نشكركم على زيارة موقع Nature.com. يُعاني متصفحكم من محدودية دعم CSS. للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح مُحدّث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). في هذه الأثناء، ولضمان استمرار الدعم، سنعرض الموقع بدون أنماط CSS وجافا سكريبت.
يُعدّ الترمس ضيق الأوراق (Lupinus angustifolius L.) من البقوليات المستخدمة في إنتاج الغذاء وتحسين التربة. وقد أدّى التوسع العالمي لزراعة الترمس ضيق الأوراق إلى جذب العديد من الفطريات الممرضة، بما في ذلك فطر أنثراكنوز الترمس، الذي يُسبّب مرض الأنثراكنوز المُدمّر. استُخدم أليلان، Lanr1 وAnMan، يُعزّزان مقاومة المرض، في تهجين الترمس ضيق الأوراق، إلا أن الآليات الجزيئية الكامنة وراء ذلك لا تزال مجهولة. في هذه الدراسة، استُخدمت علامات Lanr1 وAnMan لفحص عينات الترمس ضيق الأوراق الأوروبية. وأكّد اختبار اللقاح في بيئة مُحكمة فعالية كلا السلالتين المُقاومتين. أُجري تحليل التعبير الجيني التفاضلي على سلالات مُمثلة مُقاومة وأخرى حساسة. وارتبطت مقاومة الأنثراكنوز بزيادة التعبير عن مصطلحات علم الجينات "GO:0006952 الاستجابة الدفاعية"، و"GO:0055114 عملية الأكسدة والاختزال"، و"GO:0015979 عملية التمثيل الضوئي". بالإضافة إلى ذلك، أظهر خط Lanr1(83A:476) إعادة برمجة ملحوظة للنسخ الجيني بسرعة بعد التلقيح، بينما أظهرت الخطوط الأخرى تأخيرًا في هذه الاستجابة بحوالي 42 ساعة. ترتبط الاستجابات الدفاعية بجينات TIR-NBS وCC-NBS-LRR وNBS-LRR، وعشرة بروتينات تشارك في إمراضية الفطريات، وبروتينات نقل الدهون، وإنزيم إندوغلوكان-1،3-β-غلوكوزيداز، وبروتينات جدار الخلية الغنية بالجليسين، وجينات من مسار تفاعل الأكسجين. تزامنت الاستجابات المبكرة لـ 83A:476، بما في ذلك الكبح الدقيق للجينات المرتبطة بعملية التمثيل الضوئي، مع الحماية الناجحة خلال مرحلة النمو الخضري للفطريات، مما يشير إلى أن عاملًا مؤثرًا يحفز المناعة. يتباطأ تفاعل مانديلوب، وكذلك السحب الأفقي الكلي.
يُعدّ الترمس ضيق الأوراق (Lupinus angustifolius L.) من الحبوب الغنية بالبروتين، وموطنه الأصلي غرب البحر الأبيض المتوسط.^1,2 يُزرع حاليًا كمحصول غذائي للحيوانات والبشر، كما يُعتبر سمادًا أخضر في أنظمة تناوب المحاصيل نظرًا لقدرته على تثبيت النيتروجين بواسطة بكتيريا تثبيت النيتروجين التكافلية، وتحسينه الشامل لبنية التربة. وقد شهد الترمس ضيق الأوراق عملية استئناس سريعة خلال القرن الماضي، ولا يزال يخضع لضغوط تربية عالية.^{3,4,5,6,7,8,9,10,11,12} ومع انتشار زراعته، ظهرت أنواع جديدة من الفطريات الممرضة، مما أدى إلى ظهور أمراض جديدة تُلحق أضرارًا بالغة بالمحاصيل. كان الأمر الأكثر إثارة للدهشة بالنسبة لمزارعي ومربي الترمس هو ظهور مرض الأنثراكنوز، الذي تسببه الفطريات الممرضة، Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. كان الأمر الأكثر إثارة للدهشة بالنسبة لمزارعي ومربي الترمس هو ظهور مرض الأنثراكنوز، الذي تسببه الفطريات الممرضة، Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. أفضل أنواع المبيدات الحشرية للمزارعين ومختاري الترمس هي عدوى جرثومية مسببة للسرطان Colletotrichum lupini (بوندار) نيرنبرج، فايلر وهاجيدورن13. كان أبرز ما لاحظه مزارعو ومربو الترمس هو ظهور مرض الأنثراكنوز الناجم عن الفطر الممرض Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说،最引人注目的是炭疽病的出现،它是由病原真菌Colletotrichum lupini (بوندار) نيرنبرج، فايلر وهاجيدورن13.对于羽扇豆农民والمزيد (بوندار)嵵شعر.1 إن أفضل أنواع المبيدات الحشرية للمزارعين ومختاري الترمس هي أكثر أنواع العدوى المسببة للأمراض شيوعًا كوليتوتريتشوم لوبيني (بوندار) نيرنبرج، فايلر وهاجيدورن13. إن أكثر ما يلفت انتباه مزارعي ومربي الترمس هو ظهور مرض الأنثراكنوز الناجم عن الفطر الممرض Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.وردت أولى التقارير عن المرض من البرازيل والولايات المتحدة، حيث ظهرت الأعراض النموذجية في عامي 1912 و1929 على التوالي. ومع ذلك، وبعد حوالي 30 عامًا، تم تصنيف العامل الممرض على أنه Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (ستونمان) سبولد. & Sacc.، الطور التكاثري الجنسي لـ Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.، 有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.، 有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld في الأشكال الجينية. & Sacc.، Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld في علم التشكل المستهدف. و هـ. شرينك. و هـ. شرينك، .و هـ. شرينك. & H.施伦克،. & H.施伦克،.و هـ. شلينك، .أظهرت الدراسات الأولية لتصنيف الأمراض في منتصف القرن العشرين بعض المقاومة في سلالات الترمس الأصفر (L. luteus L.) والترمس الأبيض (L. albus L.)، بينما كانت جميع سلالات الترمس الأبيض المختبرة شديدة الحساسية^15،16. وقد بينت الدراسات أن تطور مرض الأنثراكنوز يرتبط بزيادة هطول الأمطار (رطوبة الهواء) ودرجة الحرارة (في نطاق 12-28 درجة مئوية)، مما يؤدي إلى فقدان المقاومة عند درجات حرارة أعلى^17،18. في الواقع، كان الوقت اللازم لإنبات الأبواغ وبدء المرض أقصر بأربع مرات عند 24 درجة مئوية (4 ساعات) مقارنةً بـ 12 درجة مئوية (16 ساعة) في ظل ظروف الرطوبة العالية¹⁹. وبالتالي، فقد أدى الاحتباس الحراري المستمر إلى انتشار مرض الأنثراكنوز. مع ذلك، لوحظ المرض في فرنسا (1982) وأوكرانيا (1983) كعلامة تحذيرية لخطر وشيك، لكن يبدو أن صناعة الترمس تجاهلته آنذاك^20،21. بعد بضع سنوات، انتشر هذا المرض المدمر في جميع أنحاء العالم، وأصاب أيضًا دولًا رئيسية منتجة للترمس مثل أستراليا وبولندا وألمانيا^22،23،24. عقب تفشي مرض الأنثراكنوز في منتصف التسعينيات، أسفرت عمليات الفحص المكثفة عن تحديد العديد من السلالات المقاومة في عينات NLL¹⁹. تُسيطر على مقاومة NLL لمرض الأنثراكنوز أليلان سائدان منفصلان موجودان في مصادر وراثية مختلفة: Lanr1 في صنفَي تانجيل وونغا، وAnMan في صنف ماندالاي^25،26. تُكمل هذه الأليلات المؤشرات الجزيئية التي تدعم اختيار السلالات المقاومة في برامج التربية^{25،26،27،28،29،30}. تم تهجين السلالة المقاومة 83A:476 الحاملة لأليل Lanr1 مع السلالة البرية الحساسة P27255 للحصول على مجموعة من سلالات RIL ذات مقاومة لمرض الأنثراكنوز، مما مكّن من تحديد موقع Lanr1 على الكروموسوم NLL-11. وبمقارنة علامات خريطة الارتباط من مواقع المقاومة المجاورة للأنثراكنوز مع الإطار الجينومي NLL، تبين أن الأليلات الثلاثة تقع على نفس الكروموسوم (NLL-11)، ولكن في مواقع مختلفة. ومع ذلك، ونظرًا لقلة عدد سلالات RIL والمسافة الجينية الكبيرة بين العلامات والأليلات المقابلة، لا يمكن استخلاص استنتاجات موثوقة حول جيناتها الأساسية. من جهة أخرى، يُعد استخدام الهندسة الوراثية العكسية في الترمس صعبًا نظرًا لانخفاض قدرتها على التجدد، مما يجعل التلاعب الجيني معقدًا.
أدى تطوير سلالات مستأنسة تحمل الأليل المرغوب فيه في الحالة المتماثلة، مثل 83A:476 (Lanr1) وMandelup (AnMan)، إلى فتح آفاق جديدة لدراسة مقاومة الأنثراكنوز في ظل وجود تراكيب أليلية متضادة في التجمعات البرية. وتشمل هذه الدراسة دراسة الآليات الجزيئية المحتملة، ومقارنة الاستجابات الدفاعية الناتجة عن أنماط جينية محددة. وقد قيّمت هذه الدراسة الاستجابة المبكرة للنسخ الجيني لسلالة NLL للتطعيم بفطر C. lupini. في البداية، تم فحص مجموعة من سلالات NLL الأوروبية، تضم 215 سلالة، باستخدام مؤشرات جزيئية تحدد الأليلين Lanr1 وAnMan. ثم أُجري توصيف ظاهري للأنثراكنوز على 50 سلالة من NLL، تم اختيارها مسبقًا بناءً على المؤشرات الجزيئية، في ظل ظروف مضبوطة. استنادًا إلى هذه التجارب، تم اختيار أربعة سلالات تختلف في مقاومة الأنثراكنوز والتركيب الأليلي Lanr1/AnMan لتحديد التعبير الجيني الدفاعي التفاضلي باستخدام نهجين متكاملين: التسلسل عالي الإنتاجية للحمض النووي الريبي والقياس الكمي لتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي.
أظهر فحص مجموعة من بلازما جرثومية NLL (عددها 215) باستخدام الواسمات Lanr1 (Anseq3 وAnseq4) وAnMan (Anseq4) وAnMan (AnManM1) أن سلالة واحدة فقط (95726، بالقرب من Salamanca-b) تُظهر تضخيمًا لأليل "المقاومة" لجميع الواسمات، بينما كشف فحص "وجود أليلات "الاستعداد" عن نسبة جميع الواسمات في 158 سلالة (حوالي 73.5%). أنتجت 13 سلالة أليلين "مقاومين" للواسم Lanr1، وأنتجت 8 سلالات أليلات "مقاومة" للواسم Lanr1. أما أليل "المقاومة" للواسم AnMan (انظر الجدول التكميلي S1). كانت سلالتان غير متجانستين للواسم Anseq3، وسلالة واحدة غير متجانسة للواسم AnManM1. حملت 42 سلالة (19.5%) أطوارًا متعاكسة من أليلات Anseq3 وAnseq4، مما يشير إلى ارتفاع معدل إعادة التركيب بين هذين الموقعين الجينيين. وكشفت الأنماط الظاهرية لمرض الأنثراكنوز في ظل ظروف مضبوطة (الجدول التكميلي S2) عن تباين في مقاومة الأنماط الجينية المختبرة، وهو ما انعكس في شدة المرض. وتراوحت الفروق في متوسط ​​الدرجات من 1.8 (مقاومة متوسطة) إلى 6.9 (قابلة للإصابة)، بينما تراوحت الفروق في وزن النبات من 0.62 (قابلة للإصابة) إلى 4.45 غرام (مقاومة). كان هناك ارتباط كبير بين القيم التي لوحظت في تكرارين للتجربة (0.51 لدرجات شدة المرض، P = 0.00017 و 0.61 لوزن النبات، P < 0.0001) وكذلك بين هذين المعيارين (-0.59 و-0.77، P < 0.0001). كان هناك ارتباط كبير بين القيم التي لوحظت في تكرارين للتجربة (0.51 لدرجات شدة المرض، P = 0.00017 و 0.61 لوزن النبات، P < 0.0001) وكذلك بين هذين المعيارين (-0.59 و-0.77، P < 0.0001). ترابط رائع بين المتابعين، تم رصده في تجربتين خلفيتين (0,51 للكرة المزعجة, P = 0,00017 و 0,61 للكثافة الكبيرة, P < 0,0001), وكذلك بين تلك المعلمات المزدوجة (-0,59 و -0,77, Р < 0.0001) 0.0001). تم العثور على ارتباط كبير بين القيم التي لوحظت في تكرارين للتجربة (0.51 لدرجات شدة المرض، P = 0.00017 و 0.61 لوزن النبات، P < 0.0001)، وكذلك بين هذين المعيارين (-0.59 و -0.77، P < 0.0001) 0.0001).يجب أن تكون النتيجة النهائية هي 0.51، P = 0.00017، أو 0.61، P <0.0001) من 0.59 إلى 0.77، P <0.0001).قد يكون من الصعب العثور على أي شيء آخر في أي مكان آخر 0.51، p = 0.00017، 植物 为 为 0.61، p <0.0001) 以及 两 个 参数 之间 ````- 0.59 和– 0.59 和– 0.59 和- 0.59 和- 0.77، P <0.0001). تم فحص الترابط الأساسي بين الدرجات، والملاحظة في اثنتين من النتيجتين (تقييم التصنيف 0,51، P = 0,00017 وحجم كبير 0,61, P <0,0001), وبين اثنين من المعلمات (-0,59 و -0,0001) 0,77, P <0,0001. كان هناك ارتباط كبير بين القيم التي لوحظت في التكرار (درجة شدة المرض 0.51، P = 0.00017 ووزن النبات 0.61، P < 0.0001) وبين هذين المعيارين (-0.59 و-0.0001) 0.77، P<0.0001. ).تشمل الأعراض النموذجية التي تظهر في النباتات المعرضة للإصابة التواء الساق وانحناءه بشكل يشبه قوس الراعي، يليه ظهور آفات بيضاوية الشكل تحتوي على أبواغ برتقالية/وردية اللون (الشكل التكميلي 1). تُظهر السلالات الأسترالية الحاملة لجيني Lanr1 (83A:476 وTanjil) وAnMan (Mandelup) مقاومة متوسطة (0.0331 و0.0036 على التوالي). كما تُظهر بعض السلالات التي تحمل أيضًا أليلات Lanr1 و/أو AnMan "المقاومة" أعراض المرض.
ومن المثير للاهتمام أن بعض سلالات NLL التي تفتقر إلى أي أليل علامة "مقاومة" أظهرت مستوى عالٍ من مقاومة الأنثراكنوز (مماثل أو أعلى من الأنماط الجينية Lanr1 أو AnMan)، مثل Boregine (قيمة P < 0.0001 لكلا المعلمتين)، وBojar (قيمة P < 0.0001 للنتيجة و0.001 لوزن النبات) وPopulation B-549/79b (قيمة P < 0.0001 للنتيجة وغير ذات دلالة إحصائية للوزن). ومن المثير للاهتمام أن بعض سلالات NLL التي تفتقر إلى أي أليل علامة "مقاومة" أظهرت مستوى عالٍ من مقاومة الأنثراكنوز (مماثل أو أعلى من الأنماط الجينية Lanr1 أو AnMan)، مثل Boregine (قيمة P < 0.0001 لكلا المعلمتين)، وBojar (قيمة P < 0.0001 للنتيجة و0.001 لوزن النبات) وPopulation B-549/79b (قيمة P < 0.0001 للنتيجة وغير ذات دلالة إحصائية للوزن). من المثير للاهتمام أن هناك عددًا قليلاً من خطوط NLL, أفضل العلامات التجارية "المقاومة" التي تظهر قوة عالية للغاية أنتراكنوزي (مجهز أو عالي الجودة للنمط الوراثي Lanr1 أو AnMan)، مثل Boregine (يُعرف باسم P <0,0001 لـ المعلمات العامة)، Bojar (العلامة P <0,0001 للنقاط و 0,001 للكتلة) والكثافة B-549/79b (العلامة P <0,0001 للنقاط و لا داعي للكتلة). ومن المثير للاهتمام أن العديد من سلالات NLL التي تفتقر إلى أي أليل علامة "مقاومة" أظهرت مستوى عالٍ من المقاومة لمرض الأنثراكنوز (مقارنة أو أعلى من الأنماط الجينية Lanr1 أو AnMan)، مثل Boregine (قيمة P < 0.0001 لكلا المعلمتين)، وBojar (قيمة P < 0.0001 للتقييم و0.001 لوزن النبات) والسكان B-549/79b (قيمة P < 0.0001 للتقييم وغير ذات دلالة إحصائية للوزن).تم تصميم هذه اللعبة خصيصًا لـ "抗性" من خلال سلسلة NLL من Lanr1 أو AnMan基因型相当或更高),例如Boregine(两个参数的P 值< 0.0001),Bojar(P) أقل من 0.0001، 0.001، وB-549/79b (得分P 值< 0.0001، 重量不显着). ومن المثير للاهتمام أن بعض أنظمة NLL التي لا تحتوي على أي علامات "مستضدية" تُظهر مقاومة أفقية عالية (تعادل جينات Lanr1 أو AnMan أو أعلى)، مثل Boregine (كلا المعلمتين P < 0.0001)، وBojar (قيمة P < 0.0001، وزن النبات 0.001) والسلالة B-549/79b (قيمة P < 0.0001، الوزن غير مهم). من المثير للاهتمام أن بعض خطوط NLL التي تحتوي على علامات مميزة للأزقة "المقاومة" تعرض جودة عالية للغاية لـ أنتراكنوزي (مختصر أو أحدث من خلال النمط الجيني Lanr1 أو AnMan)، مثل Boregine (يُعرف باسم P للمعلمات <0,0001)، Bojar (الوزن P <0,0001, الكتلة 0,001) والكثافة B-549/79b (الوزن P-الوزن <0,0001, الكتلة غير متجانسة). ومن المثير للاهتمام أن بعض سلالات NLL التي تفتقر إلى أي أليلات علامة "المقاومة" أظهرت مستويات عالية من مقاومة الأنثراكنوز (مقارنة أو أعلى من الأنماط الجينية Lanr1 أو AnMan)، مثل Boregine (قيمة P لكلا المعلمتين <0.0001)، وBojar (قيمة P < 0.0001، وزن النبات 0.001) والسكان B-549/79b (قيمة P < 0.0001، الوزن غير ذي دلالة إحصائية).تشير هذه الظاهرة إلى إمكانية وجود مصدر وراثي جديد للمقاومة، مما يفسر عدم وجود ارتباط ملحوظ بين الأنماط الجينية للعلامات والأنماط الظاهرية للمرض (قيم P من 0.42 إلى 0.98 تقريبًا). وبالتالي، أظهر اختبار كولموغوروف-سميرنوف أن بيانات مقاومة الأنثراكنوز موزعة توزيعًا طبيعيًا تقريبًا للدرجات (قيم P 0.25 و0.11) وكتلة النبات (قيم P 0.47 و0.55)، مما يشير إلى أن هناك أليلات أخرى غير Lanr1 وAnMan متورطة.
استنادًا إلى نتائج فحص مقاومة الأنثراكنوز، تم اختيار أربعة سلالات لتحليل النسخ الجيني: 83A:476، وBoregine، وMandelup، وPopulation 22660. أُعيد اختبار هذه السلالات لمقاومة الأنثراكنوز في تجارب التلقيح باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA)، شريطة أن تكون نتائجها مماثلة للاختبار السابق. وكانت قيم النتائج كما يلي: Boregin (1.71 ± 1.39)، و83A:476 (2.09 ± 1.38)، وMandelup (3.82 ± 1.42)، وPopulation 22660 (6.11 ± 1.29).
حقق بروتوكول Illumina NovaSeq 6000 متوسط ​​40.5 مليون زوج قراءة لكل عينة (من 29.7 إلى 54.4 مليون قراءة) (الجدول التكميلي S3). تراوحت درجات المحاذاة في التسلسل المرجعي من 75.5% إلى 88.6%. تراوح متوسط ​​ارتباط بيانات عدد القراءات بين المتغيرات التجريبية في التكرارات البيولوجية من 0.812 إلى 0.997 (المتوسط ​​0.959). من بين 35170 جينًا تم تحليلها، لم يُظهر 2917 جينًا أي تعبير، وتم التعبير عن الجينات الـ 4785 الأخرى بمستوى ضئيل (المتوسط ​​الأساسي < 5). من بين 35170 جينًا تم تحليلها، لم يُظهر 2917 جينًا أي تعبير، وتم التعبير عن الجينات الـ 4785 الأخرى بمستوى ضئيل (المتوسط ​​الأساسي < 5). من 35 170 تم تحليل الجينات 2917 لم يتم اختبار التعبير عنها، وأصلي 4785 جين معبر عن عدم اليقين уровне (baзовое сredнее <5). من بين 35170 جينًا تم تحليلها، لم يظهر 2917 جينًا أي تعبير، وتم التعبير عن الجينات المتبقية البالغ عددها 4785 جينًا بمستوى ضئيل (المتوسط ​​الأساسي <5).35,170 دولارًا أمريكيًا، 2917 دولارًا أمريكيًا، 4785 دولارًا أمريكيًا个基因的表达可以忽略不计(基本平均值<5).35170 من 35 170 تم تحليل الجينات 2917 غير معبر عنها، وأصلي 4785 جين لها عبارات غير معبرة (أساسيات أساسية <5). من بين 35170 جينًا تم تحليلها، لم يتم التعبير عن 2917 جينًا، وكان التعبير عن الجينات المتبقية البالغ عددها 4785 جينًا ضئيلاً (المتوسط ​​الأساسي <5).وبالتالي، بلغ عدد الجينات التي تم اعتبارها معبرة (المتوسط ​​الأساسي ≥ 5) خلال التجربة 27468 (78.1٪) (الجدول التكميلي S4).
منذ اللحظة الأولى، استجابت جميع سلالات NLL لتلقيح C. lupini (السلالة Col-08) بإعادة برمجة النسخ الجيني (الجدول 1)، إلا أنه لوحظت اختلافات كبيرة بين السلالات. فعلى سبيل المثال، أظهرت سلالة المقاومة 83A:476 (الحاملة لجين Lanr1) إعادة برمجة ملحوظة للنسخ الجيني عند اللحظة الأولى (6 ساعات بعد التلقيح)، مع زيادة تتراوح بين 31 و69 ضعفًا في عدد الجينات المُعبر عنها بشكل إيجابي وسلبي مقارنةً باللحظات الأخرى عند هذه النقطة الزمنية. علاوة على ذلك، كانت هذه الذروة قصيرة الأمد، حيث لم يتبق سوى عدد قليل من الجينات متغيرة بشكل ملحوظ عند اللحظة الثانية (12 ساعة بعد التلقيح). ومن المثير للاهتمام أن سلالة Boregine، التي أظهرت أيضًا مستوى عالٍ من المقاومة في اختبار التطعيم، لم تخضع لمثل هذه إعادة البرمجة الجينية الواسعة النطاق خلال التجربة. ومع ذلك، كان عدد الجينات المُعبر عنها بشكل مختلف (DEG) متساويًا في كل من Boregine و83A:476 عند 12 ساعة بعد التلقيح. أظهر كل من مانديلوب والسكان 22660 ذروة DEG في آخر نقطة زمنية (48 لتر/ثانية)، مما يشير إلى تأخير نسبي في الاستجابات الدفاعية.
نظراً لأن السلالة 83A:476 خضعت لإعادة برمجة واسعة النطاق للنسخ الجيني استجابةً لفطر C. lupini بعد 6 ساعات من الإصابة، مقارنةً بجميع السلالات الأخرى، فإن حوالي 91% من الجينات المتغيرة التعبير (DEGs) التي لوحظت في هذه المرحلة الزمنية كانت خاصة بالسلالة (الشكل 1). مع ذلك، كان هناك بعض التداخل في الاستجابات المبكرة بين سلالات الدراسة، حيث تداخلت نسب 68.5% و50.9% و52.6% من الجينات المتغيرة التعبير في سلالات Boregine وMandelup والمجموعة السكانية 22660، على التوالي، مع تلك الموجودة في السلالة 83A:476 في نقاط زمنية معينة. ومع ذلك، لم تُمثل هذه الجينات المتغيرة التعبير سوى جزء صغير (0.97-1.70%) من جميع الجينات المتغيرة التعبير التي تم الكشف عنها حالياً باستخدام السلالة 83A:476. بالإضافة إلى ذلك، كانت 11 جينة متباينة التعبير من جميع السلالات متسقة في هذا الوقت (الجداول التكميلية S4-S6)، بما في ذلك المكونات المشتركة لاستجابات الدفاع النباتية: بروتين نقل الدهون (TanjilG_32225)، وإنزيم إندوغلوكان-1،3-β-غلوكوزيد (TanjilG_23384)، وبروتينان قابلان للتحفيز بالإجهاد مثل SAM22 (TanjilG_31528 وTanjilG_31531)، وبروتين اللاتكس الأساسي (TanjilG_32352)، وبروتينان غنيان بالجليسين لجدار الخلية الهيكلي (TanjilG_19701 وTanjilG_19702). كان هناك أيضًا تداخل مرتفع نسبيًا في استجابات النسخ بين 83A:476 و Boregine عند 24 ساعة بعد الإصابة (إجمالي 16-38٪ DEG) وبين Mandelup و Population 22660 عند 48 ساعة بعد الإصابة (إجمالي 14-20٪ DEG).
مخطط فين يوضح عدد الجينات المتغيرة التعبير (DEG) في سلالات الترمس ضيق الأوراق (NLL) المُلقّحة بفطر Colletotrichum lupini (السلالة Col-08 المُستخلصة من حقول الترمس في فيرزينيتسه، بولندا، عام 1999). شملت سلالات الترمس ضيق الأوراق المُحللة: 83A:476 (مقاومة، تحمل الأليل Lanr1)، وBoregine (مقاومة، الخلفية الوراثية غير معروفة)، وMandelup (مقاومة بشكل متوسط، تحمل الأليل AnMan)، والسلالة 22660 (شديدة الحساسية). يشير الاختصار hpi إلى عدد الساعات بعد التطعيم. تم حذف القيم الصفرية لتبسيط الرسم البياني.
تم تحليل مجموعة الجينات المُفرطة التعبير بعد 6 ساعات من الإصابة للكشف عن وجود نطاقات جينات المقاومة الكلاسيكية (الجدول التكميلي S7). كشفت هذه الدراسة عن تحفيز النسخ الجيني لجينات مقاومة الأمراض الكلاسيكية التي تحتوي على نطاقات NBS-LRR فقط عند الموضع 83A:476. تضمنت هذه المجموعة جينًا واحدًا من نوع TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042)، وخمسة جينات من نوع CC-NBS-LRR (tanjilg_06165، tanjilg_06162، tanjilg_22773، tanjilg_22640، وtanjilg_16162)، وأربعة جينات من نوع NBS-LR (tanjilg_16162)، وأربعة جينات من نوع NBS-LRRE (tanjilg_16162)، بالإضافة إلى أربعة جينات من نوع NBS-Lrr (tanjilg_16162) وأربعة جينات من نوع NBS-LRR (TANJILG_16162). تحتوي جميع هذه الجينات على نطاقات أساسية مرتبة في تسلسلات محفوظة. بالإضافة إلى جينات نطاق NBS-LRR، تم تنشيط العديد من كينازات RLL عند 6 ساعات بعد الإصابة، وهي: واحد في سلالة Boregine (TanjilG_19877)، واثنان في سلالة Mandelup (TanjilG_07141 وTanjilG_19877) وفي السلالة 22660 (TanjilG_09014 وTanjilG_10361)، واثنان في السلالة 83A 27:476.
تم إخضاع الجينات التي تغيرت تعبيرها بشكل كبير استجابة للتلقيح بـ C. lupini (السلالة Col-08) لتحليل إثراء علم الجينات (GO) (الجدول التكميلي S8). كان مصطلح العملية البيولوجية الأكثر تمثيلاً بشكل مفرط هو "GO:0006952 استجابة الدفاع" والذي ظهر في 6 من أصل 16 تركيبة (الوقت × الخط) ذات دلالة عالية (قيمة P < 0.001) (الشكل 2). كان مصطلح العملية البيولوجية الأكثر تمثيلاً بشكل مفرط هو "GO:0006952 استجابة الدفاع" والذي ظهر في 6 من أصل 16 تركيبة (الوقت × الخط) ذات دلالة عالية (قيمة P < 0.001) (الشكل 2). كان المصطلح المقترح إلى حد كبير لعملية بيولوجية "GO: 0006952 ردًا آمنًا" ، والذي تم إرساله إلى 6 من 16 (الزمن × الخط) مزيج مع أقصى قدر من الدقة (الرمز P <0,001) (ريس.2). كان مصطلح العملية البيولوجية الأكثر تمثيلاً بشكل مفرط هو "GO:0006952 استجابة الدفاع"، والذي ظهر في 6 من 16 تركيبة (الوقت × السلالة) ذات دلالة عالية (قيمة P < 0.001) (الشكل 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应“،它出现在16 个(时间×线)组合中的6个中، 具有高显着性(P 值< 0.001)(图2). إن مصطلح العملية البيولوجية الأكثر تمثيلاً هو "GO:0006952 الاستجابة الدفاعية"، والذي يظهر في 6 من أصل 16 تركيبة (الوقت × الخط)، مع أهمية عالية (قيمة P < 0.001) (الشكل 2). كان المصطلح المقترح إلى حد كبير لعملية البيولوجيا البيولوجية «GO: 0006952 Defense Response»، الذي تم طرحه في 6 من 16 مزيج (الزمن × الخط) مع فارق كبير (الزمن P <0,001) (ريس.2). كان مصطلح العملية البيولوجية الأكثر تمثيلاً بشكل مفرط هو 'GO:0006952 الاستجابة الدفاعية'، والذي ظهر في 6 من أصل 16 تركيبة (الوقت × الخط) بدلالة عالية (قيمة P < 0.001) (الشكل 2).كان هذا المصطلح مُفرط التمثيل في نقطتين زمنيتين في السلالتين 83A: 476 وBoregine (بعد 6 و24 ساعة من الإصابة)، وفي نقطة زمنية واحدة في السلالتين Mandelup وPopulation 22660 (بعد 12 و6 ساعات من الإصابة، على التوالي). هذه نتيجة متوقعة، تُبرز الاستجابة المضادة للفطريات لدى السلالات المقاومة. إضافةً إلى ذلك، استجابت السلالة 83A:476 لفطر C. lupini عن طريق التحفيز السريع للجينات المرتبطة بالاندفاع التأكسدي المُمثل بالمصطلح "GO:0055114 عملية الأكسدة والاختزال"، مما يُشير إلى استجابة دفاعية مُحددة، بينما أظهرت السلالة Boregine استجابات دفاعية مُحددة، مرتبطة بالمصطلح "GO". استجابة الإجهاد: 0006950. فعّلت المجموعة السكانية 22660 استجابة المقاومة الأفقية التي تشمل المستقلبات الثانوية، مما يسلط الضوء على العدد المفرط من المصطلحات "GO:0016104 عملية التخليق الحيوي للتريتربين" و"GO:0006722 عملية استقلاب التريتربين" (ينتمي كلا المصطلحين إلى نفس مجموعة الجينات). مع الأخذ في الاعتبار نتائج تحليل إثراء مصطلحات GO، كان استقرار تفاعل مانديلوب متوسطًا بين بورجينا والمجموعة السكانية 22660. بالإضافة إلى ذلك، يتضمن التفاعل المبكر 83A:476 (6 ساعات بعد الإصابة) والتفاعل المتأخر مانديلوب والمجموعة السكانية 22660 المصطلح GO:0015979 "التمثيل الضوئي" وعمليات بيولوجية أخرى ذات صلة.
إن مصطلحات علم وظائف الجينات المستخدمة في العمليات الحيوية، والتي تم اختيارها في شرح الجينات المتغيرة التعبير خلال استجابات النسخ الجيني لنبات الترمس ضيق الأوراق (NLL) المُلقح بسلالة الترمس المصابة بالجمرة الخبيثة (سلالة Col-08 التي تم الحصول عليها من حقول الترمس في فيرزينيتسه، بولندا، عام 1999)، مبالغ فيها بشكل كبير. وشملت سلالات الترمس ضيق الأوراق التي تم تحليلها: 83A:476 (مقاومة، تحمل الأليل المتماثل Lanr1)، وBoregine (مقاومة، ذات خلفية وراثية غير معروفة)، وMandelup (مقاومة بشكل متوسط، تحمل الأليل المتماثل AnMan)، والسلالة 22660 (قابلة للإصابة).
نظراً لأن هذه الدراسة هدفت إلى تحديد الجينات المساهمة في مقاومة مرض الأنثراكنوز، فقد تم تحليل الجينات المصنفة ضمن مصطلحي "GO: 0006952 الاستجابات الدفاعية" و"GO: 0055114 عمليات الأكسدة والاختزال" باستخدام عتبات محددة، حيث تم حساب متوسط ​​خط الأساس ≥ 30 مع وجود خط واحد على الأقل × نقطة زمنية، مع دمج القيم ذات الدلالة الإحصائية لـ log2 (التغير المطوي). بلغ عدد الجينات التي استوفت هذه المعايير 65 جيناً لـ GO:0006952 و524 جيناً لـ GO:0055114.
كشفت 83A:476 عن ذروتين للتعبير الجيني التفاضلي (DEG) مُعَلَّمتين بالمصطلح GO:0006952، الأولى عند 6 جينات لكل بوصة (64 جينًا، تنظيم تصاعدي وتنازلي)، والثانية عند 24 جينًا لكل بوصة (15 جينًا، تنظيم تصاعدي فقط). كما أظهرت Boregine أن GO:0006952 بلغت ذروتها في نفس الوقت، ولكن مع عدد أقل من الجينات المُعبَّرة تفاضليًا (11 و8) وتنشيط تفضيلي. وأظهرت Mandeloop ذروتين لـ GO:0006952 عند 12 و48 ساعة بعد الإصابة، تحمل كلتاهما 12 جينًا (الأولى بجينات مُنشِّطة، والثانية بجينات مُثبِّطة فقط)، بينما أظهرت المجموعة 22660 عند 6 ساعات بعد الإصابة (13 جينًا) غلبة أكبر لذروة التنظيم التصاعدي. تجدر الإشارة إلى أن 96.4% من الجينات المتغيرة التعبير (DEG) في هذه القمم، والمُشار إليها بالرمز GO:0006952، أظهرت نفس نوع الاستجابة (زيادة أو نقصان)، مما يدل على تداخل كبير في الاستجابات الدفاعية على الرغم من الاختلافات في عدد الجينات المُشاركة. تُشفّر أكبر مجموعة من التسلسلات المرتبطة بالرمز GO:0006952 بروتين SAM22-like، وهو بروتين ينتمي إلى فئة بروتينات PR-10 (بروتينات مرتبطة بالإمراض من الفئة 10) وبروتين MLP-like (بروتين مشابه لبروتين اللاتكس) (الشكل 3). اختلفت المجموعتان في طبيعة التعبير واتجاه الاستجابة. أظهرت الجينات التي تُشفّر بروتينات SAM22-like تحفيزًا ثابتًا وهامًا في المراحل المبكرة (6 أو 12 ساعة بعد الإصابة)، وكانت غير مُستجيبة بشكل عام في نهاية التجربة (48 ساعة بعد الإصابة)، بينما أظهرت بروتينات MLP-like تنسيقًا عند 6 ساعات بعد الإصابة. عند 83A:476 و Mandelup عند 48 حصان/بوصة، لم تستجب جميع نقاط البيانات الأخرى تقريبًا. بالإضافة إلى ذلك، تباينت أنماط التعبير الجيني لبروتينات SAM22 تبعًا للتغيرات الملحوظة في مقاومة الأنثراكنوز، حيث أظهرت السلالات الأكثر مقاومة عددًا أكبر من نقاط الزمن التي حفزت هذه الجينات بشكل ملحوظ مقارنةً بالجينات الأكثر حساسية. كما أظهر جين PR-10 آخر شبيه بـ LlR18A/B نمط تعبير مشابهًا جدًا لجين بروتين SAM22.
تم تحديد المكونات الرئيسية للعملية البيولوجية "GO:0006952 الاستجابة الدفاعية" وأنماط التعبير الجيني للجينات المرشحة للأليلين Lanr1 وAnMan. يُمثل مقياس Log2 قيم log2 (التغير النسبي) بين النباتات المُلقحة (Colletotrichum lupini، السلالة Col-08، المُستخلصة من حقول الترمس، فيجينيكا، بولندا، 1999) والنباتات الضابطة (المُلقحة ظاهريًا) في نفس الوقت. تم تحليل سلالات الترمس ضيقة الأوراق التالية: 83A:476 (مقاومة، تحمل الأليل المتماثل Lanr1)، وBoregine (مقاومة، الخلفية الوراثية غير معروفة)، وMandelup (مقاومة بشكل متوسط، تحمل الأليل المتماثل AnMan)، وPopulation 22660 (قابلة للإصابة).
بالإضافة إلى ذلك، تم تقييم أنماط التعبير الجيني لجينات Lanr1 (TanjilG_05042) وAnMan (TanjilG_12861) المرشحة لتسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) (الشكل 3). أظهر جين TanjilG_05042 استجابةً ملحوظة (تنشيطًا) عند 83A:476 فقط في النقطة الزمنية الأولى (6 ساعات بعد الإصابة)، بينما كان جين TanjilG_12861 ملحوظًا في Mandeloop فقط في نقطتين زمنيتين: 6 ساعات بعد الإصابة (تثبيط) و24 ساعة بعد الإصابة (6 ساعات بعد الإصابة).
كانت الجينات الأكثر تعبيرًا في مصطلح GO:0055114 "عملية الأكسدة والاختزال" هي الجينات التي تشفر بروتينات السيتوكروم P450 والبيروكسيداز (الشكل 4). بالنسبة للعينات المعزولة من السلالة 83A:476 بعد 6 ساعات من التلقيح، لوحظت أعلى أو أدنى قيم لوغاريتمية (التغير المطوي) (لـ 86.6% من الجينات) بشكل عام بين النباتات الملقحة والنباتات الضابطة، مما يسلط الضوء على الاستجابة العالية لهذا النمط الوراثي للتلقيح. أظهرت السلالة 83A:476 أعلى تعبير تفاضلي معنوي لجين GO:0055114 بعد 6 ساعات من التلقيح (503 جينات)، بينما كانت بقية السلالات أقل تعبيرًا بعد 48 ساعة من التلقيح (Boregine، 31 جينًا؛ Mandelup، 85 جينًا؛ وPopulation 22660، 78 جينًا). في معظم جينات عائلة GO:0055114، لوحظ نوعان من الاستجابات للتطعيم (التنشيط والتثبيط). ومن المثير للاهتمام، أن ما يصل إلى 97.6% من الجينات المتغيرة التعبير (DEGs) المحددة للمصطلح GO: 0055114 في نبات الماندلوب عند 48 ساعة بعد التلقيح. تشير هذه الملاحظات إلى أنه على الرغم من النطاق الأصغر بكثير (أي عدد جينات الأكسدة والاختزال المتحولة، 85 مقابل 503)، فإن نمط استجابات النسخ المتأخرة في نبات الماندلوب لمرض الأنثراكنوز مشابه للاستجابة المبكرة للسلالة 83A:476. أما في سلالتي بورجين والسكان 22660، فإن هذا التقارب أقل، حيث يبلغ 51.6% و75.6% على التوالي.
تم الكشف عن أنماط التعبير للمكونات الرئيسية للعملية البيولوجية "GO:0055114 عملية الأكسدة والاختزال". يُمثل مقياس Log2 قيم log2 (التغير النسبي) بين النباتات المُلقحة (Colletotrichum lupini، السلالة Col-08، المُستخلصة من حقول الترمس، فيجينيكا، بولندا، 1999) والنباتات الضابطة (المُلقحة ظاهريًا) في نفس الوقت. تم تحليل سلالات الترمس ضيقة الأوراق التالية: 83A:476 (مقاومة، تحمل الأليل المتماثل Lanr1)، وBoregine (مقاومة، الخلفية الوراثية غير معروفة)، وMandelup (مقاومة بشكل متوسط، تحمل الأليل المتماثل AnMan)، وPopulation 22660 (قابلة للإصابة).
83A:476 شملت الاستجابات الجينومية للتلقيح بفطر C. lupini (السلالة Col-08) إسكاتًا منسقًا للجينات المنسوبة إلى مصطلح GO:0015979 "التمثيل الضوئي" وعمليات بيولوجية أخرى ذات صلة (الشكل 5). احتوت مجموعة الجينات المتغيرة التعبير GO:0015979 على 105 جينات تم تثبيطها بشكل ملحوظ عند 6 ساعات بعد التلقيح في 83A:476. في هذه المجموعة الفرعية، تم أيضًا خفض تنظيم 37 جينًا في سلالة مانديلوب عند 48 ساعة بعد التلقيح، و35 جينًا في نفس الوقت في المجموعة 22660، بما في ذلك 19 جينًا متغير التعبير مشتركًا بين النمطين الوراثيين. لم يتم تنشيط أي جينات متغيرة التعبير مرتبطة بمصطلح GO:0015979 بشكل ملحوظ في أي تركيبة (السلالة × الوقت).
تم الكشف عن أنماط التعبير عن المكونات الرئيسية لعملية التمثيل الضوئي (GO:0015979). يُمثل مقياس Log2 قيم log2 (التغير النسبي) بين النباتات المُلقحة (Colletotrichum lupini، السلالة Col-08، المُستخلصة من حقول الترمس، فيجينيكا، بولندا، 1999) والنباتات الضابطة (المُلقحة ظاهريًا) في نفس الوقت. تم تحليل سلالات الترمس ضيقة الأوراق التالية: 83A:476 (مقاومة، تحمل الأليل المتماثل Lanr1)، وBoregine (مقاومة، الخلفية الوراثية غير معروفة)، وMandelup (مقاومة بشكل متوسط، تحمل الأليل المتماثل AnMan)، وPopulation 22660 (قابلة للإصابة).
استنادًا إلى نتائج تحليل التعبير التفاضلي، ومن المفترض أنها تشارك في الاستجابات الدفاعية ضد الفطريات المسببة للأمراض، تم اختيار هذه المجموعة المكونة من سبعة جينات لتحديد كمية التعبير عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (الجدول التكميلي S9).
لوحظ تحفيز ملحوظ لجين البروتين المفترض TanjilG_10657 في جميع السلالات المدروسة وفي جميع الأوقات مقارنةً بالنباتات الضابطة (المحاكاة) (الجدولان التكميليان S10 وS11). بالإضافة إلى ذلك، أظهر نمط التعبير الجيني لـ TanjilG_10657 اتجاهًا تصاعديًا خلال التجربة لجميع السلالات. أظهرت السلالة 22660 أعلى حساسية لـ TanjilG_10657 للتلقيح، حيث بلغ التنشيط 114 ضعفًا، وسُجّل أعلى مستوى تعبير نسبي (4.4 ± 0.4) بعد 24 ساعة من التلقيح (الشكل 6أ). كما أظهر جين البروتين PR10 LlR18A، TanjilG_27015، تنشيطًا في جميع السلالات وفي جميع الأوقات، مع دلالة إحصائية في معظم نقاط البيانات (الشكل 6ب). على غرار TanjilG_10657، لوحظ أعلى مستوى تعبير نسبي لجين TanjilG_27015 في المجموعة الملقحة 22660 بعد 24 ساعة من التلقيح (19.5 ± 2.4). ارتفع مستوى التعبير عن جين الإندوكيناز الحمضي TanjilG_04706 بشكل ملحوظ في جميع السلالات وفي جميع نقاط القياس باستثناء سلالة Boregine بعد 6 ساعات من التلقيح (الشكل 6ج). وقد لوحظ تحفيز قوي له في نقطة القياس الأولى (6 ساعات بعد التلقيح) في السلالة 83A:476 (بمقدار 10.5 أضعاف)، وزيادة متوسطة في السلالات الأخرى (بمقدار 6.6-7.5 أضعاف). خلال التجربة، ظل تعبير TanjilG_04706 عند مستويات متقاربة في السلالتين 83A:476 وBoregine، بينما ازداد بشكل ملحوظ في سلالتي Mandelup والمجموعة 22660، ليصل إلى قيم عالية نسبيًا (5.9 ± 1.5 و6.2 ± 1.5 على التوالي). أظهر جين TanjilG_23384، الشبيه بإنزيم إندوغلوكان-1،3-بيتا-غلوكوزيداز، تنشيطًا عاليًا في أول نقطتين زمنيتين (6 و12 ساعة بعد الإصابة) في جميع السلالات باستثناء السلالة 22660 (الشكل 6د). وسُجّلت أعلى مستويات التعبير النسبي لجين TanjilG_23384 في النقطة الزمنية الثانية (12 ساعة بعد الإصابة) في سلالتي مانديلوب (2.7 ± 0.3) و83A:476 (1.5 ± 0.1). وفي 24 ساعة بعد الإصابة، كان تعبير جين TanjilG_23384 منخفضًا نسبيًا في جميع السلالات المدروسة (من 0.04 ± 0.009 إلى 0.44 ± 0.12).
تم الكشف عن أنماط التعبير الجيني لبعض الجينات المختارة (ag) باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR). تشير الأرقام 6 و12 و24 إلى الساعات بعد التطعيم. استُخدم الجينان LanDExH7 وLanTUB6 للتطبيع، بينما استُخدم الجين LanTUB6 لمعايرة السلاسل. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري بناءً على ثلاث عينات بيولوجية، كل منها متوسط ​​ثلاث عينات تقنية. تم تمييز الدلالة الإحصائية للاختلافات في مستويات التعبير بين النباتات الملقحة (Colletotrichum lupini، السلالة Col-08، التي تم الحصول عليها في عام 1999 من حقل الترمس في فيرزينيكا، بولندا) والنباتات الضابطة (النباتات الملقحة بشكل وهمي) فوق نقاط البيانات (*قيمة P < 0.05، **قيمة P ≤ 0.01، ***قيمة P ≤ 0.001). تم تمييز الدلالة الإحصائية للاختلافات في مستويات التعبير بين النباتات الملقحة (Colletotrichum lupini، السلالة Col-08، التي تم الحصول عليها في عام 1999 من حقل الترمس في فيرزينيكا، بولندا) والنباتات الضابطة (النباتات الملقحة بشكل وهمي) فوق نقاط البيانات (*قيمة P < 0.05، **قيمة P ≤ 0.01، ***قيمة P ≤ 0.001). تختلف الإحصائيات في التعبير عن التطعيم بين التطعيم (Colletotrichum lupini، stam Col-08، الذي تم الانتهاء منه في 1999 г. с) الترمس في فيرجينيا, بولشا) وأجهزة التحكم (التطعيم السهل) الممتد على طول الطريق البيانات (*التمييز P < 0,05, **التمييز P ≥ 0,01, ***التمييز P ≥ 0,001). تم ملاحظة الاختلافات ذات الدلالة الإحصائية في مستويات التعبير بين النباتات الملقحة (Colletotrichum lupini، السلالة Col-08، التي تم الحصول عليها في عام 1999 من حقل الترمس في فيرزينيس، بولندا) والنباتات الضابطة (النباتات الملقحة بشكل وهمي) أعلى نقاط البيانات (*قيمة P < 0.05، **قيمة P ≤ 0.01، ***قيمة P ≤ 0.001).种(كوليتوتريشوم لوبيني، Col-08株، 1999، 年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得(وهذا هو السبب في أن هذا هو السبب وراء نجاحي في تحقيق النجاح)* P值< 0.05، ** P 值 ≥ 0.01، *** P 值 ≥ 0.001).接种 (colletotrichum lupini، color-08 株، 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得) و和 对照 (接种 植物 之间 水平)差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05، **P ≥ 0.01، ***P ≥ 0.001). اختلافات إحصائية في التعبيرات بين التطعيم (Colletotrichum lupini, stam Col-08, плученный с полей люпina) في فيرجينيتس، بولشا، في 1999 م.) وأنظمة التحكم (التطعيمات السهلة) التي يتم إجراؤها على مدار الساعة البيانات (* علامة P < 0,05، ** علامة P ≥ 0,01، *** علامة P ≥ 0,001). تم ملاحظة الاختلافات ذات الدلالة الإحصائية في مستويات التعبير بين النباتات الملقحة (Colletotrichum lupini، السلالة Col-08، التي تم الحصول عليها من حقول الترمس في فيرجينيس، بولندا، في عام 1999) والنباتات الضابطة (النباتات الملقحة بشكل وهمي) أعلى نقاط البيانات (*قيمة P < 0.05، **قيمة P ≤ 0.01، ***قيمة P ≤ 0.001).كانت سلالات NLL التي تم تحليلها هي: 83A:476 (مقاومة، تحمل الأليل المتماثل Lanr1)، Mandelup (مقاومة بشكل معتدل، تحمل الأليل المتماثل AnMan)، Boregine (مقاومة، خلفية وراثية غير معروفة) والسكان 22660 (قابلة للإصابة).
أظهر الجين المرشح TanjilG_05042 في موقع Lanr1 نمط تعبير مختلفًا بشكل ملحوظ عن الأنماط المُستخلصة من دراسات تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) (الشكل 6هـ). لوحظ تنشيط كبير لهذا الجين في مانديلوب وسكان 22660 (بنسبة تصل إلى 39.7 و11.7 ضعفًا على التوالي)، مما أدى إلى مستويات تعبير عالية نسبيًا (تصل إلى 1.4 ± 0.14 و7.2 ± 1.3 على التوالي). كما كشف التحليل 83A:476 عن بعض الزيادة في تنظيم جين TanjilG_05042 (بنسبة تصل إلى 3.8 ضعفًا)، ومع ذلك، كانت مستويات التعبير النسبية المُحققة (0.044 ± 0.002) أقل بأكثر من 30 ضعفًا من تلك التي لوحظت في مانديلوب وسكان 22660. أظهر التحليل بواسطة qPCR اختلافات كبيرة في مستويات التعبير بين الأنماط الجينية في المتغيرات التي تم تطعيمها بشكل وهمي (الضابطة)، حيث وصل الفرق إلى 58 ضعفًا بين المجموعتين 22660 و83A:476، وكذلك بين المجموعتين 22660 و22660. وقد تم تحقيق فرق بمقدار الضعف بين Boregine وMandalup.
تم تنشيط الجين المرشح في موقع AnMan، TanjilG_12861، استجابةً للتطعيم في سلالتي 83A:476 وMandelup، بينما كان محايدًا في سلالة 22660، وانخفض تعبيره في سلالة Boregine (الشكل 6f). وكان التعبير النسبي لجين TanjilG_12861 هو الأعلى في سلالة 83A:476 المُلقّحة (0.14±0.01). أما جين بروتين الصدمة الحرارية من الفئة الأولى TanjilG_05080 HSP17.4، بوزن 17.4 كيلو دالتون، فقد أظهر مستويات تعبير نسبي أقل في جميع السلالات المدروسة وفي جميع الأوقات (الشكل 6g). وسُجّلت أعلى قيمة عند 24 ساعة بعد التلقيح في سلالة 22660 (0.14 ± 0.02، أي بزيادة قدرها ثمانية أضعاف استجابةً للتطعيم).
أظهرت مقارنة أنماط التعبير الجيني (الشكل 7) ارتباطًا قويًا بين الجين TanjilG_10657 وأربعة جينات أخرى: TanjilG_27015 (r = 0.89)، وTanjilG_05080 (r = 0.85)، وTanjilG_05042 (r = 0.80)، وTanjilG_04706 (r = 0.79). قد تشير هذه النتائج إلى تنظيم مشترك لهذه الجينات خلال الاستجابات الدفاعية. أظهر الجينان TanjilG_12861 وTanjilG_23384 أنماط تعبير مختلفة بقيم معامل ارتباط بيرسون أقل (من 0.08 إلى 0.43 ومن -0.19 إلى 0.28 على التوالي) مقارنةً بالجينات الأخرى.
تم الكشف عن الارتباطات بين أنماط التعبير الجيني باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. وتم تحليل سلالات الترمس ضيقة الأوراق التالية: 83A:476 (مقاومة، تحمل الأليل المتماثل Lanr1)، وMandelup (مقاومة بشكل متوسط، تحمل الأليل المتماثل AnMan)، وBoregine (مقاومة، الخلفية الوراثية غير معروفة)، وPopulation 22660 (قابلة للإصابة). تم حساب ثلاث نقاط زمنية (6 و12 و24 ساعة بعد التلقيح)، وشملت نباتات مُلقّحة (Colletotrichum lupini، السلالة Col-08، تم الحصول عليها من حقول الترمس في فيرزينيتسه، بولندا، عام 1999) ونباتات ضابطة (مُلقّحة ظاهريًا). يوضح المقياس قيمة معامل ارتباط بيرسون.
استنادًا إلى البيانات التي تم الحصول عليها عند 6 أحصنة لكل بوصة، أُجري تحليل WGCNA على 9981 جينًا مُعبَّرًا تفاضليًا تم تحديدها من خلال مقارنة النباتات المُلقَّحة والنباتات الضابطة للتركيز على الاستجابات الدفاعية المبكرة (الجدول التكميلي S12). وتم العثور على 22 وحدة جينية (مجموعة) ذات أنماط تعبير جيني مترابطة (إيجابية أو سلبية) بين الأنماط الجينية والمتغيرات التجريبية. في المتوسط، كانت مستويات التعبير الجيني تتناقص بالترتيب 83A:476 > مانديلوب > بورجين > السكان 22660 (في كلا المتغيرين، ومع ذلك، كان هذا الاتجاه أقوى في نباتات التحكم). في المتوسط، كانت مستويات التعبير الجيني تتناقص بالترتيب 83A:476 > مانديلوب > بورجين > السكان 22660 (في كلا المتغيرين، ومع ذلك، كان هذا الاتجاه أقوى في نباتات التحكم). في هذه المناسبة، يتجلى هذا التعبير في المقال 83A:476 > Mandelup > Boregine > السكان 22660 (في مختلف المتغيرات، ومع ذلك، هذا الاتجاه كانت صامتة في ظل ظروف مراقبة). في المتوسط، انخفضت مستويات التعبير الجيني بالترتيب 83A:476 > مانديلوب > بورجين > السكان 22660 (في كلا المتغيرين، ومع ذلك، كان هذا الاتجاه أقوى في نباتات التحكم).平均而言，基因表达水平按83A:476 > مانديلوب > بورجين > عدد السكان 22660 لا داعي للقلق بشأن هذا الأمر.平均 而 言 , 基因 水平 按 按 按 83a: 476> مانديلوب> السكان الأصليين> السكان 22660 的 顺序 下降 （, 在 种 中 , 这 种 在 在植物 中 更)........................... في هذه المناسبة، يتجلى هذا التعبير في نطاق 83A:476 > Mandelup > Boregine > السكان 22660 (على الرغم من أن هذا الاتجاه هو في المتغيرات الأخرى) الصمت في ظل ظروف التحكم). في المتوسط، انخفضت مستويات التعبير الجيني في السلسلة 83A:476 > مانديلوب > بورجين > السكان 22660 (ومع ذلك، في كلا المتغيرين، كان هذا الاتجاه أقوى في نباتات التحكم).أدى التطعيم إلى زيادة التعبير الجيني، لا سيما في الوحدات 18 و19 و14 و6 و1 (مرتبة تنازليًا حسب التأثير)، أو إلى تنظيم سلبي (مثل الوحدتين 9 و20)، أو إلى تأثيرات محايدة (مثل الوحدات 11 و22 و8 و13). وكشف تحليل إثراء مصطلحات علم الجينات (الجدول التكميلي S13) عن "GO: 0006952 الاستجابات الوقائية" للوحدة المُلقحة (18) ذات أعلى مستوى من التنشيط، بما في ذلك الجينات التي تم تحليلها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (TanjilG_04706 وTanjilG_23384 وTanjilG_10657 وTanjilG_27015)، بالإضافة إلى العديد من وحدات التمثيل الضوئي الأكثر تثبيطًا (9). تم تحديد مُركِّز الوحدة 18 (الشكل 8) على أنه جين TanjilG_26536 الذي يُشفِّر بروتين LlR18B الشبيه بـ PR-10، وتم تحديد مُركِّز الوحدة 9 على أنه جين TanjilG_28955 الذي يُشفِّر بروتين PsbQ الخاص بالنظام الضوئي الثاني. وُجد جين مُرشَّح لمقاومة الأنثراكنوز، Lanr1، وهو TanjilG_05042، في الوحدة 22 (الشكل 9)، ويرتبط بالمصطلحات "GO:0044260 عمليات الأيض الخلوية للجزيئات الكبيرة" و"GO:0006355 تنظيم النسخ، قالب الحمض النووي"، ويحمل محور TanjilG_01212. يُشفِّر هذا الجين عامل النسخ المُستجيب للإجهاد الحراري A-4a (HSFA4a).
تحليل الشبكة الموزونة للتعبير الجيني المشترك للوحدات ذات مصطلحات العمليات البيولوجية المُمثلة بشكل زائد "GO: 0006952 الاستجابات الدفاعية". تم تبسيط الربط لتسليط الضوء على الجينات الأربعة التي تم تحليلها بواسطة qPCR (TanjilG_04706، TanjilG_23384، TanjilG_10657 وTanjilG_27015).
تحليل الشبكة الموزونة للتعبير الجيني المشترك لوحدة ذات مصطلح عملية بيولوجية مفرط التمثيل "GO: 0006355: تنظيم النسخ، قالب الحمض النووي" وتحمل جين مقاومة الأنثراكنوز المرشح Lanr1 TanjilG_05042. تم تبسيط الربط لعزل جين TanjilG_05042 وجين TanjilG_01212 المركزي.
أظهرت فحوصات مقاومة الأنثراكنوز التي أُجريت في أستراليا أن معظم الأصناف التي طُرحت مبكرًا كانت عرضة للإصابة؛ ووُصفت أصناف كاليا، وكوروموب، ومانديلوب بأنها متوسطة المقاومة، بينما وُصفت أصناف وونغا، وتانجيل، و83A:476 بأنها شديدة المقاومة.^26،27،31 امتلكت هذه الأصناف نفس أليل المقاومة، المُسمى Lanr1، بينما امتلكت أصناف كوروموب ومانديلوب أليلًا مختلفًا، مُسمى AnMan.^10،26،39 في حين ورثت أصناف كاليا أليلًا مختلفًا، هو Lanr2.³⁶ أسفرت فحوصات مقاومة الأنثراكنوز في ألمانيا عن تحديد سلالة مقاومة Bo7212 تحمل أليلًا مرشحًا مختلفًا عن Lanr1، وهو LanrBo.
كشفت دراستنا عن تردد منخفض للغاية (حوالي 6%) لأليل Lanr1 في البلازما الجرثومية المختبرة. تتوافق هذه الملاحظة مع نتائج فحص البلازما الجرثومية في أوروبا الشرقية باستخدام مؤشرات Anseq3 وAnseq4، والتي أظهرت وجود أليل Lanr1 في سلالتين بيلاروسيتين فقط. يشير هذا إلى أن أليل Lanr1 لا يُستخدم على نطاق واسع في برامج التربية المحلية، على عكس أستراليا، حيث يُعدّ أحد الأليلات الرئيسية في التربية المدعومة بالمؤشرات الجينية. قد يُعزى ذلك إلى انخفاض مستوى المقاومة الذي يوفره أليل Lanr1 في الظروف الحقلية الأوروبية مقارنةً بالتقرير الأسترالي. إضافةً إلى ذلك، أظهرت دراسات الأنثراكنوز في المناطق ذات الأمطار الغزيرة في أستراليا أن استجابات المقاومة التي يتوسطها أليل Lanr1 قد لا تكون فعّالة في الظروف المناخية التي تُساعد على نمو وتطور العامل الممرض بسرعة. في الواقع، لوحظت بعض أعراض الأنثراكنوز في هذه الدراسة أيضًا في الأنماط الجينية الحاملة لأليل Lanr1، مما يشير إلى أن المقاومة قد تختفي في ظل الظروف المثلى لنمو فطر C. lupini. إضافةً إلى ذلك، من المحتمل حدوث نتائج إيجابية خاطئة لوجود علامات Anseq3 وAnseq4، التي تبعد حوالي 1 سنتيمورغان عن موقع Lanr1.
أظهرت دراستنا أن السلالة 83A:476، الحاملة للأليل Lanr1، استجابت لتلقيح C. lupini بإعادة برمجة واسعة النطاق للنسخ الجيني عند أول نقطة زمنية تم تحليلها (6 ساعات بعد التلقيح)، بينما في سلالة مانديلوب، الحاملة للأليل AnMan، لوحظت استجابات النسخ الجيني في وقت لاحق (من 24 إلى 48 ساعة بعد التلقيح). ترتبط هذه الاختلافات الزمنية في الاستجابات الدفاعية باختلافات في أعراض المرض، مما يُبرز أهمية التعرف المبكر على العامل الممرض من أجل استجابة ناجحة للمقاومة. لكي تُصيب جراثيم الجمرة الخبيثة أنسجة النبات، يجب أن تمر بعدة مراحل نمو على سطح العائل، بما في ذلك الإنبات، وانقسام الخلايا، وتكوين الزائدة الطفيلية. الزائدة الطفيلية هي بنية مُعدية تلتصق بسطح العائل وتُسهل اختراق أنسجته. وهكذا، أظهرت أبواغ فطر C. gloeosporioides في مستخلص البازلاء الانقسام الأول للنواة بعد 75-90 دقيقة من الحضانة، وتكوّن أنبوب إنبات بعد 90-120 دقيقة، ثم توقف النمو بعد 4 ساعات.⁴⁵ أما فطر C. gloeosporioides في المانجو، فقد أظهر إنباتًا لأكثر من 40% من الأبواغ الكونيدية بعد 3 ساعات من الحضانة، وتكوّنًا لحوالي 20% من الأجسام الضاغطة بعد 4 ساعات. وأظهر جين CAP20 المرتبط بالضراوة في فطر C. gloeosporioides نشاطًا نسخياً في الأبواغ الكونيدية المُكوِّنة للنباتات الهوائية بعد 3.5 ساعات من الحضانة في شمع سطح الأفوكادو، مع تركيزات عالية من بروتين CAP20 بعد 4 ساعات.⁴⁶ وبالمثل، تم تحفيز نشاط جينات تخليق الميلانين في فطر C. trifolii خلال حضانة لمدة ساعتين، تلاها تكوّن جسم ضاغط بعد ساعة واحدة. أظهرت دراسات أنسجة الأوراق أن الفراولة المُلقحة بفطر C. acutatum تُظهر أول تثبيط للعدوى بعد 8 ساعات من التلقيح، بينما تُظهر الطماطم المُلقحة بفطر C. coccodes أول تثبيط للعدوى بعد 4 ساعات من التلقيح.^48،49 يتوافق هذا إلى حد كبير مع النطاق الزمني لعملية العدوى بفطر Colletotrichum spp. تشير الاستجابات الدفاعية السريعة للسلالة 83A:476 إلى تورط جينات مقاومة النبات والمناعة المُحفزة بالمؤثرات (ETI) في هذه السلالة، بينما تدعم الاستجابات المتأخرة لمانديلوب فرضية المناعة المُحفزة بالأنماط الجزيئية المرتبطة بالميكروبات (MTI).⁵⁰ كما يدعم التداخل الجزئي بين الجينات المُحفزة أو المُثبطة في الاستجابة المتأخرة هذا المفهوم، حيث تُعتبر المناعة المُحفزة بالمؤثرات (ETI) غالبًا استجابة مُسرّعة ومُعززة للمناعة المُحفزة بالأنماط الجزيئية المرتبطة بالميكروبات (MTI) والتي تُؤدي إلى موت الخلايا المُبرمج في موقع العدوى، والمعروف باسم الصدمة التأقية.^51،52
معظم الجينات المنسوبة إلى مصطلح "استجابة الدفاع" (Gene Ontology GO:0006952) المُفرط التمثيل هي 11 جينًا متماثلًا لبروتين SAM22 المُحفز بالصيام (المشابه لـ SAM22) وسبعة بروتينات شبيهة ببروتينات اللاتكس الرئيسية (MLPs). أظهرت البروتينات الشبيهة بـ 31 و34 و43 و423 تشابهًا في التسلسل. أظهرت الجينات الشبيهة بـ SAM22 تنشيطًا ملحوظًا استمر لفترة أطول، مما يدل على زيادة مستويات مقاومة الأنثراكنوز (83A:476 وBoregine). مع ذلك، انخفض تنظيم الجينات الشبيهة بـ MLP فقط في السلالات الحاملة لأليل المقاومة المرشح (83A:476/Lanr1 عند 6 ساعات بعد الإصابة وMandelup/AnMan عند 24 ساعة بعد الإصابة). تجدر الإشارة إلى أن جميع الجينات المتماثلة المحددة الشبيهة بـ SAM22 تنشأ من مجموعة جينية تمتد على مسافة 105 كيلوبايت تقريبًا، بينما تنشأ الجينات الشبيهة بـ MLP من مناطق منفصلة من الجينوم. وقد لوحظ تنشيط منسق لجينات شبيهة بـ SAM22 في دراستنا السابقة لمقاومة NLL للتلقيح بفطر Diaporthetoxica، مما يشير إلى دورها في المكونات الأفقية للاستجابة الدفاعية. ويدعم هذا الاستنتاج أيضًا تقاريرٌ عن استجابة إيجابية لجينات شبيهة بـ SAM22 للإصابة أو المعالجة بحمض الساليسيليك، أو محفزات الفطريات، أو بيروكسيد الهيدروجين.
أظهرت الدراسات أن الجينات الشبيهة بـ MLP تستجيب لمختلف الضغوطات اللاأحيائية والأحيائية، بما في ذلك العدوى البكتيرية والفيروسية والفطرية الممرضة في العديد من أنواع النباتات⁵⁵. وتراوحت اتجاهات الاستجابة لبعض التفاعلات بين النباتات ومسببات الأمراض من زيادة ملحوظة (كما هو الحال أثناء إصابة القطن بفطر Verticillium dahliae) إلى انخفاض كبير (كما هو الحال بعد إصابة أشجار التفاح بفطر Alternaria spp.)^56،57. ولوحظ انخفاض ملحوظ في تنظيم الجين 423 الشبيه بـ MLP أثناء دفاعات الأفوكادو ضد عدوى فطر Fusarium niger، وأثناء إصابة أشجار التفاح بفطر Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola، كما أن فطر Alternaria alternata من الأنماط الممرضة للتفاح^58،59. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت أنسجة الكالس في التفاح التي تُفرط في التعبير عن الجين 423 الشبيه بـ MLP انخفاضًا في التعبير عن الجينات المرتبطة بالمقاومة، وكانت أكثر عرضة للإصابة بالعدوى الفطرية⁵⁹. بعد الإصابة بفطر الفيوزاريوم أوكسيسبوروم f، تم تثبيط جين MLP-like 423 أيضًا في بلازما جرثومية الفاصوليا الشائعة المقاومة. cn. إصابة الفاصوليا 60.
من بين أعضاء عائلة PR-10 الأخرى التي تم تحديدها في دراستنا لتسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq)، جينات LlR18A وLlR18B استجابةً لزيادة التعبير الجيني، بالإضافة إلى جين DIR1، وهو جين مُنظَّم تصاعديًا (جين واحد) أو مُنظَّم تنازليًا (ثلاثة جينات). علاوة على ذلك، يُبرز تحليل الشبكة الجينية الموزونة (WGCNA) جين LlR18B كمركز محوري في هذه الوحدة، وهو شديد الحساسية للتطعيم ويحمل العديد من جينات الاستجابة الوقائية. تم تحفيز جيني LlR18A وLlR18B في أوراق الترمس الأصفر استجابةً للبكتيريا الممرضة، وكذلك في سيقان الترمس الأصفر بعد التلقيح بفطر D. toxica، بينما تم تحفيز نظير هذه الجينات في الأرز، RSOsPR10، بسرعة بواسطة عدوى فطرية يُفترض أنها متورطة في مسار إشارات حمض الجاسمونيك.^53،61،62 يُشفِّر جين DIR1 بروتينات نقل الدهون غير المتخصصة اللازمة لبدء المقاومة المكتسبة الجهازية (SAR). مع تطور الاستجابات الوقائية، ينتقل بروتين DIR1 من بؤرة العدوى عبر اللحاء لتحفيز المقاومة الجهازية المكتسبة (SAR) في الأعضاء البعيدة. ومن المثير للاهتمام، أن جين TanjilG_02313 DIR1 قد تم تحفيزه بشكل ملحوظ في المرحلة الأولى في السلالتين 84A:476 والمجموعة 22660، لكن مقاومة الأنثراكنوز تطورت بنجاح فقط في السلالة 84A:476. قد يشير هذا إلى وجود تخصص وظيفي فرعي لجين DIR1 في NLL، حيث استجابت الجينات المتماثلة الثلاثة المتبقية للتلقيح فقط في السلالة 83A:476 بعد 6 ساعات من التلقيح، وكانت هذه الاستجابة موجهة نحو الأسفل.
في دراستنا، كانت المكونات الأكثر شيوعًا التي تتوافق مع العملية البيولوجية المسماة "GO:0055114 عملية الأكسدة والاختزال" هي بروتين السيتوكروم P450، والبيروكسيداز، وإنزيم ليبوكسيجيناز حمض اللينوليك 9S/13S، وإنزيم أوكسيداز حمض 1-أمينوسيكلوبروبان-1-كربوكسيليك. بالإضافة إلى ذلك، يُعرّف تحليلنا الجيني الموزون (WGCNA) نظير HSFA4a كمركز يحمل وحدات مثل جين المقاومة المرشح Lanr1، TanjilG_05042. يُعد HSFA4a أحد مكونات تنظيم النسخ النووي المعتمد على الأكسدة والاختزال في النباتات.
بروتينات السيتوكروم P450 هي إنزيمات مؤكسدة-مختزلة تحفز تفاعلات الهيدروكسيل المعتمدة على NADPH و/أو الأكسجين في عمليات الأيض الأولية والثانوية، بما في ذلك أيض المواد الغريبة، بالإضافة إلى الهرمونات والأحماض الدهنية والستيرولات ومكونات جدار الخلية والبوليمرات الحيوية، والتخليق الحيوي للمركبات الواقية⁶⁹. في دراستنا، انخفض التباين في وظيفة السيتوكروم P450 النباتي من -10.6 لوغاريتم 2 (التغير المضاعف) إلى 5.7 نتيجةً لوجود عدد كبير من المتماثلات المتغيرة (37) واختلافات في أنماط الاستجابة بين جينات محددة، مما يعكس مراجعة تصاعدية. إن استخدام بيانات تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) فقط لتوضيح الوظيفة البيولوجية المفترضة لجينات NLL في مثل هذه العائلة البروتينية الكبيرة سيكون أمرًا تخمينيًا للغاية. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن بعض جينات السيتوكروم P450 مرتبطة بزيادة مقاومة الفطريات أو البكتيريا الممرضة، بما في ذلك المساهمة في التفاعلات التحسسية^69،70،71.
إنزيمات البيروكسيداز من الفئة الثالثة هي إنزيمات نباتية متعددة الوظائف، تشارك في طيف واسع من العمليات الأيضية خلال نمو النبات وتطوره، وكذلك في الاستجابة للضغوط البيئية كالملوحة والجفاف وشدة الإضاءة العالية وهجوم مسببات الأمراض⁷². وتشارك هذه الإنزيمات في تفاعل العديد من أنواع النباتات مع فطر الجمرة الخبيثة، بما في ذلك نبات Stylosanthes humilis وفطر C. gloeosporioides، ونبات Lens culinaris وفطر C. truncatum، ونبات Phaseolus vulgaris وفطر C. lindemuthianum، ونبات Cucumis sativus وفطر C. lagenarium^{73،74،75،76}. وتكون الاستجابة سريعة للغاية، حتى في غضون أربع ساعات بعد الإصابة، قبل أن يخترق الفطر أنسجة النبات⁷³. كما استجاب جين البيروكسيداز للتلقيح بفطر D. toxica NLL. إضافةً إلى وظائفها المعتادة في تنظيم الانفجار التأكسدي أو القضاء على الإجهاد التأكسدي، يمكن للبيروكسيدازات أن تعيق نمو مسببات الأمراض عن طريق إنشاء حواجز فيزيائية تعتمد على تقوية جدار الخلية أثناء عملية التخشب، أو على الوحدات الفرعية أو الروابط المتشابكة لمركبات محددة. ويمكن عزو هذه الوظيفة، باستخدام المحاكاة الحاسوبية، إلى جين TanjilG_03329 الذي يشفر بيروكسيداز أنيوني مُكوِّن للّجنين، والذي ارتفع تعبيره بشكل ملحوظ في دراستنا في السلالة المقاومة 83A:476 بعد 6 ساعات من الإصابة، بينما لم يُلاحظ هذا الارتفاع في السلالات الأخرى أو في نقاط زمنية أخرى لم تستجب.
يُعدّ إنزيم 9S-/13S-ليب أوكسيجيناز لحمض اللينوليك الخطوة الأولى في مسار الأكسدة لتخليق الدهون⁷⁸. وتؤدي نواتج هذا المسار وظائف متعددة في دفاع النبات، بما في ذلك تقوية جدار الخلية من خلال تكوين رواسب الكالوز والبكتين، وتنظيم الإجهاد التأكسدي من خلال إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية^{79،80،81،82،83}. في هذه الدراسة، تغيّر تعبير إنزيم 9S-/13S-ليب أوكسيجيناز لحمض اللينوليك في جميع السلالات، ولكن في السلالة الحساسة 22660، ساد التعبير التصاعدي في نقاط زمنية مختلفة، بينما في السلالات الحاملة لجين Lanr1 المقاوم وأليل AnMan، يُبرز ذلك تنوّع طبقة الأوكسيليبين في تفاعلات الحماية من الجمرة الخبيثة بين هذه الأنماط الجينية.
لوحظ ارتفاع ملحوظ في مستوى التعبير عن نظير إنزيم أوكسيداز 1-أمينوسيكلوبروبان-1-كربوكسيلات (ACO) (9 جينات) أو انخفاض ملحوظ في مستوى التعبير عن جينين (جينين) عند تلقيح نبات الترمس. باستثناء حالتين، حدثت جميع هذه الاستجابات بعد 6 ساعات عند 83A:476. يُعد التفاعل الإنزيمي الذي تتوسطه بروتينات ACO الخطوة المحددة لمعدل إنتاج الإيثيلين، ولذلك فهو يخضع لتنظيم دقيق. الإيثيلين هرمون نباتي يؤدي أدوارًا متعددة في تنظيم نمو النبات واستجابته لظروف الإجهاد اللاأحيائي والأحيائي. يساهم تحفيز نسخ جين ACO وتفعيل مسار إشارات الإيثيلين في زيادة مقاومة الأرز للفطر شبه المتطفل oryzae oryzae من خلال تنظيم إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية والفيتوألكسينات. إن عملية إصابة الأوراق المتشابهة للغاية التي تم العثور عليها بين M. oryzae و C. lupini88,89، على خلفية زيادة تنظيمية كبيرة لنظائر ACO في سلالة 83A:476 التي تم الإبلاغ عنها في هذه الدراسة، تغير إمكانية منح مقاومة لمرض الأنثراكنوز NLL. الإيثيلين هو خطوة مركزية في الإشارات في المسارات الجزيئية.
في هذه الدراسة، لوحظ تثبيط واسع النطاق للعديد من الجينات المرتبطة بعملية التمثيل الضوئي بعد 6 ساعات من الإصابة في السلالة 83A:476، وبعد 48 ساعة من الإصابة في سلالتي مانديلوب و22660. ويتناسب مدى هذه التغيرات وتطورها طرديًا مع مستوى الإصابة. وقد لوحظت مقاومة لمرض الأنثراكنوز في هذه التجربة. وقد أُبلغ مؤخرًا عن تثبيط قوي ومبكر للنسخ الجينية المرتبطة بعملية التمثيل الضوئي في العديد من نماذج تفاعلات النباتات مع مسببات الأمراض، بما في ذلك البكتيريا والفطريات الممرضة. ويمكن أن يؤدي التثبيط السريع (منذ ساعتين بعد الإصابة في بعض التفاعلات) والشامل للجينات المرتبطة بعملية التمثيل الضوئي استجابةً للعدوى إلى تحفيز مناعة النبات، وذلك بالاعتماد على إطلاق أنواع الأكسجين التفاعلية وتفاعلها مع مسار حمض الساليسيليك للتوسط في ردود الفعل التحسسية 90،94.
في الختام، تشمل آليات الاستجابة الدفاعية المقترحة للسلالة الأكثر مقاومة (83A:476) التعرف السريع على العامل الممرض بواسطة جين المقاومة (يُفترض أنه TIR-NBS-LRR TanjilG_05042)، وإشارات حمض الساليسيليك والإيثيلين بوساطة الاستجابة التحسسية، يليها إرساء مقاومة جهازية مكتسبة بعيدة المدى. ويدعم بروتين DIR-1 هذا العمل. تجدر الإشارة إلى أن فترة التغذية الإجبارية لعدوى C. lupini قصيرة جدًا (حوالي يومين)، تليها مرحلة نمو نخرية. قد يرتبط الانتقال بين هاتين المرحلتين بالنخر وتعبير البروتينات المحفزة بالإيثيلين، والتي تعمل كمحفزات لتفاعلات فرط الحساسية في النباتات المضيفة. لذلك، فإن الفترة الزمنية المتاحة لاحتجاز C. lupini بنجاح في مرحلة التغذية الإجبارية ضيقة للغاية. إن إعادة برمجة الجينات المرتبطة بالأكسدة والاختزال والتمثيل الضوئي، التي لوحظت في السلالة 83A:476 بعد 6 ساعات من الإصابة، تتوافق مع تطور الخيوط الفطرية، وتبشر بظهور استجابة وقائية ناجحة في المرحلة التطفلية. قد تكون الاستجابات الجينية لسلالتي مانديلوب و22660 متأخرة جدًا بحيث لا تسمح برصد الفطر قبل تحوله إلى النمو النخري، ومع ذلك، قد تكون سلالة مانديلوب أكثر فعالية من سلالة 22660 لأن التنظيم السريع نسبيًا لبروتين PR-10 يعزز المقاومة الأفقية.
يبدو أن الاستجابة المناعية المحفزة بواسطة جين المقاومة التقليدي (ETI) آلية شائعة لمقاومة الفاصوليا لمرض الأنثراكنوز. ففي نبات البقوليات النموذجي Medicago truncatula، تُمنح مقاومة الأنثراكنوز بواسطة جين RCT1، وهو أحد أفراد فئة جينات المقاومة النباتية TIR-NBS-LRR97. كما يمنح هذا الجين مقاومة واسعة النطاق للأنثراكنوز في البرسيم الحجازي عند نقله إلى نباتات قابلة للإصابة. وفي الفاصوليا الشائعة (P. vulgaris)، تم تحديد أكثر من عشرين جينًا لمقاومة الأنثراكنوز حتى الآن. بعض هذه الجينات موجود في مناطق تفتقر إلى أي جينات مقاومة تقليدية، بينما يقع العديد منها على أطراف الكروموسومات التي تحمل مجموعة جينات NBS-LRR، بما في ذلك TIR-NBS-LRR99. وقد أكدت دراسة SSR على مستوى الجينوم أيضًا ارتباط جين NBS-LRR بمقاومة الأنثراكنوز في الفاصوليا الشائعة. كما تم العثور على جين R المتعارف عليه في المنطقة الجينومية التي تحمل موقع مقاومة الأنثراكنوز الرئيسي في الترمس الأبيض 101.
تُظهر دراستنا أن استجابة المقاومة الفورية، التي تُفعَّل في مرحلة مبكرة من إصابة النبات (ويُفضَّل ألا تتجاوز 12 ساعة بعد الإصابة)، تحمي نبات الترمس ضيق الأوراق بفعالية من مرض الأنثراكنوز الذي يُسببه الفطر الممرض Collelotrichum lupini. وباستخدام تقنية التسلسل عالي الإنتاجية، أظهرنا أنماط التعبير التفاضلي لجينات مقاومة الأنثراكنوز في نباتات الترمس ضيق الأوراق، والتي تتوسطها جينات المقاومة Lanr1 وAnMan. يتطلب الدفاع الناجح تصميمًا دقيقًا لجينات البروتينات المشاركة في عمليات الأكسدة والاختزال، والتمثيل الضوئي، والإمراضية، وذلك في غضون ساعات من أول اتصال للنبات بمسبب المرض. أما الاستجابات الوقائية المماثلة، ولكن المتأخرة زمنيًا، فهي أقل فعالية بكثير في حماية النباتات من الأمراض. تشبه مقاومة الأنثراكنوز التي يتوسطها جين Lanr1 الاستجابة السريعة النموذجية لجين المقاومة (المناعة المُحفَّزة بواسطة مُؤثِّر)، بينما يُرجَّح أن جين AnMan يُوفِّر استجابة أفقية (مناعة مُحفَّزة بواسطة نمط جزيئي مرتبط بالميكروب)، مما يُوفِّر مستوى معتدلًا من الاستدامة.
تألفت مجموعة سلالات NLL الـ 215 المستخدمة في فحص مؤشرات الأنثراكنوز من 74 صنفًا، و60 سلالة ناتجة عن التهجين أو التربية، و5 طفرات، و76 سلالة برية أو أصلية. وجاءت هذه السلالات من 17 دولة، معظمها من بولندا (58)، وإسبانيا (47)، وألمانيا (27)، وأستراليا (26)، وروسيا (19)، وبيلاروسيا (7)، وإيطاليا (5)، بالإضافة إلى سلالات أخرى من 10 دول. وتضمنت المجموعة أيضًا سلالات مرجعية مقاومة: 83A:476، وTanjil، وWonga الحاملة للأليل Lanr1، وMandelup الحاملة للأليل AnMan. وقد تم الحصول على هذه السلالات من قاعدة بيانات الموارد الوراثية الأوروبية للترمس، التي تديرها شركة Poznań Plant Breeding Ltd.، فياتروو، بولندا (الجدول التكميلي S1).
زُرعت النباتات في ظروف مُحكمة (فترة إضاءة 16 ساعة، درجة حرارة 25 درجة مئوية نهارًا و18 درجة مئوية ليلًا). تم تحليل عينتين بيولوجيتين. استُخلص الحمض النووي من أوراق عمرها ثلاثة أسابيع باستخدام مجموعة DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen، هيلدن، ألمانيا) وفقًا للبروتوكول. قُيِّمت جودة وتركيز الحمض النووي المستخلص باستخدام طرق قياس الطيف الضوئي (NanoDrop 2000؛ Thermo Fisher Scientific، والتهام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية). حُلِّلَ الواسم AnManM1 الذي يُشير إلى جين مقاومة الأنثراكنوز AnMan (المُستخلص من صنف مانديلوب) والواسمان Anseq3 وAnseq4 اللذان يُحيطان بجين Lanr1 (المُستخلص من صنف تانجيل) 11،26،28. سُجِّلَت الأفراد متماثلة الزيجوت للأليل المقاوم بـ "1"، والأفراد القابلة للإصابة بـ "0"، والأفراد غير متماثلة الزيجوت بـ 0.5.
استنادًا إلى نتائج فحص المؤشرات AnManM1 وAnSeq3 وAnSeq4، وتوفر البذور لإجراء تجارب المتابعة النهائية، تم اختيار 50 سلالة من نباتات NLL لدراسة النمط الظاهري لمقاومة الأنثراكنوز. أُجري التحليل مرتين في دفيئة مُتحكَّم بها حاسوبيًا، مع دورة ضوئية مدتها 14 ساعة، ونطاق درجة حرارة يتراوح بين 22 درجة مئوية نهارًا و19 درجة مئوية ليلًا. تم خدش البذور (بقطع غلاف البذرة من الجهة المقابلة للجنين بشفرة حادة) قبل الزراعة لمنع سكونها نتيجة صلابة غلافها، ولضمان إنبات متجانس. زُرعت النباتات في أصص (11 × 11 × 21 سم) بتربة معقمة (TS-1 REC 085 Medium Basic، Klasmann-Deilmann Polska، وارسو، بولندا). تم تلقيح النباتات بسلالة Colletotrichum lupini Col-08، التي تم استزراعها عام 1999 من سيقان نباتات الترمس ضيقة الأوراق المزروعة في حقل بمدينة فيرجينيتسا، بولندا الكبرى (52° 27′ 42″ شمالاً، 17° 04′ 05″ شرقاً). تمت زراعة العزلات في وسط SNA عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 21 يومًا لتحفيز التبوغ. بعد أربعة أسابيع من الزراعة، عندما وصلت النباتات إلى مرحلة 4-6 أوراق، تم التلقيح برشها بمحلول معلق من الأبواغ الكونيدية بتركيز 0.5 × 10⁶ بوغ كونيدي لكل مل. بعد التلقيح، حُفظت النباتات في الظلام لمدة 24 ساعة عند رطوبة نسبية تبلغ حوالي 98% ودرجة حرارة 25 درجة مئوية لتسهيل إنبات الأبواغ الكونيدية وعملية العدوى. زُرعت النباتات بعد ذلك تحت دورة ضوئية مدتها 14 ساعة عند درجة حرارة 22 درجة مئوية نهارًا و19 درجة مئوية ليلًا ورطوبة نسبية 70%. تم تقييم شدة المرض بعد 22 يومًا من التلقيح، وتراوحت الدرجة من 0 (مناعة) إلى 9 (شديدة الحساسية) بناءً على وجود أو غياب الآفات النخرية على السيقان والأوراق. بالإضافة إلى ذلك، تم قياس وزن النباتات بعد التقييم. حُسبت العلاقات بين الأنماط الجينية للعلامات والأنماط الظاهرية للمرض كمعاملات ارتباط ثنائية التسلسل (غياب العلامات غير المتجانسة في مجموعة السلالات لتحليل النمط الظاهري لمقاومة الأنثراكنوز).