Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рақмет. Сіз пайдаланып отырған браузер нұсқасында CSS қолдауы шектеулі. Ең жақсы тәжірибе алу үшін жаңартылған браузерді пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer бағдарламасында үйлесімділік режимін өшіріңіз). Сонымен қатар, үздіксіз қолдауды қамтамасыз ету үшін сайтты стильдер мен JavaScriptсіз көрсетеміз.
Angustifolius люпині (NLL, Lupinus angustifolius L.) - азық-түлік өндірісі және топырақты жақсарту үшін қолданылатын бұршақ тұқымдас өсімдік. NLL-дің дақыл ретінде жаһандық кеңеюі көптеген патогенді саңырауқұлақтарды, соның ішінде жойқын антракноз ауруын тудыратын люпин антракнозын тартты. NLL селекциясында төзімділікті арттыратын екі аллель, Lanr1 және AnMan, қолданылды, бірақ негізгі молекулалық механизмдер белгісіз болып қала береді. Бұл зерттеуде Lanr1 және AnMan маркерлері еуропалық NLL үлгілерін скринингтеу үшін пайдаланылды. Вакцинаны бақыланатын ортада сынау екі төзімді донордың да тиімділігін растады. Ген экспрессиясының дифференциалды профилі репрезентативті төзімді және сезімтал желілерде жүргізілді. Антракнозға төзімділік «GO:0006952 қорғаныс реакциясы», «GO:0055114 тотығу-тотықсыздану процесі» және «GO:0015979 фотосинтезі» ген онтологиясы терминдерінің шамадан тыс экспрессиясымен байланысты болды. Сонымен қатар, Lanr1(83A:476) желісі инокуляциядан кейін транскриптомның тез қайта бағдарламалануын көрсетті, ал басқа желілерде бұл жауап шамамен 42 сағатқа кешіктірілген. Қорғаныс реакциялары TIR-NBS, CC-NBS-LRR және NBS-LRR гендерімен, патогенезге қатысатын 10 ақуызбен, липидтерді тасымалдау ақуыздарымен, эндоглюкан-1,3-β-глюкозидазамен, глицинге бай жасуша қабырғасы ақуыздарымен және оттегінің реактивті жолынан гендермен байланысты. 83A:476-ға ерте жауаптар, соның ішінде фотосинтезбен байланысты гендерді мұқият басу, саңырауқұлақ биологиясының вегетативті өсу фазасында сәтті қорғаныспен сәйкес келді, бұл эффектор иммунитетті іске қосатынын көрсетеді. Манделуп реакциясы, жалпы көлденең кедергі сияқты баяулайды.
Жіңішке жапырақты люпин (NLL, Lupinus angustifolius L.) - батыс Жерорта теңізі аймағынан шыққан ақуызға бай дәнді дақыл1,2. Қазіргі уақытта ол жануарлар мен адамдарға арналған азық-түлік дақылы ретінде өсіріледі. Ол сондай-ақ симбиотикалық азотты бекітетін бактериялар арқылы азотты бекітуге және топырақ құрылымының жалпы жақсаруына байланысты ауыспалы егіс жүйелерінде жасыл тыңайтқыш болып саналады. NLL өткен ғасырда тез қолға үйрету процесінен өтті және әлі күнге дейін жоғары көбею қысымында3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. NLL кеңінен өсірумен патогендік саңырауқұлақтардың бірізділігі жаңа ауылшаруашылық тауашаларын дамытып, дақылдарды бұзатын жаңа ауруларды тудырды. Люпин өсірушілер мен селекционерлер үшін ең таңқаларлық жағдай патогенді саңырауқұлақ Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 тудырған антракнозаның пайда болуы болды. Люпин өсірушілер мен селекционерлер үшін ең таңқаларлық жағдай патогенді саңырауқұлақ Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 тудырған антракнозаның пайда болуы болды. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогенді грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Люпин өсірушілер мен селекционерлер үшін ең маңыздысы Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 патогенді саңырауқұлақтарынан туындаған антракнозаның пайда болуы болды.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它的出现，它眯由由它是由由(Бондар) Ниренберг, Фейлер және Хагедорн13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它的出现，它眯由由它是由由(Бондар)嵵Шашты。1 Наиболее поразительным для фермеров және селекционеров люпина является появление антракноза, патогенді грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Люпин өсірушілер мен селекционерлер үшін ең таңқаларлық жағдай - Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 патогенді саңырауқұлақтарынан туындаған антракнозаның пайда болуы.Ауру туралы алғашқы хабарламалар Бразилия мен Америка Құрама Штаттарынан келді, типтік белгілері сәйкесінше 1912 және 1929 жылдары пайда болды. Дегенмен, шамамен 30 жылдан кейін патоген Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz деп белгіленді. & Sacc., телеоморфты Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморфты Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld телеоморфы. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld нысанаға алынған морфологияда. және Х. Шренк,. және Х. Шренк, .және Х. Шренк. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。және Х. Шленк,.20 ғасырдың ортасында жүргізілген алдын ала ауру фенотиптеу NLL және сары люпин (L. luteus L.) үлгілерінде белгілі бір төзімділік көрсетті, бірақ тексерілген барлық ақ люпин (L. albus L.) үлгілері өте сезімтал болды15,16. Зерттеулер антракнозаның дамуы жауын-шашынның (ауа ылғалдылығы) және температураның (12-28°C диапазонында) жоғарылауымен байланысты екенін көрсетті, бұл жоғары температурада төзімділіктің бұзылуына әкеледі17, 18. Шын мәнінде, конидиялардың өніп шығуы мен аурудың басталуы үшін қажетті уақыт жоғары ылғалдылық жағдайындағы 12°C (16 сағат) температураға қарағанда 24°C (4 сағат) температурада төрт есе қысқа болды19. Осылайша, жаһандық жылыну антракнозаның таралуына әкелді. Дегенмен, ауру Францияда (1982) және Украинада (1983) жақындап келе жатқан қауіптің хабаршысы ретінде байқалды, бірақ сол кезде люпин өнеркәсібі оны елемеген сияқты20,21. Бірнеше жылдан кейін бұл жойқын ауру бүкіл әлемге таралып, Австралия, Польша және Германия сияқты ірі люпин өндіруші елдерге де әсер етті22,23,24. 1990 жылдардың ортасында антракноз індетінен кейін кең ауқымды скрининг нәтижесінде NLL19 үлгілерінде бірнеше төзімді донорлар анықталды. NLL антракнозаға төзімділігін әртүрлі гермоплазма көздерінде кездесетін екі бөлек доминантты аллель бақылайды: Танжил және Вонга сорттарындағы Lanr1 және Мандалай сортындағы AnMan. 25, 26. Бұл аллельдер селекциялық бағдарламаларда төзімді гермоплазманы таңдауды қолдайтын молекулалық маркерлерді толықтырады25,26,27,28,29,30. Lanr1 аллелін тасымалдайтын 83A:476 төзімді көбею сызығы антракнозға төзімділік үшін бөлінетін RIL популяциясын алу үшін сезімтал жабайы P27255 сызығымен будандастырылды, бұл Lanr1 локусын NLL-1131, 32, 33 хромосомасына жатқызуға мүмкіндік берді. Геномдық құрылыммен бүйірлік төзімділік локустарынан антракнозға дейінгі байланыс картасы маркерлерін туралау арқылы NLL үш аллельдің де бір хромосомада (NLL-11) орналасқанын, бірақ әртүрлі позицияларда екенін анықтады29,34,35. Дегенмен, RIL санының аздығына және маркерлер мен сәйкес аллельдер арасындағы үлкен генетикалық қашықтыққа байланысты олардың негізгі гендеріне қатысты сенімді қорытынды жасау мүмкін емес. Екінші жағынан, люпиндерде кері генетиканы қолдану олардың өте төмен регенерация әлеуетіне байланысты қиын, бұл генетикалық манипуляцияны қиындатады37.
Гомозиготалы күйде қажетті аллельді тасымалдайтын 83A:476 (Lanr1) және Mandelup (AnMan) сияқты үй жағдайындағы гермоплазманың дамуы жабайы популяцияларда аллельдердің қарама-қарсы комбинацияларының болуы жағдайында антракнозға төзімділікті зерттеуге мүмкіндік берді. Молекулалық механизмдердің мүмкіндіктері. Нақты генотиптермен туындаған қорғаныс реакцияларын салыстырыңыз. Бұл зерттеуде NLL-дің C. lupini вакцинациясына ерте транскриптомдық реакциясы бағаланды. Алдымен, Lanr1 және AnMan аллельдерін белгілейтін молекулалық маркерлерді пайдаланып, 215 сызықтан тұратын еуропалық NLL гермоплазмалық панелі тексерілді. Содан кейін антракноз фенотипін анықтау бұрын молекулалық маркерлер үшін таңдалған 50 NLL сызықтарында бақыланатын жағдайларда жүргізілді. Осы тәжірибелерге сүйене отырып, екі қосымша тәсілді қолдана отырып, дифференциалды қорғаныс генінің экспрессиясын профильдеу үшін антракнозға төзімділік пен Lanr1/AnMan аллельді құрамы бойынша ерекшеленетін төрт сызық таңдалды: жоғары өнімді РНҚ секвенирлеу және нақты уақыттағы ПТР сандық анықтау.
Lanr1 (Anseq3 және Anseq4) және AnMan (Anseq4) және AnMan (AnManM1) маркерлерімен NLL гермоплазмасының жиынтығын (N = 215) скринингтеу тек бір ғана сызықтың (95726, Саламанка-b маңында) барлық маркерлер үшін «кедергі» аллельін күшейтетінін көрсетті, ал «'Сезімтал' аллельдердің болуы» 158 (~73,5%) сызықтардағы барлық маркерлердің үлесін анықтады. Он үш сызық Lanr1 маркерінің екі «кедергі» аллельдерін, ал 8 сызық Lanr1 маркерінің «кедергі» аллельдерін шығарды. AnMan маркерінің «кедергі» аллелі (S1 қосымша кестесі). Anseq3 маркері үшін екі сызық гетерозиготалы және AnManM1 маркері үшін бір гетерозиготалы болды. 42 сызық (19,5%) Anseq3 және Anseq4 аллельдерінің қарама-қарсы фазаларын тасымалдады, бұл осы екі локус арасындағы рекомбинацияның жоғары жиілігін көрсетеді. Бақыланатын жағдайларда антракноз фенотиптері (S2 қосымша кестесі) тексерілген генотиптердің төзімділігіндегі өзгергіштікті анықтады, бұл антракноздың ауырлығында көрініс тапты. Орташа баллдардағы айырмашылықтар 1,8-ден (орташа төзімді) 6,9-ға дейін (сезімтал) және өсімдік салмағындағы айырмашылықтар 0,62-ден (сезімтал) 4,45 г-ға дейін (төзімді) болды. Тәжірибенің екі репликациясында байқалған мәндер (аурудың ауырлық көрсеткіштері үшін 0,51, P = 0,00017 және өсімдік салмағы үшін 0,61, P < 0,0001), сондай-ақ осы екі параметр (− 0,59 және − 0,77, P < 0,0001) арасында айтарлықтай корреляция болды. Тәжірибенің екі репликациясында байқалған мәндер (аурудың ауырлық көрсеткіштері үшін 0,51, өсімдік салмағы үшін P = 0,00017 және 0,61, P < 0,0001), сондай-ақ осы екі параметр (− 0,59 және − 0,77, P < 0,0001) арасында айтарлықтай корреляция болды. Выявлена ​​достоверная корреляция арасындағы значениями, наблюдаемыми в в двух повторностях эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 және 0,61 үшін массы растения, P < 0,0001 параметр), а также-медв5 (параметрлер) -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Тәжірибенің екі қайталануында байқалған мәндер (аурудың ауырлық көрсеткіштері үшін 0,51, өсімдік салмағы үшін P = 0,00017 және 0,61, P < 0,0001), сондай-ақ осы екі параметр (- 0,59 және -0,77, P < 0,0001) 0,0001) арасында айтарлықтай корреляция анықталды.在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分1，0. 0,00017，植物重量为0,61，P <0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77＂0, P <1)在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 严重 程度 为庈分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之闈 （（（（9. 0,59 和– 0,59 和– 0,59 和- 0,77，P <0,0001)。 Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 және масса растения 0,61, P <0,0001), и двиумя параметрі -0,0001) 0,77, P <0,0001. Қайталама түрде байқалған мәндер (аурудың ауырлық көрсеткіші 0,51, P = 0,00017 және өсімдік салмағы 0,61, P < 0,0001) және осы екі параметр (-0,59 және -0,0001) 0,77, P<0,0001 арасында айтарлықтай корреляция болды. ).Сезімтал өсімдіктерде байқалатын типтік белгілерге «қойшы садағы» құрылымына ұқсайтын сабақтың майысуы және бұралуы, содан кейін қызғылт сары/қызғылт спорозоиттері бар сопақша зақымданулар жатады (қосымша 1-сурет). Lanr1 (83A:476 және Tanjil) және AnMan (Mandelup) гендерін тасымалдайтын австралиялық үлгілер орташа төзімді, 0,0331 және 0,0036). «Төзімді» Lanr1 және/немесе AnMan аллельдерін тасымалдайтын кейбір линиялар аурудың белгілерін көрсетеді.
Қызығы, «төзімді» маркер аллелі жоқ бірнеше NLL желілері антракнозға төзімділіктің жоғары деңгейін көрсетті (Lanr1 немесе AnMan генотиптерімен салыстырмалы немесе одан жоғары), мысалы, Boregine (P мәні екі параметр үшін де < 0,0001), Bojar (P мәні ұпай үшін < 0,0001 және өсімдік салмағы үшін 0,001) және Population B-549/79b (P мәні ұпай үшін < 0,0001 және салмақ үшін маңызды емес). Қызығы, «төзімді» маркер аллелі жоқ бірнеше NLL желілері антракнозға төзімділіктің жоғары деңгейін көрсетті (Lanr1 немесе AnMan генотиптерімен салыстырмалы немесе одан жоғары), мысалы, Boregine (P мәні екі параметр үшін де < 0,0001), Bojar (P мәні ұпай үшін < 0,0001 және өсімдік салмағы үшін 0,001) және Population B-549/79b (P мәні ұпай үшін < 0,0001 және салмақ үшін маңызды емес). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый немесе более жоғары, чем генотипов үшін Lanr1 немесе AnMan как), тағы10, тағы10, обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки және 0,001 для массы растения) және танымал B-549/79b (значение P <0,0001 үшін осценки және незначимо үшін массы). Қызығы, «төзімді» маркер аллелі жоқ бірнеше NLL желілері антракнозаға жоғары деңгейдегі төзімділікті көрсетті (Lanr1 немесе AnMan генотиптерімен салыстыруға болады немесе одан жоғары), мысалы, Boregine (P мәні екі параметр үшін де < 0,0001), Bojar (бағалау үшін P мәні < 0,0001 және өсімдік салмағы үшін 0,001) және B-549/79b популяциясы (бағалау үшін P мәні < 0,0001 және салмақ үшін маңызды емес).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭L，一些缺乏任何“抗性”或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P值<得分为0,0001，植物重量为0,001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）。 «Антигендік» маркерлері жоқ кейбір NLL жүйелері жоғары көлденең кедергіні (Lanr1 немесе AnMan гендеріне баламалы немесе одан жоғары) көрсететіні қызық, мысалы, Boregine (екі параметрі де P < 0,0001), Bojar (P мәні < 0,0001, өсімдік салмағы 0,001) және B-549/79b штаммы (P мәні < 0,0001, салмағы маңызды емес). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 немесе AnMan), обзначение как Boregine00, обзначение как Boregine00 Божар (значение P <0,0001, масса растения 0,001) және популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Қызығы, «кедергі» маркерлік аллельдері жоқ кейбір NLL желілері антракнозға төзімділіктің жоғары деңгейін көрсетті (Lanr1 немесе AnMan генотиптерімен салыстыруға болады немесе одан жоғары), мысалы, Boregine (екі параметр үшін де P мәні <0,0001), Bojar (P мәні <0,0001, өсімдік салмағы 0,001) және B-549/79b популяциясы (P мәні <0,0001, салмағы маңызды емес).Бұл құбылыс маркерлік генотиптер мен ауру фенотиптері арасындағы корреляцияның болмауын түсіндіретін жаңа генетикалық төзімділік көзінің болуы мүмкін екенін көрсетеді (P мәндері ~0,42-ден ~0,98-ге дейін). Осылайша, Колмогоров-Смирнов сынағы антракнозға төзімділік туралы деректердің ұпайлар (P-мәндері 0,25 және 0,11) және өсімдік массасы (P-мәндері 0,47 және 0,55) бойынша шамамен қалыпты таралғанын көрсетті, бұл менің Lanr1 мен AnMan-ға қарағанда көбірек аллельдер қатысады деген болжамды білдіретінін көрсетеді.
Антракнозға төзімділікті скринингтеу нәтижелері бойынша транскриптомды талдау үшін 4 желі таңдалды: 83A:476, Boregine, Mandelup және Population 22660. Бұл желілер алдыңғы сынақтағыдай болған жағдайда, инокуляциялық тәжірибелерде сібір жарасына төзімділікке РНҚ секвенирлеу арқылы қайта сыналды. Ұпай мәндері келесідей болды: Boregin (1.71 ± 1.39), 83A: 476 (2.09 ± 1.38), Mandelup (3.82 ± 1.42) және 22660 популяциясы (6.11 ± 1.29).
Illumina NovaSeq 6000 хаттамасы үлгіге орта есеппен 40,5 Mread жұбына қол жеткізді (29,7-ден 54,4 Mread-ке дейін) (S3 қосымша кестесі). Анықтамалық тізбектегі туралау ұпайлары 75,5%-дан 88,6%-ға дейін болды. Биологиялық қайталамалар арасындағы эксперименттік нұсқалар арасындағы оқу саны деректерінің орташа корреляциясы 0,812-ден 0,997-ге дейін болды (орташа 0,959). Талданған 35 170 геннің 2917-сінде экспрессия байқалмады, ал қалған 4785 ген елеусіз деңгейде экспрессияланды (базалық орташа < 5). Талданған 35 170 геннің 2917-сінде экспрессия байқалмады, ал қалған 4785 ген елеусіз деңгейде экспрессияланды (базалық орташа < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, және негізгі 4785 генов экспрессирование на незначительном уровне (базовое среднее <5). Талданған 35 170 геннің 2917-сінде экспрессия байқалмады, ал қалған 4785 ген елеусіз деңгейде экспрессияланды (базалық орташа мән <5).在分析的35 170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35 170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировать, а остальные 4785 генов имели незначительную экспрессию (базовое среднее значение <5). Талданған 35 170 геннің 2917-сі экспрессияланбаған, ал қалған 4785 геннің экспрессиясы елеусіз болған (негізгі орташа мән <5).Осылайша, эксперимент кезінде экспрессияланған деп саналатын гендердің саны (негізгі орташа ≥ 5) 27 468 (78,1%) болды (S4 қосымша кестесі).
Бірінші уақыт нүктесінен бастап, барлық NLL желілері C. lupini (Col-08 штаммы) егуіне транскриптомды қайта бағдарламалау арқылы жауап берді (1-кесте), дегенмен желілер арасында айтарлықтай айырмашылықтар байқалды. Осылайша, 83A:476 кедергі сызығы (Lanr1 генін тасымалдайтын) бірінші уақыт нүктесінде (6 hpi) транскриптомның айтарлықтай қайта бағдарламалануын көрсетті, бұл уақыт нүктесіндегі басқа уақыт нүктелерімен салыстырғанда оқшауланған жоғары және төмен гендер санының 31-69 есе артуы байқалды. Сонымен қатар, бұл шың қысқа мерзімді болды, себебі екінші уақыт нүктесінде (12 hpi) тек бірнеше геннің экспрессиясы айтарлықтай өзгерген күйінде қалды. Қызығы, трансплантат сынағында да жоғары деңгейдегі кедергі көрсеткен Boregine эксперимент кезінде мұндай жаппай транскрипциялық қайта бағдарламалаудан өтпеді. Дегенмен, дифференциалды экспрессияланған гендер саны (DEG) Boregine және 83A:476 үшін 12 HPI кезінде бірдей болды. Манделуп та, 22660 популяциясы да соңғы уақыт нүктесінде DEG шыңдарын көрсетті (48 л/с), бұл қорғаныс реакцияларының салыстырмалы түрде кідіргенін көрсетеді.
83A:476 басқа барлық желілермен салыстырғанда 6 HPI кезінде C. lupini-ге жауап ретінде жаппай транскриптомды қайта бағдарламалаудан өткендіктен, осы уақытта байқалған DEG-лердің ~91%-ы тектік сипатта болды (1-сурет). Дегенмен, зерттеу желілері арасындағы ерте жауаптарда кейбір сәйкестіктер болды, өйткені Борегин, Манделап және 22660 популяциясындағы сәйкесінше 68,5%, 50,9% және 52,6% DEG белгілі бір уақыт кезеңдерінде 83A:476-да табылғандармен сәйкес келді. Дегенмен, бұл DEG-лер қазіргі уақытта 83A:476 көмегімен анықталған барлық DEG-лердің тек аз ғана бөлігін (0,97–1,70%) құрады. Сонымен қатар, барлық желілерден алынған 11 DEG осы уақытта когерентті болды (S4-S6 қосымша кестелері), оның ішінде өсімдік қорғаныс реакцияларының жалпы компоненттері: липидті тасымалдау ақуызы (TanjilG_32225), эндоглюкан-1,3-β-глюкозид ферменті (TanjilG_23384), SAM22 (TanjilG_31528 және TanjilG_31531) сияқты екі стресс-индукцияланатын ақуыз, негізгі латекс ақуызы (TanjilG_32352) және екі глицинге бай құрылымдық жасуша қабырғасы ақуыздары (TanjilG_19701 және TanjilG_19702). Сондай-ақ, 24 HPI кезінде 83A:476 мен Борегин арасында (жалпы 16-38% DEG) және 48 HPI кезінде Манделап пен 22660 популяциясы арасында (жалпы 14-20% DEG) транскриптом реакцияларында салыстырмалы түрде жоғары сәйкестік байқалды.
Венн диаграммасы Colletotrichum lupini (1999 жылы Польшаның Верженице қаласындағы люпин егістіктерінен алынған Col-08 штаммы) егілген тар жапырақты люпин (NLL) желілеріндегі дифференциалды экспрессияланған гендер санын (DEG) көрсетеді. Талданған NLL желілері: 83A:476 (төзімді, Lanr1 аллелін тасымалдайды), Boregine (төзімді, генетикалық тегі белгісіз), Mandelup (орташа төзімді, AnMan аллелін тасымалдайды) және 22660 популяциясы (өте сезімтал). hpi аббревиатурасы вакцинациядан кейінгі сағаттарды білдіреді. Графикті жеңілдету үшін нөлдік мәндер алынып тасталды.
6 hpi кезінде шамадан тыс экспрессияланған гендер жиынтығы канондық R ген домендерінің болуына талданды (S7 қосымша кесте). Бұл зерттеу тек 83A:476 кезінде NBS-LRR домендері бар классикалық ауруға төзімділік гендерінің транскриптомдық индукциясын анықтады. Бұл жиынтық бір TIR-NBS-LRR генінен (tanjilg_05042), бес CC-NBS-LRR генінен (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 және tanjilg_16162), сондай-ақ төрт NBS-LR, Tanjilg_16162) және төрт NBS-LRRE (tanjilg_16162), сондай-ақ төрт NBS-Lrr (tanjilg_16162) және төрт NBS-LRR (TANJILG_16162) тұрды. Бұл гендердің барлығында сақталған тізбектерде орналасқан канондық домендері бар. NBS-LRR домен гендерінен басқа, бірнеше RLL киназасы 6 ат күші кезінде белсендірілді, атап айтқанда біреуі Борегинде (TanjilG_19877), екеуі Манделупта (TanjilG_07141 және TanjilG_19877) және екеуі 22660 популяциясында (TanjilG_09014 және TanjilG_10361) және екеуі 83A 27:476-да.
C. lupini (Col-08 штаммы) егуіне жауап ретінде экспрессиясы айтарлықтай өзгерген гендер ген онтологиясын (GO) байыту талдауына ұшырады (S8 қосымша кесте). Биологиялық процесс термині ең жиі кездесетін «GO:0006952 қорғаныс реакциясы» болды, ол 16 (уақыт × сызық) комбинациясының 6-сында жоғары маңыздылықпен (P мәні < 0,001) пайда болды (2-сурет). Биологиялық процесс термині ең жиі кездесетін «GO:0006952 қорғаныс реакциясы» болды, ол 16 (уақыт × сызық) комбинациясының 6-сында жоғары маңыздылықпен (P мәні < 0,001) пайда болды (2-сурет). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологиялық процесс «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001). Биологиялық процесс термині ең жиі шамадан тыс көрсетілген «GO:0006952 қорғаныс реакциясы» болды, ол 16 (уақыт × сызықтық) комбинацияның 6-сында жоғары маңыздылықпен (P мәні < 0,001) пайда болды (2-сурет).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 Биологиялық процестің ең өкілдік термині - «GO:0006952 қорғаныс реакциясы», ол 16 (时间×线) комбинациясының 6-сында кездеседі, маңыздылығы жоғары (P мәні <0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологиялық процесс «GO: 0006952 Defense Response», 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0.001) 6-дан 16-ға дейін негіз болады. Биологиялық процесс термині ең жиі кездесетіні «GO:0006952 қорғаныс реакциясы» болды, ол 16 комбинацияның 6-сында (уақыт × сызық) жоғары маңыздылықпен (P мәні < 0,001) пайда болды (2-сурет).Бұл термин 83A-да екі уақыт нүктесінде артық көрсетілген: 476 және Boregine (6 және 24 а.к. дюйм) және Mandelup және 22660 популяциясында бір уақыт нүктесінде (сәйкесінше 12 және 6 а.к. дюйм). Бұл күтілетін нәтиже, төзімді линиялардың зеңге қарсы реакциясын көрсетеді. Сонымен қатар, 83A:476 C. lupini-ге «GO:0055114 тотығу-тотықсыздану процесі» терминімен көрсетілген тотығу жарылысына қатысты гендерді тез индукциялау арқылы жауап берді, бұл нақты қорғаныс реакциясын көрсетеді, ал Boregine «GO» терминіне қатысты нақты қорғаныс реакцияларын көрсетті. :0006950 Стресстік реакция». 22660 популяциясы екінші реттік метаболиттерді қамтитын көлденең кедергі реакциясын белсендірді, «GO:0016104 Тритерпен биосинтезі процесі» және «GO:0006722 Тритерпен метаболизмі процесі» (екі термин де бірдей гендер жиынтығына жатады) терминдерінің шамадан тыс санын атап өтті, GO терминдерін байыту талдауының нәтижелерін ескере отырып, Манделап реакциясының тұрақтылығы Борегин мен 22660 популяциясы арасында болды. Сонымен қатар, 83A:476 ерте реакциясы (6 а.к.и.) және кешіктірілген Манделап реакциясы мен 22660 популяциясы GO:0015979 «фотосинтез» терминін және басқа да байланысты биологиялық процестерді қамтиды.
Сібір жарасы люпинімен (1999 жылы Польшаның Верженице қаласындағы люпин алқаптарынан алынған Col-08 штаммы) егілген тар жапырақты люпиннің (NLL) транскриптомдық жауаптары кезінде дифференциалды түрде экспрессияланған гендердің аннотациясында таңдалған биопроцесс генінің онтология терминдері өте асыра сілтелген. Талданған NLL желілері: 83A:476 (төзімді, гомозиготалы Lanr1 аллелін тасымалдайды), Борегин (төзімді, белгісіз генетикалық фон), Манделуп (орташа төзімді, гомозиготалы AnMan аллелін тасымалдайды) және 22660 популяциясы (сезімтал).
Бұл зерттеу антракнозға төзімділікке ықпал ететін гендерді анықтауға бағытталғандықтан, GO «GO: 0006952 Қорғаныс реакциялары» және «GO: 0055114 Тотығу-тотықсыздану процестері» терминдеріне жатқызылған гендер шекті мәндермен талданды, себебі бастапқы мән кем дегенде бір сызықпен ≥ 30 құрайды. × log2 статистикалық тұрғыдан маңызды мәндерін біріктіретін уақыт нүктесі (қабат өзгерісі). Осы критерийлерге сәйкес келетін гендердің саны GO:0006952 үшін 65 және GO:0055114 үшін 524 болды.
83A:476 зерттеуінде GO:0006952 терминімен белгіленген екі DEG шыңы анықталды, біріншісі дюймге 6 генмен (64 ген, жоғары және төмен реттеу) және екіншісі дюймге 24 генмен (15 ген, тек жоғары реттеу). Борегин сонымен қатар GO:0006952 шыңының сол уақыттағы нүктесінде, бірақ DEG аз (11 және 8) және артықшылықты белсендірумен жеткенін көрсетті. Манделуп 12 және 48 HPI кезінде GO:0006952 екі шыңын көрсетті, екеуінде де 12 ген болды (біріншісі белсендіретін гендермен, ал екіншісінде тек басу гендерімен), ал 6 HPI (13 ген) кезіндегі 22660 популяцияда өсу шыңының реттелуі басым болды. Айта кету керек, бұл шыңдардағы GO:0006952 DEG-тің 96,4%-ы бірдей жауап түріне ие болды (жоғары немесе төмен), бұл қатысқан гендер санының айырмашылығына қарамастан қорғаныс жауаптарының айтарлықтай сәйкес келетінін көрсетеді. GO:0006952 терминіне қатысты тізбектердің ең үлкен тобы 10-сыныптың патогенезімен байланысты ақуыз (PR-10) ақуыз кладына және негізгі ақуыз латексіне жататын аштық стрессімен байланысты хабарлама ақуызы 22 (SAM22 тәрізді) кодтайды. ұқсас (MLP тәрізді) ақуыз) ақуызы (3-сурет). Екі топ экспрессия сипаты мен жауап бағыты бойынша ерекшеленді. SAM22 тәрізді ақуыздарды кодтайтын гендер ерте уақыт нүктелерінде (6 немесе 12 а.к.и.) тұрақты және маңызды индукция көрсетті және эксперимент соңында әдетте жауап бермеді (48 а.к.и ... 83A:476 және Манделуп 48 ат күші/дюйм жылдамдықпен жүргізілгенде, басқа барлық деректер нүктелері дерлік жауап бермеді. Сонымен қатар, SAM22 тәрізді ақуыз гендерінің экспрессия профильдеріндегі айырмашылықтар антракнозға төзімділіктің өзгергіштігінен кейін байқалды, себебі төзімдірек желілерде бұл гендерді сезімталырақ гендерге қарағанда айтарлықтай индукциялайтын уақыт нүктелері көп болды. LlR18A/B тәрізді тағы бір PR-10 гені SAM22 тәрізді ақуыз геніне өте ұқсас экспрессия үлгісін көрсетті.
«GO:0006952 қорғаныс реакциясы» биологиялық процесс терминінің негізгі компоненттері және Lanr1 және AnMan аллельдерінің кандидат гендерінің экспрессия үлгілері анықталды. Log2 шкаласы егілген (Colletotrichum lupini, Col-08 штаммы, люпин алқаптарынан алынған, Wizhenica, Польша, 1999) және бақылау (жалған егілген) өсімдіктер арасындағы log2 мәндерін (қабат өзгерісін) бір уақытта көрсетеді. Келесі тар жапырақты люпин желілері талданды: 83A:476 (төзімді, гомозиготалы Lanr1 аллелін тасымалдайды), Boregine (төзімді, генетикалық тегі белгісіз), Mandelup (орташа төзімді, гомозиготалы AnMan аллелін тасымалдайды) және 22660 популяциясы (сезімтал).
Сонымен қатар, Lanr1 (TanjilG_05042) және AnMan (TanjilG_12861) РНҚ-секвенциялық кандидат гендерінің экспрессия профильдері бағаланды (3-сурет). TanjilG_05042 гені 83A:476 кезінде тек бірінші уақыт нүктесінде (6 а.к.и.) маңызды жауап (белсендіру) көрсетті, ал TanjilG_12861 Mandeloop-та тек екі уақыт нүктесінде маңызды болды: 6 а.к.и. (төмен реттеу) және 24 а.к.и. (6 а.к.и.и.) реттелетін) ).
GO:0055114 «тотықсыздану-тотықсыздану процесі» терминінде ең көп экспрессияланған гендер цитохром P450 ақуыздары мен пероксидазаны кодтайтын гендер болды (4-сурет). 83A:476-дан 6 HPI кезінде бөлініп алынған үлгілер үшін егілген және бақылау өсімдіктері арасында ең жоғары немесе ең төменгі log2 (қабат өзгерісі) мәндері (гендердің 86,6%-ы үшін) байқалды, бұл генотиптің егілген жынысқа жоғары реакциясын көрсетеді. 83A:476 6 hpi кезінде ең маңызды GO: 0055114 DEG көрсетті (503 ген), ал қалған желілер 48 hpi кезінде (Boregine, 31 ген; Mandelup, 85 ген; және Populyasiya 22660, 78 ген)). GO:0055114 тұқымдасының көптеген гендерінде вакцинацияға екі түрлі реакция (белсендіру және тежеу) байқалды. Қызығы, Манделупеде 48 ат күшімен GO: 0055114 термині үшін анықталған DEG-лердің 97,6%-ға дейіні анықталды. Бұл бақылаулар айтарлықтай кіші масштабқа қарамастан (яғни, мутацияланған тотығу-тотықсыздану гендерінің саны, 85 және 503), манделуптың антракнозаға кешіктірілген транскриптомдық жауаптарының үлгісі 83A:476 ерте реакциясына ұқсас екенін көрсетеді. Борегин және 22660 популяциясында бұл конвергенция сәйкесінше 51,6% және 75,6% төмен.
«GO:0055114 Тотығу-тотықсыздану процесі» биологиялық процесінің негізгі компоненттерінің экспрессия заңдылықтары анықталды. Log2 шкаласы егілген (Colletotrichum lupini, Col-08 штаммы, люпин алқаптарынан алынған, Wizhenica, Польша, 1999) және бақылау (жалған егілген) өсімдіктер арасындағы log2 мәндерін (қабат өзгерісін) бір уақытта көрсетеді. Келесі тар жапырақты люпин желілері талданды: 83A:476 (төзімді, гомозиготалы Lanr1 аллелін тасымалдайды), Boregine (төзімді, генетикалық тегі белгісіз), Mandelup (орташа төзімді, гомозиготалы AnMan аллелін тасымалдайды) және 22660 популяциясы (сезімтал).
83A:476 C. lupini (Col-08 штамы) инокуляциясына транскриптомиялық жауаптар сонымен қатар GO:0015979 «фотосинтез» терминіне жатқызылған гендердің үйлесімді үнсіздігін және басқа да байланысты биологиялық процестерді қамтыды (5-сурет). Бұл GO:0015979 DEG жиынтығында 83A:476 кезінде 6 ат күші кезінде айтарлықтай басылған 105 ген болды. Бұл ішкі жиынтықта Манделупта 22660 популяцияда бір уақытта 48 ат күші кезінде және 35 ген төмендеді, оның ішінде екі генотипке де ортақ 19 DEG болды. GO: 0015979 терминіне қатысты ешқандай DEG кез келген комбинацияда айтарлықтай белсендірілмеді (жол х уақыты).
«GO:0015979 Фотосинтез» биологиялық процесінің негізгі компоненттерінің экспрессия заңдылықтары анықталды. Log2 шкаласы егілген (Colletotrichum lupini, Col-08 штаммы, люпин алқаптарынан алынған, Wizhenica, Польша, 1999) және бақылау (жалған егілген) өсімдіктер арасындағы log2 мәндерін (қабат өзгерісін) бір уақытта көрсетеді. Келесі тар жапырақты люпин желілері талданды: 83A:476 (төзімді, гомозиготалы Lanr1 аллелін тасымалдайды), Boregine (төзімді, генетикалық тегі белгісіз), Mandelup (орташа төзімді, гомозиготалы AnMan аллелін тасымалдайды) және 22660 популяциясы (сезімтал).
Дифференциалды экспрессия талдауының нәтижелеріне сүйене отырып және патогенді саңырауқұлақтарға қарсы қорғаныс реакцияларына қатысатын деп болжануда, нақты уақыт режиміндегі ПТР арқылы экспрессия профильдерін сандық анықтау үшін жеті геннен тұратын бұл жиынтық таңдалды (S9 қосымша кесте).
Болжамды TanjilG_10657 ақуыз гені барлық зерттелген желілерде және уақыт нүктелерінде бақылау (имитациялық) өсімдіктермен салыстырғанда айтарлықтай индукцияланды (S10, S11 қосымша кестелері). Сонымен қатар, TanjilG_10657 экспрессия профилі эксперимент барысында барлық желілер үшін өсу үрдісін көрсетті. 22660 популяциясы TanjilG_10657 инокуляциясына ең жоғары сезімталдықты 114 есе белсендірумен және 24 HPI кезінде ең жоғары салыстырмалы экспрессия деңгейін (4,4 ± 0,4) көрсетті (6a-сурет). PR10 LlR18A ақуыз гені TanjilG_27015 барлық желілерде және уақыт нүктелерінде белсенділікті көрсетті, көптеген деректер нүктелерінде статистикалық маңыздылыққа ие болды (6b-сурет). TanjilG_10657-ге ұқсас, TanjilG_27015-тің ең жоғары салыстырмалы экспрессия деңгейі 24 HPI (19,5 ± 2,4) кезінде 22660 егілген популяцияда байқалды. TanjilG_04706 қышқыл эндохитиназа гені Boregine 6 hpi-ден басқа барлық желілерде және барлық уақыт нүктелерінде айтарлықтай жоғарылады (6c-сурет). Ол бірінші уақыт нүктесінде (6 HPI) 83A:476 кезінде күшті индукцияланды (10,5 есе) және басқа желілерде орташа түрде жоғарылады (6,6-7,5 есе). Тәжірибе барысында TanjilG_04706 экспрессиясы 83A:476 және Boregine-де ұқсас деңгейде қалды, ал Mandelup және 22660 популяциясында ол айтарлықтай жоғарылап, салыстырмалы түрде жоғары мәндерге жетті (сәйкесінше 5,9 ± 1,5 және 6,2 ± 1,5). Эндоглюкан-1,3-β-глюкозидаза тәрізді TanjilG_23384 гені 22660 популяциясынан басқа барлық желілерде алғашқы екі уақыт нүктесінде (6 және 12 hpi) жоғары белсенділікті көрсетті (6d-сурет). TanjilG_23384 экспрессиясының ең жоғары салыстырмалы деңгейлері екінші уақыт нүктесінде (12 hpi) Манделапта (2,7 ± 0,3) және 83A:476 (1,5 ± 0,1) байқалды. 24 HPI кезінде TanjilG_23384 экспрессиясы барлық зерттелген желілерде салыстырмалы түрде төмен болды (0,04 ± 0,009-дан 0,44 ± 0,12-ге дейін).
Сандық ПТР арқылы анықталған таңдалған гендердің экспрессия профильдері (ag). 6, 12 және 24 сандары вакцинациядан кейінгі сағаттарды білдіреді. LanDExH7 және LanTUB6 гендері қалыпқа келтіру үшін, ал LanTUB6 серияаралық калибрлеу үшін пайдаланылды. Қателік жолақтары үш биологиялық қайталауға негізделген стандартты ауытқуды білдіреді, олардың әрқайсысы үш техникалық қайталаудың орташа мәні болып табылады. Егілген (Colletotrichum lupini, Col-08 штаммы, 1999 жылы Польшаның Верженица қаласындағы люпин алқабынан алынған) және бақылау (жалған егілген) өсімдіктер арасындағы экспрессия деңгейлеріндегі айырмашылықтардың статистикалық маңыздылығы деректер нүктелерінің үстінде белгіленген (*P мәні < 0,05, **P мәні ≤ 0,01, ***P мәні ≤ 0,001). Егілген (Colletotrichum lupini, Col-08 штаммы, 1999 жылы Польшаның Верженица қаласындағы люпин алқабынан алынған) және бақылау (жалған егілген) өсімдіктер арасындағы экспрессия деңгейлеріндегі айырмашылықтардың статистикалық маңыздылығы деректер нүктелерінің үстінде белгіленген (*P мәні < 0,05, **P мәні ≤ 0,01, ***P мәні ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен в 1999 г. с поля люпина в Верженице, Польша) және бақылау (ложно иноками надические направление) (*значение P < 0,05, ** значение P ≤ 0,01, *** значение P ≤ 0,001). Егілген (Colletotrichum lupini, Col-08 штаммы, 1999 жылы Польшаның Верженица қаласындағы люпин алқабынан алынған) және бақылау (жалған егілген) өсімдіктер арасындағы экспрессия деңгейлеріндегі статистикалық тұрғыдан маңызды айырмашылықтар деректер нүктелерінің үстінде көрсетілген (*P мәні < 0,05, **P мәні ≤ 0,01, ***P мәні ≤ 0,001).接种（Коллетотрихум lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记木显着性标记木悕ＰP* 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001)。接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 ж.之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,01) 0.0₤ Статистические значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированных (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) және бақылау (қолданбалы бақылауды қамтамасыз ету) значение P < 0,05, ** P- значение ≤ 0,01, ***P- значение ≤ 0,001). Деректер нүктелерінің үстінде егілген (Colletotrichum lupini, Col-08 штаммы, 1999 жылы Польшаның Верженице қаласындағы люпин алқаптарынан алынған) және бақылау (жалған егілген) өсімдіктер арасындағы экспрессия деңгейлеріндегі статистикалық тұрғыдан маңызды айырмашылықтар белгіленген (*P мәні < 0,05, **P мәні ≤ 0,01, ***P мәні ≤ 0,001).Талданған NLL сызықтары: 83A:476 (төзімді, гомозиготалы Lanr1 аллелін тасымалдайды), Mandelup (орташа төзімді, гомозиготалы AnMan аллелін тасымалдайды), Boregine (төзімді, генетикалық тегі белгісіз) және 22660 популяциясы (сезімтал).
Lanr1 локусындағы TanjilG_05042 кандидат гені РНҚ-секвенциялық зерттеулерден алынған профильдерден айтарлықтай өзгеше экспрессия үлгісін көрсетті (6e-сурет). Бұл геннің айтарлықтай белсенділігі Манделуп пен 22660 популяциясында байқалды (сәйкесінше 39,7 және 11,7 есеге дейін), нәтижесінде экспрессия деңгейлері салыстырмалы түрде жоғары болды (сәйкесінше 1,4 ± 0,14 және 7,2 ± 1,3 дейін). 83A:476 сонымен қатар TanjilG_05042 генінің кейбір жоғарылауын анықтады (3,8 есеге дейін), дегенмен, қол жеткізілген салыстырмалы экспрессия деңгейлері (0,044 ± 0,002) Манделуп пен 22660 популяциясында байқалған деңгейлерге қарағанда 30 еседен астам төмен болды. qPCR арқылы талданған нәтижелер вакцинацияланған (бақылау) нұсқалардағы генотиптер арасындағы экспрессия деңгейлерінде айтарлықтай айырмашылықтарды көрсетті, бұл 22660 және 83A:476 популяциялары арасында, сондай-ақ 22660 және 22660 популяциялары арасында 58 есе айырмашылыққа жетті. Борегин мен Мандалап арасында екі есе айырмашылыққа қол жеткізілді.
AnMan локусындағы кандидат ген, TanjilG_12861, 83A:476 және Mandelup-та вакцинацияға жауап ретінде белсендірілді, 22660 популяцияда бейтарап болды және Борегинде төмендеді (6f-сурет). TanjilG_12861 генінің салыстырмалы экспрессиясы егілген 83A: 476-да ең жоғары болды (0,14±0,01). 17,4 кДа I класты жылу шок ақуызының TanjilG_05080 HSP17.4 гені зерттелген барлық штаммдар мен уақыт нүктелерінде салыстырмалы экспрессия деңгейінің төмендігін көрсетті (6g-сурет). Ең жоғары мән 22660 популяцияда 24 HPI кезінде байқалды (0,14 ± 0,02, вакцинацияға жауаптың сегіз есе артуы).
Ген экспрессиясының профильдерін салыстыру (7-сурет) TanjilG_10657 мен басқа төрт ген арасында жоғары корреляцияны анықтады: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) және TanjilG_04706 (r = 0,79). Мұндай нәтижелер қорғаныс реакциялары кезінде бұл гендердің бірлесіп реттелуін көрсетуі мүмкін. TanjilG_12861 және TanjilG_23384 гендері басқа гендермен салыстырғанда Пирсон корреляция коэффициентінің төмен мәндерімен (сәйкесінше 0,08-ден 0,43-ке дейін және -0,19-дан 0,28-ге дейін) әртүрлі экспрессия профильдерін көрсетті.
Ген экспрессиясының профильдері арасындағы корреляциялар сандық ПТР көмегімен анықталды. Келесі тар жапырақты люпин сызықтары талданды: 83A:476 (төзімді, гомозиготалы Lanr1 аллелін тасымалдайды), Mandelup (орташа төзімді, гомозиготалы AnMan аллелін тасымалдайды), Boregine (төзімді, генетикалық фон белгісіз) және Population 22660 (сезімтал). Үш уақыт нүктесі есептелді (егуден кейін 6, 12 және 24 сағат), оның ішінде егуден өткен (Colletotrichum lupini, Col-08 штаммы, 1999 жылы Польшаның Верженице қаласындағы люпин алқаптарынан алынған) және бақылау (жалған егуден өткен) өсімдіктер. Шкала Пирсон корреляция коэффициентінің мәнін көрсетеді.
Дюймге 6 ат күшімен алынған деректерге сүйене отырып, WGCNA ерте қорғаныс реакцияларына назар аудару үшін егілген және бақылау өсімдіктерін салыстыру арқылы анықталған 9981 DEG бойынша орындалды (S12 қосымша кесте). Генотиптер мен эксперименттік нұсқалар арасында корреляцияланған (оң немесе теріс) экспрессия профильдері бар жиырма екі ген модулі (кластерлер) табылды. Орташа есеппен ген экспрессиясының деңгейі 83A:476 > Манделуп > Борегин > Популяция 22660 ретімен төмендеді (дегенмен, екі нұсқада да бұл үрдіс бақылау өсімдіктерінде күштірек болды). Орташа есеппен ген экспрессиясының деңгейі 83A:476 > Манделуп > Борегин > Популяция 22660 ретімен төмендеді (дегенмен, екі нұсқада да бұл үрдіс бақылау өсімдіктерінде күштірек болды). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Халқы 22660 (обоих вариантах, однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). Орташа есеппен ген экспрессиясының деңгейі 83A:476 > Манделуп > Борегин > Популяция 22660 ретімен төмендеді (дегенмен, екі нұсқада да бұл үрдіс бақылау өсімдіктерінде күштірек болды).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Халық 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> популяция 22660 的 顺序 下降 （， （， 圌 在在 在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。... В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Халқы 22660 (однако в обоих вариантах эта тенденция была сильнее у контрольных растений). Орташа есеппен, ген экспрессиясының деңгейі 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 сериясында төмендеді (дегенмен, екі нұсқада да бұл үрдіс бақылау өсімдіктерінде күштірек болды).Вакцинация ген экспрессиясының, әсіресе 18, 19, 14, 6 және 1 модульдерінде (әсердің кему ретімен), теріс реттеуге (мысалы, 9 және 20 модульдер) немесе бейтарап әсерлермен (мысалы, 11, 22, 8 және 13 модульдер) жоғарылауына әкелді. GO терминін байыту талдауы (S13 қосымша кестесі) егілген модуль (18) үшін максималды белсенділікпен «GO: 0006952 қорғаныс реакцияларын» анықтады, оның ішінде qPCR арқылы талданған гендер (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 және TanjilG_27015), сондай-ақ көптеген егілген фотосинтез модульдері (9) бар. 18-модуль концентраторы (8-сурет) PR-10 тәрізді LlR18B ақуызын кодтайтын TanjilG_26536 гені ретінде, ал 9-модуль концентраторы фотожүйе II PsbQ ақуызын кодтайтын TanjilG_28955 гені ретінде анықталды. Антракнозға төзімділік генінің кандидаты Lanr1, TanjilG_05042, 22-модульде (9-сурет) табылды және TanjilG_01212 хабын алып жүретін «GO:0044260 Жасушалық макромолекулалық метаболикалық процестер» және «GO:0006355 Транскрипциялық реттеу, ДНҚ шаблондау» терминдерімен байланысты. Ген жылу стрессінің транскрипция факторы A-4a (HSFA4a) кодтайды.
«GO: 0006952 Қорғаныс реакциялары» атты биологиялық процесс терминдері шамадан тыс көрсетілген модульдердің гендік бірлескен экспрессиясының салмақталған желілік талдауы. qPCR арқылы талданған төрт генді (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 және TanjilG_27015) ерекшелеу үшін лигация жеңілдетілді.
«GO: 0006355: Транскрипциялық реттеу, ДНҚ шаблондау» биологиялық процесс термині шамадан тыс көрсетілген және антракнозға төзімділік кандидаты Lanr1 TanjilG_05042 генін тасымалдайтын модульдің гендік бірлескен экспрессиясының салмақталған желілік талдауы. TanjilG_05042 генін және орталық TanjilG_01212 генін бөліп алу үшін байлау жеңілдетілді.
Австралияда жиналған антракнозға төзімділік скринингі ерте шығарылған сорттардың көпшілігінің сезімтал екенін көрсетті; Kalya, Coromup және Mandelup орташа төзімді деп сипатталды, ал Wonga, Tanjil және 83A:476 жоғары төзімді деп сипатталды26,27,31. бірдей төзімділік аллелі болды, Lanr1 деп белгіленді, ал Coromup пен Mandelup басқа аллельге ие болды, AnMan10, 26, 39 деп белгіленді, ал Kalya басқа аллельді берді., Lanr2. Германияда антракнозға төзімділікті скринингтеу нәтижесінде Lanr1-ден басқа кандидат аллелі бар, LanrBo36 деп белгіленген Bo7212 төзімді желісі анықталды.
Біздің зерттеуіміз тексерілген гермоплазмада Lanr1 аллелінің өте төмен жиілігін (шамамен 6%) анықтады. Бұл бақылау Anseq3 және Anseq4 маркерлерін пайдаланып Шығыс Еуропа гермоплазмасын скринингтеу нәтижелерімен сәйкес келеді, бұл Lanr1 аллелінің тек екі беларусь линиясында ғана бар екенін көрсетті. Бұл Lanr1 аллелінің жергілікті селекциялық бағдарламаларда әлі кеңінен қолданылмағанын көрсетеді, Австралияда ол маркер көмегімен селекциялаудың негізгі аллельдерінің бірі болып табылады. Бұл Lanr1 аллелінің еуропалық далалық жағдайларда қамтамасыз ететін төзімділік деңгейінің австралиялық есеппен салыстырғанда төмен болуына байланысты болуы мүмкін. Сонымен қатар, Австралиядағы жауын-шашын көп түсетін аймақтардағы антракнозды зерттеу Lanr1 аллелімен байланысты төзімділік реакциялары патогеннің өсуі мен жылдам дамуына ықпал ететін ауа райы жағдайларында тиімді болмауы мүмкін екенін көрсетті19,42. Шын мәнінде, осы зерттеуде Lanr1 аллелін тасымалдайтын генотиптерде де антракноздың кейбір белгілері байқалды, бұл C. lupini дамуы үшін оңтайлы жағдайларда төзімділік жоғалуы мүмкін екенін көрсетеді. Сонымен қатар, Lanr1 локусынан шамамен 1 см қашықтықта орналасқан Anseq3 және Anseq4 маркерлерінің болуының жалған оң түсіндірмелері болуы мүмкін 28,30,43.
Біздің зерттеуіміз Lanr1 аллелін тасымалдайтын 83A:476 алғашқы талданған уақыт нүктесінде (6 а.к. дюйм) C. lupini егуіне кең көлемді транскриптомды қайта бағдарламалау арқылы жауап бергенін көрсетті, ал AnMan аллелін тасымалдайтын Манделупта транскриптомдық жауаптар әлдеқайда кейінірек байқалды (24-тен 48 а.к. дейін). Қорғаныс реакцияларындағы бұл уақытша ауытқулар ауру симптомдарының айырмашылықтарымен байланысты, бұл төзімділікке сәтті жауап беру үшін патогенді ерте танудың маңыздылығын көрсетеді. Өсімдік тінін жұқтыру үшін сібір жарасы споралары иесінің бетінде бірнеше даму кезеңдерінен өтуі керек, соның ішінде өну, жасушалардың бөлінуі және аппрессорийдің пайда болуы. Қосымша - иесінің бетіне жабысатын және иесінің тіндеріне енуді жеңілдететін инфекциялық құрылым. Осылайша, бұршақ сығындысындағы C. gloeosporioides споралары ядроның 75-90 минут инкубациядан кейін бірінші бөлінуін, 90-120 минуттан кейін ұрық түтігінің пайда болуын және 4 сағаттан кейін басылуын көрсетті 45. Манго C. gloeosporioides 3 сағаттық инкубациядан кейін конидиальды өнуді 40%-дан астам және 4 сағаттан кейін шамамен 20% аппрессорлардың түзілуін көрсетті. C. gloeosporioides вируленттілігімен байланысты CAP20 гені авокадо бетіндегі балауызда 4 сағат 46 минуттан кейін CAP20 ақуызының жоғары концентрациясымен 3,5 сағаттық инкубациядан кейін эпифит түзетін конидияларда транскрипциялық белсенділік көрсетті. Сол сияқты, C. trifolii-дегі меланин биосинтезі гендерінің белсенділігі 2 сағаттық инкубация кезінде индукцияланды, содан кейін 1 сағаттан кейін аппрессорий пайда болды. Жапырақ тіндерін зерттеу C. acutatum-мен егілген құлпынай 8 ат күші дюймде алғашқы басылуды, ал C. coccodes-пен егілген қызанақ 4 ат күші дюймде алғашқы басылуды 48,49 екенін көрсетті. Бұл көбінесе Colletotrichum spp. инфекциялық процесінің уақыт шкаласына сәйкес келеді. 83A:476-ға жедел қорғаныс реакциялары өсімдік төзімділігі мен эффектормен іске қосылған иммунитет (ETI) гендерінің осы желіге қатысуын көрсетеді, ал Манделуптың кешіктірілген жауаптары микро-байланысты молекулалық үлгімен іске қосылған иммунитет (MTI) гипотезасын 50 қолдайды. 83A:476 және Манделупқа ерте жауаптар. Кешіктірілген жауаптағы жоғары немесе төмен реттелетін гендер арасындағы ішінара қабаттасу да бұл тұжырымдаманы қолдайды, себебі ETI көбінесе инфекция орнында бағдарламаланған жасуша өлімімен аяқталатын жеделдетілген және күшейтілген MTI реакциясы болып саналады, бұл анафилактикалық шок деп аталады 51,52.
GO:0006952 «Қорғаныс реакциясы» генінің шамадан тыс ұсынылған терминіне жатқызылған гендердің көпшілігі стресс тудыратын ораза туралы хабарлама 22 ақуызының (SAM22-ге ұқсас) және жеті негізгі латекс ақуыз тәрізділерінің (MLP) 11 гомологы болып табылады. 31, 34, 43 және 423 тәрізді ақуыздар тізбек ұқсастығын көрсетті. SAM22 тәрізді гендер антракнозға төзімділік деңгейінің жоғарылауын көрсететін ұзаққа созылған айтарлықтай белсенділікті көрсетті (83A:476 және Boregine). Дегенмен, MLP тәрізді гендер тек кандидаттық төзімділік аллелін тасымалдайтын сызықтарда ғана төмендеді (83A:476/Lanr1 6 ат күші және Mandelup/AnMan 24 ат күші). Анықталған барлық SAM22 тәрізді гомологтар шамамен 105 кб-ты қамтитын ген кластерінен пайда болатынын, ал MLP тәрізді гендер геномның бөлек аймақтарынан пайда болатынын атап өткен жөн. Мұндай SAM22 тәрізді гендердің үйлесімді белсендірілуі біздің Diaporthetoxica егуіне NLL төзімділігін зерттеуіміздің алдыңғы кезеңінде де анықталды, бұл олардың қорғаныс реакциясының көлденең компоненттеріне қатысатынын көрсетеді. Бұл қорытындыны SAM22 тәрізді гендердің салицил қышқылымен, саңырауқұлақ индукторларымен немесе сутегі асқын тотығымен жарақатқа немесе емдеуге оң реакциясы туралы есептер де растайды.
MLP тәрізді гендер көптеген өсімдік түрлерінде бактериялық, вирустық және патогендік саңырауқұлақ инфекцияларын қоса алғанда, әртүрлі абиотикалық және биотикалық стресстерге жауап беретіні көрсетілген55. Өсімдіктер мен патогендер арасындағы белгілі бір өзара әрекеттесуге жауап беру бағыттары қатты артудан (яғни, мақта Verticillium dahliae жұқтырған кезде) айтарлықтай төмендеуіне дейін (яғни, алма ағашын Alternaria spp. жұқтырғаннан кейін)56,57 болды. MLP тәрізді 423 генінің айтарлықтай төмендеуі авокадо қорғанысы кезінде F. niger инфекциясына дейін және алма ағашын жұқтырған кезде Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola және Alternaria alternata алма патотиптері болып табылады58,59. Сонымен қатар, MLP тәрізді 423 генін шамадан тыс экспрессиялайтын алма каллилері төзімділікпен байланысты гендердің экспрессиясын төмен көрсетті және саңырауқұлақ инфекциясына сезімтал болды59. Fusarium oxysporum f-тен кейін MLP тәрізді 423 гені төзімді жалпы бұршақ герплазмасында да басылды. cn. Бұршақ инфекциясы 60.
Біздің РНҚ-seq зерттеуімізде анықталған PR-10 тұқымдасының басқа мүшелері жоғары реттеуге жауап ретіндегі LlR18A және LlR18B гендері, сондай-ақ DIR1 липидті тасымалдау ақуызының жоғары реттелетін (1 ген) немесе төмен реттелетін (3 ген) гені болды. Сонымен қатар, WGCNA вакцинацияға өте сезімтал және бірнеше қорғаныс реакция гендерін тасымалдайтын LlR18B генін осы модульдегі хаб ретінде көрсетеді. LlR18A және LlR18B гендері патогенді бактерияларға жауап ретінде сары люпин жапырақтарында, сондай-ақ D. toxica егуден кейін NLL сабақтарында индукцияланды, ал бұл гендердің күріш гомологы RSOsPR10 жасмон қышқылының сигнал беру жолына қатысатын саңырауқұлақ инфекциясымен тез индукцияланды53,61,62. DIR1 гені жүйелі жүре пайда болған төзімділіктің (SAR) басталуы үшін қажетті спецификалық емес липидті тасымалдау ақуыздарын кодтайды. Қорғаныс реакцияларының дамуымен DIR1 ақуызы инфекция ошағынан флоэма арқылы тасымалданып, алыс мүшелерде SAR индукциялайды. Қызығы, TanjilG_02313 DIR1 гені 84A:476 және 22660 популяцияларында бірінші уақыт нүктесінде айтарлықтай индукцияланды, бірақ антракнозға төзімділік тек 84A:476 жолында ғана сәтті дамыды. Бұл NLL-де DIR1 генінің кейбір субфункционалдануын көрсетуі мүмкін, себебі қалған үш гомолог инокуляцияға тек 83A:476 жолында 6 ат күшімен жауап берді және бұл жауап төмен бағытталған.
Біздің зерттеуімізде «GO:0055114 Тотығу-тотықсыздану процесі» деп аталатын биологиялық процеске сәйкес келетін ең көп таралған компоненттер цитохром P450 ақуызы, пероксидаза, линол қышқылы 9S-/13S-липоксигеназа және 1-аминоциклопропан-1-карбон қышқылы оксидазасы болды. Сонымен қатар, біздің WGCNA HSFA4a гомологын Lanr1 төзімділік генінің кандидаты TanjilG_05042 сияқты модульдерді тасымалдайтын хаб ретінде анықтайды. HSFA4a өсімдіктердегі ядролық транскрипцияның тотығу-тотықсыздануға тәуелді реттелуінің құрамдас бөлігі болып табылады.
Цитохром P450 ақуыздары - ксенобиотиктердің, сондай-ақ гормондардың, май қышқылдарының, стеролдардың, жасуша қабырғасының компоненттерінің, биополимерлердің және қорғаныш қосылыстарының биосинтезінің метаболизмін қоса алғанда, біріншілік және екіншілік метаболизмдегі NADPH және/немесе O2-тәуелді гидроксилдену реакцияларын катализдейтін оксидоредуктазалар 69. Біздің зерттеуімізде өсімдік цитохромының P450 функциясының өзгергіштігі көптеген өзгертілген гомологтарға (37) және нақты гендер арасындағы жауап үлгілерінің айырмашылығына байланысты -10,6 log2-ден (есенің өзгеруі) 5,7-ге дейін төмендеді, бұл жоғары қарай қайта қарауды көрсетеді. . Мұндай үлкен ақуыз суперфамилиясындағы NLL гендерінің болжамды биологиялық функциясын түсіндіру үшін тек РНҚ-секвенция деректерін пайдалану өте болжамды болар еді. Дегенмен, кейбір цитохром P450 гендерінің патогенді саңырауқұлақтарға немесе бактерияларға төзімділіктің жоғарылауымен, соның ішінде аллергиялық реакцияларға үлес қосуымен байланысты екенін атап өткен жөн69,70,71.
III класты пероксидазалар - өсімдіктердің өсуі мен дамуы кезіндегі метаболикалық процестердің кең ауқымына, сондай-ақ тұздылық, құрғақшылық, жарықтың жоғары қарқындылығы және патогендердің шабуылы сияқты қоршаған ортаның күйзелістеріне жауап ретінде қатысатын көпфункционалды өсімдік ферменттері72. Пероксидазалар бірнеше өсімдік түрлерінің, соның ішінде Stylosanthes humilis және C. gloeosporioides, Lens culinaris және C. truncatum, Phaseolus vulgaris және C. lindemuthianum, Cucumis sativus және C. lagenarium73,74,75,76 Anthracis-пен өзара әрекеттесуіне қатысады. Жауап өте жылдам, кейде тіпті 4 HPI-де, саңырауқұлақ өсімдік тініне енгенге дейін73. Пероксидаза гені D. toxica NLL егуіне де жауап берді. Тотығу жарылысын реттеу немесе тотығу стрессін жою сияқты типтік функцияларынан басқа, пероксидазалар белгілі бір қосылыстардың лигнификациясы, суббірлігі немесе көлденең байланысы кезінде жасуша қабырғасын нығайтуға негізделген физикалық кедергілер жасау арқылы патогеннің өсуіне кедергі келтіруі мүмкін. Бұл функцияны silico-да 83A:476 төзімді желісінде 6 HPI кезінде айтарлықтай жоғарылаған, бірақ жауап бермеген басқа штамдар мен уақыт нүктелерінде емес, болжамды лигнин түзетін анион пероксидазасын кодтайтын TanjilG_03329 геніне жатқызуға болады.
Линол қышқылының 9S-/13S-липооксигеназасы липидтер биосинтезінің тотығу жолындағы алғашқы қадам болып табылады78. Бұл жолдың өнімдері өсімдіктерді қорғауда бірнеше функцияларды атқарады, соның ішінде каллоза мен пектин шөгінділерінің пайда болуы арқылы жасуша қабырғасын нығайту және реактивті оттегі түрлерін өндіру арқылы тотығу стрессін реттеу79,80,81,82,83. Осы зерттеуде линол қышқылының 9S-/13S-липооксигеназасының экспрессиясы барлық штамдарда өзгерді, бірақ сезімтал популяцияда 22660 әртүрлі уақыт кезеңдерінде жоғары реттеу басым болды, ал төзімді Lanr1 және AnMan аллелін тасымалдайтын штамдарда бұл генотиптер арасындағы қорғаныш күйдіргі реакцияларында оксилипин қабатының әртараптануын атап көрсетеді.
1-аминоциклопропан-1-карбоксилатоксидаза (ACO) гомологы люпинмен егу кезінде айтарлықтай жоғарылаған (9 ген) немесе төмендеген (2 ген) болды. Екі ерекшелікті қоспағанда, бұл реакциялардың барлығы 83A:476 кезінде 6 ат күші кезінде пайда болды. ACO ақуыздары арқылы жүретін ферментативті реакция этилен өндірісіндегі жылдамдықты шектейтін қадам болып табылады және сондықтан жоғары деңгейде реттеледі84. Этилен - өсімдіктердің дамуын реттеуде және абиотикалық және биотикалық стресс жағдайларына жауап беруде әртүрлі рөл атқаратын өсімдік гормоны. ACO транскрипциясын индукциялау және этилен сигнал беру жолын белсендіру реактивті оттегі түрлері мен фитоалексиндердің өндірісін реттеу арқылы күріштің гемибиотрофты саңырауқұлаққа oryzae oryzae төзімділігін арттыруға қатысады. Осы зерттеуде хабарланған 83A:476 желісіндегі ACO гомологтарының айтарлықтай жоғарылауы аясында M. oryzae және C. lupini88,89 арасында табылған өте ұқсас жапырақ инфекциясы процесі NLL антракнозасына төзімділікті молекулалық жолдардағы сигнал берудің орталық сатысы ретінде беру мүмкіндігін өзгертеді.
Осы зерттеуде фотосинтезбен байланысты көптеген гендердің кең көлемді басылуы 83A:476-да 6 ат күші кезінде және Манделуп пен 22660 популяцияда 48 ат күші кезінде байқалды. Бұл өзгерістердің көлемі мен прогрессиясы деңгейге пропорционалды. Бұл экспериментте антракнозға төзімділік байқалды. Жақында фотосинтезге байланысты транскрипттердің күшті және ерте басылуы патогендік бактериялар мен саңырауқұлақтарды қоса алғанда, өсімдік-патогендік өзара әрекеттесудің бірнеше модельдерінде тіркелді. Асығыс (кейбір өзара әрекеттесулерде 2 HPI-ден бастап) және инфекцияға жауап ретінде фотосинтезбен байланысты гендердің жаһандық басылуы реактивті оттегі түрлерінің орналасуына және олардың аллергиялық реакцияларды медиациялау үшін салицил қышқылы жолымен өзара әрекеттесуіне негізделген өсімдік иммунитетін тудыруы мүмкін 90,94.
Қорытындылай келе, ең төзімді тұқымдас (83A:476) үшін ұсынылған қорғаныс реакциясының механизмдеріне R гені (болжам бойынша TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) арқылы патогенді тез тану және аллергиялық реакция арқылы жүзеге асырылатын салицил қышқылы мен этилен сигнализациясы, содан кейін ұзақ қашықтықтағы SAR әрекетінің орнатылуы кіреді. DIR-1 ақуызы C. lupini инфекциясының биотрофты кезеңі өте қысқа (шамамен 2 күн), содан кейін некротикалық өсу болатынын атап өткен жөн95. Бұл кезеңдер арасындағы ауысу некрозбен және ие өсімдіктерінде аса сезімталдық реакцияларының триггерлері ретінде әрекет ететін этилен-индукцияланатын ақуыздардың экспрессиясымен байланысты болуы мүмкін. Сондықтан, биотрофты кезеңде C. lupini-ді сәтті ұстау үшін уақыт аралығы өте тар. 83A:476-да 6 ат күші кезінде байқалған тотығу-тотықсыздану және фотосинтезбен байланысты гендердің қайта бағдарламалануы саңырауқұлақ гифаларының дамуына сәйкес келеді және биотрофты кезеңде сәтті қорғаныс реакциясының дамуын білдіреді. Манделуп пен 22660 популяциясының транскриптомдық реакциялары некротикалық өсуге ауыспас бұрын саңырауқұлақты ұстап алу үшін тым кеш болуы мүмкін, дегенмен, Манделуп 22660 популяциясына қарағанда тиімдірек болуы мүмкін, себебі PR-10 ақуызының салыстырмалы түрде жылдам реттелуі көлденең төзімділікті арттырады.
Канондық R генімен басқарылатын ETI бұршақтың антракнозға төзімділігінің кең таралған механизмі болып көрінеді. Осылайша, Medicago truncatula үлгі бұршағында антракнозға төзімділік TIR-NBS-LRR97 өсімдік R ген класының мүшесі болып табылатын RCT1 генімен қамтамасыз етіледі. Бұл ген сонымен қатар сезімтал өсімдіктерге берілген кезде жоңышқада кең спектрлі антракнозға төзімділікті қамтамасыз етеді. Кәдімгі бұршақта (P. vulgaris) бүгінгі күнге дейін жиырмадан астам антракнозға төзімділік гендері анықталды. Бұл гендердің кейбіреулері канондық R гендері жоқ аймақтарда кездеседі, дегенмен басқалары TIR-NBS-LRRs99 қоса алғанда, NBS-LRR ген кластерін тасымалдайтын хромосомалардың шеттерінде орналасқан. Геном бойынша SSR зерттеуі сонымен қатар NBS-LRR генінің кәдімгі бұршақтағы антракнозға төзімділікпен байланысын растады. Канондық R гені ақ люпин 101-де антракнозға төзімділіктің негізгі локусын тасымалдайтын геномдық аймақта да табылды.
Біздің жұмысымыз өсімдік инфекциясының ерте сатысында (жақсырақ 12 ат күші дюймнен кешіктірмей) белсендірілетін жедел төзімділік реакциясы тар жапырақты люпинді Collelotrichum lupini патогенді саңырауқұлағы тудыратын антракноздан тиімді қорғайтынын көрсетеді. Жоғары өнімділік секвенирлеуін қолдана отырып, біз Lanr1 және AnMan төзімділік гендерімен жүзеге асырылатын NLL өсімдіктеріндегі антракнозға төзімділік гендерінің дифференциалды экспрессия профильдерін көрсеттік. Табысты қорғаныс өсімдіктің патогенмен алғашқы байланысынан кейін бірнеше сағат ішінде тотығу-тотықсыздану, фотосинтез және патогенезге қатысатын ақуыздардың гендерін мұқият жобалауды қамтиды. Ұқсас қорғаныс реакциялары, бірақ уақыт өте келе кешіктіріліп, өсімдіктерді аурулардан қорғауда әлдеқайда тиімді емес. Lanr1 генімен жүзеге асырылатын сібір жарасына төзімділік R генінің типтік жылдам реакциясына ұқсайды (эффектормен іске қосылған иммунитет), ал AnMan гені көлденең жауапты (микробпен байланысты молекулалық үлгімен іске қосылатын иммунитет) қамтамасыз етеді, бұл тұрақтылықтың орташа деңгейін қамтамасыз етеді.
Антракноз маркерлерін анықтау үшін пайдаланылған 215 NLL желілері 74 сорттан, будандастыру немесе селекция арқылы алынған 60 желіден, 5 мутанттан және 76 жабайы немесе түпнұсқа гермоплазмадан тұрды. Желілер 17 елден, негізінен Польшадан (58), Испаниядан (47), Германиядан (27), Австралиядан (26), Ресейден (19), Беларусьтен (7), Италиядан (5) және басқа да 10 елден келді. Жиынтыққа сонымен қатар анықтамалық төзімді желілер кіреді: 83A:476, Tanjil, Lanr1 аллелін тасымалдайтын Wonga және AnMan аллелін тасымалдайтын Mandelup. Желілер Польшаның Виатрово қаласындағы Poznan Plant Breeding Ltd. компаниясы жүргізетін Еуропалық Люпин генетикалық ресурстарының дерекқорынан алынды (S1 қосымша кесте).
Өсімдіктер бақыланатын жағдайларда өсірілді (фотопериод 16 сағат, күндіз температура 25°C және түнде 18°C). Екі биологиялық көшірме талданды. Хаттамаға сәйкес DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия) көмегімен үш апталық жапырақтардан ДНҚ бөлініп алынды. Бөлінген ДНҚ-ның сапасы мен концентрациясы спектрофотометриялық әдістермен бағаланды (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, АҚШ). Антракнозға төзімділік генін белгілейтін AnManM1 маркері (cv. Mandelup-тан алынған) және Lanr1 генінің қасында орналасқан Anseq3 және Anseq4 маркерлері (cv. Tanjil-дан алынған) 11,26,28 талданды. Төзімді аллель үшін гомозиготалар «1», сезімтал аллель үшін «0» және гетерозиготалар үшін 0,5 деп бағаланды.
AnManM1, AnSeq3 және AnSeq4 маркерлерін скринингтеу нәтижелеріне және соңғы бақылау тәжірибелеріне тұқымдардың қолжетімділігіне сүйене отырып, антракнозға төзімділік фенотипін анықтау үшін 50 NLL желісі таңдалды. Талдау компьютермен басқарылатын жылыжайда 14 сағаттық фотопериодпен, күндіз 22°C және түнде 19°C температура диапазонымен екі данада жүргізілді. Тұқым қабығы тым қатты болғандықтан, тұқымның тыныштық күйінде қалуын болдырмау және біркелкі өнуді қамтамасыз ету үшін тұқымдар себу алдында тырналады (эмбрионның қарама-қарсы жағындағы тұқым қабығын өткір пышақпен кеседі). Өсімдіктер стерильді топырақпен (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Варшава, Польша) құмыраларда (11 × 11 × 21 см) өсірілді. Егу 1999 жылы Үлкен Польшаның Верженица қаласындағы (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E) егістікте өсірілген тар жапырақты люпин өсімдіктерінің сабақтарынан өсірілген Colletotrichum lupini Col-08 штаммымен жүргізілді. Алаңды алыңыз. Изоляттар спора түзуді тудыру үшін 21 күн бойы қара жарықта 20°C температурада SNA ортасында өсірілді. Егуден кейін төрт аптадан кейін, өсімдіктер 4-6 жапырақ кезеңіне жеткенде, егу 0,5 x 106 конидия концентрациясында 1 мл-ге конидия суспензиясымен бүрку арқылы жүргізілді. Егуден кейін өсімдіктер конидиялардың өнуін және инфекция процесін жеңілдету үшін шамамен 98% ылғалдылықта және 25°C температурада 24 сағат бойы қараңғы жерде ұсталды. Содан кейін өсімдіктер 14 сағаттық фотопериод кезінде күндіз 22°C/түнде 19°C және 70% ылғалдылықта өсірілді. Ауру баллы егуден кейін 22 күннен кейін анықталды және сабақтар мен жапырақтарда некротикалық зақымданулардың болуына немесе болмауына байланысты 0-ден (иммундық) 9-ға дейін (өте сезімтал) болды. Сонымен қатар, балл алғаннан кейін өсімдіктердің салмағы өлшенді. Маркерлік генотиптер мен ауру фенотиптері арасындағы байланыс нүктелік екі тізбекті корреляциялар ретінде есептелді (антракнозға төзімділік фенотипін талдау үшін сызықтар жиынтығында гетерозиготалы маркерлердің болмауы).