Благодарим ви, че посетихте Nature.com. Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка на CSS. За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer). Междувременно, за да осигурим непрекъсната поддръжка, ще рендираме сайта без стилове и JavaScript.
Лупината Angustifolius (NLL, Lupinus angustifolius L.) е бобово растение, използвано за производство на храни и подобряване на почвата. Глобалното разпространение на лупината като култура е привлякло много патогенни гъби, включително лупинова антракноза, която причинява опустошителното заболяване антракноза. Два алела, Lanr1 и AnMan, които придават повишена резистентност, са използвани в селекцията на NLL, но основните молекулярни механизми остават неизвестни. В това проучване маркерите Lanr1 и AnMan са използвани за скрининг на европейски проби от NLL. Тестването на ваксината в контролирана среда потвърди ефикасността и на двата резистентни донора. Диференциално профилиране на генната експресия е извършено върху представителни резистентни и чувствителни линии. Резистентността към антракноза е свързана със свръхекспресия на генните онтологични термини „GO:0006952 Defense Response“, „GO:0055114 Redox Process“ и „GO:0015979 Photosynthesis“. В допълнение, линията Lanr1(83A:476) показа значително препрограмиране на транскриптомите бързо след инокулация, докато другите линии показаха забавяне на този отговор с около 42 часа. Защитните реакции са свързани с гените TIR-NBS, CC-NBS-LRR и NBS-LRR, 10 протеина, участващи в патогенезата, протеини за липиден трансфер, ендоглюкан-1,3-β-глюкозидаза, богати на глицин протеини на клетъчната стена и гени от реактивния път на кислорода. Ранните реакции към 83A:476, включително внимателно потискане на гени, свързани с фотосинтезата, съвпаднаха с успешна защита по време на вегетативната фаза на растеж на гъбичната биология, което предполага, че ефектор задейства имунитет. Реакцията на Mandeloop е забавена, както и общото хоризонтално съпротивление.
Теснолистната лупина (NLL, Lupinus angustifolius L.) е високопротеинова зърнена култура, произхождаща от западния средиземноморски регион1,2. В момента се отглежда като хранителна култура за животни и хора. Счита се и за зелено торене в системите за сеитбообращение поради фиксирането на азот от симбиотични азотфиксиращи бактерии и цялостното подобряване на почвената структура. NLL е претърпяла бърз процес на опитомяване през последния век и все още е под силен натиск за размножаване3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. С широкото култивиране на NLL, разпространението на патогенни гъби е развило нови селскостопански ниши и е причинило нови болести, унищожаващи реколтата. Най-забележителното за фермерите и селекционерите на лупина е появата на антракноза, причинена от патогенната гъба Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Най-забележителното за фермерите и селекционерите на лупина е появата на антракноза, причинена от патогенната гъба Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Най-важното за фермерите и селекционерите на люпина е проявата на антракноза, причинена от патогенен гриб Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Най-забележително за фермерите и селекционерите на лупина е появата на антракноза, причинена от патогенната гъба Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Бондар) Ниренберг, Фейлер и Хагедорн13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Бондар)嵵Кос.1 Най-поразителното за фермерите и селекционерите на люпина е проявата на антракноза, причинена от патогенния гриб Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Най-поразително за фермерите и развъдчиците на лупина е появата на антракноза, причинена от патогенната гъба Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Най-ранните съобщения за заболяването идват от Бразилия и Съединените щати, като типичните симптоми се появяват съответно през 1912 и 1929 г. След около 30 години обаче патогенът е обозначен като Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф на Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в „Целенасочена морфология“. & Х. Шренк,. & Х. Шренк, .и Х. Шренк. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。и Х. Шленк,.Предварителното фенотипизиране на заболяването, извършено в средата на 20-ти век, показа известна резистентност при образци от NLL и жълта лупина (L. luteus L.), но всички тествани образци от бяла лупина (L. albus L.) бяха силно чувствителни15,16. Проучванията показват, че развитието на антракноза е свързано с повишени валежи (влажност на въздуха) и температура (в диапазона 12-28°C), което води до нарушаване на резистентността при по-високи температури17, 18. Всъщност времето, необходимо за покълване на конидиите и началото на заболяването, е било четири пъти по-кратко при 24°C (4 часа), отколкото при 12°C (16 часа) при условия на висока влажност19. По този начин, продължаващото глобално затопляне е довело до разпространението на антракноза. Въпреки това, заболяването е наблюдавано във Франция (1982 г.) и Украйна (1983 г.) като предвестник на предстояща заплаха, но очевидно е било игнорирано от лупиновата индустрия по това време20,21. Няколко години по-късно това опустошително заболяване се разпространи по целия свят и засегна и големи страни производителки на лупина, като Австралия, Полша и Германия22,23,24. След епидемия от антракноза в средата на 90-те години на миналия век, обширен скрининг доведе до идентифицирането на няколко резистентни донора в проби от NLL19. Резистентността на NLL към антракноза се контролира от два отделни доминантни алела, открити в различни източници на зародишна плазма: Lanr1 в сорта Tanjil и Wonga и AnMan в сорта Mandalay25,26. Тези алели допълват молекулярните маркери, които подпомагат селекцията на резистентна зародишна плазма в селекционните програми25,26,27,28,29,30. Резистентната размножителна линия 83A:476, носеща алела Lanr1, беше кръстосана с чувствителната дива линия P27255, за да се получи RIL популация, сегрегираща за резистентност към антракноза, което направи възможно присвояването на Lanr1 локуса на хромозома NLL-1131, 32, 33. Подравняването на маркери на картата на свързване от фланкиращи локуси на резистентност към антракноза с геномна рамка, NLL разкри местоположението на всичките три алела на една и съща хромозома (NLL-11), но на различни позиции29,34,35. Въпреки това, поради малкия брой RIL и голямото генетично разстояние между маркерите и съответните алели, не могат да се направят надеждни заключения за техните основни гени. От друга страна, използването на обратна генетика при лупините е трудно поради много ниския им регенерационен потенциал, което прави генетичната манипулация тромава37.
Разработването на опитомена зародишна плазма, носеща желания алел в хомозиготно състояние, като например 83A:476 (Lanr1) и Mandelup (AnMan), отвори вратата за изучаване на резистентността към антракноза при наличие на противоположни комбинации от алели в дивите популации. Възможности за молекулярни механизми. Сравнете защитните реакции, генерирани от специфични генотипове. Това проучване оценява ранния транскриптомен отговор на NLL към ваксинация срещу C. lupini. Първо, европейски панел от зародишна плазма на NLL, съдържащ 215 линии, беше скриниран с помощта на молекулярни маркери, които маркират алелите Lanr1 и AnMan. След това беше извършено фенотипизиране на антракноза върху 50 NLL линии, предварително селектирани за молекулярни маркери, при контролирани условия. Въз основа на тези експерименти бяха избрани четири линии, различаващи се по резистентност към антракноза и алелен състав Lanr1/AnMan, за диференциално профилиране на генната експресия на защитата, използвайки два допълващи се подхода: високопроизводително РНК секвениране и количествено определяне с PCR в реално време.
Скринингът на набор от NLL зародишна плазма (N = 215) с маркери Lanr1 (Anseq3 и Anseq4) и AnMan (Anseq4) и AnMan (AnManM1) показа, че само една линия (95726, близо до Salamanca-b) усилва алела за „резистентност“ за всички маркери, докато „Наличие на „чувствителни“ алели“ установи дела на всички маркери в 158 (~73,5%) линии. Тринадесет линии произведоха два „резистентни“ алела на маркера Lanr1, а 8 линии произведоха „резистентни“ алели на маркера Lanr1. Алелът за „резистентност“ на маркера AnMan (Допълнителна таблица S1). Две линии бяха хетерозиготни за маркера Anseq3 и една хетерозиготна за маркера AnManM1. 42 линии (19,5%) носеха противоположни фази на алелите Anseq3 и Anseq4, което показва висока честота на рекомбинация между тези два локуса. Фенотипите на антракноза при контролирани условия (Допълнителна таблица S2) показват вариабилност в резистентността на тестваните генотипове, което се отразява в тежестта на антракнозата. Разликите в средните оценки варират от 1,8 (умерено устойчиви) до 6,9 (чувствителни), а разликите в теглото на растенията варират от 0,62 (чувствителни) до 4,45 g (устойчиви). Наблюдавана е значителна корелация между стойностите, наблюдавани в две повторения на експеримента (0,51 за оценка на тежестта на заболяването, P = 0,00017 и 0,61 за теглото на растението, P < 0,0001), както и между тези два параметъра (−0,59 и −0,77, P < 0,0001). Наблюдавана е значителна корелация между стойностите, наблюдавани в две повторения на експеримента (0,51 за оценка на тежестта на заболяването, P = 0,00017 и 0,61 за тегло на растението, P < 0,0001), както и между тези два параметъра (−0,59 и −0,77, P < 0,0001). Установена достоверна корелация между значенията, наблюдавани в два повторения експеримента (0,51 за балове на тежестта на заболяването, P = 0,00017 и 0,61 за масата на растенията, P < 0,0001), както и между тези два параметра (-0,59 и -0,77, R < 0,0001) 0,0001). Установена е значителна корелация между стойностите, наблюдавани при две повторения на експеримента (0,51 за оценките за тежест на заболяването, P = 0,00017 и 0,61 за теглото на растението, P < 0,0001), както и между тези два параметъра (-0,59 и -0,77, P < 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为0,51，P = 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间，(- 0,59 和- 0,77，P < 0,0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0,59 和– 0,59 和 – 0,59 和 – 0,59 和 - 0,77, P < 0,0001). Наблюдава се значителна корелация между значенията, наблюдавани в две повторения (оценка на тежестта на заболяването 0,51, P = 0,00017 и масата на растенията 0,61, P <0,0001), и между тези два параметра (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001. Наблюдавана е значителна корелация между стойностите, наблюдавани в дубликати (оценка на тежестта на заболяването 0,51, P = 0,00017 и тегло на растението 0,61, P < 0,0001), а между тези два параметъра (-0,59 и -0,0001) е 0,77, P < 0,0001. ).Типичните симптоми, наблюдавани при чувствителните растения, включват прегъване и усукване на стъблото, наподобяващо структура на „овчарски лък“, последвано от овални лезии с оранжеви/розови спорозоити (Допълнителна фигура 1). Австралийските проби, носещи гените Lanr1 (83A:476 и Tanjil) и AnMan (Mandelup), са умерено устойчиви, 0,0331 и 0,0036). Някои линии, които също носят „устойчиви“ алели Lanr1 и/или AnMan, показват симптоми на заболяването.
Интересно е, че няколко NLL линии, лишени от „резистентен“ маркерен алел, показват високо ниво на резистентност към антракноза (сравнимо или по-високо от това за генотиповете Lanr1 или AnMan), като например Boregine (P стойност < 0,0001 и за двата параметъра), Bojar (P стойност < 0,0001 за резултат и 0,001 за тегло на растението) и популация B-549/79b (P стойност < 0,0001 за резултат и незначително за тегло). Интересно е, че няколко NLL линии, лишени от „резистентен“ маркерен алел, показват високо ниво на резистентност към антракноза (сравнимо или по-високо от това за генотиповете Lanr1 или AnMan), като например Boregine (P стойност < 0,0001 и за двата параметъра), Bojar (P стойност < 0,0001 за резултат и 0,001 за тегло на растението) и популация B-549/79b (P стойност < 0,0001 за резултат и незначително за тегло). Интересно е, че няколко линии NLL, лишени от какъвто и да било «резистентен» маркерен алел, показаха високо ниво на устойчивост към антракноза (съставно или по-високо, отколкото за генотипове Lanr1 или AnMan), такива като Boregine (значение P <0,0001 за всички параметри), Bojar (значение P < 0,0001 за оценки и 0,001 за маса растения) и популации B-549/79b (значение P <0,0001 за оценка и незначително за маса). Интересно е, че няколко NLL линии, лишени от „резистентен“ маркерен алел, показват високо ниво на резистентност към антракноза (сравнимо или по-високо от това за генотиповете Lanr1 или AnMan), като например Boregine (P стойност < 0,0001 и за двата параметъра), Bojar (P стойност < 0,0001 за оценка и 0,001 за теглото на растението) и популация B-549/79b (P стойност < 0,0001 за оценка и незначително за теглото).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分为0,0001，植物重量为0,001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）。 Интересно е, че някои NLL системи, които нямат никакви „антигенни“ маркери, показват висока хоризонтална резистентност (еквивалентна на гените Lanr1 или AnMan или по-висока), като например Boregine (и двата параметъра P < 0,0001), Bojar (P стойност < 0,0001, тегло на растението 0,001) и щам B-549/79b (P стойност < 0,0001, теглото не е значително). Интересно е, че някои линии NLL, лишени от каквито и да е маркери на алеите на «резистентност», показаха висока степен на устойчивост на антракноза (сравними или по-високи, отколкото при генотипове Lanr1 или AnMan), като Boregine (значение P за всички параметри <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, маса на растенията 0,001) и популация B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, маса незначителна). Интересно е, че някои NLL линии, лишени от маркерни алели за „резистентност“, показват високи нива на резистентност към антракноза (сравними или по-високи от генотипите Lanr1 или AnMan), като например Boregine (P-стойност и за двата параметъра <0,0001), Bojar (P-стойност <0,0001, тегло на растението 0,001) и популация B-549/79b (P-стойност <0,0001, теглото не е значимо).Това явление предполага възможността за нов генетичен източник на резистентност, обяснявайки наблюдаваната липса на корелация между маркерните генотипове и болестните фенотипове (P-стойности от ~0,42 до ~0,98). По този начин, тестът на Колмогоров-Смирнов показа, че данните за резистентност към антракноза са приблизително нормално разпределени за резултати (P-стойности 0,25 и 0,11) и растителна маса (P-стойности 0,47 и 0,55), което предполага хипотезата, че са замесени повече алели от Lanr1 и AnMan.
Въз основа на резултатите от скрининга за резистентност към антракноза, за транскриптомен анализ бяха избрани 4 линии: 83A:476, Boregine, Mandelup и Population 22660. Тези линии бяха повторно тествани за резистентност към антракс в експерименти с инокулация чрез РНК секвениране, при условие че са същите като в предишния тест. Стойностите на резултата бяха следните: Boregin (1.71 ± 1.39), 83A:476 (2.09 ± 1.38), Mandelup (3.82 ± 1.42) и population 22660 (6.11 ± 1.29).
Протоколът Illumina NovaSeq 6000 постигна средно 40,5 Mread двойки на проба (29,7 до 54,4 Mreads) (Допълнителна таблица S3). Резултатите от подравняването в референтната последователност варираха от 75,5% до 88,6%. Средната корелация на данните за броя на прочетените данни между експерименталните варианти и биологичните реплики варираше от 0,812 до 0,997 (средно 0,959). От анализираните 35 170 гена, 2917 не показват експресия, а останалите 4785 гена са експресирани на незначително ниво (средна базова стойност < 5). От анализираните 35 170 гена, 2917 не показват експресия, а останалите 4785 гена са експресирани на незначително ниво (средна базова стойност < 5). От 35 170 проанализирани гена 2917 не са проявили експресия, а останалите 4785 гена са били експресирани на незначително ниво (базово средно <5). От анализираните 35 170 гена, 2917 не показват експресия, а останалите 4785 гена са експресирани на незначително ниво (средна базова стойност <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达＾,其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。.35 170 От 35 170 проанализирани гена 2917 не са експресирани, а останалите 4785 гена са имали незначителна експресия (базовото средно значение <5). От анализираните 35 170 гена, 2917 не са били експресирани, а останалите 4785 гена са имали незначителна експресия (средна базова стойност <5).По този начин, броят на гените, считани за експресирани (базова средна стойност ≥ 5) по време на експеримента, е 27 468 (78,1%) (Допълнителна таблица S4).
От първия момент на изследване, всички NLL линии реагираха на инокулацията с C. lupini (щам Col-08) чрез препрограмиране на транскриптома (Таблица 1), но между линиите бяха наблюдавани значителни разлики. Така, линията на резистентност 83A:476 (носеща гена Lanr1) показа значително препрограмиране на транскриптома в първия момент на изследване (6 hpi) с 31-69-кратно увеличение на броя на изолираните up- и down-гени в сравнение с други времеви точки в този момент. Освен това, този пик беше краткотраен, тъй като експресията само на няколко гена остана значително променена във втория момент на изследване (12 hpi). Интересното е, че Boregine, който също показа високо ниво на резистентност в теста за присаждане, не претърпя такова масивно транскрипционно препрограмиране по време на експеримента. Броят на диференциално експресираните гени (DEG) обаче беше един и същ за Boregine и 83A:476 при 12 HPI. Както Mandelup, така и популация 22660 показаха пикове на DEG в последната времева точка (48 l/s), което показва относително забавяне в защитните реакции.
Тъй като 83A:476 претърпя масивно препрограмиране на транскриптоми в отговор на C. lupini на 6 HPI в сравнение с всички други линии, ~91% от наблюдаваните диференциално разпределени гени (DEG) в този момент са специфични за линията (фиг. 1). Въпреки това, имаше известно припокриване в ранните отговори между изследваните линии, тъй като 68,5%, 50,9% и 52,6% DEG в Boregine, Mandelup и популация 22660, съответно, се припокриваха с тези, открити в 83A:476 в определени моменти от времето. Тези DEG обаче представляват само малка част (0,97–1,70%) от всички DEG, открити понастоящем с помощта на 83A:476. В допълнение, 11 диференциално разпределени гена (DEG) от всички линии бяха кохерентни по това време (допълнителни таблици S4-S6), включително общи компоненти на защитните реакции на растенията: протеин за липиден трансфер (TanjilG_32225), ензим ендоглюкан-1,3-β-глюкозид (TanjilG_23384), два стрес-индуцируеми протеина като SAM22 (TanjilG_31528 и TanjilG_31531), основен латексов протеин (TanjilG_32352) и два богати на глицин структурни протеина на клетъчната стена (TanjilG_19701 и TanjilG_19702). Наблюдава се и относително високо припокриване в транскриптомните отговори между 83A:476 и Boregine при 24 HPI (общо 16-38% DEG) и между Mandelup и популация 22660 при 48 HPI (общо 14-20% DEG).
Диаграма на Вен, показваща броя на диференциално експресираните гени (DEG) в линии от теснолистна лупина (NLL), инокулирани с Colletotrichum lupini (щам Col-08, получен от лупинови полета във Веженице, Полша, 1999 г.). Анализираните NLL линии са: 83A:476 (устойчива, носеща алела Lanr1), Boregine (устойчива, генетичен фон неизвестен), Mandelup (умерено устойчива, носеща алела AnMan) и популация 22660 (много чувствителна). Съкращението hpi означава часове след ваксинация. Нулевите стойности са премахнати, за да се опрости графиката.
Наборът от свръхекспресирани гени при 6 hpi беше анализиран за наличие на канонични R генни домейни (Допълнителна таблица S7). Това проучване разкри транскриптомна индукция на класически гени за резистентност към заболявания само с NBS-LRR домейни при 83A:476. Този набор се състоеше от един TIR-NBS-LRR ген (tanjilg_05042), пет CC-NBS-LRR гена (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 и tanjilg_16162), и четири NBS-LR, Tanjilg_16162), и четири NBS-LRRE (tanjilg_16162), както и четири NBS-Lrr (tanjilg_16162) и четири NBS-LRR (TANJILG_16162). Всички тези гени имат канонични домейни, подредени в консервативни последователности. В допълнение към гените на NBS-LRR домейна, няколко RLL кинази бяха активирани при 6 hpi, а именно една в Boregine (TanjilG_19877), две в Mandelup (TanjilG_07141 и TanjilG_19877) и в популация 22660 (TanjilG_09014 и TanjilG_10361) и две в 83A 27:476.
Гени със значително променена експресия в отговор на инокулация с C. lupini (щам Col-08) бяха подложени на анализ за обогатяване с Gene Ontology (GO) (Допълнителна таблица S8). Най-често свръхпредставеният термин за биологичен процес е „GO:0006952 защитен отговор“, който се появява в 6 от 16 (време × линия) комбинации с висока значимост (P стойност < 0,001) (фиг. 2). Най-често свръхпредставеният термин за биологичен процес е „GO:0006952 защитен отговор“, който се появява в 6 от 16 (време × линия) комбинации с висока значимост (P стойност < 0,001) (фиг. 2). Най-често чрезмерно представеният термин на биологичния процес е «GO: 0006952 защитен отговор», който се появява в 6 от 16 (време × линия) комбинация с висока значимост (значение P <0,001) (рис. 2). Най-често свръхпредставеният термин за биологичен процес е „GO:0006952 защитен отговор“, който се появява в 6 от 16 (време × родословие) комбинации с висока значимост (P стойност < 0,001) (фиг. 2).最常被过度代表的生物过程术语是„GO:0006952 防御反应“, 它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 Най-представителният термин за биологичен процес е „GO:0006952 защитен отговор“, който се появява в 6 от 16-те (时间×线) комбинации, с висока значимост (P стойност < 0,001) (图2). Най-често чрезмерно представеният термин на биологичния процес е «GO: 0006952 Отбранителен отговор», който се появява в 6 от 16 комбинации (време × линия) с висока значимост (значение P <0,001) (рис. 2). Най-често свръхпредставеният термин за биологичен процес е „GO:0006952 Defense Response“, който се появява в 6 от 16 комбинации (време × линия) с висока значимост (P стойност < 0,001) (фиг. 2).Този термин е свръхпредставен в два времеви момента в 83A: 476 и Boregine (6 и 24 hpi) и в един времеви момент в Mandelup и Population 22660 (съответно 12 и 6 hpi). Това е очакван резултат, подчертаващ противогъбичния отговор на резистентните линии. В допълнение, 83A:476 реагира на C. lupini чрез бързо индуциране на гени, свързани с оксидативния взрив, представен от термина „GO:0055114 редокс процес“, което показва специфичен защитен отговор, докато Boregine разкрива специфични защитни отговори, свързани с термина „GO“. :0006950 Реакция на стрес“. Популация 22660 активира хоризонталната резистентна реакция, включваща вторични метаболити, което подчертава прекомерния брой термини „GO:0016104 Процес на биосинтеза на тритерпени“ и „GO:0006722 Процес на метаболизъм на тритерпени“ (и двата термина принадлежат към един и същ набор от гени), като се вземат предвид резултатите от анализа за обогатяване на GO термините, стабилността на реакцията на Манделуп е между Boregine и Популация 22660. В допълнение, ранната реакция 83A:476 (6 hpi) и забавената реакция на Манделуп и Популация 22660 включват термина GO:0015979 „фотосинтеза“ и други свързани биологични процеси.
Термините за биопроцесна генна онтология, избрани в анотацията на диференциално експресирани гени по време на транскриптомните отговори на теснолистна лупина (NLL), инокулирана с антраксна лупина (щам Col-08, получен от лупинови полета във Веженице, Полша, през 1999 г.), са силно преувеличени. Анализираните NLL линии са: 83A:476 (устойчива, носеща хомозиготен алел Lanr1), Boregine (устойчива, неизвестен генетичен фон), Mandelup (умерено устойчива, носеща хомозиготен алел AnMan) и популация 22660 (чувствителна).
Тъй като това проучване имаше за цел да идентифицира гени, които допринасят за резистентност към антракноза, гените, присвоени на термините GO „GO: 0006952 Защитни отговори“ и „GO: 0055114 Редокс процеси“, бяха анализирани с гранични стойности, тъй като изходните стойности са ≥ 30 с поне една линия. × точка във времето, комбинираща статистически значими стойности на log2 (кратна промяна). Броят на гените, отговарящи на тези критерии, беше 65 за GO:0006952 и 524 за GO:0055114.
83A:476 разкрива два DEG пика, анотирани с термина GO:0006952, първият при 6 гена на инч (64 гена, възходяща и низходяща регулация), а вторият при 24 гена на инч (15 гена, само възходяща регулация). Boregine също така показва, че GO:0006952 достига пик в същия момент, но с по-малко DEG (11 и 8) и преференциално активиране. Mandeloop показва два пика на GO:0006952 при 12 и 48 HPI, като и двата носят 12 гена (първият с активиращи гени, а вторият само с потискащи гени), докато популацията 22660 при 6 HPI (13 гена) има по-голямо преобладаване на пика на повишаване на регулацията. Трябва да се отбележи, че 96,4% от GO:0006952 DEG в тези пикове имат един и същ тип отговор (нагоре или надолу), което показва значително припокриване в защитните реакции, въпреки разликите в броя на участващите гени. Най-голямата група последователности, свързани с термина GO:0006952, кодира протеина 22, свързан със стреса при гладуване (SAM22-like), който принадлежи към протеиновия клад от клас 10 на патогенезис-асоциирания протеин (PR-10) и основния протеин латекс. (MLP-like) протеин) (фиг. 3). Двете групи се различават по естеството на експресията и посоката на отговора. Гените, кодиращи SAM22-подобни протеини, показват постоянна и значителна индукция в ранни времеви точки (6 или 12 hpi) и като цяло не реагират в края на експеримента (48 hpi), докато MLP-подобните протеини показват координация при 6 hpi. 83A:476 и Mandelup при 48 hp/in, почти всички други точки от данни не реагират. Освен това, разликите в профилите на експресия на SAM22-подобни протеинови гени следват наблюдаваната вариабилност в резистентността към антракноза, тъй като по-резистентните линии имат повече времеви точки, индуциращи значително тези гени, отколкото по-чувствителните гени. Друг LlR18A/B-подобен PR-10 ген показа много подобен модел на експресия на SAM22-подобния протеинов ген.
Идентифицирани са основните компоненти на термина на биологичния процес „GO:0006952 Defense Response“ и моделите на експресия на кандидат-гените на алелите Lanr1 и AnMan. Log2 скалата представлява log2 стойности (кратна промяна) между инокулирани (Colletotrichum lupini, щам Col-08, получен от лупинови полета, Виженица, Полша, 1999 г.) и контролни (плацебо инокулирани) растения в един и същ момент. Анализирани са следните линии на теснолистна лупина: 83A:476 (устойчива, носеща хомозиготен алел Lanr1), Boregine (устойчива, генетичен фон неизвестен), Mandelup (умерено устойчива, носеща хомозиготен алел AnMan) и Популация 22660 (чувствителна).
Освен това бяха оценени профилите на експресия на RNA-seq кандидат-гените Lanr1 (TanjilG_05042) и AnMan (TanjilG_12861) (Фиг. 3). Генът TanjilG_05042 показа значителен отговор (активиране) при 83A:476 само в първата времева точка (6 hpi), докато TanjilG_12861 беше значителен в Mandeloop само в две времеви точки: 6 hpi (понижена регулация) и 24 hpi (6 hpi). С.). регулируема) ).
Най-свръхекспресираните гени в термина GO:0055114 „редокс процес“ са гените, кодиращи цитохром P450 протеини и пероксидаза (фиг. 4). За проби, изолирани от 83A:476 при 6 HPI, максимални или минимални log2 (кратна промяна) стойности (за 86,6% от гените) обикновено са наблюдавани между инокулирани и контролни растения, което подчертава високия отговор на този генотип към инокулиращия пол. 83A:476 показва най-значимия GO:0055114 DEG при 6 hpi (503 гена), докато останалите линии при 48 hpi (Boregine, 31 гена; Mandelup, 85 гена; и Population 22660, 78 гена)). В повечето гени от семейството GO:0055114 са наблюдавани два вида отговори на ваксинацията (активиране и инхибиране). Интересното е, че до 97,6% от DEG са идентифицирани за термина GO: 0055114 в Mandelupe при 48 hp. Тези наблюдения показват, че въпреки значително по-малкия мащаб (т.е. броя на мутиралите редокс гени, 85 спрямо 503), моделът на забавени транскриптомни отговори на mandelup към антракноза е подобен на ранния отговор на 83A:476. В Boregine и Population 22660 тази конвергенция е по-ниска, съответно 51,6% и 75,6%.
Разкрити са моделите на експресия на основните компоненти на термина на биологичния процес „GO:0055114 Redox процес“. Log2 скалата представлява log2 стойности (кратна промяна) между инокулирани (Colletotrichum lupini, щам Col-08, получен от лупинови полета, Виженица, Полша, 1999 г.) и контролни (плацебо инокулирани) растения в един и същ момент. Анализирани са следните линии на теснолистна лупина: 83A:476 (устойчива, носеща хомозиготен алел Lanr1), Boregine (устойчива, генетичен фон неизвестен), Mandelup (умерено устойчива, носеща хомозиготен алел AnMan) и Популация 22660 (чувствителна).
83A:476 Транскриптомните отговори на инокулация с C. lupini (щам Col-08) също включват координирано заглушаване на гени, приписвани на термина GO:0015979 „фотосинтеза“ и други свързани биологични процеси (Фиг. 5). Този GO:0015979 DEG набор съдържа 105 гена, които са значително потиснати при 6 hpi при 83A:476. В тази подгрупа 37 гена също са били потиснати в Mandelup при 48 HPI и 35 в същия момент от време в популацията 22660, включително 19 DEG, общи за двата генотипа. Никакви DEG, свързани с термина GO: 0015979, не са били значително активирани в никоя комбинация (линия x време).
Разкрити са моделите на експресия на основните компоненти на термина на биологичния процес „GO:0015979 Фотосинтеза“. Log2 скалата представлява log2 стойности (кратна промяна) между инокулирани (Colletotrichum lupini, щам Col-08, получен от лупинови полета, Виженица, Полша, 1999 г.) и контролни (плацебо инокулирани) растения в един и същ момент. Анализирани са следните линии на теснолистна лупина: 83A:476 (устойчива, носеща хомозиготен алел Lanr1), Boregine (устойчива, генетичен фон неизвестен), Mandelup (умерено устойчива, носеща хомозиготен алел AnMan) и Популация 22660 (чувствителна).
Въз основа на резултатите от диференциалния експресионен анализ и вероятно участващ в защитните реакции срещу патогенни гъби, този набор от седем гена беше избран за количествено определяне на експресионните профили чрез PCR в реално време (Допълнителна таблица S9).
Предполагаемият протеинов ген TanjilG_10657 е значително индуциран във всички изследвани линии и времеви точки в сравнение с контролните (имитиращи) растения (Допълнителни таблици S10, S11). В допълнение, профилът на експресия на TanjilG_10657 показва нарастваща тенденция в хода на експеримента за всички линии. Популация 22660 показва най-висока чувствителност на TanjilG_10657 към инокулация със 114-кратно активиране и най-високо относително ниво на експресия (4,4 ± 0,4) при 24 HPI (Фиг. 6a). Протеиновият ген PR10 LlR18A TanjilG_27015 също показва активиране във всички линии и времеви точки, със статистическа значимост в повечето точки от данните (Фиг. 6b). Подобно на TanjilG_10657, най-високото относително ниво на експресия на TanjilG_27015 е наблюдавано в инокулираната популация 22660 при 24 HPI (19,5 ± 2,4). Генът за киселинна ендохитиназа TanjilG_04706 беше значително повишен във всички линии и във всички времеви точки с изключение на Boregine 6 hpi (фиг. 6c). Той беше силно индуциран в първата времева точка (6 HPI) при 83A:476 (с 10,5 пъти) и умерено повишен в други линии (с 6,6-7,5 пъти). По време на експеримента експресията на TanjilG_04706 остана на сходни нива в 83A:476 и Boregine, докато в Mandelup и популация 22660 тя се увеличи значително, достигайки относително високи стойности (съответно 5,9 ± 1,5 и 6,2 ± 1,5). Генът, подобен на ендоглюкан-1,3-β-глюкозидаза, TanjilG_23384 показа висока активация в първите две времеви точки (6 и 12 hpi) във всички линии с изключение на популация 22660 (фиг. 6d). Най-високите относителни нива на експресия на TanjilG_23384 са наблюдавани във втората времева точка (12 hpi) при Mandelup (2.7 ± 0.3) и 83A:476 (1.5 ± 0.1). При 24 HPI, експресията на TanjilG_23384 е относително ниска във всички изследвани линии (от 0.04 ± 0.009 до 0.44 ± 0.12).
Профили на експресия на избрани гени (ag), разкрити чрез количествена PCR. Числата 6, 12 и 24 представляват часове след ваксинацията. Гените LanDExH7 и LanTUB6 са използвани за нормализиране, а LanTUB6 е използван за междусерийна калибрация. Лентите за грешки представляват стандартното отклонение, базирано на три биологични повторения, всяко от които е средната стойност на три технически повторения. Статистическата значимост на разликите в нивата на експресия между инокулираните (Colletotrichum lupini, щам Col-08, получен през 1999 г. от лупиново поле във Веженица, Полша) и контролните (симулирано инокулирани) растения е отбелязана над точките с данни (*P стойност < 0,05, **P стойност ≤ 0,01, ***P стойност ≤ 0,001). Статистическата значимост на разликите в нивата на експресия между инокулираните (Colletotrichum lupini, щам Col-08, получен през 1999 г. от лупиново поле във Веженица, Полша) и контролните (симулирано инокулирани) растения е отбелязана над точките с данни (*P стойност < 0,05, **P стойност ≤ 0,01, ***P стойност ≤ 0,001). Статистическата значимост на разликата в нивата на експресия между инокулираните (Colletotrichum lupini, щам Col-08, получен през 1999 г. с полето на люпина във Верженице, Полша) и контролните (ложно инокулирани) растения, отбелязани над точките на данни (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Статистически значимите разлики в нивата на експресия между инокулирани (Colletotrichum lupini, щам Col-08, получен през 1999 г. от лупиново поле във Веженице, Полша) и контролни (плацебо инокулирани) растения са отбелязани над точките с данни (*P стойност < 0,05, **P-стойност ≤ 0,01, ***P-стойност ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， цвят-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Статистически значими различия в нивата на експресия между инокулирани (Colletotrichum lupini, щамм Col-08, получен от полей люпина във Верженице, Полша, през 1999 г.) и контролни (ложно инокулирани) растения, отбелязани над точките на данни (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Статистически значимите разлики в нивата на експресия между инокулирани (Colletotrichum lupini, щам Col-08, получен от лупинови полета във Верженице, Полша, през 1999 г.) и контролни (плацебо инокулирани) растения са отбелязани над точките с данни (*P-стойност < 0,05, **P-стойност ≤ 0,01, ***P-стойност ≤ 0,001).Анализираните NLL линии са: 83A:476 (устойчива, носеща хомозиготен алел Lanr1), Mandelup (умерено устойчива, носеща хомозиготен алел AnMan), Boregine (устойчива, неизвестен генетичен фон) и популация 22660 (чувствителна).
Кандидат генът TanjilG_05042 в локуса Lanr1 показа значително различен модел на експресия от профилите, получени от RNA-seq изследвания (фиг. 6д). Значително активиране на този ген е наблюдавано в Mandelup и популацията 22660 (съответно до 39,7 и 11,7 пъти), което води до относително високи нива на експресия (съответно до 1,4 ± 0,14 и 7,2 ± 1,3). 83A:476 също така разкрива известно повишение на гена TanjilG_05042 (до 3,8 пъти), но постигнатите относителни нива на експресия (0,044 ± 0,002) са повече от 30 пъти по-ниски от наблюдаваните в Mandelup и популацията 22660. Анализираните чрез qPCR показват значителни разлики в нивата на експресия между генотиповете в контролни варианти с фалшива ваксинация, достигайки 58-кратна разлика между популациите 22660 и 83A:476, както и между популациите 22660 и 22660. Двукратна разлика е постигната между Boregine и Mandalup.
Кандидат-генът в локуса AnMan, TanjilG_12861, беше активиран в отговор на ваксинация в 83A:476 и Mandelup, беше неутрален в популацията 22660 и беше понижен в Boregine (фиг. 6f). Относителната експресия на гена TanjilG_12861 беше най-висока в инокулирания 83A:476 (0,14±0,01). Генът TanjilG_05080 HSP17.4, белтък на топлинен шок от клас I с молекулна маса 17,4 kDa, показа по-ниски относителни нива на експресия във всички изследвани щамове и времеви точки (фиг. 6g). Най-високата стойност беше наблюдавана на 24 HPI в популацията 22660 (0,14 ± 0,02, осемкратно увеличение в отговор на ваксинация).
Сравнението на профилите на генна експресия (фиг. 7) разкри висока корелация между TanjilG_10657 и четири други гена: TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.80) и TanjilG_04706 (r = 0.79). Такива резултати могат да показват корегулация на тези гени по време на защитни реакции. Гените TanjilG_12861 и TanjilG_23384 показаха различни профили на експресия с по-ниски стойности на коефициента на корелация на Пиърсън (съответно от 0.08 до 0.43 и -0.19 до 0.28) в сравнение с други гени.
Корелациите между профилите на генна експресия бяха открити с помощта на количествена PCR. Анализирани бяха следните линии на теснолистна лупина: 83A:476 (устойчива, носеща хомозиготен алел Lanr1), Mandelup (умерено устойчива, носеща хомозиготен алел AnMan), Boregine (устойчива, неизвестен генетичен фон) и Популация 22660 (чувствителна). Изчислени бяха три времеви точки (6, 12 и 24 часа след инокулацията), включително инокулирани (Colletotrichum lupini, щам Col-08, получен от лупинови полета във Веженице, Полша, през 1999 г.) и контролни (плацебо инокулирани) растения. Скалата показва стойността на коефициента на корелация на Пиърсън.
Въз основа на данни, получени при 6 конски сили на инч, беше извършен WGCNA върху 9981 DEG, идентифицирани чрез сравняване на инокулирани и контролни растения, за да се фокусира върху ранните защитни реакции (Допълнителна таблица S12). Открити са двадесет и два генни модула (клъстера) с корелирани (положителни или отрицателни) профили на експресия между генотиповете и експерименталните варианти. Средно нивата на генна експресия са низходящи в ред 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (и в двата варианта обаче тази тенденция е по-силна при контролните растения). Средно нивата на генна експресия са низходящи в ред 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (и в двата варианта обаче тази тенденция е по-силна при контролните растения). В средните нива на експресия гените се понижиха в ред 83A:476 > Mandelup > Boregine > Популация 22660 (в двата варианта, обаче, тази тенденция беше по-силна в контролните растения). Средно нивата на генна експресия намаляват в реда 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (и в двата варианта обаче тази тенденция е по-силна при контролните растения).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Население 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> население 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种在 在 植物 中 更). В средните нива на експресия гените се понижиха в ред 83A:476 > Mandelup > Boregine > Популация 22660 (също в двата варианта тази тенденция беше по-силна в контролните растения). Средно нивата на генна експресия намаляват в серията 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (обаче, и в двата варианта тази тенденция е по-силна при контролните растения).Ваксинацията доведе до повишена регулация на генната експресия, особено в модули 18, 19, 14, 6 и 1 (в низходящ ред на ефекта), отрицателна регулация (напр. модули 9 и 20) или с неутрални ефекти (напр. модули 11, 22, 8 и 13). Анализът на обогатяване с GO термини (Допълнителна таблица S13) разкри „GO: 0006952 Защитни отговори“ за инокулирания модул (18) с максимална активация, включително гени, анализирани чрез qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 и TanjilG_27015), както и много от най-потиснатите от инокулацията модули за фотосинтеза (9). Концентраторът на модул 18 (фиг. 8) е идентифициран като гена TanjilG_26536, кодиращ PR-10-подобния протеин LlR18B, а концентраторът на модул 9 е идентифициран като гена TanjilG_28955, кодиращ протеина PsbQ на фотосистемата II. Кандидат ген за антракнозна резистентност Lanr1, TanjilG_05042, е открит в модул 22 (фиг. 9) и е свързан с термините „GO:0044260 Клетъчни макромолекулни метаболитни процеси“ и „GO:0006355 Транскрипционна регулация, ДНК шаблониране“, носещи хъба TanjilG_01212. Генът кодира транскрипционен фактор A-4a, причинен от топлинен стрес (HSFA4a).
Претеглен мрежов анализ на коекспресията на гени на модули с прекомерно представени термини на биологични процеси „GO: 0006952 Defense responses“. Лигирането беше опростено, за да се подчертаят четирите гена, анализирани чрез qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 и TanjilG_27015).
Претеглен мрежов анализ на коекспресията на гени на модул с прекомерно представен термин за биологичен процес „GO: 0006355: Транскрипционна регулация, ДНК шаблониране“ и носещ кандидат ген за антракнозна резистентност Lanr1 TanjilG_05042. Лигирането беше опростено, за да се изолират генът TanjilG_05042 и централният ген TanjilG_01212.
Скринингът за резистентност към антракноза, събран в Австралия, показа, че повечето от рано освободените сортове са чувствителни; Kalya, Coromup и Mandelup са описани като умерено устойчиви, докато Wonga, Tanjil и 83A:476 са описани като силно устойчиви26,27,31. имат един и същ алел за резистентност, обозначен като Lanr1, а Coromup и Mandelup имат различен алел, обозначен като AnMan10, 26, 39, докато Kalya предава различен алел, Lanr2. Скринингът за резистентност към антракноза в Германия доведе до идентифицирането на резистентна линия Bo7212 с кандидат алел, различен от Lanr1, обозначен като LanrBo36.
Нашето проучване разкри много ниска честота (около 6%) на алела Lanr1 в тестваната зародишна плазма. Това наблюдение е в съответствие с резултатите от скрининг на източноевропейска зародишна плазма, използвайки маркерите Anseq3 и Anseq4, които показаха, че алелът Lanr1 присъства само в две беларуски линии. Това предполага, че алелът Lanr1 все още не се използва широко от местните селекционни програми, за разлика от Австралия, където е един от ключовите алели за маркерно-асистирана селекция. Това може да се дължи на по-ниското ниво на резистентност, осигурено от алела Lanr1 в европейски полеви условия в сравнение с австралийския доклад. Освен това, проучвания на антракноза в райони с високи валежи в Австралия показват, че реакциите на резистентност, медиирани от алела Lanr1, може да не са ефективни при метеорологични условия, които благоприятстват растежа и бързото развитие на патогена19,42. Всъщност, в настоящото проучване, някои симптоми на антракноза са наблюдавани и при генотипове, носещи алела Lanr1, което предполага, че резистентността може да изчезне при оптимални условия за развитието на C. lupini. Освен това са възможни фалшиво положителни интерпретации на наличието на маркери Anseq3 и Anseq4, които са приблизително на 1 cM от локуса Lanr1, 28,30,43.
Нашето проучване показа, че 83A:476, носещ алела Lanr1, реагира на инокулация с C. lupini с мащабно препрограмиране на транскриптоми в първата анализирана времева точка (6 hpi), докато при Mandelup, носещ алела AnMan, транскриптомните отговори са наблюдавани много по-късно (от 24 до 48 hp). Тези времеви вариации в защитните отговори са свързани с разлики в симптомите на заболяването, което подчертава значението на ранното разпознаване на патогена за успешен отговор на резистентност. За да заразят растителната тъкан, спорите на антракса трябва да преминат през няколко етапа на развитие на повърхността на гостоприемника, включително покълване, клетъчно делене и образуване на апресориум. Придатъкът е инфекциозна структура, която се прикрепя към повърхността на гостоприемника и улеснява проникването в тъканите на гостоприемника. По този начин, спорите на C. gloeosporioides в екстракт от грах показват първо делене на ядрото след 75-90 минути инкубация, образуване на зародишна тръбичка след 90-120 минути и потискане след 4 часа 45. Манго C. gloeosporioides показа над 40% конидиална кълняемост след 3 часа инкубация и около 20% образуване на апресори след 4 часа. Свързаният с вирулентността ген CAP20 на C. gloeosporioides показа транскрипционна активност в конидии, образуващи епифити, след 3,5 часа инкубация в повърхностен восък от авокадо с високи концентрации на CAP20 протеин след 4 часа и 46 минути. По подобен начин, активността на гените за биосинтез на меланин в C. trifolii беше индуцирана по време на 2-часова инкубация, последвана от образуване на апресориум след 1 час. Проучвания на листни тъкани показват, че ягодите, инокулирани с C. acutatum, имат първа супресия на 8 часа след инфузия, докато доматите, инокулирани с C. coccodes, имат първа супресия на 4 часа след инфузия48,49. Това до голяма степен съответства на времевата скала на инфекциозния процес, причинен от Colletotrichum spp. Бързите защитни реакции към 83A:476 предполагат участие на гени за растителна резистентност и ефекторно-задействан имунитет (ETI) в тази линия, докато забавените реакции на Mandelup подкрепят хипотезата за микро-асоцииран молекулярен модел-задействан имунитет (MTI) 50. Ранните реакции към 83A: 476 и Mandelup. Частичното припокриване между гени с повишена или понижена регулация в забавения отговор също подкрепя тази концепция, тъй като ETI често се счита за ускорен и засилен MTI отговор, който завършва с програмирана клетъчна смърт на мястото на инфекцията, известна като анафилактичен шок 51,52.
Повечето от гените, приписвани на свръхпредставения термин Gene Ontology GO:0006952 „Защитен отговор“, са 11-те хомолози на протеина 22, индуциран от стрес (подобен на SAM22), и седемте основни латексови протеиноподобни (MLP) протеини 31, 34, 43 и 423 показват сходство в последователността. SAM22-подобните гени показват значително активиране, което продължава по-дълго, показвайки повишени нива на резистентност към антракноза (83A:476 и Boregine). MLP-подобните гени обаче са понижени само в линии, носещи кандидат алела за резистентност (83A:476/Lanr1 при 6 hpi и Mandelup/AnMan при 24 hpi). Трябва да се отбележи, че всички идентифицирани SAM22-подобни хомолози произхождат от генен клъстер, обхващащ приблизително 105 kb, докато MLP-подобните гени произхождат от отделни региони на генома. Координирано активиране на такива SAM22-подобни гени беше открито и в предишното ни проучване на резистентност на NLL към инокулация с Diaporthetoxica, което предполага, че те участват в хоризонталните компоненти на защитния отговор. Това заключение се подкрепя и от съобщения за положителен отговор на SAM22-подобни гени на увреждане или лечение със салицилова киселина, гъбични индуктори или водороден пероксид.
Доказано е, че MLP-подобните гени реагират на различни абиотични и биотични стресове, включително бактериални, вирусни и патогенни гъбични инфекции при много растителни видове55. Посоките на реакция към определени взаимодействия между растенията и патогените варират от силно нарастващи (т.е. по време на заразяване на памук с Verticillium dahliae) до значително намаляващи (т.е. след заразяване на ябълковото дърво с Alternaria spp.)56,57. Значително понижаване на MLP-подобния ген 423 е наблюдавано по време на защитата на авокадото от инфекция с F. niger и по време на инфекция на ябълковото дърво. Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola и Alternaria alternata са патотипове на ябълката58,59. Освен това, ябълковите калуси, свръхекспресиращи MLP-подобния ген 423, имат по-ниска експресия на гени, свързани с резистентност, и са по-податливи на гъбична инфекция59. След Fusarium oxysporum f, MLP-подобният ген 423 също е потиснат в резистентната зародишна плазма на обикновения боб. cn. Инфекция с боб 60.
Други членове на семейството PR-10, идентифицирани в нашето RNA-seq проучване, бяха гените LlR18A и LlR18B в отговор на повишена регулация, както и генът с повишена (1 ген) или понижена регулация (3 гена) за протеина за липиден трансфер DIR1. В допълнение, WGCNA подчертава гена LlR18B като център в този модул, който е силно податлив на ваксинация и носи няколко гена за защитен отговор. Гените LlR18A и LlR18B бяха индуцирани в листа от жълта лупина в отговор на патогенни бактерии, както и в стъбла на NLL след инокулация с D. toxica, докато оризовият хомолог на тези гени, RSOsPR10, беше бързо индуциран от гъбична инфекция, вероятно участваща в сигналния път на жасмоновата киселина53,61,62. Генът DIR1 кодира неспецифични протеини за липиден транспорт, които са необходими за началото на системна придобита резистентност (SAR). С развитието на защитни реакции, протеинът DIR1 се транспортира от фокуса на инфекцията през флоема, за да индуцира SAR в отдалечени органи. Интересното е, че генът TanjilG_02313 DIR1 е значително индуциран в първия времеви момент в линии 84A:476 и популация 22660, но резистентността към антракноза се развива успешно само в линия 84A:476. Това може да показва известна субфункционализация на гена DIR1 при NLL, тъй като останалите три хомолога реагират на инокулация само в линия 83A:476 при 6 hpi и този отговор е насочен надолу.
В нашето проучване най-често срещаните компоненти, съответстващи на биологичния процес, наречен „GO:0055114 Redox процес“, бяха цитохром P450 протеин, пероксидаза, линолова киселина 9S-/13S-липоксигеназа и 1-аминоциклопропан-1-карбоксилна киселина оксидаза. В допълнение, нашата WGCNA определя хомолога HSFA4a като център, носещ модули, като например кандидат-гена за резистентност към Lanr1 TanjilG_05042. HSFA4a е компонент на редокс-зависимата регулация на ядрената транскрипция в растенията.
Цитохром P450 протеините са оксидоредуктази, които катализират NADPH и/или O2-зависими хидроксилиращи реакции в първичния и вторичния метаболизъм, включително метаболизма на ксенобиотици, както и хормони, мастни киселини, стероли, компоненти на клетъчната стена, биополимери и биосинтеза на защитни съединения 69. В наше проучване, вариабилността във функцията на растителния цитохром P450 е намалена от -10.6 log2 (кратна промяна) до 5.7 поради голям брой променени хомолози (37) и разлики в моделите на отговор между специфични гени, което отразява възходяща ревизия. . Използването само на RNA-seq данни за изясняване на предполагаемата биологична функция на NLL гените в такова голямо протеиново суперсемейство би било силно спекулативно. Струва си да се отбележи обаче, че някои цитохром P450 гени са свързани с повишена резистентност към патогенни гъби или бактерии, включително принос към алергични реакции 69,70,71.
Пероксидазите от клас III са многофункционални растителни ензими, участващи в широк спектър от метаболитни процеси по време на растежа и развитието на растенията, както и в отговор на стресови фактори от околната среда, като соленост, суша, висок интензитет на светлината и атака на патогени72. Пероксидазите участват във взаимодействието на няколко растителни вида с Anthracis, включително Stylosanthes humilis и C. gloeosporioides, Lens culinaris и C. truncatum, Phaseolus vulgaris и C. lindemuthianum, Cucumis sativus и C. lagenarium73,74,75,76. Реакцията е много бърза, понякога дори при 4 HPI, преди гъбата да проникне в растителната тъкан73. Генът на пероксидазата също реагира на инокулация с D. toxica NLL. В допълнение към типичните си функции за регулиране на оксидативния взрив или елиминиране на оксидативния стрес, пероксидазите могат да пречат на растежа на патогените, като създават физически бариери, основани на подсилване на клетъчната стена по време на лигнификация, образуване на субединици или омрежване на специфични съединения. Тази функция може да се припише in silico на гена TanjilG_03329, кодиращ предполагаема лигнин-образуваща анионна пероксидаза, която беше значително повишена в нашето проучване в резистентната линия 83A:476 при 6 HPI, но не и в други щамове и времеви точки, които не реагираха.
9S-/13S-липоксигеназата на линоловата киселина е първата стъпка в оксидативния път на липидната биосинтеза78. Продуктите от този път имат множество функции в растителната защита, включително укрепване на клетъчната стена чрез образуване на калозни и пектинови отлагания и регулиране на оксидативния стрес чрез производството на реактивни кислородни видове79,80,81,82,83. В настоящото проучване експресията на линолова киселина 9S-/13S-липоксигеназа е променена във всички щамове, но в чувствителната популация 22660, повишената регулация преобладава в различни времеви точки, докато в щамове, носещи резистентен Lanr1 и алел AnMan, тя подчертава диверсификацията на оксилипиновия слой в защитните антраксни реакции между тези генотипове.
Хомологът на 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат оксидаза (ACO) е значително повишен (9 гена) или понижен (2 гена) при инокулиране с лупина. С две изключения, всички тези реакции се наблюдават при 6 hp. в 83A:476. Ензимната реакция, медиирана от ACO протеините, е стъпката, ограничаваща скоростта в производството на етилен и следователно е силно регулирана84. Етиленът е растителен хормон, който играе различни роли в регулирането на развитието на растенията и реакцията им към абиотични и биотични стресови условия. Индуцирането на ACO транскрипцията и активирането на етиленовия сигнален път участват в повишаване на резистентността на ориза към хемибиотрофната гъба oryzae oryzae чрез регулиране на производството на реактивни кислородни видове и фитоалексини. Много подобен процес на инфекция на листата, открит между M. oryzae и C. lupini88,89, на фона на значително повишаване на ACO хомолозите в линията 83A:476, докладвана в това проучване, измества възможността за придаване на резистентност към NLL антракноза етилен като централна сигнализираща стъпка в молекулярните пътища.
В настоящото проучване е наблюдавано мащабно потискане на много гени, свързани с фотосинтезата, при 6 hpi в 83A:476 и при 48 hpi в Mandeloop и популацията 22660. Степента и прогресията на тези промени са пропорционални на нивото. В този експеримент е наблюдавана резистентност към антракноза. Наскоро е съобщено за силно и ранно потискане на транскриптите, свързани с фотосинтезата, в няколко модела на взаимодействия между растения и патогени, включително патогенни бактерии и гъби. Бързината (от 2 HPI в някои взаимодействия) и глобалното потискане на гени, свързани с фотосинтезата в отговор на инфекция, могат да задействат растителния имунитет, основан на разгръщането на реактивни кислородни видове и тяхното взаимодействие със салициловата киселина, за да медиират алергични реакции 90,94.
В заключение, предложените механизми за защитен отговор за най-устойчивата линия (83A:476) включват бързо разпознаване на патогена от R гена (вероятно TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) и медиирана от алергичен отговор салицилова киселина и етиленова сигнализация, последвана от установяване на дългосрочен SAR. Действието се поддържа от DIR-1 протеина. Трябва да се отбележи, че биотрофният период за инфекция с C. lupini е много кратък (приблизително 2 дни), последван от некротичен растеж95. Преходът между тези етапи може да бъде свързан с некроза и експресия на етилен-индуцируеми протеини, които действат като спусъци за реакции на свръхчувствителност в растенията гостоприемници. Следователно, времевият прозорец за успешно улавяне на C. lupini в биотрофния етап е много тесен. Препрограмирането на гени, свързани с редокс и фотосинтеза, наблюдавано в 83A:476 при 6 hpi, е в съответствие с прогресията на гъбичните хифи и предвещава развитието на успешен защитен отговор в биотрофния етап. Транскриптомните отговори на Mandelup и популацията 22660 може да са твърде забавени, за да уловят гъбичките преди преминаване към некротичен растеж, но Mandelup може да е по-ефективен от популацията 22660, тъй като относително бързата регулация на PR-10 протеина насърчава хоризонталната резистентност.
ETI, задвижван от каноничния R ген, изглежда е често срещан механизъм за резистентност на боба към антракноза. По този начин, при моделното бобово растение Medicago truncatula, резистентността към антракноза се осигурява от гена RCT1, член на класа растителни R гени TIR-NBS-LRR97. Този ген също така осигурява широкоспектърна резистентност към антракноза при люцерната, когато е прехвърлен към чувствителни растения. При обикновения фасул (P. vulgaris) до момента са идентифицирани повече от две дузини гени за резистентност към антракноза. Някои от тези гени се намират в региони, в които липсват канонични R гени, но много други са разположени в краищата на хромозомите, носещи генния клъстер NBS-LRR, включително TIR-NBS-LRRs99. Геномното SSR проучване също потвърди връзката на гена NBS-LRR с резистентността към антракноза при обикновения фасул. Каноничният R ген е открит и в геномния регион, носещ основния локус за резистентност към антракноза при бялата лупина 101.
Нашата работа показва, че незабавна реакция на резистентност, активирана в ранен етап на растителната инфекция (за предпочитане не по-късно от 12 hpi), ефективно защитава теснолистната лупина от антракноза, причинена от патогенната гъба Collelotrichum lupini. Използвайки високопроизводително секвениране, ние демонстрирахме диференциални профили на експресия на гени за резистентност към антракноза в NLL растения, медиирани от гените за резистентност Lanr1 и AnMan. Успешната защита включва внимателно проектиране на гените за протеини, участващи в редокс, фотосинтеза и патогенеза, в рамките на часове след първия контакт на растението с патоген. Подобни защитни реакции, но забавени във времето, са много по-малко ефективни при защитата на растенията от болести. Резистентността към антракс, медиирана от гена Lanr1, наподобява типичния бърз отговор на R гена (ефекторно-задействан имунитет), докато генът AnMan най-вероятно осигурява хоризонтален отговор (имунитет, задействан от молекулярен модел, свързан с микроб), осигурявайки умерено ниво на устойчивост.
215-те NLL линии, използвани за скрининг на антракнозни маркери, се състоят от 74 сорта, 60 линии, получени чрез кръстосване или селекция, 5 мутанта и 76 диви или оригинални зародишни плазми. Линиите са от 17 държави, главно от Полша (58), Испания (47), Германия (27), Австралия (26), Русия (19), Беларус (7), Италия (5) и други линии от 10 държави. Наборът включва също референтни резистентни линии: 83A:476, Tanjil, Wonga, носещи алела Lanr1, и Mandelup, носещи алела AnMan. Линиите са получени от Европейската база данни за генетични ресурси на лупина, поддържана от Poznań Plant Breeding Ltd., Вятрово, Полша (Допълнителна таблица S1).
Растенията са отглеждани при контролирани условия (фотопериод 16 часа, температура 25°C през деня и 18°C ​​през нощта). Анализирани са две биологични реплики. ДНК е изолирана от триседмични листа с помощта на DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия) съгласно протокола. Качеството и концентрацията на изолираната ДНК са оценени чрез спектрофотометрични методи (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, САЩ). Анализирани са маркерът AnManM1, маркиращ гена за резистентност към антракноза AnMan (получен от сорт Mandelup), и маркерите Anseq3 и Anseq4, фланкиращи гена Lanr1 (получен от сорт Tanjil) 11,26,28. Хомозиготите за резистентния алел са оценени като „1“, чувствителните – като „0“, а хетерозиготите – като 0,5.
Въз основа на резултатите от скрининга за маркери AnManM1, AnSeq3 и AnSeq4 и наличието на семена за финални последващи експерименти, 50 NLL линии бяха избрани за фенотипизиране на устойчивост на антракноза. Анализът беше извършен в два екземпляра в компютърно контролирана оранжерия с 14-часов фотопериод с температурен диапазон от 22°C през деня и 19°C през нощта. Семената се надраскват (отрязване на семенната обвивка от противоположната страна на ембриона с остро острие) преди сеитба, за да се предотврати покойът на семената, дължащ се на твърде твърдата семенна обвивка, и да се осигури равномерно покълване. Растенията се отглеждат в саксии (11 × 11 × 21 cm) със стерилна почва (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Варшава, Полша). Инокулацията е извършена със щам Colletotrichum lupini Col-08, отгледан през 1999 г. от стъблата на теснолистни лупини, отглеждани в поле във Верженица, Великополша (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Изолатите са култивирани в SNA среда при 20°C под черна светлина в продължение на 21 дни, за да се индуцира спорулация. Четири седмици след засяването, когато растенията са достигнали стадий 4-6 листа, е извършена инокулация чрез напръскване със суспензия от конидии с концентрация 0,5 x 10⁶ конидии на ml. След инокулацията растенията са държани на тъмно в продължение на 24 часа при влажност около 98% и температура 25°C, за да се улесни покълването на конидиите и процеса на инфекция. След това растенията бяха отглеждани при 14-часов фотопериод при 22°C ден/19°C нощ и 70% влажност. Оценката на заболяването беше извършена 22 дни след инокулацията и варираше от 0 (имунно) до 9 (силно чувствително) в зависимост от наличието или отсъствието на некротични лезии по стъблата и листата. Освен това, след оценяването, беше измерено теглото на растенията. Връзките между маркерните генотипове и фенотипите на заболяването бяха изчислени като точково-двусеквенционни корелации (липса на хетерозиготни маркери в набора от линии за анализ на фенотипа на резистентност към антракноза).