Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik. İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında məhdud CSS dəstəyi var. Ən yaxşı təcrübə üçün yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyinizi (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq Rejimini deaktiv etməyinizi) tövsiyə edirik. Bu vaxt ərzində davamlı dəstəyi təmin etmək üçün saytı stillər və JavaScript olmadan render edəcəyik.
Angustifolius lupin (NLL, Lupinus angustifolius L.) qida istehsalı və torpağın yaxşılaşdırılması üçün istifadə edilən paxlalı bitkidir. NLL-nin bir məhsul kimi qlobal miqyasda genişlənməsi, dağıdıcı antraknoz xəstəliyinə səbəb olan lupin antraknozu da daxil olmaqla bir çox patogen göbələkləri cəlb etmişdir. NLL seleksiyasında artan müqavimət göstərən iki allel, Lanr1 və AnMan, istifadə edilmişdir, lakin əsas molekulyar mexanizmlər naməlum olaraq qalır. Bu tədqiqatda Avropa NLL nümunələrini skrininq etmək üçün Lanr1 və AnMan markerlərindən istifadə edilmişdir. Vaksinin nəzarətli mühitdə sınaqdan keçirilməsi hər iki müqavimətli donorun effektivliyini təsdiqlədi. Diferensial gen ifadəsi profili nümayəndəlikli müqavimətli və həssas xətlərdə aparılmışdır. Antraknoz müqaviməti, gen ontologiyası terminlərinin "GO:0006952 Müdafiə Reaksiyası", "GO:0055114 Redoks Prosesi" və "GO:0015979 Fotosintez" ifadələrinin həddindən artıq ifadəsi ilə əlaqələndirilmişdir. Bundan əlavə, Lanr1(83A:476) xətti peyvənddən sonra sürətlə əhəmiyyətli dərəcədə transkriptom yenidən proqramlaşdırması göstərdi, digər xətlər isə bu cavabda təxminən 42 saat gecikmə göstərdi. Müdafiə reaksiyaları TIR-NBS, CC-NBS-LRR və NBS-LRR genləri, patogenezdə iştirak edən 10 zülal, lipid transfer zülalları, endoglukan-1,3-β-qlükozidaza, qlisinlə zəngin hüceyrə divarı zülalları və reaktiv oksigen yolundan gələn genlərlə əlaqələndirilir. Fotosintezlə əlaqəli genlərin diqqətlə basdırılması da daxil olmaqla, 83A:476-ya erkən reaksiyalar göbələk biologiyasının vegetativ böyümə mərhələsində uğurlu qorunma ilə üst-üstə düşdü və bu da effektorun immuniteti tetiklediyini göstərir. Mandeloop reaksiyası, ümumi üfüqi müqavimət kimi yavaşlayır.
Dar yarpaqlı lupin (NLL, Lupinus angustifolius L.) qərbi Aralıq dənizi bölgəsində yaranan yüksək proteinli dənli bitkidir1,2. Hal-hazırda heyvanlar və insanlar üçün qida məhsulu kimi yetişdirilir. Simbiotik azot fiksasiya edən bakteriyalar tərəfindən azot fiksasiyası və torpaq strukturunun ümumi yaxşılaşması səbəbindən əkin dövriyyəsi sistemlərində yaşıl peyin hesab olunur. NLL ötən əsrdə sürətli evcilləşdirmə prosesindən keçib və hələ də yüksək çoxalma təzyiqi altındadır3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. NLL-nin geniş yayılmış becərilməsi ilə patogen göbələklərin ardıcıllığı yeni kənd təsərrüfatı nişləri yaratdı və yeni məhsulu məhv edən xəstəliklərə səbəb oldu. Lupin yetişdiriciləri və yetişdiriciləri üçün ən diqqətəlayiq hal, patogen göbələk olan Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13-ün yaratdığı antraknozun görünüşü idi. Lupin yetişdiriciləri və yetişdiriciləri üçün ən diqqətəlayiq hal, patogen göbələk olan Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13-ün yaratdığı antraknozun görünüşü idi. Fermerlər və selektsionerlər üçün lyupina lyupina tərəfindən əsas götürülür, antraknoza, yüksək patogenlər Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Lupin fermerləri və yetişdiriciləri üçün ən diqqətəlayiq olanı, patogen göbələk Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 tərəfindən törədilən antraknozun ortaya çıxması idi.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它的出现，它的出现，它的出现，它是者来说，最引人注目(Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它的出现，它的出现，它的出现，它是者来说，最引人注目(Bondar)嵵Saçlı。1 Fermerlər və seleksionerlər üçün naibolee поразительным люпина является появление антракноза, патогенными грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Lupin fermerləri və yetişdiriciləri üçün ən çox təəccüblü olan patogen göbələk Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 tərəfindən törədilən antraknozun ortaya çıxmasıdır.Xəstəliyin ilkin məlumatları Braziliya və ABŞ-dan gəlmiş, tipik simptomlar müvafiq olaraq 1912 və 1929-cu illərdə ortaya çıxmışdır. Lakin, təxminən 30 ildən sonra patogen Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz kimi təyin edilmişdir. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld-un teleomorfu. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Hədəflənmiş Morfologiyada Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. və H. Şrenk,. və H. Şrenk, .və H. Şrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。və H. Şlenk,.20-ci əsrin ortalarında aparılan ilkin xəstəlik fenotipləşdirməsi NLL və sarı lupin (L. luteus L.) nümunələrində müəyyən müqavimət göstərdi, lakin sınaqdan keçirilmiş bütün ağ lupin (L. albus L.) nümunələri yüksək həssaslıq göstərdi15,16. Tədqiqatlar göstərdi ki, antraknozun inkişafı yağıntının (hava rütubətinin) və temperaturun (12-28°C diapazonunda) artması ilə əlaqələndirilir və bu da daha yüksək temperaturlarda müqavimətin pozulmasına səbəb olur17, 18. Əslində, konidiyaların cücərməsi və xəstəliyin başlaması üçün tələb olunan vaxt yüksək rütubət şəraitində 12°C-də (16 saat) olduğundan 24°C-də (4 saat) dörd dəfə qısa idi19. Beləliklə, davam edən qlobal istiləşmə antraknozun yayılmasına səbəb olmuşdur. Lakin xəstəlik Fransada (1982) və Ukraynada (1983) yaxınlaşan təhlükənin xəbərçisi kimi müşahidə edilmiş, lakin görünür, o zaman lupin sənayesi tərəfindən nəzərə alınmamışdır20,21. Bir neçə il sonra bu dağıdıcı xəstəlik bütün dünyaya yayıldı və Avstraliya, Polşa və Almaniya kimi əsas lupin istehsal edən ölkələrə də təsir etdi22,23,24. 1990-cı illərin ortalarında antraknoz epidemiyasından sonra geniş skrininq NLL19 nümunələrində bir neçə davamlı donor müəyyən edilməsi ilə nəticələndi. Antraknoza qarşı NLL müqaviməti müxtəlif germ plazma mənbələrində tapılan iki ayrı dominant allel tərəfindən idarə olunur: Tanjil və Wonga kultivarında Lanr1 və Mandalay kultivarında AnMan. 25, 26. Bu allellər seleksiya proqramlarında davamlı germ plazmasının seçilməsini dəstəkləyən molekulyar markerləri tamamlayır25,26,27,28,29,30. Lanr1 allelini daşıyan rezistent çoxalma xətti 83A:476, antraknoz müqavimətinə görə ayrılan RIL populyasiyasını əldə etmək üçün həssas vəhşi xətti P27255 ilə çarpazlaşdırıldı və bu da Lanr1 lokusunun NLL-1131, 32, 33 xromosomuna təyin edilməsini mümkün etdi. Yan müqavimət lokuslarından antraknoza keçid xəritəsi markerlərinin genomik çərçivə ilə uyğunlaşdırılması ilə NLL hər üç allelin eyni xromosomda (NLL-11) yerini, lakin fərqli mövqelərdə olduğunu aşkar etdi29,34,35. Lakin, RIL-lərin sayının az olması və markerlərlə müvafiq allellər arasındakı böyük genetik məsafə səbəbindən onların əsas genləri haqqında etibarlı nəticələr çıxarmaq mümkün deyil. Digər tərəfdən, lupinlərdə tərs genetikanın istifadəsi, çox aşağı regenerasiya potensialına görə çətindir ki, bu da genetik manipulyasiyanı çətinləşdirir37.
İstənilən alleli homozigot vəziyyətində daşıyan ev germ plazmasının, məsələn, 83A:476 (Lanr1) və Mandelup (AnMan) kimi, inkişafı, vəhşi populyasiyalarda əks allel kombinasiyalarının olması qarşısında antraknoz müqavimətini öyrənməyə imkan yaratmışdır. Molekulyar mexanizmlərin imkanları. Xüsusi genotiplər tərəfindən yaradılan müdafiə reaksiyalarını müqayisə edin. Bu tədqiqat, NLL-in C. lupini peyvəndinə erkən transkriptom reaksiyasını qiymətləndirdi. Əvvəlcə, Lanr1 və AnMan allellərini qeyd edən molekulyar markerlərdən istifadə edərək 215 xətt ehtiva edən Avropa NLL germ plazma paneli yoxlanıldı. Daha sonra nəzarətli şəraitdə əvvəllər molekulyar markerlər üçün seçilmiş 50 NLL xəttində antraknoz fenotipləşdirilməsi aparıldı. Bu təcrübələrə əsasən, iki tamamlayıcı yanaşmadan istifadə edərək diferensial müdafiə gen ifadəsi profili üçün antraknoz müqaviməti və Lanr1/AnMan allel tərkibi ilə fərqlənən dörd xətt seçildi: yüksək məhsuldarlıqlı RNT ardıcıllığı və real vaxt PCR kəmiyyətləndirməsi.
Lanr1 (Anseq3 və Anseq4) və AnMan (Anseq4) və AnMan (AnManM1) markerləri ilə NLL gerplazma dəstinin (N = 215) skrininqi göstərdi ki, yalnız bir xətt (95726, Salamanca-b yaxınlığında) bütün markerlər üçün "müqavimət" allelini gücləndirir, "'Həssas' allellərin mövcudluğu" isə 158 (~73.5%) xəttdəki bütün markerlərin nisbətini tapdı. On üç xətt Lanr1 markerinin iki "müqavimət" allelini, 8 xətt isə Lanr1 markerinin "müqavimət" allelini istehsal etdi. AnMan markerinin "müqavimət" alleli (Əlavə Cədvəl S1). Anseq3 marker üçün iki xətt, AnManM1 marker üçün isə bir xətt heterozigot idi. 42 xətt (19,5%) Anseq3 və Anseq4 allellərinin əks fazalarını daşıyırdı ki, bu da bu iki lokus arasında yüksək rekombinasiya tezliyini göstərir. Nəzarətli şəraitdə antraknoz fenotipləri (Əlavə Cədvəl S2) sınaqdan keçirilmiş genotiplərin müqavimətində dəyişkənlik aşkar etdi ki, bu da antraknozun şiddətində əks olundu. Orta ballardakı fərqlər 1,8-dən (orta dərəcədə davamlı) 6,9-a (həssas), bitki çəki fərqləri isə 0,62-dən (həssas) 4,45 q-a (həssas) qədər dəyişdi. Təcrübənin iki təkrarlanmasında müşahidə edilən dəyərlər (xəstəliyin şiddət balları üçün 0,51, P = 0,00017 və bitki çəkisi üçün 0,61, P < 0,0001), eləcə də bu iki parametr (− 0,59 və − 0,77, P < 0,0001) arasında əhəmiyyətli bir korrelyasiya mövcud idi. Təcrübənin iki təkrarlanmasında müşahidə edilən dəyərlər (xəstəliyin şiddət balları üçün 0,51, bitki çəkisi üçün P = 0,00017 və 0,61, P < 0,0001), eləcə də bu iki parametr (− 0,59 və − 0,77, P < 0,0001) arasında əhəmiyyətli bir korrelyasiya mövcud idi. Vyavlena достоверная корреляция разнечениями, наблюдаемыми в в дух повторностях эксперимента (0,51 üçün ballov tyajesti bolezni, P = 0,00017 və 0,61 üçün massi rasteniya, P < 0,0001), və əlavə 9 parametrləri -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Təcrübənin iki təkrarında müşahidə edilən dəyərlər (xəstəliyin şiddət balları üçün 0,51, bitki çəkisi üçün P = 0,00017 və 0,61, P < 0,0001), eləcə də bu iki parametr (- 0,59 və -0,77, P < 0,0001) 0,0001) arasında əhəmiyyətli bir korrelyasiya aşkar edilmişdir.在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评严重程度评分1，分0. 0.00017，植物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77＀0.0) P <0.0)在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 严重 程度 膈 帺分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之闈 （（（（9. 0,59 和– 0,59 和– 0,59 和- 0,77, P <0,0001)。 Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в в двух повторностях (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 və massa rasteniya 0,61, P <0,0001), və - 0,0001 parametr, və - 0,000 parametr -0,0001) 0,77, P <0,0001. Təkrarlanan müşahidə edilən dəyərlər (xəstəlik şiddəti balı 0.51, P = 0.00017 və bitki çəkisi 0.61, P < 0.0001) ilə bu iki parametr (-0.59 və -0.0001) 0.77, P<0.0001 arasında əhəmiyyətli bir korrelyasiya mövcud idi. ).Həssas bitkilərdə müşahidə olunan tipik simptomlara "çoban yayı" quruluşuna bənzəyən gövdənin əyilməsi və burulması, ardınca narıncı/çəhrayı sporozoitlərlə oval lezyonlar daxildir (Əlavə Şəkil 1). Lanr1 (83A:476 və Tanjil) və AnMan (Mandelup) genlərini daşıyan Avstraliya nümunələri orta dərəcədə davamlıdır, 0.0331 və 0.0036). "Davamlı" Lanr1 və/və ya AnMan allellərini də daşıyan bəzi xətlər xəstəliyin simptomlarını göstərir.
Maraqlıdır ki, heç bir "rezistent" marker alleli olmayan bir neçə NLL xətti, Boregine (hər iki parametr üçün P dəyəri < 0.0001), Bojar (bal üçün P dəyəri < 0.0001 və bitki çəkisi üçün 0.001) və Population B-549/79b (bal üçün P dəyəri < 0.0001 və çəki üçün əhəmiyyətsiz) kimi yüksək səviyyədə antraknoz müqavimətini (Lanr1 və ya AnMan genotipləri ilə müqayisə edilə bilən və ya daha yüksək) aşkar etmişdir. Maraqlıdır ki, heç bir "rezistent" marker alleli olmayan bir neçə NLL xətti, Boregine (hər iki parametr üçün P dəyəri < 0.0001), Bojar (bal üçün P dəyəri < 0.0001 və bitki çəkisi üçün 0.001) və Population B-549/79b (bal üçün P dəyəri < 0.0001 və çəki üçün əhəmiyyətsiz) kimi yüksək səviyyədə antraknoz müqavimətini (Lanr1 və ya AnMan genotipləri ilə müqayisə edilə bilən və ya daha yüksək) aşkar etmişdir. Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, chem üçün genotipov Lanr1 və ya AnMan kakreg), <10, <10 обоих параметров), Bojar (xəbərdarlıq P < 0,0001 üçün böyük ölçüdə və 0,001 üçün böyük ölçüdə) və populyar B-549/79b (xətti P <0,0001 üçün böyük ölçüdə). Maraqlıdır ki, heç bir "davamlı" marker alleli olmayan bir neçə NLL xətti antraknoza qarşı yüksək səviyyədə müqavimət göstərdi (Lanr1 və ya AnMan genotipləri ilə müqayisə edilə bilən və ya daha yüksək), məsələn, Boregine (hər iki parametr üçün P dəyəri < 0.0001), Bojar (qiymətləndirmə üçün P dəyəri < 0.0001 və bitki çəkisi üçün 0.001) və B-549/79b populyasiyasında (qiymətləndirmə üçün P dəyəri < 0.0001 və çəki üçün əhəmiyyətli deyil).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭L，一些缺乏任何“抗性”或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）。 Maraqlıdır ki, heç bir "antigen" markerə malik olmayan bəzi NLL sistemləri yüksək üfüqi müqavimət (Lanr1 və ya AnMan genlərinə bərabər və ya daha yüksək) göstərir, məsələn, Boregine (hər iki parametr P < 0.0001), Bojar (P dəyəri < 0.0001, bitki çəkisi 0.001) və B-549/79b ştammı (P dəyəri < 0.0001, çəki əhəmiyyətli deyil). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 və ya AnMan), eyni parametrlər Boregine01 (, eyni parametrlər Boregine01), Bojar (Zanachie P <0,0001, massa rasteniya 0,001) və populyasiya B-549/79b (Openka P-znachenyya <0,0001, massa yoxdur). Maraqlıdır ki, heç bir "müqavimət" marker allellərindən məhrum olan bəzi NLL xətləri, məsələn, Boregine (hər iki parametr üçün P dəyəri <0.0001), Bojar (P-dəyəri <0.0001, bitki çəkisi 0.001) və B-549/79b populyasiyasında (P-dəyəri <0.0001, çəki əhəmiyyətli deyil) yüksək səviyyədə antraknoz müqaviməti göstərmişdir (Lanr1 və ya AnMan genotipləri ilə müqayisə edilə bilən və ya daha yüksək).Bu fenomen, marker genotipləri ilə xəstəlik fenotipləri arasında müşahidə olunan korrelyasiyanın olmamasını izah edən yeni bir genetik müqavimət mənbəyinin mümkünlüyünü göstərir (P dəyərləri ~0.42-dən ~0.98-ə qədər). Beləliklə, Kolmogorov-Smirnov testi göstərdi ki, antraknoz müqavimətinə dair məlumatlar ballar (P-dəyərləri 0.25 və 0.11) və bitki kütləsi (P-dəyərləri 0.47 və 0.55) üçün təxminən normal paylanmışdır, bu da Lanr1 və AnMan-dan daha çox allelin iştirak etdiyini fərz etməyimə işarə edir.
Antraknoz müqavimətinin skrininqinin nəticələrinə əsasən, transkriptom analizi üçün 4 xətt seçildi: 83A:476, Boregine, Mandelup və Population 22660. Bu xətlər, əvvəlki testdəki ilə eyni olması şərtilə, RNT ardıcıllığı ilə peyvənd təcrübələrində qarayara müqaviməti üçün yenidən sınaqdan keçirildi. Bal dəyərləri aşağıdakı kimi idi: Boregin (1.71 ± 1.39), 83A: 476 (2.09 ± 1.38), Mandelup (3.82 ± 1.42) və populyasiya 22660 (6.11 ± 1.29).
Illumina NovaSeq 6000 protokolu hər nümunə üçün orta hesabla 40,5 Mread cütü (29,7 ilə 54,4 Mread) əldə etdi (Əlavə Cədvəl S3). İstinad ardıcıllığında uyğunlaşdırma balları 75,5%-dən 88,6%-ə qədər dəyişdi. Bioloji təkrarlar arasında eksperimental variantlar arasında oxuma sayı məlumatlarının orta korrelyasiyası 0,812 ilə 0,997 arasında dəyişdi (orta 0,959). Təhlil edilən 35.170 gendən 2917-sində heç bir ifadə aşkar edilməmiş, digər 4785 gen isə əhəmiyyətsiz səviyyədə ifadə olunmuşdur (əsas orta < 5). Təhlil edilən 35.170 gendən 2917-sində heç bir ifadə aşkar edilməmiş, digər 4785 gen isə əhəmiyyətsiz səviyyədə ifadə olunmuşdur (əsas orta < 5). Iz 35 170 proanalizator genov 2917 ne proyavlyali ekspressii, a ostalnıe 4785 genov ekspressivasiya na neznachitelnom urovne (bazovoe srednee <5). Təhlil edilən 35.170 gendən 2917-si heç bir ifadə göstərmədi, qalan 4785 gen isə əhəmiyyətsiz səviyyədə ifadə edildi (əsas orta <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35,170 İz 35 170 proanalizator genov 2917 yox, bir əsas 4785 genov imeli neznachitelnuyu ekspressiya (bazovoe srednee znachenie <5). Təhlil edilən 35.170 gendən 2917-si ifadə olunmamış, qalan 4785 genin ifadəsi isə əhəmiyyətsiz olmuşdur (əsas orta <5).Beləliklə, təcrübə zamanı ifadə edilmiş hesab edilən genlərin sayı (əsas orta ≥ 5) 27.468 (78.1%) təşkil etmişdir (Əlavə Cədvəl S4).
İlk zaman nöqtəsindən etibarən bütün NLL xətləri transkriptomu yenidən proqramlaşdırmaqla C. lupini (Col-08 ştammı) peyvəndinə cavab verdi (Cədvəl 1), lakin xətlər arasında əhəmiyyətli fərqlər müşahidə edildi. Beləliklə, Lanr1 genini daşıyan 83A:476 müqavimət xətti ilk zaman nöqtəsində (6 hpi) əhəmiyyətli transkriptom yenidən proqramlaşdırması göstərdi və bu zaman nöqtəsindəki digər zaman nöqtələri ilə müqayisədə təcrid olunmuş yuxarı və aşağı genlərin sayında 31-69 dəfə artım müşahidə edildi. Bundan əlavə, bu pik qısa müddətli idi, çünki yalnız bir neçə genin ifadəsi ikinci zaman nöqtəsində (12 hpi) əhəmiyyətli dərəcədə dəyişmiş qaldı. Maraqlıdır ki, transplantasiya testində də yüksək səviyyədə müqavimət göstərən Boregine, təcrübə zamanı bu qədər kütləvi transkripsiya yenidən proqramlaşdırmasına məruz qalmadı. Lakin, 12 HPI-də Boregine və 83A:476 üçün fərqli ifadə olunmuş genlərin (DEG) sayı eyni idi. Həm Mandelup, həm də 22660 populyasiyasında son zaman nöqtəsində DEG pikləri (48 l/s) müşahidə olunub ki, bu da müdafiə reaksiyalarında nisbi gecikməni göstərir.
83A:476, digər bütün xətlərlə müqayisədə 6 HPI-də C. lupini-yə cavab olaraq kütləvi transkriptom yenidən proqramlaşdırmasına məruz qaldığı üçün, bu zaman nöqtəsində müşahidə edilən DEG-lərin ~91%-i nəsil ilə əlaqəli idi (Şəkil 1). Bununla belə, tədqiqat xətləri arasında erkən cavablarda müəyyən üst-üstə düşmə müşahidə olunmuşdur, çünki Boregine, Mandelup və 22660 populyasiyasında müvafiq olaraq 68.5%, 50.9% və 52.6% DEG müəyyən zaman nöqtələrində 83A:476-da aşkar edilənlərlə üst-üstə düşmüşdür. Lakin, bu DEG-lər hazırda 83A:476 istifadə edilərək aşkar edilən bütün DEG-lərin yalnız kiçik bir hissəsini (0.97–1.70%) təşkil etmişdir. Bundan əlavə, bütün xətlərdən 11 DEG bu zaman əlaqəli idi (Əlavə Cədvəllər S4-S6), o cümlədən bitki müdafiə reaksiyalarının ümumi komponentləri: lipid transfer zülalı (TanjilG_32225), endoglukan-1,3-β-qlükozid fermenti (TanjilG_23384), SAM22 (TanjilG_31528 və TanjilG_31531) kimi iki stressə səbəb olan zülal, əsas lateks zülalı (TanjilG_32352) və iki qlisinlə zəngin struktur hüceyrə divarı zülalı (TanjilG_19701 və TanjilG_19702). 24 HPI-də 83A:476 və Boregine arasında (ümumi 16-38% DEG) və 48 HPI-də Mandelup və Population 22660 arasında (ümumi 14-20% DEG) transkriptom reaksiyalarında nisbətən yüksək üst-üstə düşmə də müşahidə edilmişdir.
Venn diaqramı, 1999-cu ildə Polşanın Verjenice bölgəsindəki lupin tarlalarından əldə edilən Col-08 ştammı olan Colletotrichum lupini ilə peyvənd edilmiş dar yarpaqlı lupin (NLL) xətlərində differensial ifadə olunmuş genlərin (DEG) sayını göstərir. Təhlil edilən NLL xətləri bunlar idi: 83A:476 (davamlı, Lanr1 allelini daşıyır), Boregine (davamlı, genetik mənşəyi məlum deyil), Mandelup (orta dərəcədə davamlı, AnMan allelini daşıyır) və populyasiya 22660 (çox həssas). hpi qısaltması peyvənddən sonrakı saatları bildirir. Qrafiki sadələşdirmək üçün sıfır dəyərlər silinib.
6 hpi-də həddindən artıq ifadə olunmuş genlər dəsti kanonik R gen domenlərinin mövcudluğuna görə təhlil edilmişdir (Əlavə Cədvəl S7). Bu tədqiqat yalnız 83A:476-da NBS-LRR domenləri olan klassik xəstəlik müqaviməti genlərinin transkriptom induksiyasını aşkar etmişdir. Bu dəst bir TIR-NBS-LRR genindən (tanjilg_05042), beş CC-NBS-LRR genindən (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 və tanjilg_16162) və dörd NBS-LRRE (tanjilg_16162), eləcə də dörd NBS-Lrr (tanjilg_16162) və dörd NBS-LRR (TANJILG_16162) ibarət idi. Bu genlərin hamısı qorunan ardıcıllıqla düzülmüş kanonik domenlərə malikdir. NBS-LRR domen genlərinə əlavə olaraq, bir neçə RLL kinaz 6 hpi-də aktivləşdi, yəni biri Boregine-də (TanjilG_19877), ikisi Mandelup-da (TanjilG_07141 və TanjilG_19877) və 22660 populyasiyasında (TanjilG_09014 və TanjilG_10361) və ikisi 83A 27:476-da.
C. lupini (Col-08 ştammı) ilə peyvənd olunmağa cavab olaraq ifadəsi əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdirilmiş genlər Gen Ontologiyası (GO) zənginləşdirmə təhlilinə məruz qaldılar (Əlavə Cədvəl S8). Ən çox təmsil olunan bioloji proses termini, yüksək əhəmiyyətli (P dəyəri < 0.001) 16 (zaman × xətt) kombinasiyadan 6-sında rast gəlinən "GO:0006952 müdafiə reaksiyası" idi (Şəkil 2). Ən çox təmsil olunan bioloji proses termini, yüksək əhəmiyyətli (P dəyəri < 0.001) 16 (zaman × xətt) kombinasiyadan 6-sında rast gəlinən "GO:0006952 müdafiə reaksiyası" idi (Şəkil 2). "GO: 0006952 защитный cavab" ilə 6-dan 16-ya qədər (bir × liniya) kombinasiyanın yüksək göstəriciləri (zənci P <0,001) ilə başa düşülür. Ən çox təmsil olunan bioloji proses termini, yüksək əhəmiyyətli (P dəyəri < 0.001) 16 (zaman × xətt) kombinasiyasından 6-sında meydana çıxan "GO:0006952 müdafiə reaksiyası" idi (Şəkil 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 Ən çox təmsil olunan bioloji proses termini, 16 (时间×线) kombinasiyadan 6-sında yüksək əhəmiyyətə malik (P dəyəri <0.001) (图2) olan “GO:0006952 müdafiə reaksiyası”dır. "GO: 0006952 Defense Response" termini ilə bağlı bioloji prosesdir. Ən çox təmsil olunan bioloji proses termini 'GO:0006952 Müdafiə Cavabı' idi və bu termin 16 kombinasiyadan 6-sında (zaman × xətt) yüksək əhəmiyyətə malik (P dəyəri < 0.001) görünürdü (Şəkil 2).Bu termin 83A-da iki zaman nöqtəsində: 476 və Boregine (6 və 24 hpi) və Mandelup və 22660 Populyasiyasında bir zaman nöqtəsində (müvafiq olaraq 12 və 6 hpi) həddindən artıq təmsil olunmuşdur. Bu, rezistent xətlərin göbələk əleyhinə reaksiyasını vurğulayan gözlənilən nəticədir. Bundan əlavə, 83A:476, C. lupini-yə "GO:0055114 redoks prosesi" termini ilə təmsil olunan oksidləşdirici partlayışla əlaqəli genləri sürətlə induksiya etməklə cavab verdi ki, bu da spesifik müdafiə reaksiyasını göstərir, Boregine isə "GO" termini ilə əlaqəli spesifik müdafiə reaksiyalarını ortaya qoydu. :0006950 Stress reaksiyası”. 22660 populyasiyası ikinci dərəcəli metabolitləri əhatə edən üfüqi müqavimət reaksiyasını aktivləşdirərək, “GO:0016104 Triterpen biosintezi prosesi” və “GO:0006722 Triterpen metabolizması prosesi” (hər iki termin eyni gen dəstinə aiddir) terminlərinin həddindən artıq sayını vurğuladı. GO termin zənginləşdirmə analizinin nəticələrini nəzərə alsaq, Mandelup reaksiyasının stabilliyi Boregine və 22660 populyasiyası arasında idi. Bundan əlavə, erkən reaksiya 83A:476 (6 hpi) və gecikmiş reaksiya Mandelup və 22660 populyasiyası GO:0015979 “fotosintez” terminini və digər əlaqəli bioloji prosesləri əhatə edir.
Qarayara lupini (1999-cu ildə Polşanın Verjenitse şəhərindəki lupin tarlalarından əldə edilən Col-08 ştammı) ilə peyvənd edilmiş dar yarpaqlı lupinin (NLL) transkriptom reaksiyaları zamanı fərqli şəkildə ifadə olunmuş genlərin annotasiyasında seçilmiş bioproses gen ontologiyası terminləri çox şişirdilmişdir. Təhlil edilən NLL xətləri bunlar idi: 83A:476 (davamlı, homozigot Lanr1 allelini daşıyır), Boregine (davamlı, naməlum genetik mənşəli), Mandelup (orta dərəcədə davamlı, homozigot AnMan allelini daşıyır) və populyasiya 22660 (həssas).
Bu tədqiqatın məqsədi antraknoz müqavimətinə töhfə verən genləri müəyyən etmək olduğundan, GO “GO: 0006952 Müdafiə reaksiyaları” və “GO: 0055114 Redoks prosesləri” terminlərinə aid edilən genlər, başlanğıc nöqtəsi ən azı bir xətt ilə ≥ 30 demək olduğundan, kəsiklərlə təhlil edildi. × log2-nin statistik cəhətdən əhəmiyyətli dəyərlərini (qat dəyişikliyi) birləşdirən zaman nöqtəsi. Bu meyarlara cavab verən genlərin sayı GO:0006952 üçün 65 və GO:0055114 üçün 524 idi.
83A:476, GO:0006952 termini ilə qeyd olunmuş iki DEG pikini aşkar etdi: birincisi düym başına 6 gen (64 gen, yuxarı və aşağı tənzimləmə) və ikincisi düym başına 24 gen (15 gen, yalnız yuxarı tənzimləmə). Boregine həmçinin GO:0006952-nin eyni vaxt nöqtəsində pik nöqtəsinə çatdığını, lakin daha az DEG (11 və 8) və üstünlük verilən aktivləşmə ilə olduğunu göstərdi. Mandeloop, hər ikisi 12 gen daşıyan (birincisi aktivləşdirici genlərlə, ikincisi isə yalnız basqılayıcı genlərlə) 12 və 48 HPI-də GO:0006952-nin iki pikini göstərdi, 6 HPI-də (13 gen) isə artım pik tənzimlənməsinin daha çox üstünlük təşkil etdiyini bildirdi. Qeyd etmək lazımdır ki, bu piklərdə GO:0006952 DEG-in 96,4%-i eyni tipli cavaba (yuxarı və ya aşağı) malik idi ki, bu da iştirak edən genlərin sayındakı fərqlərə baxmayaraq müdafiə reaksiyalarında əhəmiyyətli dərəcədə üst-üstə düşməni göstərir. GO:0006952 termini ilə əlaqəli ən böyük ardıcıllıq qrupu, 10-cu sinif patogenezlə əlaqəli zülal (PR-10) zülal kladı və əsas zülal lateksinə aid olan Aclıq Stressi ilə Əlaqəli Mesaj Zülalı 22-ni (SAM22-yə bənzər) kodlayır. oxşar (MLP-yə bənzər) zülal) zülal (Şəkil 3). İki qrup ifadə təbiəti və cavab istiqamətində fərqlənirdi. SAM22-yə bənzər zülalları kodlayan genlər erkən zaman nöqtələrində (6 və ya 12 hpi) ardıcıl və əhəmiyyətli induksiya göstərdi və ümumiyyətlə təcrübənin sonunda reaksiya vermədi (48 hpi), MLP-yə bənzər zülallar isə 6 hpi-də koordinasiya göstərdi. hpi. 83A:476 və Mandelup genlərində 48 at gücü/düym sürətlə, demək olar ki, bütün digər məlumat nöqtələri reaksiya vermədi. Bundan əlavə, SAM22-yə bənzər zülal genlərinin ifadə profillərindəki fərqlər antraknoz müqavimətində müşahidə olunan dəyişkənliyi izlədi, çünki daha davamlı xətlərdə bu genləri daha həssas genlərə nisbətən əhəmiyyətli dərəcədə induksiya edən daha çox zaman nöqtələri var idi. Başqa bir LlR18A/B-yə bənzər PR-10 geni SAM22-yə bənzər zülal geninə çox oxşar ifadə nümunəsi göstərdi.
“GO:0006952 Müdafiə Cavabı” bioloji proses termininin əsas komponentləri və Lanr1 və AnMan allellərinin namizəd genlərinin ifadə nümunələri müəyyən edilmişdir. Log2 şkalası, eyni vaxt nöqtəsində peyvənd edilmiş (Colletotrichum lupini, Col-08 ştammı, lupin tarlalarından əldə edilmiş, Wizhenica, Polşa, 1999) və nəzarət (saxta peyvənd edilmiş) bitkiləri arasında log2 dəyərlərini (qat dəyişikliyi) təmsil edir. Aşağıdakı dar yarpaqlı lupin xətləri təhlil edilmişdir: 83A:476 (davamlı, homozigot Lanr1 allelini daşıyır), Boregine (davamlı, genetik mənşəyi məlum deyil), Mandelup (orta dərəcədə davamlı, homozigot AnMan allelini daşıyır) və Population 22660 (həssas).
Bundan əlavə, RNT-seq namizəd genləri Lanr1 (TanjilG_05042) və AnMan (TanjilG_12861) ifadə profilləri qiymətləndirilmişdir (Şəkil 3). TanjilG_05042 geni 83A:476-da yalnız ilk zaman nöqtəsində (6 hpi) əhəmiyyətli bir reaksiya (aktivləşmə) göstərdi, TanjilG_12861 isə Mandeloop-da yalnız iki zaman nöqtəsində əhəmiyyətli idi: 6 hpi (aşağı tənzimləmə) və 24 hpi (6 hpi). ilə. tənzimlənən) ).
GO:0055114 "redoks prosesi" terminində ən çox ifadə edilən genlər sitoxrom P450 zülallarını və peroksidazı kodlayan genlər idi (Şəkil 4). 6 HPI-də 83A:476-dan təcrid olunmuş nümunələr üçün, ümumiyyətlə, peyvənd edilmiş və nəzarət bitkiləri arasında maksimum və ya minimum log2 (qat dəyişikliyi) dəyərləri (genlərin 86,6%-i üçün) müşahidə edilmişdir ki, bu da bu genotipin peyvənd edilmiş cinsə yüksək reaksiyasını vurğulayır. 83A:476 ən əhəmiyyətli GO: 0055114 DEG-i 6 hpi-də (503 gen), qalan xətlər isə 48 hpi-də (Boregine, 31 gen; Mandelup, 85 gen; və Population 22660, 78 gen)) göstərmişdir. GO:0055114 ailəsinin əksər genlərində peyvənd etməyə iki növ reaksiya (aktivləşmə və inhibə) müşahidə edilmişdir. Maraqlıdır ki, Mandelupe-də 48 at gücündə GO: 0055114 termini üçün müəyyən edilmiş DEG-lərin 97,6%-ə qədəri. Bu müşahidələr göstərir ki, əhəmiyyətli dərəcədə kiçik miqyasa (yəni mutasiya olunmuş redoks genlərinin sayı, 85 vs 503) baxmayaraq, mandelupun antraknoza gecikmiş transkriptom reaksiyalarının modeli 83A:476-nın erkən reaksiyasına bənzəyir. Boregine və 22660 populyasiyasında bu konvergensiya müvafiq olaraq 51,6% və 75,6% olaraq daha aşağıdır.
“GO:0055114 Redoks prosesi” bioloji prosesi termininin əsas komponentlərinin ifadə qanunauyğunluqları aşkar edilmişdir. Log2 şkalası, eyni vaxt nöqtəsində peyvənd edilmiş (Colletotrichum lupini, Col-08 ştammı, lupin tarlalarından əldə edilmiş, Wizhenica, Polşa, 1999) və nəzarət (saxta peyvənd edilmiş) bitkiləri arasında log2 dəyərlərini (qat dəyişikliyi) təmsil edir. Aşağıdakı dar yarpaqlı lupin xətləri təhlil edilmişdir: 83A:476 (davamlı, homozigot Lanr1 allelini daşıyır), Boregine (davamlı, genetik mənşəyi məlum deyil), Mandelup (orta dərəcədə davamlı, homozigot AnMan allelini daşıyır) və Population 22660 (həssas).
83A:476 C. lupini (Col-08 ştammı) ilə peyvənd olunmağa transkriptomik cavablar həmçinin GO:0015979 "fotosintez" termininə aid edilən genlərin əlaqələndirilmiş susdurulmasını və digər əlaqəli bioloji prosesləri də əhatə edirdi (Şəkil 5). Bu GO:0015979 DEG dəsti 83A:476-da 6 hpi-də əhəmiyyətli dərəcədə repressiyaya uğrayan 105 gen ehtiva edirdi. Bu alt qrupda, Mandelupda 22660 populyasiyada eyni vaxt nöqtəsində 48 HPI-də və 35-də 37 gen də aşağı tənzimlənmişdir, o cümlədən hər iki genotip üçün ortaq olan 19 DEG. GO: 0015979 termini ilə əlaqəli heç bir DEG heç bir kombinasiyada (xətt x zaman) əhəmiyyətli dərəcədə aktivləşməmişdir.
“GO:0015979 Fotosintez” bioloji prosesi termininin əsas komponentlərinin ifadə qanunauyğunluqları aşkar edilmişdir. Log2 şkalası, eyni vaxt nöqtəsində peyvənd edilmiş (Colletotrichum lupini, Col-08 ştammı, lupin tarlalarından əldə edilmiş, Wizhenica, Polşa, 1999) və nəzarət (saxta peyvənd edilmiş) bitkiləri arasında log2 dəyərlərini (qat dəyişikliyi) təmsil edir. Aşağıdakı dar yarpaqlı lupin xətləri təhlil edilmişdir: 83A:476 (davamlı, homozigot Lanr1 allelini daşıyır), Boregine (davamlı, genetik fonu məlum deyil), Mandelup (orta dərəcədə davamlı, homozigot AnMan allelini daşıyır) və Population 22660 (həssas).
Diferensial ifadə analizinin nəticələrinə və ehtimal ki, patogen göbələklərə qarşı müdafiə reaksiyalarında iştirak edənlərə əsasən, real vaxt PCR ilə ifadə profillərinin kəmiyyətləndirilməsi üçün yeddi gen dəsti seçilmişdir (Əlavə Cədvəl S9).
TanjilG_10657 ehtimal olunan zülal geni, nəzarət (təqlid) bitkiləri ilə müqayisədə bütün tədqiq olunan xətlərdə və zaman nöqtələrində əhəmiyyətli dərəcədə induksiya olunmuşdur (Əlavə Cədvəllər S10, S11). Bundan əlavə, TanjilG_10657-nin ifadə profili bütün xətlər üçün təcrübə müddətində artan bir tendensiya göstərdi. 22660 populyasiya, 24 HPI-də TanjilG_10657-nin peyvənd edilməsinə qarşı ən yüksək həssaslığını 114 qat aktivləşmə və ən yüksək nisbi ifadə səviyyəsini (4.4 ± 0.4) göstərdi (Şəkil 6a). PR10 LlR18A zülal geni TanjilG_27015 də bütün xətlər və zaman nöqtələri üzrə aktivləşmə göstərdi və əksər məlumat nöqtələrində statistik əhəmiyyətə malik idi (Şəkil 6b). TanjilG_10657-yə bənzər şəkildə, TanjilG_27015-in ən yüksək nisbi ifadə səviyyəsi 24 HPI-də (19.5 ± 2.4) 22660 peyvənd edilmiş populyasiyada müşahidə edilmişdir. TanjilG_04706 turşu endoxitinaz geni Boregine 6 hpi istisna olmaqla, bütün xətlərdə və bütün zaman nöqtələrində əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (Şəkil 6c). İlk zaman nöqtəsində (6 HPI) 83A:476-da güclü şəkildə induksiya edilmişdir (10.5 dəfə) və digər xətlərdə orta dərəcədə artmışdır (6.6-7.5 dəfə). Təcrübə zamanı TanjilG_04706 ifadəsi 83A:476 və Boregine-də oxşar səviyyələrdə qalmış, Mandelup və 22660 Populyasiyasında isə əhəmiyyətli dərəcədə artaraq nisbətən yüksək dəyərlərə çatmışdır (müvafiq olaraq 5.9 ± 1.5 və 6.2 ± 1.5). Endoglucan-1,3-β-qlükozidaza bənzər TanjilG_23384 geni, 22660 populyasiyasından başqa bütün xətlərdə ilk iki zaman nöqtəsində (6 və 12 hpi) yüksək aktivləşmə göstərdi (Şəkil 6d). TanjilG_23384-ün ən yüksək nisbi ifadə səviyyələri ikinci zaman nöqtəsində (12 hpi) Mandelupda (2.7 ± 0.3) və 83A:476-da (1.5 ± 0.1) müşahidə edildi. 24 HPI-də TanjilG_23384 ifadəsi bütün tədqiq olunan xətlərdə nisbətən aşağı idi (0.04 ± 0.009-dan 0.44 ± 0.12-yə qədər).
Kəmiyyət PCR ilə aşkar edilmiş seçilmiş genlərin (ag) ifadə profilləri. 6, 12 və 24 rəqəmləri peyvənddən sonrakı saatları təmsil edir. Normallaşdırma üçün LanDExH7 və LanTUB6 genləri, seriyalararası kalibrləmə üçün isə LanTUB6 genləri istifadə edilmişdir. Xəta zolaqları hər biri üç texniki təkrarın ortalaması olan üç bioloji təkrara əsaslanan standart sapmanı təmsil edir. Peyvənd edilmiş (Colletotrichum lupini, Col-08 ştammı, 1999-cu ildə Polşanın Wierzenica şəhərindəki lupin sahəsindən əldə edilmişdir) və nəzarət (saxta peyvənd edilmiş) bitkiləri arasındakı ifadə səviyyələrindəki fərqlərin statistik əhəmiyyəti məlumat nöqtələrinin yuxarısında qeyd edilmişdir (*P dəyəri < 0.05, **P dəyəri ≤ 0.01, ***P dəyəri ≤ 0.001). Peyvənd edilmiş (Colletotrichum lupini, Col-08 ştammı, 1999-cu ildə Polşanın Wierzenica şəhərindəki lupin sahəsindən əldə edilmişdir) və nəzarət (saxta peyvənd edilmiş) bitkiləri arasındakı ifadə səviyyələrindəki fərqlərin statistik əhəmiyyəti məlumat nöqtələrinin yuxarısında qeyd edilmişdir (*P dəyəri < 0.05, **P dəyəri ≤ 0.01, ***P dəyəri ≤ 0.001). Statistika znachimosty razlichiy in urovnyah ekspressiiii inokulirovannymi (Colletotrichum lupini, shtam Col-08, 1999-cu ildə polya lyupina, Verjenice, Polşa) və nəzarət (istifadəyə nəzarət) (*zənçilmə P < 0,05, ** значение P ≤ 0,01, *** qiymət P ≤ 0,001). Məlumat nöqtələrinin yuxarısında peyvənd edilmiş (Colletotrichum lupini, Col-08 ştammı, 1999-cu ildə Polşanın Verjenitse şəhərindəki bir lupin sahəsindən əldə edilmişdir) və nəzarət (saxta peyvənd edilmiş) bitkiləri arasında ifadə səviyyələrində statistik cəhətdən əhəmiyyətli fərqlər qeyd edilmişdir (*P dəyəri < 0.05, **P dəyəri ≤ 0.01, ***P dəyəri ≤ 0.001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记木显着性标记木悕ＰP* 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001)。接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对种） 和 对种之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,01, ***0.0₂ Ürək ekspressiyaları arasında statistik məlumatların müxtəlifliyi (Colletotrichum lupini, shtam Col-08, Polyuchennyy s poley lyupina, Verjenice, Polşa, 1999-cu il) və nəzarət (təxminən istifadə edilən) fərqlənmə P < 0,05, ** P-znaçologiya ≤ 0,01, ***P-znaçologiya ≤ 0,001). Məlumat nöqtələrinin yuxarısında peyvənd edilmiş (1999-cu ildə Polşanın Verjenice şəhərindəki lupin tarlalarından əldə edilmiş Colletotrichum lupini, Col-08 ştammı) və nəzarət (saxta peyvənd edilmiş) bitkiləri arasında ifadə səviyyələrində statistik cəhətdən əhəmiyyətli fərqlər qeyd edilmişdir (*P dəyəri < 0.05, **P dəyəri ≤ 0.01, ***P dəyəri ≤ 0.001).Təhlil edilən NLL xətləri bunlar idi: 83A:476 (rezistent, homozigot Lanr1 allelini daşıyır), Mandelup (orta dərəcədə rezistent, homozigot AnMan allelini daşıyır), Boregine (rezistent, naməlum genetik mənşəli) və populyasiya 22660 (həssas).
Lanr1 lokusundakı namizəd TanjilG_05042 geni, RNT-seq tədqiqatlarından əldə edilən profillərdən əhəmiyyətli dərəcədə fərqli bir ifadə nümunəsi göstərdi (Şəkil 6e). Bu genin əhəmiyyətli dərəcədə aktivləşməsi Mandelup və 22660 populyasiyasında müşahidə edildi (müvafiq olaraq 39,7 və 11,7 dəfəyə qədər), bu da nisbətən yüksək ifadə səviyyələrinə (müvafiq olaraq 1,4 ± 0,14 və 7,2 ± 1,3-ə qədər) səbəb oldu. 83A:476 həmçinin TanjilG_05042 geninin bəzi yüksəlişini (3,8 dəfəyə qədər) aşkar etdi, lakin əldə edilən nisbi ifadə səviyyələri (0,044 ± 0,002) Mandelup və 22660 populyasiyasında müşahidə edilənlərdən 30 dəfədən çox aşağı idi. qPCR ilə təhlil edilən nümunələr, saxta peyvənd edilmiş (nəzarət) variantlarda genotiplər arasında ifadə səviyyələrində əhəmiyyətli fərqlər göstərərək, 22660 və 83A:476 populyasiyaları, eləcə də 22660 və 22660 populyasiyaları arasında 58 qat fərqə çatdı. Boregine və Mandalup arasında ikiqat fərq əldə edildi.
AnMan lokusundakı namizəd geni TanjilG_12861, 83A:476 və Mandelup-da peyvənd olunmağa cavab olaraq aktivləşdi, 22660 populyasiyasında neytral idi və Boregine-də aşağı səviyyədə idi (Şəkil 6f). TanjilG_12861 geninin nisbi ifadəsi peyvənd edilmiş 83A: 476-da ən yüksək idi (0,14±0,01). 17,4 kDa I sinif istilik şoku zülalı geni TanjilG_05080 HSP17.4, tədqiq edilmiş bütün ştammlarda və zaman nöqtələrində daha aşağı nisbi ifadə səviyyələri göstərdi (Şəkil 6g). Ən yüksək dəyər 22660 populyasiyasında 24 HPI-də müşahidə edildi (0,14 ± 0,02, peyvənd olunmağa cavabda səkkiz dəfə artım).
Gen ifadə profillərinin müqayisəsi (Şəkil 7) TanjilG_10657 və digər dörd gen arasında yüksək korrelyasiya olduğunu aşkar etdi: TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.80) və TanjilG_04706 (r = 0.79). Bu cür nəticələr müdafiə reaksiyaları zamanı bu genlərin birgə tənzimlənməsini göstərə bilər. TanjilG_12861 və TanjilG_23384 genləri digər genlərlə müqayisədə daha aşağı Pearson korrelyasiya əmsalı dəyərləri (müvafiq olaraq 0.08-dən 0.43-ə və -0.19-dan 0.28-ə qədər) ilə fərqli ifadə profilləri göstərdi.
Gen ifadə profilləri arasındakı korrelyasiyalar kəmiyyət PCR istifadə edilərək aşkar edilmişdir. Aşağıdakı dar yarpaqlı lupin xətləri təhlil edilmişdir: 83A:476 (rezistent, homozigot Lanr1 allelini daşıyır), Mandelup (orta dərəcədə rezistent, homozigot AnMan allelini daşıyır), Boregine (rezistent, genetik mənşəyi məlum deyil) və Population 22660 (həssas). Üç zaman nöqtəsi hesablanmışdır (peyvənddən 6, 12 və 24 saat sonra), o cümlədən peyvənd edilmiş (Colletotrichum lupini, Col-08 ştammı, 1999-cu ildə Polşanın Wierzhenice şəhərindəki lupin tarlalarından əldə edilmişdir) və nəzarət (saxta peyvənd edilmiş) bitkilər. Şkala Pearson korrelyasiya əmsalının dəyərini göstərir.
Düym başına 6 at gücü ilə əldə edilən məlumatlara əsasən, erkən müdafiə reaksiyalarına diqqət yetirmək üçün peyvənd edilmiş və nəzarət bitkilərini müqayisə etməklə müəyyən edilmiş 9981 DEG üzərində WGCNA aparılmışdır (Əlavə Cədvəl S12). Genotiplər və eksperimental variantlar arasında korrelyasiya olunmuş (müsbət və ya mənfi) ifadə profillərinə malik iyirmi iki gen modulu (klaster) tapılmışdır. Orta hesabla, gen ifadə səviyyələri 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 sırası ilə azalırdı (lakin hər iki variantda bu tendensiya nəzarət bitkilərində daha güclü idi). Orta hesabla, gen ifadə səviyyələri 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 sırası ilə azalırdı (lakin hər iki variantda bu tendensiya nəzarət bitkilərində daha güclü idi). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Əhali 22660 (oboih variantax, bir qədər, bu tendensiya ilə silnee u nəzarət edir). Orta hesabla, gen ifadə səviyyələri 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 sırasında azalıb (lakin hər iki variantda bu tendensiya nəzarət bitkilərində daha güclü idi).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Əhali 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> əhali 22660 的 顺序 下降 （， 圧 在在 在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。. В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Əhali 22660 (odnako в обоих вариантах эта тенденция была сильнее у контрольных растений). Orta hesabla, 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 seriyasında gen ifadə səviyyələri azalmışdır (lakin hər iki variantda bu tendensiya nəzarət bitkilərində daha güclü olmuşdur).Vaksinasiya, xüsusən də 18, 19, 14, 6 və 1-ci modullarda (təsirə görə azalan sırada), mənfi tənzimlənməyə (məsələn, 9 və 20-ci modullar) və ya neytral təsirlərlə (məsələn, 11, 22, 8 və 13-cü modullar) gen ifadəsinin yüksəlməsinə səbəb oldu. GO termin zənginləşdirmə təhlili (Əlavə Cədvəl S13), qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 və TanjilG_27015) ilə təhlil edilən genlər, eləcə də bir çox İnoculate ən çox basdırılmış fotosintez modulları (9) daxil olmaqla, maksimum aktivləşmə ilə peyvənd edilmiş modul (18) üçün "GO: 0006952 Qoruyucu cavablar" aşkar etdi. Modul 18 konsentratı (Şəkil 8) PR-10-a bənzər LlR18B zülalını kodlayan TanjilG_26536 geni, modul 9 konsentratı isə fotosistem II PsbQ zülalını kodlayan TanjilG_28955 geni kimi müəyyən edilmişdir. Namizəd antraknoz müqavimət geni Lanr1, TanjilG_05042, modul 22-də tapılmışdır (Şəkil 9) və TanjilG_01212 mərkəzini daşıyan “GO:0044260 Hüceyrə makromolekulyar metabolik proseslər” və “GO:0006355 Transkripsiya tənzimlənməsi, DNT şablonlaşdırma” terminləri ilə əlaqələndirilir. Gen istilik stressi transkripsiya faktoru A-4a (HSFA4a) kodlayır.
Həddindən artıq təmsil olunmuş bioloji proses terminləri olan modulların gen birgə ifadəsinin çəkili şəbəkə təhlili “GO: 0006952 Müdafiə reaksiyaları”. qPCR ilə təhlil edilən dörd geni (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 və TanjilG_27015) vurğulamaq üçün ligasyon sadələşdirildi.
"GO: 0006355: Transkripsiya tənzimlənməsi, DNT şablonlaşdırması" adlı həddindən artıq təmsil olunmuş bioloji proses termininə malik və namizəd antraknoz müqaviməti geni Lanr1 TanjilG_05042 daşıyan modulun gen birgə ifadəsinin ağırlıqlı şəbəkə təhlili. TanjilG_05042 genini və mərkəzi TanjilG_01212 genini təcrid etmək üçün ligasyon sadələşdirildi.
Avstraliyada toplanan antraknoz müqavimətinin skrininqi göstərdi ki, erkən buraxılmış sortların əksəriyyəti həssasdır; Kalya, Coromup və Mandelup orta dərəcədə davamlı, Wonga, Tanjil və 83A:476 isə yüksək dərəcədə davamlı kimi təsvir edilmişdir26,27,31. eyni müqavimət allelinə, yəni Lanr1-ə malik idi və Coromup və Mandelup fərqli bir allelə, yəni AnMan10, 26, 39-a malik idi, Kalya isə fərqli bir allelə, yəni Lanr2-yə keçdi. Almaniyada antraknoz müqavimətinin skrininqi Lanr1-dən başqa bir namizəd allelə, yəni LanrBo36-ya malik müqavimətli Bo7212 xəttinin müəyyən edilməsi ilə nəticələndi.
Tədqiqatımız sınaqdan keçirilmiş germ plazmasında Lanr1 allelinin çox aşağı tezlikdə (təxminən 6%) olduğunu aşkar etdi. Bu müşahidə Anseq3 və Anseq4 markerlərindən istifadə edərək Şərqi Avropa germ plazmasının skrininq nəticələri ilə uyğundur ki, bu da Lanr1 allelinin yalnız iki Belarus xəttində mövcud olduğunu göstərdi. Bu, Lanr1 allelinin markerlə yetişdirilmə üçün əsas allellərdən biri olduğu Avstraliyadan fərqli olaraq yerli yetişdirmə proqramları tərəfindən hələ geniş istifadə edilmədiyini göstərir. Bu, Avstraliya hesabatı ilə müqayisədə Avropa sahə şəraitində Lanr1 alleli tərəfindən təmin edilən müqavimət səviyyəsinin daha aşağı olması ilə bağlı ola bilər. Bundan əlavə, Avstraliyada yüksək yağışlı ərazilərdə antraknoz tədqiqatları göstərdi ki, Lanr1 allelinin vasitəçiliyi ilə verilən müqavimət reaksiyaları patogenin böyüməsinə və sürətli inkişafına kömək edən hava şəraitində təsirli olmaya bilər19,42. Əslində, bu tədqiqatda Lanr1 allelini daşıyan genotiplərdə də antraknozun bəzi simptomları müşahidə edilmişdir ki, bu da C. lupini-nin inkişafı üçün optimal şəraitdə müqavimətin yox ola biləcəyini göstərir. Bundan əlavə, Lanr1 lokusundan təxminən 1 sm məsafədə yerləşən Anseq3 və Anseq4 markerlərinin mövcudluğunun yalançı müsbət şərhləri mümkündür 28,30,43.
Tədqiqatımız göstərdi ki, Lanr1 allelini daşıyan 83A:476, ilk təhlil edilən zaman nöqtəsində (6 hp) genişmiqyaslı transkriptom yenidən proqramlaşdırması ilə C. lupini peyvəndinə cavab vermiş, AnMan allelini daşıyan Mandelupda isə transkriptomik reaksiyalar daha sonra (24-dən 48 hp-yə qədər) müşahidə edilmişdir. Müdafiə reaksiyalarındakı bu zaman dəyişiklikləri xəstəlik simptomlarındakı fərqlərlə əlaqələndirilir və müqavimətə uğurlu cavab üçün patogenin erkən tanınmasının vacibliyini vurğulayır. Bitki toxumasını yoluxdurmaq üçün qarayara sporları sahib səthində cücərmə, hüceyrə bölünməsi və appressoriumun əmələ gəlməsi daxil olmaqla bir neçə inkişaf mərhələsindən keçməlidir. Əlavə, sahib səthinə yapışan və sahib toxumalarına nüfuz etməyi asanlaşdıran infeksion bir quruluşdur. Beləliklə, noxud ekstraktındakı C. gloeosporioides sporları nüvənin 75-90 dəqiqəlik inkubasiyadan sonra ilk bölünməsini, 90-120 dəqiqədən sonra cinsiyyət borusunun əmələ gəlməsini və 4 saatdan sonra basdırılmasını göstərmişdir 45. Mango C. gloeosporioides 3 saatlıq inkubasiyadan sonra 40%-dən çox konidial cücərmə və 4 saatdan sonra təxminən 20% basqılayıcı maddələrin əmələ gəlməsini göstərdi. C. gloeosporioides-in virulentliklə əlaqəli CAP20 geni, 4 saat 46 dəqiqədən sonra yüksək CAP20 zülal konsentrasiyaları ilə avokado səth mumunda 3,5 saatlıq inkubasiyadan sonra epifit əmələ gətirən konidiyalarda transkripsiya aktivliyi göstərdi. Eynilə, C. trifolii-də melanin biosintezi genlərinin aktivliyi 2 saatlıq inkubasiya zamanı induksiya edildi və ardından 1 saatdan sonra bir appressorium əmələ gəldi. Yarpaq toxumaları üzərində aparılan tədqiqatlar göstərdi ki, C. acutatum ilə inokulyasiya edilmiş çiyələklər 8 at gücünə, C. coccodes ilə inokulyasiya edilmiş pomidorlar isə 4 at gücünə 48,49 at gücünə ilk basqıya malikdir. Bu, əsasən Colletotrichum spp. yoluxucu prosesinin zaman miqyası ilə uyğun gəlir. 83A:476-ya qarşı sürətli müdafiə reaksiyaları bu xəttdə bitki müqaviməti və effektor tərəfindən tetiklenen immunitet (ETI) genlərinin iştirak etdiyini göstərir, Mandelup-un gecikmiş reaksiyaları isə mikro-əlaqəli molekulyar model ilə tetiklenen immunitet (MTI) hipotezini 50 dəstəkləyir. 83A:476 və Mandelup-a erkən reaksiyalar. Gecikmiş reaksiyada yuxarı və ya aşağı tənzimlənən genlər arasında qismən üst-üstə düşmə də bu konsepsiyanı dəstəkləyir, çünki ETI tez-tez anafilaktik şok kimi tanınan infeksiya yerində proqramlaşdırılmış hüceyrə ölümü ilə nəticələnən sürətləndirilmiş və gücləndirilmiş MTI reaksiyası hesab olunur 51,52.
Həddindən artıq təmsil olunan Gen Ontologiyası GO:0006952 “Müdafiə Reaksiyası” termininə aid edilən genlərin əksəriyyəti stresslə əlaqəli oruc mesajı 22 zülalının (SAM22-yə bənzər) və yeddi əsas lateks zülal bənzərinin (MLP) 11 homologudur. -bənzər zülallar 31, 34, 43 və 423 ardıcıllıq oxşarlığı göstərdi. SAM22-bənzər genlər daha uzun müddət davam edən əhəmiyyətli aktivləşmə göstərdi və antraknoz müqavimətinin artan səviyyələrini göstərdi (83A:476 və Boregine). Lakin, MLP-bənzər genlər yalnız namizəd müqavimət allelini daşıyan xətlərdə aşağı tənzimləndi (83A:476/Lanr1 6 at gücündə və Mandelup/AnMan 24 at gücündə). Qeyd etmək lazımdır ki, müəyyən edilmiş bütün SAM22-bənzər homologlar təxminən 105 kb-ı əhatə edən gen qrupundan, MLP-bənzər genlər isə genomun ayrı-ayrı bölgələrindən əmələ gəlir. Diaporthetoxica peyvəndinə qarşı NLL müqaviməti ilə bağlı əvvəlki tədqiqatımızda da bu cür SAM22-yə bənzər genlərin koordinasiyalı aktivləşməsi aşkar edilmişdir ki, bu da onların müdafiə reaksiyasının üfüqi komponentlərində iştirak etdiyini göstərir. Bu nəticə həmçinin SAM22-yə bənzər genlərin zədələnməyə və ya salisil turşusu, göbələk induktorları və ya hidrogen peroksid ilə müalicəyə müsbət reaksiyası barədə məlumatlarla da dəstəklənir.
MLP-yə bənzər genlərin bir çox bitki növündə bakterial, virus və patogen göbələk infeksiyaları da daxil olmaqla müxtəlif abiotik və biotik stresslərə cavab verdiyi göstərilmişdir55. Bitkilər və patogenlər arasında müəyyən qarşılıqlı təsirlərə cavab istiqamətləri güclü şəkildə artmaqdan (yəni, pambığın Verticillium dahliae ilə yoluxması zamanı) əhəmiyyətli dərəcədə azalmağa (yəni, alma ağacının Alternaria spp. ilə yoluxmasından sonra)56,57 qədər dəyişirdi. MLP-yə bənzər 423 geninin əhəmiyyətli dərəcədə aşağı tənzimlənməsi avokado müdafiəsi zamanı F. niger infeksiyasına qədər və alma ağacının infeksiyası zamanı Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola və Alternaria alternata alma patotipləridir58,59. Bundan əlavə, MLP-yə bənzər 423 genini həddindən artıq ifadə edən alma kallusları müqavimətlə əlaqəli genlərin daha aşağı ifadəsinə malik idi və göbələk infeksiyasına daha çox həssas idi59. Fusarium oxysporum f-dən sonra MLP-yə bənzər 423 geni də davamlı ümumi lobya rüşeym plazmasında bastırıldı. cn. Lobya infeksiyası 60.
RNT-seq tədqiqatımızda müəyyən edilmiş PR-10 ailəsinin digər üzvləri, yuxarı tənzimləməyə cavab olaraq LlR18A və LlR18B genləri, eləcə də lipid transfer zülalı DIR1 üçün yuxarı tənzimlənmiş (1 gen) və ya aşağı tənzimlənmiş (3 gen) gen idi. Bundan əlavə, WGCNA, peyvənd olunmağa çox həssas olan və bir neçə qoruyucu cavab geninə sahib olan LlR18B genini bu modulda bir mərkəz kimi vurğulayır. LlR18A və LlR18B genləri patogen bakteriyalara cavab olaraq sarı lupin yarpaqlarında, eləcə də D. toxica peyvəndindən sonra NLL gövdələrində induksiya edilmişdir, bu genlərin düyü homoloqu RSOsPR10 isə jasmon turşusu siqnal yolunda iştirak etdiyi ehtimal edilən göbələk infeksiyası tərəfindən sürətlə induksiya edilmişdir53,61,62. DIR1 geni, sistemik qazanılmış müqavimətin (SAR) başlaması üçün tələb olunan qeyri-spesifik lipid daşıma zülallarını kodlayır. Qoruyucu reaksiyaların inkişafı ilə DIR1 zülalı infeksiyanın mərkəzindən floem vasitəsilə daşınaraq uzaq orqanlarda SAR-ı induksiya edir. Maraqlıdır ki, TanjilG_02313 DIR1 geni ilk vaxt nöqtəsində 84A:476 və 22660 populyasiyalarında əhəmiyyətli dərəcədə induksiya olunmuşdu, lakin antraknoz müqaviməti yalnız 84A:476 sətirində uğurla inkişaf etmişdir. Bu, NLL-də DIR1 geninin bəzi subfunksionalizasiyasını göstərə bilər, çünki qalan üç homolog peyvəndlərə yalnız 83A:476 sətirində 6 at gücü ilə cavab vermiş və bu cavab aşağıya doğru yönəlmişdir.
Tədqiqatımızda, “GO:0055114 Redoks prosesi” adlanan bioloji prosesə uyğun ən çox yayılmış komponentlər sitoxrom P450 zülalı, peroksidaza, linoleik turşu 9S-/13S-lipoksigenaza və 1-aminosiklopropan-1-karboksilik turşu oksidaza idi. Bundan əlavə, WGCNA-mız HSFA4a homologunu Lanr1 müqavimət gen namizədi TanjilG_05042 kimi modulları daşıyan mərkəz kimi təyin edir. HSFA4a bitkilərdə nüvə transkripsiyasının redoksdan asılı tənzimlənməsinin bir komponentidir.
Sitoxrom P450 zülalları, ksenobiotiklərin, eləcə də hormonların, yağ turşularının, sterolların, hüceyrə divar komponentlərinin, biopolimerlərin və qoruyucu birləşmələrin biosintezinin metabolizması da daxil olmaqla, birincili və ikincili metabolizmdə NADPH və/və ya O2-asılı hidroksilləşmə reaksiyalarını katalizləşdirən oksidoreduktazalardır 69. Bizim bir araşdırmamızda, bitki sitoxromu P450 funksiyasındakı dəyişkənlik, çox sayda dəyişdirilmiş homolog (37) və spesifik genlər arasında cavab nümunələrindəki fərqlər səbəbindən -10.6 log2-dən (qat dəyişikliyi) 5.7-yə endirildi ki, bu da yuxarıya doğru düzəlişi əks etdirir. . Belə böyük bir protein superailəsində NLL genlərinin ehtimal olunan bioloji funksiyasını aydınlaşdırmaq üçün yalnız RNT-seq məlumatlarından istifadə etmək olduqca spekulyativ olardı. Bununla belə, bəzi sitoxrom P450 genlərinin allergik reaksiyalara töhfə də daxil olmaqla, patogen göbələklərə və ya bakteriyalara qarşı artan müqavimətlə əlaqəli olduğunu qeyd etmək lazımdır 69,70,71.
III sinif peroksidazlar bitki böyüməsi və inkişafı zamanı geniş metabolik proseslərdə, eləcə də duzluluq, quraqlıq, yüksək işıq intensivliyi və patogen hücumu kimi ətraf mühit stresslərinə cavab olaraq iştirak edən çoxfunksiyalı bitki fermentləridir72. Peroksidazlar Stylosanthes humilis və C. gloeosporioides, Lens culinaris və C. truncatum, Phaseolus vulgaris və C. lindemuthianum, Cucumis sativus və C. lagenarium73,74,75,76 daxil olmaqla bir neçə bitki növünün Anthracis ilə qarşılıqlı təsirində iştirak edir. Reaksiya çox sürətlidir, bəzən hətta 4 HPI-də, göbələk bitki toxumasına nüfuz etməzdən əvvəl73. Peroksidaza geni həmçinin D. toxica NLL peyvəndinə cavab verdi. Oksidləşdirici partlayışı tənzimləmək və ya oksidləşdirici stressi aradan qaldırmaq kimi tipik funksiyalarına əlavə olaraq, peroksidazlar müəyyən birləşmələrin lignifikasiyası, alt vahidi və ya çarpaz bağlanması zamanı hüceyrə divarının möhkəmləndirilməsinə əsaslanan fiziki maneələr yaratmaqla patogenin böyüməsinə mane ola bilər. Bu funksiya, in silico, 83A:476 rezistent xəttində 6 HPI-də tədqiqatımızda əhəmiyyətli dərəcədə artan, lakin cavab verməyən digər ştammlarda və zaman nöqtələrində əhəmiyyətli dərəcədə artan ehtimal olunan liqnin əmələ gətirən anion peroksidazı kodlayan TanjilG_03329 geninə aid edilə bilər.
Linoleik turşusunun 9S-/13S-lipoksigenazası lipid biosintezinin oksidləşdirici yolunda ilk addımdır78. Bu yolun məhsulları bitki müdafiəsində çoxsaylı funksiyalara malikdir, o cümlədən kalloza və pektin yataqlarının əmələ gəlməsi ilə hüceyrə divarının möhkəmləndirilməsi və reaktiv oksigen növlərinin istehsalı vasitəsilə oksidləşdirici stressin tənzimlənməsi79,80,81,82,83. Bu tədqiqatda linoleik turşusu 9S-/13S-lipoksigenazanın ifadəsi bütün ştammlarda dəyişdirilmişdir, lakin həssas populyasiya 22660-da müxtəlif zaman nöqtələrində yüksəlmə üstünlük təşkil etmişdir, rezistent Lanr1 və AnMan allelini daşıyan ştammlarda isə bu genotiplər arasında qoruyucu qarayara reaksiyalarında oksilipin təbəqəsinin diversifikasiyasını vurğulayır.
1-aminosiklopropan-1-karboksilat oksidaza (ACO) homologu lupinlə peyvənd edildikdə əhəmiyyətli dərəcədə yüksəlmiş (9 gen) və ya aşağı düşmüş (2 gen) olmuşdur. İki istisna olmaqla, bütün bu reaksiyalar 83A:476-da 6 at gücündə baş vermişdir. ACO zülalları tərəfindən vasitəçilik edilən fermentativ reaksiya etilen istehsalında sürəti məhdudlaşdıran addımdır və buna görə də yüksək dərəcədə tənzimlənir84. Etilen, bitki inkişafının tənzimlənməsində və abiotik və biotik stress şəraitinə cavabında müxtəlif rol oynayan bitki hormonudur. ACO transkripsiyasının induksiyası və etilen siqnal yolunun aktivləşdirilməsi, reaktiv oksigen növlərinin və fitoaleksinlərin istehsalını tənzimləməklə düyünün hemibiotrofik göbələk oryzae oryzae-yə qarşı müqavimətini artırmaqda iştirak edir. Bu tədqiqatda bildirilən 83A:476 xəttində ACO homologlarının əhəmiyyətli dərəcədə artması fonunda M. oryzae və C. lupini88,89 arasında aşkar edilən çox oxşar yarpaq infeksiyası prosesi, NLL antraknoz etileninə müqavimətin molekulyar yollarda siqnal mərkəzi addım olması ehtimalını dəyişdirir.
Bu tədqiqatda, Mandeloop və 22660 populyasiyasında 83A:476-da 6 at gücü və 48 at gücü gücündə fotosintezlə əlaqəli bir çox genin geniş miqyaslı basqısı müşahidə edilmişdir. Bu dəyişikliklərin dərəcəsi və irəliləməsi səviyyə ilə mütənasibdir. Bu təcrübədə antraknoz müqaviməti müşahidə edilmişdir. Bu yaxınlarda, patogen bakteriya və göbələklər də daxil olmaqla, bitki-patogen qarşılıqlı təsirlərinin bir neçə modelində fotosintezlə əlaqəli transkriptlərin güclü və erkən basqısı bildirilmişdir. İnfeksiyaya cavab olaraq fotosintezlə əlaqəli genlərin tələsməsi (bəzi qarşılıqlı təsirlərdə 2 HPI-dən) və qlobal basqısı reaktiv oksigen növlərinin yerləşdirilməsi və onların allergik reaksiyaları vasitəçilik etmək üçün salisil turşusu yolu ilə qarşılıqlı təsirinə əsaslanaraq bitki immunitetini tetikleyebilir 90,94.
Nəticə olaraq, ən davamlı nəsil (83A:476) üçün təklif olunan müdafiə reaksiyası mexanizmlərinə R geni (ehtimal ki, TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) tərəfindən patogenin sürətli tanınması və allergik reaksiya vasitəçiliyi ilə salisil turşusu və etilen siqnalizasiyası, ardınca uzunmüddətli SAR təsirinin qurulması daxildir. DIR-1 zülalı tərəfindən dəstəklənir. Qeyd etmək lazımdır ki, C. lupini infeksiyası üçün biotrofik dövr çox qısadır (təxminən 2 gün), ardınca nekrotik böyümə gəlir95. Bu mərhələlər arasındakı keçid nekroz və ev sahibi bitkilərdə hiperhəssaslıq reaksiyaları üçün tetikleyici rolunu oynayan etilenlə induksiya edilə bilən zülalların ifadəsi ilə əlaqələndirilə bilər. Buna görə də, C. lupini-nin biotrofik mərhələdə uğurla tutulması üçün vaxt pəncərəsi çox dardır. 83A:476-da 6 at gücünə müşahidə edilən redoks və fotosintezlə əlaqəli genlərin yenidən proqramlaşdırılması göbələk hifalarının irəliləməsi ilə uyğun gəlir və biotrofik mərhələdə uğurlu qoruyucu reaksiyanın inkişafını xəbər verir. Mandelup və 22660 populyasiyasının transkriptomik reaksiyaları nekrotik böyüməyə keçməzdən əvvəl göbələyi tutmaq üçün çox gecikmiş ola bilər, lakin Mandelup 22660 populyasiyasından daha təsirli ola bilər, çünki PR-10 zülalının nisbətən sürətli tənzimlənməsi üfüqi müqaviməti artırır.
Kanonik R geni tərəfindən idarə olunan ETI, paxlaların antraknoza qarşı müqavimətinin ümumi mexanizmi kimi görünür. Beləliklə, model paxlalı Medicago truncatula-da antraknoza qarşı müqavimət TIR-NBS-LRR97 bitki R gen sinfinin üzvü olan RCT1 geni tərəfindən təmin edilir. Bu gen həmçinin həssas bitkilərə köçürüldükdə yoncada geniş spektrli antraknoza qarşı müqavimət təmin edir. Adi paxlada (P. vulgaris) bu günə qədər iyirmidən çox antraknoza qarşı müqavimət geni müəyyən edilmişdir. Bu genlərin bəziləri kanonik R genlərinin olmadığı bölgələrdə tapılır, lakin bir çoxu TIR-NBS-LRRs99 da daxil olmaqla NBS-LRR gen klasterini daşıyan xromosomların kənarlarında yerləşir. Genom üzrə SSR tədqiqatı həmçinin NBS-LRR geninin adi paxlada antraknoza qarşı müqavimət ilə əlaqəsini təsdiqlədi. Kanonik R geni, ağ lupin 101-də əsas antraknoz müqavimət lokusunu daşıyan genom bölgəsində də tapıldı.
İşimiz göstərir ki, bitki infeksiyasının erkən mərhələsində (tercihen 12 at gücündən gec olmayaraq) aktivləşdirilən dərhal müqavimət reaksiyası dar yarpaqlı lupini patogen göbələk Collelotrichum lupini-nin yaratdığı antraknozdan effektiv şəkildə qoruyur. Yüksək məhsuldarlıq ardıcıllığından istifadə edərək, Lanr1 və AnMan müqavimət genləri vasitəsilə NLL bitkilərində antraknoz müqavimət genlərinin diferensial ifadə profillərini nümayiş etdirdik. Uğurlu müdafiə, bitkinin patogenlə ilk təmasından sonrakı saatlar ərzində redoks, fotosintez və patogenezdə iştirak edən zülallar üçün genlərin diqqətlə dizayn edilməsini əhatə edir. Oxşar qoruyucu reaksiyalar, lakin zamanla gecikdirilərək, bitkiləri xəstəliklərdən qorumaqda daha az təsirlidir. Lanr1 geni vasitəsilə həyata keçirilən antrakoz müqaviməti R geninin tipik sürətli reaksiyasına (effektor tərəfindən tetiklenen immunitet) bənzəyir, AnMan geni isə çox güman ki, üfüqi reaksiya (mikrobla əlaqəli molekulyar model tərəfindən tetiklenen immunitet) təmin edir və orta səviyyədə davamlılıq təmin edir.
Antraknoz markerlərini yoxlamaq üçün istifadə edilən 215 NLL xətti 74 kultivardan, çarpazlaşdırma və ya seleksiya yolu ilə əldə edilən 60 xəttdən, 5 mutantdan və 76 vəhşi və ya orijinal germplazmadan ibarət idi. Xətlər 17 ölkədən, əsasən Polşadan (58), İspaniyadan (47), Almaniyadan (27), Avstraliyadan (26), Rusiyadan (19), Belarusdan (7), İtaliyadan (5) və digər xətlərdən, 10 ölkədən gəlmişdir. Dəstə həmçinin referans davamlı xətlər daxildir: 83A:476, Tanjil, Lanr1 allelini daşıyan Wonga və AnMan allelini daşıyan Mandelup. Xətlər Polşanın Wiatrowo şəhərindəki Poznań Plant Breeding Ltd. tərəfindən saxlanılan Avropa Lupin Genetik Resurs Verilənlər Bazasından əldə edilmişdir (Əlavə Cədvəl S1).
Bitkilər nəzarətli şəraitdə yetişdirildi (fotoperiod 16 saat, gündüz temperatur 25°C və gecə 18°C). İki bioloji replika təhlil edildi. Protokola uyğun olaraq DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Almaniya) istifadə edərək üç həftəlik yarpaqlardan DNT təcrid edildi. Təcrid olunmuş DNT-nin keyfiyyəti və konsentrasiyası spektrofotometrik metodlarla qiymətləndirildi (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABŞ). Antraknoz müqavimət genini işarələyən AnManM1 markeri (cv. Mandelup-dan götürülmüş) və Lanr1 genini əhatə edən Anseq3 və Anseq4 markerləri (cv. Tanjil-dən götürülmüş) 11,26,28 təhlil edildi. Rezistent allel üçün homoziqotlar “1”, həssas allel “0” və heteroziqotlar 0,5 olaraq qiymətləndirildi.
AnManM1, AnSeq3 və AnSeq4 markerlərinin skrininqinin nəticələrinə və son izləmə təcrübələri üçün toxumların mövcudluğuna əsasən, antraknoz müqavimətinin fenotipləşdirilməsi üçün 50 NLL xətti seçildi. Təhlil, gündüz 22°C, gecə isə 19°C temperatur diapazonunda 14 saatlıq fotoperiodu olan kompüterlə idarə olunan istixanada iki nüsxədə aparıldı. Toxum örtüyünün çox sərt olması səbəbindən toxumun yuxu vəziyyətinin qarşısını almaq və vahid cücərməni təmin etmək üçün toxumlar əkilməzdən əvvəl qaşınır (embrionların əks tərəfindəki toxum örtüyü iti bıçaqla kəsilir). Bitkilər steril torpaqla (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varşava, Polşa) qablarda (11 × 11 × 21 sm) yetişdirildi. Peyvənd 1999-cu ildə Böyük Polşanın Verjenitsa şəhərindəki bir tarlada (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E) yetişdirilən dar yarpaqlı lupin bitkilərinin gövdələrindən yetişdirilən Colletotrichum lupini Col-08 ştammı ilə aparılmışdır. Bir sahə alın. İzolyasiyalar sporulyasiyanı stimullaşdırmaq üçün 21 gün ərzində qara işıq altında 20°C temperaturda SNA mühitində becərilmişdir. Əkindən dörd həftə sonra, bitkilər 4-6 yarpaq mərhələsinə çatdıqda, peyvənd ml-də 0,5 x 106 konidiya konsentrasiyasında konidiya suspenziyası ilə çiləmə yolu ilə aparılmışdır. Peyvənddən sonra bitkilər konidiyaların cücərməsini və infeksiya prosesini asanlaşdırmaq üçün təxminən 98% rütubətdə və 25°C temperaturda 24 saat qaranlıqda saxlanılmışdır. Daha sonra bitkilər 14 saatlıq fotoperiod altında 22°C gündüz/19°C gecə və 70% rütubət şəraitində yetişdirildi. Xəstəlik balı peyvənddən 22 gün sonra təyin edildi və gövdə və yarpaqlarda nekrotik lezyonların olub-olmamasından asılı olaraq 0 (immun) ilə 9 (çox həssas) arasında dəyişdi. Bundan əlavə, bal verildikdən sonra bitkilərin çəkisi ölçüldü. Marker genotipləri və xəstəlik fenotipləri arasındakı əlaqələr nöqtəli iki ardıcıllıq korrelyasiyaları (antraknoz müqavimət fenotipinin təhlili üçün xətlər dəstində heteroziqot markerlərin olmaması) kimi hesablandı.