistente, portadora del alelo homocigoto Lanr1), Boregine (resistente, con fondo genético desconocido), Mandelup (moderadamente resistente, portadora del alelo homocigoto AnMan) y la población 22660 (susceptible).
Dado que este estudio tenía como objetivo identificar genes que contribuyen a la resistencia a la antracnosis, se analizaron los genes asignados a los términos GO “GO: 0006952 Respuestas defensivas” y “GO: 0055114 Procesos redox” con umbrales de referencia de medias ≥ 30 con al menos una línea. × punto en el tiempo combinando valores estadísticamente significativos de log2 (cambio de pliegue). El número de genes que cumplían estos criterios fue de 65 para GO:0006952 y de 524 para GO:0055114.
83A:476 reveló dos picos DEG anotados con el término GO:0006952, el primero en 6 genes por pulgada (64 genes, regulación al alza y a la baja) y el segundo en 24 genes por pulgada (15 genes, solo regulación al alza). Boregine también mostró que GO:0006952 alcanzó su pico en el mismo punto temporal, pero con menos DEG (11 y 8) y activación preferencial. Mandeloop mostró dos picos de GO:0006952 en 12 y 48 HPI, ambos con 12 genes (el primero con genes activadores y el segundo solo con genes supresores), mientras que la población 22660 en 6 HPI (13 genes) tuvo un mayor predominio del pico de regulación de aumento. Cabe señalar que el 96,4% de los DEG GO:0006952 en estos picos tuvieron el mismo tipo de respuesta (al alza o a la baja), lo que indica una superposición significativa en las respuestas de defensa a pesar de las diferencias en el número de genes involucrados. El grupo más grande de secuencias relacionadas con el término GO:0006952 codifica la proteína 22 asociada al estrés por inanición (similar a SAM22), que pertenece al clado de proteínas asociadas a la patogénesis de clase 10 (PR-10) y a la proteína central látex. proteína similar (similar a MLP) (Fig. 3). Los dos grupos difirieron en la naturaleza de la expresión y la dirección de la respuesta. Los genes que codifican las proteínas similares a SAM22 mostraron una inducción consistente y significativa en los primeros puntos de tiempo (6 o 12 hpi) y generalmente no respondieron al final del experimento (48 hpi), mientras que las proteínas similares a MLP mostraron coordinación a las 6 hpi. hpi. 83A:476 y Mandelup a las 48 hp/in, casi todos los demás puntos de datos no respondieron. Además, las diferencias en los perfiles de expresión de los genes de la proteína SAM22 siguieron la variabilidad observada en la resistencia a la antracnosis, ya que las líneas más resistentes presentaron más puntos temporales que indujeron significativamente estos genes que las líneas más susceptibles. Otro gen PR-10 similar a LlR18A/B mostró un patrón de expresión muy similar al del gen de la proteína SAM22.
Se identificaron los componentes principales del término de proceso biológico “GO:0006952 Respuesta de Defensa” y los patrones de expresión de los genes candidatos de los alelos Lanr1 y AnMan. La escala Log2 representa los valores log2 (cambio de pliegue) entre las plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtenida de campos de lupino, Wizhenica, Polonia, 1999) y las plantas control (inoculadas simuladamente) en el mismo punto temporal. Se analizaron las siguientes líneas de lupino de hoja estrecha: 83A:476 (resistente, portadora del alelo Lanr1 homocigoto), Boregine (resistente, fondo genético desconocido), Mandelup (moderadamente resistente, portadora del alelo AnMan homocigoto) y Población 22660 (susceptible).
Además, se evaluaron los perfiles de expresión de los genes candidatos de RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) y AnMan (TanjilG_12861) (Fig. 3). El gen TanjilG_05042 mostró una respuesta significativa (activación) en 83A:476 solo en el primer punto temporal (6 hpi), mientras que TanjilG_12861 fue significativo en Mandeloop solo en dos puntos temporales: 6 hpi (regulación negativa) y 24 hpi (6 hpi). Con.). ajustable) ).
Los genes más sobreexpresados ​​en el término GO:0055114 “proceso redox” fueron genes que codifican proteínas citocromo P450 y peroxidasa (Fig. 4). Para muestras aisladas de 83A:476 a las 6 HPI, los valores log2 (cambio de pliegue) máximos o mínimos (para el 86,6% de los genes) se observaron generalmente entre plantas inoculadas y control, lo que resalta la alta respuesta de este genotipo al sexo de inoculación. 83A:476 mostró el DEG GO: 0055114 más significativo a las 6 hpi (503 genes), mientras que el resto de las líneas a las 48 hpi (Boregine, 31 genes; Mandelup, 85 genes; y Población 22660, 78 genes)). En la mayoría de los genes de la familia GO:0055114, se observaron dos tipos de respuestas a la vacunación (activación e inhibición). Curiosamente, hasta el 97,6% de los DEG identificados para el término GO: 0055114 en Mandelupe a las 48 hp. Estas observaciones sugieren que, a pesar de la escala significativamente menor (es decir, el número de genes redox mutados, 85 frente a 503), el patrón de respuestas transcriptómicas tardías de mandelup a la antracnosis es similar a la respuesta temprana de 83A:476. En Boregine y la Población 22660, esta convergencia es menor, del 51,6% y del 75,6%, respectivamente.
Se revelaron los patrones de expresión de los componentes principales del término del proceso biológico “GO:0055114 Proceso Redox”. La escala Log2 representa los valores log2 (cambio de pliegue) entre las plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtenida de campos de lupino, Wizhenica, Polonia, 1999) y las plantas control (inoculadas simuladamente) en el mismo punto temporal. Se analizaron las siguientes líneas de lupino de hoja estrecha: 83A:476 (resistente, portadora del alelo homocigoto Lanr1), Boregine (resistente, fondo genético desconocido), Mandelup (moderadamente resistente, portadora del alelo homocigoto AnMan) y Población 22660 (susceptible).
83A:476 Las respuestas transcriptómicas a la inoculación con C. lupini (cepa Col-08) también incluyeron el silenciamiento coordinado de genes atribuidos al término GO:0015979 “fotosíntesis” y otros procesos biológicos relacionados (FIG. 5). Este conjunto de DEG GO:0015979 contenía 105 genes que fueron significativamente reprimidos a las 6 hpi en 83A:476. En este subconjunto, 37 genes también fueron regulados a la baja en Mandelup a las 48 HPI y 35 en el mismo punto temporal en la población 22660, incluyendo 19 DEG comunes a ambos genotipos. Ningún DEG relacionado con el término GO: 0015979 fue activado significativamente en ninguna combinación (línea x tiempo).
Se revelaron los patrones de expresión de los componentes principales del término del proceso biológico “GO:0015979 Fotosíntesis”. La escala Log2 representa los valores log2 (cambio relativo) entre las plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtenida de campos de lupino, Wizhenica, Polonia, 1999) y las plantas control (inoculadas simuladamente) en el mismo punto temporal. Se analizaron las siguientes líneas de lupino de hoja estrecha: 83A:476 (resistente, portadora del alelo homocigoto Lanr1), Boregine (resistente, fondo genético desconocido), Mandelup (moderadamente resistente, portadora del alelo homocigoto AnMan) y Población 22660 (susceptible).
Basándose en los resultados del análisis de expresión diferencial y presumiblemente involucrados en las respuestas de defensa contra hongos patógenos, este conjunto de siete genes fue seleccionado para la cuantificación de perfiles de expresión mediante PCR en tiempo real (Tabla complementaria S9).
El gen de la proteína putativa TanjilG_10657 se indujo significativamente en todas las líneas y puntos de tiempo estudiados en comparación con las plantas control (mimic) (Tablas suplementarias S10, S11). Además, el perfil de expresión de TanjilG_10657 mostró una tendencia creciente a lo largo del experimento para todas las líneas. La población 22660 mostró la mayor sensibilidad de TanjilG_10657 a la inoculación con una activación de 114 veces y el nivel de expresión relativa más alto (4,4 ± 0,4) a las 24 HPI (Fig. 6a). El gen de la proteína PR10 LlR18A TanjilG_27015 también mostró activación en todas las líneas y puntos de tiempo, con significancia estadística en la mayoría de los puntos de datos (Fig. 6b). De forma similar a TanjilG_10657, el nivel de expresión relativa más alto de TanjilG_27015 se observó en la población inoculada 22660 a las 24 HPI (19,5 ± 2,4). El gen de la endoquitinasa ácida TanjilG_04706 se reguló positivamente de forma significativa en todas las líneas y en todos los puntos de tiempo excepto en Boregine a las 6 hpi (Fig. 6c). Se indujo fuertemente en el primer punto de tiempo (6 HPI) en 83A:476 (10,5 veces) y aumentó moderadamente en otras líneas (6,6-7,5 veces). Durante el experimento, la expresión de TanjilG_04706 se mantuvo en niveles similares en 83A:476 y Boregine, mientras que en Mandelup y la población 22660 aumentó significativamente, alcanzando valores relativamente altos (5,9 ± 1,5 y 6,2 ± 1,5, respectivamente). El gen TanjilG_23384, similar a la endoglucano-1,3-β-glucosidasa, mostró una alta activación en los dos primeros puntos temporales (6 y 12 hpi) en todas las líneas excepto en la población 22660 (Fig. 6d). Los niveles de expresión relativa más altos de TanjilG_23384 se observaron en el segundo punto temporal (12 hpi) en Mandelup (2,7 ± 0,3) y 83A:476 (1,5 ± 0,1). A las 24 hpi, la expresión de TanjilG_23384 fue relativamente baja en todas las líneas estudiadas (de 0,04 ± 0,009 a 0,44 ± 0,12).
Perfiles de expresión de genes seleccionados (ag) revelados mediante PCR cuantitativa. Los números 6, 12 y 24 representan las horas posteriores a la vacunación. Los genes LanDExH7 y LanTUB6 se utilizaron para la normalización, y LanTUB6 para la calibración entre series. Las barras de error representan la desviación estándar basada en tres réplicas biológicas, cada una de las cuales es el promedio de tres réplicas técnicas. La significación estadística de las diferencias en los niveles de expresión entre las plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtenida en 1999 del campo de lupinos de Wierzenica, Polonia) y las plantas de control (inoculadas simuladamente) se indican encima de los puntos de datos (*P valor < 0,05, **P valor ≤ 0,01, ***P valor ≤ 0,001). La significación estadística de las diferencias en los niveles de expresión entre las plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtenida en 1999 del campo de lupinos de Wierzenica, Polonia) y las plantas de control (inoculadas simuladamente) se indican encima de los puntos de datos (*P valor < 0,05, **P valor ≤ 0,01, ***P valor ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инакулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен в 1999 г. с поля люпина в Верженице, Польша) y контрольными (ложно инакулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Las diferencias estadísticamente significativas en los niveles de expresión entre las plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtenida en 1999 de un campo de lupino en Wierzhenice, Polonia) y las plantas de control (inoculadas simuladamente) se indican encima de los puntos de datos (*valor P < 0,05, **valor P ≤ 0,01, ***valor P ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini,Col-08株,1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001)。接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物 之间水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инакулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инакулированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Se observan diferencias estadísticamente significativas en los niveles de expresión entre las plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtenida de campos de lupino en Verzhenice, Polonia, en 1999) y las plantas de control (inoculadas simuladamente) encima de los puntos de datos (*valor P < 0,05, **valor P ≤ 0,01, ***valor P ≤ 0,001).Las líneas NLL analizadas fueron: 83A:476 (resistente, portadora del alelo homocigoto Lanr1), Mandelup (moderadamente resistente, portadora del alelo homocigoto AnMan), Boregine (resistente, con antecedentes genéticos desconocidos) y la población 22660 (susceptible).
El gen candidato TanjilG_05042 en el locus Lanr1 mostró un patrón de expresión marcadamente diferente de los perfiles obtenidos en estudios de RNA-seq (Fig. 6e). Se observó una activación significativa de este gen en Mandelup y la población 22660 (hasta 39,7 y 11,7 veces, respectivamente), lo que resultó en niveles de expresión relativamente altos (hasta 1,4 ± 0,14 y 7,2 ± 1,3, respectivamente). 83A:476 también reveló cierta regulación positiva del gen TanjilG_05042 (hasta 3,8 veces), sin embargo, los niveles de expresión relativa alcanzados (0,044 ± 0,002) fueron más de 30 veces inferiores a los observados en Mandelup y la población 22660. El análisis mediante qPCR mostró diferencias significativas en los niveles de expresión entre genotipos en variantes no vacunadas (control), alcanzando una diferencia de 58 veces entre las poblaciones 22660 y 83A:476, así como entre las poblaciones 22660 y 22660. Se logró una diferencia de dos veces entre Boregine y Mandalup.
El gen candidato en el locus AnMan, TanjilG_12861, se activó en respuesta a la vacunación en 83A:476 y Mandelup, fue neutro en la población 22660 y se reguló negativamente en Boregine (Fig. 6f). La expresión relativa del gen TanjilG_12861 fue la más alta en 83A:476 inoculado (0,14 ± 0,01). El gen de la proteína de choque térmico de clase I de 17,4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 mostró niveles de expresión relativa más bajos en todas las cepas y puntos de tiempo estudiados (Fig. 6g). El valor más alto se observó a las 24 HPI en la población 22660 (0,14 ± 0,02, un aumento de ocho veces en respuesta a la vacunación).
La comparación de los perfiles de expresión génica (Fig. 7) reveló una alta correlación entre TanjilG_10657 y otros cuatro genes: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) y TanjilG_04706 (r = 0,79). Estos resultados podrían indicar una corregulación de estos genes durante las respuestas de defensa. Los genes TanjilG_12861 y TanjilG_23384 mostraron perfiles de expresión diferentes con coeficientes de correlación de Pearson más bajos (de 0,08 a 0,43 y de -0,19 a 0,28, respectivamente) en comparación con los demás genes.
Se detectaron correlaciones entre los perfiles de expresión génica mediante PCR cuantitativa. Se analizaron las siguientes líneas de lupino de hoja estrecha: 83A:476 (resistente, portadora del alelo homocigoto Lanr1), Mandelup (moderadamente resistente, portadora del alelo homocigoto AnMan), Boregine (resistente, con fondo genético desconocido) y la Población 22660 (susceptible). Se calcularon tres puntos temporales (6, 12 y 24 horas después de la inoculación), incluyendo plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtenida de campos de lupino en Wierzhenice, Polonia, en 1999) y plantas control (inoculadas simuladamente). La escala muestra el valor del coeficiente de correlación de Pearson.
Con base en datos obtenidos a 6 caballos de fuerza por pulgada, se realizó un análisis WGCNA en 9981 genes diferencialmente expresados ​​(DEG) identificados mediante la comparación de plantas inoculadas y de control para centrarse en las respuestas de defensa tempranas (Tabla complementaria S12). Se encontraron veintidós módulos genéticos (grupos) con perfiles de expresión correlacionados (positivos o negativos) entre genotipos y variantes experimentales. En promedio, los niveles de expresión genética fueron descendentes en el orden 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (en ambas variantes, sin embargo, esta tendencia fue más fuerte en las plantas de control). En promedio, los niveles de expresión genética fueron descendentes en el orden 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (en ambas variantes, sin embargo, esta tendencia fue más fuerte en las plantas de control). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Población 22660 (в обоих вариантах, однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). En promedio, los niveles de expresión genética disminuyeron en el orden 83A:476 > Mandelup > Boregine > Población 22660 (en ambas variantes, sin embargo, esta tendencia fue más pronunciada en las plantas de control).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Población 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> población 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种 在 在植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Población 22660 (однако в обоих вариантах эта тенденция была сильнее у контрольных растений). En promedio, los niveles de expresión genética disminuyeron en la serie 83A:476 > Mandelup > Boregine > Población 22660 (sin embargo, en ambas variantes, esta tendencia fue más pronunciada en las plantas de control).La vacunación resultó en una regulación positiva de la expresión génica, especialmente en los módulos 18, 19, 14, 6 y 1 (en orden descendente de efecto), regulación negativa (por ejemplo, módulos 9 y 20) o con efectos neutros (por ejemplo, módulos 11, 22, 8 y 13). El análisis de enriquecimiento de términos GO (Tabla suplementaria S13) reveló "GO: 0006952 Respuestas protectoras" para el módulo inoculado (18) con activación máxima, incluidos los genes analizados por qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 y TanjilG_27015), así como muchos módulos de fotosíntesis más suprimidos por la inoculación (9). El concentrador del módulo 18 (Fig. 8) se identificó como el gen TanjilG_26536 que codifica la proteína LlR18B similar a PR-10, y el concentrador del módulo 9 se identificó como el gen TanjilG_28955 que codifica la proteína PsbQ del fotosistema II. Un gen candidato de resistencia a la antracnosis Lanr1, TanjilG_05042, se encontró en el módulo 22 (Fig. 9) y está asociado con los términos “GO:0044260 Procesos metabólicos macromoleculares celulares” y “GO:0006355 Regulación transcripcional, plantilla de ADN” que contiene el hub TanjilG_01212. El gen codifica el factor de transcripción de estrés térmico A-4a (HSFA4a).
Análisis de red ponderado de la coexpresión génica de módulos con términos de procesos biológicos sobrerrepresentados “GO: 0006952 Respuestas de defensa”. La ligación se simplificó para resaltar los cuatro genes analizados por qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 y TanjilG_27015).
Análisis de red ponderada de la coexpresión génica de un módulo con un término de proceso biológico sobrerrepresentado “GO: 0006355: Regulación transcripcional, plantilla de ADN” y que contiene un gen candidato de resistencia a la antracnosis Lanr1 TanjilG_05042. La ligación se simplificó para aislar el gen TanjilG_05042 y el gen central TanjilG_01212.
Las pruebas de resistencia a la antracnosis realizadas en Australia mostraron que la mayoría de los cultivares liberados tempranamente eran susceptibles; Kalya, Coromup y Mandelup se han descrito como moderadamente resistentes, mientras que Wonga, Tanjil y 83A:476 se han descrito como altamente resistentes26,27,31. tenían el mismo alelo de resistencia, denominado Lanr1, y Coromup y Mandelup tenían un alelo diferente, denominado AnMan10, 26, 39, mientras que Kalya transmitió un alelo diferente, Lanr2. Las pruebas de resistencia a la antracnosis en Alemania dieron como resultado la identificación de una línea resistente Bo7212 con un alelo candidato distinto de Lanr1, denominado LanrBo36.
Nuestro estudio reveló una frecuencia muy baja (alrededor del 6%) del alelo Lanr1 en el germoplasma analizado. Esta observación concuerda con los resultados del análisis de germoplasma de Europa del Este mediante los marcadores Anseq3 y Anseq4, que mostraron que el alelo Lanr1 está presente únicamente en dos líneas bielorrusas. Esto sugiere que el alelo Lanr1 aún no se utiliza ampliamente en los programas de mejoramiento genético locales, a diferencia de Australia, donde es uno de los alelos clave para el mejoramiento asistido por marcadores. Esto podría deberse al menor nivel de resistencia que proporciona el alelo Lanr1 en condiciones de campo europeas en comparación con el informe australiano. Además, estudios sobre la antracnosis en zonas de alta pluviosidad en Australia han demostrado que las respuestas de resistencia mediadas por el alelo Lanr1 podrían no ser efectivas en condiciones climáticas que favorecen el crecimiento y el rápido desarrollo del patógeno19,42. De hecho, en el presente estudio, también se observaron algunos síntomas de antracnosis en genotipos portadores del alelo Lanr1, lo que sugiere que la resistencia podría desaparecer en condiciones óptimas para el desarrollo de C. lupini. Además, son posibles interpretaciones falsas positivas de la presencia de los marcadores Anseq3 y Anseq4, que se encuentran aproximadamente a 1 cM del locus Lanr1 28,30,43 .
Nuestro estudio mostró que 83A:476, portador del alelo Lanr1, respondió a la inoculación de C. lupini con una reprogramación transcriptómica a gran escala en el primer punto de tiempo analizado (6 hpi), mientras que en Mandelup, portador del alelo AnMan, las respuestas transcriptómicas se observaron mucho más tarde (de 24 a 48 hp). Estas variaciones temporales en las respuestas de defensa están asociadas con diferencias en los síntomas de la enfermedad, lo que resalta la importancia del reconocimiento temprano del patógeno para una respuesta exitosa a la resistencia. Para infectar el tejido vegetal, las esporas de ántrax deben pasar por varias etapas de desarrollo en la superficie del huésped, incluyendo la germinación, la división celular y la formación de un apresorio. Un apéndice es una estructura infecciosa que se adhiere a la superficie del huésped y facilita la penetración en los tejidos del huésped. Así, las esporas de C. gloeosporioides en extracto de guisante mostraron la primera división del núcleo después de 75-90 minutos de incubación, la formación de un tubo germinativo después de 90-120 minutos y la supresión después de 4 horas 45. Mango C. gloeosporioides mostró más del 40% de germinación de conidios después de 3 horas de incubación y alrededor del 20% de formación de apresorios después de 4 horas. El gen CAP20 asociado a la virulencia de C. gloeosporioides mostró actividad transcripcional en conidios formadores de epífitas después de 3,5 h de incubación en cera de superficie de aguacate con altas concentraciones de proteína CAP20 después de 4 h 46 min. De manera similar, la actividad de los genes de biosíntesis de melanina en C. trifolii se indujo durante una incubación de 2 horas seguida de la formación de un apresorio después de 1 hora. Estudios de tejidos foliares han demostrado que las fresas inoculadas con C. acutatum tienen la primera supresión a las 8 hpi, mientras que los tomates inoculados con C. coccodes tienen la primera supresión a las 4 hpi48,49. en gran medida consistente con la escala de tiempo del proceso infeccioso de Colletotrichum spp. Las respuestas de defensa rápidas a 83A:476 sugieren la participación de genes de resistencia de la planta e inmunidad desencadenada por efectores (ETI) en esta línea, mientras que las respuestas tardías de Mandelup apoyan la hipótesis de inmunidad desencadenada por patrones moleculares microasociados (MTI) 50. Respuestas tempranas a 83A:476 y Mandelup. La superposición parcial entre genes regulados al alza o a la baja en la respuesta tardía también apoya este concepto, ya que la ETI a menudo se considera una respuesta MTI acelerada y mejorada que culmina en la muerte celular programada en el sitio de infección, conocida como choque anafiláctico 51,52.
La mayoría de los genes atribuidos al término sobrerrepresentado de Gene Ontology GO:0006952 “Respuesta de defensa” son los 11 homólogos de la proteína 22 del mensaje de ayuno inducido por estrés (similar a SAM22) y las siete proteínas principales similares a las del látex (MLP). Las proteínas similares 31, 34, 43 y 423 mostraron similitud de secuencia. Los genes similares a SAM22 mostraron una activación significativa que duró más tiempo, mostrando mayores niveles de resistencia a la antracnosis (83A:476 y Boregine). Sin embargo, los genes similares a MLP se regularon negativamente solo en líneas que portaban el alelo de resistencia candidato (83A:476/Lanr1 a las 6 hpi y Mandelup/AnMan a las 24 hpi). Cabe señalar que todos los homólogos similares a SAM22 identificados se originan de un grupo de genes que abarca aproximadamente 105 kb, mientras que los genes similares a MLP se originan de regiones separadas del genoma. En nuestro estudio previo sobre la resistencia de NLL a la inoculación con Diaporthetoxica, también se observó la activación coordinada de genes similares a SAM22, lo que sugiere su participación en los componentes horizontales de la respuesta de defensa. Esta conclusión se ve respaldada, además, por informes que indican una respuesta positiva de los genes similares a SAM22 ante lesiones o tratamientos con ácido salicílico, inductores fúngicos o peróxido de hidrógeno.
Se ha demostrado que los genes tipo MLP responden a diversos estreses abióticos y bióticos, incluidas infecciones bacterianas, virales y fúngicas patógenas en muchas especies de plantas55. Las direcciones de respuesta a ciertas interacciones entre plantas y patógenos variaron desde un fuerte aumento (es decir, durante la infestación del algodón con Verticillium dahliae) hasta una disminución significativa (es decir, después de la infección del manzano con Alternaria spp.)56,57. Se ha observado una regulación negativa significativa del gen tipo MLP 423 durante las defensas del aguacate a la infección por F. niger y durante la infección del manzano Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola y Alternaria alternata son patotipos del manzano58,59. Además, los callos de manzano que sobreexpresan el gen tipo MLP 423 tuvieron una menor expresión de genes asociados a la resistencia y fueron más susceptibles a la infección fúngica59. Después de Fusarium oxysporum f, el gen tipo MLP 423 también se suprimió en germoplasma de frijol común resistente. cn. Infección de frijoles 60.
Otros miembros de la familia PR-10 identificados en nuestro estudio de RNA-seq fueron los genes LlR18A y LlR18B en respuesta a la regulación positiva, así como el gen regulado positivamente (1 gen) o regulado negativamente (3 genes) para la proteína de transferencia de lípidos DIR1. . Además, WGCNA destaca el gen LlR18B como un nodo en este módulo, que es altamente susceptible a la vacunación y contiene varios genes de respuesta protectora. Los genes LlR18A y LlR18B se indujeron en hojas de lupino amarillo en respuesta a bacterias patógenas, así como en tallos de NLL después de la inoculación de D. toxica, mientras que el homólogo de arroz de estos genes, RSOsPR10, se indujo rápidamente por una infección fúngica presumiblemente involucrada en la vía de señalización del ácido jasmónico53,61, 62. El gen DIR1 codifica proteínas de transporte de lípidos no específicas que son necesarias para el inicio de la resistencia sistémica adquirida (SAR). Con el desarrollo de reacciones protectoras, la proteína DIR1 se transporta desde el foco de infección a través del floema para inducir SAR en órganos distantes. Curiosamente, el gen DIR1 TanjilG_02313 se indujo significativamente en el primer punto de tiempo en las líneas 84A:476 y la Población 22660, pero la resistencia a la antracnosis se desarrolló con éxito solo en la línea 84A:476. Esto puede indicar cierta subfuncionalización del gen DIR1 en NLL, ya que los tres homólogos restantes respondieron a la inoculación solo en la línea 83A:476 a las 6 hpi, y esta respuesta se dirigió hacia abajo.
En nuestro estudio, los componentes más comunes correspondientes al proceso biológico denominado “GO:0055114 Proceso Redox” fueron la proteína citocromo P450, la peroxidasa, la lipoxigenasa del ácido linoleico 9S/13S y la oxidasa del ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico. Además, nuestro análisis WGCNA define al homólogo de HSFA4a como un nodo central que contiene módulos como el gen candidato de resistencia Lanr1, TanjilG_05042. HSFA4a es un componente de la regulación redox-dependiente de la transcripción nuclear en plantas.
Las proteínas del citocromo P450 son oxidorreductasas que catalizan reacciones de hidroxilación dependientes de NADPH y/o O2 en el metabolismo primario y secundario, incluyendo el metabolismo de xenobióticos, así como hormonas, ácidos grasos, esteroles, componentes de la pared celular, biopolímeros y la biosíntesis de compuestos protectores 69. En nuestro En un estudio, la variabilidad en la función del citocromo P450 de plantas se redujo de -10,6 log2 (cambio de pliegue) a 5,7 debido a una gran cantidad de homólogos alterados (37) y diferencias en los patrones de respuesta entre genes específicos, lo que refleja una revisión ascendente. . Utilizar solo datos de RNA-seq para dilucidar la función biológica putativa de los genes NLL en una superfamilia de proteínas tan grande sería altamente especulativo. Sin embargo, vale la pena señalar que algunos genes del citocromo P450 están asociados con una mayor resistencia a hongos o bacterias patógenas, incluyendo una contribución a reacciones alérgicas69,70,71.
Las peroxidasas de clase III son enzimas vegetales multifuncionales involucradas en una amplia gama de procesos metabólicos durante el crecimiento y desarrollo de las plantas, así como en respuesta a estrés ambiental como salinidad, sequía, alta intensidad lumínica y ataque de patógenos72. Las peroxidasas están involucradas en la interacción de varias especies de plantas con Anthracis, incluyendo Stylosanthes humilis y C. gloeosporioides, Lens culinaris y C. truncatum, Phaseolus vulgaris y C. lindemuthianum, Cucumis sativus y C. lagenarium73,74,75,76. La respuesta es muy rápida, a veces incluso a las 4 HPI, antes de que el hongo penetre en el tejido vegetal73. El gen de la peroxidasa también respondió a la inoculación con D. toxica NLL. Además de sus funciones típicas de regular el estallido oxidativo o eliminar el estrés oxidativo, las peroxidasas pueden interferir con el crecimiento de patógenos al crear barreras físicas basadas en el refuerzo de la pared celular durante la lignificación, subunidad o entrecruzamiento de compuestos específicos. Esta función puede atribuirse in silico al gen TanjilG_03329 que codifica una supuesta peroxidasa aniónica formadora de lignina que se reguló positivamente de forma significativa en nuestro estudio en la línea resistente 83A:476 a las 6 HPI, pero no en otras cepas y puntos de tiempo que no respondieron.
La 9S-/13S-lipoxigenasa del ácido linoleico es el primer paso en la vía oxidativa de la biosíntesis de lípidos78. Los productos de esta vía tienen múltiples funciones en la defensa de las plantas, incluyendo el fortalecimiento de la pared celular a través de la formación de depósitos de calosa y pectina, y la regulación del estrés oxidativo a través de la producción de especies reactivas de oxígeno79,80,81,82,83. En el presente estudio, la expresión de la 9S-/13S-lipoxigenasa del ácido linoleico se alteró en todas las cepas, pero en la población susceptible 22660, la regulación positiva prevaleció en diferentes momentos, mientras que en las cepas que portan el alelo resistente Lanr1 y el alelo AnMan, se enfatiza la diversificación de la capa de oxilipinas en las reacciones protectoras del ántrax entre estos genotipos.
El homólogo de la 1-aminociclopropano-1-carboxilato oxidasa (ACO) se reguló significativamente al alza (9 genes) o a la baja (2 genes) cuando se inoculó con lupino. Con dos excepciones, todas estas respuestas ocurrieron a las 6 hp. en 83A:476. La reacción enzimática mediada por las proteínas ACO es el paso limitante de la velocidad en la producción de etileno y, por lo tanto, está altamente regulada84. El etileno es una hormona vegetal que desempeña diversas funciones en la regulación del desarrollo de las plantas y la respuesta a condiciones de estrés abiótico y biótico. La inducción de la transcripción de ACO y la activación de la vía de señalización del etileno están involucradas en el aumento de la resistencia del arroz al hongo hemibiotrófico oryzae oryzae mediante la regulación de la producción de especies reactivas de oxígeno y fitoalexinas. Un proceso de infección foliar muy similar encontrado entre M. oryzae y C. lupini88,89, en el contexto de una regulación positiva significativa de los homólogos de ACO en la línea 83A:476 reportada en este estudio, cambia la posibilidad de conferir resistencia a la antracnosis NLL. El etileno es un paso central de señalización en las vías moleculares.
En el presente estudio, se observó una supresión a gran escala de muchos genes asociados con la fotosíntesis a las 6 hpi en 83A:476 y a las 48 hpi en Mandeloop y la población 22660. La extensión y progresión de estos cambios es proporcional al nivel. Se observó resistencia a la antracnosis en este experimento. Recientemente, se ha informado de una fuerte y temprana represión de transcritos relacionados con la fotosíntesis en varios modelos de interacciones planta-patógeno, incluyendo bacterias y hongos patógenos. La prisa (desde 2 HPI en algunas interacciones) y la supresión global de genes asociados con la fotosíntesis en respuesta a la infección pueden desencadenar inmunidad vegetal basada en el despliegue de especies reactivas de oxígeno y su interacción con la vía del ácido salicílico para mediar reacciones alérgicas 90,94.
En conclusión, los mecanismos de respuesta de defensa propuestos para el linaje más resistente (83A:476) incluyen el reconocimiento rápido del patógeno por el gen R (presumiblemente TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) y la señalización de ácido salicílico y etileno mediada por la respuesta alérgica, seguida del establecimiento de SAR de largo alcance. La acción está respaldada por la proteína DIR-1. Cabe señalar que el período biotrófico para la infección por C. lupini es muy corto (aproximadamente 2 días), seguido de crecimiento necrótico95. La transición entre estas etapas puede estar asociada con la necrosis y la expresión de proteínas inducibles por etileno que actúan como desencadenantes de reacciones de hipersensibilidad en las plantas hospedantes. Por lo tanto, la ventana de tiempo para la captura exitosa de C. lupini en la etapa biotrófica es muy estrecha. La reprogramación de genes asociados con el redox y la fotosíntesis observada en 83A:476 a las 6 horas post-inoculación es consistente con la progresión de las hifas fúngicas y anuncia el desarrollo de una respuesta protectora exitosa en la etapa biotrófica. Las respuestas transcriptómicas de Mandelup y la población 22660 podrían estar demasiado retrasadas para capturar el hongo antes de que cambie a crecimiento necrótico; sin embargo, Mandelup podría ser más eficaz que la población 22660 debido a que la regulación relativamente rápida de la proteína PR-10 promueve la resistencia horizontal.
La ETI, impulsada por el gen R canónico, parece ser un mecanismo común de resistencia del frijol a la antracnosis. Así, en la leguminosa modelo Medicago truncatula, la resistencia a la antracnosis está conferida por el gen RCT1, un miembro de la clase de genes R de plantas TIR-NBS-LRR97. Este gen también confiere resistencia de amplio espectro a la antracnosis en la alfalfa cuando se transfiere a plantas susceptibles. En el frijol común (P. vulgaris), se han identificado hasta la fecha más de dos docenas de genes de resistencia a la antracnosis. Algunos de estos genes se encuentran en regiones que carecen de genes R canónicos; sin embargo, muchos otros se localizan en los bordes de los cromosomas que portan el grupo de genes NBS-LRR, incluido TIR-NBS-LRRs99. El estudio de SSR a nivel genómico también confirmó la asociación del gen NBS-LRR con la resistencia a la antracnosis en el frijol común. El gen R canónico también se encontró en la región genómica que contiene el locus principal de resistencia a la antracnosis en el lupino blanco 101.
Nuestro trabajo demuestra que una reacción de resistencia inmediata, activada en una etapa temprana de la infección de la planta (preferiblemente no más tarde de 12 hpi), protege eficazmente al lupino de hoja estrecha de la antracnosis causada por el hongo patógeno Collelotrichum lupini. Mediante secuenciación de alto rendimiento, demostramos perfiles de expresión diferencial de genes de resistencia a la antracnosis en plantas NLL, mediados por los genes de resistencia Lanr1 y AnMan. Una defensa exitosa implica el diseño cuidadoso de los genes para proteínas involucradas en la redox, la fotosíntesis y la patogénesis, a las pocas horas del primer contacto de la planta con un patógeno. Reacciones protectoras similares, pero retrasadas en el tiempo, son mucho menos efectivas para proteger a las plantas de las enfermedades. La resistencia al ántrax mediada por el gen Lanr1 se asemeja a la respuesta rápida típica del gen R (inmunidad desencadenada por efectores), mientras que el gen AnMan probablemente proporciona una respuesta horizontal (inmunidad desencadenada por un patrón molecular asociado a microbios), lo que proporciona un nivel moderado de sostenibilidad.
Las 215 líneas NLL utilizadas para la selección de marcadores de antracnosis consistieron en 74 cultivares, 60 líneas obtenidas por cruzamiento o mejoramiento genético, 5 mutantes y 76 germoplasmas silvestres u originales. Las líneas procedían de 17 países, principalmente de Polonia (58), España (47), Alemania (27), Australia (26), Rusia (19), Bielorrusia (7), Italia (5) y otras líneas de 10 países. El conjunto también incluye líneas de referencia resistentes: 83A:476, Tanjil, Wonga portadora del alelo Lanr1 y Mandelup portadora del alelo AnMan. Las líneas se obtuvieron de la base de datos europea de recursos genéticos de lupino mantenida por Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polonia (Tabla suplementaria S1).
Las plantas se cultivaron en condiciones controladas (fotoperiodo de 16 horas, temperatura de 25 °C durante el día y 18 °C por la noche). Se analizaron dos réplicas biológicas. El ADN se aisló de hojas de tres semanas de edad utilizando el kit DNeasy Plant Mini (Qiagen, Hilden, Alemania) según el protocolo. La calidad y concentración del ADN aislado se evaluaron mediante métodos espectrofotométricos (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Se analizaron el marcador AnManM1 que marca el gen de resistencia a la antracnosis AnMan (derivado del cv. Mandelup) y los marcadores Anseq3 y Anseq4 que flanquean el gen Lanr1 (derivado del cv. Tanjil) 11,26,28. Los homocigotos para el alelo resistente se puntuaron como "1", los susceptibles como "0" y los heterocigotos como 0,5.
Con base en los resultados del cribado de los marcadores AnManM1, AnSeq3 y AnSeq4 y la disponibilidad de semillas para los experimentos de seguimiento finales, se seleccionaron 50 líneas NLL para la fenotipificación de la resistencia a la antracnosis. El análisis se realizó por duplicado en un invernadero controlado por computadora con un fotoperiodo de 14 horas y un rango de temperatura de 22 °C durante el día y 19 °C por la noche. Las semillas se rasparon (cortando la cubierta de la semilla en el lado opuesto al embrión con una cuchilla afilada) antes de la siembra para evitar la latencia de la semilla debido a que la cubierta de la semilla es demasiado dura y para asegurar una germinación uniforme. Las plantas se cultivaron en macetas (11 × 11 × 21 cm) con suelo estéril (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsovia, Polonia). La inoculación se llevó a cabo con la cepa Colletotrichum lupini Col-08, cultivada en 1999 a partir de los tallos de plantas de lupino de hoja estrecha cultivadas en un campo en Verzhenitsa, Gran Polonia (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Obtener un área. Los aislados se cultivaron en medio SNA a 20 °C bajo luz negra durante 21 días para inducir la esporulación. Cuatro semanas después de la siembra, cuando las plantas habían alcanzado la etapa de 4-6 hojas, se llevó a cabo la inoculación mediante pulverización con una suspensión de conidios a una concentración de 0,5 x 10⁶ conidios por ml. Después de la inoculación, las plantas se mantuvieron en la oscuridad durante 24 horas a una humedad de aproximadamente el 98 % y una temperatura de 25 °C para facilitar la germinación de los conidios y el proceso de infección. Las plantas se cultivaron bajo un fotoperiodo de 14 horas a 22 °C de día y 19 °C de noche, con una humedad del 70 %. La puntuación de la enfermedad se realizó 22 días después de la inoculación y osciló entre 0 (inmune) y 9 (muy susceptible), según la presencia o ausencia de lesiones necróticas en tallos y hojas. Además, tras la puntuación, se midió el peso de las plantas. Las relaciones entre los genotipos de los marcadores y los fenotipos de la enfermedad se calcularon como correlaciones de dos secuencias (ausencia de marcadores heterocigotos en el conjunto de líneas para el análisis del fenotipo de resistencia a la antracnosis).