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Le lupin angustifolius (NLL, Lupinus angustifolius L.) est une légumineuse utilisée pour la production alimentaire et l'amélioration des sols. L'expansion mondiale de la culture du NLL a attiré de nombreux champignons pathogènes, dont l'anthracnose du lupin, responsable de l'anthracnose dévastatrice. Deux allèles, Lanr1 et AnMan, conférant une résistance accrue, ont été utilisés pour la sélection du NLL, mais les mécanismes moléculaires sous-jacents restent inconnus. Dans cette étude, les marqueurs Lanr1 et AnMan ont été utilisés pour cribler des échantillons européens de NLL. Les tests du vaccin en environnement contrôlé ont confirmé l'efficacité des deux donneurs résistants. Un profilage différentiel de l'expression génique a été réalisé sur des lignées représentatives résistantes et sensibles. La résistance à l'anthracnose était associée à la surexpression des termes d'ontologie génique « GO:0006952 Defense Response », « GO:0055114 Redox Process » et « GO:0015979 Photosynthese ». Français De plus, la lignée Lanr1(83A:476) a montré une reprogrammation significative du transcriptome rapidement après l'inoculation, tandis que les autres lignées ont montré un retard dans cette réponse d'environ 42 heures. Les réponses de défense sont associées aux gènes TIR-NBS, CC-NBS-LRR et NBS-LRR, 10 protéines impliquées dans la pathogenèse, des protéines de transfert de lipides, l'endoglucane-1,3-β-glucosidase, des protéines de paroi cellulaire riches en glycine et des gènes de la voie réactive de l'oxygène. Les premières réponses à 83A:476, y compris la suppression prudente des gènes associés à la photosynthèse, ont coïncidé avec une protection réussie pendant la phase de croissance végétative de la biologie fongique, suggérant qu'un effecteur déclenche l'immunité. La réaction de Mandeloop est ralentie, tout comme la traînée horizontale globale.
Le lupin à feuilles étroites (NLL, Lupinus angustifolius L.) est une céréale riche en protéines originaire de l'ouest de la Méditerranée1,2. Il est actuellement cultivé comme aliment pour les animaux et les humains. Il est également utilisé comme engrais vert dans les rotations culturales grâce à la fixation de l'azote par des bactéries symbiotiques fixatrices d'azote et à l'amélioration globale de la structure du sol. Le NLL a connu une domestication rapide au cours du siècle dernier et subit toujours une forte pression de sélection3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Avec la généralisation de sa culture, la succession de champignons pathogènes a développé de nouvelles niches agricoles et provoqué de nouvelles maladies destructrices de cultures. Le phénomène le plus remarquable pour les producteurs et les éleveurs de lupins a été l’apparition de l’anthracnose, causée par le champignon pathogène Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Le phénomène le plus remarquable pour les producteurs et les éleveurs de lupins a été l’apparition de l’anthracnose, causée par le champignon pathogène Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Les premiers soins pour les agriculteurs et les sélectionneurs de lupin sont l'antracnose, qui est un pathogène pour le colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Le phénomène le plus notable pour les producteurs et les sélectionneurs de lupins a été l’émergence de l’anthracnose causée par le champignon pathogène Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Poilé。1 Les producteurs et les sélectionneurs de lupin sont actuellement en mesure d'exploiter l'antracnose, qui est un pathogène pour le colletotrichum lupini. (Bondar) Nirenberg, Feiler et Hagedorn13. Ce qui frappe le plus les producteurs et les sélectionneurs de lupins est l’émergence de l’anthracnose causée par le champignon pathogène Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Les premiers signalements de la maladie proviennent du Brésil et des États-Unis, les symptômes typiques apparaissant respectivement en 1912 et 1929. Cependant, après une trentaine d'années, l'agent pathogène a été désigné sous le nom de Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., téléomorphe Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., téléomorphe Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., téléomorphe de Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld dans la morphologie naturelle. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld dans Morphologie ciblée. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .et H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。et H. Schlenk, .Français Le phénotypage préliminaire de la maladie effectué au milieu du 20e siècle a montré une certaine résistance chez les accessions de NLL et de lupin jaune (L. luteus L.), mais toutes les accessions de lupin blanc (L. albus L.) testées étaient très sensibles15,16. Des études ont montré que le développement de l'anthracnose est associé à une augmentation des précipitations (humidité de l'air) et de la température (de l'ordre de 12 à 28 °C), entraînant une violation de la résistance à des températures plus élevées17, 18. En fait, le temps nécessaire à la germination des conidies et au début de la maladie était quatre fois plus court à 24 °C (4 heures) qu'à 12 °C (16 heures) dans des conditions de forte humidité19. Ainsi, le réchauffement climatique en cours a conduit à la propagation de l'anthracnose. Cependant, la maladie a été observée en France (1982) et en Ukraine (1983) comme un signe avant-coureur d'une menace imminente, mais a apparemment été ignorée par l'industrie du lupin à l'époque20,21. Quelques années plus tard, cette maladie dévastatrice s'est propagée dans le monde entier et a également touché les principaux pays producteurs de lupin comme l'Australie, la Pologne et l'Allemagne22,23,24. Suite à une épidémie d'anthracnose au milieu des années 1990, un dépistage approfondi a permis d'identifier plusieurs donneurs résistants dans les échantillons NLL19. La résistance du NLL à l'anthracnose est contrôlée par deux allèles dominants distincts trouvés dans différentes sources de germoplasme : Lanr1 dans les cultivars Tanjil et Wonga et AnMan dans le cultivar Mandalay25, 26. Ces allèles complètent les marqueurs moléculaires qui soutiennent la sélection de germoplasme résistant dans les programmes de sélection25,26,27,28,29,30. Français La lignée de sélection résistante 83A:476 portant l'allèle Lanr1 a été croisée avec la lignée sauvage sensible P27255 pour obtenir une population RIL ségrégant pour la résistance à l'anthracnose, ce qui a permis d'attribuer le locus Lanr1 au chromosome NLL-1131, 32, 33. L'alignement des marqueurs de la carte de liaison des loci de résistance flanquants à l'anthracnose avec un cadre génomique, NLL a révélé l'emplacement des trois allèles sur le même chromosome (NLL-11), mais dans des positions différentes29,34,35. Cependant, en raison du petit nombre de RIL et de la grande distance génétique entre les marqueurs et les allèles correspondants, aucune conclusion fiable ne peut être tirée sur leurs gènes sous-jacents. D'autre part, l'utilisation de la génétique inverse chez les lupins est difficile en raison de leur très faible potentiel de régénération, ce qui rend la manipulation génétique lourde37.
Le développement de matériel génétique domestiqué portant l'allèle souhaité à l'état homozygote, tel que 83A:476 (Lanr1) et Mandelup (AnMan), a ouvert la voie à l'étude de la résistance à l'anthracnose face à la présence de combinaisons d'allèles opposées dans les populations sauvages. Possibilités de mécanismes moléculaires. Comparer les réponses de défense générées par des génotypes spécifiques. Cette étude a évalué la réponse transcriptomique précoce de NLL à la vaccination contre C. lupini. Dans un premier temps, un panel européen de matériel génétique NLL contenant 215 lignées a été criblé à l'aide de marqueurs moléculaires qui marquent les allèles Lanr1 et AnMan. Le phénotypage de l'anthracnose a ensuite été réalisé sur 50 lignées NLL, préalablement sélectionnées pour leurs marqueurs moléculaires, dans des conditions contrôlées. Sur la base de ces expériences, quatre lignées différant en termes de résistance à l'anthracnose et de composition allélique Lanr1/AnMan ont été sélectionnées pour le profilage différentiel de l'expression des gènes de défense en utilisant deux approches complémentaires : le séquençage d'ARN à haut débit et la quantification par PCR en temps réel.
Français Le criblage d'un ensemble de germoplasme NLL (N = 215) avec les marqueurs Lanr1 (Anseq3 et Anseq4) et AnMan (Anseq4) et AnMan (AnManM1) a montré qu'une seule lignée (95726, près de Salamanca-b) amplifie l'allèle « résistance » pour tous les marqueurs, tandis que la « Présence d'allèles « sensibles » » a trouvé la proportion de tous les marqueurs dans 158 lignées (~ 73,5 %). Treize lignées ont produit deux allèles « résistants » du marqueur Lanr1, et 8 lignées ont produit des allèles « résistants » du marqueur Lanr1. L'allèle « résistance » du marqueur AnMan (tableau supplémentaire S1). Deux lignées étaient hétérozygotes pour le marqueur Anseq3 et une hétérozygote pour le marqueur AnManM1. Quarante-deux lignées (19,5 %) portaient des phases opposées des allèles Anseq3 et Anseq4, indiquant une fréquence élevée de recombinaison entre ces deux loci. Les phénotypes d'anthracnose en conditions contrôlées (tableau supplémentaire S2) ont révélé une variabilité de la résistance des génotypes testés, qui se reflétait dans la gravité de l'anthracnose. Les différences de scores moyens allaient de 1,8 (modérément résistant) à 6,9 (sensible) et les différences de poids des plantes allaient de 0,62 (sensible) à 4,45 g (résistant). Il y avait une corrélation significative entre les valeurs observées dans deux répétitions de l'expérience (0,51 pour les scores de gravité de la maladie, P = 0,00017 et 0,61 pour le poids des plantes, P < 0,0001) ainsi qu'entre ces deux paramètres (− 0,59 et − 0,77, P < 0,0001). Il y avait une corrélation significative entre les valeurs observées dans deux réplications de l'expérience (0,51 pour les scores de gravité de la maladie, P = 0,00017 et 0,61 pour le poids des plantes, P < 0,0001) ainsi qu'entre ces deux paramètres (− 0,59 et − 0,77, P < 0,0001). Le taux de corrélation entre les balles est de 0,51 pour chaque ballon, P = 0,00017 et 0,61 pour le nettoyage de masse, P < 0,0001), et cela peut également être dû à deux paramètres (-0,59 et -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Une corrélation significative a été trouvée entre les valeurs observées dans deux répétitions de l'expérience (0,51 pour les scores de gravité de la maladie, P = 0,00017 et 0,61 pour le poids des plantes, P < 0,0001), ainsi qu'entre ces deux paramètres (- 0,59 et -0,77, P < 0,0001) 0,0001).0,51 ， P = 0,00017, pour une valeur de 0,61, P < 0,0001, pour une valeur de 0,59 à 0,77, P < 0,0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为0,51 ， p = 0,00017 ， 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0,59 和– 0,59和– 0,59 à – 0,59 à – 0,77，P < 0,0001)。 Il est nécessaire de définir une corrélation entre les valeurs de référence, qui sont définies dans deux niveaux de puissance (le taux de mise en œuvre est de 0,51, P = 0,00017 et масса растения 0,61, P <0,0001), et peut-être deux paramètres (-0,59 et -0,0001) 0,77, P <0,0001. Il y avait une corrélation significative entre les valeurs observées en double (score de gravité de la maladie 0,51, P = 0,00017 et poids de la plante 0,61, P < 0,0001) et entre ces deux paramètres (-0,59 et -0,0001) 0,77, P < 0,0001. ).Les symptômes typiques observés chez les plantes sensibles comprennent une torsion et un pliage de la tige ressemblant à une structure en « arc de berger », suivis de lésions ovales avec des sporozoïtes orange/rose (Fig. 1 supplémentaire). Les accessions australiennes portant les gènes Lanr1 (83A:476 et Tanjil) et AnMan (Mandelup) sont modérément résistantes (0,0331 et 0,0036). Certaines lignées également porteuses des allèles Lanr1 et/ou AnMan « résistants » présentent des symptômes de la maladie.
Il est intéressant de noter que quelques lignées NLL dépourvues d’allèle marqueur « résistant » ont révélé un niveau élevé de résistance à l’anthracnose (comparable ou supérieur à celui des génotypes Lanr1 ou AnMan), comme Boregine (valeur P < 0,0001 pour les deux paramètres), Bojar (valeur P < 0,0001 pour le score et 0,001 pour le poids de la plante) et la population B-549/79b (valeur P < 0,0001 pour le score et non significative pour le poids). Il est intéressant de noter que quelques lignées NLL dépourvues d’allèle marqueur « résistant » ont révélé un niveau élevé de résistance à l’anthracnose (comparable ou supérieur à celui des génotypes Lanr1 ou AnMan), comme Boregine (valeur P < 0,0001 pour les deux paramètres), Bojar (valeur P < 0,0001 pour le score et 0,001 pour le poids de la plante) et la population B-549/79b (valeur P < 0,0001 pour le score et non significative pour le poids). Il est intéressant de noter que la ligne NLL est la seule à avoir un marqueur « résistant » tout à l'heure, et que vous avez trouvé votre propre entreprise. антракнозу (сопоставимый ou более высокий, чем для генотипов Lanr1 ou ili AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 pour les opérations de nettoyage et 0,001 pour les opérations de masse) et les tarifs B-549/79b (p < 0,0001 pour les opérations de nettoyage et les dépenses pour les opérations de masse). Il est intéressant de noter que plusieurs lignées NLL dépourvues d'allèle marqueur « résistant » ont montré un niveau élevé de résistance à l'anthracnose (comparable ou supérieur à celui des génotypes Lanr1 ou AnMan), comme Boregine (valeur P < 0,0001 pour les deux paramètres), Bojar (valeur P < 0,0001 pour l'évaluation et 0,001 pour le poids de la plante) et la population B-549/79b (valeur P < 0,0001 pour l'évaluation et non significative pour le poids).NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性(与Lanr1)或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）。 Il est intéressant de noter que certains systèmes NLL qui ne possèdent aucun marqueur « antigénique » présentent une résistance horizontale élevée (équivalente aux gènes Lanr1 ou AnMan ou supérieure), comme Boregine (les deux paramètres P < 0,0001), Bojar (valeur P < 0,0001, poids de la plante 0,001) et la souche B-549/79b (valeur P < 0,0001, poids non significatif). Ce qui est intéressant, c'est que les lignes de NLL ne sont pas liées aux marqueurs de tous les « résistance », selon vos utilisateurs. антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 ou ili AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) et la population B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Il est intéressant de noter que certaines lignées NLL dépourvues d'allèles marqueurs de « résistance » ont montré des niveaux élevés de résistance à l'anthracnose (comparables ou supérieurs aux génotypes Lanr1 ou AnMan), comme Boregine (valeur P pour les deux paramètres < 0,0001), Bojar (valeur P < 0,0001, poids de la plante 0,001) et la population B-549/79b (valeur P < 0,0001, poids non significatif).Français Ce phénomène suggère la possibilité d'une nouvelle source génétique de résistance, expliquant le manque observé de corrélation entre les génotypes marqueurs et les phénotypes de la maladie (valeurs de p de ~ 0,42 à ~ 0,98). Ainsi, le test de Kolmogorov-Smirnov a montré que les données sur la résistance à l'anthracnose étaient approximativement normalement distribuées pour les scores (valeurs de p 0,25 et 0,11) et la masse végétale (valeurs de p 0,47 et 0,55), suggérant que j'émets l'hypothèse que plus d'allèles que Lanr1 et AnMan sont impliqués.
Sur la base des résultats du criblage de résistance à l'anthracnose, quatre lignées ont été sélectionnées pour l'analyse du transcriptome : 83A : 476, Boregine, Mandelup et Population 22 660. Ces lignées ont été retestées pour la résistance à l'anthrax dans des expériences d'inoculation par séquençage d'ARN, à condition qu'elles soient les mêmes que dans le test précédent. Les valeurs des scores étaient les suivantes : Boregin (1,71 ± 1,39), 83A : 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) et population 22 660 (6,11 ± 1,29).
Le protocole Illumina NovaSeq 6000 a permis d'obtenir en moyenne 40,5 paires de lectures par échantillon (29,7 à 54,4 lectures) (tableau supplémentaire S3). Les scores d'alignement dans la séquence de référence variaient de 75,5 % à 88,6 %. La corrélation moyenne des données de nombre de lectures entre les variants expérimentaux et les réplicats biologiques variait de 0,812 à 0,997 (moyenne : 0,959). Sur les 35 170 gènes analysés, 2 917 n’ont révélé aucune expression et les 4 785 autres gènes ont été exprimés à un niveau négligeable (moyenne de base < 5). Sur les 35 170 gènes analysés, 2 917 n’ont révélé aucune expression et les 4 785 autres gènes ont été exprimés à un niveau négligeable (moyenne de base < 5). Sur 35 170 générations d'analysés, 2917 n'ont pas été expédiées, un total de 4785 générations d'unités ont été exportées dans un budget limité. (базовое среднее <5). Sur les 35 170 gènes analysés, 2 917 n’ont montré aucune expression et les 4 785 gènes restants ont été exprimés à un niveau négligeable (moyenne de base < 5).35 170 personnes, 2917 personnes, 4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35 170 Pour 35 170 générations d'analysants 2917, il n'y a pas d'expressivité, un montant de 4785 générations n'a pas besoin d'être exprimé среднее (remarque <5). Sur les 35 170 gènes analysés, 2 917 n’étaient pas exprimés et les 4 785 gènes restants avaient une expression négligeable (moyenne de base < 5).Ainsi, le nombre de gènes considérés comme exprimés (moyenne de base ≥ 5) au cours de l'expérience était de 27 468 (78,1 %) (tableau supplémentaire S4).
Dès le premier point temporel, toutes les lignées NLL ont répondu à l'inoculation de C. lupini (souche Col-08) en reprogrammant le transcriptome (tableau 1). Cependant, des différences significatives ont été observées entre les lignées. Ainsi, la lignée résistante 83A:476 (porteuse du gène Lanr1) a montré une reprogrammation significative du transcriptome au premier point temporel (6 hpi) avec une augmentation de 31 à 69 fois du nombre de gènes up et down isolés par rapport aux autres points temporels à ce point temporel. De plus, ce pic a été de courte durée, car l'expression de seuls quelques gènes est restée significativement altérée au deuxième point temporel (12 hpi). Il est intéressant de noter que Boregine, qui a également montré un niveau élevé de résistance lors du test de greffe, n'a pas subi une reprogrammation transcriptionnelle aussi massive au cours de l'expérience. Cependant, le nombre de gènes différentiellement exprimés (DEG) était le même pour Boregine et 83A:476 à 12 hpi. Mandelup et la population 22660 ont tous deux montré des pics DEG au dernier point temporel (48 l/s), indiquant un retard relatif dans les réponses de défense.
Étant donné que la lignée 83A:476 a subi une reprogrammation transcriptomique massive en réponse à C. lupini à 6 HPI, comparativement à toutes les autres lignées, environ 91 % des DEG observés à ce stade étaient spécifiques à la lignée (Fig. 1). Cependant, un certain chevauchement a été observé dans les réponses précoces entre les lignées étudiées : 68,5 %, 50,9 % et 52,6 % des DEG chez Boregine, Mandelup et la population 22660, respectivement, chevauchaient ceux trouvés dans la lignée 83A:476 à certains moments. Cependant, ces DEG ne représentaient qu'une petite fraction (0,97 à 1,70 %) de tous les DEG actuellement détectés par la lignée 83A:476. Français De plus, 11 DEG de toutes les lignées étaient cohérents à ce moment (tableaux supplémentaires S4-S6), y compris les composants communs des réponses de défense des plantes : protéine de transfert de lipides (TanjilG_32225), enzyme endoglucane-1,3-β-glucoside (TanjilG_23384), deux protéines inductibles par le stress comme SAM22 (TanjilG_31528 et TanjilG_31531), protéine de latex basique (TanjilG_32352) et deux protéines structurelles de la paroi cellulaire riches en glycine (TanjilG_19701 et TanjilG_19702). Il y avait également un chevauchement relativement élevé dans les réponses du transcriptome entre 83A:476 et Boregine à 24 HPI (total 16-38 % DEG) et entre Mandelup et la population 22660 à 48 HPI (total 14-20 % DEG).
Diagramme de Venn montrant le nombre de gènes différentiellement exprimés (DEG) dans les lignées de lupin à feuilles étroites (NLL) inoculées avec Colletotrichum lupini (souche Col-08 obtenue dans des champs de lupin à Wierzhenice, Pologne, 1999). Les lignées NLL analysées étaient : 83A:476 (résistante, porteuse de l'allèle Lanr1), Boregine (résistante, contexte génétique inconnu), Mandelup (modérément résistante, porteuse de l'allèle AnMan) et la population 22660 (très sensible). L'abréviation hpi signifie heures après vaccination. Les valeurs zéro ont été supprimées pour simplifier le graphique.
Français L'ensemble des gènes surexprimés à 6 hpi a été analysé pour la présence de domaines de gènes R canoniques (tableau supplémentaire S7). Cette étude a révélé une induction transcriptomique de gènes classiques de résistance aux maladies avec des domaines NBS-LRR uniquement à 83A:476. Cet ensemble était composé d'un gène TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), de cinq gènes CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 et tanjilg_16162), de quatre NBS-LR, Tanjilg_16162, de quatre NBS-LRRE (tanjilg_16162) ainsi que de quatre NBS-Lrr (tanjilg_16162) et de quatre NBS-LRR (TANJILG_16162). Tous ces gènes possèdent des domaines canoniques disposés selon des séquences conservées. Outre les gènes du domaine NBS-LRR, plusieurs kinases RLL ont été activées à 6 hpi, à savoir une chez Boregine (TanjilG_19877), deux chez Mandelup (TanjilG_07141 et TanjilG_19877), dans la population 22660 (TanjilG_09014 et TanjilG_10361) et deux chez 83A 27:476.
Les gènes dont l'expression a été significativement modifiée en réponse à l'inoculation avec C. lupini (souche Col-08) ont été soumis à une analyse d'enrichissement de l'ontologie génétique (GO) (tableau supplémentaire S8). Le terme de processus biologique le plus fréquemment surreprésenté était « GO:0006952 réponse de défense » qui apparaissait dans 6 combinaisons sur 16 (temps × ligne) avec une signification élevée (valeur P < 0,001) (Fig. 2). Le terme de processus biologique le plus fréquemment surreprésenté était « GO:0006952 réponse de défense » qui apparaissait dans 6 combinaisons sur 16 (temps × ligne) avec une signification élevée (valeur P < 0,001) (Fig. 2). Il est maintenant temps de pré-terminer le processus biologique en utilisant « GO : 0006952, indiquez la réponse », qui est disponible en 6 années. 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Le terme de processus biologique le plus fréquemment surreprésenté était « réponse de défense GO:0006952 », qui apparaissait dans 6 des 16 combinaisons (temps × lignée) avec une signification élevée (valeur P < 0,001) (Fig. 2)."GO:0006952 防御反应"，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 Le terme de processus biologique le plus représentatif est « GO:0006952 réponse de défense », qui apparaît dans 6 des 16 combinaisons (时间×线), avec une signification élevée (valeur P < 0,001) (图2) . Le dernier terme en date du processus biologique est "GO: 0006952 Defense Response", qui a été publié dans 6 à 16 combinaisons. (dans × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Le terme de processus biologique le plus fréquemment surreprésenté était « GO:0006952 Defense Response », qui apparaissait dans 6 combinaisons sur 16 (temps × ligne) avec une signification élevée (valeur P < 0,001) (Fig. 2).Ce terme était surreprésenté à deux moments dans 83A: 476 et Boregine (6 et 24 hpi) et à un moment dans Mandelup et la population 22660 (12 et 6 hpi, respectivement). Il s'agit d'un résultat attendu, soulignant la réponse antifongique des lignées résistantes. De plus, 83A: 476 a répondu à C. lupini en induisant rapidement des gènes liés à l'explosion oxydative représentée par le terme « processus redox GO: 0055114 », indiquant une réponse de défense spécifique, tandis que Boregine a révélé des réponses de défense spécifiques, liées au terme « GO ». :0006950 Réponse au stress”. La population 22660 a activé la réponse de résistance horizontale impliquant des métabolites secondaires, soulignant le nombre excessif de termes « GO:0016104 Processus de biosynthèse des triterpènes » et « GO:0006722 Processus de métabolisme des triterpènes » (les deux termes appartiennent au même ensemble de gènes), en tenant compte des résultats de l'analyse d'enrichissement des termes GO, la stabilité de la réaction de Mandelup était entre Boregine et la population 22660. De plus, la réaction précoce 83A:476 (6 hpi) et la réaction retardée de Mandelup et de la population 22660 incluent le terme GO:0015979 « photosynthèse » et d'autres processus biologiques connexes.
Les termes d'ontologie des gènes de bioprocédés sélectionnés dans l'annotation des gènes différentiellement exprimés lors des réponses transcriptomiques du lupin à feuilles étroites (NLL) inoculé avec du lupin charbonneux (souche Col-08 obtenue dans des champs de lupin à Wierzhenice, en Pologne, en 1999) sont fortement exagérés. Les lignées NLL analysées étaient : 83A:476 (résistante, porteuse de l'allèle homozygote Lanr1), Boregine (résistante, contexte génétique inconnu), Mandelup (modérément résistante, porteuse de l'allèle homozygote AnMan) et la population 22660 (sensible).
Étant donné que cette étude visait à identifier les gènes contribuant à la résistance à l'anthracnose, les gènes attribués aux termes GO « GO : 0006952 Réponses défensives » et « GO : 0055114 Processus redox » ont été analysés avec des seuils puisque les moyennes de base étaient ≥ 30 avec au moins une ligne. × point dans le temps combinant des valeurs statistiquement significatives de log2 (variation de facteur de multiplication). Le nombre de gènes répondant à ces critères était de 65 pour GO : 0006952 et de 524 pour GO : 0055114.
83A:476 a révélé deux pics DEG annotés avec le terme GO:0006952, le premier à 6 gènes par pouce (64 gènes, régulation positive et négative) et le second à 24 gènes par pouce (15 gènes, régulation positive uniquement). Boregine a également montré que GO:0006952 atteignait un pic au même moment, mais avec moins de DEG (11 et 8) et une activation préférentielle. Mandeloop a montré deux pics de GO:0006952 à 12 et 48 HPI, tous deux porteurs de 12 gènes (le premier avec des gènes activateurs, et le second avec uniquement des gènes suppresseurs), tandis que la population 22660 à 6 HPI (13 gènes) présentait une plus grande prédominance du pic d'augmentation. régulation. Français Il convient de noter que 96,4 % des DEG GO:0006952 dans ces pics avaient le même type de réponse (à la hausse ou à la baisse), indiquant un chevauchement significatif des réponses de défense malgré les différences dans le nombre de gènes impliqués. Le plus grand groupe de séquences liées au terme GO:0006952 code pour la protéine de message associée au stress de famine 22 (SAM22-like), qui appartient au clade protéique de la protéine associée à la pathogénèse de classe 10 (PR-10) et à la protéine de base latex. protéine similaire (MLP-like) (Fig. 3). Les deux groupes différaient dans la nature de l'expression et la direction de la réponse. Les gènes codant pour les protéines de type SAM22 ont montré une induction cohérente et significative aux premiers moments (6 ou 12 hpi) et étaient généralement insensibles à la fin de l'expérience (48 hpi), tandis que les protéines de type MLP ont montré une coordination à 6 hpi. hpi. 83A:476 et Mandelup à 48 hp/in, presque tous les autres points de données étaient insensibles. De plus, les différences dans les profils d'expression des gènes de la protéine de type SAM22 ont suivi la variabilité observée dans la résistance à l'anthracnose, car les lignées plus résistantes présentaient davantage de points temporels induisant significativement ces gènes que les gènes plus sensibles. Un autre gène PR-10 de type LlR18A/B a montré un profil d'expression très similaire à celui du gène de la protéine de type SAM22.
Français Les principaux composants du terme de processus biologique « GO:0006952 Defense Response » et les profils d'expression des gènes candidats des allèles Lanr1 et AnMan ont été identifiés. L'échelle Log2 représente les valeurs log2 (variation de facteur de multiplication) entre les plantes inoculées (Colletotrichum lupini, souche Col-08, obtenue à partir de champs de lupin, Wizhenica, Pologne, 1999) et les plantes témoins (inoculées de manière fictive) au même moment. Les lignées de lupin à feuilles étroites suivantes ont été analysées : 83A:476 (résistante, porteuse de l'allèle homozygote Lanr1), Boregine (résistante, contexte génétique inconnu), Mandelup (modérément résistante, porteuse de l'allèle homozygote AnMan) et Population 22660 (sensible).
De plus, les profils d'expression des gènes candidats RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) et AnMan (TanjilG_12861) ont été évalués (Fig. 3). Le gène TanjilG_05042 a montré une réponse significative (activation) à 83A:476 seulement au premier point temporel (6 hpi), tandis que TanjilG_12861 était significatif dans Mandeloop seulement à deux points temporels : 6 hpi (régulation négative) et 24 hpi (6 hpi). Avec.). réglable) ).
Français Les gènes les plus surexprimés dans le terme GO:0055114 « processus redox » étaient les gènes codant pour les protéines du cytochrome P450 et la peroxydase (Fig. 4). Pour les échantillons isolés de 83A:476 à 6 HPI, des valeurs log2 (fold change) maximales ou minimales (pour 86,6 % des gènes) ont été généralement observées entre les plantes inoculées et les plantes témoins, soulignant la forte réponse de ce génotype au sexe inoculant. 83A:476 a montré le GO:0055114 DEG le plus significatif à 6 hpi (503 gènes), tandis que le reste des lignées à 48 hpi (Boregine, 31 gènes ; Mandelup, 85 gènes ; et Population 22660, 78 gènes)). Dans la plupart des gènes de la famille GO:0055114, deux types de réponses à la vaccination (activation et inhibition) ont été observés. Il est intéressant de noter que jusqu'à 97,6 % des DEG identifiés pour le terme GO : 0055114 chez Mandelupe à 48 hp Ces observations suggèrent que, malgré l'échelle significativement plus petite (c'est-à-dire le nombre de gènes redox mutés, 85 contre 503), le modèle de réponses transcriptomiques retardées de mandeloup à l'anthracnose est similaire à la réponse précoce de 83A : 476. Chez Boregine et la population 22660, cette convergence est plus faible à 51,6 % et 75,6 %, respectivement.
Français Les profils d'expression des principaux composants du terme du processus biologique « GO:0055114 Redox process » ont été révélés. L'échelle Log2 représente les valeurs log2 (fold change) entre les plantes inoculées (Colletotrichum lupini, souche Col-08, obtenue à partir de champs de lupin, Wizhenica, Pologne, 1999) et les plantes témoins (inoculées de manière fictive) au même moment. Les lignées de lupin à feuilles étroites suivantes ont été analysées : 83A:476 (résistante, porteuse de l'allèle homozygote Lanr1), Boregine (résistante, contexte génétique inconnu), Mandelup (modérément résistante, porteuse de l'allèle homozygote AnMan) et Population 22660 (sensible).
83A:476 Les réponses transcriptomiques à l'inoculation avec C. lupini (souche Col-08) comprenaient également une inactivation coordonnée des gènes attribués au terme GO:0015979 « photosynthèse » et à d'autres processus biologiques connexes (FIG. 5). Cet ensemble de DEG GO:0015979 contenait 105 gènes qui étaient significativement réprimés à 6 hpi à 83A:476. Dans ce sous-ensemble, 37 gènes étaient également réprimés à la baisse chez Mandelup à 48 hpi et 35 au même moment dans la population 22660, dont 19 DEG communs aux deux génotypes. Aucun DEG lié au terme GO: 0015979 n'a été significativement activé dans aucune combinaison (ligne x temps).
Français Les profils d'expression des principaux composants du terme du processus biologique « GO:0015979 Photosynthèse » ont été révélés. L'échelle Log2 représente les valeurs log2 (variation de facteur) entre les plantes inoculées (Colletotrichum lupini, souche Col-08, obtenue à partir de champs de lupin, Wizhenica, Pologne, 1999) et les plantes témoins (inoculées de manière fictive) au même moment. Les lignées de lupin à feuilles étroites suivantes ont été analysées : 83A:476 (résistante, porteuse de l'allèle homozygote Lanr1), Boregine (résistante, contexte génétique inconnu), Mandelup (modérément résistante, porteuse de l'allèle homozygote AnMan) et Population 22660 (sensible).
Sur la base des résultats de l'analyse d'expression différentielle et vraisemblablement impliqué dans les réponses de défense contre les champignons pathogènes, cet ensemble de sept gènes a été sélectionné pour la quantification des profils d'expression par PCR en temps réel (tableau supplémentaire S9).
Français Le gène protéique putatif TanjilG_10657 a été significativement induit dans toutes les lignées étudiées et à tous les moments par rapport aux plantes témoins (mimétiques) (Tableaux supplémentaires S10, S11). De plus, le profil d'expression de TanjilG_10657 a montré une tendance à la hausse au cours de l'expérience pour toutes les lignées. La population 22660 a montré la plus grande sensibilité de TanjilG_10657 à l'inoculation avec une activation de 114 fois et le niveau d'expression relatif le plus élevé (4,4 ± 0,4) à 24 HPI (Fig. 6a). Le gène protéique PR10 LlR18A TanjilG_27015 a également montré une activation sur toutes les lignées et à tous les moments, avec une significativité statistique à la plupart des points de données (Fig. 6b). Français Semblable à TanjilG_10657, le niveau d'expression relatif le plus élevé de TanjilG_27015 a été observé dans la population inoculée 22660 à 24 HPI (19,5 ± 2,4). Le gène de l'endochitinase acide TanjilG_04706 a été significativement régulé à la hausse dans toutes les lignées et à tous les points temporels, à l'exception de Boregine 6 hpi (Fig. 6c). Il a été fortement induit au premier point temporel (6 HPI) à 83A:476 (de 10,5 fois) et modérément augmenté dans les autres lignées (de 6,6 à 7,5 fois). Au cours de l'expérience, l'expression de TanjilG_04706 est restée à des niveaux similaires dans 83A:476 et Boregine, tandis que dans Mandelup et la population 22660, elle a significativement augmenté, atteignant des valeurs relativement élevées (5,9 ± 1,5 et 6,2 ± 1,5, respectivement). Français Le gène TanjilG_23384, semblable à l'endoglucane-1,3-β-glucosidase, a montré une activation élevée aux deux premiers temps (6 et 12 hpi) dans toutes les lignées sauf la population 22660 (Fig. 6d). Les niveaux d'expression relative les plus élevés de TanjilG_23384 ont été observés au deuxième temps (12 hpi) chez Mandelup (2,7 ± 0,3) et 83A:476 (1,5 ± 0,1). À 24 hpi, l'expression de TanjilG_23384 était relativement faible dans toutes les lignées étudiées (de 0,04 ± 0,009 à 0,44 ± 0,12).
Profils d'expression de gènes sélectionnés (ag) révélés par PCR quantitative. Les nombres 6, 12 et 24 représentent les heures après la vaccination. Les gènes LanDExH7 et LanTUB6 ont été utilisés pour la normalisation, et LanTUB6 pour l'étalonnage inter-séries. Les barres d'erreur représentent l'écart type basé sur trois réplicats biologiques, chacun étant la moyenne de trois réplicats techniques. La signification statistique des différences dans les niveaux d'expression entre les plantes inoculées (Colletotrichum lupini, souche Col-08, obtenue en 1999 dans le champ de lupin de Wierzenica, en Pologne) et les plantes témoins (inoculées de manière fictive) est indiquée au-dessus des points de données (*valeur P < 0,05, **valeur P ≤ 0,01, ***valeur P ≤ 0,001). La signification statistique des différences dans les niveaux d'expression entre les plantes inoculées (Colletotrichum lupini, souche Col-08, obtenue en 1999 dans le champ de lupin de Wierzenica, en Pologne) et les plantes témoins (inoculées de manière fictive) est indiquée au-dessus des points de données (*valeur P < 0,05, **valeur P ≤ 0,01, ***valeur P ≤ 0,001). Les statistiques relatives à la répartition des émissions dans les zones d'exportation comprennent des vaccins (Colletotrichum lupini, société Col-08, publié en 1999 en décembre 1999). lupin dans Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Des différences statistiquement significatives dans les niveaux d'expression entre les plantes inoculées (Colletotrichum lupini, souche Col-08, obtenue en 1999 dans un champ de lupin à Wierzhenice, en Pologne) et les plantes témoins (inoculées de manière fictive) sont notées au-dessus des points de données (*valeur P < 0,05, **valeur P ≤ 0,01, ***valeur P ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001)。接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物 之间水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001)。 Les statistiques relatives à la répartition dans les zones d'expédition comprennent les vaccins (Colletotrichum lupini, usine Col-08, en rapport avec le pôle lupin dans Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Des différences statistiquement significatives dans les niveaux d'expression entre les plantes inoculées (Colletotrichum lupini, souche Col-08, obtenue à partir de champs de lupin à Verzhenice, en Pologne, en 1999) et les plantes témoins (inoculées de manière fictive) sont notées au-dessus des points de données (*valeur P < 0,05, **valeur P ≤ 0,01, ***valeur P ≤ 0,001).Les lignées NLL analysées étaient : 83A:476 (résistante, portant l'allèle homozygote Lanr1), Mandelup (modérément résistante, portant l'allèle homozygote AnMan), Boregine (résistante, contexte génétique inconnu) et population 22660 (sensible).
Français Le gène candidat TanjilG_05042 au locus Lanr1 a montré un profil d'expression nettement différent des profils obtenus à partir d'études d'ARN-seq (Fig. 6e). Une activation significative de ce gène a été observée chez Mandelup et la population 22660 (jusqu'à 39,7 et 11,7 fois, respectivement), ce qui a entraîné des niveaux d'expression relativement élevés (jusqu'à 1,4 ± 0,14 et 7,2 ± 1,3, respectivement). 83A:476 a également révélé une certaine régulation positive du gène TanjilG_05042 (jusqu'à 3,8 fois), cependant, les niveaux d'expression relatifs atteints (0,044 ± 0,002) étaient plus de 30 fois inférieurs à ceux observés chez Mandelup et la population 22660. analysés par qPCR ont montré des différences significatives dans les niveaux d'expression entre les génotypes dans les variantes simulées vaccinées (témoins), atteignant une différence de 58 fois entre les populations 22660 et 83A:476, ainsi qu'entre les populations 22660 et 22660. Une différence de deux fois a été obtenue entre Boregine et Mandalup.
Français Le gène candidat au locus AnMan, TanjilG_12861, a été activé en réponse à la vaccination dans 83A:476 et Mandelup, était neutre dans la population 22660 et était sous-exprimé dans Boregine (Fig. 6f). L'expression relative du gène TanjilG_12861 était la plus élevée dans 83A:476 inoculé (0,14 ± 0,01). Le gène de la protéine de choc thermique de classe I de 17,4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 a montré des niveaux d'expression relative plus faibles dans toutes les souches étudiées et à tous les moments (Fig. 6g). La valeur la plus élevée a été observée à 24 HPI dans la population 22660 (0,14 ± 0,02, soit une multiplication par huit de la réponse à la vaccination).
Français La comparaison des profils d'expression génique (Fig. 7) a révélé une forte corrélation entre TanjilG_10657 et quatre autres gènes : TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) et TanjilG_04706 (r = 0,79). De tels résultats peuvent indiquer une corégulation de ces gènes lors des réponses de défense. Les gènes TanjilG_12861 et TanjilG_23384 ont montré des profils d'expression différents avec des valeurs de coefficient de corrélation de Pearson plus faibles (de 0,08 à 0,43 et de -0,19 à 0,28, respectivement) par rapport aux autres gènes.
Français Les corrélations entre les profils d'expression génique ont été détectées par PCR quantitative. Les lignées de lupin à feuilles étroites suivantes ont été analysées : 83A:476 (résistante, porteuse de l'allèle homozygote Lanr1), Mandelup (modérément résistante, porteuse de l'allèle homozygote AnMan), Boregine (résistante, contexte génétique inconnu) et Population 22660 (sensible). Trois points temporels ont été calculés (6, 12 et 24 heures après l'inoculation), incluant les plantes inoculées (Colletotrichum lupini, souche Col-08, obtenue dans des champs de lupin à Wierzhenice, en Pologne, en 1999) et les plantes témoins (inoculées de manière fictive). L'échelle indique la valeur du coefficient de corrélation de Pearson.
Sur la base de données obtenues à 6 chevaux par pouce, une analyse WGCNA a été réalisée sur 9 981 DEG, identifiée en comparant les plantes inoculées et témoins afin de se concentrer sur les réponses de défense précoces (tableau supplémentaire S12). Vingt-deux modules génétiques (groupes) ont été identifiés avec des profils d'expression corrélés (positifs ou négatifs) entre les génotypes et les variants expérimentaux. En moyenne, les niveaux d'expression des gènes étaient décroissants dans l'ordre 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (dans les deux variantes, cependant, cette tendance était plus forte dans les plantes témoins). En moyenne, les niveaux d'expression des gènes étaient décroissants dans l'ordre 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (dans les deux variantes, cependant, cette tendance était plus forte dans les plantes témoins). Au cours de la première heure d'expédition, les gens se sont rendus dans la zone 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (dans les différentes variantes, il s'agit d'une tendance сильнее у контрольных растений). En moyenne, les niveaux d'expression des gènes ont diminué dans l'ordre 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (dans les deux variantes, cependant, cette tendance était plus forte dans les plantes témoins).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a : 476> mandelup> boregine> population 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种 在 在植物 中 更）。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 Au cours de la première heure d'expédition, les gens se sont rendus à la ligne 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (dans les différentes régions, cette tendance est à la recherche de contrôle (répartition). En moyenne, les niveaux d'expression génétique ont diminué dans la série 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (cependant, dans les deux variantes, cette tendance était plus forte dans les plantes témoins).Français La vaccination a entraîné une régulation positive de l'expression des gènes, en particulier dans les modules 18, 19, 14, 6 et 1 (par ordre décroissant d'effet), une régulation négative (par exemple, les modules 9 et 20) ou avec des effets neutres (par exemple, les modules 11, 22, 8 et 13). L'analyse d'enrichissement des termes GO (tableau supplémentaire S13) a révélé « GO : 0006952 réponses protectrices » pour le module inoculé (18) avec une activation maximale, y compris les gènes analysés par qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 et TanjilG_27015), ainsi que de nombreux modules de photosynthèse les plus supprimés par Inoculate (9). Français Le concentrateur du module 18 (Fig. 8) a été identifié comme le gène TanjilG_26536 codant pour la protéine LlR18B de type PR-10, et le concentrateur du module 9 a été identifié comme le gène TanjilG_28955 codant pour la protéine PsbQ du photosystème II. Un gène candidat de résistance à l'anthracnose Lanr1, TanjilG_05042, a été trouvé dans le module 22 (Fig. 9) et est associé aux termes « GO:0044260 Processus métaboliques macromoléculaires cellulaires » et « GO:0006355 Régulation transcriptionnelle, modélisation de l'ADN » portant le hub TanjilG_01212. Le gène code pour le facteur de transcription du stress thermique A-4a (HSFA4a).
Analyse pondérée du réseau de coexpression génique de modules présentant une surreprésentation des termes de processus biologiques « GO : 0006952 Réponses de défense ». La ligature a été simplifiée pour mettre en évidence les quatre gènes analysés par qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 et TanjilG_27015).
Analyse de réseau pondérée de la coexpression génique d'un module dont le terme de processus biologique est surreprésenté : « GO : 0006355 : Régulation transcriptionnelle, modélisation ADN » et porteur du gène candidat de résistance à l'anthracnose Lanr1 TanjilG_05042. La ligature a été simplifiée pour isoler le gène TanjilG_05042 et le gène central TanjilG_01212.
Français Le criblage de la résistance à l'anthracnose collecté en Australie a montré que la plupart des premiers cultivars commercialisés étaient sensibles ; Kalya, Coromup et Mandelup ont été décrits comme modérément résistants, tandis que Wonga, Tanjil et 83A:476 ont été décrits comme très résistants26,27,31. avaient le même allèle de résistance, désigné Lanr1, et Coromup et Mandelup avaient un allèle différent, désigné AnMan10, 26, 39, tandis que Kalya a transmis un allèle différent. , Lanr2. Le criblage de la résistance à l'anthracnose en Allemagne a abouti à l'identification d'une lignée résistante Bo7212 avec un allèle candidat autre que Lanr1, désigné LanrBo36.
Notre étude a révélé une très faible fréquence (environ 6 %) de l'allèle Lanr1 dans le matériel génétique testé. Cette observation est cohérente avec les résultats du criblage du matériel génétique d'Europe de l'Est à l'aide des marqueurs Anseq3 et Anseq4, qui ont montré que l'allèle Lanr1 n'est présent que dans deux lignées biélorusses. Cela suggère que l'allèle Lanr1 n'est pas encore largement utilisé par les programmes de sélection locaux, contrairement à l'Australie, où il est l'un des allèles clés pour la sélection assistée par marqueurs. Cela pourrait être dû au niveau de résistance plus faible conféré par l'allèle Lanr1 dans les conditions de terrain européennes par rapport au rapport australien. De plus, des études sur l'anthracnose dans les zones à fortes précipitations en Australie ont montré que les réponses de résistance médiées par l'allèle Lanr1 pourraient ne pas être efficaces dans des conditions climatiques favorisant la croissance et le développement rapide du pathogène19,42. En fait, dans la présente étude, certains symptômes d'anthracnose ont également été observés chez les génotypes porteurs de l'allèle Lanr1, ce qui suggère que la résistance pourrait disparaître dans des conditions optimales de développement de C. lupini. De plus, des interprétations faussement positives de la présence des marqueurs Anseq3 et Anseq4, situés à environ 1 cM du locus Lanr1, sont possibles 28,30,43 .
Notre étude a montré que 83A:476, porteur de l'allèle Lanr1, a répondu à l'inoculation de C. lupini par une reprogrammation transcriptomique à grande échelle dès le premier point temporel analysé (6 hpi), tandis que chez Mandelup, porteur de l'allèle AnMan, les réponses transcriptomiques ont été observées beaucoup plus tard (de 24 à 48 hp). Ces variations temporelles des réponses de défense sont associées à des différences dans les symptômes de la maladie, soulignant l'importance d'une reconnaissance précoce de l'agent pathogène pour une réponse efficace à la résistance. Pour infecter les tissus végétaux, les spores du charbon doivent passer par plusieurs stades de développement à la surface de l'hôte, notamment la germination, la division cellulaire et la formation d'un appressorium. Un appendice est une structure infectieuse qui se fixe à la surface de l'hôte et facilite la pénétration dans les tissus de l'hôte. Français Ainsi, les spores de C. gloeosporioides dans l'extrait de pois ont montré la première division du noyau après 75 à 90 minutes d'incubation, la formation d'un tube germinatif après 90 à 120 minutes et la suppression après 4 heures 45. La mangue C. gloeosporioides a montré plus de 40 % de germination des conidies après 3 heures d'incubation et environ 20 % de formation d'appresseurs après 4 heures. Le gène CAP20 associé à la virulence de C. gloeosporioides a montré une activité transcriptionnelle dans les conidies formant des épiphytes après 3,5 h d'incubation dans la cire de surface d'avocat avec des concentrations élevées de protéine CAP20 après 4 h 46 min. De même, l'activité des gènes de biosynthèse de la mélanine chez C. trifolii a été induite pendant une incubation de 2 heures suivie de la formation d'un appressorium après 1 heure. Français Des études sur les tissus foliaires ont montré que les fraises inoculées avec C. acutatum ont une première suppression à 8 hpi, tandis que les tomates inoculées avec C. coccodes ont une première suppression à 4 hpi48,49. largement cohérent avec l'échelle de temps du processus infectieux de Colletotrichum spp. Les réponses de défense rapides à 83A:476 suggèrent l'implication de la résistance des plantes et des gènes d'immunité déclenchée par les effecteurs (ETI) dans cette lignée, tandis que les réponses retardées de Mandelup soutiennent l'hypothèse de l'immunité déclenchée par un motif moléculaire micro-associé (MTI) 50. Réponses précoces à 83A: 476 et Mandelup. Le chevauchement partiel entre les gènes régulés à la hausse ou à la baisse dans la réponse retardée soutient également ce concept, car l'ETI est souvent considérée comme une réponse MTI accélérée et améliorée qui culmine dans la mort cellulaire programmée au site de l'infection, connue sous le nom de choc anaphylactique 51,52 .
Français La plupart des gènes attribués au terme surreprésenté Gene Ontology GO:0006952 « Defense Response » sont les 11 homologues de la protéine 22 du message de jeûne induit par le stress (similaire à SAM22) et les sept principales protéines de type latex (MLP). Les protéines de type latex 31, 34, 43 et 423 ont montré une similarité de séquence. Les gènes de type SAM22 ont montré une activation significative qui a duré plus longtemps, montrant des niveaux accrus de résistance à l'anthracnose (83A:476 et Boregine). Cependant, les gènes de type MLP n'ont été régulés à la baisse que dans les lignées portant l'allèle de résistance candidat (83A:476/Lanr1 à 6 hpi et Mandelup/AnMan à 24 hpi). Il convient de noter que tous les homologues de type SAM22 identifiés proviennent d'un groupe de gènes couvrant environ 105 kb, tandis que les gènes de type MLP proviennent de régions distinctes du génome. Une activation coordonnée de ces gènes de type SAM22 a également été observée lors de notre précédente étude sur la résistance des NLL à l'inoculation de Diaporthetoxica, suggérant leur implication dans les composantes horizontales de la réponse de défense. Cette conclusion est également corroborée par des rapports faisant état d'une réponse positive des gènes de type SAM22 à une lésion ou à un traitement par l'acide salicylique, des inducteurs fongiques ou du peroxyde d'hydrogène.
Français Il a été démontré que les gènes de type MLP réagissent à divers stress abiotiques et biotiques, notamment aux infections bactériennes, virales et fongiques pathogènes chez de nombreuses espèces végétales55. Les directions de réponse à certaines interactions entre les plantes et les agents pathogènes allaient d'une forte augmentation (c'est-à-dire lors d'une infestation du coton par Verticillium dahliae) à une diminution significative (c'est-à-dire après une infection du pommier par Alternaria spp.)56,57. Une régulation négative significative du gène 423 de type MLP a été observée lors des défenses de l'avocat contre l'infection par F. niger et lors de l'infection du pommier Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola et Alternaria alternata sont des pathotypes du pommier58,59. De plus, les cals de pommier surexprimant le gène 423 de type MLP présentaient une expression plus faible des gènes associés à la résistance et étaient plus sensibles à l'infection fongique59. Après Fusarium oxysporum f, le gène 423 de type MLP a également été supprimé dans le germoplasme résistant du haricot commun. cn. Infection du haricot 60.
Français D'autres membres de la famille PR-10 identifiés dans notre étude d'ARN-seq étaient les gènes LlR18A et LlR18B en réponse à la régulation positive, ainsi que le gène régulé positivement (1 gène) ou négativement (3 gènes) pour la protéine de transfert lipidique DIR1. . De plus, WGCNA met en évidence le gène LlR18B comme un hub dans ce module, qui est très sensible à la vaccination et porte plusieurs gènes de réponse protectrice. Les gènes LlR18A et LlR18B ont été induits dans les feuilles de lupin jaune en réponse à des bactéries pathogènes, ainsi que dans les tiges NLL après l'inoculation de D. toxica, tandis que l'homologue du riz de ces gènes, RSOsPR10, a été rapidement induit par une infection fongique vraisemblablement impliquée dans la voie de signalisation de l'acide jasmonique53,61, 62. Le gène DIR1 code des protéines de transport lipidique non spécifiques qui sont nécessaires à l'apparition de la résistance systémique acquise (SAR). Avec le développement de réactions protectrices, la protéine DIR1 est transportée du foyer d'infection à travers le phloème pour induire une SAR dans des organes distants. Il est intéressant de noter que le gène DIR1 de TanjilG_02313 a été significativement induit dès le premier point temporel dans les lignées 84A:476 et la population 22660, mais la résistance à l'anthracnose ne s'est développée avec succès que dans la lignée 84A:476. Cela pourrait indiquer une sous-fonctionnalisation du gène DIR1 dans la NLL, puisque les trois homologues restants n'ont répondu à l'inoculation que dans la lignée 83A:476 à 6 hpi, et cette réponse était dirigée vers le bas.
Dans notre étude, les composants les plus courants correspondant au processus biologique appelé « GO:0055114 Redox process » étaient la protéine du cytochrome P450, la peroxydase, la 9S-/13S-lipoxygénase de l'acide linoléique et l'oxydase de l'acide 1-aminocyclopropane-1-carboxylique. De plus, notre WGCNA définit l'homologue HSFA4a comme un hub porteur de modules tels que le candidat gène de résistance Lanr1, TanjilG_05042. HSFA4a est un composant de la régulation redox-dépendante de la transcription nucléaire chez les plantes.
Français Les protéines du cytochrome P450 sont des oxydoréductases qui catalysent les réactions d'hydroxylation dépendantes du NADPH et/ou de l'O2 dans le métabolisme primaire et secondaire, y compris le métabolisme des xénobiotiques, ainsi que des hormones, des acides gras, des stérols, des composants de la paroi cellulaire, des biopolymères et la biosynthèse de composés protecteurs 69. Dans notre Dans une étude, la variabilité de la fonction du cytochrome P450 végétal a été réduite de -10,6 log2 (changement de facteur) à 5,7 en raison d'un grand nombre d'homologues altérés (37) et de différences dans les profils de réponse entre des gènes spécifiques, reflétant une révision à la hausse. . Utiliser uniquement les données d'ARN-seq pour élucider la fonction biologique putative des gènes NLL dans une superfamille de protéines aussi grande serait hautement spéculatif. Cependant, il convient de noter que certains gènes du cytochrome P450 sont associés à une résistance accrue aux champignons ou aux bactéries pathogènes, y compris une contribution aux réactions allergiques69,70,71.
Français Les peroxydases de classe III sont des enzymes végétales multifonctionnelles impliquées dans un large éventail de processus métaboliques pendant la croissance et le développement des plantes, ainsi qu'en réponse aux stress environnementaux tels que la salinité, la sécheresse, une forte intensité lumineuse et l'attaque d'agents pathogènes72. Les peroxydases sont impliquées dans l'interaction de plusieurs espèces végétales avec Anthracis, notamment Stylosanthes humilis et C. gloeosporioides, Lens culinaris et C. truncatum, Phaseolus vulgaris et C. lindemuthianum, Cucumis sativus et C. lagenarium73,74,75,76. La réponse est très rapide, parfois même à 4 HPI, avant que le champignon ne pénètre dans le tissu végétal73. Le gène de la peroxydase a également répondu à l'inoculation de D. toxica NLL. En plus de leurs fonctions typiques de régulation de l'explosion oxydative ou d'élimination du stress oxydatif, les peroxydases peuvent interférer avec la croissance des agents pathogènes en créant des barrières physiques basées sur le renforcement de la paroi cellulaire pendant la lignification, la sous-unité ou la réticulation de composés spécifiques. Cette fonction peut être attribuée in silico au gène TanjilG_03329 codant pour une peroxydase anionique putative formant de la lignine qui a été significativement régulée à la hausse dans notre étude dans la lignée résistante 83A:476 à 6 HPI, mais pas dans d'autres souches et points temporels qui n'ont pas répondu.
Français La 9S-/13S-lipoxygénase de l'acide linoléique est la première étape de la voie oxydative de la biosynthèse des lipides78. Les produits de cette voie ont de multiples fonctions dans la défense des plantes, notamment le renforcement de la paroi cellulaire par la formation de dépôts de callose et de pectine, et la régulation du stress oxydatif par la production d'espèces réactives de l'oxygène79,80,81,82,83. Dans la présente étude, l'expression de la 9S-/13S-lipoxygénase de l'acide linoléique a été altérée dans toutes les souches, mais dans la population sensible 22660, la régulation positive a prévalu à différents moments, tandis que dans les souches porteuses de Lanr1 résistant et de l'allèle AnMan, cela souligne la diversification de la couche d'oxylipine dans les réactions protectrices contre l'anthrax entre ces génotypes.
Français L'homologue de la 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxydase (ACO) a été significativement régulé à la hausse (9 gènes) ou à la baisse (2 gènes) lorsqu'il a été inoculé avec du lupin. À deux exceptions près, toutes ces réponses se sont produites à 6 hp. à 83A:476. La réaction enzymatique médiée par les protéines ACO est l'étape limitante de la production d'éthylène et est donc hautement régulée84. L'éthylène est une hormone végétale qui joue divers rôles dans la régulation du développement des plantes et de la réponse aux conditions de stress abiotique et biotique. L'induction de la transcription de l'ACO et l'activation de la voie de signalisation de l'éthylène sont impliquées dans l'augmentation de la résistance du riz au champignon hémibiotrophe oryzae oryzae en régulant la production d'espèces réactives de l'oxygène et de phytoalexines. Un processus d'infection foliaire très similaire trouvé entre M. oryzae et C. lupini88,89, dans le contexte d'une régulation positive significative des homologues ACO dans la lignée 83A:476 rapportée dans cette étude, déplace la possibilité de conférer une résistance à l'anthracnose NLL, une étape centrale de signalisation dans les voies moléculaires.
Français Dans la présente étude, une suppression à grande échelle de nombreux gènes associés à la photosynthèse a été observée à 6 hpi dans 83A:476 et à 48 hpi dans Mandeloop et la population 22660. L'étendue et la progression de ces changements sont proportionnelles au niveau. Une résistance à l'anthracnose a été observée dans cette expérience. Récemment, une répression forte et précoce des transcrits liés à la photosynthèse a été rapportée dans plusieurs modèles d'interactions plantes-pathogènes, y compris les bactéries et les champignons pathogènes. La hâte (à partir de 2 HPI dans certaines interactions) et la suppression globale des gènes associés à la photosynthèse en réponse à l'infection peuvent déclencher l'immunité des plantes basée sur le déploiement d'espèces réactives de l'oxygène et leur interaction avec la voie de l'acide salicylique pour médier les réactions allergiques 90,94.
Français En conclusion, les mécanismes de réponse de défense proposés pour la lignée la plus résistante (83A:476) comprennent la reconnaissance rapide de l'agent pathogène par le gène R (vraisemblablement TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) et la signalisation de l'acide salicylique et de l'éthylène médiée par la réponse allergique, suivie de l'établissement d'une SAR à longue portée. L'action est soutenue par la protéine DIR-1. Il convient de noter que la période biotrophique de l'infection par C. lupini est très courte (environ 2 jours), suivie d'une croissance nécrotique95. La transition entre ces stades peut être associée à une nécrose et à l'expression de protéines inductibles par l'éthylène qui agissent comme déclencheurs de réactions d'hypersensibilité chez les plantes hôtes. Par conséquent, la fenêtre temporelle pour une capture réussie de C. lupini au stade biotrophe est très étroite. La reprogrammation des gènes associés à la redox et à la photosynthèse observée chez 83A:476 à 6 hpi est cohérente avec la progression des hyphes fongiques et annonce le développement d'une réponse protectrice efficace au stade biotrophique. Les réponses transcriptomiques de Mandelup et de la population 22660 pourraient être trop tardives pour capturer le champignon avant le passage à la croissance nécrotique. Cependant, Mandelup pourrait être plus efficace que la population 22660, car la régulation relativement rapide de la protéine PR-10 favorise la résistance horizontale.
L'ETI, induite par le gène canonique R, semble être un mécanisme courant de résistance du haricot à l'anthracnose. Ainsi, chez la légumineuse modèle Medicago truncatula, la résistance à l'anthracnose est conférée par le gène RCT1, membre de la classe de gènes R des plantes TIR-NBS-LRR97. Ce gène confère également une résistance à large spectre à l'anthracnose à la luzerne lorsqu'il est transféré à des plantes sensibles. Chez le haricot commun (P. vulgaris), plus de deux douzaines de gènes de résistance à l'anthracnose ont été identifiés à ce jour. Certains de ces gènes se trouvent dans des régions dépourvues de gènes R canoniques, mais de nombreux autres sont situés aux extrémités des chromosomes porteurs du groupe de gènes NBS-LRR, notamment TIR-NBS-LRRs99. L'étude SSR pangénomique a également confirmé l'association du gène NBS-LRR avec la résistance à l'anthracnose chez le haricot commun. Le gène canonique R a également été trouvé dans la région génomique portant le principal locus de résistance à l'anthracnose chez le lupin blanc 101.
Nos travaux montrent qu'une réaction de résistance immédiate, activée à un stade précoce de l'infection de la plante (de préférence au plus tard 12 hpi), protège efficacement le lupin à feuilles étroites de l'anthracnose causée par le champignon pathogène Collelotrichum lupini. Grâce au séquençage à haut débit, nous avons démontré des profils d'expression différentiels des gènes de résistance à l'anthracnose chez les plantes NLL, médiés par les gènes de résistance Lanr1 et AnMan. Une défense efficace implique de concevoir soigneusement les gènes des protéines impliquées dans la redox, la photosynthèse et la pathogenèse dans les heures suivant le premier contact de la plante avec un pathogène. Des réactions protectrices similaires, mais retardées dans le temps, sont beaucoup moins efficaces pour protéger les plantes contre les maladies. La résistance à l'anthrax médiée par le gène Lanr1 ressemble à la réponse rapide typique du gène R (immunité déclenchée par un effecteur), tandis que le gène AnMan fournit très probablement une réponse horizontale (immunité déclenchée par un motif moléculaire associé au microbe), offrant un niveau de durabilité modéré.
Les 215 lignées NLL utilisées pour le criblage des marqueurs de l'anthracnose comprenaient 74 cultivars, 60 lignées obtenues par croisement ou sélection, 5 mutants et 76 germoplasmes sauvages ou originaux. Les lignées provenaient de 17 pays, principalement de Pologne (58), d'Espagne (47), d'Allemagne (27), d'Australie (26), de Russie (19), de Biélorussie (7), d'Italie (5) et d'autres lignées de 10 pays. L'ensemble comprend également des lignées résistantes de référence : 83A:476, Tanjil, Wonga portant l'allèle Lanr1 et Mandelup portant l'allèle AnMan. Les lignées ont été obtenues à partir de la base de données européenne des ressources génétiques du lupin, gérée par Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Pologne (tableau supplémentaire S1).
Français Les plantes ont été cultivées dans des conditions contrôlées (photopériode de 16 heures, température de 25 °C le jour et de 18 °C la nuit). Deux réplicats biologiques ont été analysés. L'ADN a été isolé à partir de feuilles âgées de trois semaines à l'aide du kit DNeasy Plant Mini (Qiagen, Hilden, Allemagne) selon le protocole. La qualité et la concentration de l'ADN isolé ont été évaluées par des méthodes spectrophotométriques (NanoDrop 2000 ; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis). Le marqueur AnManM1 marquant le gène de résistance à l'anthracnose AnMan (dérivé du cv. Mandelup) et les marqueurs Anseq3 et Anseq4 flanquant le gène Lanr1 (dérivé du cv. Tanjil) ont été analysés 11,26,28. Les homozygotes pour l'allèle résistant ont été notés « 1 », les sensibles – « 0 » et les hétérozygotes – 0,5.
Français Sur la base des résultats du criblage pour les marqueurs AnManM1, AnSeq3 et AnSeq4 et de la disponibilité des semences pour les expériences de suivi finales, 50 lignées NLL ont été sélectionnées pour le phénotypage de résistance à l'anthracnose. L'analyse a été réalisée en double dans une serre contrôlée par ordinateur avec une photopériode de 14 heures et une plage de températures de 22 °C le jour et 19 °C la nuit. Les graines sont grattées (en coupant le tégument de la graine du côté opposé à l'embryon avec une lame tranchante) avant le semis afin d'éviter la dormance des graines due à un tégument trop dur et d'assurer une germination uniforme. Les plantes ont été cultivées dans des pots (11 × 11 × 21 cm) avec un sol stérile (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsovie, Pologne). Français L'inoculation a été réalisée avec la souche Colletotrichum lupini Col-08, cultivée en 1999 à partir de tiges de lupins à feuilles étroites cultivés dans un champ à Verzhenitsa, en Grande-Pologne (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Obtenez une zone. Les isolats ont été cultivés dans un milieu SNA à 20° C sous lumière noire pendant 21 jours pour induire la sporulation. Quatre semaines après le semis, lorsque les plantes avaient atteint le stade 4-6 feuilles, l'inoculation a été réalisée par pulvérisation d'une suspension de conidies à une concentration de 0,5 x 106 conidies par ml. Après l'inoculation, les plantes ont été maintenues à l'obscurité pendant 24 heures à une humidité d'environ 98 % et une température de 25°C pour faciliter la germination des conidies et le processus d'infection. Les plantes ont ensuite été cultivées sous une photopériode de 14 heures à 22 °C jour/19 °C nuit et 70 % d'humidité. Le score de la maladie a été établi 22 jours après l'inoculation et variait de 0 (immunisé) à 9 (très sensible) selon la présence ou l'absence de lésions nécrotiques sur les tiges et les feuilles. De plus, après le score, le poids des plantes a été mesuré. Les relations entre les génotypes marqueurs et les phénotypes de la maladie ont été calculées sous forme de corrélations point-deux-séquences (absence de marqueurs hétérozygotes dans l'ensemble des lignées pour l'analyse du phénotype de résistance à l'anthracnose).