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루핀(Lupinus angustifolius L., NLL)은 식량 생산 및 토양 개량에 사용되는 콩과 식물입니다. 루핀의 전 세계적인 재배 확대로 인해 루핀 탄저병을 비롯한 여러 병원성 곰팡이가 유입되었으며, 이 곰팡이는 루핀에 치명적인 탄저병을 유발합니다. 루핀 육종에는 저항성을 부여하는 Lanr1과 AnMan 두 대립유전자가 사용되어 왔지만, 그 기저에 있는 분자 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았습니다. 본 연구에서는 Lanr1과 AnMan 마커를 이용하여 유럽 루핀 품종을 선별했습니다. 통제된 환경에서 백신을 시험한 결과, 두 저항성 공여체의 효능이 확인되었습니다. 대표적인 저항성 및 감수성 계통을 대상으로 유전자 발현 분석을 수행했습니다. 탄저병 저항성은 유전자 온톨로지 용어 "GO:0006952 방어 반응", "GO:0055114 산화환원 과정", "GO:0015979 광합성"의 과발현과 관련이 있었습니다. 또한, Lanr1(83A:476) 계통은 접종 후 빠르게 유의미한 전사체 재프로그래밍을 보인 반면, 다른 계통들은 약 42시간 정도 지연된 반응을 보였다. 방어 반응은 TIR-NBS, CC-NBS-LRR 및 NBS-LRR 유전자, 병원성 관련 단백질 10개, 지질 전달 단백질, 엔도글루칸-1,3-β-글루코시다아제, 글리신이 풍부한 세포벽 단백질, 그리고 반응성 산소 경로 관련 유전자들과 연관되어 있다. 광합성 관련 유전자의 신중한 억제를 포함한 83A:476에 대한 초기 반응은 곰팡이 생물학의 영양 생장 단계 동안 성공적인 보호와 일치했으며, 이는 특정 이펙터가 면역 반응을 유발함을 시사한다. 만델루프 반응은 전반적인 수평 이동과 마찬가지로 느려졌다.
좁은잎루핀(Lupinus angustifolius L., NLL)은 서부 지중해 지역이 원산지인 고단백 곡물입니다.^1,2 현재 가축과 인간의 식량 작물로 재배되고 있으며, 공생 질소 고정 박테리아에 의한 질소 고정 및 토양 구조 개선 효과로 인해 윤작 시스템에서 녹비 작물로도 사용됩니다. NLL은 지난 세기 동안 급속한 재배화 과정을 거쳤으며, 현재까지도 높은 수준의 육종 압력을 받고 있습니다.^{3,4,5,6,7,8,9,10,11,12} NLL의 광범위한 재배와 함께 병원성 곰팡이의 출현이 새로운 농업적 틈새를 개척하고 작물을 파괴하는 새로운 질병을 발생시켰습니다. 루핀 농부와 육종가에게 가장 주목할 만한 것은 병원성 곰팡이인 Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13에 의해 발생하는 탄저병의 출현이었습니다. 루핀 농부와 육종가에게 가장 주목할 만한 것은 병원성 곰팡이인 Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13에 의해 발생하는 탄저병의 출현이었습니다. Наиболее примечательным для фермеров 및 celekционеров луpinа было появление anttraкноза, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. 루핀 재배 농가와 육종가에게 가장 주목할 만한 것은 병원성 곰팡이 Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13에 의해 발생하는 탄저병의 출현이었습니다.Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 정말 대단해요.对于羽扇豆农민화饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的菌，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Haired。1 Наиболее поразительным для фермеров 및 selekционеров lucpina является появление anttraкноза, вызываемого патогеным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. 루핀 재배자와 육종가에게 가장 눈에 띄는 것은 병원성 곰팡이 Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13에 의해 발생하는 탄저병의 출현입니다.이 질병에 대한 최초 보고는 브라질과 미국에서 나왔으며, 전형적인 증상은 각각 1912년과 1929년에 나타났습니다. 그러나 약 30년 후, 병원균은 Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz.로 명명되었습니다. & Sacc., 유성형태 Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., 유성형태 Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld의 유성형태. & Sacc.는 독특한 형태의 Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld입니다. & Sacc.는 독특한 형태의 Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld입니다. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld의 표적 형태학. & H. 슈렌크,. & H. 슈렌크, .그리고 H. 슈렌크. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。그리고 H. Schlenk, .20세기 중반에 수행된 예비 질병 표현형 분석에서는 NLL(Non-Lupinus luteus L.)과 노란 루핀(L. luteus L.) 품종에서 어느 정도 저항성이 나타났지만, 시험된 모든 흰 루핀(L. albus L.) 품종은 매우 감수성이 높은 것으로 나타났습니다.15,16 연구에 따르면 탄저병 발생은 강수량(공기 습도) 증가와 온도(12~28°C 범위) 상승과 관련이 있으며, 고온에서는 저항성이 무너지는 것으로 나타났습니다.17, 18 실제로, 높은 습도 조건에서 포자가 발아하고 병이 시작되는 데 걸리는 시간은 12°C(16시간)보다 24°C(4시간)에서 4배 더 짧았습니다.19 따라서, 지속적인 지구 온난화는 탄저병의 확산을 초래했습니다. 그러나 이 질병은 프랑스(1982년)와 우크라이나(1983년)에서 임박한 위협의 전조로 관찰되었지만, 당시 루핀 산업계에서는 이를 무시했던 것으로 보입니다.20,21 몇 년 후, 이 파괴적인 질병은 전 세계로 확산되어 호주, 폴란드, 독일과 같은 주요 루핀 생산국에도 영향을 미쳤습니다.22,23,24 1990년대 중반 탄저병 발생 이후, 광범위한 스크리닝을 통해 NLL19 샘플에서 여러 저항성 공여체가 확인되었습니다. NLL의 탄저병 저항성은 서로 다른 유전자원으로부터 발견되는 두 개의 별개의 우성 대립유전자, 즉 Tanjil 및 Wonga 품종의 Lanr1과 Mandalay 품종의 AnMan에 의해 조절됩니다.25, 26 이러한 대립유전자는 육종 프로그램에서 저항성 유전자원 선발을 뒷받침하는 분자 마커를 보완합니다.25,26,27,28,29,30 Lanr1 대립유전자를 보유한 저항성 육종계통 83A:476을 감수성 야생계통 P27255와 교배하여 탄저병 저항성에 대해 분리되는 RIL 집단을 얻었고, 이를 통해 Lanr1 유전자좌를 NLL-11 염색체에 할당할 수 있었다.31, 32, 33 탄저병에 대한 저항성 유전자좌 주변의 연관지도 마커를 게놈 프레임워크인 NLL에 정렬한 결과, 세 가지 대립유전자 모두 동일한 염색체(NLL-11)에 위치하지만 서로 다른 위치에 있음을 알 수 있었다.29,34,35 그러나 RIL의 수가 적고 마커와 해당 대립유전자 사이의 유전적 거리가 크기 때문에 기저 유전자에 대한 신뢰할 만한 결론을 도출하기는 어렵다. 한편, 루핀은 재생 능력이 매우 낮아 유전자 조작이 어렵기 때문에 역유전학을 적용하기 어렵다.37
83A:476(Lanr1) 및 Mandelup(AnMan)과 같이 원하는 대립유전자를 동형접합 상태로 보유하는 재배 유전자원의 개발은 야생 개체군에서 상반된 대립유전자 조합이 존재하는 상황에서도 탄저병 저항성을 연구할 수 있는 길을 열었습니다. 분자 메커니즘의 가능성을 탐구하고, 특정 유전자형에 의해 생성되는 방어 반응을 비교하는 것이 가능해졌습니다. 본 연구는 NLL의 C. lupini 백신 접종에 대한 초기 전사체 반응을 평가했습니다. 먼저, Lanr1 및 AnMan 대립유전자를 표시하는 분자 마커를 사용하여 215개 계통으로 구성된 유럽 NLL 유전자원 패널을 스크리닝했습니다. 그런 다음, 분자 마커를 기준으로 선별된 50개 NLL 계통에 대해 통제된 조건에서 탄저병 표현형 분석을 수행했습니다. 이러한 실험을 바탕으로, 탄저병 저항성과 Lanr1/AnMan 대립유전자 구성이 서로 다른 네 가지 계통을 선별하여, 두 가지 상호보완적인 접근 방식(고처리량 RNA 시퀀싱 및 실시간 PCR 정량화)을 사용하여 차별적인 방어 유전자 발현 프로파일링을 수행하였다.
Lanr1(Anseq3 및 Anseq4), AnMan(Anseq4) 및 AnMan(AnManM1) 마커를 사용하여 NLL 유전자원 세트(N = 215)를 스크리닝한 결과, 단 하나의 계통(95726, Salamanca-b 근처)에서만 모든 마커에 대해 "저항성" 대립유전자가 증폭되었으며, "감수성" 대립유전자의 존재"는 158개 계통(약 73.5%)에서 확인되었습니다. 13개 계통은 Lanr1 마커에 대해 두 개의 "저항성" 대립유전자를 생성했고, 8개 계통은 Lanr1 마커에 대해 하나의 "저항성" 대립유전자를 생성했습니다. AnMan 마커의 "저항성" 대립유전자는 (보충표 S1 참조)에서 확인되었습니다. 두 계통은 Anseq3 마커에 대해 이형접합체였고, 한 계통은 AnManM1 마커에 대해 이형접합체였습니다. 42개 계통(19.5%)에서 Anseq3 및 Anseq4 대립유전자의 상반된 위상이 관찰되었는데, 이는 이 두 유전자좌 간의 재조합 빈도가 높다는 것을 나타냅니다. 통제된 조건에서의 탄저병 표현형(보충표 S2)은 시험된 유전자형의 저항성에서 다양성을 보여주었으며, 이는 탄저병의 심각도에 반영되었습니다. 평균 점수의 차이는 1.8(중등도 저항성)에서 6.9(감수성)까지, 식물 무게의 차이는 0.62g(감수성)에서 4.45g(저항성)까지 다양했습니다. 실험의 두 반복에서 관찰된 값들 사이에는 유의미한 상관관계가 있었으며(질병 심각도 점수의 경우 0.51, P = 0.00017, 식물 무게의 경우 0.61, P < 0.0001), 이 두 매개변수 사이에도 유의미한 상관관계가 있었다(− 0.59 및 − 0.77, P < 0.0001). 실험의 두 반복에서 관찰된 값들 사이에는 유의미한 상관관계가 있었으며(질병 심각도 점수의 경우 0.51, P = 0.00017, 식물 무게의 경우 0.61, P < 0.0001), 이 두 매개변수 사이에도 유의미한 상관관계가 있었다(-0.59와 -0.77, P < 0.0001). Выявлена ​​​достоверная корреляция между значениями, наблудаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, Р <0,0001) 0,0001). 실험의 두 반복에서 관찰된 값들 사이(질병 심각도 점수의 경우 0.51, P = 0.00017, 식물 무게의 경우 0.61, P < 0.0001)와 이 두 매개변수 사이(-0.59와 -0.77, P < 0.0001)에서 유의미한 상관관계가 발견되었다.两次重复实验中观察到的值之间存在显着상关性 (疾病严复实验中观察到的值之间存) 疾病严复实島评分为0.51，P = 0.00017，植观察到为0.61，P < 0.0001) 以及这两个参数之间(- 0.59 와- 0.77, P < 0.0001).两 次 观复 实验 中 观察 的 值 之间 存에서 相关性 （疾病 严重 程島 评 分为 分为 分为 0.51, p = 0.00017, 植物为 为 0.61 , p <0.0001) 以及 两 个 参数 之间 （(((- 0.59 와 – 0.59 와 – 0.59 와 – 0.59 와- 0.77, P < 0.0001). Наблудалась значительная корреляция между значениями, наблудаемыми в двух повторностях (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001. 두 번 측정한 값들 사이(질병 심각도 점수 0.51, P = 0.00017 및 식물 무게 0.61, P < 0.0001)와 이 두 매개변수 사이(-0.59 및 -0.0001) 0.77, P<0.0001 사이에 유의미한 상관관계가 있었다. ).병에 취약한 식물에서 나타나는 전형적인 증상으로는 줄기가 "양치기의 활"처럼 굽고 뒤틀리는 현상이 있으며, 이어서 주황색/분홍색 포자충이 있는 타원형 병변이 발생합니다(보충 그림 1). Lanr1(83A:476 및 Tanjil) 및 AnMan(Mandelup) 유전자를 보유한 호주 계통은 중간 정도의 저항성을 보입니다(pH 0.0331 및 0.0036). "저항성" Lanr1 및/또는 AnMan 대립유전자를 보유한 일부 계통에서도 병의 증상이 나타납니다.
흥미롭게도, "저항성" 마커 대립유전자가 없는 몇몇 NLL 계통에서 높은 수준의 탄저병 저항성(Lanr1 또는 AnMan 유전자형과 유사하거나 그 이상)이 나타났습니다. 예를 들어 Boregine(두 매개변수 모두 P값 < 0.0001), Bojar(점수 P값 < 0.0001, 식물 무게 P값 0.001), 그리고 Population B-549/79b(점수 P값 < 0.0001, 무게는 유의미하지 않음) 등이 있습니다. 흥미롭게도, "저항성" 마커 대립유전자가 없는 몇몇 NLL 계통에서 높은 수준의 탄저병 저항성(Lanr1 또는 AnMan 유전자형과 유사하거나 그 이상)이 나타났습니다. 예를 들어 Boregine(두 매개변수 모두 P값 < 0.0001), Bojar(점수 P값 < 0.0001, 식물 무게 P값 0.001), 그리고 Population B-549/79b(점수 P값 < 0.0001, 무게는 유의미하지 않음) 등이 있습니다. Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки 및 0,001 для массы растения) 및 популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для 마시). 흥미롭게도, '저항성' 마커 대립유전자가 없는 몇몇 NLL 계통은 탄저병에 대해 높은 수준의 저항성을 보였습니다(Lanr1 또는 AnMan 유전자형과 비슷하거나 더 높음). 예를 들어 Boregine(두 매개변수 모두 P값 < 0.0001), Bojar(평가 P값 < 0.0001, 식물 무게 P값 0.001), 그리고 B-549/79b 집단(평가 P값 < 0.0001, 무게는 유의미하지 않음)이 그러합니다.有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示抗性 (与Lanr1 或AnMan)基因型相当或更高)，例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P值<得分为0.0001，植물중량为0.001) and种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，weight不显着). 흥미로운 점은 "항원" 마커가 없는 일부 NLL 시스템이 Boregine(두 매개변수 모두 P < 0.0001), Bojar(P 값 < 0.0001, 식물 무게 0.001) 및 B-549/79b 균주(P 값 < 0.0001, 무게는 유의미하지 않음)와 같이 높은 수평 저항성(Lanr1 또는 AnMan 유전자 이상에 해당)을 나타낸다는 것이다. Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистеntности», показали высокие уровни устойчивости к antракнозу (сравнимые или выше, чем у genотипов Lanr1 및 AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих paraметров) <0,0001), Bojar(значение P <0,0001, масса растения 0,001) 및 популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). 흥미롭게도, '저항성' 마커 대립유전자가 전혀 없는 일부 NLL 계통은 탄저병에 대한 높은 수준의 저항성을 보였습니다(Lanr1 또는 AnMan 유전자형과 비슷하거나 더 높음). 예를 들어 Boregine(두 매개변수 모두 P값 <0.0001), Bojar(P값 < 0.0001, 식물 무게 0.001) 및 B-549/79b 집단(P값 < 0.0001, 무게는 유의미하지 않음)이 그러합니다.이 현상은 새로운 유전적 저항성 원천의 가능성을 시사하며, 마커 유전자형과 질병 표현형 간의 상관관계가 부족한 현상(P값 ~0.42~0.98)을 설명합니다. 따라서 콜모고로프-스미르노프 검정 결과, 탄저병 저항성 데이터는 점수(P값 0.25 및 0.11)와 식물체 질량(P값 0.47 및 0.55) 모두에서 대략 정규분포를 따르는 것으로 나타났으며, 이는 Lanr1과 AnMan 외에도 더 많은 대립유전자가 관여하고 있음을 시사합니다.
탄저병 저항성 선별 결과에 따라 83A:476, Boregine, Mandelup, Population 22660의 4개 계통을 전사체 분석 대상으로 선정하였다. 이들 계통은 이전 검사와 동일한 것으로 확인되면 접종 실험을 통해 RNA 시퀀싱을 이용하여 탄저병 저항성을 재검사하였다. 그 결과는 다음과 같다: Boregin (1.71 ± 1.39), 83A:476 (2.09 ± 1.38), Mandelup (3.82 ± 1.42), Population 22660 (6.11 ± 1.29).
Illumina NovaSeq 6000 프로토콜은 샘플당 평균 40.5 Mread 쌍(29.7~54.4 Mread)을 얻었습니다(보충표 S3). 참조 서열의 정렬 점수는 75.5%~88.6% 범위였습니다. 생물학적 반복 실험 간의 실험 변이체에 대한 읽기 횟수 데이터의 평균 상관관계는 0.812~0.997(평균 0.959) 범위였습니다. 분석된 35,170개 유전자 중 2,917개는 발현되지 않았고, 나머지 4,785개는 무시할 수 있을 정도로 낮은 수준(기준 평균 < 5)으로 발현되었다. 분석된 35,170개 유전자 중 2,917개는 발현되지 않았고, 나머지 4,785개는 무시할 수 있을 정도로 낮은 수준(기준 평균 < 5)으로 발현되었다. 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5). 분석된 35,170개 유전자 중 2,917개는 발현되지 않았고, 나머지 4,785개 유전자는 무시할 수 있을 정도로 낮은 수준(기준 평균 <5)으로 발현되었다.35,170 个基因中,2917 个没有表达,其他4785 个基因的表达可以忽略计（基本平均值< 5).35,170 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительнуuv экспрессив(базовое среднее значение <5). 분석된 35,170개 유전자 중 2,917개는 발현되지 않았고, 나머지 4,785개 유전자는 발현량이 미미했다(기준 평균 <5).따라서 실험 기간 동안 발현된 것으로 간주된 유전자 수(평균 ≥ 5)는 27,468개(78.1%)였습니다(보충표 S4).
첫 번째 시점부터 모든 NLL 계통은 C. lupini(Col-08 균주) 접종에 반응하여 전사체 재프로그래밍을 나타냈지만(표 1), 계통 간에 유의미한 차이가 관찰되었습니다. 저항성 계통 83A:476(Lanr1 유전자 보유)은 첫 번째 시점(접종 후 6시간)에서 다른 시점과 비교하여 분리된 상향 및 하향 유전자 수가 31~69배 증가하는 등 현저한 전사체 재프로그래밍을 보였습니다. 또한, 이러한 피크는 단기간에 그쳤으며, 두 번째 시점(접종 후 12시간)에는 소수의 유전자만 유의미하게 변화된 상태로 남아 있었습니다. 흥미롭게도, 접목 시험에서 높은 저항성을 보인 Boregine 계통은 실험 기간 동안 이처럼 대규모의 전사체 재프로그래밍을 겪지 않았습니다. 그러나 접종 후 12시간 시점에서 Boregine과 83A:476의 차등 발현 유전자(DEG) 수는 동일했습니다. Mandelup과 22660 개체군 모두 마지막 시점(48 l/s)에서 DEG 피크를 보였는데, 이는 방어 반응에 상대적인 지연이 있음을 나타냅니다.
83A:476 계통은 다른 모든 계통에 비해 6 HPI 시점에서 C. lupini에 대한 반응으로 대규모 전사체 재프로그래밍을 겪었기 때문에, 이 시점에서 관찰된 차등 발현 유전자(DEG)의 약 91%가 계통 특이적이었다(그림 1). 그러나 연구 대상 계통 간의 초기 반응에는 일부 중복이 있었는데, Boregine, Mandelup 및 22660 집단에서 각각 68.5%, 50.9%, 52.6%의 DEG가 특정 시점에서 83A:476에서 발견된 DEG와 겹쳤다. 하지만 이러한 DEG는 83A:476을 사용하여 현재까지 검출된 모든 DEG의 극히 일부(0.97~1.70%)만을 차지했다. 또한, 모든 계통에서 공통적으로 나타난 11개의 차등 발현 유전자(DEG)는 이 시점에서 일관성을 보였습니다(보충표 S4-S6). 여기에는 식물 방어 반응의 공통 구성 요소인 지질 전달 단백질(TanjilG_32225), 엔도글루칸-1,3-β-글루코사이드 효소(TanjilG_23384), SAM22와 같은 두 가지 스트레스 유도 단백질(TanjilG_31528 및 TanjilG_31531), 기본 라텍스 단백질(TanjilG_32352), 그리고 두 가지 글리신이 풍부한 구조 세포벽 단백질(TanjilG_19701 및 TanjilG_19702)이 포함됩니다. 또한 83A:476과 Boregine 사이에서는 24 HPI 시점에 전사체 반응에서 비교적 높은 중복(총 16-38% 차등 발현 유전자)이, Mandelup과 Population 22660 사이에서는 48 HPI 시점에 전사체 반응에서 비교적 높은 중복(총 14-20% 차등 발현 유전자)이 관찰되었다.
Colletotrichum lupini(1999년 폴란드 비에르제니체 루핀 재배지에서 얻은 Col-08 균주)를 접종한 좁은잎루핀(NLL) 계통에서 차등 발현 유전자(DEG)의 수를 나타내는 벤 다이어그램. 분석에 사용된 NLL 계통은 83A:476(저항성, Lanr1 대립유전자 보유), Boregine(저항성, 유전적 배경 불명), Mandelup(중등도 저항성, AnMan 대립유전자 보유) 및 22660 집단(매우 감수성)이다. hpi는 백신 접종 후 경과 시간을 나타낸다. 그래프를 단순화하기 위해 0 값은 제거하였다.
6시간 후 과발현된 유전자 세트를 분석하여 정규 R 유전자 도메인의 존재 여부를 확인했습니다(보충표 S7). 이 연구는 83A:476 위치에서만 NBS-LRR 도메인을 가진 고전적인 질병 저항성 유전자의 전사체 유도를 밝혀냈습니다. 이 세트는 TIR-NBS-LRR 유전자(tanjilg_05042) 1개, CC-NBS-LRR 유전자(tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 및 tanjilg_16162) 5개, NBS-LR 유전자(tanjilg_16162) 4개, NBS-LRRE 유전자(tanjilg_16162) 4개, NBS-Lrr 유전자(tanjilg_16162) 4개, NBS-LRR 유전자(TANJILG_16162) 4개로 구성되었습니다. 이 모든 유전자는 보존된 서열에 배열된 정규 도메인을 가지고 있습니다. NBS-LRR 도메인 유전자 외에도 여러 RLL 키나제가 6시간 후 활성화되었는데, 구체적으로는 Boregine(TanjilG_19877)에서 1개, Mandelup(TanjilG_07141 및 TanjilG_19877) 및 22660 집단(TanjilG_09014 및 TanjilG_10361)에서 2개, 그리고 83A 27:476에서 2개가 활성화되었습니다.
C. lupini(균주 Col-08) 접종에 반응하여 발현이 유의미하게 변화된 유전자들을 대상으로 유전자 온톨로지(GO) 농축 분석을 수행하였다(보충표 S8). 가장 빈번하게 과대표된 생물학적 과정 용어는 "GO:0006952 방어 반응"이었으며, 이는 16개의 (시간 × 라인) 조합 중 6개에서 높은 유의성(P 값 < 0.001)을 나타내며 나타났다(그림 2). 가장 빈번하게 과대표된 생물학적 과정 용어는 "GO:0006952 방어 반응"이었으며, 이는 16개의 (시간 × 라인) 조합 중 6개에서 높은 유의성(P 값 < 0.001)을 나타내며 나타났다(그림 2). Наиболее часто чрезмерно представленным terminом биологического процесса был «GO: 0006952 зачитный ответ», который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостьù (значение P <0,001) (рис. 2). 가장 빈번하게 과대표된 생물학적 과정 용어는 'GO:0006952 방어 반응'이었으며, 이는 16개의 (시간 × 계통) 조합 중 6개에서 높은 유의성(P 값 < 0.001)을 보였습니다(그림 2).最常被过年代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它丸被过应，它流现는 16 个（时间×线)组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0.001)(图2). 가장 대표적인 생물학적 과정 용어는 "GO:0006952 방어 반응"이며, 이는 16개의 (시간×선) 조합 중 6개에서 나타나며 높은 유의성을 보인다(P 값 < 0.001)(그림 2). Наиболее часто чрезмерно представленным terminом биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», который появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостья (значение P <0,001) (рис. 2). 가장 빈번하게 과대표된 생물학적 과정 용어는 'GO:0006952 방어 반응'이었으며, 이는 16개 조합(시간 × 라인) 중 6개에서 높은 유의성(P 값 < 0.001)으로 나타났습니다(그림 2).이 용어는 83A:476과 Boregine에서 두 시점(감염 후 6시간 및 24시간)에서, 그리고 Mandelup과 Population 22660에서는 한 시점(감염 후 12시간 및 6시간)에서 과다하게 나타났습니다. 이는 저항성 계통의 항진균 반응을 강조하는 예상된 결과입니다. 또한, 83A:476은 "GO:0055114 산화환원 과정"으로 표현되는 산화적 폭발과 관련된 유전자들을 빠르게 유도함으로써 C. lupini에 반응하여 특이적인 방어 반응을 보였고, Boregine은 'GO'라는 용어와 관련된 특이적인 방어 반응을 나타냈습니다. :0006950 스트레스 반응”. 22660 개체군은 이차 대사산물을 포함하는 수평적 저항 반응을 활성화시켰으며, “GO:0016104 트리테르펜 생합성 과정”과 “GO:0006722 트리테르펜 대사 과정”(두 용어 모두 동일한 유전자 집합에 속함)이라는 용어가 과도하게 많이 나타났습니다. GO 용어 풍부도 분석 결과를 고려할 때, Mandelup 반응의 안정성은 Boregine과 22660 개체군 사이에 있었습니다. 또한, 초기 반응 83A:476(6 hpi)과 지연 반응 Mandelup 및 22660 개체군에는 GO:0015979 '광합성' 및 기타 관련 생물학적 과정이라는 용어가 포함되어 있습니다.
좁은잎루핀(NLL)에 탄저병 루핀(1999년 폴란드 비에르제니체 루핀 재배지에서 얻은 Col-08 균주)을 접종했을 때 나타나는 전사체 반응 동안 차등 발현 유전자 주석에 사용된 생물공정 유전자 온톨로지 용어는 지나치게 과장되었습니다. 분석에 사용된 NLL 계통은 83A:476(저항성, Lanr1 동형접합 대립유전자 보유), Boregine(저항성, 유전적 배경 불명), Mandelup(중등도 저항성, AnMan 동형접합 대립유전자 보유) 및 22660 집단(감수성)입니다.
본 연구는 탄저병 저항성에 기여하는 유전자를 규명하는 것을 목표로 하였으므로, GO 분류상 "GO: 0006952 방어 반응"과 "GO: 0055114 산화환원 과정"에 해당하는 유전자들을 대상으로, 기준선 평균값이 30 이상이고, 최소 한 개의 행 × 시점의 log2(배율 변화) 값이 통계적으로 유의미한 경우를 기준으로 분석하였다. 이러한 기준을 충족하는 유전자의 수는 GO:0006952의 경우 65개, GO:0055114의 경우 524개였다.
83A:476은 GO:0006952라는 용어로 주석이 달린 두 개의 DEG 피크를 나타냈는데, 첫 번째는 인치당 6개 유전자(64개 유전자, 상향 및 하향 조절)에서, 두 번째는 인치당 24개 유전자(15개 유전자, 상향 조절만)에서 나타났습니다. Boregine 또한 GO:0006952가 동일한 시점에서 피크를 나타냈지만, DEG 수는 더 적었고(11개와 8개) 활성화가 우선적으로 나타났습니다. Mandeloop은 GO:0006952의 두 피크를 12 HPI와 48 HPI에서 나타냈는데, 두 피크 모두 12개의 유전자를 포함하고 있었습니다(첫 번째 피크는 활성화 유전자, 두 번째 피크는 억제 유전자만 포함). 반면 22660 집단은 6 HPI(13개 유전자)에서 증가 피크가 더 두드러지게 나타났습니다. 주목할 점은 이 피크에서 GO:0006952 DEG의 96.4%가 동일한 반응 유형(증가 또는 감소)을 보였다는 것입니다. 이는 관련된 유전자 수의 차이에도 불구하고 방어 반응에 상당한 중복이 있음을 나타냅니다. GO:0006952와 관련된 가장 큰 서열 그룹은 기아 스트레스 관련 메시지 단백질 22(SAM22 유사 단백질)를 암호화하며, 이는 클래스 10 병원성 관련 단백질(PR-10) 클레이드와 코어 단백질 라텍스 유사 단백질(MLP 유사 단백질)에 속합니다(그림 3). 두 그룹은 발현 양상과 반응 방향에서 차이를 보였습니다. SAM22 유사 단백질을 암호화하는 유전자들은 초기 시점(6시간 또는 12시간 후)에서 일관되고 유의미한 유도를 보였고, 실험 종료 시점(48시간 후)에는 일반적으로 반응이 없었던 반면, MLP 유사 단백질은 6시간 후부터 반응을 보였습니다. 83A:476과 Mandelup 품종에서 48 hp/in의 발현량을 보였지만, 거의 모든 다른 데이터 포인트는 반응이 없었습니다. 또한, SAM22 유사 단백질 유전자의 발현 양상은 탄저병 저항성의 변이와 유사한 양상을 보였는데, 저항성이 높은 계통일수록 감수성이 높은 계통보다 이러한 유전자의 발현을 유의미하게 유도하는 시점이 더 많았습니다. 또 다른 LlR18A/B 유사 PR-10 유전자도 SAM22 유사 단백질 유전자와 매우 유사한 발현 패턴을 보였습니다.
생물학적 과정 용어 "GO:0006952 방어 반응"의 주요 구성 요소와 Lanr1 및 AnMan 대립유전자 후보 유전자의 발현 패턴을 확인했습니다. Log2 척도는 동일 시점에서 접종 식물(Colletotrichum lupini, Col-08 균주, 1999년 폴란드 비제니차 루핀 재배지에서 채집)과 대조군(가짜 접종) 식물 간의 log2 값(배율 변화)을 나타냅니다. 분석에 사용된 좁은잎 루핀 계통은 다음과 같습니다: 83A:476(저항성, Lanr1 동형접합 대립유전자 보유), Boregine(저항성, 유전적 배경 불명), Mandelup(중등도 저항성, AnMan 동형접합 대립유전자 보유), 그리고 Population 22660(감수성).
또한, RNA-seq 후보 유전자 Lanr1(TanjilG_05042)과 AnMan(TanjilG_12861)의 발현 프로파일을 평가하였다(그림 3). TanjilG_05042 유전자는 첫 번째 시점(6 hpi)에서만 83A:476에서 유의미한 반응(활성화)을 보였고, TanjilG_12861은 Mandeloop 조건에서 두 시점(6 hpi(하향 조절) 및 24 hpi(6 hpi))에서만 유의미한 반응을 보였다.
GO:0055114 "산화환원 과정" 항목에서 가장 과발현된 유전자는 시토크롬 P450 단백질과 퍼옥시다아제를 코딩하는 유전자였다(그림 4). 접종 후 6시간(6 HPI)에 83A:476에서 분리한 샘플의 경우, 접종 식물과 대조 식물 간에 최대 또는 최소 log2(배율 변화) 값(유전자의 86.6%)이 일반적으로 관찰되었으며, 이는 이 유전자형이 접종 성별에 대해 높은 반응을 보임을 강조한다. 83A:476은 접종 후 6시간에 가장 유의미한 GO:0055114 차등 발현 유전자(503개)를 나타냈으며, 나머지 계통은 접종 후 48시간에 각각 Boregine(31개 유전자), Mandelup(85개 유전자), Population 22660(78개 유전자) 순으로 나타났다. GO:0055114 계열의 대부분 유전자에서 백신 접종에 대한 두 가지 유형의 반응(활성화 및 억제)이 관찰되었다. 흥미롭게도, GO: 0055114 용어에 대해 식별된 차등 발현 유전자(DEG)의 최대 97.6%가 48시간 후 만델루프에서 관찰되었습니다. 이러한 관찰 결과는 규모가 상당히 작음에도 불구하고(즉, 돌연변이된 산화환원 유전자의 수가 85개 대 503개임에도 불구하고), 만델루프의 탄저병에 대한 지연된 전사체 반응 패턴이 83A:476의 초기 반응과 유사함을 시사합니다. 보레진과 22660 개체군에서는 이러한 수렴도가 각각 51.6%와 75.6%로 더 낮습니다.
생물학적 과정 용어 "GO:0055114 산화환원 과정"의 주요 구성 요소의 발현 패턴이 밝혀졌습니다. Log2 스케일은 동일 시점에서 접종된 식물(Colletotrichum lupini, Col-08 균주, 1999년 폴란드 비제니차 루핀 재배지에서 분리)과 대조군(가짜 접종) 식물 간의 log2 값(배율 변화)을 나타냅니다. 분석에 사용된 좁은잎 루핀 계통은 다음과 같습니다: 83A:476(저항성, Lanr1 동형접합 대립유전자 보유), Boregine(저항성, 유전적 배경 불명), Mandelup(중등도 저항성, AnMan 동형접합 대립유전자 보유), 그리고 Population 22660(감수성).
83A:476 C. lupini(균주 Col-08) 접종에 대한 전사체 반응에는 GO:0015979 "광합성" 및 기타 관련 생물학적 과정과 관련된 유전자들의 동시적인 발현 억제가 포함되었습니다(그림 5). 이 GO:0015979 차등 발현 유전자(DEG) 세트는 83A:476에서 접종 후 6시간(6 hpi)에 유의미하게 억제된 105개의 유전자를 포함했습니다. 이 하위 집합에서 37개의 유전자는 접종 후 48시간(48 hpi)에 Mandelup에서도 하향 조절되었고, 35개의 유전자는 22660 집단에서도 같은 시점에 하향 조절되었으며, 이 중 19개는 두 유전자형 모두에서 공통적으로 나타나는 DEG였습니다. GO:0015979와 관련된 DEG 중 어떤 조합(계통 x 시간)에서도 유의미하게 활성화된 유전자는 없었습니다.
생물학적 과정 "GO:0015979 광합성"의 주요 구성 요소 발현 패턴이 밝혀졌습니다. Log2 척도는 동일 시점에서 접종 식물(Colletotrichum lupini, Col-08 균주, 1999년 폴란드 비제니차 루핀 재배지에서 채집)과 대조군(가짜 접종) 식물 간의 log2 값(배율 변화)을 나타냅니다. 분석에 사용된 좁은잎 루핀 품종은 다음과 같습니다: 83A:476(저항성, Lanr1 동형접합 대립유전자 보유), Boregine(저항성, 유전적 배경 불명), Mandelup(중등도 저항성, AnMan 동형접합 대립유전자 보유), 그리고 Population 22660(감수성).
차등 발현 분석 결과와 병원성 곰팡이에 대한 방어 반응에 관여하는 것으로 추정되는 이 7개 유전자 세트를 실시간 PCR을 이용한 발현 프로파일 정량화 대상으로 선정하였다(보충표 S9).
추정 단백질 유전자 TanjilG_10657은 대조군(모방) 식물과 비교했을 때 연구된 모든 계통과 시점에서 유의미하게 유도되었습니다(보충표 S10, S11). 또한, TanjilG_10657의 발현 양상은 모든 계통에서 실험 기간 동안 증가하는 경향을 보였습니다. 22660 집단은 TanjilG_10657 접종에 대해 가장 높은 민감도를 보였으며, 접종 후 24시간(24 HPI)에 114배의 활성화와 가장 높은 상대적 발현 수준(4.4 ± 0.4)을 나타냈습니다(그림 6a). PR10 LlR18A 단백질 유전자 TanjilG_27015 또한 모든 계통과 시점에서 활성화되었으며, 대부분의 데이터 포인트에서 통계적으로 유의미한 결과를 보였습니다(그림 6b). TanjilG_10657과 유사하게, TanjilG_27015의 상대적 발현 수준은 접종 후 24시간(24 HPI)에 22660 집단에서 가장 높게 관찰되었다(19.5 ± 2.4). 산성 엔도키티나제 유전자 TanjilG_04706은 Boregine의 접종 후 6시간(6 HPI)을 제외한 모든 계통과 모든 시점에서 유의하게 상향 조절되었다(그림 6c). 83A:476에서는 첫 번째 시점(접종 후 6시간)에 강하게 유도되었고(10.5배), 다른 계통에서는 중간 정도로 증가했다(6.6~7.5배). 실험 기간 동안 TanjilG_04706의 발현은 83A:476과 Boregine에서는 비슷한 수준을 유지했지만, Mandelup과 22660 집단에서는 유의하게 증가하여 상대적으로 높은 값에 도달했다(각각 5.9 ± 1.5 및 6.2 ± 1.5). 엔도글루칸-1,3-β-글루코시다제 유사 유전자 TanjilG_23384는 22660 집단을 제외한 모든 계통에서 처음 두 시점(6시간 및 12시간 후)에 높은 활성화를 보였다(그림 6d). TanjilG_23384의 상대적 발현 수준이 가장 높은 시점은 두 번째 시점(12시간 후)으로, Mandelup(2.7 ± 0.3)과 83A:476(1.5 ± 0.1)에서 관찰되었다. 24시간 후에는 모든 계통에서 TanjilG_23384의 발현 수준이 상대적으로 낮았다(0.04 ± 0.009 ~ 0.44 ± 0.12).
정량적 PCR을 통해 밝혀진 선택된 유전자(ag)의 발현 프로파일. 숫자 6, 12, 24는 백신 접종 후 경과 시간을 나타냅니다. LanDExH7 및 LanTUB6 유전자는 정규화에 사용되었으며, LanTUB6는 시리즈 간 보정에 사용되었습니다. 오차 막대는 3개의 생물학적 반복 실험을 기반으로 한 표준 편차를 나타내며, 각 생물학적 반복 실험은 3개의 기술적 반복 실험의 평균값입니다. 접종된 식물(Colletotrichum lupini, Col-08 균주, 1999년 폴란드 비에르제니차의 루핀밭에서 채집)과 대조군(모의 접종) 식물 간의 발현 수준 차이에 대한 통계적 유의성은 위 데이터 포인트에 표시되어 있습니다(*P 값 < 0.05, **P 값 ≤ 0.01, ***P 값 ≤ 0.001). 접종된 식물(Colletotrichum lupini, Col-08 균주, 1999년 폴란드 비에르제니차의 루핀밭에서 채집)과 대조군(모의 접종) 식물 간의 발현 수준 차이에 대한 통계적 유의성은 위 데이터 포인트에 표시되어 있습니다(*P 값 < 0.05, **P 값 ≤ 0.01, ***P 값 ≤ 0.001). 통계는 различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен в 1999) г. с поля лупина в Верженице, Польша) 및 Контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). 접종된 식물(Colletotrichum lupini, Col-08 균주, 1999년 폴란드 비에르제니체 루핀밭에서 채집)과 대조군(가짜 접종) 식물 간의 발현 수준에서 통계적으로 유의미한 차이는 데이터 포인트 위에 표시되어 있습니다(*P값 < 0.05, **P값 ≤ 0.01, ***P값 ≤ 0.001).接种(Colletotrichum) lupini, Col-08株,1999年从波兰Wierzenica의 羽扇豆ton获得) 및 对 사진(模拟接种) 0.05, **P 值≤ 0.01, ***P 值≤ 0.001)。接种 （colletotrichum lupini , color-08 株 , 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得) 및 对光 （接种 植物 之间 水平 差异 的 统计학显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001). Statистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей лупина в Верженице, Польша, в 1999 г.) 및 контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). 접종된 식물(1999년 폴란드 베르제니체 루핀밭에서 채취한 Colletotrichum lupini, 균주 Col-08)과 대조군(가짜 접종) 식물 간의 발현 수준에서 통계적으로 유의미한 차이는 데이터 포인트 위에 표시되어 있습니다(*P 값 < 0.05, **P 값 ≤ 0.01, ***P 값 ≤ 0.001).분석에 사용된 NLL 계통은 83A:476(저항성, Lanr1 동형접합 대립유전자 보유), Mandelup(중등도 저항성, AnMan 동형접합 대립유전자 보유), Boregine(저항성, 유전적 배경 불명) 및 22660 집단(감수성)입니다.
Lanr1 유전자좌에 위치한 후보 유전자 TanjilG_05042는 RNA-seq 연구에서 얻은 프로파일과 현저히 다른 발현 패턴을 보였다(그림 6e). 이 유전자는 Mandelup 및 22660 집단에서 유의미하게 활성화되었으며(각각 최대 39.7배 및 11.7배), 그 결과 상대적으로 높은 발현 수준(각각 최대 1.4 ± 0.14 및 7.2 ± 1.3)을 나타냈다. 83A:476에서도 TanjilG_05042 유전자의 상향 조절(최대 3.8배)이 관찰되었지만, 상대적 발현 수준(0.044 ± 0.002)은 Mandelup 및 22660 집단에서 관찰된 수준보다 30배 이상 낮았다. qPCR 분석 결과, 모의 백신 접종(대조군) 변이체에서 유전자형 간 발현 수준에 유의미한 차이가 나타났으며, 22660과 83A:476 집단 간, 그리고 22660과 22660 집단 간에는 최대 58배의 차이가 관찰되었습니다. 보레진과 만달럽 집단 간에는 2배의 차이가 나타났습니다.
AnMan 유전자좌의 후보 유전자 TanjilG_12861은 83A:476과 Mandelup에서 백신 접종에 반응하여 활성화되었고, 22660 집단에서는 중립적이었으며, Boregine에서는 발현이 감소되었습니다(그림 6f). TanjilG_12861 유전자의 상대적 발현량은 접종된 83A:476에서 가장 높았습니다(0.14±0.01). 17.4 kDa 클래스 I 열충격 단백질 유전자 TanjilG_05080 HSP17.4는 모든 연구 대상 균주와 시점에서 상대적 발현량이 낮게 나타났습니다(그림 6g). 가장 높은 값은 22660 집단에서 접종 후 24시간(24 HPI)에 관찰되었습니다(0.14±0.02, 백신 접종에 반응하여 8배 증가).
유전자 발현 프로파일 비교(그림 7) 결과, TanjilG_10657은 TanjilG_27015(r = 0.89), TanjilG_05080(r = 0.85), TanjilG_05042(r = 0.80), TanjilG_04706(r = 0.79) 등 다른 네 유전자와 높은 상관관계를 보였다. 이러한 결과는 방어 반응 동안 이들 유전자의 공동 조절 가능성을 시사한다. TanjilG_12861과 TanjilG_23384 유전자는 다른 유전자들과는 다른 발현 프로파일을 보였으며, 피어슨 상관계수 값은 각각 0.08~0.43과 -0.19~0.28이었다.
유전자 발현 프로파일 간의 상관관계는 정량적 PCR을 이용하여 분석하였다. 분석 대상은 다음과 같은 좁은잎루핀 품종이었다: 83A:476 (저항성, Lanr1 동형접합 대립유전자 보유), Mandelup (중등도 저항성, AnMan 동형접합 대립유전자 보유), Boregine (저항성, 유전적 배경 불명), 그리고 Population 22660 (감수성). 접종 후 6시간, 12시간, 24시간의 세 시점에서 분석을 진행하였다. 접종 식물(Colletotrichum lupini, Col-08 균주, 1999년 폴란드 비에르제니체 루핀 재배지에서 채집)과 대조군(가짜 접종) 식물을 모두 포함하였다. 표의 척도는 피어슨 상관계수 값을 나타낸다.
인치당 6마력에서 얻은 데이터를 기반으로, 접종 식물과 대조 식물을 비교하여 초기 방어 반응에 초점을 맞춘 9981개의 차등 발현 유전자(DEG)에 대해 전체 유전자 클러스터링 분석(WGCNA)을 수행했습니다(보충표 S12). 그 결과, 유전자형과 실험 변이체 간에 상관관계(양성 또는 음성)를 보이는 22개의 유전자 모듈(클러스터)이 발견되었습니다. 평균적으로 유전자 발현 수준은 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 순으로 감소하는 경향을 보였다(단, 두 변종 모두에서 이러한 경향은 대조군 식물에서 더 강하게 나타났다). 평균적으로 유전자 발현 수준은 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 순으로 감소하는 경향을 보였다(단, 두 변종 모두에서 이러한 경향은 대조군 식물에서 더 강하게 나타났다). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > 인구 22660 (в обоих вариантах, однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). 평균적으로 유전자 발현 수준은 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 순으로 감소했습니다(단, 두 변종 모두에서 이러한 경향은 대조군 식물에서 더 강하게 나타났습니다).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > 인구 22660的顺序下降(然而, 两种变体中, 这种趋势에서 对光植物中更强).平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> 인구 22660 的 顺序 下降 （， 种 中 ， 这 种 在 植物 中更)。、。。。。。。。。。。。。。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > 인구 22660 (однако в обоих вариантах эта тенденция была сильнее у контрольных растений). 평균적으로 유전자 발현 수준은 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 순으로 감소했습니다(단, 두 변종 모두에서 이러한 경향은 대조군 식물에서 더 강하게 나타났습니다).백신 접종은 특히 모듈 18, 19, 14, 6 및 1(효과가 높은 순서대로)에서 유전자 발현의 상향 조절, 음성 조절(예: 모듈 9 및 20) 또는 중립적 효과(예: 모듈 11, 22, 8 및 13)를 초래했습니다. GO 용어 풍부도 분석(보충표 S13)은 최대 활성화를 보이는 접종 모듈(18)에 대해 "GO: 0006952 보호 반응"을 나타냈으며, 여기에는 qPCR로 분석된 유전자(TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 및 TanjilG_27015)와 광합성이 가장 억제된 많은 모듈(9)이 포함됩니다. 모듈 18 농축기(그림 8)는 PR-10 유사 LlR18B 단백질을 코딩하는 TanjilG_26536 유전자로, 모듈 9 농축기는 광합성계 II PsbQ 단백질을 코딩하는 TanjilG_28955 유전자로 확인되었습니다. 후보 탄저병 저항성 유전자 Lanr1인 TanjilG_05042는 모듈 22(그림 9)에서 발견되었으며, TanjilG_01212 허브를 포함하는 "GO:0044260 세포 거대분자 대사 과정" 및 "GO:0006355 전사 조절, DNA 템플릿" 용어와 관련이 있습니다. 이 유전자는 열 스트레스 전사 인자 A-4a(HSFA4a)를 코딩합니다.
과다 발현된 생물학적 과정 용어 "GO: 0006952 방어 반응"을 포함하는 모듈의 유전자 공동 발현에 대한 가중 네트워크 분석. qPCR로 분석한 네 가지 유전자(TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 및 TanjilG_27015)를 강조하기 위해 연결 과정을 단순화했습니다.
과대표되는 생물학적 과정 용어 "GO: 0006355: 전사 조절, DNA 템플릿"을 포함하고 후보 탄저병 저항성 유전자 Lanr1 TanjilG_05042를 함유하는 모듈의 유전자 공동 발현에 대한 가중 네트워크 분석을 수행하였다. 연결 과정을 간소화하여 TanjilG_05042 유전자와 중심 유전자 TanjilG_01212를 분리하였다.
호주에서 수집된 탄저병 저항성 스크리닝 결과, 초기에 출시된 대부분의 품종이 감수성인 것으로 나타났습니다. Kalya, Coromup, Mandelup은 중간 정도의 저항성을, Wonga, Tanjil, 83A:476은 높은 저항성을 가진 것으로 보고되었습니다.26,27,31 83A:476은 Lanr1으로 명명된 동일한 저항성 대립유전자를 가지고 있었고, Coromup과 Mandelup은 AnMan10, 26, 39으로 명명된 다른 대립유전자를 가지고 있었으며, Kalya는 Lanr2로 명명된 다른 대립유전자를 전달했습니다. 독일에서 수행된 탄저병 저항성 스크리닝 결과, Lanr1이 아닌 다른 후보 대립유전자(LanrBo36)를 가진 저항성 계통 Bo7212가 확인되었습니다.
본 연구에서는 조사 대상 유전자원에서 Lanr1 대립유전자의 빈도가 매우 낮게(약 6%) 나타났습니다. 이러한 관찰 결과는 Anseq3 및 Anseq4 마커를 사용하여 동유럽 유전자원을 스크리닝한 결과와 일치하며, 해당 연구에서는 Lanr1 대립유전자가 벨라루스 계통 두 개에서만 발견되었습니다. 이는 Lanr1 대립유전자가 호주와 달리 유럽의 지역 육종 프로그램에서는 아직 널리 활용되지 않고 있음을 시사합니다. 호주에서는 Lanr1 대립유전자가 마커 보조 육종의 핵심 대립유전자 중 하나로 사용되고 있습니다. 이러한 현상은 유럽의 재배 환경에서 Lanr1 대립유전자가 제공하는 저항성 수준이 호주의 보고에 비해 낮기 때문일 수 있습니다. 또한, 호주의 강우량이 많은 지역에서 수행된 탄저병 연구에서는 Lanr1 대립유전자에 의해 매개되는 저항성 반응이 병원균의 성장과 빠른 발달에 유리한 기상 조건에서는 효과적이지 않을 수 있음을 보여주었습니다.19,42 실제로, 본 연구에서는 Lanr1 대립유전자를 가진 유전자형에서도 탄저병의 일부 증상이 관찰되었는데, 이는 C. lupini 발달에 최적의 조건에서 저항성이 사라질 수 있음을 시사합니다. 또한 Lanr1 유전자좌에서 약 1cM 떨어진 Anseq3 및 Anseq4 마커의 존재에 대한 위양성 해석이 가능합니다. 28,30,43
본 연구 결과, Lanr1 대립유전자를 가진 83A:476 품종은 C. lupini 접종 후 첫 분석 시점(접종 후 6시간)에 대규모 전사체 재프로그래밍 반응을 보인 반면, AnMan 대립유전자를 가진 Mandelup 품종은 훨씬 늦은 시점(접종 후 24~48시간)에 전사체 반응이 관찰되었다. 이러한 방어 반응의 시간적 차이는 질병 증상의 차이와 연관되어 있으며, 성공적인 저항성 반응을 위해서는 병원균을 조기에 인식하는 것이 중요하다는 점을 강조한다. 탄저균 포자는 식물 조직을 감염시키기 위해 숙주 표면에서 발아, 세포 분열, 부착기 형성 등 여러 발달 단계를 거쳐야 한다. 부착기는 숙주 표면에 부착하여 숙주 조직으로 침투하는 것을 용이하게 하는 감염성 구조물이다. 따라서, 완두콩 추출물에서 C. gloeosporioides 포자는 배양 75-90분 후 핵의 첫 번째 분열을 보였고, 90-120분 후 발아관이 형성되었으며, 4시간 후에는 억제되었다45. 망고 C. gloeosporioides는 배양 3시간 후 40% 이상의 분생포자 발아율을 보였고, 4시간 후에는 약 20%의 부착기가 형성되었다. C. gloeosporioides의 병원성 관련 CAP20 유전자는 아보카도 표면 왁스에서 3.5시간 배양 후 착생포자 형성 과정에서 전사 활성을 나타냈으며, CAP20 단백질 농도가 높은 조건에서는 4시간 후 46분 후에 전사 활성이 나타났다. 마찬가지로, C. trifolii의 멜라닌 생합성 유전자 활성은 2시간 배양 동안 유도되었고, 이후 1시간 후에 부착기가 형성되었다. 잎 조직 연구에 따르면 C. acutatum을 접종한 딸기는 접종 후 8시간(hpi)에, C. coccodes를 접종한 토마토는 접종 후 4시간(hpi)에 처음으로 억제 반응을 보였는데, 이는 Colletotrichum spp.의 감염 과정 시간 척도와 대체로 일치합니다. 83A:476에 대한 빠른 방어 반응은 이 계통에서 식물 저항성과 효과기 유발 면역(ETI) 유전자의 관여를 시사하는 반면, Mandelup의 지연된 반응은 미세 연관 분자 패턴 유발 면역(MTI) 가설을 뒷받침합니다. 83A:476과 Mandelup에 대한 초기 반응에서 상향 또는 하향 조절된 유전자의 부분적인 중복 또한 이 개념을 뒷받침하는데, ETI는 종종 감염 부위에서 프로그램된 세포 사멸(아나필락시스 쇼크)로 이어지는 가속화되고 강화된 MTI 반응으로 간주되기 때문입니다.
유전자 온톨로지 GO:0006952 "방어 반응"이라는 과대표되는 용어에 해당하는 유전자 대부분은 스트레스 유도 금식 메시지 22 단백질(SAM22와 유사)의 11개 동족체와 7개의 주요 라텍스 단백질 유사체(MLP)입니다. MLP 유사체 31, 34, 43, 423은 서열 유사성을 보였습니다. SAM22 유사 유전자는 유의미한 활성화를 보였으며, 그 활성화는 더 오래 지속되어 탄저병 저항성 수준이 증가했습니다(83A:476 및 Boregine). 그러나 MLP 유사 유전자는 후보 저항성 대립유전자를 가진 계통에서만 발현이 감소했습니다(83A:476/Lanr1, 6시간 후 및 Mandelup/AnMan, 24시간 후). 모든 SAM22 유사 동족체는 약 105kb에 걸쳐 있는 유전자 클러스터에서 유래하는 반면, MLP 유사 유전자는 게놈의 서로 다른 영역에서 유래한다는 점에 주목해야 합니다. 이러한 SAM22 유사 유전자의 동시 활성화는 Diaporthetoxica 접종에 대한 NLL 저항성 연구에서도 확인되었으며, 이는 이들이 방어 반응의 수평적 구성 요소에 관여함을 시사합니다. 또한, SAM22 유사 유전자가 손상이나 살리실산, 진균 유도제 또는 과산화수소 처리에 긍정적으로 반응한다는 보고도 이러한 결론을 뒷받침합니다.
MLP 유사 유전자는 다양한 식물 종에서 세균, 바이러스 및 병원성 곰팡이 감염을 포함한 다양한 비생물적 및 생물적 스트레스에 반응하는 것으로 나타났습니다.55 식물과 병원균 간의 특정 상호작용에 대한 반응 방향은 크게 증가하는 경우(예: 목화에 Verticillium dahliae가 감염되었을 때)부터 크게 감소하는 경우(예: 사과나무에 Alternaria spp.가 감염된 후)까지 다양했습니다.56,57 아보카도의 F. niger 감염에 대한 방어 기작과 사과나무 감염 시 MLP 유사 423 유전자의 유의미한 하향 조절이 관찰되었습니다. Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola와 Alternaria alternata는 사과 병원균입니다.58,59 또한, MLP 유사 423 유전자를 과발현하는 사과 캘러스는 저항성 관련 유전자의 발현이 낮았고 곰팡이 감염에 더 취약했습니다.59 Fusarium oxysporum f에 이어 MLP 유사 423 유전자도 저항성 강낭콩 유전자원에서 억제되었습니다. cn. 콩 감염 60.
RNA-seq 연구에서 확인된 PR-10 계열의 다른 구성원으로는 상향 조절에 반응하는 LlR18A 및 LlR18B 유전자와 지질 전달 단백질 DIR1의 상향 조절(1개 유전자) 또는 하향 조절(3개 유전자) 유전자가 있습니다. 또한, WGCNA는 LlR18B 유전자가 이 모듈의 허브 역할을 하며, 백신 접종에 매우 민감하고 여러 보호 반응 유전자를 포함하고 있음을 보여줍니다. LlR18A 및 LlR18B 유전자는 병원성 세균에 대한 반응으로 노란 루핀 잎에서 유도되었으며, D. toxica 접종 후 NLL 줄기에서도 유도되었습니다. 반면, 이들 유전자의 벼 동족체인 RSOsPR10은 자스몬산 신호 전달 경로53,61, 62와 관련되는 것으로 추정되는 곰팡이 감염에 의해 빠르게 유도되었습니다. DIR1 유전자는 전신 획득 저항성(SAR) 발현에 필요한 비특이적 지질 수송 단백질을 암호화합니다. 방어 반응이 발달함에 따라 DIR1 단백질은 감염 부위에서 체관을 통해 이동하여 멀리 떨어진 기관에서 SAR을 유도합니다. 흥미롭게도 TanjilG_02313 DIR1 유전자는 84A:476 계통과 22660 집단에서 초기 시점에 유의미하게 유도되었지만, 탄저병 저항성은 84A:476 계통에서만 성공적으로 발달했습니다. 이는 NLL에서 DIR1 유전자의 기능 분화가 존재함을 시사할 수 있는데, 나머지 세 개의 동족 유전자는 접종 후 6시간에 83A:476 계통에서만 반응을 보였고, 이 반응은 하향식으로 나타났기 때문입니다.
본 연구에서 “GO:0055114 산화환원 과정”이라는 생물학적 과정에 해당하는 가장 흔한 구성 요소는 시토크롬 P450 단백질, 퍼옥시다아제, 리놀레산 9S-/13S-리폭시게나아제, 그리고 1-아미노시클로프로판-1-카르복실산 산화효소였다. 또한, 우리의 WGCNA 분석은 HSFA4a 동족체가 Lanr1 저항성 유전자 후보인 TanjilG_05042와 같은 모듈을 운반하는 허브 역할을 한다는 것을 보여주었다. HSFA4a는 식물에서 핵 전사의 산화환원 의존적 조절에 관여하는 구성 요소이다.
시토크롬 P450 단백질은 1차 및 2차 대사, 특히 외래물질 대사, 호르몬, 지방산, 스테롤, 세포벽 성분, 생체고분자 및 보호 화합물 생합성에 관여하는 NADPH 및/또는 O2 의존성 수산화 반응을 촉매하는 산화환원효소입니다.69 한 연구에서는 식물 시토크롬 P450 기능의 변동성이 많은 수의 변형된 동족체(37)와 특정 유전자 간의 반응 패턴 차이로 인해 -10.6 log2(배율 변화)에서 5.7로 감소한 것으로 나타났으며, 이는 상향 조정된 결과입니다. 이처럼 거대한 단백질 슈퍼패밀리에서 NLL 유전자의 추정되는 생물학적 기능을 밝히기 위해 RNA-seq 데이터만을 사용하는 것은 매우 추측적인 접근일 수 있습니다. 그러나 일부 시토크롬 P450 유전자는 알레르기 반응에 기여하는 것을 포함하여 병원성 곰팡이 또는 박테리아에 대한 저항성 증가와 관련이 있다는 점은 주목할 만합니다.69,70,71
클래스 III 퍼옥시다아제는 식물 생장 및 발달 과정뿐 아니라 염분, 가뭄, 고광도, 병원균 공격과 같은 환경 스트레스에 대한 반응 등 광범위한 대사 과정에 관여하는 다기능 식물 효소입니다.72 퍼옥시다아제는 Stylosanthes humilis와 C. gloeosporioides, Lens culinaris와 C. truncatum, Phaseolus vulgaris와 C. lindemuthianum, Cucumis sativus와 C. lagenarium을 포함한 여러 식물 종과 탄저균의 상호작용에 관여합니다.73,74,75,76 이러한 반응은 매우 빠르게 나타나며, 때로는 곰팡이가 식물 조직에 침투하기 전인 접종 후 4시간 만에 나타나기도 합니다.73 퍼옥시다아제 유전자는 D. toxica NLL 접종에도 반응했습니다. 산화적 폭발을 조절하거나 산화적 스트레스를 제거하는 일반적인 기능 외에도, 과산화효소는 리그닌화 과정에서 세포벽을 강화하거나 특정 화합물의 소단위 또는 가교 결합을 통해 물리적 장벽을 형성함으로써 병원균의 성장을 저해할 수 있습니다. 이러한 기능은 리그닌 형성 음이온 과산화효소를 암호화하는 것으로 추정되는 TanjilG_03329 유전자에 기인하는 것으로 컴퓨터 시뮬레이션을 통해 확인되었으며, 본 연구에서 83A:476 저항성 계통의 접종 후 6시간(6 HPI)에 이 유전자의 발현이 유의하게 증가했지만, 반응을 보이지 않은 다른 균주 및 시점에서는 발현이 증가하지 않았습니다.
리놀레산의 9S-/13S-리폭시게나제는 지질 생합성의 산화 경로에서 첫 번째 단계입니다.78 이 경로의 생성물은 칼로스와 펙틴 침전물 형성을 통한 세포벽 강화, 활성산소종 생성을 통한 산화 스트레스 조절 등 식물 방어에 다양한 기능을 합니다.79,80,81,82,83 본 연구에서 리놀레산 9S-/13S-리폭시게나제의 발현은 모든 균주에서 변화되었지만, 감수성 집단인 22660에서는 다양한 시점에서 상향 조절이 우세하게 나타났습니다. 반면 저항성 Lanr1 및 AnMan 대립유전자를 보유한 균주에서는 이러한 유전자형 간의 보호 탄저병 반응에서 옥시리핀 층의 다양화가 두드러지게 나타났습니다.
1-아미노시클로프로판-1-카르복실레이트 산화효소(ACO) 동족체는 루핀 접종 시 유의미하게 상향 조절(9개 유전자)되거나 하향 조절(2개 유전자)되었다. 두 가지 예외를 제외하고, 이러한 모든 반응은 6시간 후(83A:476)에 발생했다. ACO 단백질에 의해 매개되는 효소 반응은 에틸렌 생성의 속도 제한 단계이므로 고도로 조절된다84. 에틸렌은 식물 발달 및 생물적·비생물적 스트레스 조건에 대한 반응 조절에 다양한 역할을 하는 식물 호르몬이다. ACO 전사 유도 및 에틸렌 신호 전달 경로 활성화는 활성 산소종 및 파이토알렉신 생성을 조절함으로써 반생물기생성 곰팡이인 Oryzae oryzae에 대한 벼의 저항성을 증가시키는 데 관여한다. 본 연구에서 보고된 83A:476 계통에서 ACO 동족체의 상당한 상향 조절을 배경으로 M. oryzae와 C. lupini88,89 사이에서 발견된 매우 유사한 잎 감염 과정은 NLL 탄저병에 대한 저항성을 부여할 가능성을 분자 경로의 신호 중심 단계로 전환합니다.
본 연구에서는 83A:476 균주에서는 감염 후 6시간(hpi)에, Mandeloop 및 22660 균주에서는 감염 후 48시간(hpi)에 광합성과 관련된 여러 유전자의 대규모 억제가 관찰되었다. 이러한 변화의 정도와 진행 속도는 감염 수준에 비례한다. 본 실험에서 탄저병 저항성이 관찰되었다. 최근 병원성 세균 및 진균을 포함한 여러 식물-병원체 상호작용 모델에서 광합성 관련 전사체의 강력하고 조기 억제가 보고되었다. 감염에 대한 반응으로 광합성 관련 유전자의 신속한 발현(일부 상호작용에서는 감염 후 2시간부터) 및 전반적인 억제는 활성산소종의 생성과 살리실산 경로와의 상호작용을 통해 알레르기 반응을 매개하는 식물 면역을 유발할 수 있다. 90,94
결론적으로, 가장 저항성이 강한 계통(83A:476)에 대해 제안된 방어 반응 메커니즘에는 R 유전자(아마도 TIR-NBS-LRR TanjilG_05042)에 의한 신속한 병원체 인식과 알레르기 반응 매개 살리실산 및 에틸렌 신호 전달, 그리고 그에 따른 장거리 SAR(전신 저항성) 확립이 포함됩니다. 이러한 작용은 DIR-1 단백질에 의해 뒷받침됩니다. C. lupini 감염의 생물영양기는 매우 짧으며(약 2일), 이후 괴사성 성장이 나타난다는 점에 주목해야 합니다.95 이러한 단계 사이의 전환은 괴사와 숙주 식물에서 과민 반응을 유발하는 에틸렌 유도성 단백질의 발현과 관련될 수 있습니다. 따라서 생물영양기 단계에서 C. lupini를 성공적으로 포획할 수 있는 시간적 범위는 매우 좁습니다. 83A:476 균주에서 접종 후 6시간에 관찰된 산화환원 및 광합성 관련 유전자 재프로그래밍은 곰팡이 균사의 진행과 일치하며, 생물영양 단계에서 성공적인 방어 반응이 발달했음을 시사합니다. 만델럽(Mandelup)과 22660 집단의 전사체 반응은 곰팡이가 괴사성 성장으로 전환하기 전에 이를 포착하기에는 너무 늦을 수 있지만, PR-10 단백질의 상대적으로 빠른 조절이 수평적 저항성을 촉진하기 때문에 만델럽 집단이 22660 집단보다 더 효과적일 수 있습니다.
정규 R 유전자에 의해 유도되는 ETI는 콩의 탄저병 저항성에 대한 일반적인 메커니즘으로 보입니다. 예를 들어, 모델 콩과 식물인 메디카고 트룬카툴라(Medicago truncatula)에서 탄저병 저항성은 TIR-NBS-LRR97 식물 R 유전자 계열에 속하는 RCT1 유전자에 의해 부여됩니다. 이 유전자는 감수성 식물에 이식될 경우 알팔파에서 광범위한 탄저병 저항성을 부여하기도 합니다. 일반 콩(P. vulgaris)에서는 현재까지 20개 이상의 탄저병 저항성 유전자가 확인되었습니다. 이러한 유전자 중 일부는 정규 R 유전자가 없는 영역에서 발견되지만, 다른 많은 유전자들은 TIR-NBS-LRRs99를 포함한 NBS-LRR 유전자 클러스터를 가진 염색체의 가장자리에 위치합니다. 게놈 전체 SSR 연구는 또한 일반 콩에서 NBS-LRR 유전자가 탄저병 저항성과 관련이 있음을 확인했습니다. 정규 R 유전자는 흰 루핀 101의 주요 탄저병 저항성 유전자좌를 포함하는 유전체 영역에서도 발견되었습니다.
본 연구는 식물 감염 초기 단계(바람직하게는 감염 후 12시간 이내)에 활성화되는 즉각적인 저항 반응이 병원성 곰팡이 Collelotrichum lupini에 의한 탄저병으로부터 좁은잎루핀을 효과적으로 보호한다는 것을 보여줍니다. 고처리량 시퀀싱을 이용하여 Lanr1 및 AnMan 저항 유전자에 의해 매개되는 좁은잎루핀 식물의 탄저병 저항 유전자 발현 양상의 차이를 규명했습니다. 성공적인 방어는 식물이 병원체와 처음 접촉한 후 몇 시간 이내에 산화환원, 광합성 및 병원성 관련 단백질 유전자를 신중하게 설계하는 것을 포함합니다. 유사한 보호 반응이지만 시간이 지연되면 식물을 질병으로부터 보호하는 효과가 훨씬 떨어집니다. Lanr1 유전자에 의해 매개되는 탄저병 저항성은 R 유전자의 전형적인 신속 반응(효과기 유발 면역)과 유사한 반면, AnMan 유전자는 수평적 반응(미생물 관련 분자 패턴에 의해 유발되는 면역)을 제공하여 적당한 수준의 지속성을 제공하는 것으로 추정됩니다.
탄저병 마커 선별에 사용된 215개의 NLL 계통은 74개의 재배 품종, 교배 또는 육종을 통해 얻은 60개의 계통, 5개의 돌연변이체, 그리고 76개의 야생 또는 고유 유전자원으로 구성되었습니다. 이 계통들은 17개국에서 유래되었으며, 주로 폴란드(58개), 스페인(47개), 독일(27개), 호주(26개), 러시아(19개), 벨라루스(7개), 이탈리아(5개) 및 기타 10개국에서 유래한 계통들이 포함되었습니다. 또한, 참조 저항성 계통인 83A:476, Tanjil, Lanr1 대립유전자를 가진 Wonga, 그리고 AnMan 대립유전자를 가진 Mandelup도 포함되었습니다. 이 계통들은 폴란드 비아트로보에 위치한 포즈난 식물 육종 유한회사(Poznań Plant Breeding Ltd.)에서 관리하는 유럽 루핀 유전자원 데이터베이스에서 얻었습니다(보충표 S1).
식물은 통제된 조건(광주기 16시간, 주간 온도 25°C, 야간 온도 18°C)에서 재배되었다. 두 개의 생물학적 반복 실험을 분석하였다. DNA는 DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 프로토콜에 따라 3주 된 잎에서 분리하였다. 분리된 DNA의 품질과 농도는 분광광도법(NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)으로 측정하였다. 탄저병 저항성 유전자 AnMan(품종 Mandelup 유래)을 표시하는 AnManM1 마커와 Lanr1 유전자(품종 Tanjil 유래)를 둘러싸는 Anseq3 및 Anseq4 마커를 분석하였다. 저항성 대립유전자에 대한 동형접합체는 "1", 감수성은 "0", 이형접합체는 "0"으로 점수를 매겼다.
AnManM1, AnSeq3 및 AnSeq4 마커 스크리닝 결과와 최종 후속 실험에 필요한 종자 확보 여부를 바탕으로 50개의 NLL 계통을 선별하여 탄저병 저항성 표현형 분석을 수행했습니다. 분석은 컴퓨터로 제어되는 온실에서 14시간 광주기, 주간 22°C, 야간 19°C의 온도 조건으로 2회 반복하여 진행했습니다. 종자 껍질이 너무 단단하여 휴면되는 것을 방지하고 균일한 발아를 위해 파종 전에 날카로운 칼날로 배아 반대쪽의 종피를 긁어냈습니다. 식물은 멸균 토양(TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warsaw, Poland)이 담긴 화분(11 × 11 × 21 cm)에 재배했습니다. 접종은 1999년 폴란드 베르제니차(52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E)의 한 밭에서 재배한 좁은잎루핀 줄기에서 분리한 Colletotrichum lupini Col-08 균주를 이용하여 수행하였다. 분리균주는 포자 형성을 유도하기 위해 20°C, 자외선 조사 하에 21일 동안 SNA 배지에서 배양하였다. 파종 후 4주가 지나 식물이 4~6엽이 되었을 때, 0.5 x 10⁶ 포자/ml 농도의 포자 현탁액을 분무하여 접종하였다. 접종 후, 포자 발아 및 감염 과정을 촉진하기 위해 식물을 약 98%의 습도와 25°C의 온도에서 24시간 동안 암실에 보관하였다. 이후 식물을 22°C(낮)/19°C(밤)의 14시간 광주기 조건과 70% 습도에서 재배하였다. 접종 22일 후, 줄기와 잎에 괴사성 병반이 나타나는지 여부에 따라 0(면역)부터 9(매우 감수성)까지의 병해 점수를 매겼다. 또한, 점수 측정 후 식물의 무게를 측정하였다. 마커 유전자형과 병 표현형 간의 관계는 점-이중 서열 상관관계(탄저병 저항성 표현형 분석에 사용된 계통군에서 이형접합 마커의 부재)를 이용하여 계산하였다.