Tack för att du besöker Nature.com. Webbläsarversionen du använder har begränsat CSS-stöd. För bästa möjliga upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer). Under tiden, för att säkerställa fortsatt stöd, kommer vi att rendera webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Angustifolius lupin (NLL, Lupinus angustifolius L.) är en baljväxt som används för livsmedelsproduktion och jordförbättring. Den globala expansionen av NLL som gröda har lockat till sig många patogena svampar, inklusive lupinantraknos, som orsakar den förödande antraknossjukdomen. Två alleler, Lanr1 och AnMan, som ger ökad resistens, har använts vid NLL-förädling, men de bakomliggande molekylära mekanismerna är fortfarande okända. I denna studie användes Lanr1- och AnMan-markörerna för att screena europeiska NLL-prover. Testning av vaccinet i en kontrollerad miljö bekräftade effekten av båda resistenta donatorerna. Differentiell genuttrycksprofilering utfördes på representativa resistenta och mottagliga linjer. Antraknosresistens associerades med överuttryck av genontologitermerna "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process" och "GO:0015979 Photosynthesis". Dessutom uppvisade Lanr1(83A:476)-linjen signifikant transkriptomprogrammering snabbt efter inokulering, medan de andra linjerna visade en fördröjning i detta svar på cirka 42 timmar. Försvarssvar är associerade med generna TIR-NBS, CC-NBS-LRR och NBS-LRR, 10 proteiner involverade i patogenes, lipidöverföringsproteiner, endoglukan-1,3-β-glukosidas, glycinrika cellväggsproteiner och gener från den reaktiva syrets väg. Tidiga svar på 83A:476, inklusive noggrann undertryckning av gener associerade med fotosyntes, sammanföll med framgångsrikt skydd under den vegetativa tillväxtfasen av svampbiologin, vilket tyder på att en effektor utlöser immunitet. Mandeloop-reaktionen saktas ner, liksom det totala horisontella motståndet.
Smalbladig lupin (NLL, Lupinus angustifolius L.) är en proteinrik växt med ursprung i västra Medelhavsregionen1,2. Den odlas för närvarande som livsmedelsgröda för djur och människor. Den betraktas också som gröngödsel i växtföljdssystem på grund av kvävefixering av symbiotiska kvävefixerande bakterier och en övergripande förbättring av jordstrukturen. NLL har genomgått en snabb domesticeringsprocess under det senaste århundradet och är fortfarande under högt förädlingstryck3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Med den utbredda odlingen av NLL utvecklade följden av patogena svampar nya jordbruksnischer och orsakade nya grödförstörande sjukdomar. Det mest anmärkningsvärda för lupinodlare och förädlare var uppkomsten av antraknos, orsakad av den patogena svampen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Det mest anmärkningsvärda för lupinodlare och förädlare var uppkomsten av antraknos, orsakad av den patogena svampen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогного патогного LU (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Mest anmärkningsvärt för lupinodlare och förädlare var uppkomsten av antraknos orsakad av den patogena svampen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由眀引人注目的是炭疽病的出现，它是由県它是由県(Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由眀引人注目的是炭疽病的出现，它是由県它是由県(Bondar)嵵Hårig。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенбого Collector lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Mest slående för lupinodlare och förädlare är uppkomsten av antraknos orsakad av den patogena svampen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.De tidigaste rapporterna om sjukdomen kom från Brasilien och USA, med typiska symtom som uppträdde 1912 respektive 1929. Efter cirka 30 år betecknades dock patogenen som Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf av Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld i riktad morfologi. & H. Schrenk. & H. Schrenk.och H. Schrenk. & H.施伦克，. & H.施伦克，.och H. Schlenk.Preliminär sjukdomsfenotypning som gjordes i mitten av 1900-talet visade viss resistens i NLL- och gul lupin (L. luteus L.)-anslutningar, men alla testade vita lupin (L. albus L.)-anslutningar var mycket känsliga15,16. Studier har visat att utvecklingen av antraknos är förknippad med ökad nederbörd (luftfuktighet) och temperatur (i intervallet 12-28 °C), vilket leder till en kränkning av resistensen vid högre temperaturer17, 18. Faktum är att den tid som krävdes för konidier att gro och sjukdomen att börja var fyra gånger kortare vid 24 °C (4 timmar) än vid 12 °C (16 timmar) under förhållanden med hög luftfuktighet19. Således har den pågående globala uppvärmningen lett till spridning av antraknos. Sjukdomen observerades dock i Frankrike (1982) och Ukraina (1983) som ett förebud om ett överhängande hot, men ignorerades tydligen av lupinindustrin vid den tiden20,21. Några år senare spred sig denna förödande sjukdom över hela världen och drabbade även stora lupinproducerande länder som Australien, Polen och Tyskland22,23,24. Efter ett antraknosutbrott i mitten av 1990-talet resulterade omfattande screening i identifieringen av flera resistenta donatorer i NLL19-prover. NLL-resistens mot antraknos kontrolleras av två separata dominanta alleler som finns i olika groddplasmakällor: Lanr1 i kultivaren Tanjil och Wonga och AnMan i kultivaren Mandalay25,26. Dessa alleler kompletterar de molekylära markörer som stöder selektionen av resistent groddplasma i avelsprogram25,26,27,28,29,30. Den resistenta avelslinjen 83A:476 som bar Lanr1-allelen korsades med den mottagliga vilda linjen P27255 för att erhålla en RIL-population som segregerade för antraknosresistens, vilket gjorde det möjligt att tilldela Lanr1-locuset till kromosomen NLL-1131, 32, 33. Genom att justera kopplingskartmarkörer från flankerande resistensloci till antraknos med ett genomiskt ramverk avslöjade NLL placeringen av alla tre alleler på samma kromosom (NLL-11), men i olika positioner 29, 34, 35. På grund av det lilla antalet RIL:er och det stora genetiska avståndet mellan markörer och motsvarande alleler kan dock inga tillförlitliga slutsatser dras om deras underliggande gener. Å andra sidan är användningen av omvänd genetik i lupiner svår på grund av deras mycket låga regenereringspotential, vilket gör genetisk manipulation besvärlig 37.
Utvecklingen av domesticerad groddplasma som bär den önskade allelen i homozygot tillstånd, såsom 83A:476 (Lanr1) och Mandelup (AnMan), har öppnat dörren för att studera antraknosresistens inför förekomsten av motsatta kombinationer av alleler i vilda populationer. Möjligheter till molekylära mekanismer. Jämför försvarssvar genererade av specifika genotyper. Denna studie utvärderade det tidiga transkriptomsvaret hos NLL på C. lupini-vaccination. Först screenades en europeisk NLL-groddplasmapanel innehållande 215 linjer med hjälp av molekylära markörer som markerar Lanr1- och AnMan-allelerna. Antraknosfenotypning utfördes sedan på 50 NLL-linjer, tidigare selekterade för molekylära markörer, under kontrollerade förhållanden. Baserat på dessa experiment valdes fyra linjer som skilde sig åt i antraknosresistens och Lanr1/AnMan-allelisk sammansättning för differentiell försvarsgenuttrycksprofilering med hjälp av två komplementära metoder: högkapacitets-RNA-sekvensering och realtids-PCR-kvantifiering.
Screening av en uppsättning NLL-germplasma (N = 215) med markörerna Lanr1 (Anseq3 och Anseq4) och AnMan (Anseq4) och AnMan (AnManM1) visade att endast en linje (95726, nära Salamanca-b) amplifierar "resistens"-allelen för alla markörer, medan "Förekomst av 'känsliga' alleler" fann andelen av alla markörer i 158 (~73,5%) linjer. Tretton linjer producerade två "resistenta" alleler av Lanr1-markören, och 8 linjer producerade "resistenta" alleler av Lanr1-markören. "Resistens"-allelen av AnMan-markören (kompletterande tabell S1). Två linjer var heterozygota för Anseq3-markören och en heterozygot för AnManM1-markören. 42 linjer (19,5%) bar motsatta faser av Anseq3- och Anseq4-allelerna, vilket indikerar en hög frekvens av rekombination mellan dessa två loci. Antraknosfenotyper under kontrollerade förhållanden (kompletterande tabell S2) visade variation i resistensen hos de testade genotyperna, vilket återspeglades i antraknosens svårighetsgrad. Skillnaderna i medelpoäng varierade från 1,8 (måttligt resistent) till 6,9 (känslig) och skillnaderna i växtvikt varierade från 0,62 (känslig) till 4,45 g (resistent). Det fanns en signifikant korrelation mellan värdena som observerades i två replikationer av experimentet (0,51 för sjukdomens svårighetsgrad, P = 0,00017 och 0,61 för växtvikt, P < 0,0001) samt mellan dessa två parametrar (−0,59 och −0,77, P < 0,0001). Det fanns en signifikant korrelation mellan värden som observerades i två replikationer av experimentet (0,51 för sjukdomens svårighetsgrad, P = 0,00017 och 0,61 för växtvikt, P < 0,0001) samt mellan dessa två parametrar (−0,59 och −0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 till plattformar) болезни, P = 0,00017 och 0,61 för массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59,0и <0,59,0и) 0,0001). En signifikant korrelation hittades mellan de värden som observerades i två upprepningar av experimentet (0,51 för sjukdomens svårighetsgrad, P = 0,00017 och 0,61 för växtvikt, P < 0,0001), såväl som mellan dessa två parametrar (-0,59 och -0,77, P < 0,0001) .在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分1︌P. 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77。01)P在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 为庈度 诟分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 为（鈼（（，（，，，（，，（，，，＋. 0,59 和– 0,59 和– 0,59 和–0,77，P < 0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценколе тяжя, 5, 0, 1 = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0001), och между этими двумя параметрами (-0,59 och -0,0001) 0,77, P <0,0000. Det fanns en signifikant korrelation mellan de värden som observerades i duplikat (sjukdomens svårighetsgrad 0,51, P = 0,00017 och plantvikt 0,61, P < 0,0001) och mellan dessa två parametrar (-0,59 och -0,0001) 0,77, P < 0,0001. ).Typiska symptom som ses hos mottagliga växter inkluderar knäckning och vridning av stjälken som liknar en "herdebåge"-struktur, följt av ovala lesioner med orange/rosa sporozoiter (kompletterande figur 1). Australiska accessioner som bär generna Lanr1 (83A:476 och Tanjil) och AnMan (Mandelup) är måttligt resistenta, 0,0331 och 0,0036). Vissa linjer som också bär "resistenta" Lanr1- och/eller AnMan-alleler visar symptom på sjukdomen.
Intressant nog uppvisade ett fåtal NLL-linjer som saknade någon "resistent" markörallel en hög nivå av antraknosresistens (jämförbar med eller högre än för Lanr1- eller AnMan-genotyper), såsom Boregine (P-värde < 0,0001 för båda parametrarna), Bojar (P-värde < 0,0001 för poäng och 0,001 för växtvikt) och population B-549/79b (P-värde < 0,0001 för poäng och icke-signifikant för vikt). Intressant nog uppvisade ett fåtal NLL-linjer som saknade någon "resistent" markörallel en hög nivå av antraknosresistens (jämförbar med eller högre än för Lanr1- eller AnMan-genotyper), såsom Boregine (P-värde < 0,0001 för båda parametrarna), Bojar (P-värde < 0,0001 för poäng och 0,001 för växtvikt) och population B-549/79b (P-värde < 0,0001 för poäng och icke-signifikant för vikt). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, покасазали вы устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (från <0,000) параметров), Bojar (försäljning P < 0,0001 för оценки и 0,001 для массы растения) och популяции B-549/79b (försäljning P <0,0001 för оценки и незначимо для массы). Intressant nog uppvisade flera NLL-linjer som saknade någon "resistent" markörallel en hög nivå av resistens mot antraknos (jämförbar med eller högre än för Lanr1- eller AnMan-genotyper), såsom Boregine (P-värde < 0,0001 för båda parametrarna), Bojar (P-värde < 0,0001 för utvärdering och 0,001 för växtvikt) och population B-549/79b (P-värde < 0,0001 för utvärdering och inte signifikant för vikt).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的瀅疈1或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分为0,0001，植物重量为0,001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，逍昍昂一，重量 Det är intressant att vissa NLL-system som inte har några "antigena" markörer uppvisar hög horisontell resistens (motsvarande Lanr1- eller AnMan-gener eller högre), såsom Boregine (båda parametrarna P < 0,0001), Bojar (P-värde < 0,0001, växtvikt 0,001) och stam B-549/79b (P-värde < 0,0001, vikt inte signifikant). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», покасазаливи устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P för Boregine, для обоих,00рпаов), (förvärv P <0,0001, maximipris 0,001) och B-549/79b (försäljningsvärde <0,0001, масса незначительна). Intressant nog uppvisade vissa NLL-linjer som saknade några "resistens"-marköralleler höga nivåer av antraknosresistens (jämförbar med eller högre än Lanr1- eller AnMan-genotyperna), såsom Boregine (P-värde för båda parametrarna <0,0001), Bojar (P-värde <0,0001, plantvikt 0,001) och population B-549/79b (P-värde <0,0001, vikt inte signifikant).Detta fenomen antyder möjligheten av en ny genetisk resistenskälla, vilket förklarar den observerade bristen på korrelation mellan markörgenotyper och sjukdomsfenotyper (P-värden från ~0,42 till ~0,98). Kolmogorov-Smirnov-testet visade således att data om antraknosresistens var ungefär normalfördelade för poäng (P-värden 0,25 och 0,11) och växtmassa (P-värden 0,47 och 0,55), vilket tyder på att jag antar att fler alleler än Lanr1 och AnMan är involverade.
Baserat på resultaten av screening för antraknosresistens valdes fyra linjer ut för transkriptomanalys: 83A:476, Boregine, Mandelup och population 22660. Dessa linjer testades om för mjältbrandsresistens i inokuleringsexperiment genom RNA-sekvensering, förutsatt att de var desamma som i föregående test. Poängvärdena var följande: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) och population 22660 (6,11 ± 1,29).
Illumina NovaSeq 6000-protokollet uppnådde i genomsnitt 40,5 Mread-par per prov (29,7 till 54,4 Mreads) (kompletterande tabell S3). Justeringspoängen i referenssekvensen varierade från 75,5 % till 88,6 %. Den genomsnittliga korrelationen av läsräkningsdata mellan experimentella varianter mellan biologiska replikat varierade från 0,812 till 0,997 (medelvärde 0,959). Av de 35 170 analyserade generna uppvisade 2917 inget uttryck, och de övriga 4785 generna uttrycktes på försumbar nivå (basmedelvärde < 5). Av de 35 170 analyserade generna uppvisade 2917 inget uttryck, och de övriga 4785 generna uttrycktes på försumbar nivå (basmedelvärde < 5). Från 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировалис уровне (базовое среднее <5). Av de 35 170 analyserade generna visade 2917 inget uttryck, och de återstående 4785 generna uttrycktes på en försumbar nivå (basmedelvärde <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）.35 170 Från 35 170 miljoner kronor 2917 inga pengar, och 4785 miljoner kronor är inte tillgängliga ( среднее значение <5). Av de 35 170 analyserade generna uttrycktes 2917 inte och de återstående 4785 generna hade försumbar uttryckning (basmedelvärde <5).Således var antalet gener som ansågs uttryckta (basmedelvärde ≥ 5) under experimentet 27 468 (78, 1%) (kompletterande tabell S4).
Från den första tidpunkten svarade alla NLL-linjer på inokuleringen av C. lupini (stam Col-08) genom att omprogrammera transkriptomet (tabell 1), men signifikanta skillnader observerades mellan linjerna. Således uppvisade resistenslinjen 83A:476 (som bär Lanr1-genen) signifikant transkriptomprogrammering vid den första tidpunkten (6 hpi) med en 31-69-faldig ökning av antalet isolerade upp- och nedgener jämfört med andra tidpunkter vid denna tidpunkt. Dessutom var denna topp kortlivad, eftersom uttrycket av endast ett fåtal gener förblev signifikant förändrat vid den andra tidpunkten (12 hpi). Intressant nog genomgick Boregine, som också visade en hög nivå av resistens i transplantattestet, inte en sådan massiv transkriptionell omprogrammering under experimentet. Antalet differentiellt uttryckta gener (DEG) var dock detsamma för Boregine och 83A:476 vid 12 hpi. Både Mandelup och population 22660 uppvisade DEG-toppar vid den sista tidpunkten (48 l/s), vilket indikerar en relativ fördröjning i försvarsresponserna.
Eftersom 83A:476 genomgick massiv transkriptomprogrammering som svar på C. lupini vid 6 HPI jämfört med alla andra linjer, var ~91 % av de DEG som observerades vid denna tidpunkt härstamningsspecifika (Fig. 1). Det fanns dock en viss överlappning i tidiga svar mellan studielinjer, eftersom 68,5 %, 50,9 % respektive 52,6 % DEG i Boregine, Mandelup och population 22660 överlappade med de som hittades i 83A:476 vid vissa tidpunkter. Dessa DEG stod dock endast för en liten andel (0,97–1,70 %) av alla DEG som för närvarande detekteras med 83A:476. Dessutom var 11 DEG från alla linjer koherenta vid denna tidpunkt (kompletterande tabeller S4-S6), inklusive gemensamma komponenter i växternas försvarsresponser: lipidöverföringsprotein (TanjilG_32225), endoglukan-1,3-β-glukosidenzym (TanjilG_23384), två stressinducerbara proteiner som SAM22 (TanjilG_31528 och TanjilG_31531), basiskt latexprotein (TanjilG_32352) och två glycinrika strukturella cellväggsproteiner (TanjilG_19701 och TanjilG_19702). Det fanns också en relativt hög överlappning i transkriptomresponser mellan 83A:476 och Boregine vid 24 HPI (totalt 16-38% DEG) och mellan Mandelup och population 22660 vid 48 HPI (totalt 14-20% DEG).
Venn-diagram som visar antalet differentiellt uttryckta gener (DEG) i smalbladiga lupinlinjer (NLL) inokulerade med Colletotrichum lupini (stam Col-08 erhållen från lupinfält i Wierzhenice, Polen, 1999). De analyserade NLL-linjerna var: 83A:476 (resistent, bärande på Lanr1-allelen), Boregine (resistent, genetisk bakgrund okänd), Mandelup (måttligt resistent, bärande på AnMan-allelen) och population 22660 (mycket mottaglig). Förkortningen hpi står för timmar efter vaccination. Nollvärden har tagits bort för att förenkla grafen.
Uppsättningen av överuttryckta gener vid 6 hpi analyserades med avseende på närvaron av kanoniska R-gendomäner (kompletterande tabell S7). Denna studie visade transkriptominduktion av klassiska sjukdomsresistensgener med NBS-LRR-domäner endast vid 83A:476. Denna uppsättning bestod av en TIR-NBS-LRR-gen (tanjilg_05042), fem CC-NBS-LRR-gener (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 och tanjilg_16162), och fyra NBS-LR, Tanjilg_16162), och fyra NBS-LRRE (tanjilg_16162) samt fyra NBS-Lrr (tanjilg_16162) och fyra NBS-LRR (TANJILG_16162). Alla dessa gener har kanoniska domäner arrangerade i konserverade sekvenser. Förutom NBS-LRR-domängenerna aktiverades flera RLL-kinaser vid 6 hpi, nämligen en i Boregine (TanjilG_19877), två i Mandelup (TanjilG_07141 och TanjilG_19877) och i population 22660 (TanjilG_09014 och TanjilG_10361) och två i 83A 27:476.
Gener med signifikant förändrat uttryck som svar på inokulering med C. lupini (stam Col-08) utsattes för Gene Ontology (GO) anrikningsanalys (kompletterande tabell S8). Den oftast överrepresenterade biologiska processtermen var ”GO:0006952 defense response” (GO:0006952 försvarsrespons) som förekom i 6 av 16 (tid × linje) kombinationer med hög signifikans (P-värde < 0,001) (Fig. 2). Den oftast överrepresenterade biologiska processtermen var ”GO:0006952 defense response” (GO:0006952 försvarsrespons) som förekom i 6 av 16 (tid × linje) kombinationer med hög signifikans (P-värde < 0,001) (Fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитнеты», отвор появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (sänkt P <0,001) (рис. 2). Den oftast överrepresenterade biologiska processtermen var 'GO:0006952 defense response', vilken förekom i 6 av 16 (tid × härstamning) kombinationer med hög signifikans (P-värde < 0,001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）. Den mest representativa biologiska processtermen är "GO:0006952 defense response", vilken förekommer i 6 av de 16 (时间×线) kombinationerna, med hög signifikans (P-värde < 0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defence Response», косторвыв16 золя з 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Den oftast överrepresenterade biologiska processtermen var 'GO:0006952 Defense Response', vilken förekom i 6 av 16 kombinationer (tid × linje) med hög signifikans (P-värde < 0,001) (Fig. 2).Denna term var överrepresenterad vid två tidpunkter i 83A: 476 och Boregine (6 respektive 24 hpi) och vid en tidpunkt i Mandelup och Population 22660 (12 respektive 6 hpi). Detta är ett förväntat resultat som belyser det svampdödande svaret hos de resistenta linjerna. Dessutom svarade 83A:476 på C. lupini genom att snabbt inducera gener relaterade till den oxidativa utbrott som representeras av termen "GO:0055114 redoxprocess", vilket indikerar ett specifikt försvarssvar, medan Boregine uppvisade specifika försvarssvar relaterade till termen 'GO'. :0006950 Stressrespons”. Population 22660 aktiverade det horisontella resistensresponset som involverar sekundära metaboliter, vilket belyser det stora antalet termer ”GO:0016104 Process of triterpene biosynthesis” och ”GO:0006722 Process of triterpene metabolism” (båda termerna tillhör samma uppsättning gener). Med hänsyn till resultaten av GO-termanrikningsanalysen låg Mandelup-reaktionens stabilitet mellan Boregine och population 22660. Dessutom inkluderar tidig reaktion 83A:476 (6 hpi) och fördröjd reaktion Mandelup och population 22660 termen GO:0015979 'fotosyntes' och andra relaterade biologiska processer.
De bioprocessgenontologitermer som valts ut i annoteringen av differentiellt uttryckta gener under transkriptomresponser hos smalbladig lupin (NLL) inokulerad med mjältbrandslupin (Col-08-stam erhållen från lupinfält i Wierzhenice, Polen, år 1999) är kraftigt överdrivna. De analyserade NLL-linjerna var: 83A:476 (resistent, bärande på den homozygota Lanr1-allelen), Boregine (resistent, okänd genetisk bakgrund), Mandelup (måttligt resistent, bärande på den homozygota AnMan-allelen) och population 22660 (känslig).
Eftersom denna studie syftade till att identifiera gener som bidrar till antraknosresistens, analyserades generna som tilldelats termerna GO "GO: 0006952 Defensive responses" och "GO: 0055114 Redox processes" med gränsvärden eftersom baslinjemedelvärden ≥ 30 med minst en linje × tidpunkt kombinerat statistiskt signifikanta värden för log2 (faldig förändring). Antalet gener som uppfyllde dessa kriterier var 65 för GO:0006952 och 524 för GO:0055114.
83A:476 avslöjade två DEG-toppar annoterade med termen GO:0006952, den första vid 6 gener per tum (64 gener, upp- och nedreglering) och den andra vid 24 gener per tum (15 gener, endast uppreglering). Boregine visade också att GO:0006952 nådde sin topp vid samma tidpunkt, men med mindre DEG (11 och 8) och preferentiell aktivering. Mandeloop visade två toppar av GO:0006952 vid 12 och 48 HPI, båda bärande på 12 gener (den första med aktiverande gener och den andra med endast suppressiva gener), medan 22660-populationen vid 6 HPI (13 gener) hade en större övervikt av den ökande toppregleringen. Det bör noteras att 96,4 % av GO:0006952 DEG i dessa toppar hade samma typ av respons (upp eller ner), vilket indikerar en signifikant överlappning i försvarsresponser trots skillnader i antalet involverade gener. Den största gruppen av sekvenser relaterade till termen GO:0006952 kodar för Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-liknande), som tillhör klass 10 patogenesassocierat protein (PR-10) proteinklad och kärnproteinlatexen. liknande (MLP-liknande) protein) (Fig. 3). De två grupperna skilde sig åt i uttryckets natur och responsens riktning. Generna som kodar för SAM22-liknande proteiner uppvisade konsekvent och signifikant induktion vid tidiga tidpunkter (6 eller 12 hpi) och var generellt oresponsiva vid slutet av experimentet (48 hpi), medan MLP-liknande proteiner uppvisade koordination vid 6 hpi. hpi. 83A:476 och Mandelup vid 48 hp/in, var nästan alla andra datapunkter oresponsiva. Dessutom följde skillnader i uttrycksprofiler för SAM22-liknande proteingener observerad variation i antraknosresistens, eftersom mer resistenta linjer hade fler tidpunkter som signifikant inducerade dessa gener än mer mottagliga gener. En annan LlR18A/B-liknande PR-10-gen uppvisade ett mycket liknande uttrycksmönster som den SAM22-liknande proteingenen.
Huvudkomponenterna i den biologiska processtermen "GO:0006952 Defense Response" och uttrycksmönstren för kandidatgener för Lanr1- och AnMan-allelerna identifierades. Log2-skalan representerar log2-värden (faldig förändring) mellan inokulerade (Colletotrichum lupini, stam Col-08, erhållen från lupinfält, Wizhenica, Polen, 1999) och kontrollplantor (sham-inokulerade) vid samma tidpunkt. Följande smalbladiga lupinlinjer analyserades: 83A:476 (resistent, bär den homozygota Lanr1-allelen), Boregine (resistent, genetisk bakgrund okänd), Mandelup (måttligt resistent, bär den homozygota AnMan-allelen) och population 22660 (känslig).
Dessutom utvärderades uttrycksprofilerna för RNA-sekvenseringskandidatgenerna Lanr1 (TanjilG_05042) och AnMan (TanjilG_12861) (Fig. 3). TanjilG_05042-genen visade ett signifikant svar (aktivering) vid 83A:476 endast vid den första tidpunkten (6 hpi), medan TanjilG_12861 var signifikant i Mandeloop endast vid två tidpunkter: 6 hpi (nedreglering) och 24 hpi (6 hpi). Med.). justerbar) ).
De mest överuttryckta generna i termen GO:0055114 "redoxprocess" var gener som kodar för cytokrom P450-proteiner och peroxidas (Fig. 4). För prover isolerade från 83A:476 vid 6 HPI observerades generellt maximala eller minimala log2-värden (fold change) (för 86,6 % av generna) mellan inokulerade och kontrollplantor, vilket belyser den höga responsen hos denna genotyp på inokulerande kön. 83A:476 visade den mest signifikanta GO:0055114 DEG vid 6 hpi (503 gener), medan resten av linjerna vid 48 hpi (Boregine, 31 gener; Mandelup, 85 gener; och Population 22660, 78 gener)). I de flesta gener i GO:0055114-familjen observerades två typer av responser på vaccination (aktivering och hämning). Intressant nog identifierades upp till 97,6 % av de DEG:er som identifierades för termen GO: 0055114 i Mandelupe vid 48 hp. Dessa observationer tyder på att, trots den betydligt mindre skalan (dvs. antalet muterade redoxgener, 85 mot 503), liknar mönstret av fördröjda transkriptomresponser hos mandeloup på antraknos det tidiga svaret hos 83A:476. I Boregine och Population 22660 är denna konvergens lägre, 51,6 % respektive 75,6 %.
Uttrycksmönstren för huvudkomponenterna i termen för den biologiska processen "GO:0055114 Redoxprocess" avslöjades. Log2-skalan representerar log2-värden (faldig förändring) mellan inokulerade (Colletotrichum lupini, stam Col-08, erhållen från lupinfält, Wizhenica, Polen, 1999) och kontrollplantor (sham-inokulerade) vid samma tidpunkt. Följande smalbladiga lupinlinjer analyserades: 83A:476 (resistent, bär den homozygota Lanr1-allelen), Boregine (resistent, genetisk bakgrund okänd), Mandelup (måttligt resistent, bär den homozygota AnMan-allelen) och population 22660 (känslig).
83A:476 Transkriptomiska svar på inokulering med C. lupini (stam Col-08) inkluderade också koordinerad tystning av gener som tillskrivs termen GO:0015979 "fotosyntes" och andra relaterade biologiska processer (FIG. 5). Denna GO:0015979 DEG-uppsättning innehöll 105 gener som var signifikant undertryckta vid 6 hpi vid 83A:476. I denna delmängd var 37 gener också nedreglerade i Mandelup vid 48 HPI och 35 vid samma tidpunkt i 22660-populationen, inklusive 19 DEG gemensamma för båda genotyperna. Inga DEG relaterade till termen GO: 0015979 aktiverades signifikant i någon kombination (linje x tid).
Uttrycksmönstren för huvudkomponenterna i termen för den biologiska processen "GO:0015979 Fotosyntes" avslöjades. Log2-skalan representerar log2-värden (faldig förändring) mellan inokulerade (Colletotrichum lupini, stam Col-08, erhållen från lupinfält, Wizhenica, Polen, 1999) och kontrollplantor (sham-inokulerade) vid samma tidpunkt. Följande smalbladiga lupinlinjer analyserades: 83A:476 (resistent, bär den homozygota Lanr1-allelen), Boregine (resistent, genetisk bakgrund okänd), Mandelup (måttligt resistent, bär den homozygota AnMan-allelen) och population 22660 (känslig).
Baserat på resultaten av differentiell expressionsanalys och förmodligen involverad i försvarssvar mot patogena svampar, valdes denna uppsättning av sju gener för kvantifiering av expressionsprofiler genom realtids-PCR (kompletterande tabell S9).
Den förmodade proteingenen TanjilG_10657 inducerades signifikant i alla studerade linjer och tidpunkter jämfört med kontroll- (härmande) växter (kompletterande tabeller S10, S11). Dessutom visade uttrycksprofilen för TanjilG_10657 en ökande trend under experimentets gång för alla linjer. Population 22660 visade den högsta känsligheten för TanjilG_10657 för inokulering med 114-faldig aktivering och den högsta relativa uttrycksnivån (4,4 ± 0,4) vid 24 HPI (Fig. 6a). PR10 LlR18A-proteingenen TanjilG_27015 visade också aktivering över alla linjer och tidpunkter, med statistisk signifikans vid de flesta datapunkter (Fig. 6b). I likhet med TanjilG_10657 observerades den högsta relativa uttrycksnivån för TanjilG_27015 i den inokulerade populationen med 22660 vid 24 HPI (19,5 ± 2,4). Suraendokitinasgenen TanjilG_04706 var signifikant uppreglerad i alla linjer och vid alla tidpunkter förutom för Boregine 6 hpi (Fig. 6c). Den inducerades starkt vid den första tidpunkten (6 HPI) vid 83A:476 (med 10,5 gånger) och ökade måttligt i andra linjer (med 6,6-7,5 gånger). Under experimentet förblev uttrycket av TanjilG_04706 på liknande nivåer i 83A:476 och Boregine, medan det i Mandelup och population 22660 ökade signifikant och nådde relativt höga värden (5,9 ± 1,5 respektive 6,2 ± 1,5). Den endoglukan-1,3-β-glukosidasliknande genen TanjilG_23384 visade hög aktivering vid de två första tidpunkterna (6 och 12 hpi) i alla linjer utom population 22660 (Fig. 6d). De högsta relativa uttrycksnivåerna av TanjilG_23384 observerades vid den andra tidpunkten (12 hpi) i Mandelup (2,7 ± 0,3) och 83A:476 (1,5 ± 0,1). Vid 24 HPI var TanjilG_23384-uttrycket relativt lågt i alla studerade linjer (från 0,04 ± 0,009 till 0,44 ± 0,12).
Uttrycksprofiler för utvalda gener (ag) avslöjade med kvantitativ PCR. Siffrorna 6, 12 och 24 representerar timmar efter vaccination. Generna LanDExH7 och LanTUB6 användes för normalisering och LanTUB6 användes för kalibrering mellan serier. Felstaplar representerar standardavvikelsen baserat på tre biologiska replikat, där vart och ett är medelvärdet av tre tekniska replikat. Den statistiska signifikansen av skillnader i uttrycksnivåer mellan de inokulerade (Colletotrichum lupini, stam Col-08, erhållen 1999 från lupinfältet i Wierzenica, Polen) och kontrollplantorna (skickinokulerade) är markerade ovanför datapunkterna (*P-värde < 0,05, **P-värde ≤ 0,01, ***P-värde ≤ 0,001). Den statistiska signifikansen av skillnader i uttrycksnivåer mellan de inokulerade (Colletotrichum lupini, stam Col-08, erhållen 1999 från lupinfältet i Wierzenica, Polen) och kontrollplantorna (skickinokulerade) är markerade ovanför datapunkterna (*P-värde < 0,05, **P-värde ≤ 0,01, ***P-värde ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-09 пг. поля люпина в Верженице, Польша) och контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена надих точка 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Statistiskt signifikanta skillnader i uttrycksnivåer mellan inokulerade (Colletotrichum lupini, stam Col-08, erhållen 1999 från ett lupinfält i Wierzhenice, Polen) och kontrollplantor (sham-inokulerade) noteras ovanför datapunkterna (*P-värde < 0,05, **P-värde ≤ 0,01, ***P-värde ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在繰标记在繰（ 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 撌 鯹煤照 缈水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤01) 。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, пый люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) och контрольными (ложно инокулированными) растениями отмеченды (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Statistiskt signifikanta skillnader i uttrycksnivåer mellan inokulerade (Colletotrichum lupini, stam Col-08, erhållen från lupinfält i Verzhenice, Polen, år 1999) och kontrollplantor (sham-inokulerade) noteras ovanför datapunkterna (*P-värde < 0,05, **P-värde ≤ 0,01, ***P-värde ≤ 0,001).De analyserade NLL-linjerna var: 83A:476 (resistenta, bärande på den homozygota Lanr1-allelen), Mandelup (måttligt resistenta, bärande på den homozygota AnMan-allelen), Boregine (resistenta, okänd genetisk bakgrund) och population 22660 (känsliga).
Kandidatgenen TanjilG_05042 vid Lanr1-locuset uppvisade ett markant annorlunda uttrycksmönster än de profiler som erhölls från RNA-sekvenseringsstudier (Fig. 6e). Signifikant aktivering av denna gen observerades i Mandelup och 22660-populationen (upp till 39,7 respektive 11,7 gånger), vilket resulterade i relativt höga uttrycksnivåer (upp till 1,4 ± 0,14 respektive 7,2 ± 1,3). 83A:476 avslöjade också viss uppreglering av TanjilG_05042-genen (upp till 3,8-faldigt), men de relativa uttrycksnivåerna som uppnåddes (0,044 ± 0,002) var mer än 30 gånger lägre än de som observerades i Mandelup och 22660-populationen. Analys med qPCR visade signifikanta skillnader i uttrycksnivåer mellan genotyper i mockvaccinerade (kontroll) varianter, med en 58-faldig skillnad mellan populationerna 22660 och 83A:476, samt mellan populationerna 22660 och 22660. En tvåfaldig skillnad uppnåddes mellan Boregine och Mandalup.
Kandidatgenen vid AnMan-locuset, TanjilG_12861, aktiverades som svar på vaccination i 83A:476 och Mandelup, var neutral i 22660-populationen och var nedreglerad i Boregine (Fig. 6f). Det relativa uttrycket av TanjilG_12861-genen var det högsta i inokulerad 83A:476 (0,14 ± 0,01). 17,4 kDa klass I värmechockproteingenen TanjilG_05080 HSP17.4 visade lägre relativa uttrycksnivåer i alla studerade stammar och tidpunkter (Fig. 6g). Det högsta värdet observerades vid 24 HPI i 22660-populationen (0,14 ± 0,02, en åttafaldig ökning som svar på vaccination).
Jämförelse av genuttrycksprofiler (Fig. 7) visade en hög korrelation mellan TanjilG_10657 och fyra andra gener: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) och TanjilG_04706 (r = 0,79). Sådana resultat kan indikera samreglering av dessa gener under försvarsreaktioner. TanjilG_12861- och TanjilG_23384-generna uppvisade olika uttrycksprofiler med lägre Pearson-korrelationskoefficientvärden (från 0,08 till 0,43 respektive -0,19 till 0,28) jämfört med andra gener.
Korrelationer mellan genuttrycksprofiler detekterades med kvantitativ PCR. Följande smalbladiga lupinlinjer analyserades: 83A:476 (resistent, bärande på den homozygota Lanr1-allelen), Mandelup (måttligt resistent, bärande på den homozygota AnMan-allelen), Boregine (resistent, genetisk bakgrund okänd) och population 22660 (känslig). Tre tidpunkter beräknades (6, 12 och 24 timmar efter inokulering), inklusive inokulerade (Colletotrichum lupini, stam Col-08, erhållen från lupinfält i Wierzhenice, Polen, 1999) och kontrollplantor (sham-inokulerade). Skalan visar värdet på Pearson-korrelationskoefficienten.
Baserat på data erhållna vid 6 hästkrafter per tum, utfördes WGCNA på 9981 DEG identifierade genom att jämföra inokulerade och kontrollplantor för att fokusera på tidiga försvarssvar (kompletterande tabell S12). Tjugotvå genmoduler (kluster) hittades med korrelerade (positiva eller negativa) uttrycksprofiler mellan genotyper och experimentella varianter. I genomsnitt var genuttrycksnivåerna fallande i ordning 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (i båda varianterna var dock denna trend starkare i kontrollplantorna). I genomsnitt var genuttrycksnivåerna fallande i ordning 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (i båda varianterna var dock denna trend starkare i kontrollplantorna). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Befolkning 22660 (в обоих вариантах, вариантах тенденция была сильнее у контрольных растений). I genomsnitt minskade genuttrycksnivåerna i storleksordningen 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (i båda varianterna var dock denna trend starkare i kontrollplantorna).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Befolkning 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> befolkning 22660 的 顺序 下降 （， 県 噿在 在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。... В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Befolkning 22660 была сильнее у контрольных растений). I genomsnitt minskade genuttrycksnivåerna i serien 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (dock var denna trend starkare i kontrollplantorna i båda varianterna).Vaccination resulterade i uppreglering av genuttryck, särskilt i modulerna 18, 19, 14, 6 och 1 (i fallande effektordning), negativ reglering (t.ex. modulerna 9 och 20) eller med neutrala effekter (t.ex. modulerna 11, 22, 8 och 13). GO-termanrikningsanalys (kompletterande tabell S13) avslöjade "GO: 0006952 Protective responses" för den inokulerade modulen (18) med maximal aktivering, inklusive gener analyserade med qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 och TanjilG_27015), såväl som många av de mest undertryckta fotosyntesmodulerna (9). Modul 18-koncentratorn (Fig. 8) identifierades som TanjilG_26536-genen som kodar för det PR-10-liknande LlR18B-proteinet, och modul 9-koncentratorn identifierades som TanjilG_28955-genen som kodar för fotosystem II PsbQ-proteinet. En kandidat för antraknosresistensgenen Lanr1, TanjilG_05042, hittades i modul 22 (Fig. 9) och är associerad med termerna "GO:0044260 Cellular macromolecular metabolic processes" och "GO:0006355 Transcriptional regulation, DNA templating" som bär TanjilG_01212-hubben. Genen kodar för värmestresstranskriptionsfaktor A-4a (HSFA4a).
Viktad nätverksanalys av gen-samuttryck av moduler med överrepresenterade biologiska processtermer "GO: 0006952 Försvarsresponser". Ligering förenklades för att belysa de fyra gener som analyserats med qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 och TanjilG_27015).
Viktad nätverksanalys av gen-samuttryck av en modul med en överrepresenterad biologisk processterm "GO: 0006355: Transkriptionsreglering, DNA-mallering" och bärande på en kandidat för antraknosresistensgenen Lanr1 TanjilG_05042. Ligeringen förenklades för att isolera TanjilG_05042-genen och den centrala TanjilG_01212-genen.
Resistensscreening för antraknos som samlats in i Australien visade att de flesta av de tidigt släppta sorterna var mottagliga; Kalya, Coromup och Mandelup har beskrivits som måttligt resistenta, medan Wonga, Tanjil och 83A:476 har beskrivits som mycket resistenta26,27,31. hade samma resistensallel, betecknad Lanr1, och Coromup och Mandelup hade en annan allel, betecknad AnMan10,26,39, medan Kalya förde vidare en annan allel, Lanr2. Screening för antraknosresistens i Tyskland resulterade i identifieringen av en resistent linje Bo7212 med en annan kandidatallel än Lanr1, betecknad LanrBo36.
Vår studie visade en mycket låg frekvens (cirka 6 %) av Lanr1-allelen i den testade groddplasman. Denna observation överensstämmer med resultaten av screening av östeuropeisk groddplasma med hjälp av markörerna Anseq3 och Anseq4, vilket visade att Lanr1-allelen endast finns i två vitryska linjer. Detta tyder på att Lanr1-allelen ännu inte används i stor utsträckning av lokala avelsprogram, till skillnad från i Australien, där den är en av de viktigaste allelerna för markörassisterad avel. Detta kan bero på den lägre resistensnivån som Lanr1-allelen ger under europeiska fältförhållanden jämfört med den australiska rapporten. Dessutom har studier av antraknos i områden med hög regnmängd i Australien visat att resistensreaktioner medierade av Lanr1-allelen kanske inte är effektiva i väderförhållanden som gynnar tillväxt och snabb utveckling av patogenen19,42. Faktum är att i den aktuella studien observerades även vissa symtom på antraknos hos genotyper som bär Lanr1-allelen, vilket tyder på att resistensen kan försvinna under optimala förhållanden för utvecklingen av C. lupini. Dessutom är falskt positiva tolkningar av närvaron av Anseq3- och Anseq4-markörerna, vilka är ungefär 1 cM från Lanr1-locuset, möjliga 28,30,43.
Vår studie visade att 83A:476, som bar på Lanr1-allelen, svarade på C. lupini-inokulering med storskalig transkriptomprogrammering vid den första analyserade tidpunkten (6 hpi), medan transkriptomiska svar observerades mycket senare i Mandelup, som bar på AnMan-allelen (från 24 till 48 hpi). Dessa tidsmässiga variationer i försvarssvar är förknippade med skillnader i sjukdomssymtom, vilket belyser vikten av tidig patogenigenkänning för ett framgångsrikt svar på resistens. För att infektera växtvävnad måste mjältbrandsporer genomgå flera utvecklingsstadier på värdytan, inklusive groning, celldelning och bildning av ett appressorium. Ett bihang är en infektiös struktur som fäster vid värdens yta och underlättar penetration in i värdvävnaderna. Således uppvisade sporer av C. gloeosporioides i ärtextrakt den första delningen av kärnan efter 75–90 minuters inkubation, bildandet av ett groddrör efter 90–120 minuter och undertryckande efter 4 timmar. Mango C. gloeosporioides visade mer än 40 % konidialgroning efter 3 timmars inkubation och cirka 20 % bildning av pressorer efter 4 timmar. Den virulensassocierade CAP20-genen hos C. gloeosporioides visade transkriptionell aktivitet i epifytbildande konidier efter 3,5 timmars inkubation i avokadoytvax med höga koncentrationer av CAP20-protein efter 4 timmar och 46 minuter. På liknande sätt inducerades aktiviteten hos melaninbiosyntesgener i C. trifolii under en 2-timmars inkubation följt av bildandet av ett appressorium efter 1 timme. Studier av bladvävnader har visat att jordgubbar inokulerade med C. acutatum har första hämning vid 8 hpi, medan tomater inokulerade med C. coccodes har första hämning vid 4 hpi48,49. Vilket i stort sett överensstämmer med tidsskalan för Colletotrichum spp.:s infektionsprocess. Snabba försvarssvar på 83A:476 tyder på involvering av växtresistens och effektorutlösta immunitetsgener (ETI) i denna linje, medan Mandelups fördröjda svar stöder hypotesen om mikroassocierad molekylär mönsterutlöst immunitet (MTI) 50. Tidiga svar på 83A:476 och Mandelup. Den partiella överlappningen mellan upp- eller nedreglerade gener i fördröjt svar stöder också detta koncept, eftersom ETI ofta anses vara ett accelererat och förstärkt MTI-svar som kulminerar i programmerad celldöd vid infektionsstället, känt som anafylaktisk chock 51,52.
De flesta gener som tillskrivs den överrepresenterade termen Gene Ontology GO:0006952 "Defense Response" är de 11 homologerna till det stressinducerade fastemeddelandeproteinet 22 (liknande SAM22) och de sju huvudsakliga latexproteinliknande proteinerna (MLP). -liknande proteinerna 31, 34, 43 och 423 uppvisade sekvenslikhet. SAM22-liknande gener uppvisade signifikant aktivering som varade längre, vilket visade ökade nivåer av antraknosresistens (83A:476 och Boregine). Emellertid nedreglerades MLP-liknande gener endast i linjer som bar kandidatresistensallelen (83A:476/Lanr1 vid 6 hpi och Mandelup/AnMan vid 24 hpi). Det bör noteras att alla identifierade SAM22-liknande homologer härstammar från ett genkluster som sträcker sig över cirka 105 kb, medan MLP-liknande gener härstammar från separata regioner i genomet. Koordinerad aktivering av sådana SAM22-liknande gener hittades också i vår tidigare studie av NLL-resistens mot Diaporthetoxica-inokulering, vilket tyder på att de är involverade i de horisontella komponenterna i försvarssvaret. Denna slutsats stöds också av rapporter om ett positivt svar av SAM22-liknande gener på skada eller behandling med salicylsyra, svampinducerare eller väteperoxid.
MLP-liknande gener har visat sig reagera på olika abiotiska och biotiska stressfaktorer, inklusive bakteriella, virala och patogena svampinfektioner hos många växtarter55. Responsriktningarna på vissa interaktioner mellan växter och patogener varierade från starkt ökande (dvs. under angrepp av bomull med Verticillium dahliae) till signifikant minskande (dvs. efter infektion av äppelträd med Alternaria spp.)56,57. Signifikant nedreglering av den MLP-liknande 423-genen har observerats under avokadoförsvar mot F. niger-infektion och under infektion av äppelträdet Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola och Alternaria alternata är äppelpatotyper58,59. Dessutom hade äppelkalli som överuttryckte den MLP-liknande 423-genen lägre uttryck av resistensassocierade gener och var mer mottagliga för svampinfektion59. Efter Fusarium oxysporum f undertrycktes även den MLP-liknande 423-genen i resistent vanlig böngrönplasma. cn. Böninfektion 60.
Andra medlemmar av PR-10-familjen som identifierades i vår RNA-sekvenseringsstudie var LlR18A- och LlR18B-generna som svar på uppreglering, såväl som den uppreglerade (1 gen) eller nedreglerade (3 gener) genen för lipidöverföringsproteinet DIR1. Dessutom framhäver WGCNA LlR18B-genen som ett nav i denna modul, vilken är mycket mottaglig för vaccination och bär på flera skyddande responsgener. LlR18A- och LlR18B-generna inducerades i gula lupinblad som svar på patogena bakterier, såväl som i NLL-stjälkar efter inokulering av D. toxica, medan rishomologen till dessa gener, RSOsPR10, snabbt inducerades av en svampinfektion som förmodligen är involverad i jasmonsyrasignalvägen 53,61, 62. DIR1-genen kodar för ospecifika lipidtransportproteiner som krävs för uppkomsten av systemisk förvärvad resistens (SAR). Med utvecklingen av skyddande reaktioner transporteras DIR1-proteinet från infektionsfokus genom floemet för att inducera SAR i avlägsna organ. Intressant nog inducerades TanjilG_02313 DIR1-genen signifikant vid den första tidpunkten i linje 84A:476 och population 22660, men antraknosresistens utvecklades framgångsrikt endast i linje 84A:476. Detta kan indikera viss subfunktionalisering av DIR1-genen i NLL, eftersom de återstående tre homologerna endast svarade på inokulering i linjen 83A:476 vid 6 hpi, och detta svar var riktat nedåt.
I vår studie var de vanligaste komponenterna som motsvarar den biologiska processen som kallas "GO:0055114 Redoxprocess" cytokrom P450-protein, peroxidas, linolsyra 9S-/13S-lipoxygenas och 1-aminocyklopropan-1-karboxylsyraoxidas. Dessutom definierar vår WGCNA HSFA4a-homologen som en nav som bär moduler såsom Lanr1-resistensgenkandidaten TanjilG_05042. HSFA4a är en komponent i den redoxberoende regleringen av kärntranskription i växter.
Cytokrom P450-proteiner är oxidoreduktaser som katalyserar NADPH- och/eller O2-beroende hydroxyleringsreaktioner i primär och sekundär metabolism, inklusive metabolismen av xenobiotika, såväl som hormoner, fettsyror, steroler, cellväggskomponenter, biopolymerer och biosyntesen av skyddande föreningar 69. I vår studie minskade variationen i växtcytokrom P450-funktion från -10,6 log2 (faldig förändring) till 5,7 på grund av ett stort antal förändrade homologer (37) och skillnader i responsmönster mellan specifika gener, vilket återspeglar en uppåtgående revidering. Att endast använda RNA-sekvenseringsdata för att belysa den förmodade biologiska funktionen hos NLL-generna i en så stor proteinsuperfamilj skulle vara mycket spekulativt. Det är dock värt att notera att vissa cytokrom P450-gener är associerade med ökad resistens mot patogena svampar eller bakterier, inklusive ett bidrag till allergiska reaktioner 69,70,71.
Klass III-peroxidaser är multifunktionella växtenzymer som är involverade i ett brett spektrum av metaboliska processer under växters tillväxt och utveckling, såväl som som svar på miljöpåfrestningar såsom salthalt, torka, hög ljusintensitet och patogenangrepp72. Peroxidaser är involverade i interaktionen mellan flera växtarter och Anthracis, inklusive Stylosanthes humilis och C. gloeosporioides, Lens culinaris och C. truncatum, Phaseolus vulgaris och C. lindemuthianum, Cucumis sativus och C. lagenarium73,74,75,76. Svaret är mycket snabbt, ibland till och med vid 4 HPI, innan svampen penetrerar växtvävnaden73. Peroxidasgenen svarade också på D. toxica NLL-inokulering. Förutom sina typiska funktioner att reglera oxidativ utbrott eller eliminera oxidativ stress, kan peroxidaser störa patogentillväxten genom att skapa fysiska barriärer baserade på cellväggsförstärkning under lignifiering, subenhets- eller tvärbindning av specifika föreningar. Denna funktion kan in silico tillskrivas TanjilG_03329-genen som kodar för ett förmodat ligninbildande anjonperoxidas som var signifikant uppreglerat i vår studie i den 83A:476-resistenta linjen vid 6 HPI, men inte i andra stammar och tidpunkter som inte svarade.
9S-/13S-lipoxygenas av linolsyra är det första steget i den oxidativa vägen för lipidbiosyntes78. Produkterna från denna väg har flera funktioner i växters försvar, inklusive stärkande av cellväggar genom bildandet av kallos- och pektinavlagringar, och reglering av oxidativ stress genom produktion av reaktiva syreradikaler79,80,81,82,83. I den föreliggande studien förändrades uttrycket av linolsyra 9S-/13S-lipoxygenas i alla stammar, men i den mottagliga populationen 22660 rådde uppreglering vid olika tidpunkter, medan det i stammar som bär resistent Lanr1 och AnMan-allelen betonar diversifieringen av oxylipinskiktet i skyddande mjältbrandsreaktioner mellan dessa genotyper.
Homologen 1-aminocyklopropan-1-karboxylatoxidas (ACO) var signifikant uppreglerad (9 gener) eller nedreglerad (2 gener) vid inokulering med lupin. Med två undantag inträffade alla dessa svar vid 6 hp vid 83A:476. Den enzymatiska reaktionen medierad av ACO-proteiner är det hastighetsbegränsande steget i etylenproduktion och är därför starkt reglerad84. Etylen är ett växthormon som spelar en mängd olika roller i att reglera växters utveckling och respons på abiotiska och biotiska stressförhållanden. Induktionen av ACO-transkription och aktivering av etylensignalvägen är involverade i att öka risets resistens mot den hemibiotrofa svampen oryzae oryzae genom att reglera produktionen av reaktiva syreradikaler och fytoalexiner. En mycket liknande bladinfektionsprocess som observerats mellan M. oryzae och C. lupini88,89, mot bakgrund av en signifikant uppreglering av ACO-homologer i 83A:476-linjen som rapporterats i denna studie, förskjuter möjligheten att ge resistens mot NLL-antraknosetylen, ett centralt signaleringssteg i molekylära signalvägar.
I den aktuella studien observerades storskalig undertryckning av många gener associerade med fotosyntes vid 6 hpi i 83A:476 och vid 48 hpi i Mandeloop och populationen på 22660. Omfattningen och utvecklingen av dessa förändringar är proportionell mot nivån. Antraknosresistens observerades i detta experiment. Nyligen har stark och tidig undertryckning av fotosyntesrelaterade transkript rapporterats i flera modeller av växt-patogen-interaktioner, inklusive patogena bakterier och svampar. Hastighet (från 2 HPI i vissa interaktioner) och global undertryckning av gener associerade med fotosyntes som svar på infektion kan utlösa växtimmunitet baserat på utplaceringen av reaktiva syreradikaler och deras interaktion med salicylsyravägen för att mediera allergiska reaktioner 90,94.
Sammanfattningsvis inkluderar de försvarsmekanismer som föreslagits för den mest resistenta linjen (83A:476) snabb patogenigenkänning av R-genen (förmodligen TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) och allergisk responsmedierad salicylsyra- och etylensignalering, följt av etablering av långsiktig SAR. Effekten stöds av DIR-1-proteinet. Det bör noteras att den biotrofiska perioden för C. lupini-infektion är mycket kort (ungefär 2 dagar), följt av nekrotisk tillväxt95. Övergången mellan dessa stadier kan vara associerad med nekros och uttryck av etyleninducerbara proteiner som fungerar som utlösare för överkänslighetsreaktioner i värdväxter. Därför är tidsfönstret för framgångsrik infångning av C. lupini i det biotrofiska stadiet mycket smalt. Omprogrammeringen av gener associerade med redox och fotosyntes som observerats i 83A:476 vid 6 hpi överensstämmer med utvecklingen av svamphyfer och förebådar utvecklingen av ett framgångsrikt skyddande svar i det biotrofiska stadiet. De transkriptomiska svaren hos Mandelup och 22660-populationen kan vara för fördröjda för att fånga svampen innan den övergår till nekrotisk tillväxt, men Mandelup kan vara mer effektiv än 22660-populationen eftersom den relativt snabba regleringen av PR-10-proteinet främjar horisontellt resistens.
ETI, driven av den kanoniska R-genen, verkar vara en vanlig mekanism för bönresistens mot antraknos. Således, i modellbaljväxten Medicago truncatula, ges resistens mot antraknos av RCT1-genen, en medlem av TIR-NBS-LRR97-växtens R-genklass. Denna gen ger också bredspektrum antraknosresistens i alfalfa när den överförs till mottagliga växter. I den vanliga bönan (P. vulgaris) har mer än två dussin antraknosresistensgener identifierats hittills. Några av dessa gener finns i regioner som saknar kanoniska R-gener, men många andra är belägna vid kanterna av kromosomer som bär NBS-LRR-genklustret, inklusive TIR-NBS-LRRs99. Den genomomfattande SSR-studien bekräftade också sambandet mellan NBS-LRR-genen och antraknosresistens i den vanliga bönan. Den kanoniska R-genen hittades också i den genomiska regionen som bär det huvudsakliga antraknosresistenslocuset i vit lupin 101.
Vårt arbete visar att en omedelbar resistensreaktion, aktiverad i ett tidigt skede av växtinfektion (helst senast 12 hpi), effektivt skyddar smalbladig lupin från antraknos orsakad av den patogena svampen Collelotrichum lupini. Med hjälp av högkapacitetssekvensering demonstrerade vi differentiella uttrycksprofiler av antraknosresistensgener i NLL-växter medierade av resistensgenerna Lanr1 och AnMan. Framgångsrikt försvar innebär att man noggrant utformar generna för proteiner involverade i redox, fotosyntes och patogenes inom timmar efter växtens första kontakt med en patogen. Liknande skyddsreaktioner, men fördröjda i tid, är mycket mindre effektiva för att skydda växter från sjukdomar. Mjältbrandsresistens medierad av Lanr1-genen liknar det typiska snabba svaret hos R-genen (effektorutlöst immunitet), medan AnMan-genen troligtvis ger ett horisontellt svar (immunitet utlöst av ett mikrobassocierat molekylärt mönster), vilket ger en måttlig nivå av hållbarhet.
De 215 NLL-linjerna som användes för att screena för antraknosmarkörer bestod av 74 kultivarer, 60 linjer erhållna genom korsning eller avel, 5 mutanter och 76 vilda eller ursprungliga groddplasmer. Linjerna kom från 17 länder, främst från Polen (58), Spanien (47), Tyskland (27), Australien (26), Ryssland (19), Vitryssland (7), Italien (5) och andra linjer från 10 länder. Uppsättningen inkluderar även referensresistenta linjer: 83A:476, Tanjil, Wonga som bär Lanr1-allelen och Mandelup som bär AnMan-allelen. Linjerna erhölls från European Lupine Genetic Resource Database som underhålls av Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polen (kompletterande tabell S1).
Växterna odlades under kontrollerade förhållanden (fotoperiod 16 timmar, temperatur 25 °C under dagen och 18 °C på natten). Två biologiska replikat analyserades. DNA isolerades från tre veckor gamla blad med hjälp av DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) enligt protokollet. Kvaliteten och koncentrationen av det isolerade DNA:t bedömdes med spektrofotometriska metoder (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). AnManM1-markören som markerar antraknosresistensgenen AnMan (härledd från cv. Mandelup) och markörerna Anseq3 och Anseq4 som flankerar genen Lanr1 (härledd från cv. Tanjil) analyserades11,26,28. Homozygoter för den resistenta allelen poängsattes som "1", känsliga – som "0" och heterozygoter – som 0,5.
Baserat på resultaten av screeningen för markörerna AnManM1, AnSeq3 och AnSeq4 och tillgången på frön för slutliga uppföljningsexperiment, valdes 50 NLL-linjer ut för fenotypning av antraknosresistens. Analysen utfördes i duplikat i ett datorstyrt växthus med en 14 timmars fotoperiod med ett temperaturintervall på 22 °C under dagen och 19 °C på natten. Fröna skrapas (fröskalet på motsatt sida av embryot skärs av med ett vasst blad) före sådd för att förhindra frövila på grund av att fröskalet är för hårt och för att säkerställa jämn groning. Växterna odlades i krukor (11 × 11 × 21 cm) med steril jord (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warszawa, Polen). Inokulering utfördes med stammen Colletotrichum lupini Col-08, odlad 1999 från stjälkarna av smalbladiga lupinplantor odlade på ett fält i Verzhenitsa, Storpolen (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ Ö). Välj ett område. Isolaten odlades i SNA-medium vid 20° C under svart ljus i 21 dagar för att inducera sporulation. Fyra veckor efter sådd, när plantorna hade nått 4-6 bladstadiet, utfördes inokulering genom sprayning med en suspension av konidier i en koncentration av 0,5 x 106 konidier per ml. Efter inokulering hölls plantorna i mörker i 24 timmar vid en luftfuktighet på cirka 98 % och en temperatur på 25°C för att underlätta groning av konidier och infektionsprocessen. Växterna odlades sedan under en 14-timmars fotoperiod vid 22 °C dagtid/19 °C natttid och 70 % luftfuktighet. Sjukdomspoängen gjordes 22 dagar efter inokulering och varierade från 0 (immun) till 9 (mycket mottaglig) beroende på förekomst eller frånvaro av nekrotiska lesioner på stjälkar och blad. Dessutom mättes växternas vikt efter poängsättningen. Samband mellan markörgenotyper och sjukdomsfenotyper beräknades som punkt två-sekvenskorrelationer (frånvaro av heterozygota markörer i uppsättningen linjer för analys av antraknosresistensfenotypen).