Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt đã cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web mà không có kiểu dáng và JavaScript.
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) là một loại cây họ đậu được sử dụng để sản xuất lương thực và cải tạo đất. Sự mở rộng toàn cầu của NLL như một loại cây trồng đã thu hút nhiều loại nấm gây bệnh, bao gồm cả bệnh thán thư lupine, nguyên nhân gây ra bệnh thán thư tàn phá. Hai alen, Lanr1 và AnMan, mang lại khả năng kháng bệnh tăng lên, đã được sử dụng trong quá trình lai tạo NLL, nhưng cơ chế phân tử cơ bản vẫn chưa được biết. Trong nghiên cứu này, các dấu hiệu Lanr1 và AnMan đã được sử dụng để sàng lọc các mẫu NLL của Châu Âu. Việc thử nghiệm vắc-xin trong môi trường được kiểm soát đã xác nhận hiệu quả của cả hai loại cây cho kháng bệnh. Hồ sơ biểu hiện gen khác biệt đã được thực hiện trên các dòng kháng bệnh và nhạy cảm tiêu biểu. Khả năng kháng bệnh thán thư có liên quan đến sự biểu hiện quá mức của các thuật ngữ thuật ngữ học gen “GO:0006952 Phản ứng phòng vệ”, “GO:0055114 Quá trình oxy hóa khử” và “GO:0015979 Quang hợp”. Ngoài ra, dòng Lanr1(83A:476) cho thấy sự tái lập trình phiên mã đáng kể nhanh chóng sau khi tiêm chủng, trong khi các dòng khác cho thấy sự chậm trễ trong phản ứng này khoảng 42 giờ. Phản ứng phòng vệ có liên quan đến các gen TIR-NBS, CC-NBS-LRR và NBS-LRR, 10 protein liên quan đến quá trình sinh bệnh, protein chuyển lipid, endoglucan-1,3-β-glucosidase, protein thành tế bào giàu glycine và các gen từ con đường phản ứng của oxy. Phản ứng sớm với 83A:476, bao gồm cả việc ức chế cẩn thận các gen liên quan đến quang hợp, trùng hợp với sự bảo vệ thành công trong giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng của sinh học nấm, cho thấy rằng một tác nhân kích hoạt khả năng miễn dịch. Phản ứng Mandeloop bị chậm lại, cũng như lực cản ngang tổng thể.
Cây đậu lupin lá hẹp (NLL, Lupinus angustifolius L.) là một loại ngũ cốc giàu protein có nguồn gốc từ vùng Địa Trung Hải phía tây1,2. Hiện nay, nó được trồng làm cây lương thực cho động vật và con người. Nó cũng được coi là phân xanh trong các hệ thống luân canh cây trồng do cố định đạm bởi vi khuẩn cố định đạm cộng sinh và cải thiện tổng thể cấu trúc đất. NLL đã trải qua quá trình thuần hóa nhanh chóng trong thế kỷ qua và vẫn đang chịu áp lực nhân giống cao3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Với việc trồng rộng rãi NLL, chuỗi nấm gây bệnh đã phát triển các hốc nông nghiệp mới và gây ra các bệnh mới phá hoại mùa màng. Điều đáng chú ý nhất đối với người nông dân và người lai tạo cây lupin là sự xuất hiện của bệnh thán thư do nấm gây bệnh Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 gây ra. Điều đáng chú ý nhất đối với người nông dân và người lai tạo cây lupin là sự xuất hiện của bệnh thán thư do nấm gây bệnh Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 gây ra. Bạn có thể sử dụng tài khoản của mình để có được một khoản vay và một khoản tiền lớn để có được một khoản vay, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Điều đáng chú ý nhất đối với người trồng và nhân giống cây lupin là sự xuất hiện của bệnh thán thư do nấm gây bệnh Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 gây ra.Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的。Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Có tóc。1 Hãy chắc chắn rằng bạn có thể đạt được mục tiêu của mình và bạn có thể đạt được điều đó, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Điều đáng chú ý nhất đối với người trồng và nhân giống cây lupin là sự xuất hiện của bệnh thán thư do nấm gây bệnh Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 gây ra.Các báo cáo sớm nhất về căn bệnh này đến từ Brazil và Hoa Kỳ, với các triệu chứng điển hình xuất hiện lần lượt vào năm 1912 và 1929. Tuy nhiên, sau khoảng 30 năm, tác nhân gây bệnh được chỉ định là Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph của Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., 有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., 有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld trong Hình thái học mục tiêu. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .và H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。và H. Schlenk, .Phân tích kiểu hình bệnh ban đầu được thực hiện vào giữa thế kỷ 20 cho thấy một số khả năng kháng bệnh ở các giống đậu NLL và đậu vàng (L. luteus L.), nhưng tất cả các giống đậu trắng (L. albus L.) được thử nghiệm đều rất mẫn cảm15,16. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự phát triển của bệnh thán thư có liên quan đến lượng mưa tăng (độ ẩm không khí) và nhiệt độ (trong khoảng 12-28°C), dẫn đến vi phạm khả năng kháng bệnh ở nhiệt độ cao hơn17, 18. Trên thực tế, thời gian cần thiết để bào tử nảy mầm và bệnh bắt đầu, ngắn hơn bốn lần ở 24°C (4 giờ) so với ở 12°C (16 giờ) trong điều kiện độ ẩm cao19. Do đó, tình trạng nóng lên toàn cầu đang diễn ra đã dẫn đến sự lây lan của bệnh thán thư. Tuy nhiên, căn bệnh này đã được phát hiện ở Pháp (1982) và Ukraine (1983) như một điềm báo về mối đe dọa sắp xảy ra, nhưng dường như đã bị ngành công nghiệp đậu lupin bỏ qua vào thời điểm đó20,21. Vài năm sau, căn bệnh tàn phá này đã lan rộng khắp thế giới và cũng ảnh hưởng đến các quốc gia sản xuất cây đậu lupin lớn như Úc, Ba Lan và Đức22,23,24. Sau một đợt bùng phát bệnh thán thư vào giữa những năm 1990, quá trình sàng lọc mở rộng đã dẫn đến việc xác định được một số cá thể cho kháng bệnh trong các mẫu NLL19. Khả năng kháng bệnh thán thư của NLL được kiểm soát bởi hai alen trội riêng biệt được tìm thấy trong các nguồn chất nguyên sinh khác nhau: Lanr1 ở giống Tanjil và Wonga và AnMan ở giống Mandalay 25, 26. Các alen này bổ sung cho các dấu hiệu phân tử hỗ trợ việc lựa chọn chất nguyên sinh kháng bệnh trong các chương trình nhân giống25,26,27,28,29,30. Dòng chọn giống kháng bệnh 83A:476 mang alen Lanr1 được lai với dòng hoang dã dễ bị nhiễm bệnh P27255 để thu được quần thể RIL phân ly kháng bệnh thán thư, điều này giúp có thể gán locus Lanr1 vào nhiễm sắc thể NLL-1131, 32, 33. Căn chỉnh các dấu hiệu bản đồ liên kết từ các locus kháng bệnh bên cạnh bệnh thán thư với một khuôn khổ bộ gen, NLL đã tiết lộ vị trí của cả ba alen trên cùng một nhiễm sắc thể (NLL-11), nhưng ở các vị trí khác nhau29,34,35. Tuy nhiên, do số lượng RIL ít và khoảng cách di truyền lớn giữa các dấu hiệu và alen tương ứng, nên không thể đưa ra kết luận đáng tin cậy nào về các gen cơ bản của chúng. Mặt khác, việc sử dụng di truyền ngược ở cây lupin rất khó khăn do tiềm năng tái sinh của chúng rất thấp, khiến việc thao tác di truyền trở nên cồng kềnh37.
Sự phát triển của nguồn gen thuần hóa mang alen mong muốn ở trạng thái đồng hợp tử, chẳng hạn như 83A:476 (Lanr1) và Mandelup (AnMan), đã mở ra cánh cửa để nghiên cứu khả năng kháng bệnh thán thư khi đối mặt với sự hiện diện của các tổ hợp alen đối lập trong quần thể hoang dã. Khả năng của các cơ chế phân tử. So sánh các phản ứng phòng vệ được tạo ra bởi các kiểu gen cụ thể. Nghiên cứu này đã đánh giá phản ứng phiên mã sớm của NLL đối với vắc-xin C. lupini. Đầu tiên, một nhóm nguồn gen NLL của Châu Âu bao gồm 215 dòng đã được sàng lọc bằng các dấu hiệu phân tử đánh dấu các alen Lanr1 và AnMan. Sau đó, kiểu hình bệnh thán thư đã được thực hiện trên 50 dòng NLL, trước đó đã được chọn cho các dấu hiệu phân tử, trong các điều kiện được kiểm soát. Dựa trên các thí nghiệm này, bốn dòng khác nhau về khả năng kháng bệnh thán thư và thành phần alen Lanr1/AnMan đã được chọn để lập hồ sơ biểu hiện gen phòng vệ khác biệt bằng hai phương pháp bổ sung: giải trình tự RNA thông lượng cao và định lượng PCR thời gian thực.
Sàng lọc một bộ mầm NLL (N = 215) với các dấu hiệu Lanr1 (Anseq3 và Anseq4) và AnMan (Anseq4) và AnMan (AnManM1) cho thấy chỉ có một dòng (95726, gần Salamanca-b) khuếch đại alen "kháng" cho tất cả các dấu hiệu, trong khi "Sự hiện diện của các alen 'nhạy cảm'" tìm thấy tỷ lệ của tất cả các dấu hiệu trong 158 dòng (~ 73,5%). Mười ba dòng tạo ra hai alen "kháng" của dấu hiệu Lanr1 và 8 dòng tạo ra các alen "kháng" của dấu hiệu Lanr1. Alen "kháng" của dấu hiệu AnMan (Bảng bổ sung S1). Hai dòng là dị hợp tử đối với dấu hiệu Anseq3 và một dòng dị hợp tử đối với dấu hiệu AnManM1. 42 dòng (19,5%) mang các pha đối diện của alen Anseq3 và Anseq4, cho thấy tần suất tái tổ hợp cao giữa hai locus này. Kiểu hình bệnh thán thư trong điều kiện được kiểm soát (Bảng bổ sung S2) cho thấy sự thay đổi trong khả năng kháng bệnh của các kiểu gen được thử nghiệm, điều này được phản ánh trong mức độ nghiêm trọng của bệnh thán thư. Sự khác biệt về điểm trung bình dao động từ 1,8 (kháng trung bình) đến 6,9 (nhạy cảm) và sự khác biệt về trọng lượng cây dao động từ 0,62 (nhạy cảm) đến 4,45 g (kháng). Có mối tương quan đáng kể giữa các giá trị quan sát được trong hai lần lặp lại của thí nghiệm (0,51 đối với điểm số mức độ nghiêm trọng của bệnh, P = 0,00017 và 0,61 đối với trọng lượng cây, P < 0,0001) cũng như giữa hai thông số này (− 0,59 và − 0,77, P < 0,0001). Có mối tương quan đáng kể giữa các giá trị quan sát được trong hai lần lặp lại của thí nghiệm (0,51 đối với điểm số mức độ nghiêm trọng của bệnh, P = 0,00017 và 0,61 đối với trọng lượng cây, P < 0,0001) cũng như giữa hai thông số này (− 0,59 và − 0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 và 0,61 для массы растения, P < 0,0001), và также между этими двумя параметрами (-0,59 và -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Có mối tương quan đáng kể giữa các giá trị quan sát được trong hai lần lặp lại của thí nghiệm (0,51 đối với điểm số mức độ nghiêm trọng của bệnh, P = 0,00017 và 0,61 đối với trọng lượng cây, P < 0,0001), cũng như giữa hai thông số này (- 0,59 và -0,77, P < 0,0001) = 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为0,51,P = 0,00017, 植物重量为0,61,P < 0,0001)Bạn có thể làm điều đó?分为 0,51 , p = 0,00017 , 植物 为 为 0,61 , p <0,0001) 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0,59 和– 0,59和– 0,59 和– 0,59 和- 0,77,P < 0,0001)。 Bạn có thể dễ dàng nhận được một khoản tiền lớn, nhưng bạn sẽ không phải lo lắng về điều đó nữa (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0001), và между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001. Có mối tương quan có ý nghĩa giữa các giá trị quan sát được ở hai bản sao (điểm mức độ bệnh 0,51, P = 0,00017 và trọng lượng cây 0,61, P < 0,0001) và giữa hai thông số này (-0,59 và -0,0001) là 0,77, P < 0,0001. ).Các triệu chứng điển hình thấy ở những cây dễ bị nhiễm bệnh bao gồm thân cây bị uốn cong và xoắn giống như cấu trúc "cung của người chăn cừu", sau đó là các tổn thương hình bầu dục với các bào tử màu cam/hồng (Hình bổ sung 1). Các mẫu giống của Úc mang gen Lanr1 (83A:476 và Tanjil) và AnMan (Mandelup) có khả năng kháng bệnh ở mức trung bình, 0,0331 và 0,0036). Một số dòng cũng mang các alen Lanr1 và/hoặc AnMan "kháng bệnh" biểu hiện các triệu chứng của bệnh.
Điều thú vị là một số dòng NLL thiếu bất kỳ alen đánh dấu “kháng” nào lại cho thấy mức độ kháng bệnh thán thư cao (tương đương hoặc cao hơn so với kiểu gen Lanr1 hoặc AnMan), chẳng hạn như Boregine (giá trị P < 0,0001 cho cả hai thông số), Bojar (giá trị P < 0,0001 cho điểm và 0,001 cho trọng lượng cây) và Quần thể B-549/79b (giá trị P < 0,0001 cho điểm và không có ý nghĩa đối với trọng lượng). Điều thú vị là một số dòng NLL thiếu bất kỳ alen đánh dấu “kháng” nào lại cho thấy mức độ kháng bệnh thán thư cao (tương đương hoặc cao hơn so với kiểu gen Lanr1 hoặc AnMan), chẳng hạn như Boregine (giá trị P < 0,0001 cho cả hai thông số), Bojar (giá trị P < 0,0001 cho điểm và 0,001 cho trọng lượng cây) và Quần thể B-549/79b (giá trị P < 0,0001 cho điểm và không có ý nghĩa đối với trọng lượng). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 hoặc AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки và 0,001 для массы растения) và популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для có thể). Điều thú vị là một số dòng NLL thiếu bất kỳ alen đánh dấu 'kháng' nào lại cho thấy mức độ kháng bệnh thán thư cao (tương đương hoặc cao hơn so với kiểu gen Lanr1 hoặc AnMan), chẳng hạn như Boregine (giá trị P < 0,0001 cho cả hai thông số), Bojar (giá trị P < 0,0001 để đánh giá và 0,001 cho trọng lượng cây) và quần thể B-549/79b (giá trị P < 0,0001 để đánh giá và không có ý nghĩa đối với trọng lượng).有趣的是,一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1或AnMan 基因型相当或更高),例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001),Bojar（P 值<得分为0,0001,植物重量为0,001)和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001,重量不显着）。 Điều thú vị là một số hệ thống NLL không có bất kỳ dấu hiệu “kháng nguyên” nào lại cho thấy khả năng kháng ngang cao (tương đương với gen Lanr1 hoặc AnMan hoặc cao hơn), chẳng hạn như Boregine (cả hai tham số P < 0,0001), Bojar (giá trị P < 0,0001, trọng lượng cây 0,001) và chủng B-549/79b (giá trị P < 0,0001, trọng lượng không đáng kể). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 hoặc AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) và популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Điều thú vị là một số dòng NLL thiếu bất kỳ alen đánh dấu 'kháng' nào lại cho thấy mức độ kháng bệnh thán thư cao (tương đương hoặc cao hơn kiểu gen Lanr1 hoặc AnMan), chẳng hạn như Boregine (giá trị P cho cả hai thông số <0,0001), Bojar (giá trị P < 0,0001, trọng lượng cây 0,001) và quần thể B-549/79b (giá trị P < 0,0001, trọng lượng không đáng kể).Hiện tượng này gợi ý khả năng có một nguồn gen kháng mới, giải thích sự thiếu tương quan được quan sát thấy giữa kiểu gen đánh dấu và kiểu hình bệnh (giá trị P từ ~0,42 đến ~0,98). Do đó, thử nghiệm Kolmogorov-Smirnov cho thấy dữ liệu về khả năng kháng bệnh thán thư phân phối gần như bình thường đối với điểm số (giá trị P 0,25 và 0,11) và khối lượng cây (giá trị P 0,47 và 0,55), cho thấy tôi đưa ra giả thuyết rằng có nhiều alen hơn Lanr1 và AnMan tham gia.
Dựa trên kết quả sàng lọc kháng bệnh thán thư, 4 dòng đã được chọn để phân tích transcriptome: 83A:476, Boregine, Mandelup và Population 22660. Các dòng này đã được kiểm tra lại về khả năng kháng bệnh than trong các thí nghiệm tiêm chủng bằng giải trình tự RNA, với điều kiện là chúng giống như trong thử nghiệm trước đó. Các giá trị điểm như sau: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) và population 22660 (6,11 ± 1,29).
Giao thức Illumina NovaSeq 6000 đạt được trung bình 40,5 cặp Mread trên mỗi mẫu (29,7 đến 54,4 Mread) (Bảng bổ sung S3). Điểm căn chỉnh trong trình tự tham chiếu dao động từ 75,5% đến 88,6%. Hệ số tương quan trung bình của dữ liệu số lần đọc giữa các biến thể thử nghiệm giữa các bản sao sinh học dao động từ 0,812 đến 0,997 (trung bình 0,959). Trong số 35.170 gen được phân tích, 2917 gen không biểu hiện và 4785 gen còn lại được biểu hiện ở mức không đáng kể (trung bình cơ sở < 5). Trong số 35.170 gen được phân tích, 2917 gen không biểu hiện và 4785 gen còn lại được biểu hiện ở mức không đáng kể (trung bình cơ sở < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (Xin chào <5). Trong số 35.170 gen được phân tích, 2917 gen không biểu hiện và 4785 gen còn lại được biểu hiện ở mức không đáng kể (trung bình cơ sở <5).在分析的35,170 个基因中,2917 个没有表达,其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5)。35,170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительную экспрессию (базовое среднее значение <5). Trong số 35.170 gen được phân tích, 2917 gen không được biểu hiện và 4785 gen còn lại có biểu hiện không đáng kể (trung bình cơ sở <5).Do đó, số lượng gen được coi là biểu hiện (trung bình cơ sở ≥ 5) trong quá trình thử nghiệm là 27.468 (78,1%) (Bảng bổ sung S4).
Từ thời điểm đầu tiên, tất cả các dòng NLL đều phản ứng với việc tiêm chủng C. lupini (chủng Col-08) bằng cách lập trình lại phiên mã (Bảng 1), tuy nhiên, có sự khác biệt đáng kể giữa các dòng. Do đó, dòng kháng 83A:476 (mang gen Lanr1) cho thấy sự lập trình lại phiên mã đáng kể tại thời điểm đầu tiên (6 hpi) với số lượng gen up và down được phân lập tăng gấp 31-69 lần so với các thời điểm khác tại thời điểm này. Ngoài ra, đỉnh này tồn tại trong thời gian ngắn, vì biểu hiện của chỉ một số ít gen vẫn thay đổi đáng kể tại thời điểm thứ hai (12 hpi). Điều thú vị là Boregine, cũng cho thấy mức độ kháng cao trong thử nghiệm ghép, đã không trải qua quá trình lập trình lại phiên mã lớn như vậy trong suốt quá trình thử nghiệm. Tuy nhiên, số lượng gen biểu hiện khác biệt (DEG) là như nhau đối với Boregine và 83A:476 ở 12 HPI. Cả Mandelup và quần thể 22660 đều cho thấy đỉnh DEG tại thời điểm cuối cùng (48 l/s), cho thấy sự chậm trễ tương đối trong phản ứng phòng thủ.
Bởi vì 83A:476 đã trải qua quá trình lập trình lại phiên mã hàng loạt để đáp ứng với C. lupini ở 6 HPI so với tất cả các dòng khác, nên ~91% các DEG được quan sát tại thời điểm này là đặc hiệu theo dòng dõi (Hình 1). Tuy nhiên, có một số sự chồng chéo trong các phản ứng sớm giữa các dòng nghiên cứu, vì 68,5%, 50,9% và 52,6% DEG ở Boregine, Mandelup và quần thể 22660, tương ứng, chồng chéo với những DEG được tìm thấy trong 83A:476 tại một số thời điểm nhất định. Tuy nhiên, các DEG này chỉ chiếm một phần nhỏ (0,97–1,70%) trong số tất cả các DEG hiện được phát hiện bằng 83A:476. Ngoài ra, 11 DEG từ tất cả các dòng đều nhất quán tại thời điểm này (Bảng bổ sung S4-S6), bao gồm các thành phần chung của phản ứng phòng vệ thực vật: protein chuyển lipid (TanjilG_32225), enzyme endoglucan-1,3-β-glucoside (TanjilG_23384), hai protein gây căng thẳng như SAM22 (TanjilG_31528 và TanjilG_31531), protein latex cơ bản (TanjilG_32352) và hai protein thành tế bào cấu trúc giàu glycine (TanjilG_19701 và TanjilG_19702). Cũng có sự chồng chéo tương đối cao trong phản ứng phiên mã giữa 83A: 476 và Boregine ở 24 HPI (tổng cộng 16-38% DEG) và giữa Mandelup và Quần thể 22660 ở 48 HPI (tổng cộng 14-20% DEG).
Biểu đồ Venn cho thấy số lượng gen biểu hiện khác biệt (DEG) trong các dòng đậu xanh lá hẹp (NLL) được tiêm chủng bằng Colletotrichum lupini (chủng Col-08 lấy từ các cánh đồng đậu xanh ở Wierzhenice, Ba Lan, 1999). Các dòng NLL được phân tích là: 83A:476 (kháng bệnh, mang alen Lanr1), Boregine (kháng bệnh, nền tảng di truyền không rõ), Mandelup (kháng bệnh trung bình, mang alen AnMan) và quần thể 22660 (rất dễ mắc bệnh). Viết tắt hpi là viết tắt của giờ sau khi tiêm chủng. Các giá trị bằng 0 đã được xóa để đơn giản hóa biểu đồ.
Bộ gen biểu hiện quá mức ở 6 hpi đã được phân tích để tìm sự hiện diện của các miền gen R điển hình (Bảng bổ sung S7). Nghiên cứu này cho thấy sự cảm ứng phiên mã của các gen kháng bệnh cổ điển chỉ có miền NBS-LRR ở 83A:476. Bộ gen này bao gồm một gen TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), năm gen CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 và tanjilg_16162), và bốn gen NBS-LR, Tanjilg_16162), và bốn gen NBS-LRRE (tanjilg_16162) cũng như bốn gen NBS-Lrr (tanjilg_16162) và bốn gen NBS-LRR (TANJILG_16162). Tất cả các gen này đều có miền điển hình được sắp xếp theo trình tự bảo tồn. Ngoài các gen miền NBS-LRR, một số kinase RLL đã được kích hoạt ở thời điểm 6 giờ sau khi nhiễm bệnh, cụ thể là một ở Boregine (TanjilG_19877), hai ở Mandelup (TanjilG_07141 và TanjilG_19877) và ở quần thể 22660 (TanjilG_09014 và TanjilG_10361) và hai ở 83A 27:476.
Các gen có biểu hiện thay đổi đáng kể khi đáp ứng với việc tiêm chủng C. lupini (chủng Col-08) đã được tiến hành phân tích làm giàu Gene Ontology (GO) (Bảng bổ sung S8). Thuật ngữ quá trình sinh học được biểu diễn quá mức thường xuyên nhất là “GO:0006952 phản ứng phòng vệ” xuất hiện ở 6 trong số 16 tổ hợp (thời gian × dòng) với ý nghĩa cao (giá trị P < 0,001) (Hình 2). Thuật ngữ quá trình sinh học được biểu diễn quá mức thường xuyên nhất là “GO:0006952 phản ứng phòng vệ” xuất hiện ở 6 trong số 16 tổ hợp (thời gian × dòng) với ý nghĩa cao (giá trị P < 0,001) (Hình 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся vào ngày 6 tháng 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Thuật ngữ quá trình sinh học được biểu diễn quá mức thường xuyên nhất là 'GO:0006952 phản ứng phòng vệ', xuất hiện ở 6 trong số 16 tổ hợp (thời gian × dòng dõi) với ý nghĩa cao (giá trị P < 0,001) (Hình 2).4个中,具有高显着性(P 值< 0,001)（图2)。 Thuật ngữ quá trình sinh học tiêu biểu nhất là “GO:0006952 phản ứng phòng vệ”, xuất hiện ở 6 trong số 16 tổ hợp (lần × lần), với ý nghĩa cao (giá trị P < 0,001) (hình 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Phản ứng Phòng thủ», который появлялся в 6 và 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Thuật ngữ quá trình sinh học được biểu diễn quá mức thường xuyên nhất là 'GO:0006952 Phản ứng phòng vệ', xuất hiện ở 6 trong số 16 tổ hợp (thời gian × dòng) với ý nghĩa cao (giá trị P < 0,001) (Hình 2).Thuật ngữ này được biểu thị quá mức tại hai thời điểm trong 83A: 476 và Boregine (6 và 24 hpi) và tại một thời điểm trong Mandelup và Quần thể 22660 (lần lượt là 12 và 6 hpi). Đây là kết quả dự kiến, làm nổi bật phản ứng chống nấm của các dòng kháng thuốc. Ngoài ra, 83A:476 phản ứng với C. lupini bằng cách nhanh chóng kích thích các gen liên quan đến sự bùng nổ oxy hóa được biểu thị bằng thuật ngữ “quá trình oxy hóa khử GO:0055114”, cho thấy phản ứng phòng vệ cụ thể, trong khi Boregine cho thấy phản ứng phòng vệ cụ thể, liên quan đến thuật ngữ 'GO'. :0006950 Phản ứng căng thẳng”. Dân số 22660 kích hoạt phản ứng kháng ngang liên quan đến các chất chuyển hóa thứ cấp, làm nổi bật số lượng quá mức các thuật ngữ “GO:0016104 Quá trình tổng hợp sinh học triterpene” và “GO:0006722 Quá trình chuyển hóa triterpene” (cả hai thuật ngữ đều thuộc cùng một bộ gen), có tính đến kết quả phân tích làm giàu thuật ngữ GO, độ ổn định của phản ứng Mandelup nằm giữa Boregine và Dân số 22660. Ngoài ra, phản ứng sớm 83A:476 (6 hpi) và phản ứng chậm Mandelup và Dân số 22660 bao gồm thuật ngữ GO:0015979 'quang hợp' và các quá trình sinh học liên quan khác.
Các thuật ngữ về bản thể gen sinh học được chọn trong chú thích của các gen biểu hiện khác biệt trong phản ứng phiên mã của cây đậu lupine lá hẹp (NLL) được tiêm chủng bằng cây đậu lupine bệnh than (chủng Col-08 thu được từ các cánh đồng đậu lupine ở Wierzhenice, Ba Lan, năm 1999) đã được phóng đại rất nhiều. Các dòng NLL được phân tích là: 83A:476 (kháng bệnh, mang alen Lanr1 đồng hợp tử), Boregine (kháng bệnh, nền tảng di truyền chưa xác định), Mandelup (kháng bệnh trung bình, mang alen AnMan đồng hợp tử) và quần thể 22660 (dễ mắc bệnh).
Vì nghiên cứu này nhằm xác định các gen góp phần vào khả năng kháng bệnh thán thư, nên các gen được gán cho các thuật ngữ GO “GO: 0006952 Phản ứng phòng vệ” và “GO: 0055114 Quá trình oxy hóa khử” đã được phân tích với các điểm cắt vì giá trị trung bình ban đầu ≥ 30 với ít nhất một dòng. × thời điểm kết hợp các giá trị có ý nghĩa thống kê của log2 (thay đổi gấp). Số gen đáp ứng các tiêu chí này là 65 đối với GO:0006952 và 524 đối với GO:0055114.
83A:476 cho thấy hai đỉnh DEG được chú thích bằng thuật ngữ GO:0006952, đỉnh đầu tiên ở 6 gen trên một inch (64 gen, điều hòa tăng và giảm) và đỉnh thứ hai ở 24 gen trên một inch (15 gen, chỉ điều hòa tăng). Boregine cũng cho thấy GO:0006952 đạt đỉnh tại cùng thời điểm, nhưng với ít DEG hơn (11 và 8) và kích hoạt ưu tiên. Mandeloop cho thấy hai đỉnh của GO:0006952 ở 12 và 48 HPI, cả hai đều mang 12 gen (đỉnh đầu tiên có gen kích hoạt và đỉnh thứ hai chỉ có gen ức chế), trong khi quần thể 22660 ở 6 HPI (13 gen) có sự chiếm ưu thế lớn hơn của đỉnh tăng. điều hòa. Cần lưu ý rằng 96,4% GO:0006952 DEG trong các đỉnh này có cùng loại phản ứng (tăng hoặc giảm), cho thấy sự chồng chéo đáng kể trong các phản ứng phòng vệ mặc dù có sự khác biệt về số lượng gen liên quan. Nhóm trình tự lớn nhất liên quan đến thuật ngữ GO:0006952 mã hóa Protein thông điệp liên quan đến căng thẳng đói 22 (giống SAM22), thuộc nhóm protein liên quan đến sinh bệnh học lớp 10 (PR-10) và protein lõi latex. similar (giống MLP)) (Hình 3). Hai nhóm khác nhau về bản chất biểu hiện và hướng phản ứng. Các gen mã hóa protein giống SAM22 cho thấy sự cảm ứng nhất quán và đáng kể tại các thời điểm sớm (6 hoặc 12 giờ sau khi chết) và thường không phản ứng vào cuối thí nghiệm (48 giờ sau khi chết), trong khi các protein giống MLP cho thấy sự phối hợp ở thời điểm 6 giờ sau khi chết. 83A:476 và Mandelup ở 48 hp/in, hầu như tất cả các điểm dữ liệu khác đều không phản ứng. Ngoài ra, sự khác biệt trong hồ sơ biểu hiện của các gen protein giống SAM22 theo sau sự thay đổi quan sát được trong khả năng kháng bệnh thán thư, vì các dòng kháng nhiều hơn có nhiều thời điểm gây ra các gen này đáng kể hơn các gen dễ bị tổn thương hơn. Một gen PR-10 giống LlR18A/B khác cho thấy kiểu biểu hiện rất giống với gen protein giống SAM22.
Các thành phần chính của thuật ngữ quá trình sinh học “GO:0006952 Phản ứng phòng vệ” và các kiểu biểu hiện của gen ứng viên của alen Lanr1 và AnMan đã được xác định. Thang Log2 biểu thị các giá trị log2 (thay đổi gấp đôi) giữa các cây được tiêm chủng (Colletotrichum lupini, chủng Col-08, thu được từ các cánh đồng đậu lupin, Wizhenica, Ba Lan, 1999) và các cây đối chứng (tiêm chủng giả) tại cùng thời điểm. Các dòng đậu lupin lá hẹp sau đây đã được phân tích: 83A:476 (kháng bệnh, mang alen Lanr1 đồng hợp tử), Boregine (kháng bệnh, nền tảng di truyền không rõ), Mandelup (kháng bệnh trung bình, mang alen AnMan đồng hợp tử) và Quần thể 22660 (mẫn cảm).
Ngoài ra, hồ sơ biểu hiện của các gen ứng cử viên RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) và AnMan (TanjilG_12861) đã được đánh giá (Hình 3). Gen TanjilG_05042 cho thấy phản ứng đáng kể (kích hoạt) ở 83A:476 chỉ tại thời điểm đầu tiên (6 hpi), trong khi TanjilG_12861 chỉ có ý nghĩa ở Mandeloop tại hai thời điểm: 6 hpi (điều chỉnh giảm) và 24 hpi (6 hpi). Với.). có thể điều chỉnh) ).
Các gen được biểu hiện quá mức nhất trong thuật ngữ "quy trình oxy hóa khử" GO:0055114 là các gen mã hóa protein cytochrome P450 và peroxidase (Hình 4). Đối với các mẫu được phân lập từ 83A:476 ở 6 HPI, các giá trị log2 (thay đổi gấp) tối đa hoặc tối thiểu (đối với 86,6% gen) thường được quan sát thấy giữa các cây được tiêm chủng và đối chứng, làm nổi bật phản ứng cao của kiểu gen này đối với giới tính được tiêm chủng. 83A:476 cho thấy DEG GO: 0055114 đáng kể nhất ở 6 hpi (503 gen), trong khi các dòng còn lại ở 48 hpi (Boregine, 31 gen; Mandelup, 85 gen; và Population 22660, 78 gen)). Ở hầu hết các gen của họ GO:0055114, hai loại phản ứng với vắc-xin (kích hoạt và ức chế) đã được quan sát thấy. Điều thú vị là có tới 97,6% DEG được xác định cho thuật ngữ GO: 0055114 ở Mandelupe ở 48 hp Những quan sát này cho thấy rằng, mặc dù quy mô nhỏ hơn đáng kể (tức là số lượng gen oxy hóa khử đột biến, 85 so với 503), nhưng kiểu phản ứng phiên mã chậm trễ của mandeloup đối với bệnh thán thư lại tương tự như phản ứng sớm của 83A:476. Ở Boregine và Quần thể 22660, sự hội tụ này thấp hơn ở mức lần lượt là 51,6% và 75,6%.
Các mô hình biểu hiện của các thành phần chính của thuật ngữ quá trình sinh học “GO:0055114 Quá trình oxy hóa khử” đã được tiết lộ. Thang đo Log2 biểu thị các giá trị log2 (thay đổi gấp đôi) giữa các cây được tiêm chủng (Colletotrichum lupini, chủng Col-08, thu được từ các cánh đồng đậu lupin, Wizhenica, Ba Lan, 1999) và các cây đối chứng (tiêm chủng giả) tại cùng thời điểm. Các dòng đậu lupin lá hẹp sau đây đã được phân tích: 83A:476 (kháng bệnh, mang alen Lanr1 đồng hợp tử), Boregine (kháng bệnh, nền tảng di truyền không rõ), Mandelup (kháng bệnh trung bình, mang alen AnMan đồng hợp tử) và Quần thể 22660 (mẫn cảm).
83A:476 Phản ứng phiên mã khi tiêm chủng C. lupini (chủng Col-08) cũng bao gồm sự im lặng phối hợp của các gen được quy cho thuật ngữ GO:0015979 “quang hợp” và các quá trình sinh học liên quan khác (HÌNH 5). Bộ DEG GO:0015979 này chứa 105 gen bị ức chế đáng kể ở 6 hpi tại 83A:476. Trong tập hợp con này, 37 gen cũng bị giảm điều hòa trong Mandelup ở 48 HPI và 35 gen tại cùng thời điểm trong quần thể 22660, bao gồm 19 DEG chung cho cả hai kiểu gen. Không có DEG nào liên quan đến thuật ngữ GO: 0015979 được kích hoạt đáng kể trong bất kỳ sự kết hợp nào (dòng x thời gian).
Các mô hình biểu hiện của các thành phần chính của thuật ngữ quá trình sinh học “GO:0015979 Quang hợp” đã được tiết lộ. Thang đo Log2 biểu thị các giá trị log2 (thay đổi gấp đôi) giữa các cây được tiêm chủng (Colletotrichum lupini, chủng Col-08, thu được từ các cánh đồng đậu lupin, Wizhenica, Ba Lan, 1999) và các cây đối chứng (tiêm chủng giả) tại cùng thời điểm. Các dòng đậu lupin lá hẹp sau đây đã được phân tích: 83A:476 (kháng bệnh, mang alen Lanr1 đồng hợp tử), Boregine (kháng bệnh, nền tảng di truyền không rõ), Mandelup (kháng bệnh trung bình, mang alen AnMan đồng hợp tử) và Quần thể 22660 (mẫn cảm).
Dựa trên kết quả phân tích biểu hiện khác biệt và có thể liên quan đến phản ứng phòng vệ chống lại nấm gây bệnh, bộ bảy gen này đã được chọn để định lượng hồ sơ biểu hiện bằng PCR thời gian thực (Bảng bổ sung S9).
Gen protein giả định TanjilG_10657 được cảm ứng đáng kể ở tất cả các dòng và thời điểm nghiên cứu so với cây đối chứng (bắt chước) (Bảng bổ sung S10, S11). Ngoài ra, hồ sơ biểu hiện của TanjilG_10657 cho thấy xu hướng tăng trong suốt quá trình thí nghiệm đối với tất cả các dòng. Quần thể 22660 cho thấy độ nhạy cao nhất của TanjilG_10657 đối với quá trình tiêm chủng với mức kích hoạt gấp 114 lần và mức biểu hiện tương đối cao nhất (4,4 ± 0,4) ở 24 HPI (Hình 6a). Gen protein PR10 LlR18A TanjilG_27015 cũng cho thấy sự kích hoạt trên tất cả các dòng và thời điểm, với ý nghĩa thống kê tại hầu hết các điểm dữ liệu (Hình 6b). Tương tự như TanjilG_10657, mức biểu hiện tương đối cao nhất của TanjilG_27015 được quan sát thấy ở quần thể được tiêm chủng 22660 ở 24 HPI (19,5 ± 2,4). Gen acid endochitinase TanjilG_04706 được điều hòa tăng đáng kể ở tất cả các dòng và tại mọi thời điểm ngoại trừ Boregine 6 hpi (Hình 6c). Nó được cảm ứng mạnh tại thời điểm đầu tiên (6 HPI) ở 83A:476 (gấp 10,5 lần) và tăng vừa phải ở các dòng khác (gấp 6,6-7,5 lần). Trong suốt quá trình thử nghiệm, biểu hiện của TanjilG_04706 vẫn ở mức tương tự ở 83A:476 và Boregine, trong khi ở Mandelup và Quần thể 22660, nó tăng đáng kể, đạt các giá trị tương đối cao (lần lượt là 5,9 ± 1,5 và 6,2 ± 1,5). Gen giống endoglucan-1,3-β-glucosidase TanjilG_23384 cho thấy hoạt động cao tại hai thời điểm đầu tiên (6 và 12 hpi) ở tất cả các dòng ngoại trừ quần thể 22660 (Hình 6d). Mức biểu hiện tương đối cao nhất của TanjilG_23384 được quan sát thấy tại thời điểm thứ hai (12 hpi) ở Mandelup (2,7 ± 0,3) và 83A:476 (1,5 ± 0,1). Ở 24 HPI, biểu hiện TanjilG_23384 tương đối thấp ở tất cả các dòng được nghiên cứu (từ 0,04 ± 0,009 đến 0,44 ± 0,12).
Hồ sơ biểu hiện của các gen được chọn (ag) được tiết lộ bằng PCR định lượng. Các số 6, 12 và 24 biểu thị giờ sau khi tiêm vắc-xin. Các gen LanDExH7 và LanTUB6 được sử dụng để chuẩn hóa và LanTUB6 được sử dụng để hiệu chuẩn giữa các chuỗi. Thanh lỗi biểu thị độ lệch chuẩn dựa trên ba bản sao sinh học, mỗi bản sao là giá trị trung bình của ba bản sao kỹ thuật. Ý nghĩa thống kê của sự khác biệt về mức độ biểu hiện giữa cây được tiêm chủng (Colletotrichum lupini, chủng Col-08, thu được năm 1999 từ cánh đồng lupin ở Wierzenica, Ba Lan) và cây đối chứng (tiêm chủng giả) được đánh dấu ở trên các điểm dữ liệu (*Giá trị P < 0,05, **Giá trị P ≤ 0,01, ***Giá trị P ≤ 0,001). Ý nghĩa thống kê của sự khác biệt về mức độ biểu hiện giữa cây được tiêm chủng (Colletotrichum lupini, chủng Col-08, thu được năm 1999 từ cánh đồng lupin ở Wierzenica, Ba Lan) và cây đối chứng (tiêm chủng giả) được đánh dấu ở trên các điểm dữ liệu (*Giá trị P < 0,05, **Giá trị P ≤ 0,01, ***Giá trị P ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, năm 1999 г. Верженице, Польша) và контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, *** значение P ≤ 0,001). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về mức độ biểu hiện giữa cây được tiêm chủng (Colletotrichum lupini, chủng Col-08, thu được năm 1999 từ một cánh đồng cây lupin ở Wierzhenice, Ba Lan) và cây đối chứng (được tiêm chủng giả) được ghi chú ở trên các điểm dữ liệu (*Giá trị P < 0,05, **Giá trị P ≤ 0,01, ***Giá trị P ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini, Col-08株,1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得)和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值 0,01, ***P 值 0,001)。接种 （colletotrichum lupini , color-08 株 , 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得) 和 对照 （接种 植物 之间水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P 0,01, ***P 0,001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) và контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về mức độ biểu hiện giữa cây được tiêm chủng (Colletotrichum lupini, chủng Col-08, lấy từ các cánh đồng trồng cây lupin ở Verzhenice, Ba Lan, năm 1999) và cây đối chứng (được tiêm chủng giả) được ghi chú ở trên các điểm dữ liệu (*Giá trị P < 0,05, **Giá trị P ≤ 0,01, ***Giá trị P ≤ 0,001).Các dòng NLL được phân tích là: 83A:476 (kháng bệnh, mang alen Lanr1 đồng hợp tử), Mandelup (kháng bệnh trung bình, mang alen AnMan đồng hợp tử), Boregine (kháng bệnh, nền tảng di truyền chưa rõ) và quần thể 22660 (mẫn cảm).
Gen ứng cử viên TanjilG_05042 tại locus Lanr1 cho thấy kiểu biểu hiện khác biệt rõ rệt so với các hồ sơ thu được từ các nghiên cứu RNA-seq (Hình 6e). Sự kích hoạt đáng kể của gen này đã được quan sát thấy ở Mandelup và quần thể 22660 (lần lượt là lên đến 39,7 và 11,7 lần), dẫn đến mức độ biểu hiện tương đối cao (lần lượt là lên đến 1,4 ± 0,14 và 7,2 ± 1,3). 83A:476 cũng cho thấy một số sự điều hòa tăng của gen TanjilG_05042 (lên đến 3,8 lần), tuy nhiên, mức độ biểu hiện tương đối đạt được (0,044 ± 0,002) thấp hơn 30 lần so với mức độ quan sát thấy ở Mandelup và quần thể 22660. được phân tích bằng qPCR cho thấy sự khác biệt đáng kể về mức độ biểu hiện giữa các kiểu gen trong các biến thể được tiêm vắc-xin giả (kiểm soát), đạt mức chênh lệch gấp 58 lần giữa quần thể 22660 và 83A:476, cũng như giữa quần thể 22660 và 22660. Sự khác biệt gấp hai lần đạt được giữa Boregine và Mandalup.
Gen ứng cử viên tại locus AnMan, TanjilG_12861, được kích hoạt để đáp ứng với vắc-xin ở 83A:476 và Mandelup, trung tính ở quần thể 22660 và bị giảm điều hòa ở Boregine (Hình 6f). Biểu hiện tương đối của gen TanjilG_12861 là cao nhất ở 83A: 476 đã tiêm chủng (0,14 ± 0,01). Gen protein sốc nhiệt loại I 17,4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 cho thấy mức biểu hiện tương đối thấp hơn ở tất cả các chủng và thời điểm nghiên cứu (Hình 6g). Giá trị cao nhất được quan sát thấy ở 24 HPI ở quần thể 22660 (0,14 ± 0,02, tăng gấp tám lần để đáp ứng với vắc-xin).
So sánh các hồ sơ biểu hiện gen (Hình 7) cho thấy mối tương quan cao giữa TanjilG_10657 và bốn gen khác: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) và TanjilG_04706 (r = 0,79). Những kết quả như vậy có thể chỉ ra sự đồng điều hòa của các gen này trong phản ứng phòng vệ. Các gen TanjilG_12861 và TanjilG_23384 cho thấy các hồ sơ biểu hiện khác nhau với các giá trị hệ số tương quan Pearson thấp hơn (lần lượt từ 0,08 đến 0,43 và -0,19 đến 0,28) so với các gen khác.
Các tương quan giữa các hồ sơ biểu hiện gen đã được phát hiện bằng cách sử dụng PCR định lượng. Các dòng đậu lá hẹp sau đây đã được phân tích: 83A:476 (kháng bệnh, mang alen Lanr1 đồng hợp tử), Mandelup (kháng bệnh trung bình, mang alen AnMan đồng hợp tử), Boregine (kháng bệnh, nền tảng di truyền chưa rõ) và Quần thể 22660 (mẫn cảm). Ba thời điểm đã được tính toán (6, 12 và 24 giờ sau khi tiêm chủng), bao gồm các cây đã tiêm chủng (Colletotrichum lupini, chủng Col-08, lấy từ các cánh đồng đậu ở Wierzhenice, Ba Lan, năm 1999) và cây đối chứng (tiêm chủng giả). Thang đo cho thấy giá trị của hệ số tương quan Pearson.
Dựa trên dữ liệu thu được ở mức 6 mã lực trên một inch, WGCNA đã được thực hiện trên 9981 DEG được xác định bằng cách so sánh các cây được tiêm chủng và đối chứng để tập trung vào phản ứng phòng vệ sớm (Bảng bổ sung S12). Hai mươi hai mô-đun gen (cụm) đã được tìm thấy với các cấu hình biểu hiện tương quan (tích cực hoặc tiêu cực) giữa các kiểu gen và các biến thể thử nghiệm. Trung bình, mức độ biểu hiện gen giảm dần theo thứ tự 83A:476 > Mandelup > Boregine > Quần thể 22660 (tuy nhiên, ở cả hai biến thể, xu hướng này mạnh hơn ở cây đối chứng). Trung bình, mức độ biểu hiện gen giảm dần theo thứ tự 83A:476 > Mandelup > Boregine > Quần thể 22660 (tuy nhiên, ở cả hai biến thể, xu hướng này mạnh hơn ở cây đối chứng). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Dân số 22660 (в обоих вариантах, однако, bạn có thể làm điều đó контрольных растений). Trung bình, mức độ biểu hiện gen giảm theo thứ tự 83A:476 > Mandelup > Boregine > Quần thể 22660 (tuy nhiên, ở cả hai biến thể, xu hướng này mạnh hơn ở cây đối chứng).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Dân số 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> dân số 22660 的 顺序 下降 （, 在 种 中 , 这 种 在 在植物 中 更)。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Dân số 22660 (однако в обоих вариантах эта тенденция была сильнее у контрольных (thực tế). Trung bình, mức độ biểu hiện gen giảm trong chuỗi 83A:476 > Mandelup > Boregine > Quần thể 22660 (tuy nhiên, ở cả hai biến thể, xu hướng này đều mạnh hơn ở cây đối chứng).Tiêm chủng dẫn đến điều hòa tăng biểu hiện gen, đặc biệt là ở các mô-đun 18, 19, 14, 6 và 1 (theo thứ tự hiệu ứng giảm dần), điều hòa âm tính (ví dụ mô-đun 9 và 20) hoặc có hiệu ứng trung tính (ví dụ mô-đun 11, 22, 8 và 13). Phân tích làm giàu thuật ngữ GO (Bảng bổ sung S13) cho thấy “GO: 0006952 phản ứng bảo vệ” đối với mô-đun được tiêm chủng (18) với hoạt động tối đa, bao gồm các gen được phân tích bằng qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 và TanjilG_27015), cũng như nhiều mô-đun quang hợp bị ức chế nhiều nhất (9). Bộ tập trung mô-đun 18 (Hình 8) được xác định là gen TanjilG_26536 mã hóa protein LlR18B giống PR-10, và bộ tập trung mô-đun 9 được xác định là gen TanjilG_28955 mã hóa protein PsbQ của hệ thống quang hợp II. Một gen kháng bệnh thán thư ứng cử viên Lanr1, TanjilG_05042, được tìm thấy trong mô-đun 22 (Hình 9) và có liên quan đến các thuật ngữ “GO:0044260 Các quá trình trao đổi chất đại phân tử tế bào” và “GO:0006355 Điều hòa phiên mã, tạo khuôn DNA” mang trung tâm TanjilG_01212. gen mã hóa yếu tố phiên mã ứng suất nhiệt A-4a (HSFA4a).
Phân tích mạng lưới có trọng số về sự đồng biểu hiện gen của các mô-đun với các thuật ngữ quá trình sinh học được biểu diễn quá mức “GO: 0006952 Phản ứng phòng vệ”. Việc gắn kết được đơn giản hóa để làm nổi bật bốn gen được phân tích bằng qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 và TanjilG_27015).
Phân tích mạng lưới có trọng số về sự đồng biểu hiện gen của một mô-đun với một thuật ngữ quá trình sinh học được biểu diễn quá mức “GO: 0006355: Điều hòa phiên mã, tạo mẫu DNA” và mang một gen kháng bệnh thán thư ứng cử viên Lanr1 TanjilG_05042. Việc gắn kết được đơn giản hóa để phân lập gen TanjilG_05042 và gen TanjilG_01212 trung tâm.
Việc sàng lọc khả năng kháng bệnh thán thư được thu thập tại Úc cho thấy hầu hết các giống được thả sớm đều dễ bị nhiễm bệnh; Kalya, Coromup và Mandelup được mô tả là có khả năng kháng trung bình, trong khi Wonga, Tanjil và 83A:476 được mô tả là có khả năng kháng cao26,27,31. có cùng một alen kháng, được chỉ định là Lanr1, và Coromup và Mandelup có một alen khác, được chỉ định là AnMan10, 26, 39, trong khi Kalya đã truyền một alen khác. , Lanr2. Việc sàng lọc khả năng kháng bệnh thán thư ở Đức đã xác định được dòng Bo7212 kháng với một alen ứng cử viên khác ngoài Lanr1, được chỉ định là LanrBo36.
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tần suất alen Lanr1 rất thấp (khoảng 6%) trong nguồn gen được thử nghiệm. Quan sát này phù hợp với kết quả sàng lọc nguồn gen Đông Âu bằng các dấu hiệu Anseq3 và Anseq4, cho thấy alen Lanr1 chỉ có trong hai dòng Belarus. Điều này cho thấy alen Lanr1 vẫn chưa được các chương trình nhân giống địa phương sử dụng rộng rãi, không giống như ở Úc, nơi đây là một trong những alen chính cho nhân giống hỗ trợ bằng dấu hiệu. Điều này có thể là do mức độ kháng thấp hơn do alen Lanr1 cung cấp trong điều kiện đồng ruộng ở Châu Âu so với báo cáo của Úc. Ngoài ra, các nghiên cứu về bệnh thán thư ở những vùng có lượng mưa lớn ở Úc đã chỉ ra rằng phản ứng kháng do alen Lanr1 trung gian có thể không hiệu quả trong điều kiện thời tiết thuận lợi cho sự phát triển và phát triển nhanh chóng của tác nhân gây bệnh19,42. Trên thực tế, trong nghiên cứu hiện tại, một số triệu chứng của bệnh thán thư cũng được quan sát thấy ở các kiểu gen mang alen Lanr1, cho thấy khả năng kháng có thể biến mất trong điều kiện tối ưu cho sự phát triển của C. lupini. Ngoài ra, có thể có những giải thích dương tính giả về sự hiện diện của các dấu hiệu Anseq3 và Anseq4, cách vị trí Lanr1 khoảng 1 cM, 28,30,43 .
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy 83A:476, mang alen Lanr1, phản ứng với việc tiêm chủng C. lupini bằng cách lập trình lại phiên mã quy mô lớn tại thời điểm phân tích đầu tiên (6 hpi), trong khi ở Mandelup, mang alen AnMan, phản ứng phiên mã được quan sát thấy muộn hơn nhiều. (từ 24 đến 48 hpi). Những biến thể tạm thời này trong phản ứng phòng vệ có liên quan đến sự khác biệt trong các triệu chứng bệnh, làm nổi bật tầm quan trọng của việc nhận biết mầm bệnh sớm để có phản ứng thành công với khả năng kháng thuốc. Để lây nhiễm vào mô thực vật, bào tử bệnh than phải trải qua một số giai đoạn phát triển trên bề mặt vật chủ, bao gồm nảy mầm, phân chia tế bào và hình thành appressorium. Phần phụ là cấu trúc lây nhiễm bám vào bề mặt vật chủ và tạo điều kiện xâm nhập vào mô vật chủ. Do đó, bào tử C. gloeosporioides trong chiết xuất đậu cho thấy sự phân chia đầu tiên của nhân sau 75-90 phút ủ, hình thành ống mầm sau 90-120 phút và ức chế sau 4 giờ 45 . Xoài C. gloeosporioides cho thấy hơn 40% bào tử nảy mầm sau 3 giờ ủ và khoảng 20% ​​hình thành các chất áp dụng sau 4 giờ. Gen CAP20 liên quan đến độc lực của C. gloeosporioides cho thấy hoạt động phiên mã trong bào tử hình thành biểu sinh sau 3,5 giờ ủ trong sáp bề mặt quả bơ với nồng độ protein CAP20 cao sau 4 giờ 46 phút. Tương tự như vậy, hoạt động của các gen sinh tổng hợp melanin ở C. trifolii được kích thích trong quá trình ủ 2 giờ tiếp theo là sự hình thành của một chất áp dụng sau 1 giờ. Các nghiên cứu về mô lá đã chỉ ra rằng dâu tây được tiêm C. acutatum có sự ức chế đầu tiên ở 8 hpi, trong khi cà chua được tiêm C. coccodes có sự ức chế đầu tiên ở 4 hpi48,49. phần lớn phù hợp với thang thời gian của quá trình lây nhiễm Colletotrichum spp. Phản ứng phòng vệ nhanh đối với 83A:476 cho thấy sự tham gia của gen kháng thuốc thực vật và gen miễn dịch kích hoạt bởi tác nhân (ETI) trong dòng này, trong khi phản ứng chậm của Mandelup hỗ trợ cho giả thuyết miễn dịch kích hoạt bởi mô hình phân tử liên quan đến vi mô (MTI) 50. Phản ứng sớm đối với 83A: 476 và Mandelup. Sự chồng chéo một phần giữa các gen được điều chỉnh tăng hoặc giảm trong phản ứng chậm cũng hỗ trợ cho khái niệm này, vì ETI thường được coi là phản ứng MTI được tăng tốc và tăng cường, đạt đến đỉnh điểm là tế bào chết theo chương trình tại vị trí nhiễm trùng, được gọi là sốc phản vệ 51,52 .
Hầu hết các gen được quy cho thuật ngữ được biểu diễn quá mức Gene Ontology GO:0006952 “Defense Response” là 11 đồng đẳng của protein thông điệp nhịn ăn do căng thẳng gây ra 22 (tương tự như SAM22) và bảy protein giống latex chính (MLP). Các protein giống 31, 34, 43 và 423 cho thấy sự tương đồng về trình tự. Các gen giống SAM22 cho thấy sự hoạt hóa đáng kể kéo dài lâu hơn, cho thấy mức độ kháng bệnh thán thư tăng lên (83A: 476 và Boregine). Tuy nhiên, các gen giống MLP chỉ bị giảm điều hòa ở các dòng mang alen kháng ứng viên (83A: 476/Lanr1 ở thời điểm 6 hpi và Mandelup/AnMan ở thời điểm 24 hpi). Cần lưu ý rằng tất cả các đồng đẳng giống SAM22 đã xác định đều bắt nguồn từ một cụm gen trải dài khoảng 105 kb, trong khi các gen giống MLP bắt nguồn từ các vùng riêng biệt của bộ gen. Sự kích hoạt phối hợp của các gen giống SAM22 như vậy cũng được tìm thấy trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi về khả năng kháng NLL đối với việc tiêm chủng Diaporthetoxica, cho thấy rằng chúng có liên quan đến các thành phần ngang của phản ứng phòng vệ. Kết luận này cũng được hỗ trợ bởi các báo cáo về phản ứng tích cực của các gen giống SAM22 đối với tổn thương hoặc điều trị bằng axit salicylic, chất gây cảm ứng nấm hoặc hydrogen peroxide.
Các gen giống MLP đã được chứng minh là phản ứng với nhiều loại căng thẳng phi sinh học và sinh học, bao gồm nhiễm trùng do vi khuẩn, vi-rút và nấm gây bệnh ở nhiều loài thực vật55. Hướng phản ứng với một số tương tác giữa thực vật và mầm bệnh dao động từ tăng mạnh (tức là trong quá trình xâm nhiễm bông bằng Verticillium dahliae) đến giảm đáng kể (tức là sau khi cây táo bị nhiễm Alternaria spp.)56,57. Sự điều hòa giảm đáng kể của gen giống MLP 423 đã được quan sát thấy trong quá trình phòng vệ của quả bơ đối với nhiễm trùng F. niger và trong quá trình nhiễm trùng cây táo Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola và Alternaria alternata là các kiểu bệnh của táo58,59. Ngoài ra, các mô sẹo táo biểu hiện quá mức gen giống MLP 423 có biểu hiện thấp hơn các gen liên quan đến khả năng kháng thuốc và dễ bị nhiễm nấm hơn59. Sau Fusarium oxysporum f, gen giống MLP 423 cũng bị ức chế trong chất nguyên sinh đậu thường kháng thuốc. cn. Nhiễm trùng đậu 60.
Các thành viên khác của họ PR-10 được xác định trong nghiên cứu RNA-seq của chúng tôi là các gen LlR18A và LlR18B để đáp ứng với sự điều hòa tăng, cũng như gen được điều hòa tăng (1 gen) hoặc điều hòa giảm (3 gen) cho protein vận chuyển lipid DIR1. . Ngoài ra, WGCNA làm nổi bật gen LlR18B như một trung tâm trong mô-đun này, rất dễ bị tiêm chủng và mang một số gen phản ứng bảo vệ. Các gen LlR18A và LlR18B được tạo ra trong lá cây lupin vàng để đáp ứng với vi khuẩn gây bệnh, cũng như trong thân cây NLL sau khi tiêm chủng D. toxica, trong khi đồng đẳng của các gen này ở lúa, RSOsPR10, được tạo ra nhanh chóng bởi một bệnh nhiễm nấm có thể liên quan đến con đường truyền tín hiệu axit jasmonic53,61, 62. Gen DIR1 mã hóa các protein vận chuyển lipid không đặc hiệu cần thiết cho sự khởi phát của tình trạng kháng thuốc mắc phải toàn thân (SAR). Với sự phát triển của các phản ứng bảo vệ, protein DIR1 được vận chuyển từ ổ nhiễm trùng qua mạch rây để gây ra SAR ở các cơ quan xa. Điều thú vị là gen TanjilG_02313 DIR1 đã được gây ra đáng kể tại thời điểm đầu tiên ở dòng 84A:476 và Quần thể 22660, nhưng khả năng kháng bệnh thán thư chỉ phát triển thành công ở dòng 84A:476. Điều này có thể chỉ ra một số chức năng phụ của gen DIR1 trong NLL, vì ba đồng đẳng còn lại chỉ phản ứng với việc tiêm chủng ở dòng 83A:476 sau 6 giờ và phản ứng này hướng xuống dưới.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, các thành phần phổ biến nhất tương ứng với quá trình sinh học được gọi là “Quá trình oxy hóa khử GO:0055114” là protein cytochrome P450, peroxidase, linoleic acid 9S-/13S-lipoxygenase và oxidase acid 1-aminocyclopropane-1-carboxylic. Ngoài ra, WGCNA của chúng tôi định nghĩa đồng đẳng HSFA4a là một trung tâm mang các mô-đun như ứng cử viên gen kháng Lanr1 TanjilG_05042. HSFA4a là một thành phần của quá trình điều hòa phiên mã hạt nhân phụ thuộc vào quá trình oxy hóa khử ở thực vật.
Protein cytochrome P450 là các chất oxy hóa khử xúc tác các phản ứng hydroxyl hóa phụ thuộc NADPH và/hoặc O2 trong quá trình chuyển hóa sơ cấp và thứ cấp, bao gồm quá trình chuyển hóa các chất lạ, cũng như hormone, axit béo, sterol, thành phần thành tế bào, biopolymer và quá trình sinh tổng hợp các hợp chất bảo vệ 69. Trong nghiên cứu của chúng tôi, tính biến thiên trong chức năng cytochrome P450 của thực vật đã giảm từ -10,6 log2 (thay đổi gấp đôi) xuống 5,7 do số lượng lớn các đồng đẳng bị thay đổi (37) và sự khác biệt trong các kiểu phản ứng giữa các gen cụ thể, phản ánh sự điều chỉnh theo hướng tăng. . Chỉ sử dụng dữ liệu RNA-seq để làm sáng tỏ chức năng sinh học được cho là của các gen NLL trong một siêu họ protein lớn như vậy sẽ mang tính suy đoán cao. Tuy nhiên, cần lưu ý rằng một số gen cytochrome P450 có liên quan đến khả năng kháng nấm hoặc vi khuẩn gây bệnh tăng lên, bao gồm cả việc góp phần gây ra phản ứng dị ứng 69,70,71.
Peroxidase lớp III là các enzyme thực vật đa chức năng tham gia vào nhiều quá trình trao đổi chất trong quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật, cũng như để đáp ứng với các căng thẳng về môi trường như độ mặn, hạn hán, cường độ ánh sáng cao và sự tấn công của mầm bệnh72. Peroxidase tham gia vào sự tương tác của một số loài thực vật với bệnh than, bao gồm Stylosanthes humilis và C. gloeosporioides, Lens culinaris và C. truncatum, Phaseolus vulgaris và C. lindemuthianum, Cucumis sativus và C. lagenarium73,74,75,76. Phản ứng rất nhanh, đôi khi thậm chí ở mức 4 HPI, trước khi nấm xâm nhập vào mô thực vật73. Gen peroxidase cũng phản ứng với quá trình tiêm chủng D. toxica NLL. Ngoài các chức năng điển hình của chúng là điều chỉnh sự bùng nổ oxy hóa hoặc loại bỏ căng thẳng oxy hóa, peroxidase có thể can thiệp vào sự phát triển của mầm bệnh bằng cách tạo ra các rào cản vật lý dựa trên sự gia cố thành tế bào trong quá trình hóa gỗ, tiểu đơn vị hoặc liên kết chéo của các hợp chất cụ thể. Chức năng này có thể được quy cho gen TanjilG_03329 mã hóa cho một loại peroxidase anion hình thành lignin được tăng cường đáng kể trong nghiên cứu của chúng tôi ở dòng kháng 83A:476 ở thời điểm 6 HPI, nhưng không có ở các chủng và thời điểm khác không có phản ứng.
9S-/13S-lipoxygenase của axit linoleic là bước đầu tiên trong con đường oxy hóa của quá trình sinh tổng hợp lipid78. Các sản phẩm của con đường này có nhiều chức năng trong quá trình bảo vệ thực vật, bao gồm tăng cường thành tế bào thông qua sự hình thành các cặn callose và pectin, và điều hòa stress oxy hóa thông qua sản xuất các loài oxy phản ứng79,80,81,82,83. Trong nghiên cứu hiện tại, biểu hiện của axit linoleic 9S-/13S-lipoxygenase đã bị thay đổi ở tất cả các chủng, nhưng ở quần thể dễ bị tổn thương 22660, sự điều hòa tăng chiếm ưu thế tại các thời điểm khác nhau, trong khi ở các chủng mang alen Lanr1 kháng thuốc và AnMan, nó nhấn mạnh sự đa dạng hóa của lớp oxylipin trong các phản ứng bảo vệ bệnh than giữa các kiểu gen này.
Đồng đẳng 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase (ACO) tăng đáng kể (9 gen) hoặc giảm đáng kể (2 gen) khi được tiêm chủng bằng cây đậu lupin. Ngoại trừ hai trường hợp, tất cả các phản ứng này đều xảy ra ở 6 ​​hp. tại 83A:476. Phản ứng enzym được trung gian bởi các protein ACO là bước giới hạn tốc độ trong quá trình sản xuất ethylene và do đó được điều chỉnh rất chặt chẽ84. Ethylene là một loại hormone thực vật đóng nhiều vai trò khác nhau trong việc điều chỉnh sự phát triển của cây và phản ứng với các điều kiện căng thẳng phi sinh học và sinh học. Việc cảm ứng phiên mã ACO và kích hoạt con đường truyền tín hiệu ethylene có liên quan đến việc tăng khả năng kháng nấm hemibiotrophic oryzae oryzae bằng cách điều chỉnh sản xuất các loài oxy phản ứng và phytoalexin. Một quá trình nhiễm trùng lá rất giống nhau được tìm thấy giữa M. oryzae và C. lupini88,89, trong bối cảnh điều hòa tăng đáng kể các đồng đẳng ACO trong dòng 83A:476 được báo cáo trong nghiên cứu này, làm thay đổi khả năng cung cấp khả năng kháng bệnh thán thư NLL Ethylene - một bước trung tâm truyền tín hiệu trong các con đường phân tử.
Trong nghiên cứu hiện tại, sự ức chế quy mô lớn của nhiều gen liên quan đến quang hợp đã được quan sát thấy ở 6 hpi trong 83A:476 và ở 48 hpi trong Mandeloop và quần thể 22660. Mức độ và tiến triển của những thay đổi này tỷ lệ thuận với mức độ. Khả năng kháng bệnh thán thư đã được quan sát thấy trong thí nghiệm này. Gần đây, sự ức chế mạnh và sớm của các bản sao liên quan đến quang hợp đã được báo cáo trong một số mô hình tương tác thực vật-bệnh nguyên, bao gồm vi khuẩn gây bệnh và nấm. Sự vội vàng (từ 2 HPI trong một số tương tác) và sự ức chế toàn diện các gen liên quan đến quang hợp để đáp ứng với nhiễm trùng có thể kích hoạt khả năng miễn dịch của thực vật dựa trên việc triển khai các loài oxy phản ứng và sự tương tác của chúng với con đường axit salicylic để trung gian cho các phản ứng dị ứng 90,94.
Tóm lại, các cơ chế phản ứng phòng vệ được đề xuất cho dòng kháng thuốc nhất (83A:476) bao gồm nhận dạng tác nhân gây bệnh nhanh chóng bởi gen R (có lẽ là TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) và phản ứng dị ứng trung gian bởi axit salicylic và tín hiệu ethylene, tiếp theo là thiết lập SAR tầm xa. hành động được hỗ trợ bởi protein DIR-1. Cần lưu ý rằng giai đoạn sinh dưỡng đối với nhiễm trùng C. lupini rất ngắn (khoảng 2 ngày), tiếp theo là sự phát triển hoại tử95. Sự chuyển đổi giữa các giai đoạn này có thể liên quan đến hoại tử và biểu hiện của các protein có thể cảm ứng với ethylene đóng vai trò là chất kích hoạt phản ứng quá mẫn ở cây chủ. Do đó, cửa sổ thời gian để bắt thành công C. lupini ở giai đoạn sinh dưỡng là rất hẹp. Việc lập trình lại các gen liên quan đến quá trình oxy hóa khử và quang hợp được quan sát thấy ở 83A:476 ở 6 hpi phù hợp với sự tiến triển của sợi nấm và báo hiệu sự phát triển của phản ứng bảo vệ thành công ở giai đoạn sinh dưỡng. Phản ứng phiên mã của Mandelup và quần thể 22660 có thể bị chậm quá mức để bắt được nấm trước khi chuyển sang giai đoạn phát triển hoại tử, tuy nhiên, Mandelup có thể hiệu quả hơn quần thể 22660 vì sự điều hòa tương đối nhanh của protein PR-10 thúc đẩy khả năng kháng ngang.
ETI, được thúc đẩy bởi gen R điển hình, dường như là một cơ chế phổ biến cho khả năng kháng bệnh thán thư của đậu. Do đó, trong cây họ đậu mô hình Medicago truncatula, khả năng kháng bệnh thán thư được truyền qua gen RCT1, một thành viên của lớp gen R thực vật TIR-NBS-LRR97. Gen này cũng truyền khả năng kháng bệnh thán thư phổ rộng ở cỏ linh lăng khi được chuyển sang các cây dễ bị nhiễm bệnh. Ở đậu thường (P. vulgaris), cho đến nay đã xác định được hơn hai chục gen kháng bệnh thán thư. Một số gen này được tìm thấy ở các vùng không có bất kỳ gen R điển hình nào, tuy nhiên nhiều gen khác nằm ở rìa nhiễm sắc thể mang cụm gen NBS-LRR, bao gồm TIR-NBS-LRR99. Nghiên cứu SSR trên toàn bộ hệ gen cũng xác nhận mối liên quan của gen NBS-LRR với khả năng kháng bệnh thán thư ở đậu thường. Gen R điển hình cũng được tìm thấy trong vùng bộ gen mang vị trí kháng bệnh thán thư chính ở cây đậu trắng 101.
Công trình của chúng tôi cho thấy phản ứng kháng tức thời, được kích hoạt ở giai đoạn đầu của quá trình nhiễm trùng thực vật (tốt nhất là không muộn hơn 12 giờ sau khi nhiễm bệnh), bảo vệ hiệu quả cây đậu lá hẹp khỏi bệnh thán thư do nấm gây bệnh Collelotrichum lupini gây ra. Sử dụng giải trình tự thông lượng cao, chúng tôi đã chứng minh được các hồ sơ biểu hiện khác biệt của các gen kháng bệnh thán thư ở thực vật NLL được trung gian bởi các gen kháng Lanr1 và AnMan. Phòng thủ thành công liên quan đến việc thiết kế cẩn thận các gen cho các protein tham gia vào quá trình oxy hóa khử, quang hợp và sinh bệnh trong vòng vài giờ sau lần đầu tiên cây tiếp xúc với tác nhân gây bệnh. Các phản ứng bảo vệ tương tự, nhưng bị trì hoãn theo thời gian, kém hiệu quả hơn nhiều trong việc bảo vệ thực vật khỏi bệnh tật. Khả năng kháng bệnh than do gen Lanr1 trung gian giống với phản ứng nhanh điển hình của gen R (miễn dịch kích hoạt bởi tác nhân hiệu ứng), trong khi gen AnMan rất có thể cung cấp phản ứng theo chiều ngang (miễn dịch được kích hoạt bởi mô hình phân tử liên quan đến vi khuẩn), mang lại mức độ bền vững vừa phải.
215 dòng NLL được sử dụng để sàng lọc các dấu hiệu bệnh thán thư bao gồm 74 giống, 60 dòng thu được bằng cách lai tạo hoặc lai tạo, 5 đột biến và 76 nguồn gen hoang dã hoặc nguyên bản. Các dòng này đến từ 17 quốc gia, chủ yếu từ Ba Lan (58), Tây Ban Nha (47), Đức (27), Úc (26), Nga (19), Belarus (7), Ý (5) và các dòng khác. từ 10 quốc gia. Bộ này cũng bao gồm các dòng kháng tham chiếu: 83A:476, Tanjil, Wonga mang alen Lanr1 và Mandelup mang alen AnMan. Các dòng này được lấy từ Cơ sở dữ liệu tài nguyên di truyền cây đậu Lupin châu Âu do Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Ba Lan quản lý (Bảng bổ sung S1).
Cây được trồng trong điều kiện được kiểm soát (quang kỳ 16 giờ, nhiệt độ 25°C vào ban ngày và 18°C ​​vào ban đêm). Hai bản sao sinh học đã được phân tích. DNA được phân lập từ lá ba tuần tuổi bằng cách sử dụng Bộ dụng cụ DNeasy Plant Mini (Qiagen, Hilden, Đức) theo giao thức. Chất lượng và nồng độ của DNA được phân lập được đánh giá bằng các phương pháp quang phổ (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Hoa Kỳ). Dấu hiệu AnManM1 đánh dấu gen kháng bệnh thán thư AnMan (có nguồn gốc từ cv. Mandelup) và các dấu hiệu Anseq3 và Anseq4 nằm cạnh gen Lanr1 (có nguồn gốc từ cv. Tanjil) đã được phân tích 11,26,28. Các alen đồng hợp tử cho alen kháng được chấm điểm là "1", dễ bị nhiễm - là "0" và dị hợp tử - là 0,5.
Dựa trên kết quả sàng lọc các dấu hiệu AnManM1, AnSeq3 và AnSeq4 và tính khả dụng của hạt giống cho các thí nghiệm theo dõi cuối cùng, 50 dòng NLL đã được chọn để phân tích kiểu hình kháng bệnh thán thư. Phân tích được thực hiện theo cặp trong nhà kính được điều khiển bằng máy tính với chu kỳ quang hợp 14 giờ với phạm vi nhiệt độ là 22°C vào ban ngày và 19°C vào ban đêm. Hạt giống được cào (cắt lớp vỏ hạt ở phía đối diện của phôi bằng lưỡi dao sắc) trước khi gieo để ngăn hạt ngủ đông do lớp vỏ hạt quá cứng và để đảm bảo nảy mầm đồng đều. Cây được trồng trong chậu (11 × 11 × 21 cm) với đất vô trùng (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warsaw, Ba Lan). Tiến hành tiêm chủng bằng chủng Colletotrichum lupini Col-08, được trồng vào năm 1999 từ thân cây đậu lupin lá hẹp được trồng trên một cánh đồng ở Verzhenitsa, Đại Ba Lan (52° 27′ 42″ B 17° 04′ 05″ Đ). Có một khu vực. Các phân lập được nuôi cấy trong môi trường SNA ở 20° C dưới ánh sáng đen trong 21 ngày để kích thích hình thành bào tử. Bốn tuần sau khi gieo, khi cây đạt đến giai đoạn 4-6 lá, tiến hành tiêm chủng bằng cách phun dung dịch bào tử với nồng độ 0,5 x 106 bào tử trên ml. Sau khi tiêm chủng, cây được giữ trong bóng tối trong 24 giờ ở độ ẩm khoảng 98% và nhiệt độ 25°C để tạo điều kiện cho bào tử nảy mầm và quá trình lây nhiễm. Sau đó, cây được trồng trong điều kiện quang kỳ 14 giờ ở nhiệt độ 22°C ban ngày/19°C ban đêm và độ ẩm 70%. Điểm bệnh được tính 22 ngày sau khi tiêm chủng và dao động từ 0 (miễn dịch) đến 9 (rất dễ bị nhiễm) tùy thuộc vào sự có hoặc không có các tổn thương hoại tử trên thân và lá. Ngoài ra, sau khi chấm điểm, trọng lượng của cây được đo. Mối quan hệ giữa kiểu gen đánh dấu và kiểu hình bệnh được tính là tương quan điểm hai trình tự (không có các đánh dấu dị hợp tử trong tập hợp các dòng để phân tích kiểu hình kháng bệnh thán thư).