Täname teid Nature.com-i külastamise eest. Teie kasutataval brauseriversioonil on piiratud CSS-i tugi. Parima kogemuse saamiseks soovitame teil kasutada värskendatud brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim). Seni aga renderdame saiti jätkuva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Harilik lupiin (NLL, Lupinus angustifolius L.) on kaunvili, mida kasutatakse toidutootmiseks ja mulla parandamiseks. NLL-i kui põllukultuuri ülemaailmne levik on meelitanud ligi palju patogeenseid seeni, sealhulgas lupiini antraknoosi, mis põhjustab laastavat antraknoosihaigust. NLL-i aretuses on kasutatud kahte alleeli, Lanr1 ja AnMan, mis suurendavad resistentsust, kuid nende aluseks olevad molekulaarsed mehhanismid on endiselt teadmata. Selles uuringus kasutati Euroopa NLL-i proovide skriinimiseks Lanr1 ja AnMan markereid. Vaktsiini testimine kontrollitud keskkonnas kinnitas mõlema resistentsete doonorite efektiivsust. Geeniekspressiooni diferentsiaalne profiilimine viidi läbi representatiivsetel resistentsetel ja vastuvõtlikel liinidel. Antraknoosiresistentsus oli seotud geeni ontoloogia terminite „GO:0006952 Defense Response”, „GO:0055114 Redox Process” ja „GO:0015979 Photosynthesis” üleekspressiooniga. Lisaks näitas Lanr1(83A:476) liin pärast inokuleerimist märkimisväärset ja kiiret transkriptoomi ümberprogrammeerimist, samas kui teistel liinidel täheldati selle reaktsiooni umbes 42-tunnist viivitust. Kaitsereaktsioonid on seotud TIR-NBS, CC-NBS-LRR ja NBS-LRR geenidega, 10 patogeneesis osaleva valguga, lipiidide ülekandevalkudega, endoglükaan-1,3-β-glükosidaasiga, glütsiinirikaste rakuseina valkudega ja hapniku reaktiivse raja geenidega. Varased reaktsioonid 83A:476-le, sealhulgas fotosünteesiga seotud geenide hoolikas pärssimine, langesid kokku eduka kaitsega seente bioloogia vegetatiivses kasvufaasis, mis viitab sellele, et efektor käivitab immuunsuse. Mandeloopi reaktsioon on aeglustunud, nagu ka üldine horisontaalne takistus.
Kitsalehine lupiin (NLL, Lupinus angustifolius L.) on Vahemere lääneosast pärit kõrge valgusisaldusega teravili1,2. Praegu kasvatatakse seda toidukultuurina nii loomadele kui ka inimestele. Seda peetakse ka külvikordade süsteemides haljasväetiseks tänu lämmastiku sidumisele sümbiootiliste lämmastikku siduvate bakterite poolt ja mulla struktuuri üldisele paranemisele. NLL on viimase sajandi jooksul läbinud kiire kodustamise protsessi ja on endiselt suure aretussurve all3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. NLL-i laialdase kasvatamisega tekkisid patogeensete seente järgnevuse tõttu uued põllumajanduslikud nišid ja tekkisid uued saaki hävitavad haigused. Lupiinikasvatajate ja -aretajate jaoks oli kõige tähelepanuväärsem antraknoosi ilmnemine, mida põhjustas patogeenne seen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Lupiinikasvatajate ja -aretajate jaoks oli kõige tähelepanuväärsem antraknoosi ilmnemine, mida põhjustas patogeenne seen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванногорикомноза, вызванногорныrich памермеров (Bondar) Nirenberg, Feiler ja Hagedorn13. Lupiinikasvatajate ja -aretajate jaoks oli kõige tähelepanuväärsem antraknoosi teke, mille põhjustas patogeenne seen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是生痘otrich养者(Bondar) Nirenberg, Feiler ja Hagedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是生痘otrich养者(Bondar) 嵵juukseline.1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызбонковатогогонынконеров Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler ja Hagedorn13. Lupiinikasvatajate ja -aretajate jaoks on kõige rabavam antraknoosi teke, mille põhjustab patogeenne seen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Varaseimad teated haigusest pärinesid Brasiiliast ja Ameerika Ühendriikidest, tüüpilised sümptomid ilmnesid vastavalt 1912. ja 1929. aastal. Umbes 30 aasta pärast määrati patogeeniks aga Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Kivimees) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Kivimees) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauldi teleomorf. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld sihipärases morfoloogias. & H. Schrenk,. & H. Schrenk,.ja H. Schrenk. & H.施伦克，. & H.施伦克，.ja H. Schlenk,.20. sajandi keskel tehtud esialgne haiguse fenotüüpimine näitas teatavat resistentsust NLL ja kollase lupiini (L. luteus L.) lisandites, kuid kõik testitud valge lupiini (L. albus L.) lisandid olid väga vastuvõtlikud15,16. Uuringud on näidanud, et antraknoosi teke on seotud suurenenud sademete (õhuniiskuse) ja temperatuuriga (vahemikus 12–28 °C), mis viib resistentsuse vähenemiseni kõrgematel temperatuuridel17, 18. Tegelikult oli koniidide idanemiseks ja haiguse alguseks kuluv aeg 24 °C juures (4 tundi) neli korda lühem kui 12 °C juures (16 tundi) kõrge õhuniiskuse tingimustes19. Seega on jätkuv globaalne soojenemine viinud antraknoosi levikuni. Haigust täheldati aga Prantsusmaal (1982) ja Ukrainas (1983) kui eelseisva ohu eelkäijat, kuid lupiinitööstus ignoreeris seda tol ajal ilmselt20,21. Mõni aasta hiljem levis see laastav haigus üle kogu maailma ja mõjutas ka peamisi lupiini tootvaid riike, nagu Austraalia, Poola ja Saksamaa22,23,24. Pärast antraknoosi puhangut 1990. aastate keskel tuvastati ulatusliku sõeluuringu tulemusel NLL19 proovides mitu resistentset doonorit. NLL-i resistentsust antraknoosi suhtes kontrollivad kaks eraldi domineerivat alleeli, mida leidub erinevates germplasmi allikates: Lanr1 kultivaris Tanjil ning Wonga ja AnMan kultivaris Mandalay25, 26. Need alleelid täiendavad molekulaarseid markereid, mis toetavad resistentse germplasmi valikut aretusprogrammides25,26,27,28,29,30. Resistentne aretusliin 83A:476, mis kandis Lanr1 alleeli, ristati vastuvõtliku metsiku liiniga P27255, et saada antraknoosi resistentsuse suhtes segregeeruv RIL-i populatsioon, mis võimaldas määrata Lanr1 lookuse kromosoomile NLL-1131, 32, 33. Antraknoosi külgnevate resistentsuslookuste sidemete kaardi markerite joondamine genoomse raamistikuga näitas NLL-i abil kõigi kolme alleeli asukohta samal kromosoomis (NLL-11), kuid erinevates positsioonides29,34,35. RIL-ide väikese arvu ja markerite ning vastavate alleelide vahelise suure geneetilise kauguse tõttu ei saa aga nende alusgeenide kohta usaldusväärseid järeldusi teha. Teisest küljest on pöördgeneetika kasutamine lupiinide puhul keeruline nende väga madala regeneratsioonipotentsiaali tõttu, mis muudab geneetilise manipuleerimise tülikaks37.
Kodustatud germplasmi, mis kannab soovitud alleeli homosügootses olekus, näiteks 83A:476 (Lanr1) ja Mandelup (AnMan), väljatöötamine on avanud ukse antraknoosiresistentsuse uurimiseks metsikutes populatsioonides esinevate vastandlike alleelide kombinatsioonide valguses. Molekulaarsete mehhanismide võimalused. Võrrelge spetsiifiliste genotüüpide tekitatud kaitsereaktsioone. See uuring hindas NLL-i varajast transkriptoomi vastust C. lupini vaktsineerimisele. Esmalt skriiniti Euroopa NLL-i germplasmi paneeli, mis sisaldas 215 liini, kasutades molekulaarseid markereid, mis tähistavad Lanr1 ja AnMan alleele. Seejärel viidi kontrollitud tingimustes läbi antraknoosi fenotüüpimine 50 NLL-liinil, mis olid eelnevalt molekulaarsete markerite jaoks valitud. Nende katsete põhjal valiti välja neli liini, mis erinesid antraknoosiresistentsuse ja Lanr1/AnMan alleelide koostise poolest, diferentsiaalse kaitsegeeni ekspressiooni profiilimiseks, kasutades kahte täiendavat lähenemisviisi: suure läbilaskevõimega RNA sekveneerimist ja reaalajas PCR-i kvantifitseerimist.
NLL germplasma komplekti (N = 215) skriining markeritega Lanr1 (Anseq3 ja Anseq4) ning AnMan (Anseq4) ja AnMan (AnManM1) näitas, et ainult üks liin (95726, Salamanca-b lähedal) võimendab kõigi markerite „resistentsuse“ alleeli, samas kui „vastuvõtlike“ alleelide olemasolu“ näitas kõigi markerite osakaalu 158 (~73,5%) liinis. Kolmteist liini tootsid kaks Lanr1 markeri „resistentset“ alleeli ja 8 liini tootsid Lanr1 „resistentseid“ alleele. AnMan markeri „resistentsuse“ alleel (lisa tabel S1). Kaks liini olid heterosügootsed Anseq3 markeri ja üks heterosügootne AnManM1 markeri suhtes. 42 liini (19,5%) kandsid Anseq3 ja Anseq4 alleelide vastandlikke faase, mis näitab nende kahe lookuse vahelise rekombinatsiooni suurt sagedust. Kontrollitud tingimustes esinevate antraknoosi fenotüüpide analüüs (lisatabel S2) näitas testitud genotüüpide resistentsuse varieeruvust, mis kajastus antraknoosi raskusastmes. Keskmiste skooride erinevused jäid vahemikku 1,8 (mõõdukalt resistentne) kuni 6,9 (vastuvõtlik) ja taimede kaalu erinevused jäid vahemikku 0,62 (vastuvõtlik) kuni 4,45 g (resistentne). Katse kahes korduses täheldatud väärtuste (0,51 haiguse raskusastme skooride puhul, P = 0,00017 ja 0,61 taime kaalu puhul, P < 0,0001) ja ka nende kahe parameetri vahel (−0,59 ja −0,77, P < 0,0001) oli oluline korrelatsioon. Katse kahes korduses täheldatud väärtuste (0,51 haiguse raskusastme skooride puhul, P = 0,00017 ja 0,61 taime kaalu puhul, P < 0,0001) ja ka nende kahe parameetri vahel (−0,59 ja −0,77, P < 0,0001) oli oluline korrelatsioon. Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 тверимента) болезни, P = 0,00017 ja 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,57, Ри) 0,0001) 0,0001). Katse kahes korduses täheldatud väärtuste vahel (0,51 haiguse raskusastme skooride puhul, P = 0,00017 ja 0,61 taime kaalu puhul, P < 0,0001) ning ka nende kahe parameetri vahel (-0,59 ja -0,77, P < 0,0001) leiti oluline korrelatsioon.在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评P0.51︺ 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77,00P <1)在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 伪 参 数 之闈 ， 0,59 kuni 0,59 和 – 0,59 和 - 0,77, P < 0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях, Pовторностях, Pо1, P51,0 = 0,00017 ja масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 ja -0,0001) 0,77, P <0,0001 Duplikaatides vaadeldud väärtuste (haiguse raskusastme skoor 0,51, P = 0,00017 ja taime mass 0,61, P < 0,0001) ning nende kahe parameetri (-0,59 ja -0,0001) vahel oli oluline korrelatsioon 0,77, P < 0,0001. ).Tundlikel taimedel esinevate tüüpiliste sümptomite hulka kuuluvad varre kõverdumine ja keerdumine, mis meenutab „karjaseviu“ struktuuri, millele järgnevad ovaalsed kahjustused oranžide/roosade sporosoidiitidega (lisajoonis 1). Austraalia lisandid, mis kannavad Lanr1 (83A:476 ja Tanjil) ja AnMan (Mandelup) geene, on mõõdukalt resistentsed, 0,0331 ja 0,0036). Mõned liinid, mis kannavad ka „resistentseid“ Lanr1 ja/või AnMan alleele, näitavad haiguse sümptomeid.
Huvitaval kombel ilmnes mõnel NLL liinil, millel puudus igasugune „resistentne” markeralleel, antraknoosi suhtes kõrge resistentsuse tase (võrreldav või kõrgem kui Lanr1 või AnMan genotüüpidel), näiteks Boregine'il (mõlema parameetri P-väärtus < 0,0001), Bojaril (skoori P-väärtus < 0,0001 ja taime kaalu P-väärtus 0,001) ja populatsioonil B-549/79b (skoori P-väärtus < 0,0001 ja kaalu P-väärtus ei ole statistiliselt oluline). Huvitaval kombel ilmnes mõnel NLL liinil, millel puudus igasugune „resistentne” markeralleel, antraknoosi suhtes kõrge resistentsuse tase (võrreldav või kõrgem kui Lanr1 või AnMan genotüüpidel), näiteks Boregine'il (mõlema parameetri P-väärtus < 0,0001), Bojaril (skoori P-väärtus < 0,0001 ja taime kaalu P-väärtus 0,001) ja populatsioonil B-549/79b (skoori P-väärtus < 0,0001 ja kaalu P-väärtus ei ole statistiliselt oluline). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и популяции B-549/0до1начел0е1. оценки и незначимо для массы). Huvitaval kombel näitasid mitmed NLL liinid, millel puudus igasugune „resistentne” markeralleel, antraknoosi suhtes kõrget resistentsust (võrreldav või kõrgem Lanr1 või AnMan genotüüpide puhul), näiteks Boregine (mõlema parameetri P-väärtus < 0,0001), Bojar (hindamise P-väärtus < 0,0001 ja taime kaalu puhul 0,001) ja populatsioon B-549/79b (hindamise P-väärtus < 0,0001 ja kaalu puhul mitteoluline).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭痊水平的炭疍或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分为0,0001，植物重量为0,001）和种群B-549/79b（得分P 值〼睂扩才量丏不重龇 On huvitav, et mõned NLL-süsteemid, millel puuduvad „antigeensed” markerid, näitavad üles kõrget horisontaalset resistentsust (võrdväärset Lanr1 või AnMan geenidega või kõrgemat), näiteks Boregine (mõlema parameetri P < 0,0001), Bojar (P väärtus < 0,0001, taime kaal 0,001) ja tüvi B-549/79b (P väärtus < 0,0001, kaal ei ole oluline). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высочвистевысрой к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих парамет00в1),
(значение P <0,0001, масса растения 0,001) ja популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначитения). Huvitaval kombel näitasid mõned NLL liinid, millel puudusid kõik „resistentsuse” markeralleelid, antraknoosi suhtes kõrget resistentsust (võrreldav või kõrgem Lanr1 või AnMan genotüüpidega), näiteks Boregine (mõlema parameetri P-väärtus <0,0001), Bojar (P-väärtus <0,0001, taime kaal 0,001) ja populatsioon B-549/79b (P-väärtus <0,0001, kaal ei ole oluline).See nähtus viitab võimalusele, et tegemist on uue geneetilise resistentsuse allikaga, mis selgitab täheldatud korrelatsiooni puudumist markergenotüüpide ja haigusfenotüüpide vahel (P-väärtused vahemikus ~0,42 kuni ~0,98). Seega näitas Kolmogorovi-Smirnovi test, et antraknoosi resistentsuse andmed olid skooride (P-väärtused 0,25 ja 0,11) ja taimemassi (P-väärtused 0,47 ja 0,55) osas ligikaudu normaaljaotusega, mis viitab minu hüpoteesile, et kaasatud on rohkem alleele kui Lanr1 ja AnMan.
Antraknoosi resistentsuse skriinimise tulemuste põhjal valiti transkriptoomi analüüsiks 4 liini: 83A:476, Boregine, Mandelup ja populatsioon 22660. Neid liine testiti uuesti siberi katku resistentsuse suhtes inokulatsioonikatsetes RNA sekveneerimise abil, eeldusel, et need olid samad, mis eelmises testis. Skoorid olid järgmised: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) ja populatsioon 22660 (6,11 ± 1,29).
Illumina NovaSeq 6000 protokolliga saavutati keskmiselt 40,5 M lugemispaari proovi kohta (29,7 kuni 54,4 M lugemist) (lisatabel S3). Joondusskoorid võrdlusjärjestuses olid vahemikus 75,5% kuni 88,6%. Bioloogiliste replikaatide katsevariantide lugemiskoguse andmete keskmine korrelatsioon oli vahemikus 0,812 kuni 0,997 (keskmine 0,959). 35 170 analüüsitud geenist 2917 ei ekspresseeritud ja ülejäänud 4785 geeni ekspresseeriti ebaolulisel tasemel (baaskeskmine < 5). 35 170 analüüsitud geenist 2917 ei ekspresseeritud ja ülejäänud 4785 geeni ekspresseeriti ebaolulisel tasemel (baaskeskmine < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались новспрессировались (базовое среднее <5). 35 170 analüüsitud geenist 2917 ei näidanud ekspressiooni ja ülejäänud 4785 geeni ekspresseeriti ebaolulisel tasemel (baaskeskmine <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）.35 170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительсюпо среднее значение <5). 35 170 analüüsitud geenist 2917 ei ekspresseeritud ja ülejäänud 4785 geeni ekspressioon oli tühine (baaskeskmine <5).Seega oli eksperimendi käigus ekspresseeritud geenide arv (baaskeskmine ≥ 5) 27 468 (78, 1%) (lisatabel S4).
Alates esimesest ajapunktist reageerisid kõik NLL liinid C. lupini (tüvi Col-08) inokuleerimisele transkriptoomi ümberprogrammeerimisega (tabel 1), kuid liinide vahel täheldati olulisi erinevusi. Seega näitas resistentsusliin 83A:476 (mis kannab Lanr1 geeni) esimesel ajapunktis (6 tundi pärast inokulatsiooni) olulist transkriptoomi ümberprogrammeerimist, kusjuures isoleeritud üles- ja alla-geenide arv oli samal ajapunktil võrreldes teiste ajapunktidega 31–69-kordne. Lisaks oli see piik lühiajaline, kuna ainult mõne geeni ekspressioon jäi teisel ajapunktil (12 tundi pärast inokulatsiooni) oluliselt muutumatuks. Huvitaval kombel ei läbinud Boregine, mis näitas samuti siirdekatses kõrget resistentsuse taset, katse ajal nii massiivset transkriptsioonilist ümberprogrammeerimist. Diferentsiaalselt ekspresseeritud geenide (DEG) arv oli aga Boregine'i ja 83A:476 puhul 12 tundi pärast inokulatsiooni. Nii Mandelup kui ka populatsioon 22660 näitasid viimasel ajahetkel DEG piike (48 l/s), mis näitab kaitsereaktsioonide suhtelist viivitust.
Kuna 83A:476 läbis vastusena C. lupini toimele 6. eluaastal võrreldes kõigi teiste liinidega ulatusliku transkriptoomi ümberprogrammeerimise, oli ~91% sel ajahetkel täheldatud diferentseerunud geenidest liinispetsiifilised (joonis 1). Siiski esines uuringuliinide varajastes vastustes teatav kattumine, kuna vastavalt 68,5%, 50,9% ja 52,6% diferentseerunud geenidest Boregine'is, Mandelupis ja populatsioonis 22660 kattusid teatud ajahetkedel 83A:476-s leitud muutustega. Need diferentseerunud geenid moodustasid aga vaid väikese osa (0,97–1,70%) kõigist praegu 83A:476 abil tuvastatud diferentseerunud geenidest. Lisaks olid sel ajal kõigist liinidest 11 diferentseerunud geenivarianti (DEG) koherentsed (lisatabelid S4-S6), sealhulgas taimekaitsereaktsioonide ühised komponendid: lipiidide ülekandevalk (TanjilG_32225), endoglükaan-1,3-β-glükosiidensüüm (TanjilG_23384), kaks stressist indutseeritavat valku nagu SAM22 (TanjilG_31528 ja TanjilG_31531), aluseline lateksvalk (TanjilG_32352) ja kaks glütsiinirikast struktuurset rakuseina valku (TanjilG_19701 ja TanjilG_19702). Samuti oli transkriptoomi vastustes suhteliselt suur kattumine 83A:476 ja Boregine vahel 24. HPI juures (kokku 16-38% DEG) ning Mandelupi ja populatsiooni 22660 vahel 48. HPI juures (kokku 14-20% DEG).
Venni diagramm, mis näitab diferentsiaalselt ekspresseeritud geenide (DEG) arvu kitsalehiste lupiinide (NLL) liinides, mida inokuleeriti Colletotrichum lupiniga (tüvi Col-08, saadud lupiinipõldudelt Wierzhenice'is, Poolas, 1999). Analüüsitud NLL liinid olid: 83A:476 (resistentne, kannab Lanr1 alleeli), Boregine (resistentne, geneetiline taust teadmata), Mandelup (mõõdukalt resistentne, kannab AnMan alleeli) ja populatsioon 22660 (väga vastuvõtlik). Lühend hpi tähistab tunde pärast vaktsineerimist. Graafiku lihtsustamiseks on nullväärtused eemaldatud.
6 hpi üleekspresseeritud geenide komplekti analüüsiti kanooniliste R-geeni domeenide olemasolu suhtes (lisa tabel S7). See uuring näitas klassikaliste haigusresistentsusgeenide transkriptoomi indutseerimist ainult NBS-LRR domeenidega positsioonil 83A:476. See komplekt koosnes ühest TIR-NBS-LRR geenist (tanjilg_05042), viiest CC-NBS-LRR geenist (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 ja tanjilg_16162) ning neljast NBS-LR (Tanjilg_16162) ja neljast NBS-LRRE (tanjilg_16162) geenist, samuti neljast NBS-Lrr (tanjilg_16162) ja neljast NBS-LRR (TANJILG_16162) geenist. Kõigil neil geenidel on kanoonilised domeenid, mis on paigutatud konserveerunud järjestustesse. Lisaks NBS-LRR domeeni geenidele aktiveeriti 6 hpi juures mitu RLL kinaasi, nimelt üks Boregine'is (TanjilG_19877), kaks Mandelupis (TanjilG_07141 ja TanjilG_19877) ja populatsioonis 22660 (TanjilG_09014 ja TanjilG_10361) ning kaks 83A 27:476-s.
C. lupini'ga (tüvi Col-08) inokuleerimisel oluliselt muutunud ekspressiooniga geene allutati geeni ontoloogia (GO) rikastamise analüüsile (lisa tabel S8). Kõige sagedamini üleesindatud bioloogilise protsessi termin oli „GO:0006952 kaitsereaktsioon”, mis ilmnes 6-s 16-st (aeg × joon) kombinatsioonist suure olulisusega (P väärtus <0, 001) (joonis 2). Kõige sagedamini üleesindatud bioloogilise protsessi termin oli „GO:0006952 kaitsereaktsioon”, mis ilmnes 6-s 16-st (aeg × joon) kombinatsioonist suure olulisusega (P väärtus <0, 001) (joonis 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный», откоретый» появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Kõige sagedamini üleesindatud bioloogilise protsessi termin oli „GO:0006952 kaitsereaktsioon”, mis ilmnes 6-s 16-st (aeg × liini) kombinatsioonist, millel oli kõrge olulisus (P väärtus <0, 001) (joonis 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）. Kõige tüüpilisem bioloogilise protsessi termin on „GO:0006952 kaitsereaktsioon“, mis esineb 16-st (时间×线) kombinatsioonist 6-s, millel on kõrge olulisus (P väärtus < 0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», копяры 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Kõige sagedamini üleesindatud bioloogilise protsessi termin oli „GO:0006952 Defense Response”, mis esines 6-s 16-st kombinatsioonist (aeg × joon) suure olulisusega (P väärtus <0,001) (joonis 2).See termin oli üleesindatud kahel ajahetkel 83A-s: 476 ja Boregine (6 ja 24 hpi) ning ühel ajahetkel Mandelupis ja populatsioonis 22660 (vastavalt 12 ja 6 hpi). See on ootuspärane tulemus, mis rõhutab resistentsete liinide seenevastast vastust. Lisaks reageeris 83A:476 C. lupini suhtes, indutseerides kiiresti geene, mis on seotud oksüdatiivse purskega, mida esindab termin "GO:0055114 redoksprotsess", mis viitab spetsiifilisele kaitsereaktsioonile, samas kui Boregine näitas spetsiifilisi kaitsereaktsioone, mis olid seotud terminiga "GO". :0006950 Stressireaktsioon”. Populatsioon 22660 aktiveeris horisontaalse resistentsusreaktsiooni, mis hõlmas sekundaarseid metaboliite, tuues esile terminite „GO:0016104 Triterpeeni biosünteesi protsess” ja „GO:0006722 Triterpeeni metabolismi protsess” liigse arvu (mõlemad terminid kuuluvad samasse geenikomplekti), võttes arvesse GO terminite rikastamise analüüsi tulemusi, oli Mandelupi reaktsiooni stabiilsus Boregine'i ja populatsiooni 22660 vahel. Lisaks hõlmavad varajane reaktsioon 83A:476 (6 hpi) ja hilinenud reaktsioon Mandelupis ja populatsioonis 22660 terminit GO:0015979 „fotosüntees” ja teisi seotud bioloogilisi protsesse.
Siberi katku lupiiniga (Col-08 tüvi, mis saadi 1999. aastal Wierzhenice'i lupiinipõldudelt Poolas) inokuleeritud kitsalehise lupiini (NLL) transkriptoomi vastuste ajal diferentsiaalselt ekspresseeritud geenide annotatsioonis valitud bioprotsesside geenide ontoloogia terminid on tugevalt liialdatud. Analüüsitud NLL liinid olid: 83A:476 (resistentne, kannab homosügootset Lanr1 alleeli), Boregine (resistentne, teadmata geneetiline taust), Mandelup (mõõdukalt resistentne, kannab homosügootset AnMan alleeli) ja populatsioon 22660 (vastuvõtlik).
Kuna selle uuringu eesmärk oli tuvastada antraknoosiresistentsusele kaasa aitavaid geene, analüüsiti GO terminitele „GO: 0006952 Kaitsereaktsioonid” ja „GO: 0055114 Redoksprotsessid” määratud geene piirväärtustega alates algtaseme keskmistest ≥ 30, kusjuures vähemalt üks joon × ajahetk kombineeris statistiliselt olulisi log2 väärtusi (muutuse kordsus). Nendele kriteeriumidele vastasid geenid GO:0006952 puhul 65 ja GO:0055114 puhul 524.
83A:476 näitas kahte DEG-piiki, mis olid tähistatud terminiga GO:0006952, esimene 6 geeni tolli kohta (64 geeni, üles- ja allapoole regulatsioon) ja teine ​​24 geeni tolli kohta (15 geeni, ainult ülespoole regulatsioon). Boregine näitas ka, et GO:0006952 saavutas haripunkti samal ajahetkel, kuid väiksema DEG-ga (11 ja 8) ja eelistatud aktivatsiooniga. Mandeloop näitas kahte GO:0006952 piiki 12 ja 48 HPI juures, mõlemad kandsid 12 geeni (esimene aktiveerivate geenidega ja teine ​​ainult supresseerivate geenidega), samas kui 22660 populatsioonil 6 HPI juures (13 geeni) oli suurem regulatsiooni suurenemise piik. Tuleb märkida, et 96,4% GO:0006952 DEG-st nendes piikides oli sama tüüpi reaktsioon (üles või alla), mis näitab olulist kattumist kaitsereaktsioonides, hoolimata kaasatud geenide arvu erinevustest. Suurim terminiga GO:0006952 seotud järjestuste rühm kodeerib nälgimise stressiga seotud signaalvalku 22 (SAM22-laadne), mis kuulub 10. klassi patogeneesiga seotud valgu (PR-10) valgu klaadi ja tuumavalgu lateks. sarnane (MLP-laadne) valk) valk (joonis 3). Need kaks rühma erinesid ekspressiooni olemuse ja vastuse suuna poolest. SAM22-laadseid valke kodeerivad geenid näitasid järjepidevat ja olulist induktsiooni varajastel ajahetkedel (6 või 12 hpi) ning olid katse lõpus (48 hpi) üldiselt reageerimatud, samas kui MLP-laadsed valgud näitasid koordinatsiooni 6 hpi juures. 83A:476 ja Mandelup 48 hpi juures olid peaaegu kõik muud andmepunktid reageerimatud. Lisaks järgisid SAM22-laadsete valkude geenide ekspressiooniprofiilide erinevused antraknoosi resistentsuse täheldatud varieeruvust, kuna resistentsematel liinidel oli rohkem ajahetki, mis neid geene oluliselt indutseerisid, kui vastuvõtlikumatel geenidel. Teine LlR18A/B-laadne PR-10 geen näitas väga sarnast ekspressioonimustrit SAM22-laadse valgu geeniga.
Bioloogilise protsessi termini „GO:0006952 kaitsereaktsioon” põhikomponendid ja Lanr1 ja AnMan alleelide kandidaatgeenide ekspressioonimustrid identifitseeriti. Log2 skaala esindab log2 väärtusi (korda muutust) inokuleeritud (Colletotrichum lupini, tüvi Col-08, saadud lupiinipõldudelt, Wizhenica, Poola, 1999) ja kontrolltaimede (võltsinokuleeritud) vahel samal ajahetkel. Analüüsiti järgmisi kitsalehiseid lupiiniliine: 83A:476 (resistentne, kannab homosügootset Lanr1 alleeli), Boregine (resistentne, geneetiline taust teadmata), Mandelup (mõõdukalt resistentne, kannab homosügootset AnMan alleeli) ja populatsioon 22660 (vastuvõtlik).
Lisaks hinnati RNA sekveneerimise kandidaatgeenide Lanr1 (TanjilG_05042) ja AnMan (TanjilG_12861) ekspressiooniprofiile (joonis 3). TanjilG_05042 geen näitas olulist vastust (aktivatsiooni) 83A:476 juures ainult esimesel ajahetkel (6 hpi), samas kui TanjilG_12861 oli Mandeloopis oluline ainult kahel ajahetkel: 6 hpi (allareguleerimine) ja 24 hpi (6 hpi). Koos. (reguleeritav) ).
Termini GO:0055114 „redoksprotsessis“ olid enim üleekspresseeritud geenid, mis kodeerivad tsütokroom P450 valke ja peroksidaasi (joonis 4). 83A:476-st 6. eluaastal isoleeritud proovide puhul täheldati inokuleeritud ja kontrolltaimede vahel üldiselt maksimaalseid või minimaalseid log2 (kordamuutus) väärtusi (86,6% geenide puhul), mis rõhutab selle genotüübi kõrget vastust inokuleerivale seksuaalsuhele. 83A:476 näitas kõige olulisemat GO:0055114 DEG-d 6. eluaastal (503 geeni), ülejäänud liinid aga 48. eluaastal (Boregine, 31 geeni; Mandelup, 85 geeni; ja populatsioon 22660, 78 geeni). Enamikus GO:0055114 perekonna geenides täheldati vaktsineerimisele kahte tüüpi vastust (aktiveerimine ja inhibeerimine). Huvitaval kombel tuvastati Mandelupe'is 48 hj juures termini GO: 0055114 puhul kuni 97,6% DEG-dest. Need tähelepanekud viitavad sellele, et vaatamata oluliselt väiksemale skaalale (st muteerunud redoksgeenide arv, 85 versus 503) on mandelupi hilinenud transkriptoomi vastuste muster antraknoosile sarnane 83A:476 varajase vastusega. Boregine'is ja populatsioonis 22660 on see lähenemine madalam, vastavalt 51,6% ja 75,6%.
Selgitati bioloogilise protsessi „GO:0055114 Redoksprotsess” termini põhikomponentide ekspressioonimustreid. Log2 skaala esindab log2 väärtusi (kordav muutus) inokuleeritud (Colletotrichum lupini, tüvi Col-08, saadud lupiinipõldudelt, Wizhenica, Poola, 1999) ja kontrolltaimede (võltsinokuleeritud) vahel samal ajahetkel. Analüüsiti järgmisi kitsalehiseid lupiiniliine: 83A:476 (resistentne, kannab homosügootset Lanr1 alleeli), Boregine (resistentne, geneetiline taust teadmata), Mandelup (mõõdukalt resistentne, kannab homosügootset AnMan alleeli) ja populatsioon 22660 (vastuvõtlik).
83A:476 Transkriptoomilised vastused C. lupini (tüvi Col-08) inokuleerimisele hõlmasid ka terminiga GO:0015979 „fotosünteesi“ ja muude seotud bioloogiliste protsessidega seostatud geenide koordineeritud vaigistamist (JOONIS 5). See GO:0015979 DEG-de komplekt sisaldas 105 geeni, mis olid 83A:476 6. eluaastal oluliselt represseeritud. Selles alamhulgas oli Mandelupis 48. eluaastal 37 geeni ja 22660 populatsioonis samal ajahetkel 35 geeni allareguleeritud, sealhulgas 19 DEG-d, mis olid mõlemale genotüübile ühised. Ükski terminiga GO:0015979 seotud DEG-d ei aktiveeritud oluliselt üheski kombinatsioonis (rida x aeg).
Selgitati bioloogilise protsessi „GO:0015979 fotosüntees” termini põhikomponentide ekspressioonimustreid. Log2 skaala esindab log2 väärtusi (kordav muutus) inokuleeritud (Colletotrichum lupini, tüvi Col-08, saadud lupiinipõldudelt, Wizhenica, Poola, 1999) ja kontrolltaimede (võltsinokuleeritud) vahel samal ajahetkel. Analüüsiti järgmisi kitsalehiseid lupiiniliine: 83A:476 (resistentne, kannab homosügootset Lanr1 alleeli), Boregine (resistentne, geneetiline taust teadmata), Mandelup (mõõdukalt resistentne, kannab homosügootset AnMan alleeli) ja populatsioon 22660 (vastuvõtlik).
Diferentsiaalse ekspressioonianalüüsi tulemuste põhjal ja arvatavasti patogeensete seente vastastes kaitsereaktsioonides osaledes valiti see seitsme geeni komplekt ekspressiooniprofiilide kvantifitseerimiseks reaalajas PCR-i abil (lisatabel S9).
Oletatav valgu geen TanjilG_10657 indutseeriti oluliselt kõigis uuritud liinides ja ajapunktides võrreldes kontroll- (mimimeerivate) taimedega (lisatabelid S10, S11). Lisaks näitas TanjilG_10657 ekspressiooniprofiil katse jooksul kõigi liinide puhul kasvavat trendi. Populatsioon 22660 näitas TanjilG_10657 kõrgeimat tundlikkust inokuleerimise suhtes, aktiveerudes 114 korda ja saavutades kõrgeima suhtelise ekspressioonitaseme (4,4 ± 0,4) 24. eluaastal (joonis 6a). Ka PR10 LlR18A valgu geen TanjilG_27015 näitas aktiveerumist kõigis liinides ja ajapunktides, statistiliselt olulisena enamikus andmepunktides (joonis 6b). Sarnaselt TanjilG_10657-ga täheldati TanjilG_27015 kõrgeimat suhtelist ekspressioonitaset 22660 inokuleeritud populatsioonis 24. eluaastal (19,5 ± 2,4). Happelise endokitinaasi geeni TanjilG_04706 ekspressioon oli oluliselt ülesreguleeritud kõigis liinides ja kõigil ajahetkedel, välja arvatud Boregine 6 hpi puhul (joonis 6c). See indutseeriti tugevalt esimesel ajahetkel (6 hpi) 83A:476 juures (10,5 korda) ja suurenes mõõdukalt teistes liinides (6,6–7,5 korda). Katse ajal püsis TanjilG_04706 ekspressioon 83A:476 ja Boregine'is sarnasel tasemel, samas kui Mandelupis ja populatsioonis 22660 suurenes see oluliselt, saavutades suhteliselt kõrged väärtused (vastavalt 5,9 ± 1,5 ja 6,2 ± 1,5). Endoglükaan-1,3-β-glükosidaasilaadne geen TanjilG_23384 näitas kõrget aktivatsiooni kahel esimesel ajahetkel (6 ja 12 hpi) kõigis liinides, välja arvatud populatsioon 22660 (joonis 6d). TanjilG_23384 kõrgeimad suhtelised ekspressioonitasemed täheldati teisel ajahetkel (12 hpi) Mandelupis (2,7 ± 0,3) ja 83A:476-s (1,5 ± 0,1). 24 hpi-l oli TanjilG_23384 ekspressioon kõigis uuritud liinides suhteliselt madal (0,04 ± 0,009 kuni 0,44 ± 0,12).
Valitud geenide (ag) ekspressiooniprofiilid, mis on näidatud kvantitatiivse PCR-i abil. Numbrid 6, 12 ja 24 tähistavad tunde pärast vaktsineerimist. LanDExH7 ja LanTUB6 geene kasutati normaliseerimiseks ning LanTUB6-d seeriatevaheliseks kalibreerimiseks. Vearibad tähistavad standardhälvet, mis põhineb kolmel bioloogilisel kordusel, millest igaüks on kolme tehnilise korduse keskmine. Inokuleeritud (Colletotrichum lupini, tüvi Col-08, saadud 1999. aastal Wierzenicas, Poolas lupiinipõllult) ja kontrolltaimede (kontrollinokuleeritud) ekspressioonitasemete erinevuste statistiline olulisus on märgitud andmepunktide kohal (*P väärtus < 0,05, **P väärtus ≤ 0,01, ***P väärtus ≤ 0,001). Inokuleeritud (Colletotrichum lupini, tüvi Col-08, saadud 1999. aastal Wierzenicas, Poolas lupiinipõllult) ja kontrolltaimede (kontrollinokuleeritud) ekspressioonitasemete erinevuste statistiline olulisus on märgitud andmepunktide kohal (*P väärtus < 0,05, **P väärtus ≤ 0,01, ***P väärtus ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штаменпо Col-08, 199 Col-08. с поля люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Statistiliselt olulised erinevused ekspressioonitasemetes inokuleeritud (Colletotrichum lupini, tüvi Col-08, saadud 1999. aastal lupiinipõllult Wierzhenice'is, Poolas) ja kontrolltaimede (võltsinokuleeritud) vahel on märgitud andmepunktide kohal (*P väärtus < 0,05, **P-väärtus ≤ 0,01, ***P-väärtus ≤ 0,001).接种 (Colletotrichum lupiin, Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数（标记在数) 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 姹煤 ，之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, **P ≤ 0,01, ***P.01) Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штаменнылулуй, Col-08, люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены намхи отмечены над значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Statistiliselt olulised erinevused ekspressioonitasemetes inokuleeritud (Colletotrichum lupini, tüvi Col-08, saadud lupiinipõldudelt Verzhenice'is, Poolas, 1999. aastal) ja kontrolltaimede (võltsinokuleeritud) vahel on märgitud andmepunktide kohal (*P väärtus < 0,05, **P-väärtus ≤ 0,01, ***P-väärtus ≤ 0,001).Analüüsitud NLL liinid olid: 83A:476 (resistentne, kannab homosügootset Lanr1 alleeli), Mandelup (mõõdukalt resistentne, kannab homosügootset AnMan alleeli), Boregine (resistentne, geneetiline taust teadmata) ja populatsioon 22660 (vastuvõtlik).
Lanr1 lookuses asuva kandidaatgeeni TanjilG_05042 ekspressioonimuster erines märkimisväärselt RNA sekveneerimisuuringutest saadud profiilidest (joonis 6e). Selle geeni olulist aktivatsiooni täheldati Mandelupis ja 22660 populatsioonis (vastavalt kuni 39,7 ja 11,7 korda), mille tulemuseks olid suhteliselt kõrged ekspressioonitasemed (vastavalt kuni 1,4 ± 0,14 ja 7,2 ± 1,3). 83A:476 näitas ka TanjilG_05042 geeni mõningast ülesreguleerimist (kuni 3,8-kordselt), kuid saavutatud suhtelised ekspressioonitasemed (0,044 ± 0,002) olid enam kui 30 korda madalamad kui Mandelupis ja 22660 populatsioonis täheldatud. qPCR-i abil analüüsitud tulemused näitasid olulisi erinevusi ekspressioonitasemetes genotüüpide vahel vaktsineeritud (kontroll)variantides, ulatudes 58-kordse erinevuseni populatsioonide 22660 ja 83A:476 vahel, samuti populatsioonide 22660 ja 22660 vahel. Kahekordne erinevus saavutati Boregine'i ja Mandalupi vahel.
AnMani lookuse kandidaatgeen TanjilG_12861 aktiveerus vaktsineerimise vastusena 83A:476 ja Mandelup tüvedes, oli 22660 populatsioonis neutraalne ja Boregine'is oli see allareguleeritud (joonis 6f). TanjilG_12861 geeni suhteline ekspressioon oli kõrgeim inokuleeritud 83A:476 tüves (0,14±0,01). 17,4 kDa I klassi kuumašoki valgu geen TanjilG_05080 HSP17.4 näitas madalamat suhtelist ekspressioonitaset kõigis uuritud tüvedes ja ajapunktides (joonis 6g). Kõrgeim väärtus täheldati 24. HPI juures 22660 populatsioonis (0,14 ± 0,02, kaheksakordne vaktsineerimisvastuse suurenemine).
Geeniekspressiooni profiilide võrdlus (joonis 7) näitas TanjilG_10657 ja nelja teise geeni vahel kõrget korrelatsiooni: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) ja TanjilG_04706 (r = 0,79). Sellised tulemused võivad viidata nende geenide kaasregulatsioonile kaitsereaktsioonide ajal. Geenidel TanjilG_12861 ja TanjilG_23384 olid erinevad ekspressiooniprofiilid madalamate Pearsoni korrelatsioonikordaja väärtustega (vastavalt 0,08 kuni 0,43 ja -0,19 kuni 0,28) võrreldes teiste geenidega.
Geeniekspressiooni profiilide vahelisi korrelatsioone tuvastati kvantitatiivse PCR-i abil. Analüüsiti järgmisi kitsalehiseid lupiiniliine: 83A:476 (resistentne, kannab homosügootset Lanr1 alleeli), Mandelup (mõõdukalt resistentne, kannab homosügootset AnMan alleeli), Boregine (resistentne, geneetiline taust teadmata) ja populatsioon 22660 (vastuvõtlik). Arvutati kolm ajapunkti (6, 12 ja 24 tundi pärast inokuleerimist), sealhulgas inokuleeritud (Colletotrichum lupini, tüvi Col-08, saadud lupiinipõldudelt Wierzhenice'is, Poolas, 1999. aastal) ja kontrolltaimed (võltsinokuleeritud). Skaala näitab Pearsoni korrelatsioonikordaja väärtust.
6 hobujõudu tolli kohta saadud andmete põhjal viidi läbi WGCNA 9981 DEG-l, mis identifitseeriti inokuleeritud ja kontrolltaimede võrdlemise teel, et keskenduda varajastele kaitsereaktsioonidele (lisa tabel S12). Leiti 22 geenimoodulit (klastrit), millel olid genotüüpide ja eksperimentaalsete variantide vahel korrelatsioonis (positiivsed või negatiivsed) ekspressiooniprofiilid. Keskmiselt olid geeniekspressiooni tasemed kahanevas järjekorras 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populatsioon 22660 (mõlemas variandis oli see trend kontrolltaimedes tugevam). Keskmiselt olid geeniekspressiooni tasemed kahanevas järjekorras 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populatsioon 22660 (mõlemas variandis oli see trend kontrolltaimedes tugevam). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Rahvaarv 22660 (в обоих вариантац, эантах, иэац, нотах, нетац была сильнее у контрольных растений). Keskmiselt vähenesid geeniekspressiooni tasemed järjekorras 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populatsioon 22660 (mõlemas variandis oli see trend kontrolltaimedes aga tugevam).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Rahvaarv 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）.平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> elanikkond 22660 的 顺序 下降 （Ｇ 在在 在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。. В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Rahvaarv 22660 (однако в обоих варинянтахледебентах сильнее у контрольных растений). Keskmiselt vähenesid geeniekspressiooni tasemed seerias 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populatsioon 22660 (mõlemas variandis oli see trend kontrolltaimedes siiski tugevam).Vaktsineerimine tõi kaasa geeniekspressiooni ülesreguleerimise, eriti moodulites 18, 19, 14, 6 ja 1 (kahanevas järjekorras), negatiivse regulatsiooni (nt moodulid 9 ja 20) või neutraalse efektiga (nt moodulid 11, 22, 8 ja 13). GO terminite rikastamise analüüs (lisa tabel S13) näitas inokuleeritud mooduli (18) puhul maksimaalse aktivatsiooniga „GO: 0006952 kaitsvaid reaktsioone”, sealhulgas qPCR-iga analüüsitud geene (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 ja TanjilG_27015), samuti paljusid inokuleeritud kõige enam pärssitud fotosünteesi mooduleid (9). Mooduli 18 kontsentraator (joonis 8) identifitseeriti kui TanjilG_26536 geen, mis kodeerib PR-10-laadset LlR18B valku, ja mooduli 9 kontsentraator identifitseeriti kui TanjilG_28955 geen, mis kodeerib fotosüsteem II PsbQ valku. Antraknoosi resistentsuse geeni Lanr1 kandidaat, TanjilG_05042, leiti moodulist 22 (joonis 9) ja on seotud terminitega „GO:0044260 Rakulised makromolekulaarsed ainevahetusprotsessid“ ja „GO:0006355 Transkriptsiooniline regulatsioon, DNA mallimine“, mis kannab TanjilG_01212 jaoturit. Geen kodeerib kuumastressi transkriptsioonifaktorit A-4a (HSFA4a).
Bioloogiliste protsesside üleesindatud terminitega „GO: 0006952 Defense response” moodulite geenide koekspressiooni kaalutud võrguanalüüs. Ligeerimist lihtsustati, et esile tõsta nelja qPCR-i abil analüüsitud geeni (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 ja TanjilG_27015).
Üleesindatud bioloogilise protsessi terminiga „GO: 0006355: transkriptsiooniline regulatsioon, DNA mallimine“ mooduli geeni koekspressiooni kaalutud võrgustikuanalüüs, mis kannab antraknoosi resistentsusgeeni Lanr1 TanjilG_05042. Ligeerimist lihtsustati, et eraldada TanjilG_05042 geen ja keskne TanjilG_01212 geen.
Austraalias läbi viidud antraknoosiresistentsuse skriining näitas, et enamik varakult avaldatud kultivaridest olid vastuvõtlikud; Kalya, Coromup ja Mandelup on kirjeldatud kui mõõdukalt resistentsed, samas kui Wonga, Tanjil ja 83A:476 on kirjeldatud kui väga resistentsed26,27,31. neil oli sama resistentsusalleel, mis oli tähistatud kui Lanr1, ning Coromupil ja Mandelupil oli erinev alleel, mis oli tähistatud kui AnMan10,26,39, samas kui Kalya kandis edasi teistsugust alleeli, Lanr2. Saksamaal tehtud antraknoosiresistentsuse skriining tulemusel identifitseeriti resistentne liin Bo7212, mille kandidaatalleel oli Lanr1-st erinev ja mida tähistati kui LanrBo36.
Meie uuring näitas testitud germplasmas Lanr1 alleeli väga madalat esinemissagedust (umbes 6%). See tähelepanek on kooskõlas Ida-Euroopa germplasma skriinimise tulemustega, kasutades Anseq3 ja Anseq4 markereid, mis näitasid, et Lanr1 alleel esineb ainult kahes Valgevene liinis. See viitab sellele, et Lanr1 alleeli ei kasutata kohalikes aretusprogrammides veel laialdaselt, erinevalt Austraaliast, kus see on markerpõhiste aretusmeetodite üks võtmealleele. See võib olla tingitud Lanr1 alleeli madalamast resistentsuse tasemest Euroopa põllutingimustes võrreldes Austraalia aruandega. Lisaks on antraknoosi uuringud Austraalia sademeterohketes piirkondades näidanud, et Lanr1 alleeli vahendatud resistentsusreaktsioonid ei pruugi olla efektiivsed ilmastikutingimustes, mis soodustavad patogeeni kasvu ja kiiret arengut19,42. Tegelikult täheldati käesolevas uuringus mõningaid antraknoosi sümptomeid ka Lanr1 alleeli kandvates genotüüpides, mis viitab sellele, et resistentsus võib C. lupini arenguks optimaalsetes tingimustes kaduda. Lisaks on võimalikud valepositiivsed tõlgendused Anseq3 ja Anseq4 markerite olemasolu kohta, mis asuvad Lanr1 lookusest ligikaudu 1 cM kaugusel [28,30,43].
Meie uuring näitas, et Lanr1 alleeli kandev 83A:476 reageeris C. lupini inokuleerimisele ulatusliku transkriptoomi ümberprogrammeerimisega esimesel analüüsitud ajahetkel (6 hpi), samas kui Mandelupis, AnMan alleeli kandes, täheldati transkriptoomseid vastuseid palju hiljem (24 kuni 48 hpi). Need kaitsereaktsioonide ajalised erinevused on seotud haigussümptomite erinevustega, mis rõhutab patogeenide varajase äratundmise olulisust eduka resistentsusele reageerimise jaoks. Taimekoe nakatamiseks peavad siberi katku eosed läbima peremeesorganismi pinnal mitu arenguetappi, sealhulgas idanemise, rakkude jagunemise ja appressoriumi moodustumise. Ekstensioon on nakkav struktuur, mis kinnitub peremeesorganismi pinnale ja hõlbustab tungimist peremeesorganismi kudedesse. Seega näitasid herneekstraktis olevad C. gloeosporioides eosed tuuma esimest jagunemist pärast 75–90 minutit inkubeerimist, idutoru moodustumist pärast 90–120 minutit ja supressiooni 4 tunni pärast (45). Mango C. gloeosporioides näitas pärast 3-tunnist inkubeerimist enam kui 40% koniidide idanemist ja umbes 20% apressorite moodustumist 4 tunni pärast. C. gloeosporioides virulentsusega seotud CAP20 geen näitas transkriptsioonilist aktiivsust epifüüte moodustavates koniidides pärast 3,5-tunnist inkubeerimist avokaado pinnavahas, milles oli kõrge CAP20 valgu kontsentratsioon, 4 tunni ja 46 minuti pärast. Sarnaselt indutseeriti melaniini biosünteesi geenide aktiivsus C. trifoliis 2-tunnise inkubatsiooni ajal, millele järgnes appressoriumi moodustumine 1 tunni pärast. Lehtede kudede uuringud on näidanud, et C. acutatum'iga inokuleeritud maasikatel on esimene supressioon 8 tundi pärast inokuleerimist, samas kui C. coccodes'iga inokuleeritud tomatitel on esimene supressioon 4 tundi pärast inokuleerimist48,49. See on suures osas kooskõlas Colletotrichum spp. nakkusprotsessi ajaskaalaga. Kiired kaitsereaktsioonid 83A:476 suhtes viitavad taimeresistentsuse ja efektor-käivitatava immuunsuse (ETI) geenide osalemisele selles liinis, samas kui Mandelupi hilinenud reaktsioonid toetavad mikro-seotud molekulaarse mustri poolt käivitatava immuunsuse (MTI) hüpoteesi 50. Varased reaktsioonid 83A:476 ja Mandelupi suhtes. Üles- või allapoole reguleeritud geenide osaline kattumine hilinenud reaktsioonis toetab samuti seda kontseptsiooni, kuna ETI-d peetakse sageli kiirendatud ja võimendatud MTI-reaktsiooniks, mis kulmineerub programmeeritud rakusurmaga infektsioonikohas, mida tuntakse anafülaktilise šokina 51,52.
Enamik üleesindatud terminile Gene Ontology GO:0006952 „Kaitsereaktsioon“ omistatud geenidest on stressist tingitud paastusõnumi valgu 22 (sarnane SAM22-ga) 11 homoloogi ja seitse peamist lateksvalgu-sarnast (MLP-d). SAM22-sarnased valgud 31, 34, 43 ja 423 näitasid järjestuse sarnasust. SAM22-sarnased geenid näitasid olulist ja kauem kestnud aktivatsiooni, näidates antraknoosi resistentsuse suurenenud taset (83A:476 ja Boregine). MLP-sarnased geenid olid aga allareguleeritud ainult liinides, mis kandsid kandidaatresistentsuse alleeli (83A:476/Lanr1 6 hpi ja Mandelup/AnMan 24 hpi). Tuleb märkida, et kõik tuvastatud SAM22-sarnased homoloogid pärinevad umbes 105 kb suurusest geeniklastrist, samas kui MLP-sarnased geenid pärinevad genoomi eraldi piirkondadest. Selliste SAM22-sarnaste geenide koordineeritud aktivatsiooni leiti ka meie varasemas uuringus, mis käsitles NLL-i resistentsust Diaporthetoxica inokuleerimise suhtes, mis viitab nende osalemisele kaitsereaktsiooni horisontaalsetes komponentides. Seda järeldust toetavad ka aruanded SAM22-sarnaste geenide positiivsest vastusest vigastusele või ravile salitsüülhappe, seenindutseerijate või vesinikperoksiidiga.
On näidatud, et MLP-sarnased geenid reageerivad mitmesugustele abiootilistele ja biootilistele stressiteguritele, sealhulgas bakteriaalsetele, viiruslikele ja patogeensetele seeninfektsioonidele paljudes taimeliikides55. Reaktsioonisuunad teatud taimede ja patogeenide vahelistele interaktsioonidele ulatusid tugevast suurenemisest (st puuvilla nakatumise ajal Verticillium dahliae'ga) kuni olulise vähenemiseni (st pärast õunapuu nakatumist Alternaria spp.-ga)56,57. MLP-sarnase 423 geeni olulist allareguleerimist on täheldatud avokaado kaitse ajal F. nigeri nakkuse vastu ja õunapuu nakatumise ajal. Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola ja Alternaria alternata on õuna patotüübid58,59. Lisaks oli MLP-sarnast 423 geeni üleekspresseerivatel õunakallistustel resistentsusega seotud geenide ekspressioon madalam ja nad olid seeninfektsioonidele vastuvõtlikumad59. Pärast Fusarium oxysporum f-i oli MLP-sarnane 423 geen supresseeritud ka resistentses hariliku oa iduplasmas. cn. Bean infektsioon 60.
Teised meie RNA-seq uuringus tuvastatud PR-10 perekonna liikmed olid LlR18A ja LlR18B geenid vastusena ülesreguleerimisele, samuti lipiidide ülekandevalgu DIR1 ülesreguleeritud (1 geen) või allareguleeritud (3 geeni) geen. Lisaks toob WGCNA selle mooduli keskpunktina esile LlR18B geeni, mis on vaktsineerimise suhtes väga tundlik ja kannab mitmeid kaitsva vastuse geene. LlR18A ja LlR18B geenid indutseeriti kollaste lupiini lehtedes vastusena patogeensetele bakteritele, samuti NLL-i vartes pärast D. toxica inokuleerimist, samas kui nende geenide riisi homoloog, RSOsPR10, indutseeriti kiiresti seeninfektsiooniga, mis arvatavasti on seotud jasmoonhappe signaaliülekande rajaga53,61,62. DIR1 geen kodeerib mittespetsiifilisi lipiidide transportvalke, mis on vajalikud süsteemse omandatud resistentsuse (SAR) tekkeks. Kaitsereaktsioonide arenedes transporditakse DIR1 valk infektsioonikoldest läbi floeemi, et indutseerida SAR-i kaugemates organites. Huvitaval kombel indutseeriti TanjilG_02313 DIR1 geen esimesel ajahetkel oluliselt liinides 84A:476 ja populatsioonis 22660, kuid antraknoosiresistentsus arenes edukalt välja ainult liinis 84A:476. See võib viidata DIR1 geeni teatud alafunktsionaliseerumisele NLL-is, kuna ülejäänud kolm homoloogi reageerisid inokuleerimisele ainult liinis 83A:476 6 hpi ajal ja see reaktsioon oli suunatud allapoole.
Meie uuringus olid bioloogilisele protsessile nimega „GO:0055114 redoksprotsess“ vastavateks kõige levinumateks komponentideks tsütokroom P450 valk, peroksidaas, linoolhappe 9S-/13S-lipoksügenaas ja 1-aminotsüklopropaan-1-karboksüülhappe oksüdaas. Lisaks defineerib meie WGCNA HSFA4a homoloogi kui keskust, mis kannab mooduleid, näiteks Lanr1 resistentsusgeeni kandidaati TanjilG_05042. HSFA4a on taimede tuumatranskriptsiooni redokssõltuva regulatsiooni komponent.
Tsütokroom P450 valgud on oksüdoreduktaasid, mis katalüüsivad NADPH ja/või O2-sõltuvaid hüdroksüülimisreaktsioone primaarses ja sekundaarses metabolismis, sealhulgas ksenobiootikumide, samuti hormoonide, rasvhapete, steroolide, rakuseina komponentide, biopolümeeride ja kaitsvate ühendite biosünteesi metabolismis 69. Meie uuringus vähenes taimede tsütokroom P450 funktsiooni varieeruvus -10,6 log2-lt (kordamuutus) 5,7-ni suure hulga muudetud homoloogide (37) ja spetsiifiliste geenide reageerimismustrite erinevuste tõttu, mis peegeldab ülespoole suunatud korrigeerimist. Ainult RNA-järjestusandmete kasutamine NLL-geenide oletatava bioloogilise funktsiooni selgitamiseks nii suures valgu superperekonnas oleks väga spekulatiivne. Siiski väärib märkimist, et mõned tsütokroom P450 geenid on seotud suurenenud resistentsusega patogeensete seente või bakterite suhtes, sealhulgas panusega allergiliste reaktsioonide tekkesse 69,70,71.
III klassi peroksidaasid on multifunktsionaalsed taimeensüümid, mis osalevad laias valikus ainevahetusprotsessides taime kasvu ja arengu ajal, samuti vastusena keskkonnastressidele, nagu soolsus, põud, kõrge valguse intensiivsus ja patogeenide rünnak72. Peroksidaasid osalevad mitmete taimeliikide ja Anthracise interaktsioonis, sealhulgas Stylosanthes humilis ja C. gloeosporioides, Lens culinaris ja C. truncatum, Phaseolus vulgaris ja C. lindemuthianum, Cucumis sativus ja C. lagenarium73,74,75,76. Reaktsioon on väga kiire, mõnikord isegi 4 HPI-l, enne kui seen taimekoesse tungib73. Peroksidaasi geen reageeris ka D. toxica NLL inokuleerimisele. Lisaks oma tüüpilistele funktsioonidele oksüdatiivse purske reguleerimisel või oksüdatiivse stressi kõrvaldamisel võivad peroksidaasid häirida patogeenide kasvu, luues füüsikalisi barjääre, mis põhinevad rakuseina tugevdamisel spetsiifiliste ühendite lignifikatsiooni, subühikute või ristseostamise ajal. Seda funktsiooni saab in silico omistada TanjilG_03329 geenile, mis kodeerib oletatavat ligniini moodustavat anioonperoksidaasi, mille ekspressioon meie uuringus oli 83A:476 resistentses liinis 6. HPI-l oluliselt ülesreguleeritud, kuid mitte teistes tüvedes ja ajahetkedel, mis ei reageerinud.
Linoolhappe 9S-/13S-lipoksügenaas on lipiidide biosünteesi oksüdatiivse raja esimene samm78. Selle raja produktidel on taimekaitses mitu funktsiooni, sealhulgas rakuseina tugevdamine kalloosi ja pektiini ladestuste moodustumise kaudu ning oksüdatiivse stressi reguleerimine reaktiivsete hapnikuühendite tootmise kaudu79,80,81,82,83. Käesolevas uuringus oli linoolhappe 9S-/13S-lipoksügenaasi ekspressioon muutunud kõigis tüvedes, kuid vastuvõtlikus populatsioonis 22660 valitses ülesreguleerimine erinevatel ajahetkedel, samas kui resistentset Lanr1 ja AnMan alleeli kandvates tüvedes rõhutab see oksülipiini kihi mitmekesistamist kaitsvates siberi katku reaktsioonides nende genotüüpide vahel.
1-aminotsüklopropaan-1-karboksülaatoksüdaasi (ACO) homoloogi ekspressioon oli lupiiniga inokuleerimisel oluliselt üles- (9 geeni) või allareguleeritud (2 geeni). Kahe erandiga ilmnesid kõik need reaktsioonid 6 hp juures kiirusel 83A:476. ACO valkude vahendatud ensümaatiline reaktsioon on etüleeni tootmise kiirust piirav samm ja on seetõttu kõrgelt reguleeritud84. Etüleen on taimehormoon, millel on mitmekesine roll taime arengu ja abiootiliste ja biootiliste stressitingimustele reageerimise reguleerimisel. ACO transkriptsiooni indutseerimine ja etüleeni signaaliülekande raja aktiveerimine on seotud riisi resistentsuse suurendamisega hemibiotroofse seene oryzae oryzae suhtes, reguleerides reaktiivsete hapnikuühendite ja fütoaleksiinide tootmist. Väga sarnane lehtede nakatumisprotsess, mida leiti M. oryzae ja C. lupini vahel88,89, nihutab käesolevas uuringus kirjeldatud 83A:476 liini ACO homoloogide olulise ülesreguleerimise taustal võimalust anda resistentsus NLL-antraknoos-etüleeni suhtes, mis on molekulaarsete radade signaaliülekande keskne etapp.
Käesolevas uuringus täheldati paljude fotosünteesiga seotud geenide ulatuslikku pärssimist 6 hpi juures 83A:476 populatsioonis ja 48 hpi juures Mandeloopi ja 22660 populatsioonis. Nende muutuste ulatus ja progresseerumine on proportsionaalne tasemega. Selles katses täheldati antraknoosi resistentsust. Hiljuti on mitmetes taime-patogeeni interaktsioonimudelites, sealhulgas patogeensete bakterite ja seente puhul, teatatud fotosünteesiga seotud transkriptide tugevast ja varajasest pärssimisest. Fotosünteesiga seotud geenide kiirustamine (mõnedes interaktsioonides alates 2 HPI-st) ja globaalne pärssimine vastusena infektsioonile võib käivitada taimede immuunsuse, mis põhineb reaktiivsete hapnikuühendite rakendamisel ja nende interaktsioonil salitsüülhappe rajaga, et vahendada allergilisi reaktsioone 90,94.
Kokkuvõtteks võib öelda, et kõige resistentsema liini (83A:476) jaoks pakutud kaitsereaktsioonimehhanismide hulka kuuluvad kiire patogeeni äratundmine R-geeni poolt (arvatavasti TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) ja allergilise reaktsiooni vahendatud salitsüülhappe ja etüleeni signaaliülekanne, millele järgneb pikamaa SAR-i teke. Toime toetab DIR-1 valk. Tuleb märkida, et C. lupini nakkuse biotroofne periood on väga lühike (umbes 2 päeva), millele järgneb nekrootiline kasv95. Üleminek nende etappide vahel võib olla seotud nekroosi ja etüleeni poolt indutseeritavate valkude ekspressiooniga, mis toimivad peremeestaimedes ülitundlikkusreaktsioonide vallandajatena. Seetõttu on C. lupini edukaks püüdmiseks biotroofses staadiumis ajavahemik väga kitsas. Redoks- ja fotosünteesiga seotud geenide ümberprogrammeerimine, mida täheldati 83A:476-s 6 hpi juures, on kooskõlas seenhüüfide progresseerumisega ja kuulutab eduka kaitsva reaktsiooni teket biotroofses staadiumis. Mandelupi ja 22660 populatsiooni transkriptoomsed vastused võivad olla liiga hilinenud, et seent enne nekrootilisele kasvule üleminekut kinni püüda, kuid Mandelup võib olla efektiivsem kui 22660 populatsioon, kuna PR-10 valgu suhteliselt kiire regulatsioon soodustab horisontaalset resistentsust.
ETI, mida juhib kanooniline R-geen, näib olevat tavaline mehhanism ubade antraknoosiresistentsuse tekkeks. Seega annab kaunvilja Medicago truncatula mudelkultuuris antraknoosiresistentsuse RCT1 geen, mis kuulub taime TIR-NBS-LRR97 R-geenide klassi. See geen annab ka lutsernis laia spektriga antraknoosiresistentsuse, kui see üle kantakse vastuvõtlikele taimedele. Harilikul oal (P. vulgaris) on tänaseni tuvastatud üle kahe tosina antraknoosiresistentsuse geeni. Mõned neist geenidest asuvad piirkondades, kus kanoonilised R-geenid puuduvad, kuid paljud teised asuvad NBS-LRR geeniklastrit kandvate kromosoomide servades, sealhulgas TIR-NBS-LRR99. Genoomiülene SSR-uuring kinnitas ka NBS-LRR geeni seost antraknoosiresistentsusega harilikul oal. Kanoonilist R-geeni leiti ka valge lupiini 101 genoomsest piirkonnast, mis kannab peamist antraknoosiresistentsuse lookust.
Meie töö näitab, et kohene resistentsusreaktsioon, mis aktiveeritakse taimenakkuse varases staadiumis (eelistatavalt mitte hiljem kui 12 tundi pärast nakatumist), kaitseb tõhusalt kitsalehist lupiini antraknoosi eest, mida põhjustab patogeenne seen Colletrichum lupini. Kasutades suure läbilaskevõimega sekveneerimist, demonstreerisime Lanr1 ja AnMan resistentsusgeenide vahendatud antraknoosi resistentsusgeenide diferentsiaalseid ekspressiooniprofiile NLL-taimedes. Edukas kaitse hõlmab redoks-, fotosünteesi- ja patogeneesis osalevate valkude geenide hoolikat kujundamist tundide jooksul pärast taime esimest kokkupuudet patogeeniga. Sarnased kaitsereaktsioonid, kuid ajaliselt edasi lükatud, on taimede kaitsmisel haiguste eest palju vähem tõhusad. Lanr1 geeni vahendatud siberi katku resistentsus sarnaneb R-geeni tüüpilise kiire vastusega (efektor-vallandunud immuunsus), samas kui AnMan geen annab suure tõenäosusega horisontaalse vastuse (mikroobiga seotud molekulaarse mustri poolt vallandunud immuunsus), tagades mõõduka jätkusuutlikkuse taseme.
Antraknoosi markerite skriinimiseks kasutatud 215 NLL liini koosnesid 74 kultivarist, 60 ristamise või aretamise teel saadud liinist, 5 mutantist ja 76 metsikust või originaalsest germplasmast. Liinid pärinesid 17 riigist, peamiselt Poolast (58), Hispaaniast (47), Saksamaalt (27), Austraaliast (26), Venemaalt (19), Valgevenest (7), Itaaliast (5) ja teistest liinidest 10 riigist. Komplekt sisaldab ka referentsresistentseid liine: 83A:476, Tanjil, Lanr1 alleeliga Wonga ja AnMan alleeliga Mandelup. Liinid saadi Euroopa lupiini geneetiliste ressursside andmebaasist, mida haldab Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Poola (lisatabel S1).
Taimi kasvatati kontrollitud tingimustes (fotoperiood 16 tundi, temperatuur 25 °C päeval ja 18 °C öösel). Analüüsiti kahte bioloogilist kordust. DNA eraldati kolme nädala vanustelt lehtedelt, kasutades DNeasy Plant Mini Kit'i (Qiagen, Hilden, Saksamaa) vastavalt protokollile. Isoleeritud DNA kvaliteeti ja kontsentratsiooni hinnati spektrofotomeetriliste meetoditega (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Analüüsiti antraknoosi resistentsusgeeni AnMan (pärit sordist Mandelup) tähistavat AnManM1 markerit ja Lanr1 geeni (pärit sordist Tanjil) külgnevaid markereid Anseq3 ja Anseq4 11,26,28. Resistentse alleeli homosügootidele määrati hindeks „1“, vastuvõtlikele „0“ ja heterosügootidele 0,5.
Markerite AnManM1, AnSeq3 ja AnSeq4 skriiningu tulemuste ja lõplike järelkatsete seemnete kättesaadavuse põhjal valiti antraknoosiresistentsuse fenotüüpimiseks 50 NLL liini. Analüüs viidi läbi kahes korduses arvutiga juhitavas kasvuhoones 14-tunnise fotoperioodiga, temperatuurivahemikus 22 °C päeval ja 19 °C öösel. Seemned kraabitakse enne külvi (lõikatakse terava noaga embrüo vastasküljel olev seemnekest ära), et vältida seemnete puhkeseisundit liiga kõva seemnekesta tõttu ja tagada ühtlane idanemine. Taimi kasvatati pottides (11 × 11 × 21 cm) steriilse mullaga (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varssavi, Poola). Inokuleerimine viidi läbi Colletotrichum lupini Col-08 tüvega, mis kasvatati 1999. aastal kitsalehiste lupiinitaimede vartest, mida kasvatati Verženitsas, Suur-Poolas (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E) põllul. Hankige ala. Isolaate kultiveeriti SNA söötmes temperatuuril 20 °C musta valguse käes 21 päeva, et esile kutsuda sporulatsiooni. Neli nädalat pärast külvi, kui taimed olid jõudnud 4-6 lehe staadiumisse, viidi läbi inokuleerimine, pritsides koniidide suspensiooniga kontsentratsiooniga 0,5 x 106 koniidi milliliitri kohta. Pärast inokuleerimist hoiti taimi 24 tundi pimedas umbes 98% õhuniiskuse ja 25 °C temperatuuri juures, et soodustada koniidide idanemist ja nakatumisprotsessi. Seejärel kasvatati taimi 14-tunnise fotoperioodi jooksul temperatuuril 22 °C päeval ja 19 °C öösel ning 70% õhuniiskuse juures. Haiguse skoor määrati 22 päeva pärast nakatamist ja see jäi vahemikku 0 (immuunne) kuni 9 (väga vastuvõtlik), olenevalt nekrootiliste kahjustuste olemasolust või puudumisest vartel ja lehtedel. Lisaks mõõdeti pärast hindamist taimede kaalu. Markergenotüüpide ja haigusfenotüüpide vahelised seosed arvutati punkt-kahe-järjestuse korrelatsioonidena (heterosügootsete markerite puudumine antraknoosi resistentsuse fenotüübi analüüsimiseks mõeldud liinide komplektis).