გმადლობთ, რომ ეწვიეთ Nature.com-ს. თქვენს მიერ გამოყენებულ ბრაუზერის ვერსიას CSS-ის შეზღუდული მხარდაჭერა აქვს. საუკეთესო გამოცდილებისთვის გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში). ამასობაში, მხარდაჭერის უწყვეტი უზრუნველყოფის მიზნით, საიტს სტილებისა და JavaScript-ის გარეშე ვაჩვენებთ.
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) პარკოსანი მცენარეა, რომელიც გამოიყენება საკვების წარმოებისა და ნიადაგის გაუმჯობესებისთვის. NLL-ის, როგორც კულტურის, გლობალურმა გავრცელებამ მიიზიდა მრავალი პათოგენური სოკო, მათ შორის ლუპინის ანთრაკნოზი, რომელიც იწვევს დამანგრეველ ანთრაკნოზურ დაავადებას. NLL-ის მოშენებაში გამოყენებულია ორი ალელი, Lanr1 და AnMan, რომლებიც ზრდიან რეზისტენტობას, თუმცა ძირითადი მოლეკულური მექანიზმები უცნობია. ამ კვლევაში, Lanr1 და AnMan მარკერები გამოყენებული იქნა ევროპული NLL ნიმუშების სკრინინგისთვის. ვაქცინის ტესტირებამ კონტროლირებად გარემოში დაადასტურა ორივე რეზისტენტული დონორის ეფექტურობა. გენის ექსპრესიის დიფერენციალური პროფილირება ჩატარდა რეზისტენტულ და მგრძნობიარე ხაზებზე. ანთრაკნოზის მიმართ რეზისტენტობა დაკავშირებული იყო გენის ონტოლოგიური ტერმინების ზედმეტ ექსპრესიასთან „GO:0006952 თავდაცვის რეაქცია“, „GO:0055114 რედოქს პროცესი“ და „GO:0015979 ფოტოსინთეზი“. გარდა ამისა, Lanr1(83A:476) ხაზმა ინოკულაციის შემდეგ აჩვენა ტრანსკრიპტომის მნიშვნელოვანი სწრაფი რეპროგრამირება, ხოლო სხვა ხაზებმა აჩვენა ამ პასუხის დაგვიანება დაახლოებით 42 საათით. დაცვითი რეაქციები ასოცირდება TIR-NBS, CC-NBS-LRR და NBS-LRR გენებთან, პათოგენეზში ჩართულ 10 ცილასთან, ლიპიდების გადაცემის ცილებთან, ენდოგლუკან-1,3-β-გლუკოზიდაზასთან, გლიცინით მდიდარ უჯრედის კედლის ცილებთან და ჟანგბადის რეაქტიული გზის გენებთან. 83A:476-ზე ადრეული რეაქციები, მათ შორის ფოტოსინთეზთან დაკავშირებული გენების ფრთხილად დათრგუნვა, დაემთხვა წარმატებულ დაცვას სოკოვანი ბიოლოგიის ვეგეტატიური ზრდის ფაზაში, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ ეფექტორი იწვევს იმუნიტეტს. მანდელოპის რეაქცია შენელებულია, ისევე როგორც საერთო ჰორიზონტალური წინააღმდეგობა.
ვიწროფოთლოვანი ლუპინი (NLL, Lupinus angustifolius L.) მაღალცილებიანი მარცვლეულია, რომელიც დასავლეთ ხმელთაშუა ზღვის რეგიონში წარმოიშვა1,2. ამჟამად ის ცხოველებისა და ადამიანების საკვებ კულტურად მოჰყავთ. ის ასევე მწვანე სასუქად ითვლება მოსავლის ბრუნვის სისტემებში სიმბიოზური აზოტის დამფიქსირებელი ბაქტერიების მიერ აზოტის ფიქსაციისა და ნიადაგის სტრუქტურის საერთო გაუმჯობესების გამო. NLL-მა ბოლო საუკუნეში სწრაფი მოშინაურების პროცესი გაიარა და კვლავ მაღალი გამრავლების ზეწოლის ქვეშაა3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. NLL-ის ფართოდ გავრცელებული კულტივაციით, პათოგენური სოკოების თანმიმდევრობამ ახალი სასოფლო-სამეურნეო ნიშები განავითარა და ახალი მოსავლის გამანადგურებელი დაავადებები გამოიწვია. ლუპინის მწარმოებლებისა და სელექციონერებისთვის ყველაზე აღსანიშნავი ანთრაქნოზის გაჩენა იყო, რომელსაც პათოგენური სოკო Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 იწვევს. ლუპინის მწარმოებლებისა და სელექციონერებისთვის ყველაზე აღსანიშნავი ანთრაქნოზის გაჩენა იყო, რომელსაც პათოგენური სოკო Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 იწვევს. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление antraknoza, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. ლუპინის მწარმოებლებისა და სელექციონერებისთვის ყველაზე აღსანიშნავი იყო ანთრაქნოზის გაჩენა, რომელიც გამოწვეული იყო პათოგენური სოკოთი Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是猱lleumtoricht (ბონდარი) ნირენბერგი, ფეილერი და ჰაგედორნი13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是猱lleumtoricht (ბონდარი) თმიანი. 1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление antraknoza, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. ლუპინის მწარმოებლებისა და სელექციონერებისთვის ყველაზე გასაოცარია ანთრაქნოზის გაჩენა, რომელიც გამოწვეულია პათოგენური სოკოთი Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.დაავადების შესახებ ყველაზე ადრეული ცნობები ბრაზილიასა და ამერიკის შეერთებულ შტატებში გავრცელდა, სადაც ტიპიური სიმპტომები შესაბამისად 1912 და 1929 წლებში გამოვლინდა. თუმცა, დაახლოებით 30 წლის შემდეგ, პათოგენი Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz-ის სახელით იქნა ცნობილი. & საკ., ტელეომორფი Glomerella cingulata (სტოუნმენი) სპოლდი. & საკ., ტელეომორფი Glomerella cingulata (სტოუნმენი) სპოლდი. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & საკ., Glomerella cingulata (სტოუნმენ) სპოლდის ტელეომორფი. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & საკ., Glomerella cingulata (სტოუნმენი) სპოლდი მიზნობრივ მორფოლოგიაში. & ჰ. შრენკი. & ჰ. შრენკი.და ჰ. შრენკი. & H.施伦克,. & H.施伦克,.და ჰ. შლენკი.მე-20 საუკუნის შუა პერიოდში ჩატარებული დაავადების წინასწარი ფენოტიპირებამ აჩვენა გარკვეული წინააღმდეგობა არალეგალური ლუპინისა და ყვითელი ლუპინის (L. luteus L.) სახეობებში, თუმცა ყველა შემოწმებული თეთრი ლუპინის (L. albus L.) სახეობები მაღალი მგრძნობელობით გამოირჩეოდა15,16. კვლევებმა აჩვენა, რომ ანტრაქნოზის განვითარება დაკავშირებულია ნალექების (ჰაერის ტენიანობის) და ტემპერატურის მატებასთან (12-28°C დიაპაზონში), რაც იწვევს მდგრადობის დარღვევას მაღალ ტემპერატურაზე17, 18. სინამდვილეში, კონიდიების აღმოცენებისა და დაავადების დაწყებისთვის საჭირო დრო ოთხჯერ ნაკლები იყო 24°C-ზე (4 საათი) ტემპერატურაზე, ვიდრე 12°C-ზე (16 საათი) მაღალი ტენიანობის პირობებში19. ამრიგად, მიმდინარე გლობალურმა დათბობამ გამოიწვია ანტრაქნოზის გავრცელება. თუმცა, დაავადება დაფიქსირდა საფრანგეთში (1982) და უკრაინაში (1983), როგორც მოსალოდნელი საფრთხის მაუწყებელი, მაგრამ, როგორც ჩანს, იმ დროს ლუპინის ინდუსტრიამ უგულებელყო იგი20,21. რამდენიმე წლის შემდეგ, ეს დამანგრეველი დაავადება მთელ მსოფლიოში გავრცელდა და ასევე დააზარალა ლუპინის მწარმოებელი ძირითადი ქვეყნები, როგორიცაა ავსტრალია, პოლონეთი და გერმანია22,23,24. 1990-იანი წლების შუა პერიოდში ანთრაკნოზის აფეთქების შემდეგ, ფართომასშტაბიანი სკრინინგის შედეგად NLL19 ნიმუშებში რამდენიმე რეზისტენტული დონორი იქნა იდენტიფიცირებული. NLL-ის ანთრაკნოზის მიმართ რეზისტენტობა კონტროლდება ორი ცალკეული დომინანტური ალელით, რომლებიც გვხვდება სხვადასხვა გერმპლაზმის წყაროებში: Lanr1 ჯიშ Tanjil and Wonga-ში და AnMan ჯიშში Mandalay 25, 26. ეს ალელები ავსებენ მოლეკულურ მარკერებს, რომლებიც მხარს უჭერენ რეზისტენტული გერმპლაზმის შერჩევას სელექციურ პროგრამებში25,26,27,28,29,30. Lanr1 ალელის მატარებელი რეზისტენტული გამრავლების ხაზი 83A:476 შეჯვარდა მგრძნობიარე ველურ ხაზ P27255-თან, რათა მიგვეღო ანთრაქნოზის მიმართ რეზისტენტობის გამოყოფილი RIL პოპულაცია, რამაც შესაძლებელი გახადა Lanr1 ლოკუსის NLL-1131, 32, 33 ქრომოსომასთან მიკუთვნება. გენომური ჩარჩოთი ანთრაქნოზის გვერდითი რეზისტენტობის ლოკუსებიდან შეერთების რუკის მარკერების გენომური ჩარჩოთი გასწორებით, NLL-მა გამოავლინა სამივე ალელის მდებარეობა ერთსა და იმავე ქრომოსომაზე (NLL-11), მაგრამ სხვადასხვა პოზიციებზე29,34,35. თუმცა, RIL-ების მცირე რაოდენობისა და მარკერებსა და შესაბამის ალელებს შორის დიდი გენეტიკური მანძილის გამო, მათი გენების შესახებ სანდო დასკვნების გამოტანა შეუძლებელია. მეორეს მხრივ, ლუპინებში უკუ გენეტიკის გამოყენება რთულია მათი ძალიან დაბალი რეგენერაციის პოტენციალის გამო, რაც გენეტიკურ მანიპულირებას ართულებს37.
ჰომოზიგოტურ მდგომარეობაში სასურველი ალელის მატარებელი მოშინაურებული გერმპლაზმის, როგორიცაა 83A:476 (Lanr1) და Mandelup (AnMan), განვითარებამ კარი გაუღო ანტრაქნოზის მიმართ რეზისტენტობის შესწავლას ველურ პოპულაციებში ალელების საპირისპირო კომბინაციების არსებობის პირობებში. მოლეკულური მექანიზმების შესაძლებლობები. შეადარეთ კონკრეტული გენოტიპების მიერ გენერირებული თავდაცვითი რეაქციები. ამ კვლევამ შეაფასა NLL-ის ადრეული ტრანსკრიპტომული პასუხი C. lupini ვაქცინაციაზე. პირველ რიგში, ევროპული NLL გერმპლაზმის პანელი, რომელიც შეიცავდა 215 ხაზს, გამოიკვლიეს მოლეკულური მარკერების გამოყენებით, რომლებიც აღნიშნავენ Lanr1 და AnMan ალელებს. შემდეგ ანტრაქნოზის ფენოტიპირება ჩატარდა 50 NLL ხაზზე, რომლებიც ადრე შეირჩნენ მოლეკულური მარკერებისთვის, კონტროლირებად პირობებში. ამ ექსპერიმენტების საფუძველზე, ანტრაქნოზის მიმართ რეზისტენტობით და Lanr1/AnMan ალელის შემადგენლობით განსხვავდებოდა ოთხი ხაზი, რომლებიც განსხვავდებოდა ანტრაქნოზის მიმართ რეზისტენტობით და Lanr1/AnMan ალელის შემადგენლობით, შეირჩა დიფერენციალური თავდაცვითი გენის ექსპრესიის პროფილირებისთვის ორი დამატებითი მიდგომის გამოყენებით: მაღალი გამტარუნარიანობის RNA სეკვენირება და რეალურ დროში PCR რაოდენობრივი განსაზღვრა.
NLL გერმპლაზმის ნაკრების (N = 215) სკრინინგით Lanr1 (Anseq3 და Anseq4) და AnMan (Anseq4) და AnMan (AnManM1) მარკერებით აჩვენა, რომ მხოლოდ ერთი ხაზი (95726, სალამანკა-b-სთან ახლოს) აძლიერებს „რეზისტენტობის“ ალელს ყველა მარკერისთვის, ხოლო „მგრძნობიარე“ ალელების არსებობაში“ ყველა მარკერის პროპორცია 158 (~73.5%) ხაზში აღმოჩნდა. ცამეტმა ხაზმა წარმოქმნა Lanr1 მარკერის ორი „რეზისტენტული“ ალელი, ხოლო 8 ხაზმა - Lanr1 მარკერის „რეზისტენტული“ ალელები. AnMan მარკერის „რეზისტენტობის“ ალელი (დამატებითი ცხრილი S1). ორი ხაზი იყო ჰეტეროზიგოტური Anseq3 მარკერისთვის და ერთი ჰეტეროზიგოტური AnManM1 მარკერისთვის. 42 ხაზი (19.5%) ატარებდა Anseq3 და Anseq4 ალელების საპირისპირო ფაზებს, რაც მიუთითებს ამ ორ ლოკუსს შორის რეკომბინაციის მაღალ სიხშირეზე. ანტრაქნოზის ფენოტიპების კონტროლირებად პირობებში (დამატებითი ცხრილი S2) გამოვლინდა შემოწმებული გენოტიპების რეზისტენტობის ცვალებადობა, რაც აისახა ანტრაქნოზის სიმძიმეზე. საშუალო ქულების სხვაობა მერყეობდა 1.8-დან (ზომიერად რეზისტენტობა) 6.9-მდე (მგრძნობელობა), ხოლო მცენარის წონის სხვაობა მერყეობდა 0.62-დან (მგრძნობელობა) 4.45 გ-მდე (რეზისტენტობა). ექსპერიმენტის ორ გამეორებაში დაფიქსირებულ მნიშვნელობებს შორის მნიშვნელოვანი კორელაცია იყო (0.51 დაავადების სიმძიმის ქულებისთვის, P = 0.00017 და 0.61 მცენარის წონისთვის, P < 0.0001), ასევე ამ ორ პარამეტრს შორის (-0.59 და -0.77, P < 0.0001). ექსპერიმენტის ორ გამეორებაში დაფიქსირებულ მნიშვნელობებს შორის მნიშვნელოვანი კორელაცია იყო (0.51 დაავადების სიმძიმის ქულებისთვის, P = 0.00017 და 0.61 მცენარის წონისთვის, P < 0.0001), ასევე ამ ორ პარამეტრს შორის (-0.59 და -0.77, P < 0.0001). Выывлена ​​достоверная коррреიკული мия межначениями, . этими двумя параметрими (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). ექსპერიმენტის ორ გამეორებაში დაფიქსირებულ მნიშვნელობებს შორის მნიშვნელოვანი კორელაცია დაფიქსირდა (0.51 დაავადების სიმძიმის ქულებისთვის, P = 0.00017 და 0.61 მცენარის წონისთვის, P < 0.0001), ასევე ამ ორ პარამეტრს შორის (- 0.59 და -0.77, P < 0.0001) 0.0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分严0. 0.00017，植物重量为0.61，P <0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，01.在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程庈 严重度分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之鈑（，，，，（（（，， 0.59 和 – 0.59 和- 0,59 和 - 0,77, P < 0,0001). ნაблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 და масса მზარდი 0,61, P <0,00001, P <0,00001), и -0,0001) 0,77, P <0,0001. დუბლიკატში დაფიქსირებულ მნიშვნელობებს შორის (დაავადების სიმძიმის ქულა 0.51, P = 0.00017 და მცენარის წონა 0.61, P < 0.0001) და ამ ორ პარამეტრს შორის (-0.59 და -0.0001) მნიშვნელოვანი კორელაცია იყო 0.77, P<0.0001. ).მგრძნობიარე მცენარეებში შეინიშნება ღეროს გადახრა და დაგრეხვა, რაც „მწყემსის მშვილდის“ სტრუქტურას წააგავს, რასაც მოჰყვება ოვალური დაზიანებები ნარინჯისფერი/ვარდისფერი სპოროზოიტებით (დამატებითი სურ. 1). Lanr1 (83A:476 და Tanjil) და AnMan (Mandelup) გენების მატარებელი ავსტრალიური ასიგნებები ზომიერად რეზისტენტულია, 0.0331 და 0.0036). დაავადების სიმპტომებს ავლენს ზოგიერთი ხაზი, რომელიც ასევე შეიცავს „რეზისტენტულ“ Lanr1 და/ან AnMan ალელებს.
საინტერესოა, რომ რამდენიმე NLL ხაზს, რომლებსაც არ ჰქონდათ რაიმე „რეზისტენტული“ მარკერის ალელი, აღენიშნებოდა ანთრაქნოზის მიმართ რეზისტენტობის მაღალი დონე (შედარებითი ან უფრო მაღალი, ვიდრე Lanr1 ან AnMan გენოტიპების შემთხვევაში), როგორიცაა Boregine (P მნიშვნელობა < 0.0001 ორივე პარამეტრისთვის), Bojar (P მნიშვნელობა < 0.0001 ქულისთვის და 0.001 მცენარის წონისთვის) და პოპულაცია B-549/79b (P მნიშვნელობა < 0.0001 ქულისთვის და არამნიშვნელოვანი წონისთვის). საინტერესოა, რომ რამდენიმე NLL ხაზს, რომლებსაც არ ჰქონდათ რაიმე „რეზისტენტული“ მარკერის ალელი, აღენიშნებოდა ანთრაქნოზის მიმართ რეზისტენტობის მაღალი დონე (შედარებითი ან უფრო მაღალი, ვიდრე Lanr1 ან AnMan გენოტიპების შემთხვევაში), როგორიცაა Boregine (P მნიშვნელობა < 0.0001 ორივე პარამეტრისთვის), Bojar (P მნიშვნელობა < 0.0001 ქულისთვის და 0.001 მცენარის წონისთვის) და პოპულაცია B-549/79b (P მნიშვნელობა < 0.0001 ქულისთვის და არამნიშვნელოვანი წონისთვის). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к antraknozu (сопоставимый или более высокий, чем для канцерным), Boregine (მნიშვნელობა P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (მნიშვნელობა P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) და პოპულაცია B-549/79b (მნიშვნელობა P <0,0001 для незначимо для массы). საინტერესოა, რომ რამდენიმე NLL ხაზმა, რომლებსაც არ ჰქონდათ რაიმე „რეზისტენტული“ მარკერის ალელი, აჩვენა ანთრაქნოზის მიმართ მაღალი დონის რეზისტენტობა (შედარებითი ან უფრო მაღალი, ვიდრე Lanr1 ან AnMan გენოტიპების შემთხვევაში), როგორიცაა Boregine (P მნიშვნელობა < 0.0001 ორივე პარამეტრისთვის), Bojar (P მნიშვნელობა < 0.0001 შეფასებისთვის და 0.001 მცენარის წონისთვის) და პოპულაცია B-549/79b (P მნიშვნელობა < 0.0001 შეფასებისთვის და არა მნიშვნელოვანი წონისთვის).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭r.或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重阾为 საინტერესოა, რომ ზოგიერთი NLL სისტემა, რომელსაც არ გააჩნია „ანტიგენური“ მარკერები, ავლენს მაღალ ჰორიზონტალურ რეზისტენტობას (Lanr1 ან AnMan გენების ექვივალენტური ან უფრო მაღალი), როგორიცაა Boregine (ორივე პარამეტრი P < 0.0001), Bojar (P მნიშვნელობა < 0.0001, მცენარის წონა 0.001) და შტამი B-549/79b (P მნიშვნელობა < 0.0001, წონა უმნიშვნელოა). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уровни устойчивости к antraknozu (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnM). обоих параметров <0,0001), ბოჯარი (მნიშვნელობა P <0,0001, масса растения 0,001) და პოპულარული B-549/79b (оценка P-მნიშვნელობა <0,0001, масса незначительна). საინტერესოა, რომ ზოგიერთ NLL ხაზს, რომლებსაც არ ჰქონდათ „რეზისტენტობის“ მარკერის ალელი, აღენიშნებოდა ანთრაქნოზის მიმართ რეზისტენტობის მაღალი დონე (შედარებითი ან უფრო მაღალი, ვიდრე Lanr1 ან AnMan გენოტიპები), როგორიცაა Boregine (P მნიშვნელობა ორივე პარამეტრისთვის <0.0001), Bojar (P-მნიშვნელობა < 0.0001, მცენარის წონა 0.001) და პოპულაცია B-549/79b (P-მნიშვნელობა < 0.0001, წონა უმნიშვნელო).ეს ფენომენი მიუთითებს რეზისტენტობის ახალი გენეტიკური წყაროს არსებობის შესაძლებლობაზე, რაც ხსნის მარკერების გენოტიპებსა და დაავადების ფენოტიპებს შორის კორელაციის არარსებობას (P მნიშვნელობები ~0.42-დან ~0.98-მდე). ამრიგად, კოლმოგოროვ-სმირნოვის ტესტმა აჩვენა, რომ ანთრაქნოზის მიმართ რეზისტენტობის შესახებ მონაცემები დაახლოებით ნორმალურად იყო განაწილებული ქულების (P-მნიშვნელობები 0.25 და 0.11) და მცენარის მასის (P-მნიშვნელობები 0.47 და 0.55) მიხედვით, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ მე ვარაუდობ, რომ Lanr1-სა და AnMan-ზე მეტი ალელია ჩართული.
ანტრაქნოზის მიმართ რეზისტენტობის სკრინინგის შედეგების საფუძველზე, ტრანსკრიპტომის ანალიზისთვის შეირჩა 4 ხაზი: 83A:476, ბორეგინი, მანდელუპი და პოპულაცია 22660. ეს ხაზები ხელახლა შემოწმდა ჯილეხის მიმართ რეზისტენტობაზე ინოკულაციის ექსპერიმენტებში რნმ-ის სეკვენირებით, იმ პირობით, რომ ისინი იგივე იყო, რაც წინა ტესტში. ქულების მნიშვნელობები იყო შემდეგი: ბორეგინი (1.71 ± 1.39), 83A: 476 (2.09 ± 1.38), მანდელუპი (3.82 ± 1.42) და პოპულაცია 22660 (6.11 ± 1.29).
Illumina NovaSeq 6000 პროტოკოლით ნიმუშზე საშუალოდ 40.5 Mread წყვილი დაფიქსირდა (29.7-დან 54.4 Mread-მდე) (დამატებითი ცხრილი S3). საცნობარო თანმიმდევრობაში გასწორების ქულები მერყეობდა 75.5%-დან 88.6%-მდე. ბიოლოგიურ რეპლიკაციებს შორის ექსპერიმენტულ ვარიანტებს შორის წაკითხვის დათვლის მონაცემების საშუალო კორელაცია მერყეობდა 0.812-დან 0.997-მდე (საშუალო 0.959). გაანალიზებული 35,170 გენიდან 2917-მა არ გამოავლინა ექსპრესია, ხოლო დანარჩენი 4785 გენი უმნიშვნელო დონეზე იყო გამოხატული (საბაზისო საშუალო < 5). გაანალიზებული 35,170 გენიდან 2917-მა არ გამოავლინა ექსპრესია, ხოლო დანარჩენი 4785 გენი უმნიშვნელო დონეზე იყო გამოხატული (საბაზისო საშუალო < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5). გაანალიზებული 35,170 გენიდან 2917-მა არ გამოხატა ექსპრესია, ხოლო დარჩენილი 4785 გენი უმნიშვნელო დონეზე იყო გამოხატული (საბაზისო საშუალო <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35,170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генови имели незначительную экспрессию (базовое среднее значение <5). გაანალიზებული 35,170 გენიდან 2917 არ იყო ექსპრესირებული, ხოლო დარჩენილ 4785 გენს უმნიშვნელო ექსპრესია ჰქონდა (საბაზისო საშუალო <5).ამგვარად, ექსპერიმენტის დროს ექსპრესირებული გენების რაოდენობა (საბაზისო საშუალო ≥ 5) იყო 27,468 (78.1%) (დამატებითი ცხრილი S4).
პირველივე დროიდან, ყველა NLL ხაზმა C. lupini-ს (შტამი Col-08) ინოკულაციაზე რეაგირება მოახდინა ტრანსკრიპტომის რეპროგრამირებით (ცხრილი 1), თუმცა, ხაზებს შორის მნიშვნელოვანი განსხვავებები დაფიქსირდა. ამრიგად, რეზისტენტობის ხაზმა 83A:476 (Lanr1 გენის მატარებელი) პირველ დროს (6 hpi) აჩვენა ტრანსკრიპტომის მნიშვნელოვანი რეპროგრამირება, იზოლირებული ზემოთ და ქვემოთ გენების რაოდენობის 31-69-ჯერ ზრდით სხვა დროის წერტილებთან შედარებით ამ დროს. გარდა ამისა, ეს პიკი ხანმოკლე იყო, რადგან მეორე დროს (12 hpi) მხოლოდ რამდენიმე გენის ექსპრესია მნიშვნელოვნად შეცვლილი დარჩა. საინტერესოა, რომ Boregine-მა, რომელმაც ასევე აჩვენა რეზისტენტობის მაღალი დონე ტრანსპლანტაციის ტესტში, ექსპერიმენტის დროს არ გაიარა ასეთი მასიური ტრანსკრიფციული რეპროგრამირება. თუმცა, დიფერენცირებულად ექსპრესირებული გენების რაოდენობა (DEG) იგივე იყო Boregine-სა და 83A:476-ისთვის 12 HPI-ზე. როგორც მანდელუპმა, ასევე 22660 პოპულაციამ ბოლო დროს (48 ლ/წმ) აჩვენა DEG პიკები, რაც დაცვითი რეაქციების შედარებით შეფერხებაზე მიუთითებს.
რადგან 83A:476-მა C. lupini-ზე საპასუხოდ 6 HPI-ზე გაიარა მასიური ტრანსკრიპტომის რეპროგრამირება ყველა სხვა ხაზთან შედარებით, ამ დროს დაფიქსირებული DEG-ების ~91% წარმომავლობისთვის სპეციფიკური იყო (სურ. 1). თუმცა, კვლევის ხაზებს შორის ადრეულ რეაქციებში გარკვეული გადაფარვა იყო, რადგან ბორეგინში, მანდელუპსა და 22660 პოპულაციაში DEG-ების 68.5%, 50.9% და 52.6% შესაბამისად, გარკვეულ დროს ემთხვეოდა 83A:476-ში აღმოჩენილ DEG-ებს. თუმცა, ეს DEG-ები შეადგენდნენ 83A:476-ის გამოყენებით ამჟამად აღმოჩენილი ყველა DEG-ის მხოლოდ მცირე ნაწილს (0.97–1.70%). გარდა ამისა, ამ დროს ყველა ხაზიდან 11 DEG იყო კოჰერენტული (დამატებითი ცხრილები S4-S6), მათ შორის მცენარეთა თავდაცვის რეაქციების საერთო კომპონენტები: ლიპიდური გადაცემის ცილა (TanjilG_32225), ენდოგლუკან-1,3-β-გლუკოზიდი ფერმენტი (TanjilG_23384), ორი სტრესით ინდუცირებადი ცილა, როგორიცაა SAM22 (TanjilG_31528 და TanjilG_31531), ძირითადი ლატექსის ცილა (TanjilG_32352) და ორი გლიცინით მდიდარი სტრუქტურული უჯრედის კედლის ცილა (TanjilG_19701 და TanjilG_19702). ასევე შედარებით მაღალი გადაფარვა იყო ტრანსკრიპტომურ რეაქციებში 83A:476-სა და Boregine-ს შორის 24 HPI-ზე (სულ 16-38% DEG) და Mandelup-სა და Population 22660-ს შორის 48 HPI-ზე (სულ 14-20% DEG).
ვენის დიაგრამა, რომელიც აჩვენებს დიფერენცირებულად ექსპრესირებული გენების (DEG) რაოდენობას ვიწროფოთლოვან ლუპინის (NLL) ხაზებში, რომლებიც ინოკულირებულია Colletotrichum lupini-ით (შტამი Col-08 მიღებულია ლუპინის მინდვრებიდან ვიერჟენიცეში, პოლონეთი, 1999). გაანალიზებული NLL ხაზები იყო: 83A:476 (რეზისტენტული, Lanr1 ალელის მატარებელი), Boregine (რეზისტენტული, გენეტიკური ფონი უცნობია), Mandelup (ზომიერად რეზისტენტული, AnMan ალელის მატარებელი) და პოპულაცია 22660 (ძალიან მგრძნობიარე). აბრევიატურა hpi აღნიშნავს ვაქცინაციიდან რამდენიმე საათს. ნულოვანი მნიშვნელობები ამოღებულია გრაფიკის გამარტივების მიზნით.
6 hpi-ზე ზედმეტად ექსპრესირებული გენების ნაკრები გაანალიზდა კანონიკური R გენის დომენების არსებობაზე (დამატებითი ცხრილი S7). ამ კვლევამ გამოავლინა კლასიკური დაავადებისადმი რეზისტენტობის გენების ტრანსკრიპტომული ინდუქცია მხოლოდ NBS-LRR დომენებით 83A:476-ზე. ეს ნაკრები შედგებოდა ერთი TIR-NBS-LRR გენისგან (tanjilg_05042), ხუთი CC-NBS-LRR გენისგან (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 და tanjilg_16162), ოთხი NBS-LR-ისგან, Tanjilg_16162-ისგან, ოთხი NBS-LRRE-სგან (tanjilg_16162), ასევე ოთხი NBS-Lrr-ისგან (tanjilg_16162) და ოთხი NBS-LRR-ისგან (TANJILG_16162). ყველა ამ გენს აქვს კანონიკური დომენები, რომლებიც განლაგებულია კონსერვატიულ თანმიმდევრობებში. NBS-LRR დომენის გენების გარდა, რამდენიმე RLL კინაზა გააქტიურდა 6 hpi-ზე, კერძოდ, ერთი ბორეგინში (TanjilG_19877), ორი მანდელუპში (TanjilG_07141 და TanjilG_19877) და 22660 პოპულაციაში (TanjilG_09014 და TanjilG_10361) და ორი 83A 27:476-ში.
C. lupini-ით (შტამი Col-08) ინოკულაციის საპასუხოდ მნიშვნელოვნად შეცვლილი ექსპრესიის მქონე გენები დაექვემდებარა გენის ონტოლოგიის (GO) გამდიდრების ანალიზს (დამატებითი ცხრილი S8). ყველაზე ხშირად ჭარბად წარმოდგენილი ბიოლოგიური პროცესის ტერმინი იყო „GO:0006952 თავდაცვითი პასუხი“, რომელიც 16 (დრო × ხაზი) ​​კომბინაციიდან 6-ში მაღალი მნიშვნელობით (P მნიშვნელობა < 0.001) გამოჩნდა (სურ. 2). ყველაზე ხშირად ჭარბად წარმოდგენილი ბიოლოგიური პროცესის ტერმინი იყო „GO:0006952 თავდაცვითი პასუხი“, რომელიც 16 (დრო × ხაზი) ​​კომბინაციიდან 6-ში მაღალი მნიშვნელობით (P მნიშვნელობა < 0.001) გამოჩნდა (სურ. 2). Наиболее часто черезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся в 6 из 16 (время × линя) კომბინაციები со высокой, (0006952). ყველაზე ხშირად ჭარბად წარმოდგენილი ბიოლოგიური პროცესის ტერმინი იყო „GO:0006952 თავდაცვითი პასუხი“, რომელიც მაღალი მნიშვნელობის მქონე (P მნიშვნელობა < 0.001) 16 (დრო × წარმომავლობა) კომბინაციიდან 6-ში გამოჩნდა (სურ. 2).最常被过度代表的生物过程术语是"GO:0006952 防御反应"，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 ბიოლოგიური პროცესის ყველაზე წარმომადგენლობითი ტერმინია „GO:0006952 თავდაცვითი პასუხი“, რომელიც 16 (时间×线) კომბინაციიდან 6-ში ჩნდება მაღალი მნიშვნელობით (P მნიშვნელობა < 0.001) (图2). Наиболее часто черезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», კოторый появлялся в 6 из 16 კომბინაციй (время × линя) со высокой значимостью (2.00) <0.000 P. ყველაზე ხშირად ჭარბად წარმოდგენილი ბიოლოგიური პროცესის ტერმინი იყო „GO:0006952 თავდაცვის პასუხი“, რომელიც 16 კომბინაციიდან 6-ში (დრო × ხაზი) ​​მაღალი მნიშვნელობით (P მნიშვნელობა < 0.001) გამოჩნდა (სურ. 2).ეს ტერმინი 83A-ში ორ დროის წერტილში იყო ჭარბად წარმოდგენილი: 476 და Boregine (6 და 24 hpi) და ერთ დროს Mandelup-სა და პოპულაცია 22660-ში (შესაბამისად, 12 და 6 hpi). ეს მოსალოდნელი შედეგია, რომელიც ხაზს უსვამს რეზისტენტული ხაზების სოკოს საწინააღმდეგო რეაქციას. გარდა ამისა, 83A:476 რეაგირებდა C. lupini-ზე ჟანგვითი აფეთქების გენების სწრაფი ინდუცირებით, რომლებიც წარმოდგენილია ტერმინით „GO:0055114 რედოქს პროცესი“, რაც მიუთითებს სპეციფიკურ დამცავ რეაქციაზე, მაშინ როდესაც Boregine-მა გამოავლინა სპეციფიკური დამცავ რეაქციები, რომლებიც დაკავშირებულია ტერმინ „GO“-სთან. :0006950 სტრესზე რეაქცია“. პოპულაცია 22660-მა გაააქტიურა ჰორიზონტალური რეზისტენტობის რეაქცია მეორადი მეტაბოლიტების მონაწილეობით, რაც ხაზს უსვამს ტერმინების „GO:0016104 ტრიტერპენის ბიოსინთეზის პროცესი“ და „GO:0006722 ტრიტერპენის მეტაბოლიზმის პროცესი“ (ორივე ტერმინი გენების ერთსა და იმავე ნაკრებს მიეკუთვნება), GO ტერმინის გამდიდრების ანალიზის შედეგების გათვალისწინებით, მანდელუპის რეაქციის სტაბილურობა ბორეგინსა და პოპულაცია 22660-ს შორის იყო. გარდა ამისა, ადრეული რეაქცია 83A:476 (6 hpi) და დაგვიანებული რეაქცია მანდელუპი და პოპულაცია 22660 მოიცავს ტერმინს GO:0015979 „ფოტოსინთეზი“ და სხვა მასთან დაკავშირებული ბიოლოგიური პროცესები.
ჯილეხის ლუპინით (Col-08 შტამი, მიღებული 1999 წელს პოლონეთის ქალაქ ვიერჟენიცეში ლუპინის მინდვრებიდან) ინოკულირებული ვიწროფოთლოვანი ლუპინის (NLL) ტრანსკრიპტომული პასუხების დროს დიფერენცირებულად ექსპრესირებული გენების ანოტაციაში შერჩეული ბიოპროცესის გენის ონტოლოგიური ტერმინები მნიშვნელოვნად გაზვიადებულია. გაანალიზებული NLL ხაზები იყო: 83A:476 (რეზისტენტული, ჰომოზიგოტური Lanr1 ალელის მატარებელი), ბორეგინი (რეზისტენტული, უცნობი გენეტიკური ფონი), მანდელუპი (ზომიერად რეზისტენტული, ჰომოზიგოტური AnMan ალელის მატარებელი) და პოპულაცია 22660 (მგრძნობიარე).
რადგან ამ კვლევის მიზანი იყო ანთრაქნოზის მიმართ რეზისტენტობის ხელშემწყობი გენების იდენტიფიცირება, GO „GO: 0006952 თავდაცვითი რეაქციები“ და „GO: 0055114 რედოქს პროცესები“ ტერმინებით მიკუთვნებული გენები გაანალიზდა ზღვრული მნიშვნელობებით, რადგან საბაზისო საშუალო ≥ 30 იყო მინიმუმ ერთი ხაზით. × დროის წერტილი, რომელიც აერთიანებდა log2-ის (ჯერადი ცვლილების) სტატისტიკურად მნიშვნელოვან მნიშვნელობებს. ამ კრიტერიუმებს აკმაყოფილებდა 65 გენი GO:0006952-ისთვის და 524 GO:0055114-ისთვის.
83A:476-მა გამოავლინა ორი DEG პიკი, რომლებიც აღნიშნული იყო ტერმინით GO:0006952, პირველი - 6 გენი ინჩზე (64 გენი, აღმავალი და დაღმავალი რეგულირებით) და მეორე - 24 გენი ინჩზე (15 გენი, მხოლოდ აღმავალი რეგულირებით). ბორეჯინმა ასევე აჩვენა, რომ GO:0006952 პიკს მიაღწია იმავე დროს, მაგრამ ნაკლები DEG-ით (11 და 8) და პრეფერენციული აქტივაციით. მანდელოპმა აჩვენა GO:0006952-ის ორი პიკი 12 და 48 HPI-ზე, ორივე ატარებდა 12 გენს (პირველი გამააქტიურებელი გენებით, ხოლო მეორე მხოლოდ სუპრესიული გენებით), ხოლო 22660 პოპულაციას 6 HPI-ზე (13 გენი) ჰქონდა პიკის ზრდის რეგულირების უფრო დიდი უპირატესობა. უნდა აღინიშნოს, რომ ამ პიკებში GO:0006952 DEG-ის 96.4%-ს ჰქონდა ერთი და იგივე ტიპის პასუხი (ზემოთ ან ქვემოთ), რაც მიუთითებს დამცავ რეაქციებში მნიშვნელოვან გადაფარვაზე, ჩართული გენების რაოდენობის განსხვავებების მიუხედავად. ტერმინ GO:0006952-თან დაკავშირებული თანმიმდევრობების უდიდესი ჯგუფი აკოდირებს შიმშილის სტრესთან ასოცირებულ შეტყობინების პროტეინს 22 (SAM22-ის მსგავსს), რომელიც მიეკუთვნება მე-10 კლასის პათოგენეზთან ასოცირებულ პროტეინ (PR-10) ცილის კლადს და ბირთვის ცილას (ლატექსის მსგავსი (MLP-ის მსგავსი) ცილა) ცილას (სურ. 3). ორი ჯგუფი განსხვავდებოდა ექსპრესიის ბუნებითა და რეაქციის მიმართულებით. SAM22-ის მსგავსი ცილების კოდირების გენებმა აჩვენეს თანმიმდევრული და მნიშვნელოვანი ინდუქცია ადრეულ დროის წერტილებში (6 ან 12 hpi) და ზოგადად არ რეაგირებდნენ ექსპერიმენტის ბოლოს (48 hpi), მაშინ როდესაც MLP-ის მსგავსი ცილები აჩვენეს კოორდინაცია 6 hpi-ზე (83A:476 და Mandelup 48 hpi-ზე), თითქმის ყველა სხვა მონაცემი არ რეაგირებდა. გარდა ამისა, SAM22-ის მსგავსი ცილის გენების ექსპრესიის პროფილებში განსხვავებები მოჰყვა ანთრაქნოზის მიმართ რეზისტენტობის დაკვირვებულ ცვალებადობას, რადგან უფრო რეზისტენტულ ხაზებს ჰქონდათ უფრო მეტი დროის წერტილები, რომლებიც მნიშვნელოვნად იწვევდნენ ამ გენებს, ვიდრე უფრო მგრძნობიარე გენებს. კიდევ ერთმა LlR18A/B-ის მსგავსმა PR-10 გენმა აჩვენა SAM22-ის მსგავსი ცილის გენის ექსპრესიის ძალიან მსგავსი ნიმუში.
ბიოლოგიური პროცესის ტერმინის „GO:0006952 თავდაცვის პასუხი“ ძირითადი კომპონენტები და Lanr1 და AnMan ალელების კანდიდატი გენების ექსპრესიის ნიმუშები იდენტიფიცირებული იქნა. Log2 შკალა წარმოადგენს log2 მნიშვნელობებს (ჯერადი ცვლილება) ინოკულირებულ (Colletotrichum lupini, შტამი Col-08, მიღებული ლუპინის მინდვრებიდან, ვიჟენიცა, პოლონეთი, 1999) და საკონტროლო (ფალო-ინოკულირებული) მცენარეებს შორის ერთსა და იმავე დროს. გაანალიზდა შემდეგი ვიწროფოთლოვანი ლუპინის ხაზები: 83A:476 (რეზისტენტული, ჰომოზიგოტური Lanr1 ალელის მატარებელი), Boregine (რეზისტენტული, გენეტიკური ფონი უცნობია), Mandelup (ზომიერად რეზისტენტული, ჰომოზიგოტური AnMan ალელის მატარებელი) და პოპულაცია 22660 (მგრძნობიარე).
გარდა ამისა, შეფასდა RNA-seq კანდიდატი გენების Lanr1 (TanjilG_05042) და AnMan (TanjilG_12861) ექსპრესიის პროფილები (სურ. 3). TanjilG_05042 გენმა მნიშვნელოვანი პასუხი (აქტივაცია) 83A:476-ზე მხოლოდ პირველ დროს (6 hpi) აჩვენა, ხოლო TanjilG_12861 მნიშვნელოვანი იყო მანდელუპში მხოლოდ ორ დროს: 6 hpi (დაუნ რეგულაცია) და 24 hpi (6 hpi). რეგულირებადი).
GO:0055114 „რედოქს პროცესის“ ტერმინში ყველაზე ზედმეტად გამოხატული გენები იყო ციტოქრომ P450 ცილებისა და პეროქსიდაზას კოდირების გენები (სურ. 4). 83A:476-დან 6 HPI-ზე იზოლირებული ნიმუშებისთვის, ინოკულირებულ და საკონტროლო მცენარეებს შორის, როგორც წესი, დაფიქსირდა მაქსიმალური ან მინიმალური log2 (ჯერადი ცვლილების) მნიშვნელობები (გენების 86.6%-ისთვის), რაც ხაზს უსვამს ამ გენოტიპის მაღალ რეაქციას ინოკულირებულ სქესზე. 83A:476-მა აჩვენა ყველაზე მნიშვნელოვანი GO: 0055114 DEG 6 hpi-ზე (503 გენი), ხოლო დანარჩენი ხაზები 48 hpi-ზე (Boregine, 31 გენი; Mandelup, 85 გენი; და Population 22660, 78 გენი)). GO:0055114 ოჯახის გენების უმეტესობაში დაფიქსირდა ვაქცინაციაზე ორი ტიპის რეაქცია (აქტივაცია და ინჰიბირება). საინტერესოა, რომ მანდელუპში 48 ცხენის ძალის მქონე ტერმინ GO: 0055114-ისთვის იდენტიფიცირებული DEG-ების 97.6%-მდე დაფიქსირდა. ეს დაკვირვებები მიუთითებს, რომ მნიშვნელოვნად მცირე მასშტაბის მიუხედავად (ანუ მუტირებული რედოქს გენების რაოდენობა, 85 503-ის წინააღმდეგ), მანდელუპის ანთრაკნოზზე დაგვიანებული ტრანსკრიპტომული რეაქციების ნიმუში მსგავსია 83A:476-ის ადრეული პასუხისა. ბორეგინსა და 22660 პოპულაციაში ეს კონვერგენცია უფრო დაბალია, შესაბამისად, 51.6% და 75.6%.
გამოვლინდა ბიოლოგიური პროცესის ტერმინის „GO:0055114 რედოქს პროცესი“ ძირითადი კომპონენტების ექსპრესიის ნიმუშები. Log2 შკალა წარმოადგენს log2 მნიშვნელობებს (ჯერად ცვლილებას) ინოკულირებულ (Colletotrichum lupini, შტამი Col-08, მიღებული ლუპინის მინდვრებიდან, ვიჟენიცა, პოლონეთი, 1999) და საკონტროლო (ფალო-ინოკულირებული) მცენარეებს შორის ერთსა და იმავე დროს. გაანალიზდა შემდეგი ვიწროფოთლოვანი ლუპინის ხაზები: 83A:476 (რეზისტენტული, ჰომოზიგოტური Lanr1 ალელის მატარებელი), ბორეგინი (რეზისტენტული, გენეტიკური ფონი უცნობია), მანდელუპი (ზომიერად რეზისტენტული, ჰომოზიგოტური AnMan ალელის მატარებელი) და პოპულაცია 22660 (მგრძნობიარე).
83A:476 C. lupini-ით (შტამი Col-08) ინოკულაციაზე ტრანსკრიპტომიული რეაქციები ასევე მოიცავდა GO:0015979 ტერმინ „ფოტოსინთეზს“ და სხვა დაკავშირებულ ბიოლოგიურ პროცესებს (სურ. 5) მიკუთვნებული გენების კოორდინირებულ გაჩუმებას. GO:0015979 DEG ნაკრები შეიცავდა 105 გენს, რომლებიც მნიშვნელოვნად იყო რეპრესირებული 6 hpi-ზე 83A:476-ზე. ამ ქვეჯგუფში, მანდელუპში 37 გენი ასევე დაქვეითებული იყო 48 HPI-ზე და 35 გენი იმავე დროის წერტილში 22660 პოპულაციაში, მათ შორის 19 DEG, რომლებიც საერთო იყო ორივე გენოტიპისთვის. GO: 0015979 ტერმინთან დაკავშირებული არცერთი DEG არ იყო მნიშვნელოვნად გააქტიურებული არცერთ კომბინაციაში (ხაზი x დრო).
გამოვლინდა ბიოლოგიური პროცესის ტერმინის „GO:0015979 ფოტოსინთეზის“ ძირითადი კომპონენტების ექსპრესიის ნიმუშები. Log2 შკალა წარმოადგენს log2 მნიშვნელობებს (ჯერად ცვლილებას) ინოკულირებულ (Colletotrichum lupini, შტამი Col-08, მიღებული ლუპინის მინდვრებიდან, ვიჟენიცა, პოლონეთი, 1999) და საკონტროლო (ფალო-ინოკულირებული) მცენარეებს შორის ერთსა და იმავე დროს. გაანალიზდა შემდეგი ვიწროფოთლოვანი ლუპინის ხაზები: 83A:476 (რეზისტენტული, ჰომოზიგოტური Lanr1 ალელის მატარებელი), ბორეგინი (რეზისტენტული, გენეტიკური ფონი უცნობია), მანდელუპი (ზომიერად რეზისტენტული, ჰომოზიგოტური AnMan ალელის მატარებელი) და პოპულაცია 22660 (მგრძნობიარე).
დიფერენციალური ექსპრესიის ანალიზის შედეგების საფუძველზე და სავარაუდოდ პათოგენური სოკოების წინააღმდეგ დამცავ რეაქციებში მონაწილეობის საფუძველზე, შვიდი გენის ეს ნაკრები შეირჩა ექსპრესიის პროფილების რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის რეალურ დროში PCR-ის გამოყენებით (დამატებითი ცხრილი S9).
სავარაუდო ცილოვანი გენი TanjilG_10657 მნიშვნელოვნად იყო ინდუცირებული ყველა შესწავლილ ხაზსა და დროის წერტილში საკონტროლო (მიმიკ) მცენარეებთან შედარებით (დამატებითი ცხრილები S10, S11). გარდა ამისა, TanjilG_10657-ის ექსპრესიის პროფილი ექსპერიმენტის მსვლელობისას ყველა ხაზისთვის მზარდი ტენდენციით გამოირჩეოდა. პოპულაცია 22660-მა აჩვენა TanjilG_10657-ის ყველაზე მაღალი მგრძნობელობა ინოკულაციის მიმართ 114-ჯერადი აქტივაციით და ყველაზე მაღალი ფარდობითი ექსპრესიის დონით (4.4 ± 0.4) 24 HPI-ზე (სურ. 6ა). PR10 LlR18A ცილოვანი გენი TanjilG_27015 ასევე ავლენდა აქტივაციას ყველა ხაზსა და დროის წერტილში, სტატისტიკურად მნიშვნელოვანი მონაცემების უმეტეს წერტილში (სურ. 6ბ). TanjilG_10657-ის მსგავსად, TanjilG_27015-ის ყველაზე მაღალი ფარდობითი ექსპრესიის დონე დაფიქსირდა 22660 ინოკულირებულ პოპულაციაში 24 HPI-ზე (19.5 ± 2.4). მჟავა ენდოქიტინაზას გენი TanjilG_04706 მნიშვნელოვნად მომატებული იყო ყველა ხაზში და ყველა დროის წერტილში, გარდა Boregine 6 hpi-სა (სურ. 6გ). ის ძლიერად იყო ინდუცირებული პირველ დროს (6 HPI) 83A:476-ზე (10.5-ჯერ) და ზომიერად გაიზარდა სხვა ხაზებში (6.6-7.5-ჯერ). ექსპერიმენტის დროს, TanjilG_04706-ის ექსპრესია მსგავს დონეზე დარჩა 83A:476-სა და Boregine-ში, ხოლო Mandelup-სა და პოპულაცია 22660-ში მნიშვნელოვნად გაიზარდა, მიაღწია შედარებით მაღალ მნიშვნელობებს (შესაბამისად, 5.9 ± 1.5 და 6.2 ± 1.5). ენდოგლუკან-1,3-β-გლუკოზიდაზას მსგავსმა გენმა TanjilG_23384 აჩვენა მაღალი აქტივაცია პირველ ორ დროს წერტილში (6 და 12 hpi) ყველა ხაზში, გარდა პოპულაცია 22660-სა (სურ. 6დ). TanjilG_23384-ის ყველაზე მაღალი ფარდობითი ექსპრესიის დონე დაფიქსირდა მეორე დროის წერტილში (12 hpi) Mandelup-ში (2.7 ± 0.3) და 83A:476-ში (1.5 ± 0.1). 24 HPI-ზე TanjilG_23384-ის ექსპრესია შედარებით დაბალი იყო ყველა შესწავლილ ხაზში (0.04 ± 0.009-დან 0.44 ± 0.12-მდე).
შერჩეული გენების (ag) ექსპრესიის პროფილები გამოვლინდა რაოდენობრივი პოლიმერაზული ჯაჭვური რეფლექსიის მეთოდით. ​​რიცხვები 6, 12 და 24 წარმოადგენს ვაქცინაციიდან რამდენიმე საათს. LanDExH7 და LanTUB6 გენები გამოყენებული იქნა ნორმალიზაციისთვის, ხოლო LanTUB6 - სერიებს შორის კალიბრაციისთვის. შეცდომის ზოლები წარმოადგენს სტანდარტულ გადახრას სამ ბიოლოგიურ რეპლიკატზე დაყრდნობით, რომელთაგან თითოეული წარმოადგენს სამი ტექნიკური რეპლიკაციების საშუალოს. ინოკულირებულ (Colletotrichum lupini, შტამი Col-08, მიღებული 1999 წელს პოლონეთის ქალაქ ვიერჟენიცაში ლუპინის მინდვრიდან) და საკონტროლო (სატესტო ინოკულირებული) მცენარეებს შორის ექსპრესიის დონეების სხვაობის სტატისტიკური მნიშვნელობა მონიშნულია მონაცემთა წერტილების ზემოთ (*P მნიშვნელობა < 0.05, **P მნიშვნელობა ≤ 0.01, ***P მნიშვნელობა ≤ 0.001). ინოკულირებულ (Colletotrichum lupini, შტამი Col-08, მიღებული 1999 წელს პოლონეთის ქალაქ ვიერჟენიცაში ლუპინის მინდვრიდან) და საკონტროლო (სატესტო ინოკულირებული) მცენარეებს შორის ექსპრესიის დონეების სხვაობის სტატისტიკური მნიშვნელობა მონიშნულია მონაცემთა წერტილების ზემოთ (*P მნიშვნელობა < 0.05, **P მნიშვნელობა ≤ 0.01, ***P მნიშვნელობა ≤ 0.001). Статистическая значитемость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, 1999 წ. ერთად პოლя люпина в Верженице, Польша) და კონტროლირებადი точкими данных (*მნიშვნელობა P <0,05, **მნიშვნელობა P ≤ 0,01, ***მნიშვნელობა P ≤ 0,001). სტატისტიკურად მნიშვნელოვანი განსხვავებები ექსპრესიის დონეებში ინოკულირებულ (Colletotrichum lupini, შტამი Col-08, მიღებული 1999 წელს ვიერჟენიცეში, პოლონეთი, ლუპინის მინდვრიდან) და საკონტროლო (ფალო-ინოკულირებული) მცენარეებს შორის აღინიშნება მონაცემთა წერტილების ზემოთ (*P მნიშვნელობა < 0.05, **P-მნიშვნელობა ≤ 0.01, ***P-მნიშვნელობა ≤ 0.001).接种 (Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数水平差异的统计学显着性标记在敼数0.05, **P 值≤ 0.01, ***P 值≤ 0.001).接种 (colletotrichum lupini), ფერი-08 株 ， 1999 წელი之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***0P. Статистически расте значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный со полей люпина в Верженице, Польша, 1999 წ.) отмечены над точкими данных (* მნიშვნელობა P < 0,05, ** P-მნიშვნელობა ≤ 0,01, ***P-მნიშვნელობა ≤ 0,001). სტატისტიკურად მნიშვნელოვანი განსხვავებები ექსპრესიის დონეებში ინოკულირებულ (Colletotrichum lupini, შტამი Col-08, მიღებული ლუპინის მინდვრებიდან ვერჟენიცეში, პოლონეთი, 1999 წელს) და საკონტროლო (ფალო-ინოკულირებული) მცენარეებს შორის აღინიშნება მონაცემთა წერტილების ზემოთ (*P მნიშვნელობა < 0.05, **P-მნიშვნელობა ≤ 0.01, ***P-მნიშვნელობა ≤ 0.001).გაანალიზებული NLL ხაზები იყო: 83A:476 (რეზისტენტული, ჰომოზიგოტური Lanr1 ალელის მატარებელი), Mandelup (ზომიერად რეზისტენტული, ჰომოზიგოტური AnMan ალელის მატარებელი), Boregine (რეზისტენტული, უცნობი გენეტიკური წარმომავლობა) და პოპულაცია 22660 (მგრძნობიარე).
Lanr1 ლოკუსში კანდიდატმა გენმა TanjilG_05042 მნიშვნელოვნად განსხვავებული ექსპრესიის ნიმუში აჩვენა RNA-seq კვლევებით მიღებული პროფილებისგან (სურ. 6e). ამ გენის მნიშვნელოვანი აქტივაცია დაფიქსირდა მანდელუპსა და 22660 პოპულაციაში (შესაბამისად, 39.7 და 11.7-ჯერ), რამაც გამოიწვია ექსპრესიის შედარებით მაღალი დონე (შესაბამისად, 1.4 ± 0.14 და 7.2 ± 1.3). 83A:476-მა ასევე გამოავლინა TanjilG_05042 გენის გარკვეული აწევა (3.8-ჯერამდე), თუმცა, მიღწეული ფარდობითი ექსპრესიის დონეები (0.044 ± 0.002) 30-ჯერ უფრო დაბალი იყო, ვიდრე მანდელუპსა და 22660 პოპულაციაში დაფიქსირებული. qPCR მეთოდით ანალიზმა აჩვენა მნიშვნელოვანი განსხვავებები გენოტიპებს შორის ექსპრესიის დონეებში იმიტირებულ (საკონტროლო) ვარიანტებში, რამაც 58-ჯერადი სხვაობა მიაღწია 22660 და 83A:476 პოპულაციებს შორის, ასევე 22660 და 22660 პოპულაციებს შორის. ორმაგი სხვაობა მიღწეული იქნა ბორეგინსა და მანდალუპს შორის.
AnMan ლოკუსში კანდიდატი გენი, TanjilG_12861, გააქტიურდა ვაქცინაციის საპასუხოდ 83A:476-სა და Mandelup-ში, ნეიტრალური იყო 22660 პოპულაციაში და დაქვეითებული იყო Boregine-ში (სურ. 6f). TanjilG_12861 გენის ფარდობითი ექსპრესია ყველაზე მაღალი იყო ინოკულირებულ 83A: 476-ში (0.14±0.01). 17.4 kDa I კლასის სითბური შოკის ცილის გენმა TanjilG_05080 HSP17.4 აჩვენა ფარდობითი ექსპრესიის უფრო დაბალი დონე ყველა შესწავლილ შტამსა და დროის წერტილში (სურ. 6g). ყველაზე მაღალი მნიშვნელობა დაფიქსირდა 24 HPI-ზე 22660 პოპულაციაში (0.14 ± 0.02, ვაქცინაციის საპასუხოდ რვაჯერ მეტი ზრდა).
გენის ექსპრესიის პროფილების შედარებამ (სურ. 7) გამოავლინა მაღალი კორელაცია TanjilG_10657-სა და ოთხ სხვა გენს შორის: TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.80) და TanjilG_04706 (r = 0.79). ასეთი შედეგები შეიძლება მიუთითებდეს ამ გენების კორეგულაციაზე თავდაცვითი რეაქციების დროს. TanjilG_12861 და TanjilG_23384 გენებმა აჩვენეს განსხვავებული ექსპრესიის პროფილები პირსონის კორელაციის კოეფიციენტის უფრო დაბალი მნიშვნელობებით (შესაბამისად, 0.08-დან 0.43-მდე და -0.19-დან 0.28-მდე) სხვა გენებთან შედარებით.
გენის ექსპრესიის პროფილებს შორის კორელაციები აღმოჩენილი იქნა რაოდენობრივი პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის (PCR) გამოყენებით. გაანალიზდა შემდეგი ვიწროფოთლოვანი ლუპინის ხაზები: 83A:476 (რეზისტენტული, ჰომოზიგოტური Lanr1 ალელის მატარებელი), მანდელუპი (ზომიერად რეზისტენტული, ჰომოზიგოტური AnMan ალელის მატარებელი), ბორეგინი (რეზისტენტული, გენეტიკური ფონი უცნობია) და პოპულაცია 22660 (მგრძნობიარე). გამოითვალა სამი დროის წერტილი (ინოკულაციიდან 6, 12 და 24 საათის შემდეგ), მათ შორის ინოკულირებული (Colletotrichum lupini, შტამი Col-08, მიღებული ლუპინის მინდვრებიდან ვიერჟენიცეში, პოლონეთი, 1999 წელს) და საკონტროლო (ფალო-ინოკულირებული) მცენარეები. შკალა აჩვენებს პირსონის კორელაციის კოეფიციენტის მნიშვნელობას.
ინჩზე 6 ცხენის ძალის მქონე მიღებულ მონაცემებზე დაყრდნობით, WGCNA ჩატარდა 9981 DEG-ზე, რომელიც იდენტიფიცირებული იყო ინოკულირებული და საკონტროლო მცენარეების შედარებით, ადრეული თავდაცვითი რეაქციების ფოკუსირების მიზნით (დამატებითი ცხრილი S12). აღმოჩენილი იქნა ოცდაორი გენური მოდული (კლასტერი) გენოტიპებსა და ექსპერიმენტულ ვარიანტებს შორის კორელირებული (დადებითი ან უარყოფითი) ექსპრესიის პროფილებით. საშუალოდ, გენის ექსპრესიის დონეები კლებადობით მიმდინარეობდა 83A:476 > მანდელუპი > ბორეგინი > პოპულაცია 22660 (თუმცა, ორივე ვარიანტში ეს ტენდენცია უფრო ძლიერი იყო საკონტროლო მცენარეებში). საშუალოდ, გენის ექსპრესიის დონეები კლებადობით მიმდინარეობდა 83A:476 > მანდელუპი > ბორეგინი > პოპულაცია 22660 (თუმცა, ორივე ვარიანტში ეს ტენდენცია უფრო ძლიერი იყო საკონტროლო მცენარეებში). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (в обоих варијантах, однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). საშუალოდ, გენის ექსპრესიის დონე შემდეგი თანმიმდევრობით შემცირდა: 83A:476 > მანდელუპი > ბორეგინი > პოპულაცია 22660 (თუმცა, ორივე ვარიანტში ეს ტენდენცია უფრო ძლიერი იყო საკონტროლო მცენარეებში).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > მოსახლეობა 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> მოსახლეობა 22660 的 顺序 下降 （， 下降 （， 在在 在 植物 中 更）………………….. In среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (однако в обоих варијантах эта тенденция была сильнее у контрольных растений). საშუალოდ, გენის ექსპრესიის დონე შემცირდა 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 სერიაში (თუმცა, ორივე ვარიანტში ეს ტენდენცია უფრო ძლიერი იყო საკონტროლო მცენარეებში).ვაქცინაციამ გამოიწვია გენის ექსპრესიის ამაღლება, განსაკუთრებით მოდულებში 18, 19, 14, 6 და 1 (ეფექტის კლებადობით), უარყოფითი რეგულირება (მაგ. მოდულები 9 და 20) ან ნეიტრალური ეფექტები (მაგ. მოდულები 11, 22, 8 და 13). GO ტერმინების გამდიდრების ანალიზმა (დამატებითი ცხრილი S13) გამოავლინა „GO: 0006952 დამცავი რეაქციები“ ინოკულირებული მოდულისთვის (18) მაქსიმალური აქტივაციით, მათ შორის qPCR-ით გაანალიზებული გენები (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 და TanjilG_27015), ასევე ინოკულირებული ფოტოსინთეზის მრავალი ყველაზე დათრგუნული მოდული (9). მოდული 18-ის კონცენტრატორი (სურ. 8) იდენტიფიცირებული იქნა, როგორც TanjilG_26536 გენი, რომელიც აკოდირებს PR-10-ის მსგავს LlR18B ცილას, ხოლო მოდული 9-ის კონცენტრატორი იდენტიფიცირებული იქნა, როგორც TanjilG_28955 გენი, რომელიც აკოდირებს ფოტოსისტემა II-ის PsbQ ცილას. ანთრაქნოზისადმი რეზისტენტობის კანდიდატი გენი Lanr1, TanjilG_05042, აღმოჩნდა მოდულ 22-ში (სურ. 9) და ასოცირდება ტერმინებთან „GO:0044260 უჯრედული მაკრომოლეკულური მეტაბოლური პროცესები“ და „GO:0006355 ტრანსკრიფციული რეგულაცია, დნმ-ის შაბლონირება“, რომლებიც შეიცავს TanjilG_01212 კერას. გენი აკოდირებს სითბური სტრესის ტრანსკრიფციის ფაქტორ A-4a-ს (HSFA4a).
ბიოლოგიური პროცესის ტერმინების ჭარბად წარმოდგენილ მოდულების გენების თანაექსპრესიის შეწონილი ქსელური ანალიზი „GO: 0006952 თავდაცვის პასუხები“. ლიგაცია გამარტივდა qPCR-ით ანალიზირებული ოთხი გენის (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 და TanjilG_27015) გამოსავლენად.
ანთრაქნოზის მიმართ რეზისტენტობის კანდიდატი გენის Lanr1 TanjilG_05042 შემცველი მოდულის გენის თანაექსპრესიის შეწონილი ქსელური ანალიზი. ლიგაცია გამარტივდა TanjilG_05042 გენის და ცენტრალური TanjilG_01212 გენის იზოლირებისთვის.
ავსტრალიაში ჩატარებულმა ანტრაქნოზისადმი რეზისტენტობის სკრინინგმა აჩვენა, რომ ადრე გამოშვებული ჯიშების უმეტესობა მგრძნობიარე იყო; Kalya, Coromup და Mandelup აღწერილია, როგორც ზომიერად რეზისტენტული, ხოლო Wonga, Tanjil და 83A:476 აღწერილია, როგორც მაღალრეზისტენტული26,27,31. ჰქონდათ ერთი და იგივე რეზისტენტობის ალელი, დანიშნული Lanr1, ხოლო Coromup-სა და Mandelup-ს ჰქონდათ განსხვავებული ალელი, დანიშნული AnMan10, 26, 39, ხოლო Kalya-მ სხვა ალელი, Lanr2 გადასცა. გერმანიაში ანტრაქნოზისადმი რეზისტენტობის სკრინინგის შედეგად გამოვლინდა რეზისტენტული ხაზი Bo7212 Lanr1-ისგან განსხვავებული კანდიდატი ალელით, დანიშნული LanrBo36.
ჩვენმა კვლევამ გამოავლინა Lanr1 ალელის ძალიან დაბალი სიხშირე (დაახლოებით 6%) შემოწმებულ გერმპლაზმაში. ეს დაკვირვება თანხვედრაშია აღმოსავლეთ ევროპის გერმპლაზმის სკრინინგის შედეგებთან Anseq3 და Anseq4 მარკერების გამოყენებით, რომლებმაც აჩვენა, რომ Lanr1 ალელი მხოლოდ ორ ბელორუსულ ხაზშია წარმოდგენილი. ეს იმაზე მიუთითებს, რომ Lanr1 ალელი ჯერ კიდევ არ გამოიყენება ფართოდ ადგილობრივი სელექციის პროგრამების მიერ, ავსტრალიისგან განსხვავებით, სადაც ის მარკერებით დახმარებული სელექციის ერთ-ერთი მთავარი ალელია. ეს შეიძლება გამოწვეული იყოს Lanr1 ალელის მიერ ევროპულ საველე პირობებში ავსტრალიურ ანგარიშთან შედარებით რეზისტენტობის დაბალი დონით. გარდა ამისა, ავსტრალიაში მაღალი ნალექიანობის მქონე რაიონებში ანტრაკნოზის კვლევებმა აჩვენა, რომ Lanr1 ალელის მიერ განპირობებული რეზისტენტობის რეაქციები შეიძლება არ იყოს ეფექტური ამინდის პირობებში, რომლებიც ხელს უწყობენ პათოგენის ზრდას და სწრაფ განვითარებას19,42. სინამდვილეში, ამ კვლევაში ანტრაკნოზის ზოგიერთი სიმპტომი ასევე დაფიქსირდა Lanr1 ალელის მატარებელ გენოტიპებში, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ რეზისტენტობა შეიძლება გაქრეს C. lupini-ს განვითარებისთვის ოპტიმალურ პირობებში. გარდა ამისა, შესაძლებელია Anseq3 და Anseq4 მარკერების არსებობის ცრუ დადებითი ინტერპრეტაციები, რომლებიც Lanr1 ლოკუსიდან დაახლოებით 1 სმ-ით არის დაშორებული28,30,43.
ჩვენმა კვლევამ აჩვენა, რომ Lanr1 ალელის მატარებელი 83A:476, C. lupini-ს ინოკულაციაზე რეაგირებდა ფართომასშტაბიანი ტრანსკრიპტომის რეპროგრამირებით პირველ გაანალიზებულ დროს (6 hpi), ხოლო AnMan ალელის მატარებელ მანდელუპში ტრანსკრიპტომური რეაქციები გაცილებით გვიან დაფიქსირდა (24-დან 48 hp-მდე). დაცვითი რეაქციების ეს დროითი ვარიაციები დაკავშირებულია დაავადების სიმპტომების განსხვავებებთან, რაც ხაზს უსვამს პათოგენის ადრეული ამოცნობის მნიშვნელობას რეზისტენტობაზე წარმატებული რეაგირებისთვის. მცენარეული ქსოვილის დასაინფიცირებლად, ჯილეხის სპორებმა უნდა გაიარონ განვითარების რამდენიმე ეტაპი მასპინძლის ზედაპირზე, მათ შორის აღმოცენება, უჯრედების დაყოფა და აპრესორიუმის ფორმირება. დანამატი არის ინფექციური სტრუქტურა, რომელიც ემაგრება მასპინძლის ზედაპირს და ხელს უწყობს შეღწევას მასპინძლის ქსოვილებში. ამრიგად, ბარდის ექსტრაქტში C. gloeosporioides-ის სპორებმა აჩვენეს ბირთვის პირველი დაყოფა 75-90 წუთიანი ინკუბაციის შემდეგ, ჩანასახოვანი მილის ფორმირება 90-120 წუთის შემდეგ და სუპრესია 4 საათის შემდეგ. მანგოს C. gloeosporioides-მა 3-საათიანი ინკუბაციის შემდეგ კონიდიალური აღმოცენების 40%-ზე მეტი მაჩვენებელი აჩვენა, ხოლო 4 საათის შემდეგ - აპრესორების დაახლოებით 20%. C. gloeosporioides-ის ვირულენტობასთან ასოცირებულმა CAP20 გენმა ავოკადოს ზედაპირის ცვილში 3.5-საათიანი ინკუბაციის შემდეგ, CAP20 ცილის მაღალი კონცენტრაციით 4 საათი 46 წუთის შემდეგ, ეპიფიტების წარმომქმნელ კონიდებში ტრანსკრიფციული აქტივობა აჩვენა. ანალოგიურად, C. trifolii-ში მელანინის ბიოსინთეზის გენების აქტივობა ინდუცირებული იყო 2-საათიანი ინკუბაციის დროს, რასაც მოჰყვა აპრესორიუმის ფორმირება 1 საათის შემდეგ. ფოთლის ქსოვილების კვლევებმა აჩვენა, რომ C. acutatum-ით დათესილ მარწყვს პირველი სუპრესია აქვს 8 hpi-ზე, ხოლო C. coccodes-ით დათესილ პომიდორს - 4 hpi-ზე48,49. ეს დიდწილად შეესაბამება Colletotrichum spp.-ის ინფექციური პროცესის დროის მასშტაბს. 83A:476-ზე სწრაფი თავდაცვითი რეაქციები მიუთითებს მცენარის რეზისტენტობისა და ეფექტორ-გამშვები იმუნიტეტის (ETI) გენების მონაწილეობაზე ამ ხაზში, მაშინ როდესაც მანდელუპის დაგვიანებული რეაქციები ადასტურებს მიკროასოცირებული მოლეკულური ნიმუშით გამოწვეული იმუნიტეტის (MTI) ჰიპოთეზას 50. 83A:476-სა და მანდელუპზე ადრეული რეაქციები. დაგვიანებულ პასუხში აღმავალი ან დაქვეითებული გენებს შორის ნაწილობრივი გადაფარვა ასევე ადასტურებს ამ კონცეფციას, რადგან ETI ხშირად განიხილება, როგორც დაჩქარებული და გაძლიერებული MTI პასუხი, რომელიც კულმინაციას აღწევს დაპროგრამებული უჯრედის სიკვდილით ინფექციის ადგილზე, რაც ცნობილია როგორც ანაფილაქსიური შოკი 51,52.
გენების უმეტესობა, რომლებიც მიეწერება ჭარბად წარმოდგენილ ტერმინს Gene Ontology GO:0006952 „დამცავი პასუხი“, წარმოადგენს სტრესით გამოწვეული უზმოზე მოქმედი შეტყობინების ცილის 22 (SAM22-ის მსგავსი) და შვიდი ძირითადი ლატექსის ცილის მსგავსი ცილის (MLP) 11 ჰომოლოგს. მსგავსმა ცილებმა 31, 34, 43 და 423-მა აჩვენეს თანმიმდევრობის მსგავსება. SAM22-ის მსგავსმა გენებმა აჩვენეს მნიშვნელოვანი აქტივაცია, რომელიც უფრო დიდხანს გაგრძელდა, რაც აჩვენებდა ანთრაქნოზის მიმართ რეზისტენტობის გაზრდილ დონეს (83A:476 და Boregine). თუმცა, MLP-ის მსგავსი გენები დაქვეითებული იყო მხოლოდ კანდიდატი რეზისტენტობის ალელის მატარებელ ხაზებში (83A:476/Lanr1 6 hpi-ზე და Mandelup/AnMan 24 hpi-ზე). უნდა აღინიშნოს, რომ ყველა იდენტიფიცირებული SAM22-ის მსგავსი ჰომოლოგი წარმოიშვა დაახლოებით 105 კბ-ის სიგრძის გენების კლასტერიდან, ხოლო MLP-ის მსგავსი გენები წარმოიშვა გენომის ცალკეული რეგიონებიდან. ასეთი SAM22-ის მსგავსი გენების კოორდინირებული აქტივაცია ასევე აღმოჩნდა Diaporthetoxica-ს ინოკულაციის მიმართ NLL-ის რეზისტენტობის ჩვენს წინა კვლევაში, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ ისინი ჩართულნი არიან თავდაცვითი პასუხის ჰორიზონტალურ კომპონენტებში. ამ დასკვნას ასევე ადასტურებს SAM22-ის მსგავსი გენების დადებითი პასუხის შესახებ ცნობები დაზიანებაზე ან სალიცილის მჟავით, სოკოვანი ინდუქტორებით ან წყალბადის ზეჟანგით მკურნალობაზე.
MLP-ის მსგავსი გენები რეაგირებენ სხვადასხვა აბიოტურ და ბიოტურ სტრესებზე, მათ შორის ბაქტერიულ, ვირუსულ და პათოგენურ სოკოვან ინფექციებზე მრავალ მცენარეთა სახეობაში55. მცენარეებსა და პათოგენებს შორის გარკვეული ურთიერთქმედების რეაქციის მიმართულებები მერყეობდა ძლიერი ზრდიდან (ანუ, ბამბის Verticillium dahliae-თი დაინფიცირების დროს) მნიშვნელოვან შემცირებამდე (ანუ, ვაშლის ხის Alternaria spp.-ით დაინფიცირების შემდეგ)56,57. MLP-ის მსგავსი 423 გენის მნიშვნელოვანი დაქვეითება დაფიქსირდა F. niger ინფექციისგან ავოკადოს დაცვის დროს და ვაშლის ხის ინფექციის დროს. Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola და Alternaria alternata ვაშლის პათოტიპებია58,59. გარდა ამისა, ვაშლის კალიებს, რომლებიც ზედმეტად გამოხატავენ MLP-ის მსგავს 423 გენს, ჰქონდათ რეზისტენტობასთან ასოცირებული გენების უფრო დაბალი ექსპრესია და უფრო მგრძნობიარენი იყვნენ სოკოვანი ინფექციის მიმართ59. Fusarium oxysporum f-ის შემდეგ, MLP-ის მსგავსი 423 გენი ასევე დათრგუნული იყო რეზისტენტულ ლობიოს გერმპლაზმაში. cn. ლობიოს ინფექცია 60.
ჩვენს RNA-seq კვლევაში იდენტიფიცირებული PR-10 ოჯახის სხვა წევრები იყვნენ LlR18A და LlR18B გენები ზერეგულაციის საპასუხოდ, ასევე ლიპიდური გადამცემი ცილის DIR1 ზერეგულირებული (1 გენი) ან დაქვეითებული (3 გენი) გენი. გარდა ამისა, WGCNA ამ მოდულის ცენტრად LlR18B გენს ხაზს უსვამს, რომელიც ვაქცინაციის მიმართ მაღალი მგრძნობელობით გამოირჩევა და რამდენიმე დამცავი რეაქციის გენს ატარებს. LlR18A და LlR18B გენები ინდუცირებული იყო ყვითელ ლუპინის ფოთლებში პათოგენური ბაქტერიების საპასუხოდ, ასევე არალეგალური ლიპოპროტეინების ღეროებში D. toxica-ს ინოკულაციის შემდეგ, ხოლო ამ გენების ბრინჯის ჰომოლოგი, RSOsPR10, სწრაფად ინდუცირებული იყო სოკოვანი ინფექციით, რომელიც სავარაუდოდ ჩართული იყო იასმონის მჟავის სასიგნალო გზაში53,61, 62. DIR1 გენი აკოდირებს არასპეციფიკურ ლიპიდურ გადამტან ცილებს, რომლებიც აუცილებელია სისტემური შეძენილი რეზისტენტობის (SAR) დაწყებისთვის. დამცავი რეაქციების განვითარებასთან ერთად, DIR1 ცილა ინფექციის კერიდან ფლოემის მეშვეობით გადადის, რათა შორეულ ორგანოებში SAR გამოიწვიოს. საინტერესოა, რომ TanjilG_02313 DIR1 გენი მნიშვნელოვნად იყო ინდუცირებული პირველ ეტაპზე 84A:476 და 22660 პოპულაციაში, მაგრამ ანთრაქნოზის მიმართ რეზისტენტობა წარმატებით განვითარდა მხოლოდ 84A:476 ხაზში. ეს შეიძლება მიუთითებდეს DIR1 გენის გარკვეულ სუბფუნქციალიზაციაზე არალეგალური ლიმფოიდური ლეიკემიის დროს, რადგან დარჩენილი სამი ჰომოლოგი რეაგირებდა ინოკულაციაზე მხოლოდ 83A:476 ხაზში 6 hpi-ზე და ეს პასუხი ქვევით იყო მიმართული.
ჩვენს კვლევაში, „GO:0055114 რედოქს პროცესი“-ს სახელით ცნობილი ბიოლოგიური პროცესის შესაბამისი ყველაზე გავრცელებული კომპონენტები იყო ციტოქრომ P450 ცილა, პეროქსიდაზა, ლინოლის მჟავა 9S-/13S-ლიპოქსიგენაზა და 1-ამინოციკლოპროპან-1-კარბოქსილის მჟავა ოქსიდაზა. გარდა ამისა, ჩვენი WGCNA HSFA4a-ს ჰომოლოგს განსაზღვრავს, როგორც ჰაბის მატარებელ მოდულებს, როგორიცაა Lanr1 რეზისტენტობის გენის კანდიდატი TanjilG_05042. HSFA4a მცენარეებში ბირთვული ტრანსკრიფციის რედოქს-დამოკიდებული რეგულირების კომპონენტია.
ციტოქრომ P450 ცილები წარმოადგენენ ოქსიდორედუქტაზებს, რომლებიც ახდენენ NADPH-ის და/ან O2-დამოკიდებული ჰიდროქსილირების რეაქციების კატალიზებას პირველად და მეორად მეტაბოლიზმში, მათ შორის ქსენობიოტიკების მეტაბოლიზმში, ასევე ჰორმონების, ცხიმოვანი მჟავების, სტეროლების, უჯრედის კედლის კომპონენტების, ბიოპოლიმერების და დამცავი ნაერთების ბიოსინთეზში 69. ჩვენს კვლევაში, მცენარეთა ციტოქრომ P450 ფუნქციის ცვალებადობა შემცირდა -10.6 log2-დან (ჯერადი ცვლილება) 5.7-მდე შეცვლილი ჰომოლოგების დიდი რაოდენობის (37) და კონკრეტულ გენებს შორის რეაქციის ნიმუშების განსხვავებების გამო, რაც ასახავს აღმავალი გადახედვის ტენდენციას. ასეთ დიდ ცილოვან სუპეროჯახში NLL გენების სავარაუდო ბიოლოგიური ფუნქციის გასარკვევად მხოლოდ RNA-seq მონაცემების გამოყენება ძალიან სპეკულაციური იქნებოდა. თუმცა, აღსანიშნავია, რომ ზოგიერთი ციტოქრომ P450 გენი ასოცირდება პათოგენური სოკოების ან ბაქტერიების მიმართ გაზრდილ რეზისტენტობასთან, მათ შორის ალერგიულ რეაქციებში წვლილთან 69,70,71.
III კლასის პეროქსიდაზები მრავალფუნქციური მცენარეული ფერმენტებია, რომლებიც მონაწილეობენ მეტაბოლური პროცესების ფართო სპექტრში მცენარის ზრდისა და განვითარების დროს, ასევე გარემო სტრესებზე, როგორიცაა მარილიანობა, გვალვა, მაღალი სინათლის ინტენსივობა და პათოგენების შეტევა, საპასუხოდ72. პეროქსიდაზები მონაწილეობენ მცენარეთა რამდენიმე სახეობის ურთიერთქმედებაში Anthracis-თან, მათ შორის Stylosanthes humilis-თან და C. gloeosporioides-თან, Lens culinaris-თან და C. truncatum-თან, Phaseolus vulgaris-თან და C. lindemuthianum-თან, Cucumis sativus-თან და C. lagenarium-თან73,74,75,76. რეაქცია ძალიან სწრაფია, ზოგჯერ 4 HPI-ზეც კი, სანამ სოკო მცენარის ქსოვილში შეაღწევს73. პეროქსიდაზას გენი ასევე რეაგირებს D. toxica NLL-ის ინოკულაციაზე. ჟანგვითი აფეთქების რეგულირების ან ჟანგვითი სტრესის აღმოფხვრის ტიპური ფუნქციების გარდა, პეროქსიდაზებს შეუძლიათ ხელი შეუშალონ პათოგენების ზრდას უჯრედის კედლის გამაგრების ფიზიკური ბარიერების შექმნით ლიგნიფიკაციის, ქვეერთეულის ან სპეციფიკური ნაერთების ჯვარედინი შეკავშირების დროს. ეს ფუნქცია in silico შეიძლება მივაწეროთ TanjilG_03329 გენს, რომელიც აკოდირებს სავარაუდო ლიგნინის წარმომქმნელ ანიონ პეროქსიდაზას, რომელიც ჩვენს კვლევაში მნიშვნელოვნად მომატებული იყო 83A:476 რეზისტენტულ ხაზში 6 HPI-ზე, მაგრამ არა სხვა შტამებსა და დროის წერტილებში, რომლებმაც არ გამოხატეს რეაგირება.
ლინოლის მჟავას 9S-/13S-ლიპოქსიგენაზა ლიპიდური ბიოსინთეზის ჟანგვითი გზის პირველი საფეხურია78. ამ გზის პროდუქტებს მცენარეთა დაცვაში მრავალი ფუნქცია აქვთ, მათ შორის უჯრედის კედლის გაძლიერება კალოზისა და პექტინის დეპოზიტების წარმოქმნით და ჟანგვითი სტრესის რეგულირება რეაქტიული ჟანგბადის სახეობების წარმოქმნით79,80,81,82,83. ამ კვლევაში, ლინოლის მჟავას 9S-/13S-ლიპოქსიგენაზას ექსპრესია შეიცვალა ყველა შტამში, მაგრამ მგრძნობიარე პოპულაციაში 22660, ზერეგულაცია ჭარბობდა სხვადასხვა დროს, ხოლო რეზისტენტული Lanr1-ის და AnMan ალელის მატარებელ შტამებში, ის ხაზს უსვამს ოქსილიპინის ფენის დივერსიფიკაციას ამ გენოტიპებს შორის დამცავი ჯილეხის რეაქციებში.
ლუპინით ინოკულაციისას 1-ამინოციკლოპროპან-1-კარბოქსილატ ოქსიდაზას (ACO) ჰომოლოგი მნიშვნელოვნად ამაღლებული (9 გენი) ან დაქვეითებული (2 გენი) იყო. ორი გამონაკლისის გარდა, ყველა ეს რეაქცია მოხდა 6 hp-ზე 83A:476-ზე. ACO ცილებით განპირობებული ფერმენტული რეაქცია ეთილენის წარმოების სიჩქარის შემზღუდველი ეტაპია და შესაბამისად, მკაცრად რეგულირდება84. ეთილენი არის მცენარეული ჰორმონი, რომელიც მრავალფეროვან როლს ასრულებს მცენარის განვითარების რეგულირებასა და აბიოტურ და ბიოტურ სტრესულ პირობებზე რეაგირებაში. ACO ტრანსკრიფციის ინდუქცია და ეთილენის სასიგნალო გზის გააქტიურება მონაწილეობს ბრინჯის ჰემიბიოტროფული სოკო oryzae oryzae-ს მიმართ რეაქტიული ჟანგბადის სახეობებისა და ფიტოალექსინების წარმოების რეგულირებით. M. oryzae-სა და C. lupini-ს შორის აღმოჩენილი ძალიან მსგავსი ფოთლის ინფექციის პროცესი88,89, ამ კვლევაში მოხსენიებული 83A:476 ხაზის ACO ჰომოლოგების მნიშვნელოვანი მატების ფონზე, ცვლის NLL ანთრაქნოზის მიმართ ეთილენის რეზისტენტობის მოლეკულურ გზებში სიგნალიზაციის ცენტრალურ საფეხურად მინიჭების შესაძლებლობას.
ამ კვლევაში, ფოტოსინთეზთან დაკავშირებული მრავალი გენის ფართომასშტაბიანი სუპრესია დაფიქსირდა 83A:476-ში 6 hpi-ზე და მანდელუპსა და 22660 პოპულაციაში 48 hpi-ზე. ამ ცვლილებების მასშტაბი და პროგრესირება დონის პროპორციულია. ამ ექსპერიმენტში ანთრაქნოზის მიმართ რეზისტენტობა დაფიქსირდა. ბოლო დროს, ფოტოსინთეზთან დაკავშირებული ტრანსკრიპტების ძლიერი და ადრეული რეპრესია დაფიქსირდა მცენარე-პათოგენის ურთიერთქმედების რამდენიმე მოდელში, მათ შორის პათოგენურ ბაქტერიებსა და სოკოებში. ინფექციაზე საპასუხოდ ფოტოსინთეზთან დაკავშირებული გენების დაჩქარებულმა (ზოგიერთ ურთიერთქმედებაში 2 HPI-დან) და გლობალურმა სუპრესიამ შეიძლება გამოიწვიოს მცენარის იმუნიტეტი რეაქტიული ჟანგბადის სახეობების განლაგებისა და სალიცილის მჟავას გზასთან მათი ურთიერთქმედების საფუძველზე ალერგიული რეაქციების შუამავლობისთვის 90,94.
დასკვნის სახით, ყველაზე რეზისტენტული შტოსთვის შემოთავაზებული თავდაცვითი რეაგირების მექანიზმები (83A:476) მოიცავს პათოგენის სწრაფ ამოცნობას R გენის მიერ (სავარაუდოდ TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) და ალერგიულ რეაქციაზე განპირობებულ სალიცილის მჟავასა და ეთილენის სიგნალიზაციას, რასაც მოჰყვება გრძელვადიანი SAR-ის დამყარება. მოქმედებას მხარს უჭერს DIR-1 ცილა. უნდა აღინიშნოს, რომ C. lupini ინფექციის ბიოტროფული პერიოდი ძალიან მოკლეა (დაახლოებით 2 დღე), რასაც მოჰყვება ნეკროზული ზრდა95. ამ ეტაპებს შორის გადასვლა შეიძლება დაკავშირებული იყოს ნეკროზთან და ეთილენით ინდუცირებადი ცილების ექსპრესიასთან, რომლებიც მასპინძელ მცენარეებში ჰიპერმგრძნობელობის რეაქციების ტრიგერებად მოქმედებენ. ამიტომ, C. lupini-ს ბიოტროფულ სტადიაზე წარმატებული დაჭერის დროის ფანჯარა ძალიან ვიწროა. 83A:476-ში 6 hpi-ზე დაფიქსირებული რედოქსთან და ფოტოსინთეზთან დაკავშირებული გენების რეპროგრამირება შეესაბამება სოკოვანი ჰიფების პროგრესირებას და ბიოტროფულ სტადიაზე წარმატებული დამცავი პასუხის განვითარებას აუწყებს. მანდელუპისა და 22660 პოპულაციის ტრანსკრიპტომიური რეაქციები შესაძლოა ძალიან დაგვიანებული იყოს სოკოს ნეკროზულ ზრდაზე გადასვლამდე დასაჭერად, თუმცა, მანდელუპი შესაძლოა უფრო ეფექტური იყოს, ვიდრე 22660 პოპულაცია, რადგან PR-10 ცილის შედარებით სწრაფი რეგულაცია ხელს უწყობს ჰორიზონტალურ რეზისტენტობას.
კანონიკური R გენით განპირობებული ETI, როგორც ჩანს, ლობიოს ანტრაქნოზის მიმართ რეზისტენტობის საერთო მექანიზმს წარმოადგენს. ამგვარად, მოდელურ პარკოსან მცენარე Medicago truncatula-ში ანტრაქნოზის მიმართ რეზისტენტობას RCT1 გენი იძლევა, რომელიც TIR-NBS-LRR97 მცენარის R გენის კლასის წევრია. ეს გენი ასევე იონჯაში ანტრაქნოზის მიმართ ფართო სპექტრის რეზისტენტობას ანიჭებს მგრძნობიარე მცენარეებში გადატანის შემდეგ. ჩვეულებრივ ლობიოში (P. vulgaris) დღემდე ორ ათეულზე მეტი ანტრაქნოზის მიმართ რეზისტენტობის გენი იქნა აღმოჩენილი. ამ გენების ნაწილი გვხვდება კანონიკური R გენების არმქონე რეგიონებში, თუმცა ბევრი სხვა ქრომოსომების კიდეებზე მდებარეობს, რომლებიც NBS-LRR გენების კლასტერს ატარებენ, მათ შორის TIR-NBS-LRRs99. გენომის მასშტაბით ჩატარებულმა SSR კვლევამ ასევე დაადასტურა NBS-LRR გენის კავშირი ანტრაქნოზის მიმართ რეზისტენტობასთან ჩვეულებრივ ლობიოში. კანონიკური R გენი ასევე აღმოჩნდა თეთრ ლუპინ 101-ში ანთრაქნოზის მიმართ რეზისტენტობის ძირითადი ლოკუსის მატარებელ გენომურ რეგიონში.
ჩვენი კვლევა აჩვენებს, რომ მცენარის ინფექციის ადრეულ ეტაპზე (სასურველია არაუგვიანეს 12 hpi-ისა) გააქტიურებული დაუყოვნებელი რეზისტენტობის რეაქცია ეფექტურად იცავს ვიწროფოთლოვან ლუპინს პათოგენური სოკოს, Collelotrichum lupini-ს მიერ გამოწვეული ანტრაქნოზისგან. მაღალი გამტარუნარიანობის სეკვენირების გამოყენებით, ჩვენ ვაჩვენეთ ანტრაქნოზის რეზისტენტობის გენების დიფერენციალური ექსპრესიის პროფილები არალეგალური ლიმფოიდური ...
ანთრაქნოზის მარკერების სკრინინგისთვის გამოყენებული 215 NLL ხაზი შედგებოდა 74 კულტივარისგან, შეჯვარებით ან სელექციით მიღებული 60 ხაზისგან, 5 მუტანტისგან და 76 ველური ან ორიგინალური გერმპლაზმისგან. ხაზები მოდიოდა 17 ქვეყნიდან, ძირითადად პოლონეთიდან (58), ესპანეთიდან (47), გერმანიიდან (27), ავსტრალიიდან (26), რუსეთიდან (19), ბელორუსიიდან (7), იტალიიდან (5) და სხვა ხაზებიდან 10 ქვეყნიდან. ნაკრები ასევე მოიცავს რეზისტენტულ ხაზებს: 83A:476, Tanjil, Wonga, Lanr1 ალელის მატარებელი და Mandelup, AnMan ალელის მატარებელი. ხაზები მიღებულია ევროპის ლუპინის გენეტიკური რესურსების მონაცემთა ბაზიდან, რომელსაც აწარმოებს Poznań Plant Breeding Ltd., ვიატროვო, პოლონეთი (დამატებითი ცხრილი S1).
მცენარეები გაიზარდა კონტროლირებად პირობებში (ფოტოპერიოდის ხანგრძლივობა 16 საათი, ტემპერატურა 25°C დღის განმავლობაში და 18°C ​​ღამით). გაანალიზდა ორი ბიოლოგიური რეპლიკატი. დნმ იზოლირებული იქნა სამი კვირის ფოთლებიდან DNeasy Plant Mini Kit-ის (Qiagen, Hilden, გერმანია) გამოყენებით პროტოკოლის მიხედვით. იზოლირებული დნმ-ის ხარისხი და კონცენტრაცია შეფასდა სპექტროფოტომეტრიული მეთოდებით (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, აშშ). გაანალიზდა ანტრაქნოზის მიმართ რეზისტენტობის გენ AnMan-ის აღმნიშვნელი AnMan მარკერი (მიღებული cv. Mandelup-დან) და Lanr1 გენის (მიღებული cv. Tanjil-დან) გვერდით მდებარე მარკერები Anseq3 და Anseq4 11,26,28. რეზისტენტული ალელის ჰომოზიგოტები შეფასდა როგორც „1“, მგრძნობიარე - როგორც „0“, ხოლო ჰეტეროზიგოტები - როგორც 0.5.
AnManM1, AnSeq3 და AnSeq4 მარკერების სკრინინგის შედეგებისა და საბოლოო შემდგომი ექსპერიმენტებისთვის თესლის ხელმისაწვდომობის საფუძველზე, ანტრაქნოზის მიმართ რეზისტენტობის ფენოტიპირებისთვის შეირჩა 50 NLL ხაზი. ანალიზი ჩატარდა ორჯერ კომპიუტერული კონტროლირებადი სათბურის პირობებში 14-საათიანი ფოტოპერიოდით, ტემპერატურის დიაპაზონით 22°C დღის განმავლობაში და 19°C ღამით. თესლი იფხეკება (ემბრიონის მოპირდაპირე მხარეს თესლის გარსი ბასრი დანით იჭრება) დათესვამდე, რათა თავიდან იქნას აცილებული თესლის მიძინება თესლის გარსის სიმტკიცის გამო და უზრუნველყოფილი იყოს ერთგვაროვანი აღმოცენება. მცენარეები გაიზარდა ქოთნებში (11 × 11 × 21 სმ) სტერილურ ნიადაგზე (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, ვარშავა, პოლონეთი). ინოკულაცია ჩატარდა Colletotrichum lupini Col-08 შტამით, რომელიც 1999 წელს გაიზარდა ვერჟენიცაში, დიდი პოლონეთის (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E) მინდორში მოყვანილი ვიწროფოთლოვანი ლუპინის მცენარეების ღეროებიდან. აიღეთ გარკვეული ფართობი. იზოლატები კულტივირებული იქნა SNA გარემოში 20°C ტემპერატურაზე, შავი სინათლის ქვეშ, 21 დღის განმავლობაში სპორულაციის ინდუცირების მიზნით. დათესვიდან ოთხი კვირის შემდეგ, როდესაც მცენარეები მიაღწიეს 4-6 ფოთლის სტადიას, ინოკულაცია ჩატარდა კონიდიების სუსპენზიის შესხურებით 0.5 x 106 კონიდია მლ კონცენტრაციით. ინოკულაციის შემდეგ, მცენარეები 24 საათის განმავლობაში შეინახეს სიბნელეში დაახლოებით 98% ტენიანობისა და 25°C ტემპერატურის პირობებში, რათა ხელი შეეწყოთ კონიდიების აღმოცენებას და ინფექციის პროცესს. შემდეგ მცენარეები გაიზარდა 14-საათიანი ფოტოპერიოდის პირობებში, 22°C დღე/19°C ღამე ტემპერატურაზე და 70%-იან ტენიანობაზე. დაავადების ქულა დადგინდა ინოკულაციიდან 22 დღის შემდეგ და მერყეობდა 0-დან (იმუნური) 9-მდე (ძალიან მგრძნობიარე), ღეროებსა და ფოთლებზე ნეკროზული დაზიანებების არსებობის ან არარსებობის მიხედვით. გარდა ამისა, ქულების დადგენის შემდეგ, გაიზომა მცენარეების წონა. მარკერების გენოტიპებსა და დაავადების ფენოტიპებს შორის ურთიერთკავშირი გამოითვალა წერტილოვანი თანმიმდევრობის კორელაციების სახით (ჰეტეროზიგოტური მარკერების არარსებობა ანთრაქნოზისადმი რეზისტენტობის ფენოტიპის ანალიზისთვის განკუთვნილი ხაზების ნაკრებში).