Ďakujeme za návštevu stránky Nature.com. Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS. Pre dosiahnutie čo najlepšieho zážitku odporúčame používať aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v prehliadači Internet Explorer). Medzitým budeme stránku vykresľovať bez štýlov a JavaScriptu, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu.
Lupinus angustifolius (NLL, Lupinus angustifolius L.) je strukovina používaná na produkciu potravín a zlepšenie pôdy. Globálne rozšírenie NLL ako plodiny prilákalo mnoho patogénnych húb vrátane antraknózy lupiny, ktorá spôsobuje ničivú antraknózu. Pri šľachtení NLL sa použili dve alely, Lanr1 a AnMan, ktoré prepožičiavajú zvýšenú rezistenciu, ale základné molekulárne mechanizmy zostávajú neznáme. V tejto štúdii sa na skríning európskych vzoriek NLL použili markery Lanr1 a AnMan. Testovanie vakcíny v kontrolovanom prostredí potvrdilo účinnosť oboch rezistentných darcov. Diferenciálne profilovanie génovej expresie sa vykonalo na reprezentatívnych rezistentných a citlivých líniách. Rezistencia na antraknózu bola spojená s nadmernou expresiou génových ontologických termínov „GO:0006952 Defense Response“, „GO:0055114 Redox Process“ a „GO:0015979 Photosynthesis“. Okrem toho línia Lanr1(83A:476) vykazovala významné preprogramovanie transkriptómu rýchlo po inokulácii, zatiaľ čo ostatné línie vykazovali oneskorenie v tejto odpovedi približne o 42 hodín. Obranné reakcie sú spojené s génmi TIR-NBS, CC-NBS-LRR a NBS-LRR, 10 proteínmi zapojenými do patogenézy, proteínmi prenosu lipidov, endoglukán-1,3-β-glukozidázou, proteínmi bunkovej steny bohatými na glycín a génmi z reaktívnej dráhy kyslíka. Včasné reakcie na 83A:476, vrátane starostlivého potlačenia génov spojených s fotosyntézou, sa zhodovali s úspešnou ochranou počas vegetatívnej rastovej fázy hubovej biológie, čo naznačuje, že efektor spúšťa imunitu. Mandeloopova reakcia je spomalená, rovnako ako celkový horizontálny odpor.
Úzkolistý lupina (NLL, Lupinus angustifolius L.) je obilnina s vysokým obsahom bielkovín pochádzajúca zo západného Stredomoria1,2. V súčasnosti sa pestuje ako potravinová plodina pre zvieratá a ľudí. V systémoch striedania plodín sa tiež považuje za zelené hnojivo vďaka fixácii dusíka symbiotickými baktériami fixujúcimi dusík a celkovému zlepšeniu štruktúry pôdy. NLL prešla v minulom storočí rýchlym procesom domestikácie a stále je pod vysokým šľachtiteľským tlakom3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. S rozsiahlym pestovaním NLL si postupné množenie patogénnych húb vytvorilo nové poľnohospodárske niky a spôsobilo nové choroby ničiace úrodu. Pre pestovateľov a šľachtiteľov lupiny bol najpozoruhodnejší výskyt antraknózy, ktorú spôsobuje patogénna huba Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Pre pestovateľov a šľachtiteľov lupiny bol najpozoruhodnejší výskyt antraknózy, ktorú spôsobuje patogénna huba Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров a селекционеров примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появленконие ановтров патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Pre pestovateľov a šľachtiteľov vlčieho bôbu bol najvýznamnejší výskyt antraknózy spôsobenej patogénnou hubou Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler a Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是rich矔煗ClupClup (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是rich矔煗ClupClup (Bondar)嵵Vlasy。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является поянтнионие вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Pre pestovateľov a šľachtiteľov lupiny je najvýraznejší výskyt antraknózy spôsobenej patogénnou hubou Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler a Hagedorn13.Najstaršie správy o chorobe pochádzajú z Brazílie a Spojených štátov, pričom typické príznaky sa objavili v rokoch 1912 a 1929. Avšak po približne 30 rokoch bol patogén označený ako Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld v Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld v cielenej morfológii. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .a H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。a H. Schlenk, .Predbežné fenotypovanie ochorenia vykonané v polovici 20. storočia preukázalo určitú rezistenciu u vzoriek NLL a žltého lupinu (L. luteus L.), ale všetky testované vzorky bieleho lupinu (L. albus L.) boli vysoko náchylné15,16. Štúdie ukázali, že vývoj antraknózy je spojený so zvýšenými zrážkami (vlhkosť vzduchu) a teplotou (v rozmedzí 12 – 28 °C), čo vedie k narušeniu rezistencie pri vyšších teplotách17, 18. V skutočnosti bol čas potrebný na klíčenie konídií a začiatok ochorenia pri teplote 24 °C (4 hodiny) štyrikrát kratší ako pri teplote 12 °C (16 hodín) za podmienok vysokej vlhkosti19. Prebiehajúce globálne otepľovanie teda viedlo k šíreniu antraknózy. Ochorenie bolo však pozorované vo Francúzsku (1982) a na Ukrajine (1983) ako predzvesť hroziacej hrozby, ale v tom čase ho lupinový priemysel zjavne ignoroval20,21. O niekoľko rokov neskôr sa táto ničivá choroba rozšírila po celom svete a postihla aj hlavné krajiny produkujúce lupinu, ako napríklad Austráliu, Poľsko a Nemecko22,23,24. Po vypuknutí antraknózy v polovici 90. rokov 20. storočia viedol rozsiahly skríning k identifikácii niekoľkých rezistentných darcov vo vzorkách NLL19. Rezistencia NLL voči antraknóze je kontrolovaná dvoma samostatnými dominantnými alelami nachádzajúcimi sa v rôznych zdrojoch zárodočnej plazmy: Lanr1 v kultivare Tanjil a Wonga a AnMan v kultivare Mandalay25,26. Tieto alely dopĺňajú molekulárne markery, ktoré podporujú výber rezistentnej zárodočnej plazmy v šľachtiteľských programoch25,26,27,28,29,30. Rezistentná krížená línia 83A:476 nesúca alelu Lanr1 bola krížená s náchylnou divokou líniou P27255, aby sa získala populácia RIL segregujúca na rezistenciu voči antraknóze, čo umožnilo priradiť lokus Lanr1 k chromozómu NLL-1131, 32, 33. Zarovnaním markerov väzbovej mapy z laternárnych lokusov rezistencie k antraknóze s genomickým rámcom NLL odhalila umiestnenie všetkých troch alel na tom istom chromozóme (NLL-11), ale v rôznych pozíciách29,34,35. Avšak kvôli malému počtu RIL a veľkej genetickej vzdialenosti medzi markermi a zodpovedajúcimi alelami nemožno vyvodiť žiadne spoľahlivé závery o ich základných génoch. Na druhej strane, použitie reverznej genetiky u lupín je ťažké kvôli ich veľmi nízkemu regeneračnému potenciálu, čo robí genetickú manipuláciu ťažkopádnou37.
Vývoj domestikovanej zárodočnej plazmy nesúcej požadovanú alelu v homozygotnom stave, ako napríklad 83A:476 (Lanr1) a Mandelup (AnMan), otvoril dvere k štúdiu rezistencie na antraknózu vzhľadom na prítomnosť opačných kombinácií alel vo voľne žijúcich populáciách. Možnosti molekulárnych mechanizmov. Porovnanie obranných reakcií generovaných špecifickými genotypmi. Táto štúdia hodnotila skorú transkriptómovú odpoveď NLL na očkovanie proti C. lupini. Najprv bol pomocou molekulárnych markerov, ktoré označujú alely Lanr1 a AnMan, skrínovaný európsky panel zárodočnej plazmy NLL obsahujúci 215 línií. Následne sa vykonalo fenotypovanie antraknózy na 50 líniách NLL, predtým selektovaných na molekulárne markery, za kontrolovaných podmienok. Na základe týchto experimentov boli na profilovanie diferenciálnej obrannej génovej expresie pomocou dvoch komplementárnych prístupov: vysokokapacitného sekvenovania RNA a kvantifikácie PCR v reálnom čase vybrané štyri línie, ktoré sa líšia rezistenciou na antraknózu a alelickým zložením Lanr1/AnMan.
Skríning súboru zárodočnej plazmy NLL (N = 215) s markermi Lanr1 (Anseq3 a Anseq4) a AnMan (Anseq4) a AnMan (AnManM1) ukázal, že iba jedna línia (95726, blízko Salamanca-b) amplifikuje alelu „rezistencie“ pre všetky markery, zatiaľ čo „prítomnosť „citlivých“ alel“ zistila podiel všetkých markerov v 158 (~73,5 %) líniách. Trinásť línií produkovalo dve „rezistentné“ alely markera Lanr1 a 8 línií produkovalo „rezistentné“ alely markera Lanr1. Alela „rezistencie“ markera AnMan (doplnková tabuľka S1). Dve línie boli heterozygotné pre marker Anseq3 a jedna heterozygotná pre marker AnManM1. 42 línií (19,5 %) nieslo opačné fázy alel Anseq3 a Anseq4, čo naznačuje vysokú frekvenciu rekombinácie medzi týmito dvoma lokusmi. Fenotypy antraknózy za kontrolovaných podmienok (doplnková tabuľka S2) preukázali variabilitu v rezistencii testovaných genotypov, čo sa odrazilo v závažnosti antraknózy. Rozdiely v priemerných skóre sa pohybovali od 1,8 (stredne rezistentné) do 6,9 (náchylné) a rozdiely v hmotnosti rastlín sa pohybovali od 0,62 (náchylné) do 4,45 g (rezistentné). Medzi hodnotami pozorovanými v dvoch opakovaniach experimentu (0,51 pre skóre závažnosti ochorenia, P = 0,00017 a 0,61 pre hmotnosť rastliny, P < 0,0001), ako aj medzi týmito dvoma parametrami (−0,59 a −0,77, P < 0,0001) bola zistená významná korelácia. V dvoch opakovaniach experimentu bola zistená významná korelácia medzi hodnotami pozorovanými v dvoch opakovaniach (0,51 pre skóre závažnosti ochorenia, P = 0,00017 a 0,61 pre hmotnosť rastliny, P < 0,0001), ako aj medzi týmito dvoma parametrami (−0,59 a −0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми вэвтух пововтовторнововий эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, 100, P = 0,00017 между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Zistila sa významná korelácia medzi hodnotami pozorovanými v dvoch opakovaniach experimentu (0,51 pre skóre závažnosti ochorenia, P = 0,00017 a 0,61 pre hmotnosť rastliny, P < 0,0001), ako aj medzi týmito dvoma parametrami (-0,59 a -0,77, P < 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分1似0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77,001 P < 0,70,000 P在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p < 0,0001） 以及 两 个 参数 乌,–闼-9 0,59 和 – 0,59 和 – 0,59 和 – 0,77, P < 0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемырвусот в между значениями (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 a масса растения 0,61, P <0,0001), a мутиду э параметрами (-0,59 a -0,0001) 0,77, P <0,0001. Medzi hodnotami pozorovanými v duplikáte (skóre závažnosti ochorenia 0,51, P = 0,00017 a hmotnosť rastliny 0,61, P < 0,0001) a medzi týmito dvoma parametrami (-0,59 a -0,0001) bola signifikantná korelácia 0,77, P < 0,0001. ).Medzi typické príznaky pozorované u náchylných rastlín patrí zalomenie a skrútenie stonky pripomínajúce štruktúru „pastierskej luky“, po ktorej nasledujú oválne lézie s oranžovými/ružovými sporozoitmi (doplnkový obrázok 1). Austrálske odrody nesúce gény Lanr1 (83A:476 a Tanjil) a AnMan (Mandelup) sú stredne rezistentné, 0,0331 a 0,0036). Niektoré línie, ktoré tiež nesú „rezistentné“ alely Lanr1 a/alebo AnMan, vykazujú príznaky choroby.
Je zaujímavé, že niekoľko NLL línií bez akejkoľvek „rezistentnej“ markerovej alely vykazovalo vysokú úroveň rezistencie na antraknózu (porovnateľnú alebo vyššiu ako u genotypov Lanr1 alebo AnMan), ako napríklad Boregine (hodnota P < 0,0001 pre oba parametre), Bojar (hodnota P < 0,0001 pre skóre a 0,001 pre hmotnosť rastliny) a populácia B-549/79b (hodnota P < 0,0001 pre skóre a nevýznamná pre hmotnosť). Je zaujímavé, že niekoľko NLL línií bez akejkoľvek „rezistentnej“ markerovej alely vykazovalo vysokú úroveň rezistencie na antraknózu (porovnateľnú alebo vyššiu ako u genotypov Lanr1 alebo AnMan), ako napríklad Boregine (hodnota P < 0,0001 pre oba parametre), Bojar (hodnota P < 0,0001 pre skóre a 0,001 pre hmotnosť rastliny) a populácia B-549/79b (hodnota P < 0,0001 pre skóre a nevýznamná pre hmotnosť). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерногого аркерного алибо высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем диловит Lanr takka Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оиценкислы, 100 для оиценкис растения) a популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Je zaujímavé, že niekoľko NLL línií bez akejkoľvek „rezistentnej“ markerovej alely vykazovalo vysokú úroveň rezistencie voči antraknóze (porovnateľnú alebo vyššiu ako u genotypov Lanr1 alebo AnMan), ako napríklad Boregine (hodnota P < 0,0001 pre oba parametre), Bojar (hodnota P < 0,0001 pre hodnotenie a 0,001 pre hmotnosť rastliny) a populácia B-549/79b (hodnota P < 0,0001 pre hodnotenie a nevýznamná pre hmotnosť).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭怊平的炭性平的炭性或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分为0,0001，植物重量为0,001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，釘怏丼㝍怏丼㝍怏丸 Je zaujímavé, že niektoré NLL systémy, ktoré nemajú žiadne „antigénne“ markery, vykazujú vysokú horizontálnu rezistenciu (ekvivalentnú génom Lanr1 alebo AnMan alebo vyššiu), ako napríklad Boregine (oba parametre P < 0,0001), Bojar (hodnota P < 0,0001, hmotnosť rastliny 0,001) a kmeň B-549/79b (hodnota P < 0,0001, hmotnosť nie je štatisticky významná). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллеклей «резистенитносто» уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такиезие качне Bor обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) a популяцкия B-549/79 P-значение <0,0001, масса незначительна). Je zaujímavé, že niektoré NLL línie, ktorým chýbali akékoľvek alely „rezistentných“ markerov, vykazovali vysoké úrovne rezistencie na antraknózu (porovnateľné alebo vyššie ako genotypy Lanr1 alebo AnMan), ako napríklad Boregine (hodnota P pre oba parametre < 0,0001), Bojar (hodnota P < 0,0001, hmotnosť rastliny 0,001) a populácia B-549/79b (hodnota P < 0,0001, hmotnosť nie je významná).Tento jav naznačuje možnosť nového genetického zdroja rezistencie, čo vysvetľuje pozorovaný nedostatok korelácie medzi markerovými genotypmi a fenotypmi ochorenia (hodnoty P od ~0,42 do ~0,98). Kolmogorov-Smirnovov test teda ukázal, že údaje o rezistencii voči antraknóze boli približne normálne rozdelené pre skóre (hodnoty P 0,25 a 0,11) a hmotnosť rastliny (hodnoty P 0,47 a 0,55), čo naznačuje hypotézu, že je zapojených viac alel ako Lanr1 a AnMan.
Na základe výsledkov skríningu rezistencie na antraknózu boli na analýzu transkriptómu vybrané 4 línie: 83A:476, Boregine, Mandelup a populácia 22660. Tieto línie boli opätovne testované na rezistenciu na antrax v inokulačných experimentoch pomocou sekvenovania RNA, za predpokladu, že boli rovnaké ako v predchádzajúcom teste. Hodnoty skóre boli nasledovné: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) a populácia 22660 (6,11 ± 1,29).
Protokol Illumina NovaSeq 6000 dosiahol priemerne 40,5 párov Mread na vzorku (29,7 až 54,4 Mread) (doplnková tabuľka S3). Skóre zarovnania v referenčnej sekvencii sa pohybovalo od 75,5 % do 88,6 %. Priemerná korelácia údajov o počte čítaní medzi experimentálnymi variantmi medzi biologickými replikátmi sa pohybovala od 0,812 do 0,997 (priemer 0,959). Z 35 170 analyzovaných génov 2 917 nepreukázalo žiadnu expresiu a zvyšných 4 785 génov bolo exprimovaných na zanedbateľnej úrovni (základný priemer < 5). Z 35 170 analyzovaných génov 2 917 nepreukázalo žiadnu expresiu a zvyšných 4 785 génov bolo exprimovaných na zanedbateľnej úrovni (základný priemer < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли эksпрессии, а остальные 4785 Из экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5). Z 35 170 analyzovaných génov 2917 nevykazovalo žiadnu expresiu a zvyšných 4785 génov bolo exprimovaných na zanedbateľnej úrovni (základný priemer <5).在分析的35 170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35 170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 игенов незначительную экспрессию (базовое среднее значение <5). Z 35 170 analyzovaných génov nebolo 2917 exprimovaných a zvyšných 4785 génov malo zanedbateľnú expresiu (základný priemer <5).Počet génov považovaných za exprimované (základný priemer ≥ 5) počas experimentu bol teda 27 468 (78,1 %) (doplnková tabuľka S4).
Od prvého časového bodu všetky línie NLL reagovali na inokuláciu C. lupini (kmeň Col-08) preprogramovaním transkriptómu (Tabuľka 1), medzi líniami sa však pozorovali významné rozdiely. Rezistentná línia 83A:476 (nesúca gén Lanr1) tak vykazovala významné preprogramovanie transkriptómu v prvom časovom bode (6 hpi) s 31 – 69-násobným nárastom počtu izolovaných up- a down-génov v porovnaní s inými časovými bodmi v tomto časovom bode. Okrem toho bol tento vrchol krátkodobý, pretože expresia iba niekoľkých génov zostala v druhom časovom bode (12 hpi) významne zmenená. Je zaujímavé, že Boregine, ktorý tiež vykazoval vysokú úroveň rezistencie v teste štepu, neprešiel počas experimentu takýmto masívnym transkripčným preprogramovaním. Počet diferencovane exprimovaných génov (DEG) bol však pri 12 HPI rovnaký pre Boregine aj 83A:476. Mandelup aj populácia 22660 vykazovali vrcholy DEG v poslednom časovom bode (48 l/s), čo naznačuje relatívne oneskorenie obranných reakcií.
Keďže línia 83A:476 prešla masívnym preprogramovaním transkriptómu v reakcii na C. lupini pri 6 HPI v porovnaní so všetkými ostatnými líniami, ~91 % pozorovaných diferenčne exprimovaných genómov (DEG) v tomto časovom bode bolo špecifických pre danú líniu (Obr. 1). V skorých reakciách medzi študovanými líniami sa však vyskytlo určité prekrývanie, keďže 68,5 %, 50,9 % a 52,6 % DEG v Boregine, Mandelup a populácii 22660 sa v určitých časových bodoch prekrývalo s tými, ktoré sa našli v línii 83A:476. Tieto DEG však predstavovali iba malú časť (0,97 – 1,70 %) všetkých DEG, ktoré sa v súčasnosti detegujú pomocou línie 83A:476. Okrem toho bolo v tomto čase koherentných 11 DEG zo všetkých línií (doplnkové tabuľky S4-S6), vrátane spoločných zložiek obranných reakcií rastlín: proteín prenosu lipidov (TanjilG_32225), enzým endoglukán-1,3-β-glukozid (TanjilG_23384), dva stresom indukovateľné proteíny, ako napríklad SAM22 (TanjilG_31528 a TanjilG_31531), základný latexový proteín (TanjilG_32352) a dva štrukturálne proteíny bunkovej steny bohaté na glycín (TanjilG_19701 a TanjilG_19702). Taktiež sa pozorovalo relatívne vysoké prekrývanie v transkriptómových odpovediach medzi 83A:476 a Boregine pri 24 HPI (celkovo 16-38 % DEG) a medzi Mandelup a populáciou 22660 pri 48 HPI (celkovo 14-20 % DEG).
Vennov diagram znázorňujúci počet diferencovane exprimovaných génov (DEG) v líniách lupiny úzkolistej (NLL) inokulovaných Colletotrichum lupini (kmeň Col-08 získaný z lupinových polí vo Wierzheniciach, Poľsko, 1999). Analyzované línie NLL boli: 83A:476 (rezistentná, nesúca alelu Lanr1), Boregine (rezistentná, genetické pozadie neznáme), Mandelup (stredne rezistentná, nesúca alelu AnMan) a populácia 22660 (veľmi citlivá). Skratka hpi označuje hodiny po vakcinácii. Nulové hodnoty boli odstránené pre zjednodušenie grafu.
Súbor génov s nadmernou expresiou v čase 6 hpi bol analyzovaný na prítomnosť kanonických domén R génu (doplnková tabuľka S7). Táto štúdia odhalila transkriptómovú indukciu klasických génov rezistencie voči chorobám iba s doménami NBS-LRR v polohe 83A:476. Tento súbor pozostával z jedného génu TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), piatich génov CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 a tanjilg_16162) a štyroch génov NBS-LR, Tanjilg_16162) a štyroch génov NBS-LRRE (tanjilg_16162), ako aj štyroch génov NBS-Lrr (tanjilg_16162) a štyroch génov NBS-LRR (TANJILG_16162). Všetky tieto gény majú kanonické domény usporiadané v konzervovaných sekvenciách. Okrem génov domény NBS-LRR bolo po 6 hpi aktivovaných niekoľko RLL kináz, a to jedna v Boregine (TanjilG_19877), dve v Mandelup (TanjilG_07141 a TanjilG_19877) a v populácii 22660 (TanjilG_09014 a TanjilG_10361) a dve v 83A 27:476.
Gény s významne zmenenou expresiou v reakcii na inokuláciu C. lupini (kmeň Col-08) boli podrobené analýze obohatenia Gene Ontology (GO) (doplnková tabuľka S8). Najčastejšie nadmerne zastúpeným termínom biologického procesu bol „obranná reakcia GO:0006952“, ktorý sa objavil v 6 zo 16 kombinácií (čas × čiara) s vysokou významnosťou (hodnota P < 0,001) (obr. 2). Najčastejšie nadmerne zastúpeným termínom biologického procesu bol „obranná reakcia GO:0006952“, ktorý sa objavil v 6 zo 16 kombinácií (čas × čiara) s vysokou významnosťou (hodnota P < 0,001) (obr. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса б006 «GO 2006 защитный ответ», который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинацэй с вытьяноЎйстысочоЎй вытьяноЎй вытсояноЎ (значение P <0,001) (рис. 2). Najčastejšie nadmerne zastúpeným termínom biologického procesu bol „obranná reakcia GO:0006952“, ktorý sa objavil v 6 zo 16 kombinácií (čas × línia) s vysokou významnosťou (hodnota P < 0,001) (obr. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 Najreprezentatívnejším termínom biologického procesu je „obranná reakcia GO:0006952“, ktorá sa objavuje v 6 zo 16 kombinácií (时间×线) s vysokou významnosťou (hodnota P < 0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процеского процесса,506 «Obrana: Reakcia na 0206 который появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значий значимостьче (мостьче <0рнстьче 2). Najčastejšie nadmerne zastúpeným termínom biologického procesu bol „GO:0006952 Obranná reakcia“, ktorý sa objavil v 6 zo 16 kombinácií (čas × čiara) s vysokou významnosťou (hodnota P < 0,001) (obr. 2).Tento termín bol nadmerne zastúpený v dvoch časových bodoch v populácii 83A: 476 a Boregine (6 a 24 hpi) a v jednom časovom bode v populácii Mandelup a 22660 (12 a 6 hpi). Toto je očakávaný výsledok, ktorý zdôrazňuje antifungálnu odpoveď rezistentných línií. Okrem toho, 83A:476 reagovala na C. lupini rýchlou indukciou génov súvisiacich s oxidačným vzplanutím reprezentovaným termínom „redoxný proces GO:0055114“, čo naznačuje špecifickú obrannú odpoveď, zatiaľ čo Boregine preukázala špecifické obranné reakcie súvisiace s termínom „GO“. :0006950 Stresová reakcia“. Populácia 22660 aktivovala horizontálnu rezistentnú reakciu zahŕňajúcu sekundárne metabolity, čo zdôrazňuje nadmerný počet termínov „GO:0016104 Proces biosyntézy triterpénov“ a „GO:0006722 Proces metabolizmu triterpénov“ (oba termíny patria do rovnakej sady génov), berúc do úvahy výsledky analýzy obohatenia GO termínov, stabilita Mandelupovej reakcie bola medzi Boregine a populáciou 22660. Okrem toho, skorá reakcia 83A:476 (6 hpi) a oneskorená reakcia Mandelup a populácia 22660 zahŕňajú termín GO:0015979 „fotosyntéza“ a ďalšie súvisiace biologické procesy.
Termíny bioprocesnej génovej ontológie vybrané v anotácii diferencovane exprimovaných génov počas transkriptómových odpovedí lupiny úzkolistej (NLL) inokulovanej antraxovým lupinom (kmeň Col-08 získaný z lupinových polí vo Wierzheniciach v Poľsku v roku 1999) sú značne prehnané. Analyzované línie NLL boli: 83A:476 (rezistentná, nesúca homozygotnú alelu Lanr1), Boregine (rezistentná, neznáme genetické pozadie), Mandelup (stredne rezistentná, nesúca homozygotnú alelu AnMan) a populácia 22660 (citlivá).
Keďže cieľom tejto štúdie bolo identifikovať gény, ktoré prispievajú k rezistencii na antraknózu, gény priradené k termínom GO „GO: 0006952 Obranné reakcie“ a „GO: 0055114 Redoxné procesy“ boli analyzované s hraničnými hodnotami od východiskových priemerov ≥ 30 s aspoň jednou čiarou. × časový bod kombinujúci štatisticky významné hodnoty log2 (násobná zmena). Počet génov spĺňajúcich tieto kritériá bol 65 pre GO:0006952 a 524 pre GO:0055114.
Štúdia 83A:476 odhalila dva píky DEG označené termínom GO:0006952, prvý pri 6 génoch na palec (64 génov, regulácia smerom nahor a nadol) a druhý pri 24 génoch na palec (15 génov, iba regulácia smerom nahor). Boregine tiež ukázal, že GO:0006952 dosiahol vrchol v rovnakom časovom bode, ale s menším DEG (11 a 8) a preferenčnou aktiváciou. Mandeloop vykazoval dva píky GO:0006952 pri 12 a 48 HPI, pričom oba niesli 12 génov (prvý s aktivačnými génmi a druhý iba s supresívnymi génmi), zatiaľ čo populácia 22660 pri 6 HPI (13 génov) mala väčšiu prevahu píku so zvýšenou reguláciou. Treba poznamenať, že 96,4 % píkov GO:0006952 DEG v týchto píkoch malo rovnaký typ reakcie (smerom nahor alebo nadol), čo naznačuje významné prekrývanie obranných reakcií napriek rozdielom v počte zapojených génov. Najväčšia skupina sekvencií súvisiacich s termínom GO:0006952 kóduje proteín 22 podobný SAM22 (Starvation Stress-Associated Message Protein 22), ktorý patrí do proteínovej skupiny PR-10 (Pathogenethics-associated protein) triedy 10 a do jadrového proteínového latexu (MLP-like protein) (Obr. 3). Tieto dve skupiny sa líšili v povahe expresie a smere reakcie. Gény kódujúce proteíny podobné SAM22 vykazovali konzistentnú a významnú indukciu v skorých časových bodoch (6 alebo 12 hpi) a na konci experimentu (48 hpi) vo všeobecnosti nereagovali, zatiaľ čo proteíny podobné MLP vykazovali koordináciu pri 6 hpi. 83A:476 a Mandelup pri 48 hp/in, takmer všetky ostatné dátové body nereagovali. Okrem toho rozdiely v expresných profiloch génov proteínov podobných SAM22 nasledovali pozorovanú variabilitu v rezistencii na antraknózu, pretože rezistentnejšie línie mali viac časových bodov, ktoré významne indukovali tieto gény, ako citlivejšie gény. Ďalší gén PR-10 podobný LlR18A/B vykazoval veľmi podobný expresný vzorec ako gén proteínu podobného SAM22.
Boli identifikované hlavné zložky biologického procesného termínu „GO:0006952 Defense Response“ a expresné vzorce kandidátskych génov alel Lanr1 a AnMan. Log2 stupnica predstavuje log2 hodnoty (násobok zmeny) medzi inokulovanými (Colletotrichum lupini, kmeň Col-08, získaný z lupinových polí, Wizhenica, Poľsko, 1999) a kontrolnými (simulovanými inokulovanými) rastlinami v rovnakom časovom bode. Analyzovali sa nasledujúce línie úzkolistého lupinu: 83A:476 (rezistentná, nesúca homozygotnú alelu Lanr1), Boregine (rezistentná, genetické pozadie neznáme), Mandelup (stredne rezistentná, nesúca homozygotnú alelu AnMan) a populácia 22660 (náchylná).
Okrem toho boli vyhodnotené expresné profily kandidátskych génov RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) a AnMan (TanjilG_12861) (Obr. 3). Gén TanjilG_05042 vykazoval významnú odpoveď (aktiváciu) v čase 83A:476 iba v prvom časovom bode (6 hpi), zatiaľ čo TanjilG_12861 bol v Mandeloop významne signifikantný iba v dvoch časových bodoch: 6 hpi (znížená regulácia) a 24 hpi (6 hpi). S... nastaviteľnou...).
Najviac nadmerne exprimované gény v termíne GO:0055114 „redox process“ boli gény kódujúce proteíny cytochrómu P450 a peroxidázu (obr. 4). Pri vzorkách izolovaných z 83A:476 pri 6 HPI boli vo všeobecnosti pozorované maximálne alebo minimálne hodnoty log2 (násobná zmena) (pre 86,6 % génov) medzi inokulovanými a kontrolnými rastlinami, čo zdôrazňuje vysokú reakciu tohto genotypu na inokulované pohlavie. 83A:476 vykazoval najvýznamnejší GO:0055114 DEG pri 6 hpi (503 génov), zatiaľ čo zvyšok línií pri 48 hpi (Boregine, 31 génov; Mandelup, 85 génov; a Populácia 22660, 78 génov)). Vo väčšine génov čeľade GO:0055114 boli pozorované dva typy reakcií na vakcináciu (aktivácia a inhibícia). Je zaujímavé, že až 97,6 % DEG identifikovaných pre termín GO: 0055114 v Mandelupe pri 48 hp. Tieto pozorovania naznačujú, že napriek výrazne menšiemu rozsahu (tj počtu mutovaných redoxných génov, 85 oproti 503) je vzorec oneskorených transkriptómových odpovedí mandelupe na antraknózu podobný skorej odpovedi 83A:476. V Boregine a populácii 22660 je táto konvergencia nižšia, a to 51,6 % a 75,6 %.
Boli odhalené vzorce expresie hlavných zložiek termínu biologického procesu „GO:0055114 Redox process“. Log2 stupnica predstavuje log2 hodnoty (násobok zmeny) medzi inokulovanými (Colletotrichum lupini, kmeň Col-08, získaný z lupinových polí, Wizhenica, Poľsko, 1999) a kontrolnými (simulovanými inokulovanými) rastlinami v rovnakom časovom bode. Analyzovali sa nasledujúce línie úzkolistého lupinu: 83A:476 (rezistentná, nesúca homozygotnú alelu Lanr1), Boregine (rezistentná, genetické pozadie neznáme), Mandelup (stredne rezistentná, nesúca homozygotnú alelu AnMan) a populácia 22660 (náchylná).
83A:476 Transkriptomické reakcie na inokuláciu s C. lupini (kmeň Col-08) zahŕňali aj koordinované umlčanie génov pripisovaných termínu GO:0015979 „fotosyntéza“ a ďalším súvisiacim biologickým procesom (obr. 5). Táto sada GO:0015979 DEG obsahovala 105 génov, ktoré boli významne potlačené pri 6 hpi pri 83A:476. V tejto podskupine bolo 37 génov tiež downregulovaných v Mandelupovej populácii pri 48 HPI a 35 v rovnakom časovom bode v populácii 22660, vrátane 19 DEG spoločných pre oba genotypy. Žiadne DEG súvisiace s termínom GO: 0015979 neboli významne aktivované v žiadnej kombinácii (riadok x čas).
Boli odhalené vzorce expresie hlavných zložiek termínu biologického procesu „GO:0015979 Fotosyntéza“. Log2 stupnica predstavuje log2 hodnoty (násobok zmeny) medzi inokulovanými (Colletotrichum lupini, kmeň Col-08, získaný z lupinových polí, Wizhenica, Poľsko, 1999) a kontrolnými (simulovanými) rastlinami v rovnakom časovom bode. Analyzovali sa nasledujúce línie úzkolistého lupinu: 83A:476 (rezistentná, nesúca homozygotnú alelu Lanr1), Boregine (rezistentná, genetické pozadie neznáme), Mandelup (stredne rezistentná, nesúca homozygotnú alelu AnMan) a populácia 22660 (náchylná).
Na základe výsledkov analýzy diferenciálnej expresie a pravdepodobne zapojených do obranných reakcií proti patogénnym hubám bola táto sada siedmich génov vybraná na kvantifikáciu expresných profilov pomocou PCR v reálnom čase (doplnková tabuľka S9).
Predpokladaný proteínový gén TanjilG_10657 bol významne indukovaný vo všetkých študovaných líniách a časových bodoch v porovnaní s kontrolnými (napodobňujúcimi) rastlinami (doplnkové tabuľky S10, S11). Okrem toho, expresný profil TanjilG_10657 vykazoval rastúci trend v priebehu experimentu pre všetky línie. Populácia 22660 vykazovala najvyššiu citlivosť TanjilG_10657 na inokuláciu so 114-násobnou aktiváciou a najvyššou relatívnou úrovňou expresie (4,4 ± 0,4) pri 24 HPI (obr. 6a). Gén proteínu PR10 LlR18A TanjilG_27015 tiež vykazoval aktiváciu vo všetkých líniách a časových bodoch so štatistickou významnosťou vo väčšine dátových bodov (obr. 6b). Podobne ako TanjilG_10657, najvyššia relatívna úroveň expresie TanjilG_27015 bola pozorovaná v inokulovanej populácii 22660 pri 24 HPI (19,5 ± 2,4). Gén kyslej endochitinázy TanjilG_04706 bol signifikantne zvýšený vo všetkých líniách a vo všetkých časových bodoch okrem Boregine 6 hpi (Obr. 6c). V prvom časovom bode (6 HPI) v čase 83A:476 bol silne indukovaný (10,5-krát) a v ostatných líniách mierne zvýšený (6,6 – 7,5-krát). Počas experimentu zostala expresia TanjilG_04706 na podobných úrovniach v líniách 83A:476 a Boregine, zatiaľ čo v líniách Mandelup a populácii 22660 sa signifikantne zvýšila a dosiahla relatívne vysoké hodnoty (5,9 ± 1,5 a 6,2 ± 1,5). Gén podobný endoglukán-1,3-β-glukozidáze TanjilG_23384 vykazoval vysokú aktiváciu v prvých dvoch časových bodoch (6 a 12 hpi) vo všetkých líniách okrem populácie 22660 (Obr. 6d). Najvyššie relatívne hladiny expresie TanjilG_23384 boli pozorované v druhom časovom bode (12 hpi) u Mandelup (2,7 ± 0,3) a 83A:476 (1,5 ± 0,1). Pri 24 HPI bola expresia TanjilG_23384 relatívne nízka vo všetkých študovaných líniách (od 0,04 ± 0,009 do 0,44 ± 0,12).
Profily expresie vybraných génov (ag) zistené kvantitatívnou PCR. Čísla 6, 12 a 24 predstavujú hodiny po vakcinácii. Gény LanDExH7 a LanTUB6 boli použité na normalizáciu a LanTUB6 bol použitý na kalibráciu medzi sériami. Chybové úsečky predstavujú štandardnú odchýlku na základe troch biologických replikátov, z ktorých každý je priemerom troch technických replikátov. Štatistická významnosť rozdielov v hladinách expresie medzi inokulovanými (Colletotrichum lupini, kmeň Col-08, získaný v roku 1999 z lupinového poľa vo Wierzenici v Poľsku) a kontrolnými (falošne inokulovanými) rastlinami je vyznačená nad dátovými bodmi (*hodnota P < 0,05, **hodnota P ≤ 0,01, ***hodnota P ≤ 0,001). Štatistická významnosť rozdielov v hladinách expresie medzi inokulovanými (Colletotrichum lupini, kmeň Col-08, získaný v roku 1999 z lupinového poľa vo Wierzenici v Poľsku) a kontrolnými (falošne inokulovanými) rastlinami je vyznačená nad dátovými bodmi (*hodnota P < 0,05, **hodnota P ≤ 0,01, ***hodnota P ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулалировантными Col-08, получен v roku 1999 г с поля люпина в Верженице, Польша) a контрольными (лиожокинова. растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***00не P.0. Štatisticky významné rozdiely v hladinách expresie medzi inokulovanými (Colletotrichum lupini, kmeň Col-08, získaný v roku 1999 z lupinového poľa vo Wierzheniciach v Poľsku) a kontrolnými (simulovanými inokulovanými) rastlinami sú uvedené nad dátovými bodmi (*hodnota P < 0,05, **hodnota P ≤ 0,01, ***hodnota P ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在*数捼0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， farba-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对穥 玤－之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ ・01, 0,01 ***P Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулировантными (Colletotrich,lupnыmy) полученный с полей люпина в Верженице, Польша, v roku 1999 г.) a контрольными (ложнинуна) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-01). Štatisticky významné rozdiely v hladinách expresie medzi inokulovanými (Colletotrichum lupini, kmeň Col-08, získaný z lupinových polí vo Verzheniciach v Poľsku v roku 1999) a kontrolnými (simulovanými) rastlinami sú uvedené nad dátovými bodmi (*hodnota P < 0,05, **hodnota P ≤ 0,01, ***hodnota P ≤ 0,001).Analyzované línie NLL boli: 83A:476 (rezistentná, nesúca homozygotnú alelu Lanr1), Mandelup (stredne rezistentná, nesúca homozygotnú alelu AnMan), Boregine (rezistentná, neznáme genetické pozadie) a populácia 22660 (náchylná).
Kandidátsky gén TanjilG_05042 na lokuse Lanr1 vykazoval výrazne odlišný vzorec expresie od profilov získaných zo štúdií RNA-seq (obr. 6e). V populácii Mandelup a 22660 bola pozorovaná významná aktivácia tohto génu (až 39,7-krát a 11,7-krát), čo viedlo k relatívne vysokým hladinám expresie (až 1,4 ± 0,14-krát a 7,2 ± 1,3-krát). Štúdia 83A:476 tiež odhalila určitú zvýšenú reguláciu génu TanjilG_05042 (až 3,8-krát), avšak dosiahnuté relatívne hladiny expresie (0,044 ± 0,002) boli viac ako 30-krát nižšie ako tie, ktoré boli pozorované v populácii Mandelup a 22660. Analýza pomocou qPCR ukázala významné rozdiely v hladinách expresie medzi genotypmi v kontrolných variantoch s miernou vakcináciou, pričom rozdiel dosiahol 58-násobný medzi populáciami 22660 a 83A:476, ako aj medzi populáciami 22660 a 22660. Dvojnásobný rozdiel sa dosiahol medzi Boregine a Mandalup.
Kandidátsky gén v lokuse AnMan, TanjilG_12861, bol aktivovaný v reakcii na očkovanie v populáciách 83A:476 a Mandelup, v populácii 22660 bol neutrálny a v populácii Boregine bol downregulovaný (Obr. 6f). Relatívna expresia génu TanjilG_12861 bola najvyššia v inokulovanej populácii 83A:476 (0,14 ± 0,01). Gén TanjilG_05080 HSP17.4 pre proteín tepelného šoku triedy I s molekulovou hmotnosťou 17,4 kDa vykazoval nižšie relatívne hladiny expresie vo všetkých študovaných kmeňoch a časových bodoch (Obr. 6g). Najvyššia hodnota bola pozorovaná pri 24 HPI v populácii 22660 (0,14 ± 0,02, čo predstavuje osemnásobný nárast v reakcii na očkovanie).
Porovnanie profilov génovej expresie (obr. 7) odhalilo vysokú koreláciu medzi TanjilG_10657 a štyrmi ďalšími génmi: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) a TanjilG_04706 (r = 0,79). Takéto výsledky môžu naznačovať koreguláciu týchto génov počas obranných reakcií. Gény TanjilG_12861 a TanjilG_23384 vykazovali odlišné profily expresie s nižšími hodnotami Pearsonovho korelačného koeficientu (od 0,08 do 0,43 a -0,19 do 0,28) v porovnaní s inými génmi.
Korelácie medzi profilmi génovej expresie boli detegované pomocou kvantitatívnej PCR. Analyzovali sa nasledujúce línie lupiny úzkolistej: 83A:476 (rezistentná, nesúca homozygotnú alelu Lanr1), Mandelup (stredne rezistentná, nesúca homozygotnú alelu AnMan), Boregine (rezistentná, genetické pozadie neznáme) a populácia 22660 (náchylná). Boli vypočítané tri časové body (6, 12 a 24 hodín po inokulácii), vrátane inokulovaných (Colletotrichum lupini, kmeň Col-08, získaný z lupinových polí vo Wierzheniciach v Poľsku v roku 1999) a kontrolných (fiktívne inokulovaných) rastlín. Stupnica zobrazuje hodnotu Pearsonovho korelačného koeficientu.
Na základe údajov získaných pri výkone 6 konských síl na palec (6 konských síl na palec) bola vykonaná WGCNA na 9981 DEG identifikovaných porovnaním inokulovaných a kontrolných rastlín s cieľom zamerať sa na skoré obranné reakcie (doplnková tabuľka S12). Bolo nájdených dvadsaťdva génových modulov (zhlukov) s korelovanými (pozitívnymi alebo negatívnymi) expresnými profilmi medzi genotypmi a experimentálnymi variantmi. V priemere boli hladiny génovej expresie klesajúce v poradí 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populácia 22660 (v oboch variantoch bol však tento trend silnejší u kontrolných rastlín). V priemere boli hladiny génovej expresie klesajúce v poradí 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populácia 22660 (v oboch variantoch bol však tento trend silnejší u kontrolných rastlín). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populácia 22660 (в ововатина однако, эта тенденция быla сильнее у контрольных растений). V priemere sa hladiny génovej expresie znižovali v poradí 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populácia 22660 (v oboch variantoch bol však tento trend silnejší u kontrolných rastlín).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Populácia 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> počet obyvateľov 22 660 的 顺序 下降 （Ｇ 在 缈Ｇ 在 缿在 在 植物 中 更）。。。。。。。... В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (однатовахва эта тенденция быla сильнее у контрольныh растений). V priemere sa hladiny génovej expresie znížili v sérii 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populácia 22660 (avšak v oboch variantoch bol tento trend silnejší v kontrolných rastlinách).Vakcinácia viedla k zvýšenej regulácii génovej expresie, najmä v moduloch 18, 19, 14, 6 a 1 (v zostupnom poradí účinku), negatívnej regulácii (napr. moduly 9 a 20) alebo s neutrálnymi účinkami (napr. moduly 11, 22, 8 a 13). Analýza obohatenia GO termínov (doplnková tabuľka S13) odhalila „GO: 0006952 Protective Responses“ pre inokulovaný modul (18) s maximálnou aktiváciou, vrátane génov analyzovaných pomocou qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 a TanjilG_27015), ako aj mnohé inokulované najviac potlačené moduly fotosyntézy (9). Koncentrátor modulu 18 (obr. 8) bol identifikovaný ako gén TanjilG_26536 kódujúci proteín PR-10 podobný LlR18B a koncentrátor modulu 9 bol identifikovaný ako gén TanjilG_28955 kódujúci proteín fotosystému II PsbQ. Kandidátsky gén rezistencie na antraknózu Lanr1, TanjilG_05042, bol nájdený v module 22 (obr. 9) a je spojený s termínmi „GO:0044260 Celulárne makromolekulárne metabolické procesy“ a „GO:0006355 Transkripčná regulácia, tvorba DNA templátov“, ktoré nesú uzol TanjilG_01212. Gén kóduje transkripčný faktor tepelného stresu A-4a (HSFA4a).
Vážená sieťová analýza génovej koexpresie modulov s nadmerne zastúpenými termínmi biologických procesov „GO: 0006952 Defense responses“. Ligácia bola zjednodušená, aby sa zvýraznili štyri gény analyzované pomocou qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 a TanjilG_27015).
Vážená sieťová analýza génovej koexpresie modulu s nadmerne zastúpeným termínom biologického procesu „GO: 0006355: Transkripčná regulácia, DNA templating“ a nesúci kandidátsky gén rezistencie na antraknózu Lanr1 TanjilG_05042. Ligácia bola zjednodušená na izoláciu génu TanjilG_05042 a centrálneho génu TanjilG_01212.
Skríning rezistencie na antraknózu zozbieraný v Austrálii ukázal, že väčšina skorých vydaných kultivarov bola náchylná; Kalya, Coromup a Mandelup boli opísané ako stredne rezistentné, zatiaľ čo Wonga, Tanjil a 83A:476 boli opísané ako vysoko rezistentné26,27,31. mali rovnakú alelu rezistencie, označenú Lanr1, a Coromup a Mandelup mali inú alelu, označenú AnMan10, 26, 39, zatiaľ čo Kalya preniesla inú alelu, Lanr2. Skríning rezistencie na antraknózu v Nemecku viedol k identifikácii rezistentnej línie Bo7212 s kandidátskou alelou inou ako Lanr1, označenou LanrBo36.
Naša štúdia odhalila veľmi nízku frekvenciu (približne 6 %) alely Lanr1 v testovanej zárodočnej plazme. Toto pozorovanie je v súlade s výsledkami skríningu východoeurópskej zárodočnej plazmy pomocou markerov Anseq3 a Anseq4, ktoré ukázali, že alela Lanr1 je prítomná iba v dvoch bieloruských líniách. To naznačuje, že alela Lanr1 ešte nie je v miestnych šľachtiteľských programoch široko používaná, na rozdiel od Austrálie, kde je jednou z kľúčových alel pre šľachtenie s pomocou markerov. Môže to byť spôsobené nižšou úrovňou rezistencie, ktorú poskytuje alela Lanr1 v európskych poľných podmienkach v porovnaní s austrálskou správou. Okrem toho štúdie antraknózy v oblastiach s vysokými zrážkami v Austrálii ukázali, že reakcie rezistencie sprostredkované alelou Lanr1 nemusia byť účinné v poveternostných podmienkach, ktoré podporujú rast a rýchly vývoj patogénu19,42. V skutočnosti sa v tejto štúdii niektoré príznaky antraknózy pozorovali aj u genotypov nesúcich alelu Lanr1, čo naznačuje, že rezistencia môže za optimálnych podmienok pre vývoj C. lupini zmiznúť. Okrem toho sú možné falošne pozitívne interpretácie prítomnosti markerov Anseq3 a Anseq4, ktoré sú približne 1 cM od lokusu Lanr1, 28,30,43.
Naša štúdia ukázala, že 83A:476, nesúci alelu Lanr1, reagoval na inokuláciu C. lupini rozsiahlym preprogramovaním transkriptómu v prvom analyzovanom časovom bode (6 hpi), zatiaľ čo u Mandelup, nesúceho alelu AnMan, boli transkriptomické reakcie pozorované oveľa neskôr (od 24 do 48 hp). Tieto časové variácie v obranných reakciách sú spojené s rozdielmi v symptómoch ochorenia, čo zdôrazňuje dôležitosť včasného rozpoznania patogénu pre úspešnú reakciu na rezistenciu. Aby sa spóry antraxu infikovali, musia prejsť niekoľkými vývojovými štádiami na povrchu hostiteľa, vrátane klíčenia, bunkového delenia a tvorby apresória. Prívesok je infekčná štruktúra, ktorá sa pripája k povrchu hostiteľa a uľahčuje prenikanie do hostiteľských tkanív. Spóry C. gloeosporioides v extrakte z hrachu teda vykazovali prvé delenie jadra po 75 – 90 minútach inkubácie, tvorbu zárodočnej trubice po 90 – 120 minútach a supresiu po 4 hodinách 45. Mangový druh C. gloeosporioides vykazoval viac ako 40 % klíčenie konídií po 3 hodinách inkubácie a približne 20 % tvorbu apresorov po 4 hodinách. Gén CAP20 asociovaný s virulenciou z C. gloeosporioides vykazoval transkripčnú aktivitu v konídiách tvoriacich epifyty po 3,5 hodinách inkubácie v povrchovom vosku avokáda s vysokými koncentráciami proteínu CAP20 po 4 hodinách 46 minútach. Podobne bola aktivita génov biosyntézy melanínu v C. trifolii indukovaná počas 2-hodinovej inkubácie, po ktorej nasledovala tvorba apresória po 1 hodine. Štúdie listových tkanív ukázali, že jahody inokulované C. acutatum majú prvú supresiu po 8 hodinách po infekcii, zatiaľ čo paradajky inokulované C. coccodes majú prvú supresiu po 4 hodinách po infekcii48,49, čo je do značnej miery v súlade s časovým harmonogramom infekčného procesu spôsobeného druhmi Colletotrichum. Rýchle obranné reakcie na 83A:476 naznačujú zapojenie génov rezistencie rastlín a efektorom spúšťanej imunity (ETI) v tejto línii, zatiaľ čo Mandelupove oneskorené reakcie podporujú hypotézu mikro-asociovanej molekulárne vzorom spúšťanej imunity (MTI) 50. Včasné reakcie na 83A: 476 a Mandelupa. Čiastočné prekrývanie medzi up- alebo down-regulovanými génmi v oneskorenej reakcii tiež podporuje túto koncepciu, pretože ETI sa často považuje za zrýchlenú a zosilnenú MTI reakciu, ktorá vrcholí programovanou bunkovou smrťou v mieste infekcie, známou ako anafylaktický šok 51,52.
Väčšina génov pripisovaných nadmerne zastúpenému termínu Gene Ontology GO:0006952 „Obranná reakcia“ je 11 homológov proteínu stresom indukovaného hladovania 22 (podobného SAM22) a sedem hlavných proteínov podobných latexovým proteínom (MLP) 31, 34, 43 a 423 vykazovalo sekvenčnú podobnosť. Gény podobné SAM22 vykazovali významnú aktiváciu, ktorá trvala dlhšie, čo vykazovalo zvýšené hladiny rezistencie na antraknózu (83A:476 a Boregine). Gény podobné MLP však boli downregulované iba v líniách nesúcich kandidátsku alelu rezistencie (83A:476/Lanr1 pri 6 hpi a Mandelup/AnMan pri 24 hpi). Treba poznamenať, že všetky identifikované homológy podobné SAM22 pochádzajú z génového klastra s dĺžkou približne 105 kb, zatiaľ čo gény podobné MLP pochádzajú zo samostatných oblastí genómu. Koordinovaná aktivácia takýchto génov podobných SAM22 bola zistená aj v našej predchádzajúcej štúdii rezistencie NLL na inokuláciu Diaporthetoxica, čo naznačuje, že sú zapojené do horizontálnych zložiek obrannej reakcie. Tento záver podporujú aj správy o pozitívnej reakcii génov podobných SAM22 na poškodenie alebo liečbu kyselinou salicylovou, induktormi plesní alebo peroxidom vodíka.
Ukázalo sa, že gény podobné MLP reagujú na rôzne abiotické a biotické stresy vrátane bakteriálnych, vírusových a patogénnych hubových infekcií u mnohých rastlinných druhov55. Smery reakcie na určité interakcie medzi rastlinami a patogénmi sa pohybovali od silného nárastu (t. j. počas napadnutia bavlny Verticillium dahliae) až po významný pokles (t. j. po infekcii jablone Alternaria spp.)56,57. Významná downregulácia génu podobného MLP 423 bola pozorovaná počas obranyschopnosti avokáda voči infekcii F. niger a počas infekcie jablone Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola a Alternaria alternata sú patotypy jabĺk58,59. Okrem toho, kalusy jabĺk s nadmernou expresiou génu podobného MLP 423 mali nižšiu expresiu génov asociovaných s rezistenciou a boli náchylnejšie na hubovú infekciu59. Po infekcii Fusarium oxysporum f bol gén podobný MLP 423 potlačený aj v rezistentnej zárodočnej plazme fazule bežnej. cn. Infekcia fazule 60.
Ďalšími členmi rodiny PR-10 identifikovanými v našej štúdii RNA-seq boli gény LlR18A a LlR18B v reakcii na zvýšenú reguláciu, ako aj zvýšene regulovaný (1 gén) alebo znížene regulovaný (3 gény) gén pre proteín prenosu lipidov DIR1. Okrem toho WGCNA zdôrazňuje gén LlR18B ako uzol v tomto module, ktorý je vysoko citlivý na vakcináciu a nesie niekoľko génov ochrannej odpovede. Gény LlR18A a LlR18B boli indukované v listoch žltého lupinu v reakcii na patogénne baktérie, ako aj v stonkách NLL po inokulácii D. toxica, zatiaľ čo ryžový homológ týchto génov, RSOsPR10, bol rýchlo indukovaný plesňovou infekciou pravdepodobne zapojenou do signálnej dráhy kyseliny jasmónovej53,61,62. Gén DIR1 kóduje nešpecifické proteíny transportu lipidov, ktoré sú potrebné na nástup systémovej získanej rezistencie (SAR). S rozvojom ochranných reakcií je proteín DIR1 transportovaný z ložiska infekcie cez floém, aby indukoval SAR vo vzdialených orgánoch. Je zaujímavé, že gén DIR1 TanjilG_02313 bol významne indukovaný v prvom časovom bode v líniách 84A:476 a populácii 22660, ale rezistencia na antraknózu sa úspešne vyvinula iba v línii 84A:476. To môže naznačovať určitú subfunkcionalizáciu génu DIR1 v NLL, pretože zostávajúce tri homológy reagovali na inokuláciu iba v línii 83A:476 po 6 hpi a táto reakcia bola smerovaná smerom nadol.
V našej štúdii boli najbežnejšími zložkami zodpovedajúcimi biologickému procesu nazývanému „GO:0055114 Redox process“ proteín cytochrómu P450, peroxidáza, kyselina linolová 9S-/13S-lipoxygenáza a oxidáza kyseliny 1-aminocyklopropán-1-karboxylovej. Okrem toho naša WGCNA definuje homológ HSFA4a ako uzol nesúci moduly, ako je napríklad kandidátsky gén rezistencie na Lanr1 TanjilG_05042. HSFA4a je súčasťou redox-dependentnej regulácie jadrovej transkripcie v rastlinách.
Proteíny cytochrómu P450 sú oxidoreduktázy, ktoré katalyzujú NADPH a/alebo O2-dependentné hydroxylačné reakcie v primárnom a sekundárnom metabolizme vrátane metabolizmu xenobiotík, ako aj hormónov, mastných kyselín, sterolov, zložiek bunkovej steny, biopolymérov a biosyntézy ochranných zlúčenín 69. V našej štúdii sa variabilita funkcie rastlinného cytochrómu P450 znížila z -10,6 log2 (násobná zmena) na 5,7 v dôsledku veľkého počtu zmenených homológov (37) a rozdielov vo vzorcoch odpovedí medzi špecifickými génmi, čo odráža revíziu smerom nahor. Použitie iba údajov RNA-seq na objasnenie predpokladanej biologickej funkcie génov NLL v takej veľkej proteínovej superrodine by bolo vysoko špekulatívne. Stojí však za zmienku, že niektoré gény cytochrómu P450 sú spojené so zvýšenou odolnosťou voči patogénnym hubám alebo baktériám, vrátane prispievania k alergickým reakciám 69,70,71.
Peroxidázy triedy III sú multifunkčné rastlinné enzýmy zapojené do širokej škály metabolických procesov počas rastu a vývoja rastlín, ako aj do reakcie na environmentálne stresy, ako je slanosť, sucho, vysoká intenzita svetla a napadnutie patogénmi72. Peroxidázy sa podieľajú na interakcii niekoľkých rastlinných druhov s anthracis, vrátane Stylosanthes humilis a C. gloeosporioides, Lens culinaris a C. truncatum, Phaseolus vulgaris a C. lindemuthianum, Cucumis sativus a C. lagenarium73,74,75,76. Reakcia je veľmi rýchla, niekedy dokonca pri 4 HPI, predtým, ako huba prenikne do rastlinného tkaniva73. Gén peroxidázy tiež reagoval na inokuláciu D. toxica NLL. Okrem svojich typických funkcií regulácie oxidačného vzplanutia alebo eliminácie oxidačného stresu môžu peroxidázy interferovať s rastom patogénov vytváraním fyzikálnych bariér založených na spevňovaní bunkovej steny počas lignifikácie, podjednotiek alebo zosieťovania špecifických zlúčenín. Túto funkciu možno in silico pripísať génu TanjilG_03329 kódujúcemu predpokladanú lignín-tvoriacu anión peroxidázu, ktorá bola v našej štúdii signifikantne upregulovaná u rezistentnej línie 83A:476 pri 6 HPI, ale nie u iných kmeňov a časových bodov, ktoré nereagovali.
9S-/13S-lipoxygenáza kyseliny linolovej je prvým krokom v oxidačnej dráhe biosyntézy lipidov78. Produkty tejto dráhy majú viacero funkcií v obrane rastlín, vrátane posilňovania bunkovej steny tvorbou usadenín kalózy a pektínu a regulácie oxidačného stresu produkciou reaktívnych foriem kyslíka79,80,81,82,83. V predloženej štúdii bola expresia 9S-/13S-lipoxygenázy kyseliny linolovej zmenená u všetkých kmeňov, ale v citlivej populácii 22660 prevládala zvýšená regulácia v rôznych časových bodoch, zatiaľ čo u kmeňov nesúcich rezistentný Lanr1 a alelu AnMan zdôrazňuje diverzifikáciu oxylipínovej vrstvy v ochranných reakciách antraxu medzi týmito genotypmi.
Homológ 1-aminocyklopropán-1-karboxylátoxidázy (ACO) bol významne upregulovaný (9 génov) alebo downregulovaný (2 gény) pri inokulácii lupinou. S dvoma výnimkami sa všetky tieto reakcie vyskytli pri 6 hp v čase 83A:476. Enzymatická reakcia sprostredkovaná proteínmi ACO je krokom limitujúcim rýchlosť produkcie etylénu, a preto je vysoko regulovaná84. Etylén je rastlinný hormón, ktorý hrá rôzne úlohy v regulácii vývoja rastlín a reakcie na abiotické a biotické stresové podmienky. Indukcia transkripcie ACO a aktivácia signálnej dráhy etylénu sa podieľajú na zvyšovaní odolnosti ryže voči hemibiotrofnej hube oryzae oryzae reguláciou produkcie reaktívnych foriem kyslíka a fytoalexínov. Veľmi podobný proces infekcie listov zistený medzi M. oryzae a C. lupini88,89, na pozadí významnej zvýšenej regulácie homológov ACO v línii 83A:476 uvedenej v tejto štúdii, posúva možnosť udelenia rezistencie voči NLL antraknóze etylénu ako signálneho ústredného kroku v molekulárnych dráhach.
V predloženej štúdii sa pozorovalo rozsiahle potlačenie mnohých génov spojených s fotosyntézou pri 6 hpi u populácie 83A:476 a pri 48 hpi u populácie Mandeloop a 22660. Rozsah a progresia týchto zmien je úmerná úrovni. V tomto experimente sa pozorovala rezistencia na antraknózu. Nedávno sa v niekoľkých modeloch interakcií rastlín a patogénov, vrátane patogénnych baktérií a húb, zaznamenala silná a skorá represia transkriptov súvisiacich s fotosyntézou. Zrýchlené (od 2 HPI v niektorých interakciách) a globálne potlačenie génov spojených s fotosyntézou v reakcii na infekciu môže spustiť imunitu rastlín na základe nasadenia reaktívnych foriem kyslíka a ich interakcie s dráhou kyseliny salicylovej na sprostredkovanie alergických reakcií 90,94.
Záverom možno konštatovať, že mechanizmy obrannej reakcie navrhnuté pre najodolnejšiu líniu (83A:476) zahŕňajú rýchle rozpoznanie patogénu génom R (pravdepodobne TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) a signalizáciu kyseliny salicylovej a etylénu sprostredkovanú alergickou odpoveďou, po ktorej nasleduje vytvorenie dlhodobého SAR. Účinok je podporený proteínom DIR-1. Treba poznamenať, že biotrofické obdobie infekcie C. lupini je veľmi krátke (približne 2 dni), po ktorom nasleduje nekrotický rast95. Prechod medzi týmito štádiami môže byť spojený s nekrózou a expresiou etylénom indukovateľných proteínov, ktoré pôsobia ako spúšťače reakcií precitlivenosti v hostiteľských rastlinách. Preto je časové okno pre úspešné zachytenie C. lupini v biotrofickom štádiu veľmi úzke. Preprogramovanie génov spojených s redoxom a fotosyntézou pozorované v 83A:476 po 6 hodinách po zabití je v súlade s progresiou hubových hýf a predznamenáva vývoj úspešnej ochrannej reakcie v biotrofickom štádiu. Transkriptomické reakcie Mandelupu a populácie 22660 môžu byť príliš oneskorené na zachytenie huby pred prepnutím do nekrotického rastu, avšak Mandelup môže byť účinnejší ako populácia 22660, pretože relatívne rýchla regulácia proteínu PR-10 podporuje horizontálnu rezistenciu.
Zdá sa, že ETI, riadená kanonickým génom R, je bežným mechanizmom rezistencie fazule voči antraknóze. V modelovej strukovine Medicago truncatula je rezistencia voči antraknóze zabezpečovaná génom RCT1, členom triedy génov R rastliny TIR-NBS-LRR97. Tento gén tiež zabezpečuje širokospektrálnu rezistenciu voči antraknóze u lucerny po prenose na náchylné rastliny. U fazule obyčajnej (P. vulgaris) bolo doteraz identifikovaných viac ako dva tucty génov rezistencie voči antraknóze. Niektoré z týchto génov sa nachádzajú v oblastiach, kde chýbajú akékoľvek kanonické gény R, mnohé ďalšie sa však nachádzajú na okrajoch chromozómov nesúcich génový klaster NBS-LRR, vrátane TIR-NBS-LRRs99. Štúdia SSR v celom genóme tiež potvrdila súvislosť génu NBS-LRR s rezistenciou voči antraknóze u fazule obyčajnej. Kanonický gén R bol tiež nájdený v genómovej oblasti nesúcej hlavný lokus rezistencie voči antraknóze u bielej lupiny 101.
Naša práca ukazuje, že okamžitá rezistentná reakcia, aktivovaná v skorom štádiu infekcie rastlín (najlepšie najneskôr do 12 hodín po infekcii), účinne chráni úzkolistú lupinu pred antraknózou spôsobenou patogénnou hubou Collelotrichum lupini. Pomocou vysokokapacitného sekvenovania sme demonštrovali diferenciálne expresné profily génov rezistencie na antraknózu v rastlinách NLL sprostredkované génmi rezistencie Lanr1 a AnMan. Úspešná obrana zahŕňa starostlivé navrhnutie génov pre proteíny zapojené do redoxu, fotosyntézy a patogenézy v priebehu niekoľkých hodín od prvého kontaktu rastliny s patogénom. Podobné ochranné reakcie, ale časovo oneskorené, sú oveľa menej účinné pri ochrane rastlín pred chorobami. Rezistencia na antrax sprostredkovaná génom Lanr1 sa podobá typickej rýchlej reakcii génu R (imunita spúšťaná efektorom), zatiaľ čo gén AnMan s najväčšou pravdepodobnosťou poskytuje horizontálnu reakciu (imunita spúšťaná molekulárnym vzorcom asociovaným s mikróbom), čo zabezpečuje strednú úroveň udržateľnosti.
215 NLL línií použitých na skríning antraknózových markerov pozostávalo zo 74 kultivarov, 60 línií získaných krížením alebo šľachtením, 5 mutantov a 76 divokých alebo pôvodných zárodočných plazmiet. Línie pochádzali zo 17 krajín, najmä z Poľska (58), Španielska (47), Nemecka (27), Austrálie (26), Ruska (19), Bieloruska (7), Talianska (5) a ďalšie línie z 10 krajín. Súbor obsahuje aj referenčné rezistentné línie: 83A:476, Tanjil, Wonga s alelou Lanr1 a Mandelup s alelou AnMan. Línie boli získané z Európskej databázy genetických zdrojov lupiny, ktorú spravuje spoločnosť Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Poľsko (doplnková tabuľka S1).
Rastliny boli pestované za kontrolovaných podmienok (fotoperióda 16 hodín, teplota 25 °C počas dňa a 18 °C v noci). Analyzovali sa dva biologické replikáty. DNA bola izolovaná z trojtýždňových listov pomocou súpravy DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Nemecko) podľa protokolu. Kvalita a koncentrácia izolovanej DNA bola hodnotená spektrofotometrickými metódami (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Analyzoval sa marker AnManM1 označujúci gén rezistencie na antraknózu AnMan (odvodený z odrody Mandelup) a markery Anseq3 a Anseq4 ohraničujúce gén Lanr1 (odvodený z odrody Tanjil) 11,26,28. Homozygoti pre rezistentnú alelu boli hodnotení ako „1“, náchylní ako „0“ a heterozygoti ako 0,5.
Na základe výsledkov skríningu markerov AnManM1, AnSeq3 a AnSeq4 a dostupnosti semien pre záverečné následné experimenty bolo na fenotypizáciu rezistencie na antraknózu vybraných 50 línií NLL. Analýza sa vykonala duplicitne v počítačom riadenom skleníku so 14-hodinovou fotoperiódou s teplotným rozsahom 22 °C počas dňa a 19 °C v noci. Semená sa pred výsevom poškriabu (odrežu sa semenný obal na opačnej strane embrya ostrou čepeľou), aby sa zabránilo dormancii semien v dôsledku príliš tvrdého semenného obalu a aby sa zabezpečilo rovnomerné klíčenie. Rastliny sa pestovali v kvetináčoch (11 × 11 × 21 cm) so sterilnou pôdou (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varšava, Poľsko). Inokulácia sa uskutočnila kmeňom Colletotrichum lupini Col-08, vypestovaným v roku 1999 zo stoniek úzkolistých rastlín lupiny pestovaných na poli vo Verženici, Veľkopoľsko (52° 27′ 42″ s. š. 17° 04′ 05″ v. d.). Získaná oblasť. Izoláty sa kultivovali v médiu SNA pri teplote 20 °C pod čiernym svetlom počas 21 dní, aby sa vyvolala sporulácia. Štyri týždne po zasiatí, keď rastliny dosiahli štádium 4 – 6 listov, sa uskutočnila inokulácia postrekom suspenziou konídií v koncentrácii 0,5 x 10⁶ konídií na ml. Po inokulácii sa rastliny udržiavali 24 hodín v tme pri vlhkosti približne 98 % a teplote 25 °C, aby sa uľahčilo klíčenie konídií a proces infekcie. Rastliny boli potom pestované za 14-hodinovej fotoperiódy pri teplote 22 °C cez deň/19 °C v noci a 70 % vlhkosti. Skóre ochorenia bolo stanovené 22 dní po inokulácii a pohybovalo sa od 0 (imúnne) do 9 (veľmi náchylné) v závislosti od prítomnosti alebo neprítomnosti nekrotických lézií na stonkách a listoch. Okrem toho bola po vyhodnotení meraná hmotnosť rastlín. Vzťahy medzi genotypmi markerov a fenotypmi ochorenia boli vypočítané ako bodové dvojsekvenčné korelácie (absencia heterozygotných markerov v súbore línií pre analýzu fenotypu rezistencie na antraknózu).