Grazas por visitar Nature.com. A versión do navegador que estás a usar ten compatibilidade limitada con CSS. Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que uses un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Mentres tanto, para garantir a compatibilidade continua, renderizaremos o sitio sen estilos nin JavaScript.
O lupino Angustifolius (NLL, Lupinus angustifolius L.) é unha planta leguminosa utilizada para a produción de alimentos e a mellora do solo. A expansión global do NLL como cultivo atraeu moitos fungos patóxenos, incluída a antracnose do lupino, que causa a devastadora enfermidade da antracnose. Dous alelos, Lanr1 e AnMan, que confiren unha maior resistencia, utilizáronse na mellora de NLL, pero os mecanismos moleculares subxacentes seguen sendo descoñecidos. Neste estudo, os marcadores Lanr1 e AnMan utilizáronse para cribar mostras europeas de NLL. As probas da vacina nun ambiente controlado confirmaron a eficacia de ambos os doantes resistentes. A elaboración de perfís de expresión xénica diferencial realizouse en liñas resistentes e susceptibles representativas. A resistencia á antracnose asociouse á sobreexpresión dos termos da ontoloxía xénica "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process" e "GO:0015979 Photosynthesis". Ademais, a liña Lanr1(83A:476) mostrou unha reprogramación significativa do transcriptoma rapidamente despois da inoculación, mentres que as outras liñas mostraron un atraso nesta resposta duns 42 horas. As respostas de defensa están asociadas cos xenes TIR-NBS, CC-NBS-LRR e NBS-LRR, 10 proteínas implicadas na patoxénese, proteínas de transferencia de lípidos, endoglucano-1,3-β-glicosidase, proteínas da parede celular ricas en glicina e xenes da vía reactiva do osíxeno. As primeiras respostas a 83A:476, incluída a supresión coidadosa de xenes asociados coa fotosíntese, coincidiron cunha protección exitosa durante a fase de crecemento vexetativo da bioloxía fúnxica, o que suxire que un efector desencadea a inmunidade. A reacción de Mandeloop ralentizase, así como a resistencia horizontal xeral.
O altramuz de folla estreita (LNL, Lupinus angustifolius L.) é un cereal rico en proteínas orixinario da rexión do Mediterráneo occidental1,2. Actualmente cultívase como cultivo alimentario para animais e humanos. Tamén se considera esterco verde nos sistemas de rotación de cultivos debido á fixación do nitróxeno por bacterias simbióticas fixadoras do nitróxeno e á mellora xeral da estrutura do solo. O LNL sufriu un rápido proceso de domesticación no último século e aínda está baixo unha alta presión de reprodución3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Co cultivo xeneralizado do LNL, a sucesión de fungos patóxenos desenvolveu novos nichos agrícolas e causou novas enfermidades que destrúen as colleitas. O máis rechamante para os cultivadores e criadores de altramuces foi a aparición de antracnose, causada polo fungo patóxeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. O máis rechamante para os cultivadores e criadores de altramuces foi a aparición de antracnose, causada polo fungo patóxeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров e селекционеров люпина было появление антракнозав, патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. O máis notable para os cultivadores e criadores de altramuces foi a aparición da antracnose causada polo fungo patóxeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是现，它是现它是由眗腟 眀目的是炭目的是炭疽病的出现，它是由真hum Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是现，它是玟眗Collethum (Bondar)嵵Haired。1 Наиболее поразительным для фермеров e селекционеров люпина является появление антракнозозакнозозонеров патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. O máis rechamante para os cultivadores e criadores de altramuces é a aparición de antracnose causada polo fungo patóxeno Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Os primeiros informes da enfermidade proviñan do Brasil e dos Estados Unidos, e os síntomas típicos apareceron en 1912 e 1929 respectivamente. Non obstante, despois duns 30 anos, o patóxeno foi designado como Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorfa Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfa Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfo de Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld en Morfoloxía dirixida. e H. Schrenk. e H. Schrenk.e H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。e H. Schlenk.A fenotipificación preliminar da enfermidade realizada a mediados do século XX mostrou certa resistencia nas accesións de NLL e de lupino amarelo (L. luteus L.), pero todas as accesións de lupino branco (L. albus L.) analizadas foron moi susceptibles15,16. Os estudos demostraron que o desenvolvemento da antracnose está asociado a un aumento das precipitacións (humidade do aire) e da temperatura (no rango de 12-28 °C), o que leva a unha violación da resistencia a temperaturas máis altas17, 18. De feito, o tempo necesario para que as conidias xerminasen e a enfermidade comezase foi catro veces máis curto a 24 °C (4 horas) que a 12 °C (16 horas) en condicións de alta humidade19. Así, o quecemento global en curso provocou a propagación da antracnose. Non obstante, a enfermidade observouse en Francia (1982) e Ucraína (1983) como un presaxio dunha ameaza inminente, pero aparentemente foi ignorada pola industria do lupino nese momento20,21. Uns anos máis tarde, esta devastadora enfermidade estendeuse por todo o mundo e tamén afectou aos principais países produtores de altramuces como Australia, Polonia e Alemaña22,23,24. Tras un brote de antracnose a mediados da década de 1990, unha extensa selección permitiu identificar varios doantes resistentes en mostras NLL19. A resistencia das NLL á antracnose está controlada por dous alelos dominantes separados que se atopan en diferentes fontes de xermoplasma: Lanr1 no cultivar Tanjil e Wonga e AnMan no cultivar Mandalay25, 26. Estes alelos complementan os marcadores moleculares que apoian a selección de xermoplasma resistente nos programas de mellora25,26,27,28,29,30. A liña de reprodución resistente 83A:476 que portaba o alelo Lanr1 cruzouse coa liña salvaxe susceptible P27255 para obter unha poboación RIL segregada para a resistencia á antracnose, o que permitiu asignar o locus Lanr1 ao cromosoma NLL-1131, 32, 33. A aliñación dos marcadores do mapa de ligamento desde os loci de resistencia flanqueantes ata a antracnose cun marco xenómico, NLL, revelou a localización dos tres alelos no mesmo cromosoma (NLL-11), pero en diferentes posicións29,34,35. Non obstante, debido ao pequeno número de RIL e á gran distancia xenética entre os marcadores e os alelos correspondentes, non se poden extraer conclusións fiables sobre os seus xenes subxacentes. Por outra banda, o uso da xenética inversa en altramuces é difícil debido ao seu potencial de rexeneración moi baixo, o que fai que a manipulación xenética sexa engorrosa37.
O desenvolvemento de xermoplasma domesticado que leva o alelo desexado en estado homocigoto, como 83A:476 (Lanr1) e Mandelup (AnMan), abriu a porta ao estudo da resistencia á antracnose ante a presenza de combinacións opostas de alelos en poboacións salvaxes. Posibilidades de mecanismos moleculares. Comparar as respostas de defensa xeradas por xenotipos específicos. Este estudo avaliou a resposta do transcriptoma temperán de NLL á vacinación con C. lupini. En primeiro lugar, examinouse un panel europeo de xermoplasma de NLL que contiña 215 liñas utilizando marcadores moleculares que marcan os alelos Lanr1 e AnMan. A continuación, realizouse a fenotipificación da antracnose en 50 liñas NLL, previamente seleccionadas para marcadores moleculares, en condicións controladas. Baseándose nestes experimentos, seleccionáronse catro liñas que difiren na resistencia á antracnose e na composición alélica Lanr1/AnMan para a elaboración de perfís de expresión xénica de defensa diferencial utilizando dúas abordaxes complementarias: secuenciación de ARN de alto rendemento e cuantificación por PCR en tempo real.
A selección dun conxunto de xermoplasma NLL (N = 215) con marcadores Lanr1 (Anseq3 e Anseq4) e AnMan (Anseq4) e AnMan (AnManM1) mostrou que só unha liña (95726, preto de Salamanca-b) amplifica o alelo de "resistencia" para todos os marcadores, mentres que a "Presenza de alelos 'susceptibles'" atopou a proporción de todos os marcadores en 158 (~73,5 %) liñas. Trece liñas produciron dous alelos "resistentes" do marcador Lanr1 e 8 liñas produciron alelos "resistentes" do marcador Lanr1. O alelo de "resistencia" do marcador AnMan (Táboa suplementaria S1). Dúas liñas eran heterocigotas para o marcador Anseq3 e unha heterocigota para o marcador AnManM1. 42 liñas (19,5 %) portaban fases opostas dos alelos Anseq3 e Anseq4, o que indica unha alta frecuencia de recombinación entre estes dous loci. Os fenotipos de antracnose en condicións controladas (Táboa suplementaria S2) revelaron variabilidade na resistencia dos xenotipos probados, o que se reflectiu na gravidade da antracnose. As diferenzas nas puntuacións medias oscilaron entre 1,8 (moderadamente resistente) e 6,9 ​​(susceptible) e as diferenzas de peso das plantas oscilaron entre 0,62 (susceptible) e 4,45 g (resistente). Houbo unha correlación significativa entre os valores observados en dúas réplicas do experimento (0,51 para as puntuacións de gravidade da enfermidade, P = 0,00017 e 0,61 para o peso da planta, P < 0,0001), así como entre estes dous parámetros (−0,59 e −0,77, P < 0,0001). Houbo unha correlación significativa entre os valores observados en dúas réplicas do experimento (0,51 para as puntuacións de gravidade da enfermidade, P = 0,00017 e 0,61 para o peso da planta, P < 0,0001), así como entre estes dous parámetros (−0,59 e −0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция э0, кслентер э0 баллов тяжести болезни, P = 0,00017 e 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между между эвтамимду эрастения (-0,59 e -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Atopouse unha correlación significativa entre os valores observados en dúas repeticións do experimento (0,51 para as puntuacións de gravidade da enfermidade, P = 0,00017 e 0,61 para o peso da planta, P < 0,0001), así como entre estes dous parámetros (-0,59 e -0,77, P < 0,0001) (0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分1︺0.P. 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77）0,00,001)在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 诸 庈 诸分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （ 0,0001 （ 参数 之（ （ 9. 0,59 和– 0,59 和– 0,59 和- 0,77，P <0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух постенками ( тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 e масса растения 0,61, P <0,0001), e между этими двуми двуме пара9ми -0,0001) 0,77, P <0,0001. Houbo unha correlación significativa entre os valores observados por duplicado (puntuación de gravidade da enfermidade 0,51, P = 0,00017 e peso da planta 0,61, P < 0,0001) e entre estes dous parámetros (-0,59 e -0,0001) 0,77, P < 0,0001. ).Os síntomas típicos que se observan en plantas susceptibles inclúen a torsión e a curvatura do talo que semella unha estrutura en "arco de pastor", seguida de lesións ovais con esporozoítos laranxas/rosa (Figura suplementaria 1). As accesións australianas que levan os xenes Lanr1 (83A:476 e Tanjil) e AnMan (Mandelup) son moderadamente resistentes, 0,0331 e 0,0036). Algunhas liñas que tamén levan alelos Lanr1 e/ou AnMan "resistentes" mostran síntomas da enfermidade.
Curiosamente, unhas poucas liñas NLL que carecen de calquera alelo marcador "resistente" revelaron un alto nivel de resistencia á antracnose (comparable ou superior ao dos xenotipos Lanr1 ou AnMan), como Boregine (valor P < 0,0001 para ambos os parámetros), Bojar (valor P < 0,0001 para a puntuación e 0,001 para o peso da planta) e a poboación B-549/79b (valor P < 0,0001 para a puntuación e non significativo para o peso). Curiosamente, unhas poucas liñas NLL que carecen de calquera alelo marcador "resistente" revelaron un alto nivel de resistencia á antracnose (comparable ou superior ao dos xenotipos Lanr1 ou AnMan), como Boregine (valor P < 0,0001 para ambos os parámetros), Bojar (valor P < 0,0001 para a puntuación e 0,001 para o peso da planta) e a poboación B-549/79b (valor P < 0,0001 para a puntuación e non significativo para o peso). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллокави золокавы уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 илаи или более высокий) (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) e популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Curiosamente, varias liñas NLL que carecen de calquera alelo marcador "resistente" mostraron un alto nivel de resistencia á antracnose (comparable ou superior ao dos xenotipos Lanr1 ou AnMan), como Boregine (valor P < 0,0001 para ambos os parámetros), Bojar (valor P < 0,0001 para a avaliación e 0,001 para o peso da planta) e a poboación B-549/79b (valor P < 0,0001 para a avaliación e non significativo para o peso).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽的炭等位基因的NLL或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值<0,0001）、Bojar（P 值<得分为0,0001，植物重量为0,001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重显睂怍量一 É interesante que algúns sistemas NLL que non teñen ningún marcador "antixénico" mostren unha alta resistencia horizontal (equivalente aos xenes Lanr1 ou AnMan ou superior), como Boregine (ambos os parámetros P < 0,0001), Bojar (valor P < 0,0001, peso da planta 0,001) e a cepa B-549/79b (valor P < 0,0001, peso non significativo). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентноста», споликва уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие какие какачдлеше Boregine обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) e популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Curiosamente, algunhas liñas NLL que carecen de ningún alelo marcador de "resistencia" mostraron altos niveis de resistencia á antracnose (comparables ou superiores aos xenotipos Lanr1 ou AnMan), como Boregine (valor P para ambos os parámetros <0,0001), Bojar (valor P < 0,0001, peso da planta 0,001) e a poboación B-549/79b (valor P < 0,0001, peso non significativo).Este fenómeno suxire a posibilidade dunha nova fonte xenética de resistencia, o que explica a falta de correlación observada entre os xenotipos marcadores e os fenotipos da enfermidade (valores P de ~0,42 a ~0,98). Polo tanto, a proba de Kolmogorov-Smirnov mostrou que os datos sobre a resistencia á antracnose estaban distribuídos aproximadamente normalmente para as puntuacións (valores P 0,25 e 0,11) e a masa vexetal (valores P 0,47 e 0,55), o que suxire que a miña hipótese é que están implicados máis alelos que Lanr1 e AnMan.
Baseándose nos resultados da proba de resistencia á antracnose, seleccionáronse 4 liñas para a análise do transcriptoma: 83A:476, Boregine, Mandelup e Poboación 22660. Estas liñas foron reevaluadas para a resistencia ao ántrax en experimentos de inoculación mediante secuenciación de ARN, sempre que fosen os mesmos que na proba anterior. Os valores de puntuación foron os seguintes: Boregine (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) e poboación 22660 (6,11 ± 1,29).
O protocolo Illumina NovaSeq 6000 acadou unha media de 40,5 pares de lecturas M por mostra (de 29,7 a 54,4 lecturas M) (Táboa suplementaria S3). As puntuacións de aliñamento na secuencia de referencia oscilaron entre o 75,5 % e o 88,6 %. A correlación media dos datos de reconto de lecturas entre variantes experimentais entre réplicas biolóxicas oscilou entre 0,812 e 0,997 (media de 0,959). Dos 35.170 xenes analizados, 2917 non revelaron expresión e os outros 4785 xenes expresáronse a un nivel insignificante (media base < 5). Dos 35.170 xenes analizados, 2917 non revelaron expresión e os outros 4785 xenes expresáronse a un nivel insignificante (media base < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов геслсинов экспрессии незначительном уровне (базовое среднее <5). Dos 35.170 xenes analizados, 2917 non mostraron expresión e os 4785 xenes restantes expresáronse a un nivel insignificante (media base <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35.170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имелисунч имелись экспрессию (базовое среднее значение <5). Dos 35.170 xenes analizados, 2917 non se expresaban e os 4785 xenes restantes tiveron unha expresión insignificante (media base <5).Así, o número de xenes considerados expresados ​​(media base ≥ 5) durante o experimento foi de 27.468 (78,1 %) (táboa suplementaria S4).
Desde o primeiro punto de tempo, todas as liñas NLL responderon á inoculación de C. lupini (cepa Col-08) reprogramando o transcriptoma (Táboa 1); porén, observáronse diferenzas significativas entre as liñas. Así, a liña de resistencia 83A:476 (que porta o xene Lanr1) mostrou unha reprogramación significativa do transcriptoma no primeiro punto de tempo (6 hpi) cun aumento de 31-69 veces no número de xenes ascendentes e descendentes illados en comparación con outros puntos de tempo neste punto de tempo. Ademais, este pico foi de curta duración, xa que a expresión duns poucos xenes permaneceu significativamente alterada no segundo punto de tempo (12 hpi). Curiosamente, Boregine, que tamén mostrou un alto nivel de resistencia na proba de enxerto, non sufriu unha reprogramación transcricional tan masiva durante o experimento. Non obstante, o número de xenes expresados ​​diferencialmente (DEG) foi o mesmo para Boregine e 83A:476 a 12 HPI. Tanto Mandelup como a poboación 22660 mostraron picos de DEG no último punto temporal (48 l/s), o que indica un atraso relativo nas respostas de defensa.
Dado que 83A:476 sufriu unha reprogramación masiva do transcriptoma en resposta a C. lupini a 6 HPI en comparación con todas as outras liñas, ~91 % dos DEG observados neste momento eran específicos de liñaxe (Fig. 1). Non obstante, houbo certa superposición nas primeiras respostas entre as liñas de estudo, xa que o 68,5 %, 50,9 % e 52,6 % de DEG en Boregine, Mandelup e a poboación 22660, respectivamente, superpuxéronse cos atopados en 83A:476 nalgúns momentos. Non obstante, estes DEG representaron só unha pequena fracción (0,97–1,70 %) de todos os DEG detectados actualmente usando 83A:476. Ademais, 11 DEG de todas as liñas eran coherentes neste momento (táboas suplementarias S4-S6), incluíndo compoñentes comúns das respostas de defensa das plantas: proteína de transferencia de lípidos (TanjilG_32225), encima endoglucano-1,3-β-glucósido (TanjilG_23384), dúas proteínas inducibles por estrés como SAM22 (TanjilG_31528 e TanjilG_31531), proteína básica do látex (TanjilG_32352) e dúas proteínas da parede celular estrutural ricas en glicina (TanjilG_19701 e TanjilG_19702). Tamén houbo unha superposición relativamente alta nas respostas do transcriptoma entre 83A:476 e Boregine a 24 HPI (total 16-38 % DEG) e entre Mandelup e Poboación 22660 a 48 HPI (total 14-20 % DEG).
Diagrama de Venn que mostra o número de xenes expresados ​​diferencialmente (DEG) en liñas de lupino de folla estreita (NLL) inoculadas con Colletotrichum lupini (cepa Col-08 obtida de campos de lupinos en Wierzhenice, Polonia, 1999). As liñas NLL analizadas foron: 83A:476 (resistente, portadora do alelo Lanr1), Boregine (resistente, antecedentes xenéticos descoñecidos), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo AnMan) e a poboación 22660 (moi susceptible). A abreviatura hpi significa horas despois da vacinación. Elimináronse os valores cero para simplificar o gráfico.
Analizouse o conxunto de xenes sobreexpresados ​​a 6 hpi para detectar a presenza de dominios canónicos do xene R (Táboa suplementaria S7). Este estudo revelou a indución do transcriptoma de xenes clásicos de resistencia a enfermidades con dominios NBS-LRR só en 83A:476. Este conxunto constaba dun xene TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), cinco xenes CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 e tanjilg_16162), catro NBS-LR, Tanjilg_16162, catro NBS-LRRE (tanjilg_16162), así como catro NBS-Lrr (tanjilg_16162) e catro NBS-LRR (TANJILG_16162). Todos estes xenes teñen dominios canónicos dispostos en secuencias conservadas. Ademais dos xenes do dominio NBS-LRR, activáronse varias quinases RLL ás 6 hpi, concretamente unha en Boregine (TanjilG_19877), dúas en Mandelup (TanjilG_07141 e TanjilG_19877) e na poboación 22660 (TanjilG_09014 e TanjilG_10361) e dúas en 83A 27:476.
Os xenes con expresión significativamente alterada en resposta á inoculación con C. lupini (cepa Col-08) foron sometidos a unha análise de enriquecemento de ontoloxía xénica (GO) (táboa suplementaria S8). O termo de proceso biolóxico sobrerrepresentado con máis frecuencia foi a "resposta de defensa GO:0006952", que apareceu en 6 de 16 combinacións (tempo × liña) con alta significación (valor P < 0,001) (Fig. 2). O termo de proceso biolóxico sobrerrepresentado con máis frecuencia foi a "resposta de defensa GO:0006952", que apareceu en 6 de 16 combinacións (tempo × liña) con alta significación (valor P < 0,001) (Fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952» который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значимостью (значимостью) (значение P) (0,ирс. O termo de proceso biolóxico sobrerrepresentado con máis frecuencia foi a «resposta de defensa GO:0006952», que apareceu en 6 de 16 combinacións (tempo × liñaxe) con alta significación (valor P < 0,001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 O termo de proceso biolóxico máis representativo é a "resposta de defensa GO:0006952", que aparece en 6 das 16 combinacións (时间×线), cunha significación alta (valor P < 0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense», появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис.2). O termo de proceso biolóxico sobrerrepresentado con máis frecuencia foi "GO:0006952 Defense Response", que apareceu en 6 de 16 combinacións (tempo × liña) con alta significación (valor P < 0,001) (Fig. 2).Este termo estivo sobrerrepresentado en dous puntos temporais en 83A: 476 e Boregine (6 e 24 hpi) e nun punto temporal en Mandelup e Poboación 22660 (12 e 6 hpi, respectivamente). Este é un resultado esperado, que destaca a resposta antifúnxica das liñas resistentes. Ademais, 83A:476 respondeu a C. lupini inducindo rapidamente xenes relacionados coa explosión oxidativa representada polo termo "proceso redox GO:0055114", o que indica unha resposta de defensa específica, mentres que Boregine revelou respostas de defensa específicas, relacionadas co termo "GO". :0006950 Resposta ao estrés”. A poboación 22660 activou a resposta de resistencia horizontal que implica metabolitos secundarios, destacando o número excesivo de termos “GO:0016104 Proceso de biosíntese de triterpenos” e “GO:0006722 Proceso de metabolismo de triterpenos” (ambos os termos pertencen ao mesmo conxunto de xenes), tendo en conta os resultados da análise de enriquecemento de termos GO, a estabilidade da reacción de Mandelup estaba entre Boregine e a poboación 22660. Ademais, a reacción temperá 83A:476 (6 hpi) e a reacción tardía de Mandelup e a poboación 22660 inclúen o termo GO:0015979 "fotosíntese" e outros procesos biolóxicos relacionados.
Os termos da ontoloxía xénica dos bioprocesos seleccionados na anotación de xenes expresados ​​diferencialmente durante as respostas do transcriptoma do lupino de folla estreita (NLL) inoculado con lupino con antraz (cepa Col-08 obtida de campos de lupinos en Wierzhenice, Polonia, en 1999) están moi esaxerados. As liñas NLL analizadas foron: 83A:476 (resistente, que leva o alelo homocigoto Lanr1), Boregine (resistente, fondo xenético descoñecido), Mandelup (moderadamente resistente, que leva o alelo homocigoto AnMan) e a poboación 22660 (susceptible).
Dado que este estudo tiña como obxectivo identificar os xenes que contribúen á resistencia á antracnose, os xenes asignados aos termos GO "GO: 0006952 Defensive responses" e "GO: 0055114 Redox processs" analizáronse con límites xa que as medias basais ≥ 30 con polo menos unha liña × punto no tempo combinando valores estatisticamente significativos de log2 (cambio de pregamento). O número de xenes que cumprían estes criterios foi de 65 para GO:0006952 e 524 para GO:0055114.
83A:476 revelou dous picos DEG anotados co termo GO:0006952, o primeiro a 6 xenes por polgada (64 xenes, regulación ascendente e descendente) e o segundo a 24 xenes por polgada (15 xenes, só regulación ascendente). Boregine tamén mostrou que GO:0006952 alcanzou o seu pico no mesmo punto temporal, pero con menos DEG (11 e 8) e activación preferencial. Mandeloop mostrou dous picos de GO:0006952 a 12 e 48 HPI, ambos con 12 xenes (o primeiro con xenes activadores e o segundo só con xenes supresores), mentres que a poboación 22660 a 6 HPI (13 xenes) tivo unha maior predominancia da regulación do pico de aumento. Cómpre sinalar que o 96,4 % dos DEG GO:0006952 nestes picos tiveron o mesmo tipo de resposta (ascendente ou descendente), o que indica unha superposición significativa nas respostas de defensa a pesar das diferenzas no número de xenes implicados. O maior grupo de secuencias relacionadas co termo GO:0006952 codifica a proteína de mensaxe asociada ao estrés da inanición 22 (tipo SAM22), que pertence ao clado de proteínas de clase 10 asociadas á patoxénese (PR-10) e á proteína central látex. proteína similar (tipo MLP) (Fig. 3). Os dous grupos diferían na natureza da expresión e na dirección da resposta. Os xenes que codifican as proteínas de tipo SAM22 mostraron unha indución consistente e significativa nos primeiros puntos de tempo (6 ou 12 hpi) e xeralmente non responderon ao final do experimento (48 hpi), mentres que as proteínas de tipo MLP mostraron coordinación ás 6 hpi. hpi. 83A:476 e Mandelup a 48 hp/in, case todos os demais puntos de datos non responderon. Ademais, as diferenzas nos perfís de expresión dos xenes das proteínas de tipo SAM22 seguiron a variabilidade observada na resistencia á antracnose, xa que as liñas máis resistentes tiveron máis puntos de tempo que induciron significativamente estes xenes que os xenes máis susceptibles. Outro xene PR-10 de tipo LlR18A/B mostrou un patrón de expresión moi similar ao xene da proteína de tipo SAM22.
Identificáronse os principais compoñentes do termo do proceso biolóxico "GO:0006952 Defense Response" e os patróns de expresión dos xenes candidatos dos alelos Lanr1 e AnMan. A escala Log2 representa os valores de log2 (cambio de pregamento) entre as plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida de campos de altramuces, Wizhenica, Polonia, 1999) e as plantas de control (inoculadas de forma simulada) no mesmo punto temporal. Analizáronse as seguintes liñas de altramuces de folla estreita: 83A:476 (resistente, portadora do alelo Lanr1 homocigoto), Boregine (resistente, antecedentes xenéticos descoñecidos), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo AnMan homocigoto) e a Poboación 22660 (susceptible).
Ademais, avaliáronse os perfís de expresión dos xenes candidatos de RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) e AnMan (TanjilG_12861) (Fig. 3). O xene TanjilG_05042 mostrou unha resposta significativa (activación) en 83A:476 só no primeiro punto temporal (6 hpi), mentres que TanjilG_12861 foi significativo en Mandeloop só en dous puntos temporais: 6 hpi (regulación á baixa) e 24 hpi (6 hpi). Con.). axustable) ).
Os xenes máis sobreexpresados ​​no termo GO:0055114 "proceso redox" foron os xenes que codifican as proteínas do citocromo P450 e a peroxidase (Fig. 4). Para as mostras illadas de 83A:476 a 6 HPI, os valores máximos ou mínimos de log2 (cambio de pregamento) (para o 86,6 % dos xenes) observáronse xeralmente entre as plantas inoculadas e as de control, o que destaca a alta resposta deste xenotipo ao sexo inoculado. 83A:476 mostrou o DEG GO:0055114 máis significativo a 6 hpi (503 xenes), mentres que o resto das liñas a 48 hpi (Boregine, 31 xenes; Mandelup, 85 xenes; e Poboación 22660, 78 xenes)). Na maioría dos xenes da familia GO:0055114, observáronse dous tipos de respostas á vacinación (activación e inhibición). Curiosamente, ata o 97,6 % dos DEG identificados para o termo GO: 0055114 en Mandelupe a 48 hp. Estas observacións suxiren que, a pesar da escala significativamente menor (é dicir, o número de xenes redox mutados, 85 fronte a 503), o patrón de respostas transcriptómicas retardadas de mandeloup á antracnose é similar á resposta temperá de 83A:476. En Boregine e Poboación 22660, esta converxencia é menor, cun 51,6 % e un 75,6 %, respectivamente.
Reveláronse os patróns de expresión dos principais compoñentes do termo do proceso biolóxico "GO:0055114 Proceso redox". A escala Log2 representa os valores de log2 (cambio de pregamento) entre as plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida de campos de altramuces, Wizhenica, Polonia, 1999) e as plantas de control (inoculadas de forma simulada) no mesmo punto temporal. Analizáronse as seguintes liñas de altramuces de folla estreita: 83A:476 (resistente, portadora do alelo homocigoto Lanr1), Boregine (resistente, antecedentes xenéticos descoñecidos), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo homocigoto AnMan) e a Poboación 22660 (susceptible).
83A:476 As respostas transcriptómicas á inoculación con C. lupini (cepa Col-08) tamén incluíron o silenciamento coordinado de xenes atribuídos ao termo GO:0015979 "fotosíntese" e outros procesos biolóxicos relacionados (FIG. 5). Este conxunto de DEG GO:0015979 contiña 105 xenes que foron reprimidos significativamente a 6 hpi en 83A:476. Neste subconxunto, 37 xenes tamén foron regulados á baixa en Mandelup a 48 HPI e 35 no mesmo punto temporal na poboación 22660, incluíndo 19 DEG comúns a ambos os xenotipos. Ningún DEG relacionado co termo GO:0015979 se activou significativamente en ningunha combinación (liña x tempo).
Reveláronse os patróns de expresión dos principais compoñentes do termo do proceso biolóxico "GO:0015979 Fotosíntese". A escala Log2 representa os valores de log2 (cambio de pregamento) entre as plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida de campos de altramuces, Wizhenica, Polonia, 1999) e as plantas de control (inoculadas de forma simulada) no mesmo punto temporal. Analizáronse as seguintes liñas de altramuces de folla estreita: 83A:476 (resistente, portadora do alelo homocigoto Lanr1), Boregine (resistente, antecedentes xenéticos descoñecidos), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo homocigoto AnMan) e a Poboación 22660 (susceptible).
Baseándose nos resultados da análise de expresión diferencial e presumiblemente implicados en respostas de defensa contra fungos patóxenos, seleccionouse este conxunto de sete xenes para a cuantificación dos perfís de expresión mediante PCR en tempo real (Táboa suplementaria S9).
O suposto xene da proteína TanjilG_10657 induciuse significativamente en todas as liñas e puntos temporais estudados en comparación coas plantas de control (imitadoras) (táboas suplementarias S10, S11). Ademais, o perfil de expresión de TanjilG_10657 mostrou unha tendencia crecente ao longo do experimento para todas as liñas. A poboación 22660 mostrou a maior sensibilidade de TanjilG_10657 á inoculación cunha activación de 114 veces e o nivel de expresión relativa máis alto (4,4 ± 0,4) a 24 HPI (Fig. 6a). O xene da proteína PR10 LlR18A TanjilG_27015 tamén mostrou activación en todas as liñas e puntos temporais, con significación estatística na maioría dos puntos de datos (Fig. 6b). De xeito similar a TanjilG_10657, o nivel de expresión relativa máis alto de TanjilG_27015 observouse na poboación inoculada 22660 a 24 HPI (19,5 ± 2,4). O xene da endoquitinase ácida TanjilG_04706 aumentou significativamente en todas as liñas e en todos os puntos temporais agás para Boregine 6 hpi (Fig. 6c). Induciuse fortemente no primeiro punto temporal (6 HPI) en 83A:476 (en 10,5 veces) e aumentou moderadamente noutras liñas (en 6,6-7,5 veces). Durante o experimento, a expresión de TanjilG_04706 mantívose en niveis similares en 83A:476 e Boregine, mentres que en Mandelup e Poboación 22660 aumentou significativamente, alcanzando valores relativamente altos (5,9 ± 1,5 e 6,2 ± 1,5, respectivamente). O xene similar á endoglucano-1,3-β-glicosidase TanjilG_23384 mostrou unha alta activación nos dous primeiros puntos temporais (6 e 12 hpi) en todas as liñas agás na poboación 22660 (Fig. 6d). Os niveis de expresión relativa máis altos de TanjilG_23384 observáronse no segundo punto temporal (12 hpi) en Mandelup (2,7 ± 0,3) e 83A:476 (1,5 ± 0,1). A 24 HPI, a expresión de TanjilG_23384 foi relativamente baixa en todas as liñas estudadas (de 0,04 ± 0,009 a 0,44 ± 0,12).
Perfis de expresión de xenes seleccionados (ag) revelados por PCR cuantitativa. Os números 6, 12 e 24 representan as horas posteriores á vacinación. Os xenes LanDExH7 e LanTUB6 empregáronse para a normalización e LanTUB6 para a calibración entre series. As barras de erro representan a desviación estándar baseada en tres réplicas biolóxicas, cada unha das cales é a media de tres réplicas técnicas. A significación estatística das diferenzas nos niveis de expresión entre as plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida en 1999 do campo de altramuces en Wierzenica, Polonia) e as plantas de control (inoculadas con simulación) están marcadas enriba dos puntos de datos (*valor P < 0,05, **valor P ≤ 0,01, ***valor P ≤ 0,001). A significación estatística das diferenzas nos niveis de expresión entre as plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida en 1999 do campo de altramuces en Wierzenica, Polonia) e as plantas de control (inoculadas con simulación) están marcadas enriba dos puntos de datos (*valor P < 0,05, **valor P ≤ 0,01, ***valor P ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, м Статистическая) получен в 1999 г с поля люпина в Верженице, Польша) e контрольными (ложно инокулимиров) отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Obsérvanse diferenzas estatisticamente significativas nos niveis de expresión entre as plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida en 1999 dun campo de altramuces en Wierzhenice, Polonia) e as plantas de control (inoculadas de forma simulada) por riba dos puntos de datos (*valor P < 0,05, **valor P ≤ 0,01, ***valor P ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数渍在数渍在数渍平差异的统计学显着性标记在敹乼渍在数渍0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对煥秉 波兰 ）水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, м ш08 полученный с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) e контрольными (ложно ино инокаулирольными) отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Obsérvanse diferenzas estatisticamente significativas nos niveis de expresión entre as plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida de campos de altramuces en Verzhenice, Polonia, en 1999) e as plantas de control (inoculadas de forma simulada) por riba dos puntos de datos (*valor P < 0,05, **valor P ≤ 0,01, ***valor P ≤ 0,001).As liñas NLL analizadas foron: 83A:476 (resistente, portadora do alelo homocigoto Lanr1), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo homocigoto AnMan), Boregine (resistente, fondo xenético descoñecido) e a poboación 22660 (susceptíbel).
O xene candidato TanjilG_05042 no locus Lanr1 mostrou un patrón de expresión marcadamente diferente dos perfís obtidos a partir de estudos de RNA-seq (Fig. 6e). Observouse unha activación significativa deste xene en Mandelup e na poboación 22660 (ata 39,7 e 11,7 veces, respectivamente), o que resultou en niveis de expresión relativamente altos (ata 1,4 ± 0,14 e 7,2 ± 1,3, respectivamente). 83A:476 tamén revelou certa regulación á alza do xene TanjilG_05042 (ata 3,8 veces); porén, os niveis de expresión relativos acadados (0,044 ± 0,002) foron máis de 30 veces inferiores aos observados en Mandelup e na poboación 22660. analizados por qPCR mostraron diferenzas significativas nos niveis de expresión entre xenotipos en variantes vacinadas con placebo (control), alcanzando unha diferenza de 58 veces entre as poboacións 22660 e 83A:476, así como entre as poboacións 22660 e 22660. Conseguíuse unha diferenza do dobre entre Boregine e Mandalup.
O xene candidato no locus AnMan, TanjilG_12861, activouse en resposta á vacinación en 83A:476 e Mandelup, foi neutro na poboación 22660 e estaba regulado á baixa en Boregine (Fig. 6f). A expresión relativa do xene TanjilG_12861 foi a máis alta en 83A:476 inoculado (0,14 ± 0,01). O xene da proteína de choque térmico de clase I de 17,4 kDa, TanjilG_05080 HSP17.4, mostrou niveis de expresión relativa máis baixos en todas as cepas e puntos temporais estudados (Fig. 6g). O valor máis alto observouse a 24 HPI na poboación 22660 (0,14 ± 0,02, un aumento de oito veces na resposta á vacinación).
A comparación dos perfís de expresión xénica (Fig. 7) revelou unha alta correlación entre TanjilG_10657 e outros catro xenes: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) e TanjilG_04706 (r = 0,79). Estes resultados poden indicar unha corregulación destes xenes durante as respostas de defensa. Os xenes TanjilG_12861 e TanjilG_23384 mostraron diferentes perfís de expresión con valores de coeficiente de correlación de Pearson máis baixos (de 0,08 a 0,43 e de -0,19 a 0,28, respectivamente) en comparación con outros xenes.
Detectáronse correlacións entre os perfís de expresión xénica mediante PCR cuantitativa. Analizáronse as seguintes liñas de altramuz de folla estreita: 83A:476 (resistente, que porta o alelo homocigoto Lanr1), Mandelup (moderadamente resistente, que porta o alelo homocigoto AnMan), Boregine (resistente, antecedentes xenéticos descoñecidos) e Poboación 22660 (susceptíbel). Calculáronse tres puntos de tempo (6, 12 e 24 horas despois da inoculación), incluíndo plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida de campos de altramuz en Wierzhenice, Polonia, en 1999) e plantas de control (inoculadas de forma simulada). A escala mostra o valor do coeficiente de correlación de Pearson.
Baseándose nos datos obtidos a 6 cabalos de vapor por polgada, realizouse unha análise de WGCNA en 9981 DEG identificados comparando plantas inoculadas e de control para centrarse nas respostas de defensa temperás (Táboa suplementaria S12). Atopáronse vinte e dous módulos (clústeres) xénicos con perfís de expresión correlacionados (positivos ou negativos) entre xenotipos e variantes experimentais. De media, os niveis de expresión xénica foron descendentes na orde 83A:476 > Mandelup > Boregine > Poboación 22660 (non obstante, en ambas as variantes esta tendencia foi máis forte nas plantas de control). De media, os niveis de expresión xénica foron descendentes na orde 83A:476 > Mandelup > Boregine > Poboación 22660 (non obstante, en ambas as variantes esta tendencia foi máis forte nas plantas de control). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Poboación 22660 (в обоих, надава эта тенденция была сильнее у контрольных растений). De media, os niveis de expresión xénica diminuíron na orde 83A:476 > Mandelup > Boregine > Poboación 22660 (non obstante, en ambas variantes, esta tendencia foi máis forte nas plantas de control).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Poboación 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> poboación 22660 的 顺序 下降 （， ， 在 筌 在 筏 下降在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。... В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Poboación 22660 тенденция была сильнее у контрольных растений). De media, os niveis de expresión xénica diminuíron na serie 83A:476 > Mandelup > Boregine > Poboación 22660 (non obstante, en ambas as variantes, esta tendencia foi máis forte nas plantas de control).A vacinación provocou unha regulación positiva da expresión xénica, especialmente nos módulos 18, 19, 14, 6 e 1 (en orde descendente de efecto), regulación negativa (por exemplo, módulos 9 e 20) ou con efectos neutros (por exemplo, módulos 11, 22, 8 e 13). A análise de enriquecemento de termos GO (Táboa suplementaria S13) revelou "GO: 0006952 Respostas protectoras" para o módulo inoculado (18) con activación máxima, incluíndo xenes analizados por qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 e TanjilG_27015), así como moitos módulos de fotosíntese máis suprimidos (9). O concentrador do módulo 18 (Fig. 8) identificouse como o xene TanjilG_26536 que codifica a proteína LlR18B de tipo PR-10, e o concentrador do módulo 9 identificouse como o xene TanjilG_28955 que codifica a proteína PsbQ do fotosistema II. Un xene candidato de resistencia á antracnose, Lanr1, TanjilG_05042, atopouse no módulo 22 (Fig. 9) e está asociado cos termos "GO:0044260 Cellular macromolecular metabolic processes" e "GO:0006355 Transcritional regulation, DNA templating" que levan o núcleo TanjilG_01212. O xene codifica o factor de transcrición de estrés térmico A-4a (HSFA4a).
Análise de rede ponderada da coexpresión xénica de módulos con termos de procesos biolóxicos sobrerrepresentados "GO: 0006952 Respostas de defensa". A ligación simplificouse para destacar os catro xenes analizados por qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 e TanjilG_27015).
Análise de rede ponderada da coexpresión xénica dun módulo cun termo de proceso biolóxico sobrerrepresentado "GO: 0006355: Regulación transcripcional, creación de modelos de ADN" e que leva un xene candidato de resistencia á antracnose Lanr1 TanjilG_05042. A ligación simplificouse para illar o xene TanjilG_05042 e o xene central TanjilG_01212.
As probas de resistencia á antracnose recollidas en Australia mostraron que a maioría dos cultivares liberados temperáns eran susceptibles; Kalya, Coromup e Mandelup foron descritos como moderadamente resistentes, mentres que Wonga, Tanjil e 83A:476 foron descritos como altamente resistentes26,27,31. tiñan o mesmo alelo de resistencia, designado Lanr1, e Coromup e Mandelup tiñan un alelo diferente, designado AnMan10, 26, 39, mentres que Kalya pasaba por alto un alelo diferente, Lanr2. A proba de resistencia á antracnose en Alemaña deu lugar á identificación dunha liña resistente Bo7212 cun alelo candidato diferente de Lanr1, designado LanrBo36.
O noso estudo revelou unha frecuencia moi baixa (arredor do 6 %) do alelo Lanr1 no xermoplasma analizado. Esta observación é consistente cos resultados da selección de xermoplasma de Europa do Leste utilizando os marcadores Anseq3 e Anseq4, que mostraron que o alelo Lanr1 está presente só en dúas liñas belarusas. Isto suxire que o alelo Lanr1 aínda non é amplamente utilizado polos programas de mellora locais, a diferenza de Australia, onde é un dos alelos clave para a mellora asistida por marcadores. Isto pode deberse ao menor nivel de resistencia proporcionado polo alelo Lanr1 en condicións de campo europeas en comparación co informe australiano. Ademais, os estudos de antracnose en zonas de altas choivas en Australia demostraron que as respostas de resistencia mediadas polo alelo Lanr1 poden non ser eficaces en condicións meteorolóxicas que favorecen o crecemento e o rápido desenvolvemento do patóxeno19,42. De feito, no presente estudo, tamén se observaron algúns síntomas de antracnose en xenotipos que portan o alelo Lanr1, o que suxire que a resistencia pode desaparecer en condicións óptimas para o desenvolvemento de C. lupini. Ademais, son posibles interpretacións falsos positivos da presenza dos marcadores Anseq3 e Anseq4, que están a aproximadamente 1 cM do locus Lanr1 28, 30, 43.
O noso estudo mostrou que 83A:476, que leva o alelo Lanr1, respondeu á inoculación de C. lupini cunha reprogramación do transcriptoma a grande escala no primeiro punto de tempo analizado (6 hpi), mentres que en Mandelup, que leva o alelo AnMan, as respostas transcriptómicas observáronse moito máis tarde (de 24 a 48 hp). Estas variacións temporais nas respostas de defensa están asociadas a diferenzas nos síntomas da enfermidade, o que destaca a importancia do recoñecemento temperán dos patóxenos para unha resposta exitosa á resistencia. Para infectar o tecido vexetal, as esporas de antraz deben pasar por varias etapas de desenvolvemento na superficie do hóspede, incluíndo a xerminación, a división celular e a formación dun apresorio. Un apéndice é unha estrutura infecciosa que se adhire á superficie do hóspede e facilita a penetración nos tecidos do hóspede. Así, as esporas de C. gloeosporioides no extracto de chícharos mostraron a primeira división do núcleo despois de 75-90 minutos de incubación, a formación dun tubo xerminal despois de 90-120 minutos e a supresión despois de 4 horas. O *C. gloeosporioides* de manga mostrou unha xerminación conidial de máis do 40 % despois de 3 horas de incubación e unha formación de apresores de aproximadamente o 20 % despois de 4 horas. O xene CAP20 asociado á virulencia de *C. gloeosporioides* mostrou actividade transcricional en conidios formadores de epífitas despois de 3,5 horas de incubación en cera superficial do aguacate con altas concentracións de proteína CAP20 despois de 4 horas e 46 minutos. Do mesmo xeito, a actividade dos xenes de biosíntese de melanina en *C. trifolii* induciuse durante unha incubación de 2 horas seguida da formación dun apresorio despois de 1 hora. Estudos de tecidos foliares demostraron que os amorodos inoculados con *C. acutatum* teñen unha primeira supresión ás 8 hpi, mentres que os tomates inoculados con *C. coccodes* teñen unha primeira supresión ás 4 hpi (48,49). Isto é en gran medida consistente coa escala de tempo do proceso infeccioso de *Colletotrichum spp.*. As respostas rápidas de defensa ao 83A:476 suxiren a implicación de xenes de resistencia das plantas e de inmunidade desencadeada por efectores (ETI) nesta liña, mentres que as respostas retardadas de Mandelup apoian a hipótese da inmunidade desencadeada por patróns moleculares microasociados (MTI) 50. As primeiras respostas ao 83A: 476 e Mandelup. A superposición parcial entre xenes regulados positivamente ou negativamente na resposta retardada tamén apoia este concepto, xa que a ETI adoita considerarse unha resposta MTI acelerada e potenciada que culmina na morte celular programada no lugar da infección, coñecida como choque anafiláctico 51,52.
A maioría dos xenes atribuídos ao termo sobrerrepresentado Gene Ontology GO:0006952 "Resposta de defensa" son os 11 homólogos da proteína 22 da mensaxe de xaxún inducido polo estrés (similar a SAM22) e as sete principais proteínas similares a proteínas do látex (MLP). As proteínas similares a 31, 34, 43 e 423 mostraron semellanza de secuencia. Os xenes similares a SAM22 mostraron unha activación significativa que durou máis tempo, mostrando niveis aumentados de resistencia á antracnose (83A:476 e Boregine). Non obstante, os xenes similares a MLP só foron regulados á baixa en liñas que portaban o alelo de resistencia candidato (83A:476/Lanr1 a 6 hpi e Mandelup/AnMan a 24 hpi). Cómpre sinalar que todos os homólogos similares a SAM22 identificados orixínanse dun grupo de xenes que abrangue aproximadamente 105 kb, mentres que os xenes similares a MLP orixínanse en rexións separadas do xenoma. A activación coordinada destes xenes de tipo SAM22 tamén se atopou no noso estudo previo sobre a resistencia das NLL á inoculación de Diaporthetoxica, o que suxire que están implicadas nos compoñentes horizontais da resposta de defensa. Esta conclusión tamén está corroborada por informes dunha resposta positiva dos xenes de tipo SAM22 a lesións ou tratamento con ácido salicílico, indutores de fungos ou peróxido de hidróxeno.
Demostrouse que os xenes de tipo MLP responden a diversos estreses abióticos e bióticos, incluíndo infeccións fúnxicas bacterianas, virais e patóxenas en moitas especies de plantas55. As direccións de resposta a certas interaccións entre plantas e patóxenos variaron desde un forte aumento (é dicir, durante a infestación do algodón con Verticillium dahliae) ata unha diminución significativa (é dicir, despois da infección da maceira con Alternaria spp.)56,57. Observouse unha regulación á baixa significativa do xene 423 de tipo MLP durante as defensas do aguacate contra a infección por F. niger e durante a infección da maceira Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola e Alternaria alternata son patotipos da mazá58,59. Ademais, os callos da mazá que sobreexpresan o xene 423 de tipo MLP tiveron unha menor expresión de xenes asociados á resistencia e foron máis susceptibles á infección fúnxica59. Despois de Fusarium oxysporum f, o xene 423 de tipo MLP tamén se suprimiu no xermoplasma de faba común resistente. cn. Infección por faba 60.
Outros membros da familia PR-10 identificados no noso estudo de RNA-seq foron os xenes LlR18A e LlR18B en resposta á regulación á alza, así como o xene regulado á alza (1 xene) ou regulado á baixa (3 xenes) para a proteína de transferencia de lípidos DIR1. Ademais, o WGCNA destaca o xene LlR18B como un centro neste módulo, que é moi susceptible á vacinación e porta varios xenes de resposta protectora. Os xenes LlR18A e LlR18B foron inducidos en follas de lupino amarelo en resposta a bacterias patóxenas, así como en talos NLL despois da inoculación de D. toxica, mentres que o homólogo do arroz destes xenes, RSOsPR10, foi inducido rapidamente por unha infección fúnxica presumiblemente implicada na vía de sinalización do ácido jasmónico53,61,62. O xene DIR1 codifica proteínas de transporte de lípidos non específicas que son necesarias para a aparición da resistencia sistémica adquirida (SAR). Co desenvolvemento de reaccións protectoras, a proteína DIR1 transpórtase desde o foco de infección a través do floema para inducir a SAR en órganos distantes. Curiosamente, o xene DIR1 TanjilG_02313 induciuse significativamente no primeiro punto temporal nas liñas 84A:476 e na Poboación 22660, pero a resistencia á antracnose só se desenvolveu con éxito na liña 84A:476. Isto pode indicar certa subfuncionalización do xene DIR1 na NLL, xa que os tres homólogos restantes responderon á inoculación só na liña 83A:476 ás 6 hpi, e esta resposta dirixiuse cara abaixo.
No noso estudo, os compoñentes máis comúns correspondentes ao proceso biolóxico denominado «GO:0055114 Proceso redox» foron a proteína do citocromo P450, a peroxidase, a 9S-/13S-lipoxixenase do ácido linoleico e a oxidase do ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico. Ademais, o noso WGCNA define o homólogo HSFA4a como un centro que leva módulos como o xene candidato de resistencia a Lanr1, TanjilG_05042. O HSFA4a é un compoñente da regulación dependente de redox da transcrición nuclear nas plantas.
As proteínas do citocromo P450 son oxidorredutases que catalizan as reaccións de hidroxilación dependentes de NADPH e/ou O2 no metabolismo primario e secundario, incluído o metabolismo de xenobióticos, así como hormonas, ácidos graxos, esterois, compoñentes da parede celular, biopolímeros e a biosíntese de compostos protectores 69. No noso Nun estudo, a variabilidade na función do citocromo P450 das plantas reduciuse de -10,6 log2 (cambio de pregamento) a 5,7 debido a un gran número de homólogos alterados (37) e diferenzas nos patróns de resposta entre xenes específicos, o que reflicte unha revisión á alza. . Usar só datos de secuenciación de ARN para dilucidar a suposta función biolóxica dos xenes NLL nunha superfamilia de proteínas tan grande sería altamente especulativo. Non obstante, cómpre sinalar que algúns xenes do citocromo P450 están asociados a unha maior resistencia a fungos ou bacterias patóxenas, incluída unha contribución ás reaccións alérxicas 69,70,71.
As peroxidases de clase III son encimas vexetais multifuncionais implicados nunha ampla gama de procesos metabólicos durante o crecemento e desenvolvemento das plantas, así como en resposta a estreses ambientais como a salinidade, a seca, a alta intensidade lumínica e o ataque de patóxenos72. As peroxidases están implicadas na interacción de varias especies de plantas con Anthracis, incluíndo Stylosanthes humilis e C. gloeosporioides, Lens culinaris e C. truncatum, Phaseolus vulgaris e C. lindemuthianum, Cucumis sativus e C. lagenarium73,74,75,76. A resposta é moi rápida, ás veces incluso a 4 HPI, antes de que o fungo penetre no tecido vexetal73. O xene da peroxidase tamén respondeu á inoculación NLL de D. toxica. Ademais das súas funcións típicas para regular a explosión oxidativa ou eliminar o estrés oxidativo, as peroxidases poden interferir co crecemento de patóxenos ao crear barreiras físicas baseadas no reforzo da parede celular durante a lignificación, a subunidade ou a reticulación de compostos específicos. Esta función pódese atribuír in silico ao xene TanjilG_03329 que codifica unha suposta peroxidase aniónica formadora de lignina que se regulou positivamente de forma significativa no noso estudo na liña resistente 83A:476 a 6 HPI, pero non noutras cepas e puntos temporais que non responderon.
A 9S-/13S-lipoxixenase do ácido linoleico é o primeiro paso na vía oxidativa da biosíntese de lípidos78. Os produtos desta vía teñen múltiples funcións na defensa das plantas, incluíndo o fortalecemento da parede celular mediante a formación de depósitos de calosa e pectina, e a regulación do estrés oxidativo mediante a produción de especies reactivas de osíxeno79,80,81,82,83. No presente estudo, a expresión da 9S-/13S-lipoxixenase do ácido linoleico alterouse en todas as cepas, pero na poboación susceptible 22660, a regulación á alza prevaleceu en diferentes puntos temporais, mentres que nas cepas que portaban Lanr1 resistente e o alelo AnMan, enfatiza a diversificación da capa de oxilipina nas reaccións protectoras do antraz entre estes xenotipos.
O homólogo da 1-aminociclopropano-1-carboxilato oxidase (ACO) foi significativamente regulado positivamente (9 xenes) ou negativamente (2 xenes) cando se inoculou con altramuz. Con dúas excepcións, todas estas respostas ocorreron a 6 hp. en 83A:476. A reacción encimática mediada polas proteínas ACO é o paso limitante da velocidade na produción de etileno e, polo tanto, está altamente regulada84. O etileno é unha hormona vexetal que desempeña diversos papeis na regulación do desenvolvemento das plantas e a resposta a condicións de estrés abiótico e biótico. A indución da transcrición de ACO e a activación da vía de sinalización do etileno están implicadas no aumento da resistencia do arroz ao fungo hemibiotrófico oryzae oryzae ao regular a produción de especies reactivas de osíxeno e fitoalexinas. Un proceso de infección foliar moi similar atopado entre M. oryzae e C. lupini88,89, no contexto dunha regulación á alza significativa dos homólogos de ACO na liña 83A:476 descrita neste estudo, cambia a posibilidade de conferir resistencia á antracnose etileno NLL, un paso central de sinalización nas vías moleculares.
No presente estudo, observouse a supresión a grande escala de moitos xenes asociados coa fotosíntese a 6 hpi en 83A:476 e a 48 hpi en Mandeloop e na poboación 22660. A extensión e a progresión destes cambios son proporcionais ao nivel. Neste experimento observouse resistencia á antracnose. Recentemente, informouse dunha represión forte e temperá dos transcritos relacionados coa fotosíntese en varios modelos de interaccións planta-patóxeno, incluíndo bacterias e fungos patóxenos. A présa (a partir de 2 HPI nalgunhas interaccións) e a supresión global de xenes asociados coa fotosíntese en resposta á infección poden desencadear a inmunidade das plantas baseándose no despregamento de especies reactivas de osíxeno e a súa interacción coa vía do ácido salicílico para mediar reaccións alérxicas 90,94.
En conclusión, os mecanismos de resposta de defensa propostos para a liñaxe máis resistente (83A:476) inclúen o recoñecemento rápido de patóxenos polo xene R (presumiblemente TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) e a sinalización de ácido salicílico e etileno mediada por resposta alérxica, seguida do establecemento dunha acción SAR de longo alcance. A acción está apoiada pola proteína DIR-1. Cómpre sinalar que o período biotrófico para a infección por C. lupini é moi curto (aproximadamente 2 días), seguido de crecemento necrótico95. A transición entre estas etapas pode estar asociada á necrose e á expresión de proteínas inducibles por etileno que actúan como desencadeantes de reaccións de hipersensibilidade nas plantas hospedadoras. Polo tanto, a xanela de tempo para a captura exitosa de C. lupini na etapa biotrófica é moi estreita. A reprogramación de xenes asociados coa oxidación-redox e a fotosíntese observada en 83A:476 a 6 hpi é consistente coa progresión das hifas fúnxicas e anuncia o desenvolvemento dunha resposta protectora exitosa na etapa biotrófica. As respostas transcriptómicas de Mandelup e da poboación 22660 poden ser demasiado tardías para capturar o fungo antes de cambiar a crecemento necrótico; porén, Mandelup pode ser máis eficaz que a poboación 22660 porque a regulación relativamente rápida da proteína PR-10 promove a resistencia horizontal.
A ETI, impulsada polo xene R canónico, parece ser un mecanismo común para a resistencia da faba á antracnose. Así, na leguminosa modelo Medicago truncatula, a resistencia á antracnose confírella o xene RCT1, un membro da clase de xenes R da planta TIR-NBS-LRR97. Este xene tamén confire resistencia á antracnose de amplo espectro na alfalfa cando se transfire a plantas susceptibles. Na faba común (P. vulgaris), identificáronse ata a data máis de dúas ducias de xenes de resistencia á antracnose. Algúns destes xenes atópanse en rexións que carecen de xenes R canónicos, non obstante, moitos outros están situados nos bordos dos cromosomas que levan o grupo de xenes NBS-LRR, incluídos os TIR-NBS-LRRs99. O estudo SSR de todo o xenoma tamén confirmou a asociación do xene NBS-LRR coa resistencia á antracnose na faba común. O xene R canónico tamén se atopou na rexión xenómica que leva o principal locus de resistencia á antracnose no lupino branco 101.
O noso traballo demostra que unha reacción de resistencia inmediata, activada nunha fase temperá da infección da planta (preferiblemente non máis tarde de 12 hpi), protexe eficazmente o lupino de folla estreita da antracnose causada polo fungo patóxeno Collelotrichum lupini. Usando a secuenciación de alto rendemento, demostramos perfís de expresión diferencial de xenes de resistencia á antracnose en plantas NLL mediados polos xenes de resistencia Lanr1 e AnMan. Unha defensa exitosa implica deseñar coidadosamente os xenes para as proteínas implicadas na oxidación-oxidación, a fotosíntese e a patoxénese dentro das horas posteriores ao primeiro contacto da planta cun patóxeno. Reaccións protectoras similares, pero retardadas no tempo, son moito menos eficaces para protexer as plantas das enfermidades. A resistencia ao antraz mediada polo xene Lanr1 parécese á resposta rápida típica do xene R (inmunidade desencadeada por efectores), mentres que o xene AnMan probablemente proporciona unha resposta horizontal (inmunidade desencadeada por un patrón molecular asociado a microbios), proporcionando un nivel moderado de sustentabilidade.
As 215 liñas NLL empregadas para detectar marcadores de antracnose consistían en 74 cultivares, 60 liñas obtidas por cruzamento ou reprodución, 5 mutantes e 76 xermoplasmas salvaxes ou orixinais. As liñas procedían de 17 países, principalmente de Polonia (58), España (47), Alemaña (27), Australia (26), Rusia (19), Belarús (7), Italia (5) e outras liñas de 10 países. O conxunto tamén inclúe liñas resistentes de referencia: 83A:476, Tanjil, Wonga que leva o alelo Lanr1 e Mandelup que leva o alelo AnMan. As liñas obtivéronse da Base de Datos Europea de Recursos Xenéticos de Lupino mantida por Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polonia (Táboa suplementaria S1).
As plantas cultiváronse en condicións controladas (fotoperíodo 16 horas, temperatura 25 °C durante o día e 18 °C pola noite). Analizáronse dúas réplicas biolóxicas. Illouse ADN de follas de tres semanas de idade utilizando o kit DNeasy Plant Mini (Qiagen, Hilden, Alemaña) segundo o protocolo. A calidade e a concentración do ADN illado avaliáronse mediante métodos espectrofotométricos (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Analizáronse o marcador AnManM1 que marca o xene de resistencia á antracnose AnMan (derivado do cv. Mandelup) e os marcadores Anseq3 e Anseq4 que flanquean o xene Lanr1 (derivado do cv. Tanjil) 11, 26, 28. Os homocigotos para o alelo resistente puntuáronse como "1", os susceptibles como "0" e os heterocigotos como 0,5.
Baseándose nos resultados da selección dos marcadores AnManM1, AnSeq3 e AnSeq4 e na dispoñibilidade de sementes para os experimentos de seguimento finais, seleccionáronse 50 liñas NLL para a fenotipificación da resistencia á antracnose. A análise realizouse por duplicado nun invernadoiro controlado por ordenador cun fotoperíodo de 14 horas cun rango de temperatura de 22 °C durante o día e 19 °C pola noite. As sementes rañábanse (cortando a cuberta da semente no lado oposto do embrión cunha lámina afiada) antes da sementeira para evitar a dormencia das sementes debido a que a cuberta é demasiado dura e para garantir unha xerminación uniforme. As plantas cultiváronse en macetas (11 × 11 × 21 cm) con terra estéril (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsovia, Polonia). A inoculación realizouse coa cepa Colletotrichum lupini Col-08, cultivada en 1999 a partir dos talos de plantas de altramuz de folla estreita cultivadas nun campo en Verzhenitsa, Gran Polonia (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Obtén unha área. Os illamentos cultiváronse en medio SNA a 20 °C baixo luz negra durante 21 días para inducir a esporulación. Catro semanas despois da sementeira, cando as plantas alcanzaran a fase de 4-6 follas, a inoculación realizouse pulverizando cunha suspensión de conidios a unha concentración de 0,5 x 106 conidios por ml. Despois da inoculación, as plantas mantivéronse na escuridade durante 24 horas a unha humidade de aproximadamente o 98 % e unha temperatura de 25 °C para facilitar a xerminación das conidios e o proceso de infección. As plantas cultiváronse entón baixo un fotoperíodo de 14 horas a 22 °C de día/19 °C de noite e 70 % de humidade. A puntuación da enfermidade realizouse 22 días despois da inoculación e oscilou entre 0 (inmune) e 9 (moi susceptible) dependendo da presenza ou ausencia de lesións necróticas nos talos e nas follas. Ademais, despois da puntuación, mediuse o peso das plantas. As relacións entre os xenotipos marcadores e os fenotipos da enfermidade calculáronse como correlacións puntuais de dúas secuencias (ausencia de marcadores heterocigotos no conxunto de liñas para a análise do fenotipo de resistencia á antracnose).