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Le lupin à feuilles étroites (Lupinus angustifolius L.) est une légumineuse utilisée pour l'alimentation et l'amélioration des sols. Son expansion mondiale a favorisé l'apparition de nombreux champignons pathogènes, dont l'anthracnose du lupin, responsable de cette maladie dévastatrice. Deux allèles, Lanr1 et AnMan, conférant une résistance accrue, ont été utilisés dans l'amélioration variétale du lupin, mais les mécanismes moléculaires sous-jacents restent inconnus. Dans cette étude, les marqueurs Lanr1 et AnMan ont été utilisés pour cribler des échantillons européens de lupin à feuilles étroites. Les tests du vaccin en environnement contrôlé ont confirmé l'efficacité des deux donneurs résistants. Une analyse d'expression génique différentielle a été réalisée sur des lignées représentatives résistantes et sensibles. La résistance à l'anthracnose était associée à une surexpression des gènes impliqués dans la réponse de défense (GO:0006952), les processus redox (GO:0055114) et la photosynthèse (GO:0015979). De plus, la lignée Lanr1(83A:476) a présenté une reprogrammation transcriptomique significative rapidement après l'inoculation, tandis que les autres lignées ont montré un délai d'environ 42 heures dans cette réponse. Les réponses de défense sont associées aux gènes TIR-NBS, CC-NBS-LRR et NBS-LRR, à 10 protéines impliquées dans la pathogenèse, aux protéines de transfert de lipides, à l'endoglucane-1,3-β-glucosidase, aux protéines de la paroi cellulaire riches en glycine et aux gènes de la voie réactive de l'oxygène. Les réponses précoces à 83A:476, notamment la suppression ciblée des gènes associés à la photosynthèse, ont coïncidé avec une protection efficace pendant la phase de croissance végétative du champignon, suggérant qu'un effecteur déclenche l'immunité. La réaction de Mandeloop est ralentie, de même que la traînée horizontale globale.
Le lupin à feuilles étroites (Lupinus angustifolius L.) est une céréale riche en protéines originaire du bassin méditerranéen occidental^1,2. Il est actuellement cultivé pour l'alimentation animale et humaine. Il est également utilisé comme engrais vert dans les systèmes de rotation des cultures grâce à la fixation de l'azote par des bactéries symbiotiques fixatrices d'azote et à l'amélioration globale de la structure du sol. Le lupin à feuilles étroites a connu une domestication rapide au cours du siècle dernier et fait toujours l'objet d'une forte pression de sélection^{3,4,5,6,7,8,9,10,11,12}. Avec la généralisation de sa culture, la succession de champignons pathogènes a développé de nouvelles niches écologiques et engendré de nouvelles maladies dévastatrices pour les cultures. Le plus remarquable pour les producteurs et les éleveurs de lupins a été l’apparition de l’anthracnose, causée par le champignon pathogène Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Le plus remarquable pour les producteurs et les éleveurs de lupins a été l’apparition de l’anthracnose, causée par le champignon pathogène Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Les premiers soins pour les agriculteurs et les sélectionneurs de lupin sont l'antracnose, qui est un pathogène pour le colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler et Hagedorn13. Ce qui a le plus marqué les éleveurs et les producteurs de lupins, c'est l'émergence de l'anthracnose causée par le champignon pathogène Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Poilé。1 Les producteurs et les sélectionneurs de lupin sont actuellement en mesure d'exploiter l'antracnose, qui est un pathogène pour le colletotrichum lupini. (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Ce qui frappe le plus les éleveurs et les producteurs de lupins, c’est l’émergence de l’anthracnose causée par le champignon pathogène Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Les premiers signalements de la maladie provenaient du Brésil et des États-Unis, les symptômes typiques apparaissant respectivement en 1912 et 1929. Cependant, après environ 30 ans, l'agent pathogène a été désigné sous le nom de Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., téléomorphe Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., téléomorphe Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., téléomorphe de Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld dans la morphologie naturelle. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld dans Morphologie ciblée. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .et H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。et H. Schlenk, .Les phénotypages préliminaires de la maladie, réalisés au milieu du XXe siècle, ont révélé une certaine résistance chez les accessions de lupin des marais (NLL) et de lupin jaune (L. luteus L.), mais toutes les accessions de lupin blanc (L. albus L.) testées se sont avérées très sensibles^15,16. Des études ont montré que le développement de l'anthracnose est associé à une augmentation des précipitations (humidité de l'air) et de la température (entre 12 et 28 °C), entraînant une perte de résistance à des températures plus élevées^17,18. En effet, le temps nécessaire à la germination des conidies et au déclenchement de la maladie était quatre fois plus court à 24 °C (4 heures) qu'à 12 °C (16 heures) dans des conditions d'humidité élevée¹⁹. Ainsi, le réchauffement climatique actuel a favorisé la propagation de l'anthracnose. Pourtant, la maladie a été observée en France (1982) et en Ukraine (1983) comme un signe avant-coureur d'une menace imminente, mais elle a apparemment été ignorée par la filière lupinière à l'époque^20,21. Quelques années plus tard, cette maladie dévastatrice s'est propagée à travers le monde et a également touché d'importants pays producteurs de lupin comme l'Australie, la Pologne et l'Allemagne^22,23,24. Suite à une épidémie d'anthracnose au milieu des années 1990, un criblage extensif a permis d'identifier plusieurs donneurs résistants dans des échantillons de NLL19. La résistance du lupin NLL à l'anthracnose est contrôlée par deux allèles dominants distincts présents dans différentes sources de matériel génétique : Lanr1 chez les cultivars Tanjil et Wonga et AnMan chez le cultivar Mandalay^25,26. Ces allèles complètent les marqueurs moléculaires qui soutiennent la sélection de matériel génétique résistant dans les programmes d'amélioration variétale^{25,26,27,28,29,30}. La lignée résistante 83A:476, porteuse de l'allèle Lanr1, a été croisée avec la lignée sauvage sensible P27255 afin d'obtenir une population de lignées recombinantes consanguines (RIL) présentant une ségrégation pour la résistance à l'anthracnose. Ceci a permis de localiser le locus Lanr1 sur le chromosome NLL-11^{31, 32, 33}. L'alignement des marqueurs de liaison des loci de résistance flanquants à l'anthracnose avec un cadre génomique, NLL, a révélé la localisation des trois allèles sur le même chromosome (NLL-11), mais à des positions différentes^{29, 34, 35}. Cependant, en raison du faible nombre de RIL et de la grande distance génétique entre les marqueurs et les allèles correspondants, aucune conclusion fiable ne peut être tirée quant à leurs gènes sous-jacents. Par ailleurs, l'utilisation de la génétique inverse chez le lupin est difficile du fait de son très faible potentiel de régénération, ce qui rend la manipulation génétique complexe³⁷.
Le développement de matériel génétique domestiqué porteur de l'allèle souhaité à l'état homozygote, comme 83A:476 (Lanr1) et Mandelup (AnMan), a permis d'étudier la résistance à l'anthracnose malgré la présence de combinaisons alléliques opposées dans les populations sauvages. Cette étude explore les mécanismes moléculaires sous-jacents et compare les réponses de défense générées par des génotypes spécifiques. Elle évalue la réponse transcriptomique précoce de *C. lupini* (NLL) à la vaccination. Un panel européen de 215 lignées de NLL a d'abord été criblé à l'aide de marqueurs moléculaires des allèles Lanr1 et AnMan. Le phénotypage de l'anthracnose a ensuite été réalisé sur 50 lignées de NLL, préalablement sélectionnées pour ces marqueurs, dans des conditions contrôlées. À partir de ces expériences, quatre lignées différant par leur résistance à l'anthracnose et leur composition allélique Lanr1/AnMan ont été sélectionnées pour l'analyse de l'expression différentielle des gènes de défense, par deux approches complémentaires : le séquençage d'ARN à haut débit et la quantification par PCR en temps réel.
Le criblage d'un ensemble de matériel génétique NLL (N = 215) avec les marqueurs Lanr1 (Anseq3 et Anseq4) et AnMan (Anseq4) et AnMan (AnManM1) a montré qu'une seule lignée (95726, proche de Salamanca-b) amplifie l'allèle de résistance pour tous les marqueurs, tandis que la présence d'allèles de sensibilité a été observée dans 158 lignées (environ 73,5 %). Treize lignées présentaient deux allèles de résistance du marqueur Lanr1, et huit lignées présentaient un seul allèle de résistance du marqueur AnMan (voir tableau supplémentaire S1). Deux lignées étaient hétérozygotes pour le marqueur Anseq3 et une était hétérozygote pour le marqueur AnManM1. Quarante-deux lignées (19,5 %) présentaient des phases opposées des allèles Anseq3 et Anseq4, indiquant une fréquence élevée de recombinaison entre ces deux locus. Les phénotypes d'anthracnose en conditions contrôlées (Tableau supplémentaire S2) ont révélé une variabilité de la résistance des génotypes testés, reflétée par la gravité de l'anthracnose. Les différences de scores moyens allaient de 1,8 (modérément résistant) à 6,9 (sensible) et les différences de poids des plantes de 0,62 g (sensible) à 4,45 g (résistant). Il y avait une corrélation significative entre les valeurs observées dans deux réplications de l'expérience (0,51 pour les scores de gravité de la maladie, P = 0,00017 et 0,61 pour le poids de la plante, P < 0,0001) ainsi qu'entre ces deux paramètres (− 0,59 et − 0,77, P < 0,0001). Il y avait une corrélation significative entre les valeurs observées dans deux réplications de l'expérience (0,51 pour les scores de gravité de la maladie, P = 0,00017 et 0,61 pour le poids de la plante, P < 0,0001) ainsi qu'entre ces deux paramètres (− 0,59 et − 0,77, P < 0,0001). Le taux de corrélation entre les balles est de 0,51 pour chaque ballon, P = 0,00017 et 0,61 pour le nettoyage de masse, P < 0,0001), et cela peut également être dû à deux paramètres (-0,59 et -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Une corrélation significative a été trouvée entre les valeurs observées dans deux répétitions de l'expérience (0,51 pour les scores de gravité de la maladie, P = 0,00017 et 0,61 pour le poids de la plante, P < 0,0001), ainsi qu'entre ces deux paramètres (- 0,59 et -0,77, P < 0,0001) 0,0001).0,51 ， P = 0,00017, pour une valeur de 0,61, P < 0,0001, pour une valeur de 0,59 à 0,77, P < 0,0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为0,51 ， p = 0,00017 ， 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0,59 和– 0,59和– 0,59 和– 0,59 和- 0,77，P < 0,0001)。 Il est nécessaire de définir une corrélation entre les valeurs de référence, qui sont définies dans deux niveaux de puissance (le taux de mise en œuvre est de 0,51, P = 0,00017 et masse 0,61, P <0,0001), et peut-être deux paramètres (-0,59 et -0,0001) 0,77, P <0,0001. Il y avait une corrélation significative entre les valeurs observées en double (score de gravité de la maladie 0,51, P = 0,00017 et poids de la plante 0,61, P < 0,0001) et entre ces deux paramètres (-0,59 et -0,0001) 0,77, P < 0,0001. ).Les symptômes typiques observés chez les plantes sensibles comprennent le cintrage et la torsion de la tige, formant une structure en « arc de berger », suivis de lésions ovales contenant des sporozoïtes orange/roses (Fig. suppl. 1). Les accessions australiennes porteuses des gènes Lanr1 (83A:476 et Tanjil) et AnMan (Mandelup) présentent une résistance modérée (0,0331 et 0,0036 respectivement). Certaines lignées porteuses d'allèles « résistants » Lanr1 et/ou AnMan présentent également des symptômes de la maladie.
Il est intéressant de noter que quelques lignées NLL dépourvues de tout allèle marqueur « résistant » ont révélé un niveau élevé de résistance à l'anthracnose (comparable ou supérieur à celui des génotypes Lanr1 ou AnMan), comme Boregine (valeur P < 0,0001 pour les deux paramètres), Bojar (valeur P < 0,0001 pour le score et 0,001 pour le poids de la plante) et Population B-549/79b (valeur P < 0,0001 pour le score et non significative pour le poids). Il est intéressant de noter que quelques lignées NLL dépourvues de tout allèle marqueur « résistant » ont révélé un niveau élevé de résistance à l'anthracnose (comparable ou supérieur à celui des génotypes Lanr1 ou AnMan), comme Boregine (valeur P < 0,0001 pour les deux paramètres), Bojar (valeur P < 0,0001 pour le score et 0,001 pour le poids de la plante) et Population B-549/79b (valeur P < 0,0001 pour le score et non significative pour le poids). Il est intéressant de noter que la ligne NLL est la seule à avoir un marqueur « résistant » tout à l'heure, et que vous avez trouvé votre propre entreprise. антракнозу (сопоставимый ou более высокий, чем для генотипов Lanr1 ou ili AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 pour les opérations de nettoyage et 0,001 pour les opérations de masse) et les tarifs B-549/79b (p < 0,0001 pour les opérations de nettoyage et les dépenses pour les opérations de masse). Il est intéressant de noter que plusieurs lignées NLL dépourvues de tout allèle marqueur « résistant » ont montré un niveau élevé de résistance à l'anthracnose (comparable ou supérieur à celui des génotypes Lanr1 ou AnMan), comme Boregine (valeur P < 0,0001 pour les deux paramètres), Bojar (valeur P < 0,0001 pour l'évaluation et 0,001 pour le poids de la plante) et la population B-549/79b (valeur P < 0,0001 pour l'évaluation et non significative pour le poids).NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性(与Lanr1)或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）。 Il est intéressant de noter que certains systèmes NLL qui ne possèdent aucun marqueur « antigénique » présentent une résistance horizontale élevée (équivalente aux gènes Lanr1 ou AnMan ou supérieure), comme Boregine (les deux paramètres P < 0,0001), Bojar (valeur P < 0,0001, poids de la plante 0,001) et la souche B-549/79b (valeur P < 0,0001, poids non significatif). Ce qui est intéressant, c'est que les lignes de NLL ne sont pas liées aux marqueurs de tous les « résistance », selon vos utilisateurs. антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 ou ili AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) et la population B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Il est intéressant de noter que certaines lignées NLL dépourvues d'allèles marqueurs de « résistance » ont montré des niveaux élevés de résistance à l'anthracnose (comparables ou supérieurs aux génotypes Lanr1 ou AnMan), comme Boregine (valeur P pour les deux paramètres < 0,0001), Bojar (valeur P < 0,0001, poids de la plante 0,001) et la population B-549/79b (valeur P < 0,0001, poids non significatif).Ce phénomène suggère l'existence possible d'une nouvelle source génétique de résistance, expliquant l'absence de corrélation observée entre les génotypes des marqueurs et les phénotypes de la maladie (valeurs P comprises entre ~0,42 et ~0,98). Ainsi, le test de Kolmogorov-Smirnov a montré que les données relatives à la résistance à l'anthracnose suivaient approximativement une distribution normale pour les scores (valeurs P de 0,25 et 0,11) et la biomasse végétale (valeurs P de 0,47 et 0,55), ce qui suggère l'implication d'un plus grand nombre d'allèles que Lanr1 et AnMan.
Suite aux résultats du criblage de la résistance à l'anthracnose, quatre lignées ont été sélectionnées pour l'analyse du transcriptome : 83A:476, Boregine, Mandelup et la population 22660. Ces lignées ont été testées à nouveau pour leur résistance à l'anthracnose par séquençage d'ARN lors d'expériences d'inoculation, à condition qu'elles soient identiques à celles du test précédent. Les scores obtenus étaient les suivants : Boregine (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) et population 22660 (6,11 ± 1,29).
Le protocole Illumina NovaSeq 6000 a permis d'obtenir en moyenne 40,5 paires de lectures par échantillon (de 29,7 à 54,4 paires de lectures) (Tableau supplémentaire S3). Les scores d'alignement sur la séquence de référence variaient de 75,5 % à 88,6 %. La corrélation moyenne des données de comptage de lectures entre les variants expérimentaux et les réplicats biologiques était comprise entre 0,812 et 0,997 (moyenne : 0,959). Sur les 35 170 gènes analysés, 2 917 n'ont révélé aucune expression, et les 4 785 autres gènes ont été exprimés à un niveau négligeable (moyenne de base < 5). Sur les 35 170 gènes analysés, 2 917 n'ont révélé aucune expression, et les 4 785 autres gènes ont été exprimés à un niveau négligeable (moyenne de base < 5). Sur 35 170 générations d'analysés, 2917 n'ont pas été expédiées, un total de 4785 générations d'unités ont été exportées dans un budget limité. (базовое среднее <5). Parmi les 35 170 gènes analysés, 2 917 n'ont montré aucune expression et les 4 785 gènes restants ont été exprimés à un niveau négligeable (moyenne de base < 5).35 170 personnes, 2917 personnes, 4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35 170 Pour 35 170 générations d'analysants 2917, il n'y a pas d'expressivité, un montant de 4785 générations n'a pas besoin d'être exprimé среднее значение <5). Parmi les 35 170 gènes analysés, 2 917 n'étaient pas exprimés et les 4 785 gènes restants avaient une expression négligeable (moyenne de base < 5).Ainsi, le nombre de gènes considérés comme exprimés (moyenne de base ≥ 5) au cours de l'expérience était de 27 468 (78,1 %) (Tableau supplémentaire S4).
Dès le premier point de mesure, toutes les lignées NLL ont répondu à l'inoculation de C. lupini (souche Col-08) par une reprogrammation du transcriptome (Tableau 1). Cependant, des différences significatives ont été observées entre les lignées. Ainsi, la lignée résistante 83A:476 (porteuse du gène Lanr1) a présenté une reprogrammation transcriptomique significative au premier point de mesure (6 hpi), avec une augmentation de 31 à 69 fois du nombre de gènes surexprimés et sous-exprimés isolés par rapport aux autres points de mesure. De plus, ce pic a été de courte durée, car l'expression de seulement quelques gènes est restée significativement modifiée au second point de mesure (12 hpi). Il est intéressant de noter que Boregine, qui a également montré un niveau élevé de résistance lors du test de greffage, n'a pas subi une reprogrammation transcriptionnelle aussi massive au cours de l'expérience. Cependant, le nombre de gènes différentiellement exprimés (GDE) était identique pour Boregine et 83A:476 à 12 hpi. Les populations Mandelup et 22660 ont toutes deux montré des pics DEG au dernier point temporel (48 l/s), indiquant un retard relatif dans les réponses de défense.
Étant donné que la lignée 83A:476 a subi une reprogrammation massive de son transcriptome en réponse à C. lupini 6 heures après l'infection (HPI), comparativement à toutes les autres lignées, environ 91 % des gènes différentiellement exprimés (DEG) observés à ce stade étaient spécifiques de cette lignée (Fig. 1). Cependant, un certain chevauchement a été observé dans les réponses précoces entre les lignées étudiées : 68,5 %, 50,9 % et 52,6 % des DEG chez Boregine, Mandelup et la population 22660, respectivement, correspondaient à ceux identifiés chez 83A:476 à certains moments. Néanmoins, ces DEG ne représentaient qu'une faible fraction (0,97 à 1,70 %) de l'ensemble des DEG actuellement détectés chez 83A:476. De plus, 11 gènes différentiellement exprimés (DEGs) issus de toutes les lignées étaient cohérents à ce stade (Tableaux supplémentaires S4 à S6), incluant des composants communs des réponses de défense des plantes : la protéine de transfert de lipides (TanjilG_32225), l’enzyme endoglucane-1,3-β-glucoside (TanjilG_23384), deux protéines inductibles par le stress comme SAM22 (TanjilG_31528 et TanjilG_31531), la protéine basique du latex (TanjilG_32352) et deux protéines structurales de la paroi cellulaire riches en glycine (TanjilG_19701 et TanjilG_19702). On observait également un chevauchement relativement important des réponses transcriptomiques entre 83A:476 et Boregine à 24 hpi (total de DEGs : 16 à 38 %) et entre Mandelup et la population 22660 à 48 hpi (total de DEGs : 14 à 20 %).
Diagramme de Venn illustrant le nombre de gènes différentiellement exprimés (GDE) dans des lignées de lupin à feuilles étroites (LFE) inoculées avec Colletotrichum lupini (souche Col-08 isolée de champs de lupins à Wierzhenice, Pologne, 1999). Les lignées de LFE analysées étaient : 83A:476 (résistante, porteuse de l’allèle Lanr1), Boregine (résistante, fond génétique inconnu), Mandelup (modérément résistante, porteuse de l’allèle AnMan) et la population 22660 (très sensible). L’abréviation hpi signifie « heures après vaccination ». Les valeurs nulles ont été supprimées pour simplifier le graphique.
L'ensemble des gènes surexprimés à 6 hpi a été analysé afin de détecter la présence de domaines canoniques de gènes R (Tableau supplémentaire S7). Cette étude a révélé une induction du transcriptome de gènes de résistance classiques aux maladies possédant des domaines NBS-LRR uniquement au niveau de la région 83A:476. Cet ensemble comprenait un gène TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), cinq gènes CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 et tanjilg_16162), quatre gènes NBS-LR (tanjilg_16162), quatre gènes NBS-LRRE (tanjilg_16162), quatre gènes NBS-Lrr (tanjilg_16162) et quatre gènes NBS-LRR (tanjilg_16162). Tous ces gènes possèdent des domaines canoniques organisés en séquences conservées. En plus des gènes du domaine NBS-LRR, plusieurs kinases RLL ont été activées à 6 hpi, à savoir une à Boregine (TanjilG_19877), deux à Mandelup (TanjilG_07141 et TanjilG_19877) et dans la population 22660 (TanjilG_09014 et TanjilG_10361) et deux dans 83A 27:476.
Les gènes dont l'expression a été significativement modifiée en réponse à l'inoculation avec C. lupini (souche Col-08) ont été soumis à une analyse d'enrichissement Gene Ontology (GO) (Tableau supplémentaire S8). Le terme de processus biologique le plus fréquemment surreprésenté était « GO:0006952 réponse de défense », qui est apparu dans 6 des 16 combinaisons (temps × ligne) avec une signification élevée (valeur P < 0,001) (Fig. 2). Le terme de processus biologique le plus fréquemment surreprésenté était « GO:0006952 réponse de défense », qui est apparu dans 6 des 16 combinaisons (temps × ligne) avec une signification élevée (valeur P < 0,001) (Fig. 2). Il est maintenant temps de pré-terminer le processus biologique en utilisant « GO : 0006952, indiquez la réponse », qui est disponible en 6 années. 16 (dans × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Le terme de processus biologique le plus fréquemment surreprésenté était « GO:0006952 réponse de défense », qui est apparu dans 6 des 16 combinaisons (temps × lignée) avec une signification élevée (valeur P < 0,001) (Fig. 2)."GO:0006952 防御反应"，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 Le terme de processus biologique le plus représentatif est « GO:0006952 réponse de défense », qui apparaît dans 6 des 16 combinaisons (temps×ligne), avec une signification élevée (valeur P < 0,001) (Figure 2). Le dernier terme en date du processus biologique est "GO: 0006952 Defense Response", qui a été publié dans 6 à 16 combinaisons. (dans × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Le terme de processus biologique le plus fréquemment surreprésenté était « GO:0006952 Réponse de défense », qui est apparu dans 6 des 16 combinaisons (temps × ligne) avec une signification élevée (valeur P < 0,001) (Fig. 2).Ce terme était surreprésenté à deux moments chez 83A:476 et Boregine (6 et 24 hpi) et à un moment chez Mandelup et Population 22660 (12 et 6 hpi, respectivement). Ce résultat, attendu, souligne la réponse antifongique des lignées résistantes. De plus, 83A:476 a réagi à C. lupini en induisant rapidement l'expression de gènes liés au stress oxydatif, représenté par le terme « GO:0055114 processus redox », indiquant une réponse de défense spécifique. Boregine, quant à elle, a présenté des réponses de défense spécifiques, liées au terme « GO ». La population 22660 a activé la réponse de résistance horizontale impliquant des métabolites secondaires, mettant en évidence un nombre excessif de termes « GO:0016104 Processus de biosynthèse des triterpènes » et « GO:0006722 Processus du métabolisme des triterpènes » (ces deux termes appartenant au même ensemble de gènes). Compte tenu des résultats de l'analyse d'enrichissement des termes GO, la stabilité de la réaction de Mandelup se situait entre celle de la population de Boregine et celle de la population 22660. De plus, la réaction précoce 83A:476 (6 hpi) et la réaction retardée de Mandelup, observées chez la population 22660, incluent le terme GO:0015979 « photosynthèse » ainsi que d'autres processus biologiques apparentés.
Les termes de l'ontologie génique des bioprocédés sélectionnés pour l'annotation des gènes différentiellement exprimés lors des réponses transcriptomiques du lupin à feuilles étroites (NLL) inoculé avec le lupin infecté par la bactérie du charbon (souche Col-08 isolée de champs de lupins à Wierzhenice, en Pologne, en 1999) sont fortement surreprésentés. Les lignées de NLL analysées étaient : 83A:476 (résistante, porteuse de l'allèle homozygote Lanr1), Boregine (résistante, fond génétique inconnu), Mandelup (modérément résistante, porteuse de l'allèle homozygote AnMan) et la population 22660 (sensible).
Cette étude ayant pour objectif d'identifier les gènes contribuant à la résistance à l'anthracnose, les gènes associés aux termes GO « GO:0006952 Réponses défensives » et « GO:0055114 Processus redox » ont été analysés en appliquant des seuils : moyennes de base ≥ 30 avec au moins une valeur significative de log2 (rapport de variation) à un point temporel donné. Le nombre de gènes répondant à ces critères était de 65 pour GO:0006952 et de 524 pour GO:0055114.
L'analyse 83A:476 a révélé deux pics de gènes différentiellement exprimés (DEG) annotés avec le terme GO:0006952. Le premier, à 6 gènes par pouce (64 gènes, régulation à la hausse et à la baisse), et le second, à 24 gènes par pouce (15 gènes, régulation à la hausse uniquement). Boregine a également montré que GO:0006952 atteignait son pic au même moment, mais avec moins de DEG (11 et 8) et une activation préférentielle. Mandeloop a montré deux pics de GO:0006952 à 12 et 48 HPI, chacun comportant 12 gènes (le premier avec des gènes activateurs et le second uniquement des gènes suppresseurs), tandis que la population 22660 à 6 HPI (13 gènes) présentait une prédominance plus marquée du pic de régulation à la hausse. Il convient de noter que 96,4 % des gènes différentiellement exprimés (DEG) associés à GO:0006952 dans ces pics présentaient le même type de réponse (à la hausse ou à la baisse), ce qui indique un chevauchement important des réponses de défense malgré les différences dans le nombre de gènes impliqués. Le groupe le plus important de séquences liées au terme GO:0006952 code pour la protéine de message associée au stress de famine 22 (SAM22-like), qui appartient au clade des protéines PR-10 (protéines associées à la pathogenèse de classe 10) et au clade des protéines MLP (protéines de type latex) (Fig. 3). Les deux groupes différaient par la nature de leur expression et le sens de la réponse. Les gènes codant pour les protéines SAM22-like ont montré une induction constante et significative aux premiers temps (6 ou 12 hpi) et étaient généralement inactifs à la fin de l'expérience (48 hpi), tandis que les protéines MLP-like ont montré une induction coordonnée à 6 hpi. Pour les lignées 83A:476 et Mandelup à 48 hp/in, presque toutes les autres données sont restées inchangées. De plus, les profils d'expression des gènes codant pour des protéines de type SAM22 présentaient des différences corrélées à la variabilité de la résistance à l'anthracnose : les lignées les plus résistantes présentaient davantage de points temporels induisant significativement ces gènes que les lignées plus sensibles. Un autre gène PR-10 de type LlR18A/B a montré un profil d'expression très similaire à celui du gène codant pour une protéine de type SAM22.
Les principaux composants du processus biologique « GO:0006952 Réponse de défense » et les profils d'expression des gènes candidats des allèles Lanr1 et AnMan ont été identifiés. L'échelle Log2 représente les valeurs log2 (rapport de variation) entre les plantes inoculées (Colletotrichum lupini, souche Col-08, provenant de champs de lupins de Wizhenica, Pologne, 1999) et les plantes témoins (inoculées simulées) au même moment. Les lignées de lupin à feuilles étroites suivantes ont été analysées : 83A:476 (résistante, porteuse de l'allèle Lanr1 homozygote), Boregine (résistante, fond génétique inconnu), Mandelup (modérément résistante, porteuse de l'allèle AnMan homozygote) et Population 22660 (sensible).
De plus, les profils d'expression des gènes candidats Lanr1 (TanjilG_05042) et AnMan (TanjilG_12861) identifiés par RNA-seq ont été évalués (Fig. 3). Le gène TanjilG_05042 a montré une réponse significative (activation) au niveau de la région 83A:476 uniquement au premier point de mesure (6 hpi), tandis que l'expression de TanjilG_12861 dans la boucle de Mande était significative uniquement à deux points de mesure : 6 hpi (sous-régulation) et 24 hpi (6 hpi).
Les gènes les plus surexprimés associés au terme GO:0055114 « processus redox » étaient des gènes codant pour les cytochromes P450 et la peroxydase (Fig. 4). Pour les échantillons isolés de la lignée 83A:476 à 6 hpi, les valeurs maximales ou minimales de log2 (rapport d’expression) (pour 86,6 % des gènes) ont généralement été observées entre les plantes inoculées et les plantes témoins, soulignant la forte réponse de ce génotype à l’inoculation. La lignée 83A:476 a présenté le plus grand nombre de gènes différentiellement exprimés (DEG) associés à GO:0055114 à 6 hpi (503 gènes), tandis que les autres lignées présentaient des DEG plus significatifs à 48 hpi (Boregine, 31 gènes ; Mandelup, 85 gènes ; et Population 22660, 78 gènes). Deux types de réponses à la vaccination (activation et inhibition) ont été observés pour la plupart des gènes de la famille GO:0055114. Il est intéressant de noter que jusqu'à 97,6 % des gènes différentiellement exprimés (DEGs) identifiés pour le terme GO : 0055114 chez le mandeloup à 48 h. Ces observations suggèrent que, malgré une échelle significativement plus petite (c.-à-d. le nombre de gènes redox mutés, 85 contre 503), le profil des réponses transcriptomiques retardées du mandeloup à l'anthracnose est similaire à la réponse précoce de 83A : 476. Chez la Borégine et la population 22660, cette convergence est plus faible, à 51,6 % et 75,6 % respectivement.
Les profils d'expression des principaux composants du processus biologique « GO:0055114 Processus redox » ont été mis en évidence. L'échelle Log2 représente les valeurs log2 (rapport de variation) entre les plantes inoculées (Colletotrichum lupini, souche Col-08, isolée de champs de lupins de Wizhenica, Pologne, 1999) et les plantes témoins (inoculées simulées) au même moment. Les lignées de lupin à feuilles étroites suivantes ont été analysées : 83A:476 (résistante, porteuse de l'allèle homozygote Lanr1), Boregine (résistante, fond génétique inconnu), Mandelup (modérément résistante, porteuse de l'allèle homozygote AnMan) et Population 22660 (sensible).
Les réponses transcriptomiques à l'inoculation par C. lupini (souche Col-08) ont également révélé une répression coordonnée des gènes associés au terme GO:0015979 « photosynthèse » et à d'autres processus biologiques apparentés (Fig. 5). Cet ensemble de gènes différentiellement exprimés (DEG) associés à GO:0015979 comprenait 105 gènes significativement réprimés 6 heures après l'inoculation (hpi) chez la lignée 83A:476. Dans ce sous-ensemble, 37 gènes étaient également sous-exprimés chez Mandelup 48 hpi et 35 au même moment dans la population 22660, dont 19 DEG communs aux deux génotypes. Aucun DEG associé au terme GO:0015979 n'a été significativement activé, quelle que soit la combinaison (lignée x temps).
Les profils d'expression des principaux composants du processus biologique « GO:0015979 Photosynthèse » ont été mis en évidence. L'échelle Log2 représente les valeurs log2 (rapport de variation) entre les plantes inoculées (Colletotrichum lupini, souche Col-08, isolée de champs de lupins de Wizhenica, Pologne, 1999) et les plantes témoins (inoculées simulées) au même moment. Les lignées de lupin à feuilles étroites suivantes ont été analysées : 83A:476 (résistante, porteuse de l'allèle homozygote Lanr1), Boregine (résistante, fond génétique inconnu), Mandelup (modérément résistante, porteuse de l'allèle homozygote AnMan) et Population 22660 (sensible).
Sur la base des résultats de l'analyse d'expression différentielle et présumément impliqués dans les réponses de défense contre les champignons pathogènes, cet ensemble de sept gènes a été sélectionné pour la quantification des profils d'expression par PCR en temps réel (Tableau supplémentaire S9).
Le gène putatif de la protéine TanjilG_10657 a été significativement induit dans toutes les lignées et à tous les points temporels étudiés, comparativement aux plantes témoins (Tableaux supplémentaires S10 et S11). De plus, le profil d'expression de TanjilG_10657 a montré une tendance à la hausse au cours de l'expérience pour toutes les lignées. La population 22660 a présenté la plus grande sensibilité de TanjilG_10657 à l'inoculation, avec une activation multipliée par 114 et le niveau d'expression relatif le plus élevé (4,4 ± 0,4) à 24 h post-inoculation (Fig. 6a). Le gène de la protéine PR10 LlR18A, TanjilG_27015, a également montré une activation dans toutes les lignées et à tous les points temporels, avec une signification statistique pour la plupart des points de données (Fig. 6b). À l'instar de TanjilG_10657, le niveau d'expression relative le plus élevé de TanjilG_27015 a été observé dans la population inoculée 22660 à 24 hpi (19,5 ± 2,4). Le gène de l'endochitinase acide TanjilG_04706 a été significativement surexprimé dans toutes les lignées et à tous les temps d'observation, à l'exception de Boregine à 6 hpi (Fig. 6c). Son expression a été fortement induite au premier temps d'observation (6 hpi) chez 83A:476 (multipliée par 10,5) et modérément augmentée dans les autres lignées (multipliée par 6,6 à 7,5). Au cours de l'expérience, l'expression de TanjilG_04706 est restée à des niveaux similaires chez 83A:476 et Boregine, tandis que chez Mandelup et la population 22660, elle a augmenté significativement, atteignant des valeurs relativement élevées (5,9 ± 1,5 et 6,2 ± 1,5, respectivement). Le gène TanjilG_23384, codant pour une endoglucane-1,3-β-glucosidase de type TanjilG, a présenté une forte activation aux deux premiers points de mesure (6 et 12 hpi) dans toutes les lignées, à l'exception de la population 22660 (Fig. 6d). Les niveaux d'expression relative les plus élevés de TanjilG_23384 ont été observés au deuxième point de mesure (12 hpi) chez Mandelup (2,7 ± 0,3) et 83A:476 (1,5 ± 0,1). À 24 hpi, l'expression de TanjilG_23384 était relativement faible dans toutes les lignées étudiées (de 0,04 ± 0,009 à 0,44 ± 0,12).
Profils d'expression de gènes sélectionnés (ag) obtenus par PCR quantitative. Les valeurs 6, 12 et 24 correspondent aux heures après la vaccination. Les gènes LanDExH7 et LanTUB6 ont servi à la normalisation et LanTUB6 à l'étalonnage inter-séries. Les barres d'erreur représentent l'écart-type calculé à partir de trois réplicats biologiques, chacun étant la moyenne de trois réplicats techniques. La signification statistique des différences dans les niveaux d'expression entre les plantes inoculées (Colletotrichum lupini, souche Col-08, obtenue en 1999 à partir du champ de lupin de Wierzenica, Pologne) et les plantes témoins (inoculées de manière factice) est indiquée au-dessus des points de données (*valeur P < 0,05, **valeur P ≤ 0,01, ***valeur P ≤ 0,001). La signification statistique des différences dans les niveaux d'expression entre les plantes inoculées (Colletotrichum lupini, souche Col-08, obtenue en 1999 à partir du champ de lupin de Wierzenica, Pologne) et les plantes témoins (inoculées de manière factice) est indiquée au-dessus des points de données (*valeur P < 0,05, **valeur P ≤ 0,01, ***valeur P ≤ 0,001). Les statistiques relatives à la répartition des émissions dans les zones d'exportation comprennent des vaccins (Colletotrichum lupini, société Col-08, publié en 1999 en décembre 1999). lupin dans Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Les différences statistiquement significatives dans les niveaux d'expression entre les plantes inoculées (Colletotrichum lupini, souche Col-08, obtenue en 1999 à partir d'un champ de lupins à Wierzhenice, en Pologne) et les plantes témoins (inoculées de manière simulée) sont notées au-dessus des points de données (*valeur P < 0,05, **valeur P ≤ 0,01, ***valeur P ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001)。接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物 之间水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001)。 Les statistiques relatives à la répartition dans les zones d'expédition comprennent les vaccins (Colletotrichum lupini, usine Col-08, en rapport avec le pôle lupin dans Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Les différences statistiquement significatives dans les niveaux d'expression entre les plantes inoculées (Colletotrichum lupini, souche Col-08, obtenue à partir de champs de lupins de Verzhenice, Pologne, en 1999) et les plantes témoins (inoculées de manière simulée) sont notées au-dessus des points de données (*valeur P < 0,05 , **valeur P ≤ 0,01, ***valeur P ≤ 0,001).Les lignées NLL analysées étaient : 83A:476 (résistante, portant l'allèle homozygote Lanr1), Mandelup (modérément résistante, portant l'allèle homozygote AnMan), Boregine (résistante, fond génétique inconnu) et population 22660 (sensible).
Le gène candidat TanjilG_05042, situé au locus Lanr1, a présenté un profil d'expression nettement différent de celui obtenu par séquençage d'ARN (Fig. 6e). Une activation significative de ce gène a été observée dans les populations de Mandelup et 22660 (jusqu'à 39,7 et 11,7 fois, respectivement), conduisant à des niveaux d'expression relativement élevés (jusqu'à 1,4 ± 0,14 et 7,2 ± 1,3, respectivement). La lignée 83A:476 a également révélé une surexpression du gène TanjilG_05042 (jusqu'à 3,8 fois), mais les niveaux d'expression relatifs atteints (0,044 ± 0,002) étaient plus de 30 fois inférieurs à ceux observés dans les populations de Mandelup et 22660. L'analyse par qPCR a montré des différences significatives dans les niveaux d'expression entre les génotypes dans les variants témoins (vaccinés de manière factice), atteignant une différence de 58 fois entre les populations 22660 et 83A:476, ainsi qu'entre les populations 22660 et 22660. Une différence de deux fois a été obtenue entre Boregine et Mandalup.
Le gène candidat TanjilG_12861, situé au locus AnMan, a été activé en réponse à la vaccination chez les souches 83A:476 et Mandelup, est resté neutre dans la population 22660 et a été sous-exprimé chez la souche Boregine (Fig. 6f). L'expression relative du gène TanjilG_12861 était la plus élevée chez la souche 83A:476 inoculée (0,14 ± 0,01). Le gène de la protéine de choc thermique de classe I de 17,4 kDa, TanjilG_05080 (HSP17.4), a présenté des niveaux d'expression relative plus faibles dans toutes les souches et à tous les temps d'observation étudiés (Fig. 6g). La valeur la plus élevée a été observée 24 heures après l'inoculation dans la population 22660 (0,14 ± 0,02, soit une augmentation de huit fois en réponse à la vaccination).
La comparaison des profils d'expression génique (Fig. 7) a révélé une forte corrélation entre TanjilG_10657 et quatre autres gènes : TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) et TanjilG_04706 (r = 0,79). Ces résultats suggèrent une corégulation de ces gènes lors des réponses de défense. Les gènes TanjilG_12861 et TanjilG_23384 ont présenté des profils d'expression différents, avec des coefficients de corrélation de Pearson plus faibles (de 0,08 à 0,43 et de -0,19 à 0,28, respectivement) que les autres gènes.
Les corrélations entre les profils d'expression génique ont été détectées par PCR quantitative. Les lignées de lupin à feuilles étroites suivantes ont été analysées : 83A:476 (résistante, porteuse de l'allèle homozygote Lanr1), Mandelup (modérément résistante, porteuse de l'allèle homozygote AnMan), Boregine (résistante, fond génétique inconnu) et Population 22660 (sensible). Trois points temporels ont été analysés (6, 12 et 24 heures après l'inoculation), incluant des plantes inoculées (Colletotrichum lupini, souche Col-08, isolée de champs de lupins de Wierzhenice, en Pologne, en 1999) et des plantes témoins (inoculées simulées). L'échelle représente la valeur du coefficient de corrélation de Pearson.
À partir de données obtenues à une puissance de 6 chevaux par pouce, une analyse WGCNA a été réalisée sur 9 981 gènes différentiellement exprimés (DEG) identifiés par comparaison de plantes inoculées et de plantes témoins, afin de se concentrer sur les réponses de défense précoces (Tableau supplémentaire S12). Vingt-deux modules (clusters) de gènes ont été identifiés, présentant des profils d’expression corrélés (positifs ou négatifs) entre les génotypes et les variants expérimentaux. En moyenne, les niveaux d'expression des gènes diminuaient dans l'ordre 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (dans les deux variantes, cependant, cette tendance était plus forte chez les plantes témoins). En moyenne, les niveaux d'expression des gènes diminuaient dans l'ordre 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (dans les deux variantes, cependant, cette tendance était plus forte chez les plantes témoins). Au cours de la première heure d'expédition, les gens se sont rendus dans la zone 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (dans les différentes variantes, il s'agit d'une tendance сильнее у контрольных растений). En moyenne, les niveaux d'expression des gènes ont diminué dans l'ordre 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (dans les deux variantes, cependant, cette tendance était plus forte chez les plantes témoins).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a : 476> mandelup> boregine> population 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种 在 在植物 中 更）。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 Au cours de la première heure d'expédition, les gens se sont rendus à la ligne 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (dans les différentes régions, cette tendance est à la recherche de contrôle растений). En moyenne, les niveaux d'expression génétique ont diminué dans la série 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (cependant, dans les deux variantes, cette tendance était plus forte chez les plantes témoins).La vaccination a entraîné une surexpression génique, notamment dans les modules 18, 19, 14, 6 et 1 (par ordre décroissant d'effet), une régulation négative (par exemple, les modules 9 et 20) ou des effets neutres (par exemple, les modules 11, 22, 8 et 13). L'analyse d'enrichissement des termes GO (Tableau supplémentaire S13) a révélé « GO : 0006952 Réponses protectrices » pour le module inoculé (18) présentant l'activation maximale, incluant des gènes analysés par qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 et TanjilG_27015), ainsi que de nombreux modules de photosynthèse les plus fortement inhibés par l'inoculation (9). Le concentrateur du module 18 (Fig. 8) a été identifié comme étant le gène TanjilG_26536 codant pour la protéine LlR18B de type PR-10, et le concentrateur du module 9 comme étant le gène TanjilG_28955 codant pour la protéine PsbQ du photosystème II. Un gène candidat de résistance à l'anthracnose, Lanr1 (TanjilG_05042), a été trouvé dans le module 22 (Fig. 9) et est associé aux termes « GO:0044260 Processus métaboliques macromoléculaires cellulaires » et « GO:0006355 Régulation transcriptionnelle, matrice d'ADN », portant le hub TanjilG_01212. Ce gène code pour le facteur de transcription A-4a de réponse au stress thermique (HSFA4a).
Analyse de réseau pondérée de la co-expression génique des modules présentant une surreprésentation des termes de processus biologiques « GO : 0006952 Réponses de défense ». La ligation a été simplifiée pour mettre en évidence les quatre gènes analysés par qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 et TanjilG_27015).
Analyse de réseau pondérée de la co-expression génique d'un module avec un terme de processus biologique surreprésenté « GO : 0006355 : Régulation transcriptionnelle, matrice d'ADN » et portant un gène candidat de résistance à l'anthracnose Lanr1 TanjilG_05042. La ligation a été simplifiée pour isoler le gène TanjilG_05042 et le gène central TanjilG_01212.
Les tests de résistance à l'anthracnose réalisés en Australie ont montré que la plupart des cultivars précoces étaient sensibles ; Kalya, Coromup et Mandelup ont été décrits comme modérément résistants, tandis que Wonga, Tanjil et 83A:476 ont été décrits comme très résistants^26,27,31. Ces cultivars possédaient le même allèle de résistance, désigné Lanr1, tandis que Coromup et Mandelup possédaient un allèle différent, désigné AnMan^10,26,39. Kalya, quant à lui, transmettait un allèle différent, Lanr2. En Allemagne, les tests de résistance à l'anthracnose ont permis d'identifier une lignée résistante, Bo7212, porteuse d'un allèle candidat autre que Lanr1, désigné LanrBo36.
Notre étude a révélé une très faible fréquence (environ 6 %) de l'allèle Lanr1 dans le matériel génétique testé. Cette observation concorde avec les résultats du criblage du matériel génétique d'Europe de l'Est à l'aide des marqueurs Anseq3 et Anseq4, qui ont montré que l'allèle Lanr1 n'est présent que dans deux lignées biélorusses. Cela suggère que l'allèle Lanr1 n'est pas encore largement utilisé par les programmes de sélection locaux, contrairement à l'Australie, où il s'agit d'un allèle clé pour la sélection assistée par marqueurs. Ceci pourrait être dû au niveau de résistance plus faible conféré par l'allèle Lanr1 dans les conditions de terrain européennes, comparativement aux données australiennes. De plus, des études sur l'anthracnose dans les zones à fortes précipitations d'Australie ont montré que les réponses de résistance médiées par l'allèle Lanr1 peuvent être inefficaces dans des conditions climatiques favorisant la croissance et le développement rapide du pathogène^19,42. En effet, dans la présente étude, certains symptômes d'anthracnose ont également été observés chez des génotypes porteurs de l'allèle Lanr1, suggérant que la résistance pourrait disparaître dans des conditions optimales pour le développement de C. lupini. De plus, des interprétations faussement positives de la présence des marqueurs Anseq3 et Anseq4, qui sont à environ 1 cM du locus Lanr1, sont possibles 28,30,43 .
Notre étude a montré que la lignée 83A:476, porteuse de l'allèle Lanr1, a réagi à l'inoculation de C. lupini par une reprogrammation transcriptomique à grande échelle dès le premier point temporel analysé (6 hpi), tandis que chez la lignée Mandelup, porteuse de l'allèle AnMan, les réponses transcriptomiques ont été observées beaucoup plus tard (de 24 à 48 hpi). Ces variations temporelles des réponses de défense sont associées à des différences dans les symptômes de la maladie, soulignant l'importance d'une reconnaissance précoce du pathogène pour une réponse de résistance efficace. Pour infecter les tissus végétaux, les spores de la bactérie du charbon doivent passer par plusieurs stades de développement à la surface de l'hôte, notamment la germination, la division cellulaire et la formation d'un appressorium. Un appressorium est une structure infectieuse qui se fixe à la surface de l'hôte et facilite la pénétration dans ses tissus. Ainsi, les spores de C. gloeosporioides dans un extrait de pois ont présenté une première division nucléaire après 75 à 90 minutes d'incubation, la formation d'un tube germinatif après 90 à 120 minutes, et une inhibition de la germination après 4 heures⁴⁵. Chez C. gloeosporioides cultivé sur mangue, plus de 40 % des conidies ont germé après 3 heures d'incubation, et environ 20 % des conidies ont formé des appressoria après 4 heures. Le gène CAP20, associé à la virulence chez C. gloeosporioides, a présenté une activité transcriptionnelle dans les conidies épiphytes après 3,5 heures d'incubation dans la cire de surface de l'avocat, avec de fortes concentrations de protéine CAP20 après 4 heures⁴⁶. De même, l'activité des gènes de biosynthèse de la mélanine chez C. trifolii a été induite au cours d'une incubation de 2 heures, suivie de la formation d'un appressorium après 1 heure. Des études sur les tissus foliaires ont montré que les fraisiers inoculés avec C. acutatum présentent une première suppression à 8 hpi, tandis que les tomates inoculées avec C. coccodes présentent une première suppression à 4 hpi^48,49, ce qui est globalement cohérent avec la chronologie du processus infectieux de Colletotrichum spp. Les réponses de défense rapides à 83A:476 suggèrent l'implication de gènes de résistance et d'immunité déclenchée par effecteur (ETI) chez cette lignée, tandis que les réponses retardées de Mandelup soutiennent l'hypothèse de l'immunité déclenchée par les motifs moléculaires associés aux micro-organismes (MTI)⁵⁰. Les réponses précoces à 83A:476 et Mandelup. Le chevauchement partiel entre les gènes surexprimés ou sous-exprimés dans la réponse retardée soutient également ce concept, car l'ETI est souvent considérée comme une réponse MTI accélérée et amplifiée qui aboutit à la mort cellulaire programmée au site d'infection, connue sous le nom de choc anaphylactique^51,52.
La plupart des gènes associés au terme surreprésenté de l'ontologie génique GO:0006952 « Réponse de défense » sont les 11 homologues de la protéine SAM22 (protéine de réponse au stress induite par le jeûne) et les sept principales protéines de type latex (MLP). Les protéines de type SAM22 31, 34, 43 et 423 présentent une similarité de séquence. Les gènes de type SAM22 montrent une activation significative et prolongée, associée à une résistance accrue à l'anthracnose (83A:476 et Boregine). En revanche, les gènes de type MLP sont sous-exprimés uniquement dans les lignées porteuses de l'allèle de résistance candidat (83A:476/Lanr1 à 6 hpi et Mandelup/AnMan à 24 hpi). Il est à noter que tous les homologues de type SAM22 identifiés proviennent d'un cluster de gènes d'environ 105 kb, tandis que les gènes de type MLP proviennent de régions distinctes du génome. L'activation coordonnée de ces gènes de type SAM22 a également été observée dans notre précédente étude sur la résistance de NLL à l'inoculation de Diaporthetoxica, suggérant leur implication dans les composantes horizontales de la réponse de défense. Cette conclusion est également étayée par des observations de réponse positive des gènes de type SAM22 à une lésion ou à un traitement par l'acide salicylique, des inducteurs fongiques ou le peroxyde d'hydrogène.
Il a été démontré que les gènes de type MLP répondent à divers stress abiotiques et biotiques, notamment aux infections bactériennes, virales et fongiques pathogènes chez de nombreuses espèces végétales⁵⁵. L'intensité de la réponse à certaines interactions entre les plantes et les pathogènes varie d'une forte augmentation (par exemple, lors d'une infestation du coton par Verticillium dahliae) à une diminution significative (par exemple, après une infection du pommier par Alternaria spp.)^56,57. Une forte diminution de l'expression du gène de type MLP 423 a été observée lors des mécanismes de défense de l'avocatier contre l'infection par Fusarium niger et lors de l'infection du pommier par Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola et Alternaria alternata, deux pathotypes du pommier^58,59. De plus, les cals de pommier surexprimant le gène de type MLP 423 présentent une expression réduite des gènes associés à la résistance et sont plus sensibles aux infections fongiques⁵⁹. Après une infection par Fusarium oxysporum f., l'expression du gène de type MLP 423 est également supprimée dans le matériel génétique résistant du haricot commun. cn. Infection du haricot 60.
Parmi les autres membres de la famille PR-10 identifiés dans notre étude RNA-seq, on trouve les gènes LlR18A et LlR18B, dont l'expression est augmentée, ainsi que le gène codant pour la protéine de transfert de lipides DIR1, surexprimé (1 gène) ou sous-exprimé (3 gènes). De plus, l'analyse WGCNA met en évidence le gène LlR18B comme un élément central de ce module ; ce gène est très sensible à la vaccination et porte plusieurs gènes de réponse protectrice. Les gènes LlR18A et LlR18B ont été induits dans les feuilles de lupin jaune en réponse à des bactéries pathogènes, ainsi que dans les tiges de NLL après inoculation par D. toxica. L'homologue de ces gènes chez le riz, RSOsPR10, a été rapidement induit par une infection fongique, probablement impliquée dans la voie de signalisation de l'acide jasmonique^53,61,62. Le gène DIR1 code pour des protéines de transport de lipides non spécifiques, nécessaires à l'apparition de la résistance systémique acquise (RSA). Avec le développement des réactions protectrices, la protéine DIR1 est transportée du foyer d'infection via le phloème pour induire une SAR dans les organes distants. Fait intéressant, le gène DIR1 TanjilG_02313 a été significativement induit dès le premier point de mesure dans les lignées 84A:476 et la population 22660, mais la résistance à l'anthracnose ne s'est développée qu'avec succès dans la lignée 84A:476. Ceci pourrait indiquer une certaine subfonctionnalisation du gène DIR1 dans NLL, puisque les trois autres homologues n'ont répondu à l'inoculation que dans la lignée 84A:476 à 6 hpi, et cette réponse était dirigée vers le bas.
Dans notre étude, les composants les plus fréquemment associés au processus biologique appelé « GO:0055114 Processus redox » étaient la protéine cytochrome P450, la peroxydase, la linoléique 9S/13S-lipoxygénase et l’aminocyclopropane-1-carboxylate oxydase. De plus, notre analyse WGCNA identifie l’homologue HSFA4a comme un nœud central portant des modules tels que le gène candidat de résistance Lanr1, TanjilG_05042. HSFA4a est un composant de la régulation redox-dépendante de la transcription nucléaire chez les plantes.
Les protéines du cytochrome P450 sont des oxydoréductases qui catalysent les réactions d'hydroxylation dépendantes du NADPH et/ou de l'O₂ dans le métabolisme primaire et secondaire, notamment le métabolisme des xénobiotiques, ainsi que celui des hormones, des acides gras, des stérols, des composants de la paroi cellulaire, des biopolymères et la biosynthèse de composés protecteurs⁶⁹. Dans notre étude, la variabilité de la fonction du cytochrome P450 chez les plantes a été réduite de -10,6 log2 (rapport de variation) à 5,7 en raison d'un grand nombre d'homologues altérés (37) et de différences dans les profils de réponse entre des gènes spécifiques, reflétant une révision à la hausse. Utiliser uniquement des données de séquençage d'ARN (RNA-seq) pour élucider la fonction biologique putative des gènes NLL dans une superfamille de protéines aussi vaste serait hautement spéculatif. Cependant, il convient de noter que certains gènes du cytochrome P450 sont associés à une résistance accrue aux champignons ou bactéries pathogènes, et contribuent notamment aux réactions allergiques^69,70,71.
Les peroxydases de classe III sont des enzymes végétales multifonctionnelles impliquées dans de nombreux processus métaboliques lors de la croissance et du développement des plantes, ainsi que dans la réponse aux stress environnementaux tels que la salinité, la sécheresse, une forte intensité lumineuse et les attaques de pathogènes⁷². Les peroxydases interviennent dans l'interaction de plusieurs espèces végétales avec Anthracis, notamment Stylosanthes humilis et C. gloeosporioides, Lens culinaris et C. truncatum, Phaseolus vulgaris et C. lindemuthianum, Cucumis sativus et C. lagenarium^73,74,75,76. La réponse est très rapide, parfois même 4 heures après l'inoculation (HPI), avant que le champignon ne pénètre dans les tissus végétaux⁷³. Le gène de la peroxydase a également répondu à l'inoculation de D. toxica NLL. Outre leurs fonctions typiques de régulation du stress oxydatif, les peroxydases peuvent interférer avec la croissance du pathogène en créant des barrières physiques grâce au renforcement de la paroi cellulaire lors de la lignification, de la synthèse de sous-unités ou de la réticulation de composés spécifiques. Cette fonction peut être attribuée in silico au gène TanjilG_03329 codant pour une putative peroxydase anionique formant de la lignine qui a été significativement régulée à la hausse dans notre étude dans la lignée résistante 83A:476 à 6 HPI, mais pas dans d'autres souches et points temporels qui n'ont pas répondu.
La 9S-/13S-lipoxygénase de l'acide linoléique constitue la première étape de la voie oxydative de la biosynthèse des lipides⁷⁸. Les produits de cette voie jouent de multiples rôles dans la défense des plantes, notamment le renforcement de la paroi cellulaire par la formation de dépôts de callose et de pectine, et la régulation du stress oxydatif par la production d'espèces réactives de l'oxygène^{79,80,81,82,83}. Dans la présente étude, l'expression de la 9S-/13S-lipoxygénase de l'acide linoléique était altérée dans toutes les souches. Cependant, dans la population sensible 22660, une surexpression prédominait à différents moments, tandis que dans les souches porteuses des allèles de résistance Lanr1 et AnMan, ce qui souligne la diversification de la couche d'oxylipine impliquée dans les réactions protectrices contre l'anthrax entre ces génotypes.
L'homologue de l'oxydase de l'1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACO) a été significativement surexprimé (9 gènes) ou sous-exprimé (2 gènes) après inoculation avec du lupin. À deux exceptions près, toutes ces réponses sont apparues 6 heures après l'inoculation (83A:476). La réaction enzymatique catalysée par les protéines ACO constitue l'étape limitante de la production d'éthylène et est donc finement régulée⁸⁴. L'éthylène est une hormone végétale qui joue divers rôles dans la régulation du développement des plantes et leur réponse aux stress abiotiques et biotiques. L'induction de la transcription de l'ACO et l'activation de la voie de signalisation de l'éthylène contribuent à accroître la résistance du riz au champignon hémibiotrophe Oryzae oryzae en régulant la production d'espèces réactives de l'oxygène et de phytoalexines. Un processus d'infection foliaire très similaire trouvé entre M. oryzae et C. lupini88,89, sur fond d'une régulation positive significative des homologues d'ACO dans la lignée 83A:476 rapportée dans cette étude, modifie la possibilité de conférer une résistance à l'anthracnose NLL. L'éthylène est une étape centrale de signalisation dans les voies moléculaires.
Dans la présente étude, une forte suppression de nombreux gènes associés à la photosynthèse a été observée 6 hpi chez la souche 83A:476 et 48 hpi chez les souches Mandeloop et 22660. L'ampleur et la progression de ces modifications sont proportionnelles au niveau d'infection. Une résistance à l'anthracnose a été observée dans cette expérience. Récemment, une répression forte et précoce des transcrits liés à la photosynthèse a été rapportée dans plusieurs modèles d'interactions plante-pathogène, notamment avec des bactéries et des champignons pathogènes. La suppression rapide (dès 2 hpi dans certaines interactions) et globale des gènes associés à la photosynthèse en réponse à l'infection peut déclencher une réponse immunitaire chez la plante, via la production d'espèces réactives de l'oxygène et leur interaction avec la voie de l'acide salicylique, induisant ainsi des réactions allergiques^90,94.
En conclusion, les mécanismes de défense proposés pour la lignée la plus résistante (83A:476) comprennent une reconnaissance rapide du pathogène par le gène R (vraisemblablement TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) et une signalisation par l'acide salicylique et l'éthylène, induisant une réponse allergique, suivie de l'établissement d'une SAR à longue portée. Cette action est soutenue par la protéine DIR-1. Il convient de noter que la phase biotrophe de l'infection par C. lupini est très courte (environ 2 jours), suivie d'une croissance nécrotique⁹⁵. La transition entre ces phases pourrait être associée à la nécrose et à l'expression de protéines inductibles par l'éthylène, qui déclenchent des réactions d'hypersensibilité chez les plantes hôtes. Par conséquent, la fenêtre temporelle pour une capture efficace de C. lupini au stade biotrophe est très étroite. La reprogrammation des gènes associés à l'oxydoréduction et à la photosynthèse observée chez 83A:476 à 6 hpi est cohérente avec la progression des hyphes fongiques et annonce le développement d'une réponse protectrice efficace au stade biotrophe. Les réponses transcriptomiques de Mandelup et de la population 22660 pourraient être trop tardives pour permettre au champignon de se développer avant la nécrose. Cependant, Mandelup pourrait être plus efficace que la population 22660 car la régulation relativement rapide de la protéine PR-10 favorise la résistance horizontale.
L'ETI, pilotée par le gène R canonique, semble être un mécanisme courant de résistance du haricot à l'anthracnose. Ainsi, chez la légumineuse modèle Medicago truncatula, la résistance à l'anthracnose est conférée par le gène RCT1, membre de la famille de gènes R végétaux TIR-NBS-LRR97. Ce gène confère également une résistance à large spectre à l'anthracnose chez la luzerne lorsqu'il est transféré à des plantes sensibles. Chez le haricot commun (Phyllus vulgaris), plus d'une vingtaine de gènes de résistance à l'anthracnose ont été identifiés à ce jour. Certains de ces gènes se trouvent dans des régions dépourvues de gènes R canoniques, tandis que beaucoup d'autres sont situés aux extrémités des chromosomes portant le cluster de gènes NBS-LRR, notamment TIR-NBS-LRRs99. L'étude SSR à l'échelle du génome a également confirmé l'association du gène NBS-LRR avec la résistance à l'anthracnose chez le haricot commun. Le gène R canonique a également été trouvé dans la région génomique portant le principal locus de résistance à l'anthracnose chez le lupin blanc 101.
Nos travaux montrent qu'une réaction de résistance immédiate, activée dès les premiers stades de l'infection (idéalement dans les 12 heures suivant l'infection), protège efficacement le lupin à feuilles étroites contre l'anthracnose causée par le champignon pathogène Collelotrichum lupini. Grâce au séquençage à haut débit, nous avons mis en évidence des profils d'expression différentielle des gènes de résistance à l'anthracnose chez le lupin à feuilles étroites, via les gènes de résistance Lanr1 et AnMan. Une défense efficace repose sur la conception précise des gènes codant pour les protéines impliquées dans la réaction d'oxydoréduction, la photosynthèse et la pathogénèse, quelques heures seulement après le premier contact de la plante avec le pathogène. Des réactions protectrices similaires, mais retardées, sont beaucoup moins efficaces. La résistance à l'anthracnose médiée par le gène Lanr1 s'apparente à la réponse rapide typique du gène R (immunité déclenchée par un effecteur), tandis que le gène AnMan induit vraisemblablement une réponse horizontale (immunité déclenchée par un motif moléculaire associé aux microbes), assurant une protection modérée.
Les 215 lignées NLL utilisées pour le criblage des marqueurs d'anthracnose comprenaient 74 cultivars, 60 lignées obtenues par croisement ou sélection, 5 mutants et 76 lignées sauvages ou originales. Ces lignées provenaient de 17 pays, principalement de Pologne (58), d'Espagne (47), d'Allemagne (27), d'Australie (26), de Russie (19), de Biélorussie (7), d'Italie (5) et d'autres pays. L'ensemble comprenait également des lignées de référence résistantes : 83A:476, Tanjil, Wonga (porteuse de l'allèle Lanr1) et Mandelup (porteuse de l'allèle AnMan). Ces lignées ont été obtenues auprès de la base de données européenne des ressources génétiques du lupin, gérée par Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Pologne (Tableau supplémentaire S1).
Les plantes ont été cultivées en conditions contrôlées (photopériode de 16 heures, température de 25 °C le jour et de 18 °C la nuit). Deux réplicats biologiques ont été analysés. L'ADN a été extrait de feuilles âgées de trois semaines à l'aide du kit DNeasy Plant Mini (Qiagen, Hilden, Allemagne) selon le protocole fourni. La qualité et la concentration de l'ADN extrait ont été évaluées par spectrophotométrie (NanoDrop 2000 ; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis). Le marqueur AnManM1, qui porte le gène de résistance à l'anthracnose AnMan (issu du cultivar Mandelup), et les marqueurs Anseq3 et Anseq4, qui flanquent le gène Lanr1 (issu du cultivar Tanjil), ont été analysés^11,26,28. Les homozygotes pour l'allèle de résistance ont reçu le score « 1 », les individus sensibles « 0 » et les hétérozygotes « 0,5 ».
Sur la base des résultats du criblage des marqueurs AnManM1, AnSeq3 et AnSeq4 et de la disponibilité des semences pour les expériences de suivi finales, 50 lignées NLL ont été sélectionnées pour le phénotypage de la résistance à l'anthracnose. L'analyse a été réalisée en double dans une serre à environnement contrôlé par ordinateur, avec une photopériode de 14 heures et une température de 22 °C le jour et de 19 °C la nuit. Les semences ont été scarifiées (par incision du tégument du côté opposé à l'embryon à l'aide d'une lame tranchante) avant le semis afin de prévenir la dormance due à un tégument trop dur et d'assurer une germination uniforme. Les plantes ont été cultivées en pots (11 × 11 × 21 cm) remplis de terreau stérile (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsovie, Pologne). L'inoculation a été réalisée avec la souche Colletotrichum lupini Col-08, cultivée en 1999 à partir de tiges de lupins à feuilles étroites cultivés en plein champ à Verzhenitsa, en Grande-Pologne (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Les isolats ont été cultivés sur milieu SNA à 20 °C sous lumière noire pendant 21 jours afin d'induire la sporulation. Quatre semaines après le semis, lorsque les plantes avaient atteint le stade 4-6 feuilles, l'inoculation a été effectuée par pulvérisation d'une suspension de conidies à une concentration de 0,5 x 10⁶ conidies par ml. Après inoculation, les plantes ont été maintenues à l'obscurité pendant 24 heures à une humidité relative d'environ 98 % et à une température de 25 °C afin de favoriser la germination des conidies et le processus d'infection. Les plantes ont ensuite été cultivées sous une photopériode de 14 heures, à une température de 22 °C le jour et de 19 °C la nuit, et à une humidité relative de 70 %. Le score de sensibilité à la maladie a été établi 22 jours après l'inoculation et variait de 0 (immunisé) à 9 (très sensible) selon la présence ou l'absence de lésions nécrotiques sur les tiges et les feuilles. Le poids des plantes a également été mesuré après l'évaluation. Les relations entre les génotypes des marqueurs et les phénotypes de résistance à la maladie ont été calculées par corrélation point à point (absence de marqueurs hétérozygotes dans l'ensemble des lignées pour l'analyse du phénotype de résistance à l'anthracnose).