Takk for at du besøker Nature.com. Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte. For best mulig opplevelse anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi gjengi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Angustifolius lupin (NLL, Lupinus angustifolius L.) er en belgfrukt som brukes til matproduksjon og jordforbedring. Den globale spredningen av NLL som avling har tiltrukket seg mange patogene sopper, inkludert lupinantraknose, som forårsaker den ødeleggende antraknosesykdommen. To alleler, Lanr1 og AnMan, som gir økt resistens, har blitt brukt i NLL-foredling, men de underliggende molekylære mekanismene er fortsatt ukjente. I denne studien ble Lanr1- og AnMan-markørene brukt til å screene europeiske NLL-prøver. Testing av vaksinen i et kontrollert miljø bekreftet effekten av begge resistente donorer. Differensiell genuttrykksprofilering ble utført på representative resistente og mottakelige linjer. Antraknoseresistens var assosiert med overuttrykk av genontologitermene «GO:0006952 Defense Response», «GO:0055114 Redox Process» og «GO:0015979 Photosynthesis». I tillegg viste Lanr1(83A:476)-linjen betydelig transkriptomreprogrammering raskt etter inokulering, mens de andre linjene viste en forsinkelse i denne responsen på omtrent 42 timer. Forsvarsresponser er assosiert med TIR-NBS-, CC-NBS-LRR- og NBS-LRR-genene, 10 proteiner involvert i patogenese, lipidoverføringsproteiner, endoglukan-1,3-β-glukosidase, glysinrike celleveggproteiner og gener fra oksygenets reaktive bane. Tidlige responser på 83A:476, inkludert nøye undertrykkelse av gener assosiert med fotosyntese, falt sammen med vellykket beskyttelse i den vegetative vekstfasen av soppbiologi, noe som tyder på at en effektor utløser immunitet. Mandeloop-reaksjonen er bremset ned, i likhet med den generelle horisontale luftmotstanden.
Smalbladet lupin (NLL, Lupinus angustifolius L.) er et proteinrikt frokostblanding som stammer fra den vestlige Middelhavsregionen1,2. Den dyrkes i dag som matvekst for dyr og mennesker. Den regnes også som grønngjødsel i vekstskiftesystemer på grunn av nitrogenfiksering av symbiotiske nitrogenfikserende bakterier og generell forbedring av jordstrukturen. NLL har gjennomgått en rask domestiseringsprosess det siste århundret og er fortsatt under høyt avlspress3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Med den utbredte dyrkingen av NLL utviklet suksesjonen av patogene sopp nye landbruksnisjer og forårsaket nye avlingsødeleggende sykdommer. Det mest bemerkelsesverdige for lupinbønder og -oppdrettere var forekomsten av antraknose, forårsaket av den patogene soppen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Det mest bemerkelsesverdige for lupinbønder og -oppdrettere var forekomsten av antraknose, forårsaket av den patogene soppen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогного LU (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Det mest bemerkelsesverdige for lupinbønder og -oppdrettere var fremveksten av antraknose forårsaket av den patogene soppen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由眀引人注目的是炭疽病的出现，它是由県它是由県(Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由眀引人注目的是炭疽病的出现，它是由県它是由県(Bondar)嵵Håret。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенты lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Det mest slående for lupinbønder og -oppdrettere er fremveksten av antraknose forårsaket av den patogene soppen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.De tidligste rapportene om sykdommen kom fra Brasil og USA, med typiske symptomer som dukket opp i henholdsvis 1912 og 1929. Etter omtrent 30 år ble imidlertid patogenet betegnet som Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf av Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld i målrettet morfologi. & H. Schrenk. & H. Schrenk.og H. Schrenk. & H.施伦克，. & H.施伦克，.og H. Schlenk.Foreløpig sykdomsfenotyping utført på midten av 1900-tallet viste noe resistens i NLL- og gul lupin (L. luteus L.)-tilvekster, men alle testede hvite lupin (L. albus L.)-tilvekster var svært mottakelige15,16. Studier har vist at utviklingen av antraknose er assosiert med økt nedbør (luftfuktighet) og temperatur (i området 12–28 °C), noe som fører til et brudd på resistensen ved høyere temperaturer17, 18. Faktisk var tiden det tok for konidier å spire og sykdommen å begynne, fire ganger kortere ved 24 °C (4 timer) enn ved 12 °C (16 timer) under forhold med høy luftfuktighet19. Dermed har den pågående globale oppvarmingen ført til spredning av antraknose. Sykdommen ble imidlertid observert i Frankrike (1982) og Ukraina (1983) som et varsel om en forestående trussel, men ble tilsynelatende ignorert av lupinindustrien på den tiden20,21. Noen år senere spredte denne ødeleggende sykdommen seg over hele verden og rammet også store lupinproduserende land som Australia, Polen og Tyskland22,23,24. Etter et antraknoseutbrudd på midten av 1990-tallet resulterte omfattende screening i identifiseringen av flere resistente donorer i NLL19-prøver. NLL-resistens mot antraknose kontrolleres av to separate dominante alleler som finnes i forskjellige kimplasmakilder: Lanr1 i kultivaren Tanjil og Wonga og AnMan i kultivaren Mandalay25,26. Disse allelene utfyller de molekylære markørene som støtter utvelgelsen av resistent kimplasma i avlsprogrammer25,26,27,28,29,30. Den resistente avlslinjen 83A:476 som bar Lanr1-allelet ble krysset med den mottakelige ville linjen P27255 for å oppnå en RIL-populasjon som segregerte for antraknose-resistens, noe som gjorde det mulig å tilordne Lanr1-lokuset til kromosom NLL-1131, 32, 33. Justering av koblingskartmarkører fra flankerende resistensloci til antraknose med et genomisk rammeverk, NLL avslørte plasseringen av alle tre alleler på samme kromosom (NLL-11), men i forskjellige posisjoner 29, 34, 35. På grunn av det lille antallet RIL-er og den store genetiske avstanden mellom markører og tilsvarende alleler, kan det imidlertid ikke trekkes pålitelige konklusjoner om deres underliggende gener. På den annen side er bruk av revers genetikk i lupiner vanskelig på grunn av deres svært lave regenereringspotensial, noe som gjør genetisk manipulasjon tungvint 37.
Utviklingen av domestisert kimplasma som bærer det ønskede allelet i homozygot tilstand, slik som 83A:476 (Lanr1) og Mandelup (AnMan), har åpnet døren for å studere antraknose-resistens i møte med tilstedeværelsen av motstridende kombinasjoner av alleler i ville populasjoner. Muligheter for molekylære mekanismer. Sammenlign forsvarsresponser generert av spesifikke genotyper. Denne studien evaluerte den tidlige transkriptomresponsen til NLL på C. lupini-vaksinasjon. Først ble et europeisk NLL-kimplasmapanel som inneholdt 215 linjer screenet ved hjelp av molekylære markører som markerer Lanr1- og AnMan-allelene. Antraknose-fenotyping ble deretter utført på 50 NLL-linjer, tidligere valgt ut for molekylære markører, under kontrollerte forhold. Basert på disse eksperimentene ble fire linjer som var forskjellige i antraknose-resistens og Lanr1/AnMan-allelsammensetning valgt ut for differensiell forsvarsgenuttrykksprofilering ved hjelp av to komplementære tilnærminger: høykapasitets RNA-sekvensering og sanntids PCR-kvantifisering.
Screening av et sett med NLL-kimplasma (N = 215) med markørene Lanr1 (Anseq3 og Anseq4) og AnMan (Anseq4) og AnMan (AnManM1) viste at bare én linje (95726, nær Salamanca-b) amplifiserer «resistens»-allelet for alle markører, mens «Tilstedeværelse av 'mottakelige' alleler» fant andelen av alle markører i 158 (~73,5 %) linjer. Tretten linjer produserte to «resistente» alleler av Lanr1-markøren, og 8 linjer produserte «resistente» alleler av Lanr1-markøren. «Resistens»-allelet til AnMan-markøren (tilleggstabell S1). To linjer var heterozygote for Anseq3-markøren og én heterozygot for AnManM1-markøren. 42 linjer (19,5 %) bar motsatte faser av Anseq3- og Anseq4-allelene, noe som indikerer en høy frekvens av rekombinasjon mellom disse to lokiene. Antraknose-fenotyper under kontrollerte forhold (tilleggstabell S2) viste variasjon i resistensen til de testede genotypene, noe som gjenspeiles i alvorlighetsgraden av antraknose. Forskjeller i gjennomsnittsskårer varierte fra 1,8 (moderat resistent) til 6,9 (mottakelig), og forskjeller i plantevekt varierte fra 0,62 (mottakelig) til 4,45 g (resistent). Det var en signifikant korrelasjon mellom verdiene observert i to replikasjoner av eksperimentet (0,51 for sykdomsgrad, P = 0,00017 og 0,61 for plantevekt, P < 0,0001) samt mellom disse to parameterne (−0,59 og −0,77, P < 0,0001). Det var en signifikant korrelasjon mellom verdiene observert i to replikasjoner av eksperimentet (0,51 for sykdomsgrad, P = 0,00017 og 0,61 for plantevekt, P < 0,0001) samt mellom disse to parameterne (−0,59 og −0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 til salgs) болезни, P = 0,00017 og 0,61 for массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59,0и <0,59,0и) 0,0001). Det ble funnet en signifikant korrelasjon mellom verdiene observert i to repetisjoner av eksperimentet (0,51 for sykdomsgrad, P = 0,00017 og 0,61 for plantevekt, P < 0,0001), samt mellom disse to parameterne (-0,59 og -0,77, P < 0,0001) .在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分1︌P. 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77。01)P在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 为庈度 诟分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之（锟 （，（，，（，，， 0,59 和–0,59 和– 0,59 和–0,77，P < 0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценколе тяжя 5, 0, 5 = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0001), og между этими двумя параметрами (-0,59 og -0,0001) 0,77, P <0,000. Det var en signifikant korrelasjon mellom verdiene observert i duplikat (sykdomsgrad 0,51, P = 0,00017 og plantevekt 0,61, P < 0,0001) og mellom disse to parameterne (-0,59 og -0,0001) 0,77, P < 0,0001. ).Typiske symptomer sett hos mottakelige planter inkluderer knekking og vridning av stilken som ligner en «gjeterbue»-struktur, etterfulgt av ovale lesjoner med oransje/rosa sporozoitter (tilleggsfigur 1). Australske aksessioner som bærer Lanr1- (83A:476 og Tanjil) og AnMan (Mandelup)-genene er moderat resistente, 0,0331 og 0,0036). Noen linjer som også bærer «resistente» Lanr1- og/eller AnMan-alleler viser symptomer på sykdommen.
Interessant nok viste noen få NLL-linjer som manglet noen «resistente» markøralleler et høyt nivå av antraknose-resistens (sammenlignbar med eller høyere enn for Lanr1- eller AnMan-genotyper), som Boregine (P-verdi < 0,0001 for begge parametere), Bojar (P-verdi < 0,0001 for poengsum og 0,001 for plantevekt) og populasjon B-549/79b (P-verdi < 0,0001 for poengsum og ikke-signifikant for vekt). Interessant nok viste noen få NLL-linjer som manglet noen «resistente» markøralleler et høyt nivå av antraknose-resistens (sammenlignbar med eller høyere enn for Lanr1- eller AnMan-genotyper), som Boregine (P-verdi < 0,0001 for begge parametere), Bojar (P-verdi < 0,0001 for poengsum og 0,001 for plantevekt) og populasjon B-549/79b (P-verdi < 0,0001 for poengsum og ikke-signifikant for vekt). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, покасусали вы устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 eller AnMan), таких или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (siden <0,000 p. параметров), Bojar (nedsatt P < 0,0001 for оценки и 0,001 для массы растения) og популяции B-549/79b (tidlig P <0,0001 for оценки и незначимо для массы). Interessant nok viste flere NLL-linjer som manglet noen «resistente» markøralleler et høyt nivå av resistens mot antraknose (sammenlignbar med eller høyere enn for Lanr1- eller AnMan-genotyper), som Boregine (P-verdi < 0,0001 for begge parametere), Bojar (P-verdi < 0,0001 for evaluering og 0,001 for plantevekt) og populasjon B-549/79b (P-verdi < 0,0001 for evaluering og ikke signifikant for vekt).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炩r1或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分为0,0001，植物重量为0,001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，逍昍昂一，重量 Det er interessant at noen NLL-systemer som ikke har noen «antigeniske» markører viser høy horisontal resistens (tilsvarende Lanr1- eller AnMan-gener eller høyere), slik som Boregine (begge parametere P < 0,0001), Bojar (P-verdi < 0,0001, plantevekt 0,001) og stamme B-549/79b (P-verdi < 0,0001, vekt ikke signifikant). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», покасазаливи устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P обоих,00рпаов), (nedsatt P <0,0001, maks. 0,001) og forbruk B-549/79b (P-verdi <0,0001, масса незначительна). Interessant nok viste noen NLL-linjer som manglet noen «resistens»-markøralleler høye nivåer av antraknose-resistens (sammenlignbar med eller høyere enn Lanr1- eller AnMan-genotyper), som Boregine (P-verdi for begge parametere <0,0001), Bojar (P-verdi < 0,0001, plantevekt 0,001) og populasjon B-549/79b (P-verdi < 0,0001, vekt ikke signifikant).Dette fenomenet antyder muligheten for en ny genetisk kilde til resistens, noe som forklarer den observerte mangelen på korrelasjon mellom markørgenotyper og sykdomsfenotyper (P-verdier fra ~0,42 til ~0,98). Kolmogorov-Smirnov-testen viste dermed at dataene om antraknose-resistens var omtrent normalfordelt for poengsummer (P-verdier 0,25 og 0,11) og plantemasse (P-verdier 0,47 og 0,55), noe som tyder på at jeg antar at flere alleler enn Lanr1 og AnMan er involvert.
Basert på resultatene av screening for antraknose-resistens ble fire linjer valgt ut for transkriptomanalyse: 83A:476, Boregine, Mandelup og populasjon 22660. Disse linjene ble testet på nytt for miltbrannresistens i inokuleringseksperimenter ved hjelp av RNA-sekvensering, forutsatt at de var de samme som i forrige test. Poengverdiene var som følger: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) og populasjon 22660 (6,11 ± 1,29).
Illumina NovaSeq 6000-protokollen oppnådde et gjennomsnitt på 40,5 Mread-par per prøve (29,7 til 54,4 Mreads) (tilleggstabell S3). Justeringspoengsummene i referansesekvensen varierte fra 75,5 % til 88,6 %. Den gjennomsnittlige korrelasjonen av leseantallsdata mellom eksperimentelle varianter mellom biologiske replikater varierte fra 0,812 til 0,997 (gjennomsnitt 0,959). Av de 35 170 genene som ble analysert, viste 2917 ingen uttrykk, og de andre 4785 genene ble uttrykt på et ubetydelig nivå (basisgjennomsnitt < 5). Av de 35 170 genene som ble analysert, viste 2917 ingen uttrykk, og de andre 4785 genene ble uttrykt på et ubetydelig nivå (basisgjennomsnitt < 5). Fra 35 170 millioner kroner 2917 ingen forbrukspriser, og 4785 millioner kroner. уровне (базовое среднее <5). Av de 35 170 genene som ble analysert, viste 2917 ingen uttrykk, og de resterende 4785 genene ble uttrykt på et ubetydelig nivå (basisgjennomsnitt <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）.35 170 Fra 35 170 millioner kroner 2917 ikke mer enn 4785 millioner kroner ( среднее значение <5). Av de 35 170 genene som ble analysert, ble 2917 ikke uttrykt, og de resterende 4785 genene hadde ubetydelig uttrykk (basisgjennomsnitt <5).Dermed var antallet gener som ble ansett som uttrykt (basisgjennomsnitt ≥ 5) under eksperimentet 27 468 (78,1 %) (tilleggstabell S4).
Fra første tidspunkt responderte alle NLL-linjene på inokuleringen av C. lupini (stamme Col-08) ved å reprogrammere transkriptomet (tabell 1). Det ble imidlertid observert signifikante forskjeller mellom linjene. Dermed viste resistenslinjen 83A:476 (som bærer Lanr1-genet) signifikant transkriptomreprogrammering ved første tidspunkt (6 hpi) med en 31–69 ganger økning i antall isolerte opp- og nedgener sammenlignet med andre tidspunkter på dette tidspunktet. I tillegg var denne toppen kortvarig, ettersom uttrykket av bare noen få gener forble signifikant endret ved det andre tidspunktet (12 hpi). Interessant nok gjennomgikk ikke Boregine, som også viste et høyt nivå av resistens i grafttesten, en så massiv transkripsjonell reprogrammering under eksperimentet. Imidlertid var antallet differensielt uttrykte gener (DEG) det samme for Boregine og 83A:476 ved 12 hpi. Både Mandelup og populasjon 22660 viste DEG-topper ved siste tidspunkt (48 l/s), noe som indikerer en relativ forsinkelse i forsvarsresponsene.
Fordi 83A:476 gjennomgikk massiv transkriptom-reprogrammering som respons på C. lupini ved 6 HPI sammenlignet med alle andre linjer, var ~91 % av DEG-ene som ble observert på dette tidspunktet avstamningsspesifikke (fig. 1). Det var imidlertid en viss overlapping i tidlige responser mellom studielinjene, ettersom 68,5 %, 50,9 % og 52,6 % DEG i henholdsvis Boregine, Mandelup og populasjon 22660 overlappet med de som ble funnet i 83A:476 på bestemte tidspunkter. Imidlertid utgjorde disse DEG-ene bare en liten andel (0,97–1,70 %) av alle DEG-er som for øyeblikket oppdages ved bruk av 83A:476. I tillegg var 11 DEG-er fra alle linjene koherente på dette tidspunktet (tilleggstabeller S4-S6), inkludert felles komponenter i planteforsvarsresponser: lipidoverføringsprotein (TanjilG_32225), endoglukan-1,3-β-glukosidenzym (TanjilG_23384), to stressinduserbare proteiner som SAM22 (TanjilG_31528 og TanjilG_31531), basisk lateksprotein (TanjilG_32352) og to glysinrike strukturelle celleveggproteiner (TanjilG_19701 og TanjilG_19702). Det var også en relativt høy overlapping i transkriptomresponser mellom 83A:476 og Boregine ved 24 HPI (totalt 16-38 % DEG) og mellom Mandelup og populasjon 22660 ved 48 HPI (totalt 14-20 % DEG).
Venn-diagram som viser antall differensielt uttrykte gener (DEG) i smalbladet lupin (NLL)-linjer inokulert med Colletotrichum lupini (stamme Col-08 hentet fra lupinfelt i Wierzhenice, Polen, 1999). NLL-linjene som ble analysert var: 83A:476 (resistent, bærer Lanr1-allelet), Boregine (resistent, genetisk bakgrunn ukjent), Mandelup (moderat resistent, bærer AnMan-allelet) og populasjon 22660 (svært mottakelig). Forkortelsen hpi står for timer etter vaksinasjon. Nullverdier er fjernet for å forenkle grafen.
Settet med overuttrykte gener ved 6 hpi ble analysert for tilstedeværelse av kanoniske R-gendomener (tilleggstabell S7). Denne studien avdekket transkriptominduksjon av klassiske sykdomsresistensgener med NBS-LRR-domener kun ved 83A:476. Dette settet besto av ett TIR-NBS-LRR-gen (tanjilg_05042), fem CC-NBS-LRR-gener (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 og tanjilg_16162), og fire NBS-LR, Tanjilg_16162), og fire NBS-LRRE (tanjilg_16162) samt fire NBS-Lrr (tanjilg_16162) og fire NBS-LRR (TANJILG_16162). Alle disse genene har kanoniske domener arrangert i konserverte sekvenser. I tillegg til NBS-LRR-domenegenene ble flere RLL-kinaser aktivert ved 6 hpi, nemlig én i Boregine (TanjilG_19877), to i Mandelup (TanjilG_07141 og TanjilG_19877) og i populasjon 22660 (TanjilG_09014 og TanjilG_10361) og to i 83A 27:476.
Gener med betydelig endret uttrykk som respons på inokulering med C. lupini (stamme Col-08) ble utsatt for Gene Ontology (GO) berikelsesanalyse (tilleggstabell S8). Den oftest overrepresenterte biologiske prosesstermen var «GO:0006952 defense response», som forekom i 6 av 16 (tid × linje) kombinasjoner med høy signifikans (P-verdi < 0,001) (fig. 2). Den oftest overrepresenterte biologiske prosesstermen var «GO:0006952 defense response», som forekom i 6 av 16 (tid × linje) kombinasjoner med høy signifikans (P-verdi < 0,001) (fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитнеты», отвор появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (nedsatt P <0,001) (r. 2). Den oftest overrepresenterte biologiske prosesstermen var 'GO:0006952 defense response', som forekom i 6 av 16 (tid × avstamning) kombinasjoner med høy signifikans (P-verdi < 0,001) (fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）. Det mest representative biologiske prosessuttrykket er «GO:0006952 defense response», som forekommer i 6 av de 16 (时间×线) kombinasjonene, med høy signifikans (P-verdi < 0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», колсторвыв 16 av 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Den oftest overrepresenterte biologiske prosesstermen var 'GO:0006952 Defense Response', som forekom i 6 av 16 kombinasjoner (tid × linje) med høy signifikans (P-verdi < 0,001) (fig. 2).Denne termen var overrepresentert på to tidspunkter i 83A: 476 og Boregine (6 og 24 hpi) og på ett tidspunkt i Mandelup og populasjon 22660 (henholdsvis 12 og 6 hpi). Dette er et forventet resultat, som fremhever den soppdrepende responsen til de resistente linjene. I tillegg responderte 83A:476 på C. lupini ved raskt å indusere gener relatert til det oksidative utbruddet representert av termen «GO:0055114 redoksprosess», som indikerer en spesifikk forsvarsrespons, mens Boregine viste spesifikke forsvarsresponser relatert til termen «GO». :0006950 Stressrespons”. Populasjon 22660 aktiverte den horisontale motstandsresponsen som involverte sekundære metabolitter, noe som fremhever det overdrevne antallet termer «GO:0016104 Prosess for triterpenbiosyntese» og «GO:0006722 Prosess for triterpenmetabolisme» (begge termer tilhører samme sett med gener). Tatt i betraktning resultatene av GO-termanrikingsanalysen, var Mandelup-reaksjonens stabilitet mellom Boregine og populasjon 22660. I tillegg inkluderer tidlig reaksjon 83A:476 (6 hpi) og forsinket reaksjon Mandelup og populasjon 22660 termen GO:0015979 'fotosyntese' og andre relaterte biologiske prosesser.
Bioprosessgenontologitermene som ble valgt i annotasjonen av differensielt uttrykte gener under transkriptomresponser hos smalbladet lupin (NLL) inokulert med miltbrannlupin (Col-08-stamme hentet fra lupinfelt i Wierzhenice, Polen, i 1999) er sterkt overdrevet. NLL-linjene som ble analysert var: 83A:476 (resistent, bærer det homozygote Lanr1-allelet), Boregine (resistent, ukjent genetisk bakgrunn), Mandelup (moderat resistent, bærer det homozygote AnMan-allelet) og populasjon 22660 (mottakelig).
Fordi denne studien hadde som mål å identifisere gener som bidrar til antraknose-resistens, ble genene tilordnet termene GO «GO: 0006952 Defensive responses» og «GO: 0055114 Redox processes» analysert med grenseverdier siden baseline-gjennomsnitt ≥ 30 med minst én linje × tidspunkt som kombinerer statistisk signifikante verdier av log2 (fold change). Antall gener som oppfylte disse kriteriene var 65 for GO:0006952 og 524 for GO:0055114.
83A:476 avdekket to DEG-topper merket med begrepet GO:0006952, den første ved 6 gener per tomme (64 gener, opp- og nedregulering) og den andre ved 24 gener per tomme (15 gener, kun oppregulering). Boregine viste også at GO:0006952 nådde toppen på samme tidspunkt, men med mindre DEG (11 og 8) og preferensiell aktivering. Mandeloop viste to topper av GO:0006952 ved 12 og 48 HPI, begge med 12 gener (den første med aktiverende gener, og den andre med kun undertrykkende gener), mens 22660-populasjonen ved 6 HPI (13 gener) hadde en større overvekt av økningstoppregulering. Det bør bemerkes at 96,4 % av GO:0006952 DEG i disse toppene hadde samme type respons (opp eller ned), noe som indikerer en betydelig overlapping i forsvarsresponser til tross for forskjeller i antall gener involvert. Den største gruppen av sekvenser relatert til termen GO:0006952 koder for Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-lignende), som tilhører klasse 10 patogenese-assosiert protein (PR-10) proteinklade og kjerneproteinlateksen. lignende (MLP-lignende) protein) protein (fig. 3). De to gruppene skilte seg i uttrykkets natur og responsretningen. Genene som koder for SAM22-lignende proteiner viste konsistent og signifikant induksjon ved tidlige tidspunkter (6 eller 12 hpi) og var generelt ikke-responsive ved slutten av eksperimentet (48 hpi), mens MLP-lignende proteiner viste koordinasjon ved 6 hpi. hpi. 83A:476 og Mandelup ved 48 hp/in, var nesten alle andre datapunkter ikke-responsive. I tillegg fulgte forskjeller i uttrykkprofiler av SAM22-lignende proteingener observert variasjon i antraknose-resistens, ettersom mer resistente linjer hadde flere tidspunkter som signifikant induserte disse genene enn mer mottakelige gener. Et annet LlR18A/B-lignende PR-10-gen viste et veldig likt uttrykksmønster som det SAM22-lignende proteingenet.
Hovedkomponentene i den biologiske prosessbetegnelsen «GO:0006952 Defense Response» og uttrykksmønstrene til kandidatgener for Lanr1- og AnMan-allelene ble identifisert. Log2-skalaen representerer log2-verdier (fold endring) mellom inokulerte (Colletotrichum lupini, stamme Col-08, hentet fra lupinfelt, Wizhenica, Polen, 1999) og kontrollplanter (sham-inokulerte) på samme tidspunkt. Følgende smalbladede lupinlinjer ble analysert: 83A:476 (resistent, bærer det homozygote Lanr1-allelet), Boregine (resistent, genetisk bakgrunn ukjent), Mandelup (moderat resistent, bærer det homozygote AnMan-allelet) og populasjon 22660 (mottakelig).
I tillegg ble uttrykkprofilene til RNA-sekvenseringskandidatgenene Lanr1 (TanjilG_05042) og AnMan (TanjilG_12861) evaluert (fig. 3). TanjilG_05042-genet viste en signifikant respons (aktivering) ved 83A:476 bare ved første tidspunkt (6 hpi), mens TanjilG_12861 var signifikant i Mandeloop bare ved to tidspunkter: 6 hpi (nedregulering) og 24 hpi (6 hpi). Med.). justerbar) ).
De mest overuttrykte genene i termen GO:0055114 «redoksprosess» var gener som koder for cytokrom P450-proteiner og peroksidase (fig. 4). For prøver isolert fra 83A:476 ved 6 HPI ble det generelt observert maksimale eller minimale log2-verdier (fold endring) (for 86,6 % av genene) mellom inokulerte planter og kontrollplanter, noe som fremhever den høye responsen til denne genotypen på inokulert kjønn. 83A:476 viste den mest signifikante GO:0055114 DEG ved 6 hpi (503 gener), mens resten av linjene viste den mest signifikante ved 48 hpi (Boregine, 31 gener; Mandelup, 85 gener; og Populasjon 22660, 78 gener). I de fleste genene i GO:0055114-familien ble det observert to typer responser på vaksinasjon (aktivering og inhibering). Interessant nok ble opptil 97,6 % av DEG-ene identifisert for termen GO: 0055114 i Mandelupe ved 48 hp. Disse observasjonene tyder på at, til tross for den betydelig mindre skalaen (dvs. antall muterte redoksgener, 85 versus 503), er mønsteret av forsinkede transkriptomresponser hos mandeloup på antraknose likt den tidlige responsen hos 83A:476. I Boregine og populasjon 22660 er denne konvergensen lavere, henholdsvis 51,6 % og 75,6 %.
Ekspresjonsmønstrene til hovedkomponentene i begrepet i den biologiske prosessen «GO:0055114 Redox-prosessen» ble avslørt. Log2-skalaen representerer log2-verdier (fold endring) mellom inokulerte (Colletotrichum lupini, stamme Col-08, hentet fra lupinfelt, Wizhenica, Polen, 1999) og kontrollplanter (sham-inokulerte) på samme tidspunkt. Følgende smalbladede lupinlinjer ble analysert: 83A:476 (resistent, bærer det homozygote Lanr1-allelet), Boregine (resistent, genetisk bakgrunn ukjent), Mandelup (moderat resistent, bærer det homozygote AnMan-allelet) og populasjon 22660 (mottakelig).
83A:476 Transkriptomiske responser på inokulering med C. lupini (stamme Col-08) inkluderte også koordinert silencing av gener tilskrevet termen GO:0015979 «fotosyntese» og andre relaterte biologiske prosesser (FIG. 5). Dette GO:0015979 DEG-settet inneholdt 105 gener som var signifikant undertrykt ved 6 hpi ved 83A:476. I denne undergruppen var 37 gener også nedregulert i Mandelup ved 48 HPI og 35 på samme tidspunkt i 22660-populasjonen, inkludert 19 DEG-er som er felles for begge genotypene. Ingen DEG-er relatert til termen GO: 0015979 ble signifikant aktivert i noen kombinasjon (linje x tid).
Ekspresjonsmønstrene til hovedkomponentene i begrepet for den biologiske prosessen «GO:0015979 Fotosyntese» ble avslørt. Log2-skalaen representerer log2-verdier (fold endring) mellom inokulerte (Colletotrichum lupini, stamme Col-08, hentet fra lupinfelt, Wizhenica, Polen, 1999) og kontrollplanter (sham-inokulerte) på samme tidspunkt. Følgende smalbladede lupinlinjer ble analysert: 83A:476 (resistent, bærer det homozygote Lanr1-allelet), Boregine (resistent, genetisk bakgrunn ukjent), Mandelup (moderat resistent, bærer det homozygote AnMan-allelet) og populasjon 22660 (mottakelig).
Basert på resultatene fra differensiell ekspresjonsanalyse og antagelig involvert i forsvarsresponser mot patogene sopp, ble dette settet med syv gener valgt for kvantifisering av ekspresjonsprofiler ved hjelp av sanntids-PCR (tilleggstabell S9).
Det antatte proteingenet TanjilG_10657 ble signifikant indusert i alle studerte linjer og tidspunkter sammenlignet med kontrollplanter (etterligningsplanter) (tilleggstabeller S10, S11). I tillegg viste ekspresjonsprofilen til TanjilG_10657 en økende trend i løpet av eksperimentet for alle linjer. Populasjon 22660 viste den høyeste følsomheten til TanjilG_10657 for inokulering med 114 ganger aktivering og det høyeste relative ekspresjonsnivået (4,4 ± 0,4) ved 24 HPI (fig. 6a). PR10 LlR18A-proteingenet TanjilG_27015 viste også aktivering på tvers av alle linjer og tidspunkter, med statistisk signifikans ved de fleste datapunkter (fig. 6b). I likhet med TanjilG_10657 ble det høyeste relative ekspresjonsnivået til TanjilG_27015 observert i den 22660 inokulerte populasjonen ved 24 HPI (19,5 ± 2,4). Surendokitinasegenet TanjilG_04706 var signifikant oppregulert i alle linjer og på alle tidspunkter unntatt Boregine 6 hpi (fig. 6c). Det ble sterkt indusert ved første tidspunkt (6 HPI) ved 83A:476 (med 10,5 ganger) og moderat økt i andre linjer (med 6,6–7,5 ganger). Under eksperimentet forble uttrykket av TanjilG_04706 på lignende nivåer i 83A:476 og Boregine, mens det i Mandelup og populasjon 22660 økte signifikant og nådde relativt høye verdier (henholdsvis 5,9 ± 1,5 og 6,2 ± 1,5). Det endoglukan-1,3-β-glukosidaselignende genet TanjilG_23384 viste høy aktivering ved de to første tidspunktene (6 og 12 hpi) i alle linjer unntatt populasjon 22660 (fig. 6d). De høyeste relative ekspresjonsnivåene av TanjilG_23384 ble observert ved det andre tidspunktet (12 hpi) i Mandelup (2,7 ± 0,3) og 83A:476 (1,5 ± 0,1). Ved 24 HPI var TanjilG_23384-ekspresjonen relativt lav i alle studerte linjer (fra 0,04 ± 0,009 til 0,44 ± 0,12).
Ekspresjonsprofiler av utvalgte gener (ag) avslørt ved kvantitativ PCR. Tallene 6, 12 og 24 representerer timer etter vaksinasjon. LanDExH7- og LanTUB6-genene ble brukt til normalisering, og LanTUB6 ble brukt til kalibrering mellom serier. Feilfeltene representerer standardavviket basert på tre biologiske replikater, som hver er gjennomsnittet av tre tekniske replikater. Den statistiske signifikansen av forskjeller i uttrykknivåene mellom de inokulerte plantene (Colletotrichum lupini, stamme Col-08, oppnådd i 1999 fra lupinåkeren i Wierzenica, Polen) og kontrollplantene (prøveinokulerte) er markert over datapunktene (*P-verdi < 0,05, **P-verdi ≤ 0,01, ***P-verdi ≤ 0,001). Den statistiske signifikansen av forskjeller i uttrykknivåene mellom de inokulerte plantene (Colletotrichum lupini, stamme Col-08, oppnådd i 1999 fra lupinåkeren i Wierzenica, Polen) og kontrollplantene (prøveinokulerte) er markert over datapunktene (*P-verdi < 0,05, **P-verdi ≤ 0,01, ***P-verdi ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08. september 9. september. поля люпина в Верженице, Польша) og контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена надих точе 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Statistisk signifikante forskjeller i uttrykknivåer mellom inokulerte (Colletotrichum lupini, stamme Col-08, oppnådd i 1999 fra et lupinfelt i Wierzhenice, Polen) og kontrollplanter (sham-inokulerte) er notert over datapunktene (*P-verdi < 0,05, **P-verdi ≤ 0,01, ***P-verdi ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在繰标记在繰捈0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 撌 鯹煤照 缈水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤01)。0. Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, пый люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отметными (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Statistisk signifikante forskjeller i uttrykknivåer mellom inokulerte (Colletotrichum lupini, stamme Col-08, hentet fra lupinåkre i Verzhenice, Polen, i 1999) og kontrollplanter (sham-inokulerte) er notert over datapunktene (*P-verdi < 0,05, **P-verdi ≤ 0,01, ***P-verdi ≤ 0,001).NLL-linjene som ble analysert var: 83A:476 (resistent, bærer det homozygote Lanr1-allelet), Mandelup (moderat resistent, bærer det homozygote AnMan-allelet), Boregine (resistent, ukjent genetisk bakgrunn) og populasjon 22660 (mottakelig).
Kandidatgenet TanjilG_05042 ved Lanr1-lokuset viste et markant forskjellig uttrykksmønster fra profilene som ble oppnådd fra RNA-sekvenseringsstudier (fig. 6e). Signifikant aktivering av dette genet ble observert i Mandelup og 22660-populasjonen (opptil henholdsvis 39,7 og 11,7 ganger), noe som resulterte i relativt høye uttrykksnivåer (opptil henholdsvis 1,4 ± 0,14 og 7,2 ± 1,3). 83A:476 avdekket også en viss oppregulering av TanjilG_05042-genet (opptil 3,8 ganger). De relative oppnådde uttrykksnivåene (0,044 ± 0,002) var imidlertid mer enn 30 ganger lavere enn de som ble observert i Mandelup og 22660-populasjonen. Analysert med qPCR viste signifikante forskjeller i uttrykknivåer mellom genotyper i mock-vaksinerte (kontroll) varianter, og nådde en 58-ganger forskjell mellom populasjonene 22660 og 83A:476, samt mellom populasjonene 22660 og 22660. En todelt forskjell ble oppnådd mellom Boregine og Mandalup.
Kandidatgenet ved AnMan-locuset, TanjilG_12861, ble aktivert som respons på vaksinasjon i 83A:476 og Mandelup, var nøytralt i 22660-populasjonen og var nedregulert i Boregine (fig. 6f). Den relative ekspresjonen av TanjilG_12861-genet var høyest i inokulert 83A:476 (0,14 ± 0,01). 17,4 kDa klasse I varmesjokkproteingenet TanjilG_05080 HSP17.4 viste lavere relative ekspresjonsnivåer i alle studerte stammer og tidspunkter (fig. 6g). Den høyeste verdien ble observert ved 24 HPI i 22660-populasjonen (0,14 ± 0,02, en åtte ganger økning som respons på vaksinasjon).
Sammenligning av genuttrykksprofiler (fig. 7) viste en høy korrelasjon mellom TanjilG_10657 og fire andre gener: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) og TanjilG_04706 (r = 0,79). Slike resultater kan indikere samregulering av disse genene under forsvarsresponser. TanjilG_12861- og TanjilG_23384-genene viste forskjellige uttrykksprofiler med lavere Pearson-korrelasjonskoeffisientverdier (fra henholdsvis 0,08 til 0,43 og -0,19 til 0,28) sammenlignet med andre gener.
Korrelasjoner mellom genuttrykksprofiler ble detektert ved hjelp av kvantitativ PCR. Følgende smalbladede lupinlinjer ble analysert: 83A:476 (resistent, bærer det homozygote Lanr1-allelet), Mandelup (moderat resistent, bærer det homozygote AnMan-allelet), Boregine (resistent, genetisk bakgrunn ukjent) og populasjon 22660 (mottakelig). Tre tidspunkter ble beregnet (6, 12 og 24 timer etter inokulering), inkludert inokulerte (Colletotrichum lupini, stamme Col-08, hentet fra lupinfelt i Wierzhenice, Polen, i 1999) og kontrollplanter (sham-inokulerte). Skalaen viser verdien av Pearson-korrelasjonskoeffisienten.
Basert på data innhentet ved 6 hestekrefter per tomme, ble WGCNA utført på 9981 DEG identifisert ved å sammenligne inokulerte og kontrollplanter for å fokusere på tidlige forsvarsresponser (Tilleggstabell S12). 22 genmoduler (klynger) ble funnet med korrelerte (positive eller negative) uttrykkprofiler mellom genotyper og eksperimentelle varianter. I gjennomsnitt var genuttrykksnivåene synkende i rekkefølge 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasjon 22660 (i begge variantene var imidlertid denne trenden sterkere i kontrollplanter). I gjennomsnitt var genuttrykksnivåene synkende i rekkefølge 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasjon 22660 (i begge variantene var imidlertid denne trenden sterkere i kontrollplanter). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Befolkning 22660 (в обоих вариантах, вариантах тенденция была сильнее у контрольных растений). I gjennomsnitt sank genuttrykksnivåene i størrelsesorden 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasjon 22660 (i begge variantene var imidlertid denne trenden sterkere i kontrollplanter).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Befolkning 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> befolkning 22660 的 顺序 下降 （， 県 噿在 在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。…… В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Befolkning 22660 была сильнее у контрольных растений). I gjennomsnitt sank genuttrykksnivåene i serien 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasjon 22660 (i begge variantene var imidlertid denne trenden sterkere i kontrollplanter).Vaksinasjon resulterte i oppregulering av genuttrykk, spesielt i modulene 18, 19, 14, 6 og 1 (i synkende rekkefølge etter effekt), negativ regulering (f.eks. modulene 9 og 20) eller med nøytrale effekter (f.eks. modulene 11, 22, 8 og 13). GO-termanrikingsanalyse (tilleggstabell S13) avdekket «GO: 0006952 Protective responses» for den inokulerte modulen (18) med maksimal aktivering, inkludert gener analysert med qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 og TanjilG_27015), samt mange av de mest undertrykte fotosyntesemodulene fra Inokulat (9). Modul 18-konsentratoren (fig. 8) ble identifisert som TanjilG_26536-genet som koder for det PR-10-lignende LlR18B-proteinet, og modul 9-konsentratoren ble identifisert som TanjilG_28955-genet som koder for fotosystem II PsbQ-proteinet. Et kandidat-antraknose-resistensgen Lanr1, TanjilG_05042, ble funnet i modul 22 (fig. 9) og er assosiert med begrepene «GO:0044260 Cellular macromolecular metabolic processes» og «GO:0006355 Transcriptional regulation, DNA templating» som bærer TanjilG_01212-huben. Genet koder for varmestress-transkripsjonsfaktor A-4a (HSFA4a).
Vektet nettverksanalyse av gen-koekspresjon av moduler med overrepresenterte biologiske prosesstermer «GO: 0006952 Forsvarsresponser». Ligering ble forenklet for å fremheve de fire genene som ble analysert med qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 og TanjilG_27015).
Vektet nettverksanalyse av gen-koekspresjon av en modul med en overrepresentert biologisk prosessterm «GO: 0006355: Transkripsjonsregulering, DNA-templering» og som bærer et kandidat-antraknose-resistensgen Lanr1 TanjilG_05042. Ligeringen ble forenklet for å isolere TanjilG_05042-genet og det sentrale TanjilG_01212-genet.
Screening for antraknose-resistens samlet inn i Australia viste at de fleste av de tidlig utgitte kultivarene var mottakelige; Kalya, Coromup og Mandelup har blitt beskrevet som moderat resistente, mens Wonga, Tanjil og 83A:476 har blitt beskrevet som svært resistente26,27,31. hadde samme resistensallel, betegnet Lanr1, og Coromup og Mandelup hadde et annet allel, betegnet AnMan10,26,39, mens Kalya videreførte et annet allel, Lanr2. Screening for antraknose-resistens i Tyskland resulterte i identifiseringen av en resistent linje Bo7212 med et annet kandidatallel enn Lanr1, betegnet LanrBo36.
Studien vår viste en svært lav frekvens (omtrent 6 %) av Lanr1-allelet i den testede kimplasmaen. Denne observasjonen er i samsvar med resultatene av screening av østeuropeisk kimplasma ved bruk av markørene Anseq3 og Anseq4, som viste at Lanr1-allelet bare er tilstede i to hviterussiske linjer. Dette tyder på at Lanr1-allelet ennå ikke er mye brukt av lokale avlsprogrammer, i motsetning til i Australia, hvor det er en av nøkkelallelene for markørassistert avl. Dette kan skyldes det lavere nivået av resistens som Lanr1-allelet gir under europeiske feltforhold sammenlignet med den australske rapporten. I tillegg har studier av antraknose i områder med mye nedbør i Australia vist at resistensresponser mediert av Lanr1-allelet kanskje ikke er effektive under værforhold som favoriserer vekst og rask utvikling av patogenet19,42. Faktisk ble det i den foreliggende studien også observert noen symptomer på antraknose i genotyper som bærer Lanr1-allelet, noe som tyder på at resistens kan forsvinne under optimale forhold for utviklingen av C. lupini. I tillegg er falskt positive tolkninger av tilstedeværelsen av Anseq3- og Anseq4-markørene, som er omtrent 1 cM fra Lanr1-lokuset, mulige 28,30,43.
Studien vår viste at 83A:476, som bar Lanr1-allelet, responderte på C. lupini-inokulering med storskala transkriptomprogrammering ved det første analyserte tidspunktet (6 hpi), mens transkriptomiske responser ble observert mye senere i Mandelup, som bar AnMan-allelet (fra 24 til 48 hpi). Disse tidsmessige variasjonene i forsvarsresponser er assosiert med forskjeller i sykdomssymptomer, noe som understreker viktigheten av tidlig patogengjenkjenning for en vellykket respons på resistens. For å infisere plantevev må miltbrannsporer gå gjennom flere utviklingsstadier på vertsoverflaten, inkludert spiring, celledeling og dannelse av et appressorium. Et vedheng er en infeksiøs struktur som fester seg til vertsoverflaten og letter penetrering inn i vertsvevet. Dermed viste sporer av C. gloeosporioides i erteekstrakt den første delingen av kjernen etter 75–90 minutters inkubasjon, dannelsen av et kimrør etter 90–120 minutter og undertrykkelse etter 4 timer. Mango C. gloeosporioides viste mer enn 40 % konidial spiring etter 3 timers inkubasjon og omtrent 20 % dannelse av appressorer etter 4 timer. Det virulensassosierte CAP20-genet til C. gloeosporioides viste transkripsjonsaktivitet i epifyttdannende konidier etter 3,5 timers inkubasjon i avokadooverflatevoks med høye konsentrasjoner av CAP20-protein etter 4 timer og 46 minutter. Tilsvarende ble aktiviteten til melaninbiosyntesegener i C. trifolii indusert i løpet av en 2-timers inkubasjon etterfulgt av dannelse av et appressorium etter 1 time. Studier av bladvev har vist at jordbær inokulert med C. acutatum har første undertrykkelse ved 8 timer per dag, mens tomater inokulert med C. coccodes har første undertrykkelse ved 4 timer per dag48,49. Dette er i stor grad i samsvar med tidsskalaen for Colletotrichum spp.s infeksjonsprosess. Raske forsvarsresponser på 83A:476 antyder involvering av planteresistens og effektorutløst immunitet (ETI)-gener i denne linjen, mens Mandelups forsinkede responser støtter hypotesen om mikroassosiert molekylær mønsterutløst immunitet (MTI) 50. Tidlige responser på 83A:476 og Mandelup. Den delvise overlappingen mellom opp- eller nedregulerte gener i forsinket respons støtter også dette konseptet, ettersom ETI ofte anses å være en akselerert og forbedret MTI-respons som kulminerer i programmert celledød på infeksjonsstedet, kjent som anafylaktisk sjokk 51,52.
De fleste genene som tilskrives det overrepresenterte begrepet Gene Ontology GO:0006952 «Defense Response» er de 11 homologene til det stressinduserte fastemeldingsproteinet 22 (ligner på SAM22) og de syv store lateksproteinlignende proteinene (MLP-er). -lignende proteiner 31, 34, 43 og 423 viste sekvenslikhet. SAM22-lignende gener viste signifikant aktivering som varte lenger, og viste økte nivåer av antraknose-resistens (83A:476 og Boregine). MLP-lignende gener var imidlertid bare nedregulert i linjer som bar kandidatresistensallelet (83A:476/Lanr1 ved 6 hpi og Mandelup/AnMan ved 24 hpi). Det bør bemerkes at alle identifiserte SAM22-lignende homologer stammer fra en genklynge som strekker seg over omtrent 105 kb, mens MLP-lignende gener stammer fra separate regioner av genomet. Koordinert aktivering av slike SAM22-lignende gener ble også funnet i vår tidligere studie av NLL-resistens mot Diaporthetoxica-inokulering, noe som tyder på at de er involvert i de horisontale komponentene i forsvarsresponsen. Denne konklusjonen støttes også av rapporter om en positiv respons av SAM22-lignende gener på skade eller behandling med salisylsyre, soppinduserende midler eller hydrogenperoksid.
MLP-lignende gener har vist seg å respondere på ulike abiotiske og biotiske stressfaktorer, inkludert bakterielle, virale og patogene soppinfeksjoner hos mange plantearter55. Reaksjonsretningene på visse interaksjoner mellom planter og patogener varierte fra sterkt økende (dvs. under angrep av bomull med Verticillium dahliae) til betydelig avtagende (dvs. etter infeksjon av epletre med Alternaria spp.)56,57. Signifikant nedregulering av det MLP-lignende 423-genet har blitt observert under avokadoforsvar mot F. niger-infeksjon og under infeksjon av epletreet Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola og Alternaria alternata er eplepatotyper58,59. I tillegg hadde eplekalli som overuttrykte det MLP-lignende 423-genet lavere uttrykk av resistensassosierte gener og var mer utsatt for soppinfeksjon59. Etter Fusarium oxysporum f ble det MLP-lignende 423-genet også undertrykt i resistent vanlig bønne-kimplasma. cn. Bønneinfeksjon 60.
Andre medlemmer av PR-10-familien som ble identifisert i vår RNA-sekvenseringsstudie var LlR18A- og LlR18B-genene som respons på oppregulering, samt det oppregulerte (1 gen) eller nedregulerte (3 gener) genet for lipidoverføringsproteinet DIR1. I tillegg fremhever WGCNA LlR18B-genet som et knutepunkt i denne modulen, som er svært mottakelig for vaksinasjon og bærer flere beskyttende responsgener. LlR18A- og LlR18B-genene ble indusert i gule lupinblader som respons på patogene bakterier, samt i NLL-stilker etter D. toxica-inokulering, mens rishomologen til disse genene, RSOsPR10, raskt ble indusert av en soppinfeksjon antagelig involvert i jasmonsyresignalveien 53,61, 62. DIR1-genet koder for uspesifikke lipidtransportproteiner som er nødvendige for starten av systemisk ervervet resistens (SAR). Med utviklingen av beskyttende reaksjoner transporteres DIR1-proteinet fra infeksjonsfokuset gjennom floemet for å indusere SAR i fjerne organer. Interessant nok ble TanjilG_02313 DIR1-genet signifikant indusert ved første tidspunkt i linje 84A:476 og populasjon 22660, men antraknose-resistens utviklet seg kun vellykket i linje 84A:476. Dette kan indikere en viss subfunksjonalisering av DIR1-genet i NLL, siden de resterende tre homologene bare responderte på inokulering i 83A:476-linjen ved 6 hpi, og denne responsen var rettet nedover.
I vår studie var de vanligste komponentene som korresponderer med den biologiske prosessen kalt «GO:0055114 Redox-prosessen» cytokrom P450-protein, peroksidase, linolsyre 9S-/13S-lipoksygenase og 1-aminocyklopropan-1-karboksylsyreoksidase. I tillegg definerer vår WGCNA HSFA4a-homologen som et knutepunkt som bærer moduler som Lanr1-resistensgenkandidaten TanjilG_05042. HSFA4a er en komponent i den redoksavhengige reguleringen av kjernetranskripsjon i planter.
Cytokrom P450-proteiner er oksidoreduktaser som katalyserer NADPH- og/eller O2-avhengige hydroksyleringsreaksjoner i primær og sekundær metabolisme, inkludert metabolismen av xenobiotika, samt hormoner, fettsyrer, steroler, celleveggkomponenter, biopolymerer og biosyntesen av beskyttende forbindelser 69. I vår studie ble variasjonen i plantecytokrom P450-funksjon redusert fra -10,6 log2 (fold endring) til 5,7 på grunn av et stort antall endrede homologer (37) og forskjeller i responsmønstre mellom spesifikke gener, noe som gjenspeiler en opprevisjon. Å bruke kun RNA-sekvenseringsdata for å belyse den antatte biologiske funksjonen til NLL-genene i en så stor proteinsuperfamilie ville være svært spekulativt. Det er imidlertid verdt å merke seg at noen cytokrom P450-gener er assosiert med økt resistens mot patogene sopp eller bakterier, inkludert et bidrag til allergiske reaksjoner 69,70,71.
Klasse III peroksidaser er multifunksjonelle planteenzymer involvert i et bredt spekter av metabolske prosesser under plantevekst og -utvikling, samt som respons på miljøbelastninger som saltinnhold, tørke, høy lysintensitet og patogenangrep72. Peroksidaser er involvert i interaksjonen mellom flere plantearter og Anthracis, inkludert Stylosanthes humilis og C. gloeosporioides, Lens culinaris og C. truncatum, Phaseolus vulgaris og C. lindemuthianum, Cucumis sativus og C. lagenarium73,74,75,76. Responsen er svært rask, noen ganger til og med ved 4 HPI, før soppen trenger inn i plantevevet73. Peroksidasegenet responderte også på D. toxica NLL-inokulering. I tillegg til deres typiske funksjoner for å regulere oksidativt utbrudd eller eliminere oksidativt stress, kan peroksidaser forstyrre patogenvekst ved å skape fysiske barrierer basert på celleveggforsterkning under lignifisering, subenhets- eller tverrbinding av spesifikke forbindelser. Denne funksjonen kan in silico tilskrives TanjilG_03329-genet som koder for en antatt lignindannende anionperoksidase som var signifikant oppregulert i vår studie i den 83A:476-resistente linjen ved 6 HPI, men ikke i andre stammer og tidspunkter som ikke responderte.
9S-/13S-lipoksygenase av linolsyre er det første trinnet i den oksidative veien for lipidbiosyntese78. Produktene fra denne veien har flere funksjoner i planteforsvar, inkludert styrking av cellevegger gjennom dannelse av kallose- og pektinavleiringer, og regulering av oksidativt stress gjennom produksjon av reaktive oksygenarter79,80,81,82,83. I denne studien var uttrykket av linolsyre 9S-/13S-lipoksygenase endret i alle stammer, men i den mottakelige populasjonen 22660 rådet oppregulering på forskjellige tidspunkter, mens det i stammer som bærer resistent Lanr1 og AnMan-allelet, understreker diversifiseringen av oksylipinlaget i beskyttende miltbrannreaksjoner mellom disse genotypene.
Homologen 1-aminocyklopropan-1-karboksylatoksidase (ACO) var signifikant oppregulert (9 gener) eller nedregulert (2 gener) ved inokulering med lupin. Med to unntak forekom alle disse responsene ved 6 hp ved 83A:476. Den enzymatiske reaksjonen mediert av ACO-proteiner er det hastighetsbegrensende trinnet i etylenproduksjon og er derfor sterkt regulert84. Etylen er et plantehormon som spiller en rekke roller i reguleringen av planteutvikling og respons på abiotiske og biotiske stressforhold. Induksjon av ACO-transkripsjon og aktivering av etylensignalveien er involvert i å øke risens resistens mot den hemibiotrofiske soppen oryzae oryzae ved å regulere produksjonen av reaktive oksygenarter og fytoaleksiner. En svært lik bladinfeksjonsprosess funnet mellom M. oryzae og C. lupini88,89, mot bakgrunn av en betydelig oppregulering av ACO-homologer i 83A:476-linjen rapportert i denne studien, endrer muligheten for å gi resistens mot NLL-antraknose etylen, et sentralt signaleringstrinn i molekylære signalveier.
I den foreliggende studien ble det observert storskala undertrykkelse av mange gener assosiert med fotosyntese ved 6 hpi i 83A:476 og ved 48 hpi i Mandeloop og 22660-populasjonen. Omfanget og utviklingen av disse endringene er proporsjonal med nivået. Antraknose-resistens ble observert i dette eksperimentet. Nylig har sterk og tidlig undertrykkelse av fotosyntese-relaterte transkripter blitt rapportert i flere modeller av plante-patogen-interaksjoner, inkludert patogene bakterier og sopp. Hastighet (fra 2 HPI i noen interaksjoner) og global undertrykkelse av gener assosiert med fotosyntese som respons på infeksjon kan utløse planteimmunitet basert på utplassering av reaktive oksygenarter og deres interaksjon med salisylsyreveien for å mediere allergiske reaksjoner 90,94.
Avslutningsvis inkluderer forsvarsresponsmekanismer som er foreslått for den mest resistente avstamningen (83A:476) rask patogengjenkjenning av R-genet (antagelig TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) og allergisk responsmediert salisylsyre- og etylensignalering, etterfulgt av etablering av langtrekkende SAR. Virkningen støttes av DIR-1-proteinet. Det bør bemerkes at den biotrofiske perioden for C. lupini-infeksjon er svært kort (omtrent 2 dager), etterfulgt av nekrotisk vekst95. Overgangen mellom disse stadiene kan være assosiert med nekrose og uttrykk av etyleninduserbare proteiner som fungerer som utløsere for hypersensitivitetsreaksjoner i vertsplanter. Derfor er tidsvinduet for vellykket fangst av C. lupini i det biotrofiske stadiet svært smalt. Omprogrammeringen av gener assosiert med redoks og fotosyntese observert i 83A:476 ved 6 hpi er i samsvar med progresjonen av sophyfer og varsler utviklingen av en vellykket beskyttende respons i det biotrofiske stadiet. De transkriptomiske responsene til Mandelup og 22660-populasjonen kan være for forsinkede til å fange soppen før den går over til nekrotisk vekst. Mandelup kan imidlertid være mer effektiv enn 22660-populasjonen fordi den relativt raske reguleringen av PR-10-proteinet fremmer horisontal motstand.
ETI, drevet av det kanoniske R-genet, ser ut til å være en vanlig mekanisme for bønneresistens mot antraknose. I modellbelgfrukten Medicago truncatula gis dermed resistens mot antraknose av RCT1-genet, et medlem av TIR-NBS-LRR97-plantens R-genklasse. Dette genet gir også bredspektret antraknoseresistens i alfalfa når det overføres til mottakelige planter. I vanlig bønne (P. vulgaris) er det hittil identifisert mer enn to dusin antraknoseresistensgener. Noen av disse genene finnes i regioner som mangler kanoniske R-gener, men mange andre er lokalisert i kantene av kromosomer som bærer NBS-LRR-genklyngen, inkludert TIR-NBS-LRRs99. Den genomomfattende SSR-studien bekreftet også assosiasjonen mellom NBS-LRR-genet og antraknoseresistens i vanlig bønne. Det kanoniske R-genet ble også funnet i den genomiske regionen som bærer det viktigste antraknoseresistenslokuset i hvit lupin 101.
Vårt arbeid viser at en umiddelbar resistensreaksjon, aktivert på et tidlig stadium av planteinfeksjon (helst ikke senere enn 12 hpi), effektivt beskytter smalbladet lupin mot antraknose forårsaket av den patogene soppen Collelotrichum lupini. Ved hjelp av høykapasitetssekvensering demonstrerte vi differensielle uttrykksprofiler av antraknose-resistensgener i NLL-planter mediert av Lanr1- og AnMan-resistensgenene. Vellykket forsvar innebærer nøye utforming av genene for proteiner involvert i redoks, fotosyntese og patogenese innen timer etter plantens første kontakt med et patogen. Lignende beskyttende reaksjoner, men forsinket i tid, er mye mindre effektive for å beskytte planter mot sykdommer. Miltbrannresistens mediert av Lanr1-genet ligner den typiske raske responsen til R-genet (effektorutløst immunitet), mens AnMan-genet mest sannsynlig gir en horisontal respons (immunitet utløst av et mikrobeassosiert molekylært mønster), noe som gir et moderat nivå av bærekraft.
De 215 NLL-linjene som ble brukt til å screene for antraknosemarkører, besto av 74 kultivarer, 60 linjer oppnådd ved krysning eller avl, 5 mutanter og 76 ville eller originale kimplasmer. Linjene kom fra 17 land, hovedsakelig fra Polen (58), Spania (47), Tyskland (27), Australia (26), Russland (19), Hviterussland (7), Italia (5) og andre linjer fra 10 land. Settet inkluderer også referanseresistente linjer: 83A:476, Tanjil, Wonga som bærer Lanr1-allelet og Mandelup som bærer AnMan-allelet. Linjene ble hentet fra European Lupine Genetic Resource Database, som vedlikeholdes av Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polen (tilleggstabell S1).
Plantene ble dyrket under kontrollerte forhold (fotoperiode 16 timer, temperatur 25 °C om dagen og 18 °C om natten). To biologiske replikater ble analysert. DNA ble isolert fra tre uker gamle blader ved bruk av DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til protokollen. Kvaliteten og konsentrasjonen av det isolerte DNA-et ble vurdert ved hjelp av spektrofotometriske metoder (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). AnManM1-markøren som markerer antraknose-resistensgenet AnMan (avledet fra cv. Mandelup) og markørene Anseq3 og Anseq4 som flankerer genet Lanr1 (avledet fra cv. Tanjil) ble analysert11,26,28. Homozygoter for det resistente allelet ble scoret som "1", mottakelige – som "0", og heterozygoter – som 0,5.
Basert på resultatene av screening for markørene AnManM1, AnSeq3 og AnSeq4 og tilgjengeligheten av frø for endelige oppfølgingsforsøk, ble 50 NLL-linjer valgt ut for fenotyping av antraknose-resistens. Analysen ble utført i duplikat i et datastyrt drivhus med en 14-timers fotoperiode med et temperaturområde på 22 °C om dagen og 19 °C om natten. Frøene skrapes (frøskallen på motsatt side av embryoet kuttes av med et skarpt blad) før såing for å forhindre frødvale på grunn av at frøskallen er for hard og for å sikre jevn spiring. Plantene ble dyrket i potter (11 × 11 × 21 cm) med steril jord (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warszawa, Polen). Inokulering ble utført med Colletotrichum lupini Col-08-stammen, dyrket i 1999 fra stilkene til smalbladede lupinplanter dyrket på et jorde i Verzhenitsa, Stor-Polen (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ Ø). Finn et område. Isolatene ble dyrket i SNA-medium ved 20 °C under svart lys i 21 dager for å indusere sporulering. Fire uker etter såing, da plantene hadde nådd 4-6 bladstadiet, ble inokuleringen utført ved å spraye med en suspensjon av konidier i en konsentrasjon på 0,5 x 106 konidier per ml. Etter inokulering ble plantene holdt i mørket i 24 timer med en fuktighet på omtrent 98 % og en temperatur på 25 °C for å lette spiringen av konidier og infeksjonsprosessen. Plantene ble deretter dyrket under en 14-timers fotoperiode ved 22 °C dagtid/19 °C natttid og 70 % luftfuktighet. Sykdomspoengsummen ble beregnet 22 dager etter inokulering og varierte fra 0 (immun) til 9 (svært mottakelig) avhengig av tilstedeværelse eller fravær av nekrotiske lesjoner på stilker og blader. I tillegg ble plantenes vekt målt etter poengsetting. Forholdet mellom markørgenotyper og sykdomsfenotyper ble beregnet som punkt to-sekvenskorrelasjoner (fravær av heterozygote markører i settet med linjer for analyse av antraknose-resistensfenotypen).