شكرًا لزيارتكم موقع Nature.com. إصدار المتصفح الذي تستخدمونه يدعم CSS بشكل محدود. للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح مُحدّث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). في هذه الأثناء، ولضمان استمرار الدعم، سنُقدّم الموقع بدون أنماط أو JavaScript.
الترمس الضاغط (NLL، Lupinus angustifolius L.) هو نبات بقوليّ يُستخدم في إنتاج الغذاء وتحسين التربة. وقد جذب التوسع العالمي لزراعة الترمس الضاغط كمحصول العديد من الفطريات المُمرضة، بما في ذلك أنثراكنوز الترمس، المُسبب لمرض الأنثراكنوز المُدمر. وقد استُخدم أليلان، هما Lanr1 وAnMan، واللذان يُضفيان مقاومة متزايدة، في تربية الترمس الضاغط، إلا أن الآليات الجزيئية الكامنة وراء ذلك لا تزال مجهولة. في هذه الدراسة، استُخدمت علامتا Lanr1 وAnMan لفحص عينات الترمس الضاغط الأوروبية. وقد أكد اختبار اللقاح في بيئة مُراقبة فعالية كلا النوعين المُقاومين. وأُجريت دراسة تنميطية للتعبير الجيني التفاضلي على سلالات مُمثلة مقاومة وحساسة. وارتبطت مقاومة الترمس الضاغط بالإفراط في التعبير عن مصطلحات علم الجينات "GO:0006952 استجابة الدفاع"، و"GO:0055114 عملية الأكسدة والاختزال"، و"GO:0015979 التمثيل الضوئي". بالإضافة إلى ذلك، أظهر خط Lanr1 (83A:476) إعادة برمجة ملحوظة للنسخ الجيني بسرعة بعد التلقيح، بينما أظهرت الخطوط الأخرى تأخيرًا في هذه الاستجابة بحوالي 42 ساعة. ترتبط الاستجابات الدفاعية بجينات TIR-NBS وCC-NBS-LRR وNBS-LRR، وعشرة بروتينات مشاركة في التسبب في المرض، وبروتينات نقل الدهون، وإندوجلوكان-1،3-β-غلوكوزيداز، وبروتينات جدار الخلية الغنية بالجليسين، وجينات من المسار التفاعلي للأكسجين. تزامنت الاستجابات المبكرة لـ 83A:476، بما في ذلك التثبيط الدقيق للجينات المرتبطة بالتمثيل الضوئي، مع حماية ناجحة خلال مرحلة النمو الخضري في بيولوجيا الفطريات، مما يشير إلى أن أحد العوامل المؤثرة يُحفز المناعة. يتباطأ تفاعل مانديلوب، وكذلك السحب الأفقي الكلي.
الترمس ضيق الأوراق (NLL، Lupinus angustifolius L.) هو نبات حبوب غني بالبروتين، موطنه الأصلي منطقة غرب البحر الأبيض المتوسط. يُزرع حاليًا كمحصول غذائي للحيوانات والبشر. كما يُعتبر سمادًا أخضر في أنظمة تناوب المحاصيل بفضل تثبيت النيتروجين بواسطة البكتيريا التكافلية المثبتة للنيتروجين، وتحسين بنية التربة بشكل عام. شهد الترمس ضيق الأوراق عملية تدجين سريعة في القرن الماضي، ولا يزال يعاني من ضغط تكاثر مرتفع. مع انتشار زراعة الترمس ضيق الأوراق، طوّرت الفطريات الممرضة بيئات زراعية جديدة، وتسببت في أمراض جديدة مدمرة للمحاصيل. كان الأمر الأكثر إثارة للدهشة بالنسبة لمزارعي ومربي الترمس هو ظهور مرض أنثراكنوز، الذي يسببه الفطر الممرض، كوليتوتريكوم لوبيني (بوندار) نيرينبيرج، فيلر وهاجيدورن13. كان الأمر الأكثر إثارة للدهشة بالنسبة لمزارعي ومربي الترمس هو ظهور مرض أنثراكنوز، الذي يسببه الفطر الممرض، كوليتوتريكوم لوبيني (بوندار) نيرينبيرج، فيلر وهاجيدورن13. أفضل أنواع المبيدات الحشرية للمزارعين ومختاري الترمس هي عدوى جرثومية مسببة للسرطان Colletotrichum lupini (بوندار) نيرنبرج، فايلر وهاجيدورن13. كان الأمر الأكثر إثارة للاهتمام بالنسبة لمزارعي ومربي نبات الترمس هو ظهور مرض أنثراكنوز الناجم عن الفطريات المسببة للأمراض Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg، Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说،最引人注目的是炭疽病的出现،它是由病原真菌Colletotrichum lupini (بوندار) نيرنبرج، فايلر وهاجيدورن13.对于羽扇豆农民والمزيد (بوندار)嵵شعر.1 إن أفضل أنواع المبيدات الحشرية للمزارعين ومختاري الترمس هي أكثر أنواع العدوى المسببة للأمراض شيوعًا كوليتوتريتشوم لوبيني (بوندار) نيرنبرج، فايلر وهاجيدورن13. الأمر الأكثر إثارة للدهشة بالنسبة لمزارعي ومربي الترمس هو ظهور مرض أنثراكنوز الناجم عن الفطريات المسببة للأمراض Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg، Feiler & Hagedorn13.ظهرت أولى التقارير عن هذا المرض في البرازيل والولايات المتحدة، حيث ظهرت أعراضه النموذجية في عامي ١٩١٢ و١٩٢٩ على التوالي. ومع ذلك، بعد حوالي ٣٠ عامًا، سُمّي العامل الممرض كوليتوتريكوم غلويوسبوريوديس (بينز). & Sacc.، الشكل الخارجي Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.، الشكل الخارجي Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (ستونمان) سبولد. & Sacc.، الشكل الخارجي لـ Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.، 有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.، 有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld في الأشكال الجينية. & Sacc.، Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld في علم الأشكال المستهدف. & هـ. شرينك،. & هـ. شرينك، .و ح. شرينك. & H.施伦克،. & H.施伦克،.و H. شلينك، .أظهرت دراسة أولية للنمط الظاهري للمرض، أُجريت في منتصف القرن العشرين، بعض المقاومة في سلالات الذبول الشمالي والذئب الأصفر (L. luteus L.)، إلا أن جميع سلالات الذبول الأبيض (L. albus L.) التي خضعت للاختبار كانت شديدة التأثر بالمرض.15،16. وقد أظهرت الدراسات أن تطور مرض الأنثراكنوز يرتبط بزيادة هطول الأمطار (رطوبة الهواء) ودرجة الحرارة (في نطاق 12-28 درجة مئوية)، مما يؤدي إلى ضعف المقاومة عند درجات الحرارة المرتفعة.17،18. في الواقع، كان الوقت اللازم لإنبات الأبواغ وبدء المرض أقصر بأربع مرات عند درجة حرارة 24 درجة مئوية (4 ساعات) منه عند درجة حرارة 12 درجة مئوية (16 ساعة) في ظل ظروف الرطوبة العالية.19 وبالتالي، أدى الاحتباس الحراري المستمر إلى انتشار مرض الأنثراكنوز. ومع ذلك، لوحظ المرض في فرنسا (1982) وأوكرانيا (1983) باعتباره نذير تهديد وشيك، ولكن يبدو أن صناعة الترمس تجاهلته في ذلك الوقت20،21. وبعد بضع سنوات، انتشر هذا المرض المدمر في جميع أنحاء العالم وأثر أيضًا على الدول الرئيسية المنتجة للترمس مثل أستراليا وبولندا وألمانيا22،23،24. وبعد تفشي مرض أنثراكنوز في منتصف التسعينيات، أدى الفحص المكثف إلى تحديد العديد من المتبرعين المقاومين في عينات NLL19. يتم التحكم في مقاومة NLL للأنثراكنوز بواسطة أليلين سائدين منفصلين موجودين في مصادر جرثومية مختلفة: Lanr1 في الصنف Tanjil و Wonga و AnMan في الصنف Mandalay 25، 26. تكمل هذه الأليلات العلامات الجزيئية التي تدعم اختيار الجرثومة المقاومة في برامج التربية25،26،27،28،29،30. تم تهجين سلالة التكاثر المقاومة 83A:476 الحاملة لأليل Lanr1 مع السلالة البرية الحساسة P27255 للحصول على مجموعة من بروتينات RIL المنفصلة لمقاومة مرض الأنثراكنوز، مما مكّن من تحديد موضع Lanr1 للكروموسوم NLL-1131، 32، 33. وبمواءمة علامات خريطة الارتباط من مواقع المقاومة المحيطة بمرض الأنثراكنوز مع إطار جينومي، كشف NLL عن موقع الأليلات الثلاثة على نفس الكروموسوم (NLL-11)، ولكن في مواقع مختلفة29،34،35. ومع ذلك، نظرًا لقلة عدد بروتينات RIL والمسافة الجينية الكبيرة بين العلامات والأليلات المقابلة، لا يمكن استخلاص استنتاجات موثوقة حول الجينات الأساسية. من ناحية أخرى، يُعد استخدام علم الوراثة العكسي في الترمس صعبًا نظرًا لانخفاض قدرته على التجدد، مما يجعل التلاعب الجيني به أمرًا شاقًا37.
لقد فتح تطوير البلازما الجرثومية المُستأنسة الحاملة للأليل المطلوب في الحالة المتماثلة اللواقح، مثل 83A:476 (Lanr1) وMandelup (AnMan)، الباب أمام دراسة مقاومة مرض الأنثراكنوز في مواجهة وجود توليفات متعارضة من الأليلات في التجمعات البرية. إمكانيات الآليات الجزيئية. قارن الاستجابات الدفاعية الناتجة عن أنماط جينية محددة. قيّمت هذه الدراسة الاستجابة المبكرة للنسخ الجيني لـ NLL لتطعيم C. lupini. في البداية، فُحصت مجموعة أوروبية من البلازما الجرثومية NLL تحتوي على 215 سلالة باستخدام علامات جزيئية تُميز أليلات Lanr1 وAnMan. ثم أُجريت دراسة النمط الظاهري للأنثراكنوز على 50 سلالة NLL، مُختارة مسبقًا للعلامات الجزيئية، في ظل ظروف مُتحكم بها. وبناءً على هذه التجارب، تم اختيار أربعة خطوط تختلف في مقاومة أنثراكنوز والتركيب الأليلي Lanr1/AnMan لرسم ملف تعريف التعبير الجيني للدفاع التفاضلي باستخدام نهجين متكاملين: تسلسل الحمض النووي الريبي عالي الإنتاجية وتقدير تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي.
أظهر فحص مجموعة من البلازما الجرثومية NLL (N = 215) مع العلامات Lanr1 (Anseq3 و Anseq4) و AnMan (Anseq4) و AnMan (AnManM1) أن خطًا واحدًا فقط (95726، بالقرب من Salamanca-b) يضخم أليل "المقاومة" لجميع العلامات، بينما وجد "وجود الأليلات "الحساسة"" نسبة جميع العلامات في 158 (~73.5٪) من الخطوط. أنتجت ثلاثة عشر خطًا أليلين "مقاومين" لعلامة Lanr1، وأنتجت 8 خطوط أليلات "مقاومة" لعلامة Lanr1. أليل "المقاومة" لعلامة AnMan (الجدول التكميلي S1). كان خطان متغايرين للعلامة Anseq3 وخط واحد متغاير للعلامة AnManM1. حملت 42 سلالة (19.5%) طورين متعاكسين من أليلات Anseq3 وAnseq4، مما يشير إلى ارتفاع وتيرة إعادة التركيب بين هذين الموضعين. كشفت الأنماط الظاهرية للأنثراكنوز في ظل ظروف مُراقبة (الجدول التكميلي S2) عن تباين في مقاومة الأنماط الجينية المُختبرة، مما انعكس على شدة الإصابة بالأنثراكنوز. تراوحت الفروق في متوسط ​​الدرجات بين 1.8 (مقاومة متوسطة) و6.9 (حساسة)، وتراوحت الفروق في وزن النبات بين 0.62 (حساسة) و4.45 (مقاومة). كان هناك ارتباط كبير بين القيم الملاحظة في تكرارين للتجربة (0.51 لدرجات شدة المرض، P = 0.00017 و 0.61 لوزن النبات، P < 0.0001) وكذلك بين هذين المعلمتين (− 0.59 و − 0.77، P < 0.0001). كان هناك ارتباط كبير بين القيم الملاحظة في تكرارين للتجربة (0.51 لدرجات شدة المرض، P = 0.00017 و 0.61 لوزن النبات، P < 0.0001) وكذلك بين هذين المعلمتين (- 0.59 و - 0.77، P < 0.0001). ترابط رائع بين المتابعين، تم رصده في تجربتين خلفيتين (0,51 للكرة المزعجة, P = 0,00017 و 0,61 للكثافة الكبيرة, P < 0,0001), وكذلك بين هذه المعلمات المزدوجة (-0,59 و -0,77، Р < 0,0001) 0,0001). ووجد ارتباط معنوي بين القيم الملاحظة في تكرارين للتجربة (0.51 لدرجات شدة المرض، P = 0.00017 و 0.61 لوزن النبات، P < 0.0001)، وكذلك بين هذين المعلمتين (- 0.59 و -0.77، P < 0.0001) 0.0001).يجب أن تكون النتيجة النهائية هي 0.51، P = 0.00017، أو 0.61، P <0.0001) من 0.59 إلى 0.77، P <0.0001).قد يكون من الصعب العثور على أي شيء آخر في أي مكان آخر 0.51، p = 0.00017، 植物 为 为 0.61، p <0.0001) 以及两个参数 之间 （((- 0.59 和– 0.59 和– 0.59 和– 0.59 和- 0.77، P <0.0001). تم فحص الترابط الأساسي بين الدرجات، والملاحظة في اثنتين من النتيجتين (تقييم التصنيف 0,51، P = 0,00017 وحجم كبير 0,61, P <0,0001), وبين اثنين من المعلمات (-0,59 و -0,0001) 0,77, P <0,0001. كان هناك ارتباط معنوي بين القيم الملاحظة في التكرارات (درجة شدة المرض 0.51، P = 0.00017 ووزن النبات 0.61، P < 0.0001) وبين هذين المتغيرين (-0.59 و -0.0001) 0.77، P < 0.0001. ).تشمل الأعراض النموذجية التي تُلاحظ في النباتات الحساسة تجعدًا وانحناءً في الساق يُشبه شكل قوس الراعي، يليه ظهور آفات بيضاوية مع أبواغ برتقالية/وردية (الشكل التكميلي 1). السلالات الأسترالية التي تحمل جينات Lanr1 (83A:476 وTanjil) وAnMan (Mandelup) تتميز بمقاومة متوسطة، 0.0331 و0.0036. بعض السلالات التي تحمل أيضًا أليلات Lanr1 و/أو AnMan "المقاومة" تُظهر أعراض المرض.
ومن المثير للاهتمام أن بعض خطوط NLL التي تفتقر إلى أي أليل علامة "مقاومة" كشفت عن مستوى عالٍ من مقاومة أنثراكنوز (مماثل أو أعلى من النمط الجيني Lanr1 أو AnMan)، مثل Boregine (قيمة P < 0.0001 لكلا المعلمتين)، وBojar (قيمة P < 0.0001 للنتيجة و0.001 لوزن النبات) والسكان B-549/79b (قيمة P < 0.0001 للنتيجة وغير مهمة للوزن). ومن المثير للاهتمام أن بعض خطوط NLL التي تفتقر إلى أي أليل علامة "مقاومة" كشفت عن مستوى عالٍ من مقاومة أنثراكنوز (مماثل أو أعلى من النمط الجيني Lanr1 أو AnMan)، مثل Boregine (قيمة P < 0.0001 لكلا المعلمتين)، وBojar (قيمة P < 0.0001 للنتيجة و0.001 لوزن النبات) والسكان B-549/79b (قيمة P < 0.0001 للنتيجة وغير مهمة للوزن). من المثير للاهتمام أن هناك عددًا قليلاً من خطوط NLL, أفضل العلامات التجارية "المقاومة" التي تظهر قوة عالية للغاية أنتراكنوزي (متوافر أو أكثر حداثة، بسبب النمط الجيني Lanr1 أو AnMan)، مثل Boregine (يرمز إليه P <0,0001) لجميع المعلمات)، Bojar (العلامة P <0,0001 للنقاط و 0,001 للكثافة الكبيرة) والكثافة B-549/79b (العلامة P <0,0001 للنقاط) وغير معروف للكتلة). ومن المثير للاهتمام أن العديد من خطوط NLL التي تفتقر إلى أي أليل علامة "مقاومة" أظهرت مستوى عالٍ من المقاومة للأنثراكنوز (مماثل أو أعلى من النمط الجيني Lanr1 أو AnMan)، مثل Boregine (قيمة P < 0.0001 لكلا المعلمتين)، وBojar (قيمة P < 0.0001 للتقييم و0.001 لوزن النبات) والسكان B-549/79b (قيمة P < 0.0001 للتقييم وليست مهمة للوزن).تم تصميم هذه اللعبة خصيصًا لـ "抗性" من خلال سلسلة NLL من Lanr1 أو AnMan基因型相当或更高),例如Boregine(两个参数的P 值< 0.0001),Bojar(P) أقل من 0.0001، 0.001، وB-549/79b (得分P 值< 0.0001، 重量不显着). ومن المثير للاهتمام أن بعض أنظمة NLL التي لا تحتوي على أي علامات "مستضدية" تظهر مقاومة أفقية عالية (تعادل جينات Lanr1 أو AnMan أو أعلى)، مثل Boregine (كلا المعلمتين P < 0.0001)، وBojar (قيمة P < 0.0001، وزن النبات 0.001) والسلالة B-549/79b (قيمة P < 0.0001، الوزن غير مهم). من المثير للاهتمام أن بعض خطوط NLL التي تحتوي على علامات مميزة للأزقة "المقاومة" تعرض جودة عالية للغاية لـ أنتراكنوزي (مختصر أو أحدث من خلال النمط الجيني Lanr1 أو AnMan)، مثل Boregine (يُعرف باسم P للمعلمات <0,0001)، Bojar (الوزن P <0,0001, الكتلة 0,001) والكثافة B-549/79b (الوزن P-الوزن <0,0001, الكتلة غير متجانسة). ومن المثير للاهتمام أن بعض خطوط NLL التي تفتقر إلى أي أليلات علامة "مقاومة" أظهرت مستويات عالية من مقاومة أنثراكنوز (مقارنة أو أعلى من النمط الجيني Lanr1 أو AnMan)، مثل Boregine (قيمة P لكلا المعلمتين <0.0001)، وBojar (قيمة P <0.0001، وزن النبات 0.001) والسكان B-549/79b (قيمة P <0.0001، الوزن غير مهم).تشير هذه الظاهرة إلى احتمال وجود مصدر وراثي جديد للمقاومة، مما يُفسر غياب الارتباط الملحوظ بين الأنماط الجينية للعلامات والأنماط الظاهرية للمرض (القيم الاحتمالية من ~0.42 إلى ~0.98). وهكذا، أظهر اختبار كولموغوروف-سميرنوف أن بيانات مقاومة الأنثراكنوز كانت موزعة توزيعًا طبيعيًا تقريبًا للدرجات (القيم الاحتمالية 0.25 و0.11) وكتلة النبات (القيم الاحتمالية 0.47 و0.55)، مما يُشير إلى أنني أفترض أن عددًا أكبر من الأليلات من Lanr1 وAnMan مُتورط.
بناءً على نتائج فحص مقاومة الجمرة الخبيثة، تم اختيار أربعة سلالات لتحليل النسخ الجيني: 83A:476، وBoregine، وMandelup، وPubulation 22660. أُعيد اختبار مقاومة الجمرة الخبيثة لهذه السلالات في تجارب التلقيح باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي، بشرط أن تكون مطابقة للاختبار السابق. كانت قيم الدرجات كما يلي: Boregin (1.71 ± 1.39)، و83A:476 (2.09 ± 1.38)، وMandelup (3.82 ± 1.42)، وPubulation 22660 (6.11 ± 1.29).
حقق بروتوكول Illumina NovaSeq 6000 متوسط ​​40.5 زوجًا من Mread لكل عينة (من 29.7 إلى 54.4 Mread) (الجدول التكميلي S3). تراوحت درجات التوافق في التسلسل المرجعي بين 75.5% و88.6%. تراوح متوسط ​​ارتباط بيانات عدد القراءات بين المتغيرات التجريبية والتكرارات البيولوجية بين 0.812 و0.997 (بمتوسط ​​0.959). من بين 35170 جينًا تم تحليلها، لم يظهر 2917 جينًا أي تعبير، وتم التعبير عن الجينات الأخرى البالغ عددها 4785 جينًا بمستوى لا يذكر (متوسط ​​القاعدة < 5). من بين 35170 جينًا تم تحليلها، لم يظهر 2917 جينًا أي تعبير، وتم التعبير عن الجينات الأخرى البالغ عددها 4785 جينًا بمستوى لا يذكر (متوسط ​​القاعدة < 5). من 35 170 تم تحليل الجينات 2917 لم يتم اختبار التعبير عنها، وأصلي 4785 جين معبر عن عدم اليقين уровне (baзовое сredнее <5). من بين 35170 جينًا تم تحليلها، لم يظهر 2917 أي تعبير، وتم التعبير عن الجينات المتبقية البالغ عددها 4785 بمستوى لا يذكر (متوسط ​​القاعدة <5).35,170 دولارًا أمريكيًا، 2917 دولارًا أمريكيًا، 4785 دولارًا أمريكيًا个基因的表达可以忽略不计(基本平均值<5).35,170 من 35 170 تم تحليل الجينات 2917 غير معبر عنها، وأصلي 4785 جين لها عبارات غير معبرة (أساسيات أساسية <5). من بين 35170 جينًا تم تحليلها، لم يتم التعبير عن 2917 جينًا، وكان التعبير عن الجينات المتبقية البالغ عددها 4785 جينًا ضئيلًا (متوسط ​​القاعدة <5).وبالتالي، بلغ عدد الجينات التي تم اعتبارها معبرًا عنها (متوسط ​​القاعدة ≥ 5) أثناء التجربة 27468 (78.1%) (الجدول التكميلي S4).
من نقطة الوقت الأولى، استجابت جميع خطوط NLL لتلقيح C. lupini (سلالة Col-08) عن طريق إعادة برمجة النسخ (الجدول 1)، ومع ذلك، لوحظت اختلافات كبيرة بين الخطوط. وبالتالي، أظهر خط المقاومة 83A: 476 (الذي يحمل جين Lanr1) إعادة برمجة نسخية كبيرة في نقطة الوقت الأولى (6 ساعات بعد التطعيم) مع زيادة 31-69 ضعفًا في عدد الجينات المعزولة للأعلى والأسفل مقارنة بنقاط الوقت الأخرى في هذه النقطة الزمنية. بالإضافة إلى ذلك، كانت هذه الذروة قصيرة الأجل، حيث ظل التعبير عن عدد قليل فقط من الجينات متغيرًا بشكل كبير في نقطة الوقت الثانية (12 ساعة بعد التطعيم). ومن المثير للاهتمام أن Boregine، الذي أظهر أيضًا مستوى عالٍ من المقاومة في اختبار الطعم، لم يخضع لمثل هذه إعادة البرمجة النسخية الضخمة أثناء التجربة. ومع ذلك، كان عدد الجينات المعبر عنها تفاضليًا (DEG) هو نفسه بالنسبة لـ Boregine و83A: 476 عند 12 ساعة بعد التطعيم. أظهر كل من مانديلوب والسكان 22660 ذروة DEG في نقطة الوقت الأخيرة (48 لتر/ثانية)، مما يشير إلى تأخير نسبي في استجابات الدفاع.
نظرًا لأن 83A:476 خضعت لإعادة برمجة نسخية واسعة النطاق استجابةً لـ C. lupini عند 6 HPI مقارنةً بجميع السلالات الأخرى، فإن حوالي 91% من DEGs المرصودة في هذه المرحلة الزمنية كانت خاصة بالسلالة (الشكل 1). ومع ذلك، كان هناك بعض التداخل في الاستجابات المبكرة بين سلالات الدراسة، حيث تداخلت 68.5% و50.9% و52.6% من DEGs في Boregine وMandelup والسكان 22660، على التوالي، مع تلك الموجودة في 83A:476 في نقاط زمنية معينة. ومع ذلك، لم تُمثل هذه DEGs سوى جزء صغير (0.97-1.70%) من جميع DEGs المرصودة حاليًا باستخدام 83A:476. بالإضافة إلى ذلك، كانت 11 DEGs من جميع الخطوط متماسكة في هذا الوقت (الجداول التكميلية S4-S6)، بما في ذلك المكونات المشتركة لاستجابات دفاع النبات: بروتين نقل الدهون (TanjilG_32225)، إنزيم إندوجلوكان-1،3-β-جلوكوسيد (TanjilG_23384)، بروتينان قابلان للتحفيز بالإجهاد مثل SAM22 (TanjilG_31528 وTanjilG_31531)، بروتين اللاتكس الأساسي (TanjilG_32352)، وبروتينان لجدار الخلية البنيوي الغني بالجليسين (TanjilG_19701 وTanjilG_19702). كان هناك أيضًا تداخل مرتفع نسبيًا في استجابات النسخ بين 83A: 476 وBoregine عند 24 HPI (إجمالي 16-38% DEG) وبين Mandelup والسكان 22660 عند 48 HPI (إجمالي 14-20% DEG).
مخطط فين يوضح عدد الجينات ذات التعبير التفاضلي (DEG) في سلالات الترمس ضيق الأوراق (NLL) الملقحة بسلالة Colletotrichum lupini (سلالة Col-08 المُستقاة من حقول الترمس في فيرزينيس، بولندا، 1999). سلالات الترمس ضيق الأوراق التي تم تحليلها هي: 83A:476 (مقاومة، تحمل أليل Lanr1)، وBoregine (مقاومة، خلفية وراثية غير معروفة)، وMandelup (مقاومة متوسطة، تحمل أليل AnMan)، والسكان 22660 (حساسية عالية للإصابة). يُشير الاختصار hpi إلى عدد الساعات بعد التطعيم. حُذفت القيم الصفرية لتبسيط الرسم البياني.
تم تحليل مجموعة الجينات المُعبر عنها بشكل مفرط عند 6 ساعات بعد الإصابة للتحقق من وجود نطاقات جينية R قياسية (الجدول التكميلي S7). كشفت هذه الدراسة عن تحريض النسخ الجيني لجينات مقاومة الأمراض الكلاسيكية ذات نطاقات NBS-LRR فقط عند 83A:476. تتكون هذه المجموعة من جين TIR-NBS-LRR واحد (tanjilg_05042)، وخمسة جينات CC-NBS-LRR (tanjilg_06165، tanjilg_06162، tanjilg_22773، tanjilg_22640، وtanjilg_16162)، وأربعة جينات NBS-LR، Tanjilg_16162، وأربعة جينات NBS-LRRE (tanjilg_16162)، بالإضافة إلى أربعة جينات NBS-Lrr (tanjilg_16162) وأربعة جينات NBS-LRR (TANJILG_16162). جميع هذه الجينات لها نطاقات أساسية مرتبة في تسلسلات محفوظة. بالإضافة إلى جينات نطاق NBS-LRR، تم تنشيط العديد من كينازات RLL بعد 6 ساعات من التلقيح، وهي: واحدة في Boregine (TanjilG_19877)، واثنتان في Mandelup (TanjilG_07141 وTanjilG_19877)، وفي المجموعة السكانية 22660 (TanjilG_09014 وTanjilG_10361)، واثنتان في 83A 27:476.
تم إخضاع الجينات ذات التعبير المتغير بشكل كبير استجابة للتطعيم بـ C. lupini (سلالة Col-08) لتحليل إثراء علم الجينات (GO) (الجدول التكميلي S8). كان مصطلح العملية البيولوجية الأكثر تمثيلاً هو "استجابة الدفاع GO:0006952" والذي ظهر في 6 من 16 مجموعة (الوقت × الخط) ذات دلالة عالية (قيمة P < 0.001) (الشكل 2). كان مصطلح العملية البيولوجية الأكثر تمثيلاً هو "استجابة الدفاع GO:0006952" والذي ظهر في 6 من 16 مجموعة (الوقت × الخط) ذات دلالة عالية (قيمة P < 0.001) (الشكل 2). كان المصطلح المقترح إلى حد كبير لعملية بيولوجية "GO: 0006952 ردًا آمنًا" ، والذي تم إرساله إلى 6 من 16 (الزمن × الخط) مزيج مع أقصى قدر من الدقة (الرمز P <0,001) (ريس.2). كان مصطلح العملية البيولوجية الأكثر تمثيلاً هو "استجابة الدفاع GO:0006952"، والذي ظهر في 6 من 16 تركيبة (الوقت × النسل) ذات دلالة إحصائية عالية (قيمة P < 0.001) (الشكل 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应“،它出现在16 个(时间×线)组合中的6个中، 具有高显着性(P 值< 0.001)(图2). المصطلح الأكثر تمثيلا للعملية البيولوجية هو "استجابة الدفاع GO:0006952"، والذي يظهر في 6 من 16 مجموعة (时间×线)، مع أهمية عالية (قيمة P < 0.001) (图2). كان المصطلح المقترح إلى حد كبير لعملية البيولوجيا البيولوجية «GO: 0006952 Defense Response»، الذي تم طرحه في 6 من 16 مزيج (الزمن × الخط) مع فارق كبير (الزمن P <0,001) (ريس.2). كان مصطلح العملية البيولوجية الأكثر تمثيلاً هو "GO:0006952 Defense Response"، والذي ظهر في 6 من 16 مجموعة (الوقت × الخط) ذات دلالة إحصائية عالية (قيمة P < 0.001) (الشكل 2).كان هذا المصطلح مُمَثَّلاً بشكلٍ زائد في نقطتين زمنيتين في 83A: 476 وBoregine (6 و24 ساعة بعد الإصابة)، وفي نقطة زمنية واحدة في Mandelup وPopulation 22660 (12 و6 ساعات بعد الإصابة، على التوالي). هذه نتيجة متوقعة، تُبرز الاستجابة المضادة للفطريات للسلالات المقاومة. بالإضافة إلى ذلك، استجاب 83A:476 لـ C. lupini عن طريق تحفيز سريع للجينات المرتبطة بالانفجار التأكسدي الذي يُمثله مصطلح "عملية الأكسدة والاختزال GO:0055114"، مما يشير إلى استجابة دفاعية محددة، بينما كشف Boregine عن استجابات دفاعية محددة، مرتبطة بمصطلح "GO". :0006950 استجابة الإجهاد". فعّلت المجموعة 22660 استجابة المقاومة الأفقية التي تتضمن مستقلبات ثانوية، مما يُبرز العدد المفرط للمصطلحين "GO:0016104 عملية تخليق التربين" و"GO:0006722 عملية استقلاب التربين" (ينتمي كلا المصطلحين إلى نفس مجموعة الجينات). مع الأخذ في الاعتبار نتائج تحليل إثراء مصطلح GO، كان استقرار تفاعل ماندلوب بين بورجين والمجموعة 22660. بالإضافة إلى ذلك، يتضمن التفاعل المبكر 83A:476 (6 ساعات بعد الإنبات) والتفاعل المتأخر ماندلوب والمجموعة 22660 مصطلح GO:0015979 "البناء الضوئي" وغيره من العمليات البيولوجية ذات الصلة.
مصطلحات علم جينات العمليات الحيوية المختارة في شرح الجينات المعبر عنها تفاضليًا أثناء استجابات النسخ الجيني لذئب ضيق الأوراق (NLL) المُلقّح بذئب الجمرة الخبيثة (سلالة Col-08 المُستقاة من حقول ذئب في فيرزينيس، بولندا، عام 1999) مُبالغ فيها إلى حد كبير. سلالات ذئب ضيق الأوراق التي حُللت هي: 83A:476 (مقاومة، تحمل أليل Lanr1 متماثل اللواقح)، وBoregine (مقاومة، ذات خلفية وراثية غير معروفة)، وMandelup (مقاومة متوسطة، تحمل أليل AnMan متماثل اللواقح)، والسكان 22660 (حساسة).
لأن هذه الدراسة هدفت إلى تحديد الجينات المساهمة في مقاومة الأنثراكنوز، فقد تم تحليل الجينات المُخصصة لمصطلحي GO "GO: 0006952 الاستجابات الدفاعية" و"GO: 0055114 عمليات الأكسدة والاختزال" باستخدام قيم حدية، حيث كانت متوسطات خط الأساس ≥ 30، مع وجود خط واحد على الأقل. × نقطة زمنية تجمع بين قيم ذات دلالة إحصائية لـ log2 (التغير في الطية). بلغ عدد الجينات التي تستوفي هذه المعايير 65 جينًا لـ GO: 0006952 و524 جينًا لـ GO: 0055114.
كشف 83A:476 عن ذروتين لـ DEG مُعلّق عليهما بمصطلح GO:0006952، الأولى عند 6 جينات لكل بوصة (64 جينًا، تنظيم تصاعدي وتنازلي)، والثانية عند 24 جينًا لكل بوصة (15 جينًا، تنظيم تصاعدي فقط). أظهر بورجين أيضًا أن GO:0006952 بلغ ذروته في نفس النقطة الزمنية، ولكن مع انخفاض في DEG (11 و8) وتنشيط تفضيلي. أظهر مانديلوب ذروتين لـ GO:0006952 عند 12 و48 من HPI، وكلاهما يحمل 12 جينًا (الأولى بجينات منشطة، والثانية بجينات مثبطة فقط)، بينما كان لدى المجموعة 22660 عند 6 من HPI (13 جينًا) غلبة أكبر لتنظيم ذروة الزيادة. تجدر الإشارة إلى أن 96.4٪ من GO: 0006952 DEG في هذه القمم كان لها نفس نوع الاستجابة (صعوبة أو صعوبة) ، مما يشير إلى تداخل كبير في الاستجابات الدفاعية على الرغم من الاختلافات في عدد الجينات المعنية. أكبر مجموعة من التسلسلات المتعلقة بمصطلح GO: 0006952 تشفر بروتين الرسائل المرتبط بالإجهاد المجاعة 22 (مثل SAM22) ، والذي ينتمي إلى فرع البروتين المرتبط بالمرض من الفئة 10 (PR-10) والبروتين الأساسي لاتكس. بروتين مشابه (مثل MLP) (الشكل 3). اختلفت المجموعتان في طبيعة التعبير واتجاه الاستجابة. أظهرت الجينات التي تشفر بروتينات شبيهة بـ SAM22 تحريضًا ثابتًا وهامًا في نقاط زمنية مبكرة (6 أو 12 ساعة بعد الإصابة) وكانت غير مستجيبة بشكل عام في نهاية التجربة (48 ساعة بعد الإصابة) ، بينما أظهرت بروتينات شبيهة بـ MLP تنسيقًا عند 6 ساعات بعد الإصابة. 83A:476 وماندلوب عند 48 حصان/بوصة، كانت جميع نقاط البيانات الأخرى تقريبًا غير مستجيبة. بالإضافة إلى ذلك، تبعت الاختلافات في أنماط التعبير الجيني لجينات البروتين الشبيه بـ SAM22 التباين الملحوظ في مقاومة الأنثراكنوز، حيث كان للسلالات الأكثر مقاومة نقاط زمنية أكثر تُحفز هذه الجينات بشكل ملحوظ مقارنةً بالجينات الأكثر حساسية. أظهر جين PR-10 آخر شبيه بـ LlR18A/B نمط تعبير مشابه جدًا لجين البروتين الشبيه بـ SAM22.
تم تحديد المكونات الرئيسية لمصطلح العملية البيولوجية "GO:0006952 Defense Response" وأنماط التعبير الجيني للجينات المرشحة لأليلات Lanr1 وAnMan. يمثل مقياس Log2 قيم log2 (التغير في الطية) بين نباتات الترمس الملقحة (Colletotrichum lupini، سلالة Col-08، المأخوذة من حقول الترمس، Wizhenica، بولندا، 1999) ونباتات المجموعة الضابطة (الملقحة زورًا) في نفس النقطة الزمنية. تم تحليل سلالات الترمس ضيقة الأوراق التالية: 83A:476 (مقاومة، تحمل أليل Lanr1 متماثل اللواقح)، وBoregine (مقاومة، خلفية وراثية غير معروفة)، وMandelup (مقاومة متوسطة، تحمل أليل AnMan متماثل اللواقح)، والسكان 22660 (حساسة).
بالإضافة إلى ذلك، تم تقييم أنماط التعبير الجيني لجينات RNA-seq المرشحة Lanr1 (TanjilG_05042) وAnMan (TanjilG_12861) (الشكل 3). أظهر جين TanjilG_05042 استجابةً (تنشيطًا) ملحوظة في 83A:476 فقط عند نقطة زمنية أولى (6 ساعات بعد الزرع)، بينما كان جين TanjilG_12861 ملحوظًا في Mandeloop فقط عند نقطتين زمنيتين: 6 ساعات بعد الزرع (تنظيم تنازلي) و24 ساعة بعد الزرع (6 ساعات بعد الزرع). (مع.). قابل للتعديل).
كانت الجينات الأكثر تعبيرًا في مصطلح "عملية الأكسدة والاختزال" GO:0055114 هي الجينات التي تُشفِّر بروتينات السيتوكروم P450 والبيروكسيديز (الشكل 4). بالنسبة للعينات المعزولة من 83A:476 عند 6 ساعات بعد التلقيح، لوحظت قيم قصوى أو دنيا للوغاريتم2 (تغير الطي) (لـ 86.6% من الجينات) بشكل عام بين النباتات الملقحة والنباتات الضابطة، مما يُبرز الاستجابة العالية لهذا النمط الجيني لجنس التلقيح. أظهر 83A:476 أعلى قيمة لـ GO: 0055114 DEG عند 6 ساعات بعد التلقيح (503 جينات)، بينما أظهرت بقية السلالات عند 48 ساعة بعد التلقيح (Boregine، 31 جينًا؛ Mandelup، 85 جينًا؛ وPopulation 22660، 78 جينًا). في معظم جينات عائلة GO:0055114، لوحظ نوعان من الاستجابات للتلقيح (التنشيط والتثبيط). من المثير للاهتمام أن ما يصل إلى 97.6% من جينات DEGs التي تم تحديدها لمصطلح GO: 0055114 في مانديلوب عند 48 ساعة. تشير هذه الملاحظات إلى أنه على الرغم من صغر حجمها بشكل ملحوظ (أي عدد جينات الأكسدة والاختزال المتحولة، 85 مقابل 503)، فإن نمط استجابات النسخ المتأخرة في مانديلوب للأنثراكنوز يشبه الاستجابة المبكرة لـ 83A:476. في بورجين والسكان 22660، يكون هذا التقارب أقل بنسبة 51.6% و75.6% على التوالي.
تم الكشف عن أنماط التعبير عن المكونات الرئيسية لمصطلح العملية البيولوجية "عملية الأكسدة والاختزال GO:0055114". يمثل مقياس Log2 قيم log2 (التغير في الطية) بين نباتات الترمس الملقحة (Colletotrichum lupini، سلالة Col-08، المأخوذة من حقول الترمس، Wizhenica، بولندا، 1999) والنباتات الضابطة (الملقحة زورًا) في نفس النقطة الزمنية. تم تحليل سلالات الترمس ضيقة الأوراق التالية: 83A:476 (مقاومة، تحمل أليل Lanr1 متماثل اللواقح)، وBoregine (مقاومة، خلفية وراثية غير معروفة)، وMandelup (مقاومة متوسطة، تحمل أليل AnMan متماثل اللواقح)، والسكان 22660 (حساسة).
83A:476 تضمنت الاستجابات النسخية للتلقيح بـ C. lupini (سلالة Col-08) أيضًا إسكاتًا منسقًا للجينات المنسوبة إلى مصطلح GO:0015979 "البناء الضوئي" وغيرها من العمليات البيولوجية ذات الصلة (الشكل 5). احتوت مجموعة DEG GO:0015979 هذه على 105 جينات تم كبتها بشكل ملحوظ عند 6 ساعات بعد التلقيح في 83A:476. في هذه المجموعة الفرعية، تم أيضًا تقليل نشاط 37 جينًا في Mandelup عند 48 ساعة بعد التلقيح و35 في نفس الوقت في مجموعة 22660، بما في ذلك 19 DEGs مشتركة بين كلا النمطين الجينيين. لم يتم تنشيط أي DEGs مرتبطة بمصطلح GO:0015979 بشكل ملحوظ في أي تركيبة (الخط × الوقت).
تم الكشف عن أنماط التعبير عن المكونات الرئيسية لمصطلح العملية البيولوجية "GO:0015979 التمثيل الضوئي". يمثل مقياس Log2 قيم log2 (التغير في الطية) بين النباتات الملقحة (Colletotrichum lupini، سلالة Col-08، المأخوذة من حقول الترمس، Wizhenica، بولندا، 1999) والنباتات الضابطة (الملقحة زورًا) في نفس النقطة الزمنية. تم تحليل سلالات الترمس ضيقة الأوراق التالية: 83A:476 (مقاومة، تحمل أليل Lanr1 متماثل اللواقح)، وBoregine (مقاومة، خلفية وراثية غير معروفة)، وMandelup (مقاومة متوسطة، تحمل أليل AnMan متماثل اللواقح)، والسكان 22660 (حساسة).
استنادًا إلى نتائج تحليل التعبير التفاضلي ويفترض أنها تشارك في استجابات الدفاع ضد الفطريات المسببة للأمراض، تم اختيار هذه المجموعة من الجينات السبعة لقياس ملفات تعريف التعبير عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (الجدول التكميلي S9).
تم تحفيز جين البروتين المفترض TanjilG_10657 بشكل ملحوظ في جميع السلالات المدروسة وفي فترات زمنية محددة مقارنةً بالنباتات المقلدة (الجدولان التكميليان S10 وS11). بالإضافة إلى ذلك، أظهر نمط التعبير الجيني لجين TanjilG_10657 اتجاهًا متزايدًا على مدار التجربة لجميع السلالات. أظهرت المجموعة 22660 أعلى حساسية لجين TanjilG_10657 للتلقيح، حيث بلغ معدل التنشيط 114 ضعفًا، وأعلى مستوى تعبير نسبي (4.4 ± 0.4) عند 24 نقطة تلقيح (الشكل 6أ). كما أظهر جين البروتين PR10 LlR18A TanjilG_27015 نشاطًا في جميع السلالات وفي فترات زمنية محددة، مع دلالة إحصائية في معظم نقاط البيانات (الشكل 6ب). على غرار TanjilG_10657، لوحظ أعلى مستوى تعبير نسبي لجين TanjilG_27015 في المجموعة الملقحة 22660 عند 24 ساعة بعد الإصابة (19.5 ± 2.4). ارتفع مستوى جين إندوكيتيناز الحمض TanjilG_04706 بشكل ملحوظ في جميع السلالات وفي جميع النقاط الزمنية باستثناء Boregine 6 ساعة بعد الإصابة (الشكل 6ج). وقد حُثّ بقوة في النقطة الزمنية الأولى (6 ساعات بعد الإصابة) عند 83A:476 (بمقدار 10.5 مرة)، وزاد بشكل معتدل في السلالات الأخرى (بمقدار 6.6-7.5 مرة). خلال التجربة، ظلّ التعبير عن TanjilG_04706 عند مستويات مماثلة في 83A:476 وBoregine، بينما ازداد بشكل ملحوظ في Mandelup والمجموعة 22660، ليصل إلى قيم عالية نسبيًا (5.9 ± 1.5 و6.2 ± 1.5، على التوالي). أظهر جين TanjilG_23384، الشبيه بالإندوجلوكان-1،3-β-جلوكوسيداز، نشاطًا عاليًا عند أول نقطتين زمنيتين (6 و12 ساعة بعد التلقيح) في جميع السلالات باستثناء المجموعة 22660 (الشكل 6د). ولوحظت أعلى مستويات التعبير النسبي لجين TanjilG_23384 عند النقطة الزمنية الثانية (12 ساعة بعد التلقيح) في مانديلوب (2.7 ± 0.3) و83A:476 (1.5 ± 0.1). وعند 24 ساعة بعد التلقيح، كان التعبير النسبي لجين TanjilG_23384 منخفضًا نسبيًا في جميع السلالات المدروسة (من 0.04 ± 0.009 إلى 0.44 ± 0.12).
تم الكشف عن أنماط التعبير الجيني لجينات مختارة (ag) باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. تمثل الأرقام 6 و12 و24 الساعات التالية للتطعيم. استُخدم جينا LanDExH7 وLanTUB6 للتطبيع، بينما استُخدم LanTUB6 للمعايرة بين السلاسل. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري بناءً على ثلاث مكررات بيولوجية، كل منها يمثل متوسط ​​ثلاث مكررات تقنية. تم توضيح الأهمية الإحصائية للاختلافات في مستويات التعبير بين النباتات الملقحة (Colletotrichum lupini، سلالة Col-08، التي تم الحصول عليها في عام 1999 من حقل الترمس في Wierzenica، بولندا) والنباتات الضابطة (الملقحة بشكل وهمي) أعلى نقاط البيانات (*قيمة P < 0.05، **قيمة P ≤ 0.01، ***قيمة P ≤ 0.001). تم توضيح الأهمية الإحصائية للاختلافات في مستويات التعبير بين النباتات الملقحة (Colletotrichum lupini، سلالة Col-08، التي تم الحصول عليها في عام 1999 من حقل الترمس في Wierzenica، بولندا) والنباتات الضابطة (الملقحة بشكل وهمي) أعلى نقاط البيانات (*قيمة P < 0.05، **قيمة P ≤ 0.01، ***قيمة P ≤ 0.001). تختلف الإحصائيات في التعبير عن التطعيم بين التطعيم (Colletotrichum lupini، stam Col-08، الذي تم الانتهاء منه في 1999 g. с) الترمس في فيرجينيا, بولشا) وأجهزة التحكم (التطعيم السهل) الممتد على طول الطريق البيانات (*التمييز P < 0,05, **التمييز P ≥ 0,01, ***التمييز P ≥ 0,001). تم ملاحظة فروق ذات دلالة إحصائية في مستويات التعبير بين النباتات الملقحة (Colletotrichum lupini، سلالة Col-08، التي تم الحصول عليها في عام 1999 من حقل الترمس في Wierzhenice، بولندا) والنباتات الضابطة (الملقحة بشكل وهمي) أعلى نقاط البيانات (*قيمة P < 0.05، **قيمة P ≤ 0.01، ***قيمة P ≤ 0.001).接种(كوليتوتريشوم لوبيني، Col-08株، 1999، 年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得(وهذا هو السبب في أن هذا هو السبب وراء نجاحي في تحقيق النجاح)* P值< 0.05، ** P 值 ≥ 0.01، *** P 值 ≥ 0.001).接种 (colletotrichum lupini، color-08 株، 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得) و和 对照 (接种 植物 之间 水平)差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05، **P ≥ 0.01، ***P ≥ 0.001). اختلافات إحصائية في التعبيرات بين التطعيم (Colletotrichum lupini, stam Col-08, плученный с полей люпina) في فيرجينيتس، بولشا، في 1999 م.) وأنظمة التحكم (الحقن المنخفضة للغاية) ممتدة على точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≥ 0,01, ***P-значение ≥ 0,001). تم ملاحظة فروق ذات دلالة إحصائية في مستويات التعبير بين النباتات الملقحة (Colletotrichum lupini، سلالة Col-08، التي تم الحصول عليها من حقول الترمس في فيرزينيس، بولندا، في عام 1999) والنباتات الضابطة (الملقحة بشكل وهمي) أعلى نقاط البيانات (*قيمة P < 0.05، **قيمة P ≤ 0.01، ***قيمة P ≤ 0.001).كانت خطوط NLL التي تم تحليلها هي: 83A: 476 (مقاومة، تحمل أليل Lanr1 المتماثل)، Mandelup (مقاومة متوسطة، تحمل أليل AnMan المتماثل)، Boregine (مقاومة، خلفية وراثية غير معروفة) والسكان 22660 (حساسة).
أظهر الجين المرشح TanjilG_05042 في موضع Lanr1 نمط تعبير مختلفًا بشكل ملحوظ عن الأنماط المُستقاة من دراسات تسلسل الحمض النووي الريبي (الشكل 6هـ). لوحظ تنشيط كبير لهذا الجين في مانديلوب ومجموعة 22660 (حتى 39.7 مرة و11.7 مرة على التوالي)، مما أدى إلى مستويات تعبير عالية نسبيًا (حتى 1.4 ± 0.14 و7.2 ± 1.3 مرة على التوالي). كما كشف 83A:476 عن بعض الزيادة في تنظيم جين TanjilG_05042 (حتى 3.8 ضعف)، إلا أن مستويات التعبير النسبية المُحققة (0.044 ± 0.002) كانت أقل بأكثر من 30 ضعفًا من تلك المُلاحظة في مانديلوب ومجموعة 22660. أظهرت البيانات التي تم تحليلها بواسطة qPCR اختلافات كبيرة في مستويات التعبير بين النمط الجيني في المتغيرات التي تم تطعيمها بشكل وهمي (مجموعة التحكم)، حيث وصلت إلى فرق 58 ضعفًا بين السكان 22660 و83A:476، وكذلك بين السكان 22660 و22660. وتم تحقيق فرق مضاعف بين Boregine وMandalup.
تم تنشيط الجين المرشح في موضع AnMan، TanjilG_12861، استجابةً للتطعيم في السلالتين 83A:476 وMandelup، وكان محايدًا في المجموعة 22660، وانخفض نشاطه في Boregine (الشكل 6و). كان التعبير النسبي لجين TanjilG_12861 هو الأعلى في السلالات الملقحة 83A:476 (0.14±0.01). أظهر جين بروتين الصدمة الحرارية من الصنف الأول TanjilG_05080 HSP17.4، ذو الوزن الجزيئي 17.4 كيلو دالتون، مستويات تعبير نسبي أقل في جميع السلالات المدروسة وفي نقاط زمنية محددة (الشكل 6ز). ولوحظت أعلى قيمة عند 24 HPI في المجموعة 22660 (0.14±0.02، أي زيادة ثمانية أضعاف في الاستجابة للتطعيم).
أظهرت مقارنة أنماط التعبير الجيني (الشكل 7) ارتباطًا وثيقًا بين TanjilG_10657 وأربعة جينات أخرى: TanjilG_27015 (r = 0.89)، وTanjilG_05080 (r = 0.85)، وTanjilG_05042 (r = 0.80)، وTanjilG_04706 (r = 0.79). قد تشير هذه النتائج إلى التنظيم المشترك لهذه الجينات أثناء الاستجابات الدفاعية. أظهر الجينان TanjilG_12861 وTanjilG_23384 أنماط تعبير مختلفة، مع قيم معامل ارتباط بيرسون منخفضة (من 0.08 إلى 0.43، ومن -0.19 إلى 0.28، على التوالي) مقارنةً بالجينات الأخرى.
تم الكشف عن الارتباطات بين أنماط التعبير الجيني باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. حُللت سلالات الترمس ضيقة الأوراق التالية: 83A:476 (مقاومة، تحمل أليل Lanr1 متماثل اللواقح)، وMandelup (مقاومة متوسطة، تحمل أليل AnMan متماثل اللواقح)، وBoregine (مقاومة، الخلفية الوراثية غير معروفة)، والسكان 22660 (حساسة). حُسبت ثلاث نقاط زمنية (6، 12، و24 ساعة بعد التلقيح)، بما في ذلك النباتات الملقحة (Colletotrichum lupini، سلالة Col-08، المأخوذة من حقول الترمس في Wierzhenice، بولندا، عام 1999) والنباتات الضابطة (الملقحة زورًا). يُظهر المقياس قيمة معامل ارتباط بيرسون.
استنادًا إلى بيانات تم الحصول عليها بمعدل 6 حصان لكل بوصة، أُجريت عملية WGCNA على 9981 DEG تم تحديدها بمقارنة النباتات الملقحة والنباتات الضابطة للتركيز على الاستجابات الدفاعية المبكرة (الجدول التكميلي S12). وُجدت اثنتان وعشرون وحدة جينية (مجموعات) ذات أنماط تعبير مترابطة (إيجابية أو سلبية) بين الأنماط الجينية والمتغيرات التجريبية. في المتوسط، كانت مستويات التعبير الجيني تتناقص بالترتيب 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (في كلا المتغيرين، ومع ذلك، كان هذا الاتجاه أقوى في النباتات الضابطة). في المتوسط، كانت مستويات التعبير الجيني تتناقص بالترتيب 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (في كلا المتغيرين، ومع ذلك، كان هذا الاتجاه أقوى في النباتات الضابطة). في هذه المناسبة، يتجلى هذا التعبير في المقال 83A:476 > Mandelup > Boregine > السكان 22660 (في مختلف المتغيرات، ومع ذلك، هذا الاتجاه كانت صامتة في ظل ظروف مراقبة). في المتوسط، انخفضت مستويات التعبير الجيني بالترتيب 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (في كلا المتغيرين، ومع ذلك، كان هذا الاتجاه أقوى في النباتات الضابطة).平均而言，基因表达水平按83A:476 > مانديلوب > بورجين > عدد السكان 22660 لا داعي للقلق بشأن هذا الأمر.平均 而 言 , 基因 水平 按 按 按 83a: 476> مانديلوب> السكان الأصليين> السكان 22660 的 顺序 下降 （, 在 种 中 , 这 种 在 在植物 中 更)........................... في هذه المناسبة، يتجلى هذا التعبير في نطاق 83A:476 > Mandelup > Boregine > السكان 22660 (على الرغم من أن هذا الاتجاه هو في المتغيرات الأخرى) الصمت في ظل ظروف التحكم). في المتوسط، انخفضت مستويات التعبير الجيني في السلسلة 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (ومع ذلك، في كلا المتغيرين، كان هذا الاتجاه أقوى في النباتات الضابطة).أدى التطعيم إلى زيادة تنظيم التعبير الجيني، خاصةً في الوحدات 18 و19 و14 و6 و1 (بترتيب تنازلي للتأثير)، أو تنظيم سلبي (مثل الوحدتين 9 و20)، أو بتأثيرات محايدة (مثل الوحدات 11 و22 و8 و13). كشف تحليل إثراء مصطلح GO (الجدول التكميلي S13) عن "استجابات وقائية GO: 0006952" للوحدة الملقحة (18) ذات التنشيط الأقصى، بما في ذلك الجينات التي حُلّلت بواسطة qPCR (TanjilG_04706 وTanjilG_23384 وTanjilG_10657 وTanjilG_27015)، بالإضافة إلى العديد من وحدات التمثيل الضوئي الأكثر قمعًا في Inoculate (9). تم تحديد مُركِّز الوحدة 18 (الشكل 8) على أنه جين TanjilG_26536 المُشفِّر لبروتين LlR18B المُشابه لـ PR-10، وتم تحديد مُركِّز الوحدة 9 على أنه جين TanjilG_28955 المُشفِّر لبروتين PsbQ في النظام الضوئي الثاني. وُجِد جين مُرشَّح لمقاومة الأنثراكنوز Lanr1، TanjilG_05042، في الوحدة 22 (الشكل 9)، وهو مُرتبط بمصطلحي "GO:0044260 العمليات الأيضية الجزيئية الخلوية" و"GO:0006355 التنظيم النسخي، قوالب الحمض النووي" اللذين يحملان محور TanjilG_01212. يُشفِّر الجين عامل نسخ الإجهاد الحراري A-4a (HSFA4a).
تحليل شبكي مرجح للتعبير الجيني المشترك للوحدات ذات مصطلحات العمليات البيولوجية المُمَثَّلة بشكل زائد "GO: 0006952 استجابات الدفاع". تم تبسيط عملية الربط لتسليط الضوء على الجينات الأربعة التي تم تحليلها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) (TanjilG_04706، وTanjilG_23384، وTanjilG_10657، وTanjilG_27015).
تحليل شبكي مرجح للتعبير الجيني المشترك لوحدة ذات مصطلح عملية بيولوجية مُمَثَّل بشكل زائد "GO: 0006355: التنظيم النسخي، قوالب الحمض النووي" وتحمل جينًا مرشحًا لمقاومة مرض الأنثراكنوز Lanr1 TanjilG_05042. تم تبسيط عملية الربط لعزل جين TanjilG_05042 وجين TanjilG_01212 المركزي.
أظهر فحص مقاومة مرض الأنثراكنوز، الذي جُمِع في أستراليا، أن معظم الأصناف المُصدرة مبكرًا كانت حساسة؛ ووُصِفَت كاليا وكوروموب ومانديلوب بأنها متوسطة المقاومة، بينما وُصِفَت وونجا وتانجيل و83A:476 بأنها شديدة المقاومة26،27،31. كان لكلٍّ من صنفي كاليا أليل المقاومة نفسه، المُسمّى Lanr1، بينما كان لكلٍّ من صنفي كوروموب ومانديلوب أليل مختلف، المُسمّى AnMan10،26،39، بينما نقل كاليا أليلًا مختلفًا، Lanr2. أسفر فحص مقاومة مرض الأنثراكنوز في ألمانيا عن تحديد سلالة مقاومة Bo7212 تحمل أليلًا مرشحًا غير Lanr1، المُسمّى LanrBo36.
كشفت دراستنا عن تواتر منخفض جدًا (حوالي 6%) لأليل Lanr1 في المادة الوراثية المختبرة. تتوافق هذه الملاحظة مع نتائج فحص المادة الوراثية في شرق أوروبا باستخدام علامتي Anseq3 وAnseq4، والتي أظهرت وجود أليل Lanr1 في سلالتين بيلاروسيتين فقط. يشير هذا إلى أن أليل Lanr1 لا يُستخدم على نطاق واسع في برامج التربية المحلية حتى الآن، على عكس أستراليا، حيث يُعدّ أحد الأليلات الرئيسية للتكاثر بمساعدة الواسمات. قد يُعزى ذلك إلى انخفاض مستوى المقاومة الذي يُوفره أليل Lanr1 في الظروف الحقلية الأوروبية مقارنةً بالتقرير الأسترالي. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت دراسات أنثراكنوز في المناطق ذات الأمطار الغزيرة في أستراليا أن استجابات المقاومة التي يُتوسطها أليل Lanr1 قد لا تكون فعالة في الظروف الجوية التي تُشجع على نمو وتطور المُمرض بسرعة19،42. في الواقع، لوحظت في هذه الدراسة أيضًا بعض أعراض مرض أنثراكنوز في الأنماط الجينية التي تحمل أليل Lanr1، مما يشير إلى أن المقاومة قد تختفي في ظل الظروف المثلى لتطور فطر C. lupini. بالإضافة إلى ذلك، من الممكن وجود تفسيرات إيجابية خاطئة لوجود علامتي Anseq3 وAnseq4، واللتين تبعدان حوالي 1 سنتيمتر عن موضع Lanr1، 28،30،43.
أظهرت دراستنا أن فطر 83A:476، الحامل لأليل Lanr1، استجاب لتلقيح C. lupini بإعادة برمجة النسخ الجيني واسعة النطاق في أول نقطة زمنية تم تحليلها (6 ساعات بعد التلقيح)، بينما في فطر Mandelup، الحامل لأليل AnMan، لوحظت استجابات نسخية متأخرة جدًا (من 24 إلى 48 ساعة بعد التلقيح). ترتبط هذه الاختلافات الزمنية في الاستجابات الدفاعية باختلافات في أعراض المرض، مما يُبرز أهمية التعرف المبكر على مسببات الأمراض لتحقيق استجابة ناجحة للمقاومة. لإصابة أنسجة النبات، يجب أن تمر جراثيم الجمرة الخبيثة بمراحل نمو متعددة على سطح العائل، بما في ذلك الإنبات وانقسام الخلايا وتكوين الزائدة. الزائدة هي بنية معدية تلتصق بسطح العائل وتُسهّل اختراق أنسجة العائل. وهكذا، أظهرت جراثيم C. gloeosporioides في مستخلص البازلاء الانقسام الأول للنواة بعد 75-90 دقيقة من الحضانة، وتكوين أنبوب جرثومي بعد 90-120 دقيقة، والقمع بعد 4 ساعات 45. أظهرت جراثيم المانجو C. gloeosporioides إنباتًا أبواغيًا بنسبة تزيد عن 40% بعد 3 ساعات من الحضانة وتكوين حوالي 20% من المثبطات بعد 4 ساعات. أظهر جين CAP20 المرتبط بالضراوة لجراثيم C. gloeosporioides نشاطًا نسخيًا في الأبواغ المكونة للنباتات الهوائية بعد 3.5 ساعة من الحضانة في شمع سطح الأفوكادو مع تركيزات عالية من بروتين CAP20 بعد 4 ساعات و46 دقيقة. وبالمثل، تم تحريض نشاط جينات التخليق الحيوي للميلانين في C. trifolii خلال فترة حضانة لمدة ساعتين تليها تكوين محفز بعد ساعة واحدة. أظهرت دراسات أنسجة الأوراق أن الفراولة المُلقحة بـ C. acutatum تُظهر أول تثبيط بعد 8 ساعات بعد الإصابة، بينما تُظهر الطماطم المُلقحة بـ C. coccodes أول تثبيط بعد 4 ساعات بعد الإصابة48،49. يتوافق هذا إلى حد كبير مع النطاق الزمني لعملية العدوى بـ Colletotrichum spp. تشير الاستجابات الدفاعية السريعة لـ 83A:476 إلى تورط جينات مقاومة النبات والمناعة المُحفزة بالمُستَقبِل (ETI) في هذه السلالة، بينما تدعم استجابات ماندلوب المتأخرة فرضية المناعة المُحفزة بالنمط الجزيئي المرتبط بالميكرو (MTI) 50. الاستجابات المبكرة لـ 83A:476 وماندلوب. كما يدعم التداخل الجزئي بين الجينات المُنظمة صعودًا أو هبوطًا في الاستجابة المتأخرة هذا المفهوم، حيث غالبًا ما يُعتبر ETI استجابة مُتسارعة ومُعززة للمناعة المُحفزة بالمُستَقبِل تؤدي إلى موت الخلايا المُبرمج في موقع العدوى، والمعروف باسم الصدمة التأقية 51،52.
معظم الجينات المنسوبة إلى المصطلح المفرط التمثيل Gene Ontology GO:0006952 "الاستجابة الدفاعية" هي 11 متماثلًا لبروتين رسالة الصيام الناتج عن الإجهاد 22 (مشابه لـ SAM22) والبروتينات السبعة الرئيسية الشبيهة باللاتكس (MLPs). أظهرت البروتينات الشبيهة باللاتكس 31 و34 و43 و423 تشابهًا في التسلسل. أظهرت الجينات الشبيهة بـ SAM22 نشاطًا كبيرًا استمر لفترة أطول، مما يدل على زيادة مستويات مقاومة الأنثراكنوز (83A:476 وBoregine). ومع ذلك، تم تقليل تنظيم الجينات الشبيهة بـ MLP فقط في الخطوط التي تحمل أليل المقاومة المرشح (83A:476/Lanr1 عند 6 ساعات بعد الزرع وMandelup/AnMan عند 24 ساعة بعد الزرع). تجدر الإشارة إلى أن جميع المتماثلات الشبيهة بـ SAM22 المحددة تنشأ من مجموعة جينية تمتد على حوالي 105 كيلو قاعدة، بينما تنشأ الجينات الشبيهة بـ MLP من مناطق منفصلة من الجينوم. وُجد أيضًا تنشيطٌ مُنسّقٌ لهذه الجينات الشبيهة بـ SAM22 في دراستنا السابقة لمقاومة NLL لتطعيم Diaporthetoxica، مما يُشير إلى أنها تُشارك في المكونات الأفقية للاستجابة الدفاعية. ويدعم هذا الاستنتاج أيضًا تقاريرٌ عن استجابةٍ إيجابيةٍ لجيناتٍ شبيهةٍ بـ SAM22 للإصابة أو العلاج بحمض الساليسيليك، أو مُحفّزات الفطريات، أو بيروكسيد الهيدروجين.
أظهرت الجينات الشبيهة بـ MLP استجابةً لمختلف الضغوط الحيوية وغير الحيوية، بما في ذلك العدوى البكتيرية والفيروسية والفطرية المسببة للأمراض في العديد من أنواع النباتات.55. تراوحت اتجاهات الاستجابة لبعض التفاعلات بين النباتات ومسببات الأمراض بين زيادة حادة (أي أثناء إصابة القطن بفطر Verticillium dahliae) وانخفاض ملحوظ (أي بعد إصابة شجرة التفاح بفطر Alternaria spp.)56،57. ولوحظ انخفاض ملحوظ في تنظيم جين 423 الشبيه بـ MLP أثناء دفاعات الأفوكادو ضد عدوى F. niger، وأثناء إصابة شجرة التفاح Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola و Alternaria alternata، وهما من الأنماط المرضية للتفاح.58،59. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت كالي التفاح التي تُفرط في التعبير عن جين 423 الشبيه بـ MLP انخفاضًا في التعبير عن الجينات المرتبطة بالمقاومة، وكانت أكثر عرضة للإصابة بالعدوى الفطرية.59 بعد الإصابة بفطر Fusarium oxysporum f، تم أيضًا تثبيط جين MLP-like 423 في البلازما الجرثومية الشائعة للفاصولياء. cn. إصابة الفاصولياء 60.
من بين الأعضاء الآخرين لعائلة PR-10 التي تم تحديدها في دراسة RNA-seq الخاصة بنا، كان جينا LlR18A وLlR18B استجابةً لزيادة التنظيم، بالإضافة إلى جين زيادة التنظيم (جين واحد) أو خفض التنظيم (ثلاثة جينات) لبروتين نقل الدهون DIR1. بالإضافة إلى ذلك، تُسلّط WGCNA الضوء على جين LlR18B كمحور في هذه الوحدة، وهو شديد التأثر بالتطعيم ويحمل العديد من جينات الاستجابة الوقائية. تم تحفيز جينات LlR18A وLlR18B في أوراق الترمس الصفراء استجابةً للبكتيريا المسببة للأمراض، وكذلك في سيقان NLL بعد تلقيح D. toxica، بينما تم تحفيز نظير الأرز لهذه الجينات، RSOsPR10، بسرعة بواسطة عدوى فطرية يُفترض أنها مرتبطة بمسار إشارات حمض الجاسمونيك53،61،62. يُشفّر جين DIR1 بروتينات نقل الدهون غير النوعية اللازمة لبدء المقاومة المكتسبة الجهازية (SAR). مع تطور التفاعلات الوقائية، ينتقل بروتين DIR1 من بؤرة العدوى عبر اللحاء لتحفيز الاستجابة المناعية في الأعضاء البعيدة. ومن المثير للاهتمام أن جين TanjilG_02313 DIR1 قد حُثّ بشكل ملحوظ في النقطة الزمنية الأولى في السلالات 84A:476 والسكان 22660، إلا أن مقاومة الأنثراكنوز لم تتطور بنجاح إلا في السلالة 84A:476. قد يشير هذا إلى بعض الاختلال الوظيفي لجين DIR1 في NLL، حيث استجابت المتماثلات الثلاثة المتبقية للتلقيح فقط في السلالة 83A:476 بعد 6 ساعات من التلقيح، وكانت هذه الاستجابة موجهة نحو الانخفاض.
في دراستنا، كانت المكونات الأكثر شيوعًا المرتبطة بالعملية البيولوجية المسماة "عملية الأكسدة والاختزال GO:0055114" هي بروتين السيتوكروم P450، والبيروكسيديز، وحمض اللينوليك 9S-/13S-ليبوكسيجيناز، وأوكسيديز حمض 1-أمينوسيكلوبروبان-1-كربوكسيليك. بالإضافة إلى ذلك، يُعرّف WGCNA الخاص بنا نظير HSFA4a بأنه وحدة محورية تحمل وحدات مثل مرشح جين مقاومة Lanr1 TanjilG_05042. يُعد HSFA4a أحد مكونات التنظيم المعتمد على الأكسدة والاختزال للنسخ النووي في النباتات.
بروتينات السيتوكروم بي450 هي إنزيمات أكسدة واختزال تُحفّز تفاعلات الهيدروكسيل المعتمدة على NADPH و/أو O2 في الأيض الأولي والثانوي، بما في ذلك أيض المواد الغريبة، بالإضافة إلى الهرمونات والأحماض الدهنية والستيرولات ومكونات جدار الخلية والبوليمرات الحيوية والتخليق الحيوي للمركبات الواقية 69. في دراسة، انخفض التباين في وظيفة السيتوكروم بي450 النباتي من -10.6 لوغاريتم2 (تغير في عدد الأضعاف) إلى 5.7 بسبب العدد الكبير من المتماثلات المتغيرة (37) والاختلافات في أنماط الاستجابة بين جينات محددة، مما يعكس مراجعة تصاعدية. إن استخدام بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي فقط لتوضيح الوظيفة البيولوجية المفترضة لجينات NLL في مثل هذه العائلة البروتينية الكبيرة سيكون أمرًا تخمينيًا للغاية. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن بعض جينات السيتوكروم P450 مرتبطة بزيادة مقاومة الفطريات أو البكتيريا المسببة للأمراض، بما في ذلك المساهمة في حدوث ردود الفعل التحسسية69،70،71.
بيروكسيديزات الصنف الثالث هي إنزيمات نباتية متعددة الوظائف، تشارك في مجموعة واسعة من العمليات الأيضية أثناء نمو النبات وتطوره، بالإضافة إلى استجابتها للضغوط البيئية مثل الملوحة والجفاف وشدة الضوء العالي وهجوم مسببات الأمراض72. تشارك البيروكسيديزات في تفاعل العديد من أنواع النباتات مع الجمرة الخبيثة، بما في ذلك Stylosanthes humilis وC. gloeosporioides، وLens culinaris وC. truncatum، وPhaseolus vulgaris وC. lindemuthianum، وCucumis sativus وC. lagenarium73،74،75،76. تكون الاستجابة سريعة جدًا، حتى في بعض الأحيان عند 4 ساعات من التعرض، قبل أن يخترق الفطر أنسجة النبات73. كما استجاب جين البيروكسيديز للتلقيح بـ D. toxica NLL. بالإضافة إلى وظائفها الاعتيادية في تنظيم الانفجار التأكسدي أو التخلص من الإجهاد التأكسدي، يمكن أن تتداخل البيروكسيديزات مع نمو مسببات الأمراض من خلال إنشاء حواجز فيزيائية تعتمد على تقوية جدار الخلية أثناء التخشب، أو تكوين الوحدات الفرعية، أو الترابط المتقاطع لمركبات محددة. يمكن أن تُعزى هذه الوظيفة حاسوبيًا إلى جين TanjilG_03329 الذي يُشفر بيروكسيديز أنيون مُكوّن لليجنين، والذي ارتفع نشاطه بشكل ملحوظ في دراستنا في سلالة 83A:476 المقاومة عند 6 HPI، ولكن ليس في سلالات أخرى وفي فترات زمنية لم تستجب.
يُعدّ إنزيم ليبوكسيجيناز حمض اللينوليك 9S-/13S- الخطوة الأولى في مسار الأكسدة لتخليق الدهون78. ولمنتجات هذا المسار وظائف متعددة في دفاع النبات، بما في ذلك تقوية جدار الخلية من خلال تكوين رواسب الكالوز والبكتين، وتنظيم الإجهاد التأكسدي من خلال إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية79،80،81،82،83. في هذه الدراسة، تغيّر التعبير عن إنزيم ليبوكسيجيناز حمض اللينوليك 9S-/13S- في جميع السلالات، ولكن في المجموعة المعرضة للإصابة 22660، سادت زيادة التنظيم في نقاط زمنية مختلفة، بينما في السلالات التي تحمل جين Lanr1 المقاوم وأليل AnMan، يُبرز هذا التعبير تنوع طبقة الأوكسيليبين في تفاعلات الجمرة الخبيثة الوقائية بين هذه الأنماط الجينية.
ارتفع مستوى مُشابه إنزيم 1-أمينوسيكلوبروبان-1-كاربوكسيلات أوكسيديز (ACO) بشكل ملحوظ (9 جينات) أو انخفض (جينان) عند تلقيحه بالترمس. باستثناء حالتين، حدثت جميع هذه الاستجابات عند 6 ساعات بعد التلقيح عند 83A:476. يُعد التفاعل الأنزيمي الذي تُحدثه بروتينات ACO الخطوة المُحددة لمعدل إنتاج الإيثيلين، وبالتالي فهو مُنظم بدرجة عالية84. الإيثيلين هرمون نباتي يلعب أدوارًا مُتنوعة في تنظيم نمو النبات واستجابته لظروف الإجهاد الحيوي وغير الحيوي. يُساهم تحريض نسخ ACO وتنشيط مسار إشارات الإيثيلين في زيادة مقاومة الأرز لفطر أوريزا أوريزا نصف التغذية، وذلك من خلال تنظيم إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية والفيتوأليكسينات. تم العثور على عملية إصابة أوراق متشابهة للغاية بين M. oryzae و C. lupini88،89، على خلفية زيادة تنظيمية كبيرة في نظائر ACO في خط 83A:476 المذكور في هذه الدراسة، مما يحول إمكانية منح مقاومة لأنثراكنوز NLL إيثيلين خطوة مركزية للإشارة في المسارات الجزيئية.
في هذه الدراسة، لوحظ تثبيط واسع النطاق للعديد من الجينات المرتبطة بالتمثيل الضوئي عند 6 ساعات بعد الإصابة في المجموعة 83A:476، وعند 48 ساعة بعد الإصابة في مانديلوب والسكان 22660. يتناسب مدى هذه التغيرات وتطورها طرديًا مع مستواها. لوحظت مقاومة للأنثراكنوز في هذه التجربة. مؤخرًا، تم الإبلاغ عن تثبيط قوي ومبكر للنسخ المرتبطة بالتمثيل الضوئي في العديد من نماذج تفاعلات النبات مع مسببات الأمراض، بما في ذلك البكتيريا والفطريات المسببة للأمراض. يمكن أن يؤدي التسرع (من 2 ساعة بعد الإصابة في بعض التفاعلات) والتثبيط الشامل للجينات المرتبطة بالتمثيل الضوئي استجابةً للعدوى إلى تحفيز مناعة النبات بناءً على نشر أنواع الأكسجين التفاعلية وتفاعلها مع مسار حمض الساليسيليك للتوسط في ردود الفعل التحسسية 90،94.
في الختام، تتضمن آليات الاستجابة الدفاعية المقترحة للسلالة الأكثر مقاومة (83A:476) التعرف السريع على مسببات الأمراض بواسطة جين R (يُفترض أنه TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) وإشارات حمض الساليسيليك والإيثيلين بوساطة الاستجابة التحسسية، متبوعةً بتكوين SAR طويل المدى. يدعم بروتين DIR-1 هذا التأثير. تجدر الإشارة إلى أن فترة التغذية الحيوية لعدوى C. lupini قصيرة جدًا (حوالي يومين)، تليها نمو نخري95. قد يرتبط الانتقال بين هذه المراحل بالنخر وتعبير البروتينات القابلة للتحريض بالإيثيلين والتي تعمل كمحفزات لتفاعلات فرط الحساسية في النباتات المضيفة. لذلك، فإن الإطار الزمني لالتقاط C. lupini بنجاح في مرحلة التغذية الحيوية ضيق جدًا. إن إعادة برمجة الجينات المرتبطة بالأكسدة والاختزال والتمثيل الضوئي، الملحوظة في 83A:476 عند 6 ساعات بعد الولادة، تتوافق مع تطور الخيوط الفطرية، وتُبشّر بتطور استجابة وقائية ناجحة في المرحلة الحيوية. قد تكون الاستجابات النسخية لماندلوب ومجموعة 22660 متأخرة جدًا بحيث لا تتمكن من التقاط الفطر قبل التحول إلى النمو النخري، ومع ذلك، قد يكون ماندلوب أكثر فعالية من مجموعة 22660 لأن التنظيم السريع نسبيًا لبروتين PR-10 يعزز المقاومة الأفقية.
يبدو أن ETI، الذي يحركه الجين R الأساسي، آلية شائعة لمقاومة الفاصوليا لمرض الأنثراكنوز. وهكذا، في البقوليات النموذجية Medicago truncatula، تُمنح مقاومة الأنثراكنوز بواسطة جين RCT1، وهو عضو في فئة جينات R النباتية TIR-NBS-LRR97. يمنح هذا الجين أيضًا مقاومة واسعة النطاق للأنثراكنوز في البرسيم الحجازي عند نقله إلى نباتات حساسة. في الفاصوليا الشائعة (P. vulgaris)، تم تحديد أكثر من عشرين جينًا لمقاومة الأنثراكنوز حتى الآن. توجد بعض هذه الجينات في مناطق تفتقر إلى أي جينات R أساسية، ومع ذلك توجد العديد من الجينات الأخرى على حواف الكروموسومات التي تحمل مجموعة جينات NBS-LRR، بما في ذلك TIR-NBS-LRRs99. كما أكدت دراسة SSR على مستوى الجينوم ارتباط جين NBS-LRR بمقاومة الأنثراكنوز في الفاصوليا الشائعة. تم العثور أيضًا على الجين R الأساسي في المنطقة الجينومية التي تحمل موضع مقاومة الأنثراكنوز الرئيسي في نبات الذئبة الأبيض 101.
يُظهر عملنا أن رد فعل المقاومة الفوري، الذي يُنشَّط في مرحلة مبكرة من إصابة النبات (يفضل ألا يتجاوز ١٢ ساعة بعد الإصابة)، يحمي بفعالية نبات الترمس ضيق الأوراق من مرض الأنثراكنوز الذي يسببه الفطر الممرض Collelotrichum lupini. باستخدام تسلسل عالي الإنتاجية، أظهرنا أنماط تعبير تفاضلية لجينات مقاومة الأنثراكنوز في نباتات NLL التي تتوسطها جينات المقاومة Lanr1 وAnMan. يتطلب الدفاع الناجح تصميمًا دقيقًا لجينات البروتينات المشاركة في الأكسدة والاختزال والتمثيل الضوئي والتسبب في الأمراض في غضون ساعات من أول اتصال للنبات مع مسببات الأمراض. أما ردود الفعل الوقائية المماثلة، وإن كانت متأخرة في الوقت المناسب، فهي أقل فعالية بكثير في حماية النباتات من الأمراض. تشبه مقاومة الجمرة الخبيثة التي يتوسطها جين Lanr1 الاستجابة السريعة النموذجية لجين R (المناعة التي يُحفزها المستجيب)، بينما يُوفر جين AnMan على الأرجح استجابة أفقية (مناعة يُحفزها نمط جزيئي مرتبط بالميكروب)، مما يوفر مستوى متوسطًا من الاستدامة.
تتألف سلالات NLL الـ 215 المستخدمة لفحص علامات مرض الأنثراكنوز من 74 صنفًا، و60 سلالة مُحصّلة بالتهجين أو التكاثر، و5 طفرات، و76 مادة جرثومية برية أو أصلية. جاءت السلالات من 17 دولة، معظمها من بولندا (58)، وإسبانيا (47)، وألمانيا (27)، وأستراليا (26)، وروسيا (19)، وبيلاروسيا (7)، وإيطاليا (5)، وسلالات أخرى من 10 دول. تتضمن المجموعة أيضًا سلالات مقاومة مرجعية: 83A:476، وTanjil، وWonga تحمل أليل Lanr1، وMandelup تحمل أليل AnMan. تم الحصول على السلالات من قاعدة بيانات الموارد الوراثية الأوروبية للترمس، التي تديرها شركة بوزنان لتربية النباتات المحدودة، فياتروفو، بولندا (الجدول التكميلي S1).
نمت النباتات في ظل ظروف خاضعة للرقابة (فترة ضوئية 16 ساعة، ودرجة حرارة 25 درجة مئوية خلال النهار و 18 درجة مئوية في الليل). تم تحليل اثنين من التكرارات البيولوجية. تم عزل الحمض النووي من أوراق عمرها ثلاثة أسابيع باستخدام مجموعة DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen، Hilden، ألمانيا) وفقًا للبروتوكول. تم تقييم جودة وتركيز الحمض النووي المعزول بطرق القياس الطيفي الضوئي (NanoDrop 2000؛ Thermo Fisher Scientific، Waltham، MA، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحليل علامة AnManM1 التي تميز جين مقاومة الأنثراكنوز AnMan (المشتق من صنف Mandelup) والعلامات Anseq3 و Anseq4 المحيطة بالجين Lanr1 (المشتق من صنف Tanjil) 11،26،28. تم تسجيل متماثلات الزيجوت للأليل المقاوم على أنها "1"، والحساسة - على أنها "0"، والمتغايرة - على أنها 0.5.
بناءً على نتائج فحص العلامات AnManM1 وAnSeq3 وAnSeq4، وتوافر البذور لتجارب المتابعة النهائية، تم اختيار 50 سلالة من NLL لتحديد النمط الظاهري لمقاومة الأنثراكنوز. أُجري التحليل مكررًا في دفيئة مُتحكم بها حاسوبيًا، بفترة ضوئية مدتها 14 ساعة، ونطاق درجة حرارة 22 درجة مئوية نهارًا و19 درجة مئوية ليلًا. تُخدش البذور (بقطع غلافها الخارجي بشفرة حادة) قبل الزراعة لمنع خمولها الناتج عن صلابة غلافها الخارجي، ولضمان إنبات منتظم. زُرعت النباتات في أصص (11 × 11 × 21 سم) بتربة معقمة (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warsaw, Poland). تم إجراء التلقيح باستخدام سلالة Colletotrichum lupini Col-08، المزروعة في عام 1999 من سيقان نباتات الترمس ضيقة الأوراق المزروعة في حقل في فيرزينيتسا، بولندا الكبرى (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E ). احصل على منطقة. تمت زراعة العزلات في وسط SNA عند 20 درجة مئوية تحت ضوء أسود لمدة 21 يومًا لتحفيز التبوغ. بعد أربعة أسابيع من الزراعة، عندما وصلت النباتات إلى مرحلة 4-6 أوراق، تم إجراء التلقيح عن طريق الرش بتعليق من الأبواغ بتركيز 0.5 × 106 أبواغ لكل مل. بعد التلقيح، تم الاحتفاظ بالنباتات في الظلام لمدة 24 ساعة عند رطوبة تبلغ حوالي 98٪ ودرجة حرارة 25 درجة مئوية لتسهيل إنبات الأبواغ وعملية العدوى. زُرعت النباتات بعد ذلك في فترة ضوئية مدتها 14 ساعة، عند درجة حرارة 22 درجة مئوية نهارًا/19 درجة مئوية ليلًا، ورطوبة 70%. حُسبت درجة المرض بعد 22 يومًا من التلقيح، وتراوحت بين 0 (مناعة) و9 (حساسة جدًا) حسب وجود أو عدم وجود آفات نخرية على السيقان والأوراق. بالإضافة إلى ذلك، بعد التقييم، قيست أوزان النباتات. حُسبت العلاقة بين الأنماط الجينية للعلامات والأنماط الظاهرية للمرض من خلال ارتباطات نقطتين متتاليتين (غياب العلامات المتغايرة في مجموعة السلالات لتحليل النمط الظاهري لمقاومة مرض الأنثراكنوز).