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앙구스티폴리우스 루핀(NLL, Lupinus angustifolius L.)은 식량 생산 및 토양 개량에 사용되는 콩과 식물입니다. NLL 작물이 전 세계적으로 확산됨에 따라 파괴적인 탄저병을 유발하는 루핀 탄저병을 포함한 많은 병원성 진균이 유입되었습니다. 저항성 증가를 유발하는 두 대립유전자인 Lanr1과 AnMan이 NLL 육종에 사용되었지만, 그 기저 분자 기전은 아직 밝혀지지 않았습니다. 본 연구에서는 Lanr1과 AnMan 마커를 사용하여 유럽 NLL 샘플을 스크리닝했습니다. 통제된 환경에서 백신을 시험하여 두 저항성 공여체 모두의 효능을 확인했습니다. 대표적인 저항성 및 감수성 계통에 대해 차등 유전자 발현 프로파일링을 수행했습니다. 탄저병 저항성은 유전자 온톨로지 용어 "GO:0006952 방어 반응", "GO:0055114 산화환원 과정", "GO:0015979 광합성"의 과발현과 관련이 있었습니다. 또한, Lanr1(83A:476) 계통은 접종 후 유의미한 전사체 재프로그래밍을 빠르게 보인 반면, 다른 계통들은 이 반응이 약 42시간 지연되는 것으로 나타났습니다. 방어 반응은 TIR-NBS, CC-NBS-LRR 및 NBS-LRR 유전자, 병인 발생에 관여하는 10가지 단백질, 지질 전달 단백질, 엔도글루칸-1,3-β-글루코시다제, 글리신 풍부 세포벽 단백질, 그리고 산소 반응 경로와 관련된 유전자와 관련이 있습니다. 광합성 관련 유전자의 신중한 억제를 포함한 83A:476에 대한 초기 반응은 곰팡이 생물학의 영양생장기 동안 성공적인 방어와 동시에 나타났으며, 이는 효과기가 면역을 유발함을 시사합니다. 만델루프 반응은 전반적인 수평 저항과 마찬가지로 느려집니다.
좁은잎루핀(NLL, Lupinus angustifolius L.)은 지중해 서부 지역이 원산지인 고단백 곡물입니다.1,2 현재 가축과 인간의 식량 작물로 재배되고 있습니다. 또한, 공생 질소고정세균에 의한 질소고정과 토양 구조의 전반적인 개선으로 윤작 시스템에서 녹비로 간주됩니다. NLL은 지난 세기 동안 급속한 작물화 과정을 거쳤으며, 여전히 높은 육종 압력을 받고 있습니다.3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. NLL의 광범위한 재배로 인해 병원성 균류가 새로운 농업적 지위를 형성하고 새로운 작물 파괴 병해를 유발했습니다. 루핀 농부와 육종가들에게 가장 주목할 만한 것은 병원성 균인 Colletotrichum lupini(Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13에 의해 발생하는 탄저병의 출현이었습니다. 루핀 농부와 육종가들에게 가장 주목할 만한 것은 병원성 균인 Colletotrichum lupini(Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13에 의해 발생하는 탄저병의 출현이었습니다. Наиболее примечательным для фермеров 및 celekционеров луpinа было появление anttraкноза, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. 루핀 농부와 육종가들에게 가장 주목할 만한 것은 병원성 균인 Colletotrichum lupini(Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13에 의한 탄저병의 출현이었습니다.Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 정말 대단해요.对于羽扇豆农민화饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的菌，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Haired。1 Наиболее поразительным для фермеров 및 selekционеров lucpina является появление anttraкноза, вызываемого патогеным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. 루핀 농부와 육종가들에게 가장 놀라운 것은 병원성 균인 Colletotrichum lupini(Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13에 의해 발생하는 탄저병의 출현입니다.이 질병에 대한 최초 보고는 브라질과 미국에서 이루어졌으며, 각각 1912년과 1929년에 전형적인 증상이 나타났습니다. 그러나 약 30년 후, 이 병원균은 Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz.로 명명되었습니다. & Sacc., 완전형 Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., 완전형 Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld의 완전형. & Sacc.는 독특한 형태의 Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld입니다. & Sacc.는 독특한 형태의 Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld입니다. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld의 표적 형태학. & H. 슈렌크,. & H. 슈렌크, .그리고 H. 슈렌크. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。및 H. Schlenk, .20세기 중반에 실시한 예비 병 표현형 검사에서 NLL과 노랑 루핀(L. luteus L.) 액세션에서 약간의 저항성이 나타났지만, 시험한 모든 백색 루핀(L. albus L.) 액세션은 매우 감수성이 높았습니다.15,16 연구에 따르면 탄저병 발생은 강수량(공기 습도)과 온도(12~28°C 범위)의 증가와 관련이 있으며, 고온에서 저항성이 위배되는 것으로 나타났습니다.17,18 실제로, 분생포자가 발아하고 병이 시작되는 데 걸리는 시간은 습도가 높은 조건에서 24°C(4시간)에서 12°C(16시간)보다 4배 더 짧았습니다.19 따라서 지속적인 지구 온난화가 탄저병 확산으로 이어졌습니다. 그러나 이 질병은 프랑스(1982)와 우크라이나(1983)에서 임박한 위협의 전조로 관찰되었지만 당시 루핀 산업에서는 무시된 것으로 보입니다.20,21. 몇 년 후, 이 파괴적인 질병은 전 세계로 퍼져 호주, 폴란드, 독일과 같은 주요 루핀 생산국에도 영향을 미쳤습니다.22,23,24. 1990년대 중반 탄저병이 발생한 후 광범위한 스크리닝을 통해 NLL19 샘플에서 여러 내성 공여자를 식별했습니다. NLL의 탄저병 내성은 서로 다른 유전자원에서 발견되는 두 가지 별도의 우성 대립유전자에 의해 제어됩니다. 품종 Tanjil과 Wonga의 Lanr1과 품종의 AnMan입니다. Mandalay 25, 26. 이러한 대립유전자는 육종 프로그램에서 내성 유전자원 선택을 뒷받침하는 분자 마커를 보완합니다.25,26,27,28,29,30. Lanr1 대립유전자를 갖는 저항성 육종 계통 83A:476을 감수성 야생 계통 P27255와 교배하여 탄저병 저항성으로 분리되는 RIL 집단을 얻었고, 이를 통해 Lanr1 유전자좌를 NLL-11 염색체에 할당할 수 있었습니다(31, 32, 33). 탄저병에 인접한 저항 유전자좌에서 유래한 연관 지도 마커를 유전체 프레임워크인 NLL과 정렬한 결과, 세 대립유전자 모두 동일한 염색체(NLL-11)에 위치하지만 위치는 서로 달랐습니다.29,34,35 그러나 RIL의 수가 적고 마커와 해당 대립유전자 사이의 유전적 거리가 크기 때문에, 기저 유전자에 대한 신뢰할 만한 결론을 도출할 수 없었습니다. 한편, 루핀은 재생 가능성이 매우 낮아 역유전학을 적용하기 어렵고, 이로 인해 유전자 조작이 번거로웠습니다.37
83A:476(Lanr1) 및 Mandelup(AnMan)과 같이 원하는 대립유전자를 동형접합 상태로 갖는 가축화된 생식질의 개발은 야생 개체군에서 대립유전자의 상반된 조합이 존재하는 상황에서 탄저병 저항성을 연구할 수 있는 길을 열었습니다. 분자 기전의 가능성을 연구하고, 특정 유전자형에 의해 생성된 방어 반응을 비교합니다. 본 연구에서는 C. lupini 백신 접종에 대한 NLL의 초기 전사체 반응을 평가했습니다. 먼저, Lanr1 및 AnMan 대립유전자를 표시하는 분자 마커를 사용하여 215개 계통으로 구성된 유럽 NLL 생식질 패널을 스크리닝했습니다. 그런 다음, 분자 마커를 위해 미리 선발된 50개 NLL 계통에 대해 통제된 조건에서 탄저병 표현형 분석을 수행했습니다. 이러한 실험을 바탕으로, 탄저병 저항성과 Lanr1/AnMan 대립유전자 구성이 다른 네 가지 계통을 선택하여 두 가지 상호 보완적인 접근 방식(고처리량 RNA 시퀀싱 및 실시간 PCR 정량)을 사용하여 차별적 방어 유전자 발현 프로파일링을 수행했습니다.
영어: Lanr1(Anseq3 및 Anseq4)과 AnMan(Anseq4) 및 AnMan(AnManM1) 마커를 갖는 NLL 유전자원 세트(N = 215)를 스크리닝한 결과, 모든 마커에 대한 "저항성" 대립유전자를 증폭시키는 계통은 한 계통(95726, Salamanca-b 근처)뿐인 반면, "'감수성' 대립유전자의 존재"는 158개(~73.5%) 계통에서 모든 마커의 비율을 찾았습니다. 13개 계통은 Lanr1 마커의 "저항성" 대립유전자를 두 개 만들었고, 8개 계통은 Lanr1 마커의 "저항성" 대립유전자를 만들었습니다. AnMan 마커의 "저항성" 대립유전자(보충 표 S1). 두 계통은 Anseq3 마커에 대해 이형접합자였고 한 계통은 AnManM1 마커에 대해 이형접합자였습니다. 42개 계통(19.5%)에서 Anseq3 및 Anseq4 대립유전자의 상반된 위상이 발견되었는데, 이는 두 유전자좌 간의 재조합 빈도가 높음을 시사합니다. 통제된 조건에서의 탄저병 표현형(보충 표 S2)은 시험 유전자형의 저항성에서 다양성을 보였으며, 이는 탄저병의 중증도에 반영되었습니다. 평균 점수 차이는 1.8(중간 저항성)에서 6.9(감수성)까지였고, 식물 중량 차이는 0.62(감수성)에서 4.45g(저항성)까지였습니다. 실험의 두 반복에서 관찰된 값(질병 심각도 점수의 경우 0.51, P = 0.00017 및 식물 무게의 경우 0.61, P < 0.0001)과 이 두 매개변수(-0.59 및 -0.77, P < 0.0001) 간에 유의한 상관관계가 있었습니다. 실험의 두 반복에서 관찰된 값들(질병 심각도 점수의 경우 0.51, P = 0.00017 및 식물 무게의 경우 0.61, P < 0.0001)과 이 두 매개변수들(-0.59 및 -0.77, P < 0.0001) 사이에는 유의한 상관관계가 있었습니다. Выявлена ​​​достоверная корреляция между значениями, наблудаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, Р <0,0001) 0,0001). 실험을 두 번 반복하여 관찰한 값(질병 심각도 점수의 경우 0.51, P = 0.00017 및 식물 무게의 경우 0.61, P < 0.0001)과 이 두 매개변수(- 0.59 및 -0.77, P < 0.0001) 간의 유의한 상관관계가 발견되었습니다.两次重复实验中观察到的值之间存在显着상关性 (疾病严复实验中观察到的值之间存) 疾病严复实島评分为0.51，P = 0.00017，植观察到为0.61，P < 0.0001) 以及这两个参数之间(- 0.59 와- 0.77, P < 0.0001).两 次 观复 实验 中 观察 的 值 之间 存에서 相关性 （疾病 严重 程島 评 分为 分为 分为 0.51, p = 0.00017, 植物为 为 0.61 , p <0.0001) 以及 两 个 参数 之间 （(((- 0.59 와 – 0.59 와 – 0.59 와 – 0.59 와- 0.77, P < 0.0001). Наблудалась значительная корреляция между значениями, наблудаемыми в двух повторностях (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001. 중복으로 관찰된 값(질병 심각도 점수 0.51, P = 0.00017 및 식물 무게 0.61, P < 0.0001)과 이 두 매개변수(-0.59 및 -0.0001) 간에는 0.77, P < 0.0001의 유의한 상관관계가 있었습니다. ).감수성 식물에서 나타나는 전형적인 증상은 줄기가 "양치기의 활"처럼 휘어지고 꼬이는 것, 그리고 주황색/분홍색 포자소체를 동반한 타원형 병반이 뒤따르는 것입니다(보충 그림 1). Lanr1(83A:476 및 Tanjil)과 AnMan(Mandelup) 유전자를 보유한 호주 계통은 중간 정도의 저항성을 보입니다(0.0331 및 0.0036). "저항성" Lanr1 및/또는 AnMan 대립유전자를 보유한 일부 계통도 이 질병의 증상을 보입니다.
흥미롭게도, "저항성" 마커 대립유전자가 없는 몇몇 NLL 계통은 높은 수준의 탄저병 저항성(Lanr1 또는 AnMan 유전자형과 동등하거나 더 높음)을 나타냈습니다. 여기에는 Boregine(두 매개변수 모두에 대해 P 값 < 0.0001), Bojar(점수에 대해 P 값 < 0.0001, 식물 중량에 대해 0.001) 및 Population B-549/79b(점수에 대해 P 값 < 0.0001, 중량에 대해 유의하지 않음)가 포함됩니다. 흥미롭게도, "저항성" 마커 대립유전자가 없는 몇몇 NLL 계통은 높은 수준의 탄저병 저항성(Lanr1 또는 AnMan 유전자형과 동등하거나 더 높음)을 나타냈습니다. 여기에는 Boregine(두 매개변수 모두에 대해 P 값 < 0.0001), Bojar(점수에 대해 P 값 < 0.0001, 식물 중량에 대해 0.001) 및 Population B-549/79b(점수에 대해 P 값 < 0.0001, 중량에 대해 유의하지 않음)가 포함됩니다. Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки 및 0,001 для массы растения) 및 популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для 마시). 흥미롭게도, '저항성' 마커 대립유전자가 없는 몇몇 NLL 계통은 탄저병에 대해 높은 수준의 저항성을 보였습니다(Lanr1 또는 AnMan 유전자형과 동등하거나 더 높음). 여기에는 Boregine(두 매개변수 모두에 대해 P 값 < 0.0001), Bojar(평가에 대해 P 값 < 0.0001, 식물 중량에 대해 0.001) 및 집단 B-549/79b(평가에 대해 P 값 < 0.0001, 중량에 대해 유의하지 않음)가 포함됩니다.有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示抗性 (与Lanr1 或AnMan)基因型相当或更高)，例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P值<得分为0.0001，植물중량为0.001) and种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，weight不显着). "항원성" 마커가 없는 일부 NLL 시스템이 높은 수평 저항성(Lanr1 또는 AnMan 유전자와 동일하거나 그 이상)을 보이는 것은 흥미롭습니다. 이러한 시스템에는 Boregine(두 매개변수 모두 P < 0.0001), Bojar(P 값 < 0.0001, 식물 중량 0.001) 및 균주 B-549/79b(P 값 < 0.0001, 중량은 유의하지 않음)가 있습니다. Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистеntности», показали высокие уровни устойчивости к antракнозу (сравнимые или выше, чем у genотипов Lanr1 및 AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих paraметров) <0,0001), Bojar(значение P <0,0001, масса растения 0,001) 및 популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). 흥미롭게도, '저항성' 마커 대립유전자가 없는 일부 NLL 계통은 높은 수준의 탄저병 저항성(Lanr1 또는 AnMan 유전자형과 동등하거나 더 높음)을 보였습니다. 여기에는 Boregine(두 매개변수에 대한 P값 <0.0001), Bojar(P값 < 0.0001, 식물 중량 0.001) 및 집단 B-549/79b(P값 < 0.0001, 중량은 유의하지 않음)가 포함됩니다.이러한 현상은 새로운 유전적 저항성 원천의 가능성을 시사하며, 마커 유전자형과 질병 표현형 간의 상관관계가 관찰되지 않은 것을 설명합니다(P 값은 약 0.42에서 약 0.98). 따라서 콜모고로프-스미르노프 검정 결과, 탄저병 저항성 데이터는 점수(P 값은 0.25와 0.11)와 식물체량(P 값은 0.47과 0.55)에 대해 거의 정규분포를 따르는 것으로 나타났습니다. 이는 Lanr1과 AnMan보다 더 많은 대립유전자가 관여한다는 가설을 시사합니다.
탄저병 저항성 스크리닝 결과를 바탕으로 전사체 분석을 위해 83A:476, Boregine, Mandelup, 그리고 Population 22660의 4개 계통을 선정했습니다. 이 계통들은 RNA 시퀀싱을 통해 접종 실험에서 탄저병 저항성을 재검토했지만, 이전 시험과 동일한 결과를 보였습니다. 점수 값은 다음과 같습니다: Boregine(1.71±1.39), 83A:476(2.09±1.38), Mandelup(3.82±1.42) 그리고 Population 22660(6.11±1.29).
Illumina NovaSeq 6000 프로토콜은 샘플당 평균 40.5 Mread 쌍(29.7~54.4 Mread)을 달성했습니다(보충 표 S3). 참조 시퀀스의 정렬 점수는 75.5%~88.6% 범위였습니다. 실험 변이체와 생물학적 반복 실험 간의 리드 카운트 데이터의 평균 상관관계는 0.812~0.997(평균 0.959) 범위였습니다. 분석된 35,170개 유전자 중 2,917개는 발현이 나타나지 않았고, 나머지 4,785개 유전자는 무시할 수 있는 수준(기준 평균 < 5)으로 발현되었습니다. 분석된 35,170개 유전자 중 2,917개는 발현이 나타나지 않았고, 나머지 4,785개 유전자는 무시할 수 있는 수준(기준 평균 < 5)으로 발현되었습니다. 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5). 분석된 35,170개 유전자 중 2,917개는 발현이 없었고, 나머지 4,785개 유전자는 무시할 수 있는 수준(기준 평균 <5)으로 발현되었습니다.35,170 个基因中,2917 个没有表达,其他4785 个基因的表达可以忽略计（基本平均值< 5).35,170 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительнуuv экспрессив(базовое среднее значение <5). 분석된 35,170개 유전자 중 2,917개는 발현되지 않았고 나머지 4,785개 유전자는 발현이 미미했습니다(기준 평균 <5).따라서 실험 동안 발현된 것으로 간주된 유전자 수(기준 평균 ≥ 5)는 27,468개(78.1%)였습니다(보충 표 S4).
첫 번째 시점부터 모든 NLL 라인은 전사체를 재프로그래밍하여 C. lupini(Col-08 균주) 접종에 반응했지만(표 1), 라인 간에 유의미한 차이가 관찰되었습니다. 따라서 저항성 라인 83A:476(Lanr1 유전자 보유)은 첫 번째 시점(6 hpi)에 유의미한 전사체 재프로그래밍을 보였으며, 이 시점의 다른 시점과 비교하여 분리된 상향 및 하향 유전자의 수가 31-69배 증가했습니다. 또한, 이 피크는 수명이 짧았는데, 두 번째 시점(12 hpi)에서 소수의 유전자의 발현만이 유의미하게 변화된 상태로 유지되었기 때문입니다. 흥미롭게도, 접목 시험에서 높은 수준의 저항성을 보인 Boregine은 실험 중에 그러한 대규모 전사 재프로그래밍을 겪지 않았습니다. 그러나 차등 발현 유전자(DEG)의 수는 12 HPI에서 Boregine과 83A:476에서 동일했습니다. 맨델럽과 개체군 22660은 모두 마지막 시점에서 DEG 피크(48 l/s)를 보였는데, 이는 방어 반응이 상대적으로 지연되었음을 나타냅니다.
83A:476은 다른 모든 계통에 비해 6 HPI에서 C. lupini에 대한 반응으로 대규모 전사체 재프로그래밍을 겪었기 때문에, 이 시점에서 관찰된 DEG의 약 91%가 계통 특이적이었습니다(그림 1). 그러나 연구 계통 간 초기 반응에는 일부 중복이 있었는데, Boregine, Mandelup, 그리고 22660번 개체군의 DEG가 각각 68.5%, 50.9%, 그리고 52.6%로 특정 시점의 83A:476에서 발견된 DEG와 중복되었습니다. 그러나 이러한 DEG는 현재 83A:476을 사용하여 검출된 모든 DEG의 극히 일부(0.97~1.70%)에 불과했습니다. 또한 모든 계통의 11개 DEG가 이때 일관성을 보였습니다(보충 표 S4-S6). 여기에는 식물 방어 반응의 공통 구성 요소인 지질 전이 단백질(TanjilG_32225), 엔도글루칸-1,3-β-글루코사이드 효소(TanjilG_23384), SAM22와 같은 두 가지 스트레스 유도 단백질(TanjilG_31528 및 TanjilG_31531), 염기성 라텍스 단백질(TanjilG_32352), 글리신이 풍부한 두 가지 구조적 세포벽 단백질(TanjilG_19701 및 TanjilG_19702)이 포함됩니다. 24 HPI에서 83A:476과 Boregine(총 16-38% DEG) 사이, 48 HPI에서 Mandelup과 Population 22660(총 14-20% DEG) 사이 전사체 반응에서 비교적 높은 중복이 있었습니다.
콜레토트리쿰 루피니(Colletotrichum lupini, 1999년 폴란드 비에르제니체 루핀 농장에서 얻은 Col-08 균주)를 접종한 좁은잎 루핀(NLL) 계통에서 차등 발현 유전자(DEG)의 수를 보여주는 벤 다이어그램입니다. 분석된 NLL 계통은 다음과 같습니다. 83A:476(Lanr1 대립유전자를 갖는 내성), 보레진(유전적 배경 불명), 만델럽(AnMan 대립유전자를 갖는 중간 내성), 그리고 22660번 개체군(매우 감수성). 약어 hpi는 백신 접종 후 시간을 나타냅니다. 그래프를 단순화하기 위해 0 값을 제거했습니다.
6 hpi에서 과발현된 유전자 세트를 대상으로 표준 R 유전자 도메인의 존재 여부를 분석했습니다(보충 표 S7). 이 연구에서는 83A:476에서만 NBS-LRR 도메인을 가진 고전적 질병 저항성 유전자의 전사체 유도가 확인되었습니다. 이 세트는 TIR-NBS-LRR 유전자 1개(tanjilg_05042), CC-NBS-LRR 유전자 5개(tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, tanjilg_16162), 그리고 NBS-LR, Tanjilg_16162) 4개, NBS-LRRE(tanjilg_16162) 4개, 그리고 NBS-Lrr(tanjilg_16162) 4개와 NBS-LRR(TANJILG_16162) 4개로 구성되었습니다. 이 유전자들은 모두 표준 도메인이 보존된 서열로 배열되어 있습니다. NBS-LRR 도메인 유전자 외에도 여러 RLL 키나제가 6 hpi에서 활성화되었습니다. 즉, Boregine(TanjilG_19877)에서 1개, Mandelup(TanjilG_07141 및 TanjilG_19877)에서 2개, 집단 22660(TanjilG_09014 및 TanjilG_10361)에서 2개, 83A 27:476에서 2개가 활성화되었습니다.
C. lupini(Col-08 균주) 접종에 따라 발현이 크게 변화된 유전자는 유전자 온톨로지(GO) 풍부 분석을 거쳤습니다(보충 표 S8). 가장 빈번하게 과대 표현된 생물학적 과정 항목은 "GO:0006952 방어 반응"으로, 높은 유의성을 갖는 16가지(시간 × 선) 조합 중 6가지에서 나타났습니다(P 값 < 0.001)(그림 2). 가장 빈번하게 과대 표현된 생물학적 과정 항목은 "GO:0006952 방어 반응"으로, 높은 유의성을 갖는 16가지(시간 × 선) 조합 중 6가지에서 나타났습니다(P 값 < 0.001)(그림 2). Наиболее часто чрезмерно представленным terminом биологического процесса был «GO: 0006952 зачитный ответ», который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостьù (значение P <0,001) (рис. 2). 가장 빈번하게 과대 표현된 생물학적 과정 항목은 'GO:0006952 방어 반응'으로, 16가지(시간 × 계통) 조합 중 6가지에서 높은 유의성(P값 < 0.001)으로 나타났습니다(그림 2).最常被过年代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它丸被过应，它流现는 16 个（时间×线)组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0.001)(图2). 가장 대표적인 생물학적 과정 항목은 “GO:0006952 방어반응”으로, 16가지(시간×세로) 조합 중 6가지에서 나타났으며 유의수준이 높았다(P값 < 0.001)(그림2). Наиболее часто чрезмерно представленным terminом биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», который появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостья (значение P <0,001) (рис. 2). 가장 빈번하게 과대 표현된 생물학적 과정 항목은 'GO:0006952 방어 반응'으로, 16가지 조합 중 6가지에서 높은 유의성(P 값 < 0.001)으로 나타났습니다(그림 2).이 용어는 83A에서 두 시점, 즉 476과 Boregine(6 및 24 hpi)에서 과다하게 표현되었고, Mandelup과 Population 22660(각각 12 및 6 hpi)에서는 한 시점에서 과다하게 표현되었습니다. 이는 예상된 결과로, 저항성 계통의 항진균 반응을 강조합니다. 또한, 83A:476은 "GO:0055114 산화환원 과정"이라는 용어로 표현되는 산화적 폭발과 관련된 유전자를 빠르게 유도하여 C. lupini에 반응하여 특이적 방어 반응을 나타냈고, Boregine은 'GO'라는 용어와 관련된 특이적 방어 반응을 나타냈습니다. :0006950 스트레스 반응”. 개체군 22660은 이차 대사산물과 관련된 수평 저항 반응을 활성화시켰으며, “GO:0016104 트리테르펜 생합성 과정”과 “GO:0006722 트리테르펜 대사 과정”이라는 용어가 과도하게 많이 사용된 것을 강조했습니다(두 용어 모두 동일한 유전자 집합에 속함). GO 용어 농축 분석 결과를 고려할 때, 만델럽 반응 안정성은 보레진과 개체군 22660 사이에 존재했습니다. 또한, 초기 반응 83A:476(6 hpi)과 지연 반응 만델럽 및 개체군 22660은 GO:0015979 '광합성' 및 기타 관련 생물학적 과정을 포함합니다.
좁은잎루핀(NLL)에 탄저병 루핀(1999년 폴란드 비에르제니체 루핀 농장에서 채취한 Col-08 균주)을 접종하여 전사체 반응 중 차등 발현 유전자를 주석으로 사용할 때 선택된 생물공정 유전자 온톨로지 용어는 크게 과장되어 있습니다. 분석된 NLL 계통은 다음과 같습니다. 83A:476(저항성, 동형접합 Lanr1 대립유전자 보유), Boregine(저항성, 유전적 배경 불명), Mandelup(중간 저항성, 동형접합 AnMan 대립유전자 보유), 그리고 22660번 개체군(감수성).
본 연구는 탄저병 저항성에 기여하는 유전자를 식별하는 것을 목표로 했기 때문에, GO ​​항목 "GO: 0006952 방어 반응"과 "GO: 0055114 산화환원 과정"에 할당된 유전자는 기준선 평균이 30 이상이며 최소 한 줄 이상인 경우를 기준으로 분석했습니다. × log²(배수 변화)의 통계적으로 유의미한 값을 결합한 시점. 이러한 기준을 충족하는 유전자의 수는 GO:0006952의 경우 65개, GO:0055114의 경우 524개였습니다.
83A:476은 GO:0006952라는 용어가 표시된 두 개의 DEG 피크를 나타냈는데, 첫 번째 피크는 인치당 6개 유전자(64개 유전자, 상향 및 하향 조절)에서, 두 번째 피크는 인치당 24개 유전자(15개 유전자, 상향 조절만)에서 나타났습니다. Boregine은 또한 GO:0006952가 동일한 시점에서 피크를 나타냈지만, DEG가 더 적고(11개와 8개) 우선적으로 활성화됨을 보여주었습니다. Mandeloop는 12 HPI와 48 HPI에서 GO:0006952의 두 피크를 나타냈는데, 두 피크 모두 12개 유전자(첫 번째는 활성화 유전자, 두 번째는 억제 유전자만 있음)를 가지고 있는 반면, 6 HPI(13개 유전자)에서 22660 개체군은 증가 피크 조절이 더 우세했습니다. 이 피크에서 GO:0006952 DEG의 96.4%가 동일한 유형의 반응(상승 또는 하락)을 보였으며, 이는 관련된 유전자 수의 차이에도 불구하고 방어 반응에서 상당한 중복을 나타냅니다.GO:0006952라는 용어와 관련된 가장 큰 시퀀스 그룹은 Starvation Stress-Associated Message Protein 22(SAM22 유사)를 인코딩하는데, 이는 클래스 10 병원성 관련 단백질(PR-10) 단백질 클레이드와 코어 단백질 라텍스에 속합니다.유사(MLP 유사) 단백질) 단백질(그림 3).두 그룹은 발현의 특성과 반응 방향에서 달랐습니다.SAM22 유사 단백질을 인코딩하는 유전자는 초기 시점(6 또는 12 hpi)에서 일관되고 상당한 유도를 보였으며 실험 종료 시(48 hpi)에는 일반적으로 반응이 없었지만 MLP 유사 단백질은 6 hpi에서 배위를 보였습니다. 83A:476과 Mandelup(48 hp/in)에서 거의 모든 다른 데이터 포인트는 반응하지 않았습니다. 또한, SAM22 유사 단백질 유전자의 발현 양상은 탄저병 저항성에서 관찰된 변동성에 따라 달랐는데, 이는 저항성이 높은 계통일수록 감수성이 높은 유전자보다 이러한 유전자를 유의하게 유도하는 시점이 더 많았기 때문입니다. 또 다른 LlR18A/B 유사 PR-10 유전자는 SAM22 유사 단백질 유전자와 매우 유사한 발현 양상을 보였습니다.
생물학적 과정 용어 "GO:0006952 방어 반응"의 주요 구성 요소와 Lanr1 및 AnMan 대립유전자 후보 유전자의 발현 양상을 확인했습니다. Log2 척도는 접종된 식물(Colletotrichum lupini, Col-08 균주, 루핀 밭에서 입수, Wizhenica, 폴란드, 1999)과 대조군(가성 접종) 식물 사이의 동일 시점에서의 log2 값(배수 변화)을 나타냅니다. 분석 대상은 다음과 같은 좁은 잎 루핀 계통입니다: 83A:476(저항성, 동형접합 Lanr1 대립유전자 보유), Boregine(저항성, 유전적 배경 불명), Mandelup(중간 저항성, 동형접합 AnMan 대립유전자 보유), 그리고 Population 22660(감수성).
또한, RNA-seq 후보 유전자인 Lanr1(TanjilG_05042)과 AnMan(TanjilG_12861)의 발현 프로파일을 평가하였다(그림 3). TanjilG_05042 유전자는 첫 번째 시점(6 hpi)에서만 83A:476에서 유의미한 반응(활성화)을 보인 반면, TanjilG_12861은 Mandeloop에서 두 시점, 즉 6 hpi(하향 조절)와 24 hpi(6 hpi)에서만 유의미한 반응을 보였다. (With.). adjustable) ).
GO:0055114 "산화환원 과정"이라는 용어에서 가장 과발현된 유전자는 시토크롬 P450 단백질과 과산화효소를 인코딩하는 유전자였습니다(그림 4). 6 HPI에서 83A:476에서 분리한 샘플의 경우, 최대 또는 최소 log2(배수 변화) 값(유전자의 86.6%)이 일반적으로 접종된 식물과 대조 식물 사이에서 관찰되었으며, 이는 이 유전자형이 접종 성별에 대해 높은 반응을 보인다는 것을 강조합니다. 83A:476은 6 hpi에서 가장 유의한 GO: 0055114 DEG(503개 유전자)를 보인 반면, 나머지 계통은 48 hpi에서 GO: 0055114 DEG(31개 유전자; Mandelup, 85개 유전자; Population 22660, 78개 유전자)를 보였습니다. GO:0055114 계열의 대부분 유전자에서 백신 접종에 대한 두 가지 유형의 반응(활성화 및 억제)이 관찰되었습니다. 흥미롭게도, 48 hp의 만델루프에서 GO: 0055114라는 용어에 대해 확인된 DEG의 최대 97.6%가 이러한 관찰 결과를 통해 유의미하게 작은 규모(즉, 돌연변이된 산화환원 유전자의 수, 85개 대 503개)에도 불구하고, 탄저병에 대한 만델루프의 지연된 전사체 반응 패턴이 83A:476의 초기 반응과 유사함을 시사합니다. 보레진과 개체군 22660에서는 이러한 수렴성이 각각 51.6%와 75.6%로 더 낮습니다.
생물학적 과정 용어 "GO:0055114 산화환원 과정"의 주요 구성 요소의 발현 양상이 밝혀졌습니다. Log2 척도는 접종된 식물(Colletotrichum lupini, Col-08 균주, 루핀 밭에서 획득, Wizhenica, 폴란드, 1999)과 대조군(가짜 접종) 식물 간의 동일 시점에서의 log2 값(배수 변화)을 나타냅니다. 분석 대상은 다음과 같은 좁은 잎 루핀 계통입니다: 83A:476(저항성, 동형접합 Lanr1 대립유전자 보유), Boregine(저항성, 유전적 배경 불명), Mandelup(중간 저항성, 동형접합 AnMan 대립유전자 보유), 그리고 Population 22660(감수성).
83A:476 C. lupini(Col-08 균주) 접종에 대한 전사체 반응에는 GO:0015979 "광합성" 및 기타 관련 생물학적 과정에 기인하는 유전자의 공동 발현 억제도 포함되었습니다(그림 5). 이 GO:0015979 DEG 세트에는 83A:476에서 6 hpi에 유의하게 억제된 105개의 유전자가 포함되었습니다. 이 하위 세트에서 Mandelup에서는 48 HPI에서 37개의 유전자가, 22660 개체군에서는 동일 시점에서 35개의 유전자가 하향 조절되었으며, 여기에는 두 유전자형 모두에 공통적인 19개의 DEG가 포함되었습니다. GO: 0015979와 관련된 DEG는 어떤 조합(줄 x 시간)에서도 유의하게 활성화되지 않았습니다.
생물학적 과정 "GO:0015979 광합성"의 주요 구성 요소의 발현 양상이 밝혀졌습니다. Log2 척도는 접종된 식물(Colletotrichum lupini, Col-08 균주, 루핀 밭에서 획득, Wizhenica, 폴란드, 1999)과 대조군(가성 접종) 식물 간의 동일 시점에서의 log2 값(배수 변화)을 나타냅니다. 분석 대상은 다음과 같은 좁은 잎 루핀 계통입니다: 83A:476(저항성, 동형접합 Lanr1 대립유전자 보유), Boregine(저항성, 유전적 배경 불명), Mandelup(중간 저항성, 동형접합 AnMan 대립유전자 보유), 그리고 Population 22660(감수성).
차등 발현 분석 결과와 병원성 진균에 대한 방어 반응과 관련이 있을 것으로 추정되는 이 7개 유전자 세트를 실시간 PCR을 통해 발현 프로필을 정량화하기 위해 선택했습니다(보충 표 S9).
추정 단백질 유전자인 TanjilG_10657은 대조군(모방) 식물체와 비교하여 모든 연구 계통 및 시점에서 유의하게 유도되었다(보충 표 S10, S11). 또한, TanjilG_10657의 발현 양상은 모든 계통에서 실험 기간 동안 증가하는 경향을 보였다. 22660번 집단은 접종에 대한 TanjilG_10657의 가장 높은 민감도를 보였으며, 114배 활성화되었고, 24 HPI에서 가장 높은 상대 발현 수준(4.4±0.4)을 나타냈다(그림 6a). PR10 LlR18A 단백질 유전자인 TanjilG_27015 또한 모든 계통 및 시점에서 활성화되었으며, 대부분의 데이터 지점에서 통계적으로 유의미했다(그림 6b). TanjilG_10657과 유사하게 TanjilG_27015의 가장 높은 상대적 발현 수준은 24 HPI(19.5 ± 2.4)에서 22660 접종 집단에서 관찰되었습니다. 산성 엔도키티나제 유전자 TanjilG_04706은 Boregine 6 hpi를 제외한 모든 계통과 모든 시점에서 상당히 상향 조절되었습니다(그림 6c). 83A:476에서 첫 번째 시점(6 HPI)에 강하게 유도되었고(10.5배), 다른 계통에서는 적당히 증가했습니다(6.6-7.5배). 실험 동안 TanjilG_04706의 발현은 83A:476과 Boregine에서 비슷한 수준을 유지했지만 Mandelup과 Population 22660에서는 상당히 증가하여 비교적 높은 값(각각 5.9 ± 1.5 및 6.2 ± 1.5)에 도달했습니다. 엔도글루칸-1,3-β-글루코시다제 유사 유전자인 TanjilG_23384는 22660번 집단을 제외한 모든 계통에서 처음 두 시점(6시간 및 12시간)에 높은 활성화를 보였다(그림 6d). TanjilG_23384의 상대 발현량이 가장 높은 것은 Mandelup(2.7±0.3)과 83A:476(1.5±0.1)에서 두 번째 시점(12시간)이었다. 24시간째 TanjilG_23384의 발현량은 모든 연구 계통에서 상대적으로 낮았다(0.04±0.009에서 0.44±0.12).
정량 PCR을 통해 확인된 선별된 유전자(ag)의 발현 프로파일. 숫자 6, 12, 24는 백신 접종 후 시간을 나타냅니다. LanDExH7 및 LanTUB6 유전자는 정규화에 사용되었고, LanTUB6는 시리즈 간 검정에 사용되었습니다. 오차 막대는 세 번의 생물학적 반복 실험에 기반한 표준 편차를 나타내며, 각 실험은 세 번의 기술적 반복 실험의 평균입니다. 접종된 식물(폴란드 비에르제니차의 루핀 밭에서 1999년에 얻은 Colletotrichum lupini, Col-08 균주)과 대조 식물(가짜 접종) 간의 발현 수준 차이에 대한 통계적 유의성은 위에 데이터 포인트로 표시되어 있습니다(*P 값 < 0.05, **P 값 ≤ 0.01, ***P 값 ≤ 0.001). 접종된 식물(폴란드 비에르제니차의 루핀 밭에서 1999년에 얻은 Colletotrichum lupini, Col-08 균주)과 대조 식물(가짜 접종) 간의 발현 수준 차이에 대한 통계적 유의성은 위에 데이터 포인트로 표시되어 있습니다(*P 값 < 0.05, **P 값 ≤ 0.01, ***P 값 ≤ 0.001). 통계는 различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен в 1999) г. с поля лупина в Верженице, Польша) 및 Контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). 접종된 식물(폴란드 비에르제니체의 루핀 밭에서 1999년에 얻은 Colletotrichum lupini, Col-08 균주)과 대조구(가짜 접종) 식물 간의 발현 수준에 통계적으로 유의미한 차이가 데이터 포인트 위에 표시되어 있습니다(*P 값 < 0.05, **P 값 ≤ 0.01, ***P 값 ≤ 0.001).接种(Colletotrichum) lupini, Col-08株,1999年从波兰Wierzenica의 羽扇豆ton获得) 및 对 사진(模拟接种) 0.05, **P 值≤ 0.01, ***P 值≤ 0.001)。接种 （colletotrichum lupini , color-08 株 , 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得) 및 对光 （接种 植物 之间 水平 差异 的 统计학显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001). Statистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей лупина в Верженице, Польша, в 1999 г.) 및 контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). 접종된 식물(Colletotrichum lupini, Col-08 균주, 1999년 폴란드 Verzhenice의 루핀 밭에서 채취)과 대조 식물(가짜 접종) 간의 발현 수치에 통계적으로 유의미한 차이가 데이터 포인트 위에 표시되어 있습니다(*P 값 < 0.05, **P 값 ≤ 0.01, ***P 값 ≤ 0.001).분석된 NLL 계통은 다음과 같습니다: 83A:476(저항성, 동형 접합체 Lanr1 대립유전자를 가짐), Mandelup(중간 저항성, 동형 접합체 AnMan 대립유전자를 가짐), Boregine(저항성, 유전적 배경 불명) 및 집단 22660(감수성).
Lanr1 유전자좌의 후보 유전자 TanjilG_05042는 RNA-seq 연구에서 얻은 프로파일과 현저히 다른 발현 양상을 보였다(그림 6e). 이 유전자의 유의미한 활성화는 Mandelup과 22660 개체군에서 관찰되었으며(각각 최대 39.7배 및 11.7배), 상대적으로 높은 발현 수준(각각 최대 1.4±0.14배 및 7.2±1.3배)을 나타냈다. 83A:476에서도 TanjilG_05042 유전자의 일부 상향조절(최대 3.8배)이 관찰되었지만, 상대 발현 수준(0.044±0.002)은 Mandelup과 22660 개체군에서 관찰된 것보다 30배 이상 낮았다. qPCR로 분석한 결과, 모의 백신 접종(대조군) 변이체의 유전자형 간에 발현 수준에 상당한 차이가 있었으며, 집단 22660과 83A:476 사이, 그리고 집단 22660과 22660 사이에서 58배의 차이가 나타났습니다. Boregine과 Mandalup 사이에서는 2배의 차이가 나타났습니다.
AnMan 유전자좌의 후보 유전자인 TanjilG_12861은 83A:476과 Mandelup에서 백신 접종에 반응하여 활성화되었고, 22660 개체군에서는 중성이었고, Boregine에서는 하향조절되었다(그림 6f). TanjilG_12861 유전자의 상대 발현은 접종된 83A:476에서 가장 높았다(0.14±0.01). 17.4 kDa 클래스 I 열충격 단백질 유전자인 TanjilG_05080 HSP17.4는 모든 연구 균주 및 시점에서 상대 발현 수준이 더 낮았다(그림 6g). 가장 높은 발현 값은 22660 개체군에서 24 HPI에서 관찰되었다(0.14±0.02, 백신 접종에 대한 반응으로 8배 증가).
유전자 발현 프로파일 비교(그림 7) 결과, TanjilG_10657과 다른 네 유전자, 즉 TanjilG_27015(r = 0.89), TanjilG_05080(r = 0.85), TanjilG_05042(r = 0.80), TanjilG_04706(r = 0.79) 사이에 높은 상관관계가 나타났습니다. 이러한 결과는 방어 반응 중 이들 유전자의 공동 조절을 시사할 수 있습니다. TanjilG_12861과 TanjilG_23384 유전자는 다른 유전자에 비해 낮은 피어슨 상관계수(각각 0.08~0.43 및 -0.19~0.28)를 보이며 서로 다른 발현 프로파일을 보였습니다.
유전자 발현 프로파일 간의 상관관계는 정량적 PCR을 이용하여 분석하였다. 분석에 사용된 좁은잎 루핀 계통은 다음과 같다: 83A:476(저항성, 동형접합 Lanr1 대립유전자 보유), Mandelup(중간 저항성, 동형접합 AnMan 대립유전자 보유), Boregine(저항성, 유전적 배경 불명), 그리고 Population 22660(감수성). 접종된 개체(Colletotrichum lupini, Col-08 균주, 1999년 폴란드 비에르제니체 루핀 포장에서 입수)와 대조군(가접종)을 포함하여 접종 후 6시간, 12시간, 그리고 24시간 후의 세 시점을 계산하였다. 눈금은 피어슨 상관계수 값을 나타낸다.
인치당 6마력으로 얻은 데이터를 바탕으로, 접종된 식물과 대조군 식물을 비교하여 초기 방어 반응에 초점을 맞춘 9981도(DEG)에 대해 WGCNA를 수행했습니다(보충 표 S12). 유전자형과 실험 변이체 간에 상관관계(양성 또는 음성)가 있는 22개의 유전자 모듈(클러스터)이 발견되었습니다. 평균적으로 유전자 발현 수준은 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 순으로 감소했습니다(그러나 두 변종 모두에서 이러한 경향은 대조 식물에서 더 강했습니다). 평균적으로 유전자 발현 수준은 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 순으로 감소했습니다(그러나 두 변종 모두에서 이러한 경향은 대조 식물에서 더 강했습니다). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > 인구 22660 (в обоих вариантах, однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). 평균적으로 유전자 발현 수준은 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 순으로 감소했습니다(그러나 두 변종 모두에서 이러한 경향은 대조 식물에서 더 강했습니다).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > 인구 22660的顺序下降(然而, 两种变体中, 这种趋势에서 对光植物中更强).平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> 인구 22660 的 顺序 下降 （， 种 中 ， 这 种 在 植物 中更)。、。。。。。。。。。。。。。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > 인구 22660 (однако в обоих вариантах эта тенденция была сильнее у контрольных растений). 평균적으로 유전자 발현 수준은 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 시리즈에서 감소했습니다(그러나 두 변종 모두에서 이러한 경향은 대조 식물에서 더 강했습니다).백신 접종은 특히 모듈 18, 19, 14, 6 및 1(효과 순으로)에서 유전자 발현의 상향 조절을 초래했으며, 음성 조절(예: 모듈 9 및 20) 또는 중립적 효과(예: 모듈 11, 22, 8 및 13)를 나타냈습니다. GO 용어 농축 분석(보충 표 S13)은 qPCR로 분석한 유전자(TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 및 TanjilG_27015)를 포함하여 최대 활성화를 보인 접종 모듈(18)과 가장 많이 억제된 광합성 모듈(9)에 대한 "GO: 0006952 보호 반응"을 나타냈습니다. 모듈 18 농축기(그림 8)는 PR-10 유사 LlR18B 단백질을 암호화하는 TanjilG_26536 유전자로 확인되었고, 모듈 9 농축기는 광계 II PsbQ 단백질을 암호화하는 TanjilG_28955 유전자로 확인되었습니다. 탄저병 저항성 유전자 후보인 Lanr1인 TanjilG_05042는 모듈 22(그림 9)에서 발견되었으며, TanjilG_01212 허브를 포함하는 "GO:0044260 세포 거대분자 대사 과정" 및 "GO:0006355 전사 조절, DNA 주형"이라는 용어와 연관되어 있습니다. 이 유전자는 열 스트레스 전사 인자 A-4a(HSFA4a)를 암호화합니다.
생물학적 과정 용어가 과대 표현된 모듈 "GO: 0006952 방어 반응"의 유전자 공동 발현에 대한 가중 네트워크 분석. qPCR로 분석된 네 가지 유전자(TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657, TanjilG_27015)를 강조하기 위해 연결 과정을 단순화했습니다.
생물학적 과정 항 "GO: 0006355: 전사 조절, DNA 템플릿화"가 과대 표현되고 탄저병 저항성 후보 유전자인 Lanr1 TanjilG_05042를 포함하는 모듈의 유전자 공발현에 대한 가중 네트워크 분석. TanjilG_05042 유전자와 중심 TanjilG_01212 유전자를 분리하기 위해 연결 과정을 단순화했습니다.
호주에서 수집된 탄저병 저항성 스크리닝 결과, 초기 출시 품종 대부분이 감수성인 것으로 나타났습니다. Kalya, Coromup, Mandelup은 중간 정도의 저항성을 보인 반면, Wonga, Tanjil, 83A:476은 높은 저항성을 보였습니다.26,27,31. 는 동일한 저항성 대립유전자(Lanr1)를 가지고 있었고, Coromup과 Mandelup은 다른 대립유전자(AnMan10, 26, 39)를 가지고 있었으며, Kalya는 다른 대립유전자(Lanr2)를 전달했습니다. 독일에서 탄저병 저항성 스크리닝을 실시한 결과, Lanr1 이외의 후보 대립유전자(LanrBo36)를 가진 저항성 계통 Bo7212가 확인되었습니다.
본 연구에서는 시험된 유전자원에서 Lanr1 대립유전자의 매우 낮은 빈도(약 6%)를 확인했습니다. 이러한 관찰 결과는 Anseq3 및 Anseq4 마커를 사용하여 동유럽 유전자원을 스크리닝한 결과와 일치하며, Lanr1 대립유전자는 벨라루스 계통 두 개에만 존재한다는 것을 보여주었습니다. 이는 Lanr1 대립유전자가 마커 지원 육종의 핵심 대립유전자 중 하나인 호주와 달리 지역 육종 프로그램에서 아직 널리 사용되지 않음을 시사합니다. 이는 호주 보고에 비해 유럽의 포장 조건에서 Lanr1 대립유전자가 제공하는 저항성 수준이 낮기 때문일 수 있습니다. 또한, 호주의 강우량이 많은 지역에서의 탄저병 연구는 Lanr1 대립유전자에 의해 매개되는 저항성 반응이 병원균의 성장과 빠른 발달에 유리한 기상 조건에서는 효과적이지 않을 수 있음을 보여주었습니다19,42. 실제로 본 연구에서는 Lanr1 대립유전자를 가진 유전자형에서도 일부 탄저병 증상이 관찰되었는데, 이는 C. lupini의 발달에 최적의 조건에서 내성이 사라질 수 있음을 시사합니다. 또한, Lanr1 유전자좌에서 약 1 cM 떨어진 Anseq3 및 Anseq4 마커의 존재에 대한 위양성 해석이 가능합니다. 28,30,43
본 연구에 따르면 Lanr1 대립유전자를 가진 83A:476은 C. lupini 접종 후 첫 번째 분석 시점(6시간 후)에 대규모 전사체 재프로그래밍 반응을 보인 반면, AnMan 대립유전자를 가진 Mandelup에서는 훨씬 늦게(24시간 후에서 48시간 후) 전사체 반응이 관찰되었습니다. 이러한 방어 반응의 시간적 차이는 병징의 차이와 연관되어 있으며, 이는 저항성 대응에 대한 성공적인 반응을 위해 조기 병원체 인식의 중요성을 강조합니다. 식물 조직을 감염시키려면 탄저균 포자가 발아, 세포 분열, 부착기 형성 등 기주 표면에서 여러 발달 단계를 거쳐야 합니다. 부속기는 기주 표면에 부착하여 기주 조직으로의 침투를 용이하게 하는 감염성 구조물입니다. 따라서 완두콩 추출물의 C. gloeosporioides 포자는 배양 75-90분 후 핵의 첫 번째 분열, 90-120분 후 발아관 형성, 4시간 후 억제를 보였다 45 . 망고 C. gloeosporioides는 배양 3시간 후 40% 이상의 포자 발아와 4시간 후 약 20%의 억제자 형성을 보였다. C. gloeosporioides의 독성 관련 CAP20 유전자는 CAP20 단백질 농도가 높은 아보카도 표면 왁스에서 3.5시간 배양 후 4시간 46분 후 기생식물 형성 포자에서 전사 활성을 보였다. 마찬가지로 C. trifolii의 멜라닌 생합성 유전자의 활성은 2시간 배양 후 1시간 후 부착기가 형성되는 동안 유도되었다. 잎 조직 연구에 따르면 C. acutatum을 접종한 딸기는 8 hpi에서 첫 억제를 보인 반면, C. coccodes를 접종한 토마토는 4 hpi에서 첫 억제를 보였습니다.48,49 이는 Colletotrichum spp. 감염 과정의 시간 척도와 대체로 일치합니다. 83A:476에 대한 신속한 방어 반응은 이 계통에서 식물 저항성 및 효과기 유발 면역(ETI) 유전자의 관여를 시사하는 반면, Mandelup의 지연 반응은 미세 연관 분자 패턴 유발 면역(MTI) 가설을 뒷받침합니다.50. 83A:476 및 Mandelup에 대한 초기 반응. 지연 반응에서 상향 또는 하향 조절된 유전자 간의 부분적 중복도 이 개념을 뒷받침합니다. ETI는 종종 가속화되고 강화된 MTI 반응으로 간주되어 감염 부위에서 프로그램된 세포 사멸(아나필락시스 쇼크라고 함)로 끝나기 때문입니다.51,52.
과대 표현된 용어인 Gene Ontology GO:0006952 "방어 반응"에 기인하는 유전자의 대부분은 스트레스 유도 단식 메시지 22 단백질(SAM22와 유사)의 11개 상동체와 7개의 주요 라텍스 단백질 유사체(MLP)입니다. 유사 단백질 31, 34, 43 및 423은 서열 유사성을 보였습니다. SAM22 유사 유전자는 더 오래 지속되는 상당한 활성화를 보였으며, 탄저병 저항성(83A:476 및 Boregine) 수치 증가를 보였습니다. 그러나 MLP 유사 유전자는 후보 저항성 대립유전자(6 hpi에서 83A:476/Lanr1 및 24 hpi에서 Mandelup/AnMan)를 갖는 계통에서만 하향 조절되었습니다. 확인된 모든 SAM22 유사 상동체는 약 105kb에 달하는 유전자 클러스터에서 유래한 반면, MLP 유사 유전자는 유전체의 서로 다른 영역에서 유래한다는 점에 유의해야 합니다. 이러한 SAM22 유사 유전자의 동시적인 활성화는 Diaporthetoxica 접종에 대한 NLL 저항성에 대한 이전 연구에서도 발견되었으며, 이는 이 유전자들이 방어 반응의 수평적 구성 요소에 관여함을 시사합니다. 이러한 결론은 SAM22 유사 유전자가 손상이나 살리실산, 진균 유도제 또는 과산화수소 치료에 양성 반응을 보였다는 보고에서도 뒷받침됩니다.
MLP 유사 유전자는 여러 식물 종에서 박테리아, 바이러스 및 병원성 진균 감염을 포함한 다양한 비생물적 및 생물학적 스트레스에 반응하는 것으로 나타났습니다55. 식물과 병원균 간의 특정 상호작용에 대한 반응 방향은 크게 증가하는 경우(예: 면화가 Verticillium dahliae에 감염될 때)부터 크게 감소하는 경우(예: 사과나무가 Alternaria spp.에 감염될 때)까지 다양했습니다56,57. 아보카도가 F. niger 감염에 대한 방어 기작을 취하는 동안과 사과나무 Botryosphaeria berengeriana(f. cn. piricola)와 Alternaria alternata가 사과 병원형인 경우 감염 과정에서 MLP 유사 423 유전자의 유의미한 하향조절이 관찰되었습니다58,59. 또한, MLP 유사 423 유전자를 과발현하는 사과 캘러스는 저항성 관련 유전자의 발현이 낮았고 진균 감염에 더 취약했습니다59. Fusarium oxysporum f에 이어, 저항성 일반 콩 유전자원에서도 MLP 유사 423 유전자가 억제되었습니다. 콩 감염 60.
RNA-seq 연구에서 확인된 PR-10 계열의 다른 구성원은 상향 조절에 반응하는 LlR18A 및 LlR18B 유전자와 지질 전달 단백질 DIR1에 대한 상향 조절된(1개 유전자) 또는 하향 조절된(3개 유전자) 유전자였습니다. . 또한 WGCNA는 이 모듈의 허브로 LlR18B 유전자를 강조하는데, 이 유전자는 백신 접종에 매우 민감하고 여러 가지 보호 반응 유전자를 가지고 있습니다. LlR18A 및 LlR18B 유전자는 병원성 박테리아에 반응하여 노란 루핀 잎에서 유도되었고, D. toxica 접종 후 NLL 줄기에서도 유도되었지만, 이러한 유전자의 벼 동족체인 RSOsPR10은 아마도 자스몬산 신호 전달 경로에 관여하는 곰팡이 감염에 의해 빠르게 유도되었습니다53,61, 62. DIR1 유전자는 전신 획득 저항(SAR)의 발병에 필요한 비특이적 지질 운반 단백질을 인코딩합니다. 방어 반응이 발달함에 따라, DIR1 단백질은 감염 지점에서 체관을 통해 이동되어 먼 기관의 SAR을 유도합니다. 흥미롭게도, TanjilG_02313 DIR1 유전자는 84A:476 계통과 22660번 집단에서 첫 번째 시점에서 유의미하게 유도되었지만, 탄저병 저항성은 84A:476 계통에서만 성공적으로 발현되었습니다. 이는 나머지 세 개의 상동 유전자가 6 hpi에서 83A:476 계통에서만 접종에 반응했고, 이 반응은 하향으로 진행되었기 때문에 NLL에서 DIR1 유전자의 일부 기능적 변화를 시사하는 것으로 보입니다.
본 연구에서 "GO:0055114 산화환원 과정"이라고 불리는 생물학적 과정에 해당하는 가장 흔한 구성 요소는 시토크롬 P450 단백질, 과산화효소, 리놀레산 9S-/13S-리폭시게나제, 그리고 1-아미노시클로프로판-1-카르복실산 산화효소였습니다. 또한, 본 WGCNA는 HSFA4a 상동체를 Lanr1 저항성 유전자 후보인 TanjilG_05042와 같은 모듈을 운반하는 허브로 정의합니다. HSFA4a는 식물에서 핵 전사의 산화환원 의존적 조절에 관여하는 구성 요소입니다.
시토크롬 P450 단백질은 이종물질 대사, 호르몬, 지방산, 스테롤, 세포벽 성분, 생체고분자, 보호 화합물 생합성을 포함한 1차 및 2차 대사에서 NADPH 및/또는 O2 의존성 수산화 반응을 촉매하는 산화환원효소입니다.69. 우리 연구에서 식물 시토크롬 P450 기능의 변동성은 많은 수의 변형된 상동체(37)와 특정 유전자 간 반응 패턴의 차이로 인해 -10.6 log2(배수 변화)에서 5.7로 감소하여 상향 조정을 반영했습니다. 이렇게 큰 단백질 슈퍼패밀리에서 NLL 유전자의 추정 생물학적 기능을 밝히기 위해 RNA-seq 데이터만 사용하는 것은 매우 추측적인 일입니다. 그러나 일부 시토크롬 P450 유전자는 알레르기 반응에 기여하는 것을 포함하여 병원성 진균이나 박테리아에 대한 저항성 증가와 관련이 있다는 점은 주목할 가치가 있습니다.69,70,71.
III급 과산화효소는 식물 생장 및 발달 과정뿐 아니라 염분, 가뭄, 강한 광도, 병원균 공격과 같은 환경 스트레스에 대한 반응으로 광범위한 대사 과정에 관여하는 다기능 식물 효소입니다.72 과산화효소는 Stylosanthes humilis와 C. gloeosporioides, Lens culinaris와 C. truncatum, Phaseolus vulgaris와 C. lindemuthianum, Cucumis sativus와 C. lagenarium을 포함한 여러 식물 종과 탄저병(Anthracis)의 상호작용에 관여합니다.73,74,75,76 곰팡이가 식물 조직에 침투하기 전에 반응 속도가 매우 빠르며, 때로는 4 HPI에서도 나타납니다.73 과산화효소 유전자는 D. toxica NLL 접종에도 반응합니다. 과산화효소는 산화적 폭발을 조절하거나 산화 스트레스를 제거하는 일반적인 기능 외에도, 특정 화합물의 리그닌화, 소단위체 형성 또는 가교 결합 과정에서 세포벽 강화를 기반으로 물리적 장벽을 형성하여 병원균의 생장을 방해할 수 있습니다. 이러한 기능은 본 연구에서 83A:476 저항성 계통에서 6 HPI에서 유의미하게 상향조절된 것으로 추정되는 리그닌 형성 음이온 과산화효소를 암호화하는 TanjilG_03329 유전자에 기인하는 것으로 추정되지만, 반응하지 않은 다른 균주 및 시점에서는 이러한 유전자 발현이 관찰되지 않았습니다.
리놀레산의 9S-/13S-리폭시게나제는 지질 생합성 산화 경로의 첫 단계입니다78. 이 경로의 생성물은 식물 방어에 있어 다양한 기능을 하는데, 칼로스 및 펙틴 침전물 형성을 통한 세포벽 강화, 활성산소 생성을 통한 산화 스트레스 조절 등이 있습니다79,80,81,82,83. 본 연구에서는 모든 균주에서 리놀레산 9S-/13S-리폭시게나제의 발현이 변화했지만, 감수성 집단인 22660에서는 발현이 다른 시점에서 증가했습니다. 반면, 내성 Lanr1과 AnMan 대립유전자를 보유한 균주에서는 이러한 유전자형 간의 방어적 탄저병 반응에서 옥실리핀 층의 다양성을 강조합니다.
1-아미노사이클로프로판-1-카르복실레이트 산화효소(ACO) 유사체는 루핀 접종 시 유의미하게 상향조절(9개 유전자) 또는 하향조절(2개 유전자)되었다. 두 가지 예외를 제외하고, 이러한 반응은 모두 6 hp에서 83A:476에서 발생했다. ACO 단백질에 의해 매개되는 효소 반응은 에틸렌 생성의 속도 제한 단계이므로 고도로 조절된다84. 에틸렌은 식물 발달과 비생물적 및 생물학적 스트레스 조건에 대한 반응을 조절하는 데 다양한 역할을 하는 식물 호르몬이다. ACO 전사 유도 및 에틸렌 신호 전달 경로 활성화는 활성 산소종과 파이토알렉신 생성을 조절함으로써 반생명영양균인 오리자에(oryzae)에 대한 벼의 저항성 증가에 관여한다. 이 연구에서 보고된 83A:476 계통의 ACO 동족체의 상당한 상향 조절을 배경으로, M. oryzae와 C. lupini88,89 사이에서 발견된 매우 유사한 잎 감염 과정은 분자 경로의 신호 전달 중심 단계인 NLL 탄저병 에틸렌에 대한 내성을 부여할 가능성을 보여줍니다.
본 연구에서는 83A:476 개체군에서 6 hpi, Mandeloop 및 22660 개체군에서 48 hpi에 광합성 관련 유전자의 대규모 억제가 관찰되었습니다. 이러한 변화의 정도와 진행은 농도에 비례합니다. 이 실험에서 탄저병 저항성이 관찰되었습니다. 최근, 병원성 세균 및 곰팡이를 포함한 여러 식물-병원균 상호작용 모델에서 광합성 관련 전사체의 강력하고 조기 억제가 보고되었습니다. 감염에 대한 반응으로 광합성 관련 유전자의 가속(일부 상호작용에서 2 hpi 이상) 및 전반적인 억제는 활성 산소종의 분포와 살리실산 경로와의 상호작용을 통해 알레르기 반응을 매개함으로써 식물 면역을 유발할 수 있습니다.
결론적으로, 가장 저항성이 높은 계통(83A:476)에 대해 제안된 방어 반응 기전은 R 유전자(아마도 TIR-NBS-LRR TanjilG_05042)에 의한 신속한 병원체 인식, 알레르기 반응 매개 살리실산 및 에틸렌 신호전달, 그리고 그에 따른 장거리 SAR 확립을 포함합니다. 이러한 작용은 DIR-1 단백질에 의해 뒷받침됩니다. C. lupini 감염의 활물영양기(biotrophic period)는 매우 짧으며(약 2일), 괴사성 생장이 뒤따른다는 점에 유의해야 합니다.95 이러한 단계들 사이의 전환은 괴사 및 기주 식물에서 과민 반응을 유발하는 에틸렌 유도 단백질의 발현과 관련이 있을 수 있습니다. 따라서 활물영양기에서 C. lupini를 성공적으로 포획하는 데 걸리는 시간은 매우 짧습니다. 83A:476에서 6 hpi 시점에 관찰된 산화환원반응 및 광합성 관련 유전자의 재프로그래밍은 곰팡이 균사의 진행과 일치하며, 활생영양 단계에서 성공적인 보호 반응의 발달을 예고합니다. Mandelup과 22660 개체군의 전사체 반응은 괴사성 생장으로 전환되기 전에 곰팡이를 포획하기에는 너무 늦을 수 있지만, PR-10 단백질의 비교적 빠른 조절이 수평 저항성을 촉진하기 때문에 Mandelup이 22660 개체군보다 더 효과적일 수 있습니다.
정식 R 유전자에 의해 구동되는 ETI는 콩의 탄저병 저항성에 대한 공통적인 메커니즘인 것으로 보입니다. 따라서 모델 콩과식물 Medicago truncatula에서 탄저병 저항성은 TIR-NBS-LRR97 식물 R 유전자 클래스의 구성원인 RCT1 유전자에 의해 부여됩니다. 이 유전자는 또한 감수성 식물로 전이될 때 알팔파에서 광범위 탄저병 저항성을 부여합니다. 일반 콩(P. vulgaris)에서 지금까지 20개 이상의 탄저병 저항성 유전자가 확인되었습니다. 이러한 유전자 중 일부는 정식 R 유전자가 없는 영역에서 발견되지만 TIR-NBS-LRRs99를 포함하여 NBS-LRR 유전자 클러스터를 운반하는 염색체의 가장자리에 위치한 다른 많은 유전자도 있습니다. 게놈 전체 SSR 연구는 또한 일반 콩에서 NBS-LRR 유전자와 탄저병 저항성의 연관성을 확인했습니다. 정식 R 유전자는 흰 루핀 101의 주요 탄저병 저항성 유전자좌를 지닌 게놈 영역에서도 발견되었습니다.
본 연구는 식물 감염 초기 단계(바람직하게는 12 hpi 이내)에 활성화되는 즉각적인 저항 반응이 좁은잎루핀을 병원성 곰팡이인 Collelotrichum lupini에 의한 탄저병으로부터 효과적으로 보호한다는 것을 보여줍니다. 고처리량 시퀀싱을 사용하여 Lanr1 및 AnMan 저항성 유전자에 의해 매개되는 NLL 식물체에서 탄저병 저항성 유전자의 차등 발현 프로파일을 입증했습니다. 성공적인 방어는 식물이 병원균과 처음 접촉한 후 몇 시간 이내에 산화환원, 광합성 및 병인 발생에 관여하는 단백질 유전자를 신중하게 설계하는 것을 포함합니다. 유사한 방어 반응이지만 시간이 지연되면 식물을 병으로부터 보호하는 효과가 훨씬 떨어집니다. Lanr1 유전자에 의해 매개되는 탄저병 저항성은 R 유전자(효과기 유발 면역)의 전형적인 신속 반응과 유사한 반면, AnMan 유전자는 수평 반응(미생물 관련 분자 패턴에 의해 유발되는 면역)을 제공하여 중간 수준의 지속 가능성을 제공할 가능성이 높습니다.
탄저병 마커를 스크리닝하는 데 사용된 215개 NLL 계통은 74개 품종, 교배 또는 육종으로 얻은 60개 계통, 돌연변이 5개, 야생 또는 원종 유전자원 76개로 구성되었습니다. 이 계통은 주로 폴란드(58), 스페인(47), 독일(27), 호주(26), 러시아(19), 벨로루시(7), 이탈리아(5) 및 기타 계통에서 17개국에서 왔습니다. 10개국에서 왔습니다. 이 세트에는 참조 저항성 계통인 83A:476, Tanjil, Lanr1 대립유전자를 갖는 Wonga 및 AnMan 대립유전자를 갖는 Mandelup도 포함됩니다. 이 계통은 폴란드 비아트로보에 있는 Poznań Plant Breeding Ltd.에서 관리하는 유럽 루핀 유전자원 데이터베이스에서 얻었습니다(보충 표 S1).
식물은 통제된 조건(광주기 16시간, 낮에는 25°C, 밤에는 18°C)에서 재배되었습니다. 두 번의 생물학적 반복 실험을 통해 분석했습니다. 프로토콜에 따라 DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 3주 된 잎에서 DNA를 분리했습니다. 분리된 DNA의 품질과 농도는 분광광도법(NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)으로 평가했습니다. 탄저병 저항성 유전자인 AnMan(Cv. Mandelup에서 유래)을 나타내는 AnManM1 마커와 유전자 Lanr1(Cv. Tanjil에서 유래)을 둘러싸고 있는 Anseq3 및 Anseq4 마커를 분석했습니다[11,26,28]. 저항성 대립유전자에 대한 동형접합자는 "1", 감수성은 "0", 이형접합자는 0.5로 평가했습니다.
AnManM1, AnSeq3, AnSeq4 마커 스크리닝 결과와 최종 추적 실험을 위한 종자 확보 여부를 바탕으로, 50개의 NLL 계통을 탄저병 저항성 표현형 분석을 위해 선발했습니다. 분석은 주간 22°C, 야간 19°C의 온도 범위에서 14시간 광주기를 갖춘 컴퓨터 제어 온실에서 2회 반복 수행했습니다. 종자 껍질이 너무 단단하여 휴면에 빠지는 것을 방지하고 균일한 발아를 보장하기 위해 파종 전에 날카로운 칼날로 배아의 반대편 종피를 긁어냈습니다. 식물은 멸균 토양(TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warsaw, Poland)이 있는 화분(11×11×21cm)에서 재배했습니다. 접종은 1999년 폴란드 대베르제니차(52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E)의 밭에서 재배한 좁은 잎 루핀 식물의 줄기에서 배양한 Colletotrichum lupini Col-08 균주로 수행했습니다. 지역을 얻으세요. 분리균은 포자 형성을 유도하기 위해 21일 동안 검은색 빛 아래에서 20°C의 SNA 배지에서 배양했습니다. 파종 후 4주, 식물이 4-6잎 단계에 도달했을 때 0.5 x 106개의 포자/ml 농도의 포자 현탁액을 분무하여 접종했습니다. 접종 후 식물을 습도 약 98%, 온도 25°C에서 24시간 동안 어둠 속에 두어 포자 발아와 감염 과정을 촉진했습니다. 식물은 22°C 주간/19°C 야간, 70% 습도에서 14시간 광주기 조건에서 재배되었습니다. 접종 후 22일째에 질병 점수를 측정했으며, 줄기와 잎의 괴사 병변 유무에 따라 0(면역)에서 9(매우 민감함)까지 점수를 매겼습니다. 또한, 점수 매기기 후 식물의 무게를 측정했습니다. 마커 유전자형과 질병 표현형 간의 관계는 2점-서열 상관관계(탄저병 저항성 표현형 분석을 위한 계통 세트에서 이형접합 마커가 없음)로 계산했습니다.