Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt được cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web mà không có kiểu dáng và JavaScript.
Cây lupin Angustifolius (NLL, Lupinus angustifolius L.) là một loại cây họ đậu được sử dụng để sản xuất lương thực và cải tạo đất. Sự mở rộng toàn cầu của NLL như một loại cây trồng đã thu hút nhiều loại nấm gây bệnh, bao gồm cả bệnh thán thư lupin, gây ra bệnh thán thư tàn phá nghiêm trọng. Hai alen, Lanr1 và AnMan, mang lại khả năng kháng bệnh cao hơn, đã được sử dụng trong công tác lai tạo giống NLL, nhưng cơ chế phân tử cơ bản vẫn chưa được biết rõ. Trong nghiên cứu này, các dấu hiệu Lanr1 và AnMan đã được sử dụng để sàng lọc các mẫu NLL châu Âu. Thử nghiệm vaccine trong môi trường được kiểm soát đã xác nhận hiệu quả của cả hai dòng cho kháng bệnh. Phân tích biểu hiện gen khác biệt đã được thực hiện trên các dòng kháng và mẫn cảm đại diện. Khả năng kháng bệnh thán thư có liên quan đến sự biểu hiện quá mức của các thuật ngữ phân loại gen “GO:0006952 Phản ứng phòng vệ”, “GO:0055114 Quá trình oxy hóa khử” và “GO:0015979 Quang hợp”. Ngoài ra, dòng Lanr1(83A:476) cho thấy sự tái lập trình transcriptome đáng kể diễn ra nhanh chóng sau khi cấy, trong khi các dòng khác cho thấy sự chậm trễ trong phản ứng này khoảng 42 giờ. Các phản ứng phòng vệ liên quan đến các gen TIR-NBS, CC-NBS-LRR và NBS-LRR, 10 protein liên quan đến bệnh sinh, protein vận chuyển lipid, endoglucan-1,3-β-glucosidase, protein thành tế bào giàu glycine và các gen từ con đường phản ứng của oxy. Các phản ứng sớm đối với 83A:476, bao gồm việc ức chế cẩn thận các gen liên quan đến quang hợp, trùng khớp với sự bảo vệ thành công trong giai đoạn sinh trưởng thực vật của sinh học nấm, cho thấy rằng một tác nhân kích hoạt khả năng miễn dịch. Phản ứng Mandeloop bị chậm lại, cũng như lực kéo ngang tổng thể.
Cây lupin lá hẹp (NLL, Lupinus angustifolius L.) là một loại ngũ cốc giàu protein có nguồn gốc từ vùng Địa Trung Hải phía tây1,2. Hiện nay, nó được trồng làm cây lương thực cho động vật và con người. Nó cũng được coi là phân xanh trong hệ thống luân canh cây trồng nhờ khả năng cố định nitơ của vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh và cải thiện cấu trúc đất nói chung. NLL đã trải qua quá trình thuần hóa nhanh chóng trong thế kỷ trước và vẫn đang chịu áp lực nhân giống cao3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Với việc canh tác NLL rộng rãi, sự kế thừa của các loại nấm gây bệnh đã tạo ra những môi trường sống mới trong nông nghiệp và gây ra các bệnh phá hoại cây trồng mới. Điều đáng chú ý nhất đối với nông dân và nhà lai tạo lupin là sự xuất hiện của bệnh thán thư, do nấm gây bệnh Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 gây ra. Điều đáng chú ý nhất đối với nông dân và nhà lai tạo lupin là sự xuất hiện của bệnh thán thư, do nấm gây bệnh Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 gây ra. Bạn có thể sử dụng tài khoản của mình để có được một khoản vay phù hợp và bạn có thể dễ dàng nhận được khoản vay của mình, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Điều đáng chú ý nhất đối với nông dân và nhà lai tạo lupin là sự xuất hiện của bệnh thán thư do nấm gây bệnh Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 gây ra.Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的。Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Có tóc。1 Hãy chắc chắn rằng bạn có thể đạt được mục tiêu của mình và bạn có thể đạt được điều đó, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Điều đáng chú ý nhất đối với nông dân và nhà lai tạo lupin là sự xuất hiện của bệnh thán thư do nấm gây bệnh Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 gây ra.Những báo cáo sớm nhất về căn bệnh này đến từ Brazil và Hoa Kỳ, với các triệu chứng điển hình xuất hiện lần lượt vào năm 1912 và 1929. Tuy nhiên, sau khoảng 30 năm, tác nhân gây bệnh được xác định là Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., thể hữu tính Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., thể hữu tính Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., dạng hữu tính của Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., 有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., 有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld trong Hình thái học mục tiêu. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .và H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。và H. Schlenk, .Việc phân tích kiểu hình bệnh sơ bộ được thực hiện vào giữa thế kỷ 20 cho thấy một số giống lupin NLL và lupin vàng (L. luteus L.) có khả năng kháng bệnh, nhưng tất cả các giống lupin trắng (L. albus L.) được thử nghiệm đều rất dễ bị nhiễm bệnh15,16. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự phát triển của bệnh thán thư có liên quan đến lượng mưa (độ ẩm không khí) và nhiệt độ tăng (trong khoảng 12-28°C), dẫn đến sự phá vỡ khả năng kháng bệnh ở nhiệt độ cao hơn17, 18. Trên thực tế, thời gian cần thiết để bào tử nảy mầm và bệnh bắt đầu ngắn hơn bốn lần ở 24°C (4 giờ) so với ở 12°C (16 giờ) trong điều kiện độ ẩm cao19. Do đó, sự nóng lên toàn cầu đang diễn ra đã dẫn đến sự lây lan của bệnh thán thư. Tuy nhiên, bệnh này đã được quan sát thấy ở Pháp (1982) và Ukraina (1983) như một điềm báo về mối đe dọa sắp xảy ra, nhưng dường như đã bị ngành công nghiệp lupin bỏ qua vào thời điểm đó20,21. Vài năm sau, căn bệnh tàn phá này lan rộng khắp thế giới và cũng ảnh hưởng đến các quốc gia sản xuất lupin chính như Úc, Ba Lan và Đức22,23,24. Sau một đợt bùng phát bệnh thán thư vào giữa những năm 1990, việc sàng lọc rộng rãi đã dẫn đến việc xác định một số nguồn gen kháng bệnh trong các mẫu NLL19. Khả năng kháng bệnh thán thư của NLL được kiểm soát bởi hai alen trội riêng biệt được tìm thấy trong các nguồn gen khác nhau: Lanr1 trong giống Tanjil và Wonga và AnMan trong giống Mandalay 25, 26. Các alen này bổ sung cho các dấu hiệu phân tử hỗ trợ việc lựa chọn nguồn gen kháng bệnh trong các chương trình lai tạo25,26,27,28,29,30. Dòng lai kháng bệnh 83A:476 mang alen Lanr1 được lai với dòng hoang dại mẫn cảm P27255 để thu được quần thể RIL phân ly về khả năng kháng bệnh thán thư, nhờ đó có thể xác định vị trí gen Lanr1 trên nhiễm sắc thể NLL-1131, 32, 33. Bằng cách đối chiếu các dấu hiệu bản đồ liên kết từ các locus kháng bệnh thán thư với khung gen NLL, người ta đã phát hiện ra vị trí của cả ba alen trên cùng một nhiễm sắc thể (NLL-11), nhưng ở các vị trí khác nhau29,34,35. Tuy nhiên, do số lượng RIL ít và khoảng cách di truyền lớn giữa các dấu hiệu và alen tương ứng, nên không thể đưa ra kết luận đáng tin cậy nào về các gen cơ bản của chúng. Mặt khác, việc sử dụng di truyền ngược ở cây lupin rất khó khăn do khả năng tái sinh rất thấp của chúng, điều này khiến việc thao tác di truyền trở nên phức tạp37.
Việc phát triển nguồn gen thuần hóa mang alen mong muốn ở trạng thái đồng hợp tử, chẳng hạn như 83A:476 (Lanr1) và Mandelup (AnMan), đã mở ra cánh cửa nghiên cứu khả năng kháng bệnh thán thư khi có sự hiện diện của các tổ hợp alen đối lập trong quần thể hoang dã. Khả năng của các cơ chế phân tử. So sánh các phản ứng phòng vệ được tạo ra bởi các kiểu gen cụ thể. Nghiên cứu này đánh giá phản ứng phiên mã sớm của NLL đối với việc tiêm phòng C. lupini. Đầu tiên, một nhóm nguồn gen NLL châu Âu gồm 215 dòng được sàng lọc bằng cách sử dụng các dấu hiệu phân tử đánh dấu các alen Lanr1 và AnMan. Sau đó, việc xác định kiểu hình bệnh thán thư được thực hiện trên 50 dòng NLL, đã được chọn trước đó dựa trên các dấu hiệu phân tử, trong điều kiện được kiểm soát. Dựa trên các thí nghiệm này, bốn dòng khác nhau về khả năng kháng bệnh thán thư và thành phần alen Lanr1/AnMan đã được chọn để phân tích biểu hiện gen phòng vệ khác biệt bằng hai phương pháp bổ sung: giải trình tự RNA thông lượng cao và định lượng PCR thời gian thực.
Sàng lọc một tập hợp nguồn gen NLL (N = 215) với các chỉ thị Lanr1 (Anseq3 và Anseq4) và AnMan (Anseq4) và AnMan (AnManM1) cho thấy chỉ có một dòng (95726, gần Salamanca-b) khuếch đại alen “kháng” đối với tất cả các chỉ thị, trong khi “Sự hiện diện của alen ‘mẫn cảm’” cho thấy tỷ lệ của tất cả các chỉ thị ở 158 dòng (~73,5%). Mười ba dòng tạo ra hai alen “kháng” của chỉ thị Lanr1, và 8 dòng tạo ra alen “kháng” của chỉ thị Lanr1. Alen “kháng” của chỉ thị AnMan (Bảng bổ sung S1). Hai dòng dị hợp tử đối với chỉ thị Anseq3 và một dòng dị hợp tử đối với chỉ thị AnManM1. 42 dòng (19,5%) mang các pha ngược nhau của alen Anseq3 và Anseq4, cho thấy tần suất tái tổ hợp cao giữa hai locus này. Kiểu hình bệnh thán thư trong điều kiện được kiểm soát (Bảng bổ sung S2) cho thấy sự biến đổi về khả năng kháng bệnh của các kiểu gen được thử nghiệm, điều này được phản ánh qua mức độ nghiêm trọng của bệnh thán thư. Sự khác biệt về điểm trung bình dao động từ 1,8 (kháng trung bình) đến 6,9 (mẫn cảm) và sự khác biệt về trọng lượng cây dao động từ 0,62 g (mẫn cảm) đến 4,45 g (kháng). Có mối tương quan đáng kể giữa các giá trị quan sát được trong hai lần lặp lại thí nghiệm (0,51 đối với điểm mức độ nghiêm trọng của bệnh, P = 0,00017 và 0,61 đối với trọng lượng cây, P < 0,0001) cũng như giữa hai thông số này (− 0,59 và − 0,77, P < 0,0001). Có mối tương quan đáng kể giữa các giá trị quan sát được trong hai lần lặp lại thí nghiệm (0,51 đối với điểm mức độ nghiêm trọng của bệnh, P = 0,00017 và 0,61 đối với trọng lượng cây, P < 0,0001) cũng như giữa hai thông số này (− 0,59 và − 0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 và 0,61 для массы растения, P < 0,0001), và также между этими двумя параметрами (-0,59 và -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Đã tìm thấy mối tương quan đáng kể giữa các giá trị quan sát được trong hai lần lặp lại thí nghiệm (0,51 đối với điểm mức độ nghiêm trọng của bệnh, P = 0,00017 và 0,61 đối với trọng lượng cây, P < 0,0001), cũng như giữa hai thông số này (-0,59 và -0,77, P < 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为0,51,P = 0,00017, 植物重量为0,61,P < 0,0001)Bạn có thể làm điều đó?分为 0,51 , p = 0,00017 , 植物 为 为 0,61 , p <0,0001) 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0,59 和– 0,59和– 0,59 和– 0,59 和- 0,77,P < 0,0001)。 Bạn có thể dễ dàng nhận được một khoản tiền lớn, nhưng bạn sẽ không phải lo lắng về điều đó nữa (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 và масса растения 0,61, P <0,0001), và между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001. Có mối tương quan đáng kể giữa các giá trị quan sát được khi đo lặp lại (điểm mức độ nghiêm trọng của bệnh là 0,51, P = 0,00017 và trọng lượng cây là 0,61, P < 0,0001) và giữa hai thông số này (-0,59 và -0,0001) là 0,77, P<0,0001. ).Các triệu chứng điển hình thường thấy ở cây mẫn cảm bao gồm thân cây bị gập và xoắn lại giống như cấu trúc "cung tên của người chăn cừu", tiếp theo là các vết loét hình bầu dục với bào tử màu cam/hồng (Hình bổ sung 1). Các giống của Úc mang gen Lanr1 (83A:476 và Tanjil) và AnMan (Mandelup) có khả năng kháng bệnh ở mức độ vừa phải (0,0331 và 0,0036). Một số dòng cũng mang alen Lanr1 và/hoặc AnMan "kháng bệnh" nhưng vẫn biểu hiện triệu chứng của bệnh.
Điều thú vị là, một vài dòng NLL thiếu bất kỳ alen đánh dấu "kháng bệnh" nào lại thể hiện mức độ kháng bệnh thán thư cao (tương đương hoặc cao hơn so với kiểu gen Lanr1 hoặc AnMan), chẳng hạn như Boregine (giá trị P < 0,0001 cho cả hai thông số), Bojar (giá trị P < 0,0001 cho điểm số và 0,001 cho trọng lượng cây) và quần thể B-549/79b (giá trị P < 0,0001 cho điểm số và không có ý nghĩa thống kê đối với trọng lượng). Điều thú vị là, một vài dòng NLL thiếu bất kỳ alen đánh dấu "kháng bệnh" nào lại thể hiện mức độ kháng bệnh thán thư cao (tương đương hoặc cao hơn so với kiểu gen Lanr1 hoặc AnMan), chẳng hạn như Boregine (giá trị P < 0,0001 cho cả hai thông số), Bojar (giá trị P < 0,0001 cho điểm số và 0,001 cho trọng lượng cây) và quần thể B-549/79b (giá trị P < 0,0001 cho điểm số và không có ý nghĩa thống kê đối với trọng lượng). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 hoặc AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки và 0,001 для массы растения) và популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для có thể). Điều thú vị là, một số dòng NLL thiếu bất kỳ alen đánh dấu 'kháng' nào lại thể hiện mức độ kháng bệnh thán thư cao (tương đương hoặc cao hơn so với kiểu gen Lanr1 hoặc AnMan), chẳng hạn như Boregine (giá trị P < 0,0001 cho cả hai thông số), Bojar (giá trị P < 0,0001 cho đánh giá và 0,001 cho trọng lượng cây) và quần thể B-549/79b (giá trị P < 0,0001 cho đánh giá và không có ý nghĩa thống kê đối với trọng lượng).有趣的是,一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1或AnMan 基因型相当或更高),例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001),Bojar（P 值<得分为0,0001,植物重量为0,001)和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001,重量不显着）。 Điều thú vị là một số hệ thống NLL không có bất kỳ dấu hiệu "kháng nguyên" nào lại thể hiện khả năng kháng ngang cao (tương đương với gen Lanr1 hoặc AnMan hoặc cao hơn), chẳng hạn như Boregine (cả hai thông số P < 0,0001), Bojar (giá trị P < 0,0001, trọng lượng cây 0,001) và chủng B-549/79b (giá trị P < 0,0001, trọng lượng không đáng kể). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 hoặc AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) và популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Điều thú vị là, một số dòng NLL thiếu bất kỳ alen đánh dấu 'kháng bệnh' nào lại thể hiện mức độ kháng bệnh thán thư cao (tương đương hoặc cao hơn kiểu gen Lanr1 hoặc AnMan), chẳng hạn như Boregine (giá trị P cho cả hai tham số <0,0001), Bojar (giá trị P < 0,0001, trọng lượng cây 0,001) và quần thể B-549/79b (giá trị P < 0,0001, trọng lượng không đáng kể).Hiện tượng này cho thấy khả năng tồn tại một nguồn gen kháng bệnh mới, giải thích sự thiếu tương quan giữa kiểu gen đánh dấu và kiểu hình bệnh (giá trị P từ ~0,42 đến ~0,98). Do đó, phép thử Kolmogorov-Smirnov cho thấy dữ liệu về khả năng kháng bệnh thán thư phân bố gần như bình thường đối với điểm số (giá trị P là 0,25 và 0,11) và khối lượng cây (giá trị P là 0,47 và 0,55), cho thấy tôi đưa ra giả thuyết rằng có nhiều alen hơn Lanr1 và AnMan tham gia.
Dựa trên kết quả sàng lọc khả năng kháng bệnh thán thư, 4 dòng được chọn để phân tích transcriptome: 83A:476, Boregine, Mandelup và Population 22660. Các dòng này được kiểm tra lại khả năng kháng bệnh thán thư trong các thí nghiệm gây nhiễm bằng phương pháp giải trình tự RNA, với điều kiện chúng giống như trong lần thử nghiệm trước. Giá trị điểm số như sau: Boregine (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) và Population 22660 (6,11 ± 1,29).
Giao thức Illumina NovaSeq 6000 đạt trung bình 40,5 cặp Mread trên mỗi mẫu (29,7 đến 54,4 Mread) (Bảng bổ sung S3). Điểm số căn chỉnh trong trình tự tham chiếu dao động từ 75,5% đến 88,6%. Hệ số tương quan trung bình của dữ liệu số lượng đọc giữa các biến thể thực nghiệm giữa các bản sao sinh học dao động từ 0,812 đến 0,997 (trung bình 0,959). Trong số 35.170 gen được phân tích, 2917 gen không biểu hiện và 4785 gen còn lại được biểu hiện ở mức không đáng kể (giá trị trung bình cơ sở < 5). Trong số 35.170 gen được phân tích, 2917 gen không biểu hiện và 4785 gen còn lại được biểu hiện ở mức không đáng kể (giá trị trung bình cơ sở < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5). Trong số 35.170 gen được phân tích, 2917 gen không biểu hiện và 4785 gen còn lại được biểu hiện ở mức không đáng kể (trung bình cơ sở <5).在分析的35,170 个基因中,2917 个没有表达,其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5)。35.170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительную экспрессию (базовое среднее значение <5). Trong số 35.170 gen được phân tích, 2917 gen không được biểu hiện và 4785 gen còn lại có mức độ biểu hiện không đáng kể (trung bình cơ sở <5).Như vậy, số lượng gen được coi là biểu hiện (trung bình cơ sở ≥ 5) trong suốt thí nghiệm là 27.468 (78,1%) (Bảng bổ sung S4).
Từ thời điểm đầu tiên, tất cả các dòng NLL đều phản ứng với việc cấy C. lupini (chủng Col-08) bằng cách lập trình lại hệ gen (Bảng 1), tuy nhiên, sự khác biệt đáng kể đã được quan sát thấy giữa các dòng. Cụ thể, dòng kháng bệnh 83A:476 (mang gen Lanr1) cho thấy sự lập trình lại hệ gen đáng kể ở thời điểm đầu tiên (6 giờ sau khi cấy) với sự gia tăng gấp 31-69 lần số lượng gen được phân lập tăng và giảm so với các thời điểm khác. Ngoài ra, đỉnh điểm này chỉ tồn tại trong thời gian ngắn, vì sự biểu hiện của chỉ một vài gen vẫn bị thay đổi đáng kể ở thời điểm thứ hai (12 giờ sau khi cấy). Điều thú vị là, Boregine, cũng cho thấy mức độ kháng bệnh cao trong thử nghiệm ghép, không trải qua quá trình lập trình lại phiên mã mạnh mẽ như vậy trong suốt thí nghiệm. Tuy nhiên, số lượng gen biểu hiện khác biệt (DEG) là như nhau đối với Boregine và 83A:476 ở 12 giờ sau khi cấy. Cả Mandelup và quần thể 22660 đều cho thấy đỉnh DEG ở thời điểm cuối cùng (48 l/s), cho thấy sự chậm trễ tương đối trong phản ứng phòng vệ.
Do dòng 83A:476 trải qua quá trình tái lập trình transcriptome mạnh mẽ để đáp ứng với C. lupini ở 6 giờ sau khi nhiễm bệnh so với tất cả các dòng khác, khoảng 91% các gen biểu hiện khác biệt (DEG) được quan sát tại thời điểm này là đặc trưng cho dòng (Hình 1). Tuy nhiên, có một số sự chồng chéo trong phản ứng ban đầu giữa các dòng nghiên cứu, vì 68,5%, 50,9% và 52,6% DEG ở Boregine, Mandelup và quần thể 22660, tương ứng, trùng lặp với những DEG được tìm thấy ở 83A:476 tại một số thời điểm nhất định. Tuy nhiên, những DEG này chỉ chiếm một phần nhỏ (0,97–1,70%) trong tổng số DEG hiện được phát hiện bằng cách sử dụng dòng 83A:476. Ngoài ra, 11 gen biểu hiện khác biệt (DEG) từ tất cả các dòng đều nhất quán tại thời điểm này (Bảng bổ sung S4-S6), bao gồm các thành phần chung của phản ứng phòng vệ thực vật: protein chuyển lipid (TanjilG_32225), enzyme endoglucan-1,3-β-glucoside (TanjilG_23384), hai protein cảm ứng stress như SAM22 (TanjilG_31528 và TanjilG_31531), protein mủ cơ bản (TanjilG_32352), và hai protein cấu trúc thành tế bào giàu glycine (TanjilG_19701 và TanjilG_19702). Cũng có sự trùng lặp tương đối cao trong phản ứng phiên mã giữa 83A:476 và Boregine ở 24 giờ sau khi nhiễm bệnh (tổng cộng 16-38% DEG) và giữa Mandelup và Quần thể 22660 ở 48 giờ sau khi nhiễm bệnh (tổng cộng 14-20% DEG).
Biểu đồ Venn thể hiện số lượng gen biểu hiện khác biệt (DEG) trong các dòng lupin lá hẹp (NLL) được cấy nhiễm Colletotrichum lupini (chủng Col-08 thu được từ các cánh đồng lupin ở Wierzhenice, Ba Lan, năm 1999). Các dòng NLL được phân tích là: 83A:476 (kháng, mang alen Lanr1), Boregine (kháng, nguồn gốc di truyền chưa rõ), Mandelup (kháng vừa phải, mang alen AnMan) và quần thể 22660 (rất mẫn cảm). Từ viết tắt hpi biểu thị số giờ sau khi tiêm chủng. Các giá trị bằng không đã được loại bỏ để đơn giản hóa biểu đồ.
Tập hợp các gen biểu hiện quá mức ở 6 giờ sau khi nhiễm bệnh đã được phân tích về sự hiện diện của các miền gen R chuẩn (Bảng bổ sung S7). Nghiên cứu này cho thấy sự cảm ứng phiên mã của các gen kháng bệnh kinh điển với các miền NBS-LRR chỉ tại vị trí 83A:476. Tập hợp này bao gồm một gen TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), năm gen CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 và tanjilg_16162), và bốn gen NBS-LR (tanjilg_16162), bốn gen NBS-LRRE (tanjilg_16162) cũng như bốn gen NBS-Lrr (tanjilg_16162) và bốn gen NBS-LRR (TANJILG_16162). Tất cả các gen này đều có các miền chuẩn được sắp xếp theo trình tự bảo tồn. Ngoài các gen miền NBS-LRR, một số kinase RLL đã được hoạt hóa ở 6 ​​giờ sau khi nhiễm bệnh, cụ thể là một trong Boregine (TanjilG_19877), hai trong Mandelup (TanjilG_07141 và TanjilG_19877) và trong quần thể 22660 (TanjilG_09014 và TanjilG_10361) và hai trong 83A 27:476.
Các gen có biểu hiện thay đổi đáng kể khi được cấy nhiễm C. lupini (chủng Col-08) đã được phân tích làm giàu Gene Ontology (GO) (Bảng bổ sung S8). Thuật ngữ quy trình sinh học được thể hiện quá mức thường xuyên nhất là “GO:0006952 phản ứng phòng vệ”, xuất hiện trong 6 trên 16 tổ hợp (thời gian × đường) với ý nghĩa thống kê cao (giá trị P < 0,001) (Hình 2). Thuật ngữ quy trình sinh học được thể hiện quá mức thường xuyên nhất là “GO:0006952 phản ứng phòng vệ”, xuất hiện trong 6 trên 16 tổ hợp (thời gian × đường) với ý nghĩa thống kê cao (giá trị P < 0,001) (Hình 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся vào ngày 6 tháng 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Thuật ngữ quy trình sinh học được thể hiện quá mức thường xuyên nhất là 'GO:0006952 phản ứng phòng vệ', xuất hiện trong 6 trên 16 tổ hợp (thời gian × dòng dõi) với ý nghĩa thống kê cao (giá trị P < 0,001) (Hình 2).4个中,具有高显着性(P 值< 0,001)（图2)。 Thuật ngữ quy trình sinh học tiêu biểu nhất là “GO:0006952 phản ứng phòng vệ”, xuất hiện trong 6 trong số 16 tổ hợp (thời gian × đường), với ý nghĩa thống kê cao (giá trị P < 0,001) (Hình 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Phản ứng Phòng thủ», который появлялся в 6 đến 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Thuật ngữ quy trình sinh học được thể hiện quá mức thường xuyên nhất là 'GO:0006952 Phản ứng phòng vệ', xuất hiện trong 6 trên 16 tổ hợp (thời gian × đường) với ý nghĩa thống kê cao (giá trị P < 0,001) (Hình 2).Thuật ngữ này được biểu hiện quá mức ở hai thời điểm trong 83A:476 và Boregine (6 và 24 giờ sau khi nhiễm) và ở một thời điểm trong Mandelup và Population 22660 (lần lượt là 12 và 6 giờ sau khi nhiễm). Đây là kết quả được dự đoán trước, làm nổi bật phản ứng kháng nấm của các dòng kháng bệnh. Ngoài ra, 83A:476 phản ứng với C. lupini bằng cách nhanh chóng cảm ứng các gen liên quan đến sự bùng phát oxy hóa được biểu thị bằng thuật ngữ “GO:0055114 redox process”, cho thấy một phản ứng phòng vệ đặc hiệu, trong khi Boregine cho thấy các phản ứng phòng vệ đặc hiệu, liên quan đến thuật ngữ 'GO'. :0006950 Phản ứng căng thẳng”. Quần thể 22660 kích hoạt phản ứng kháng ngang liên quan đến các chất chuyển hóa thứ cấp, làm nổi bật số lượng lớn các thuật ngữ “GO:0016104 Quá trình sinh tổng hợp triterpene” và “GO:0006722 Quá trình chuyển hóa triterpene” (cả hai thuật ngữ đều thuộc cùng một tập hợp gen), có tính đến kết quả phân tích làm giàu thuật ngữ GO, độ ổn định phản ứng Mandelup nằm giữa Boregine và Quần thể 22660. Ngoài ra, phản ứng sớm 83A:476 (6 giờ sau khi nhiễm) và phản ứng chậm Mandelup và Quần thể 22660 bao gồm thuật ngữ GO:0015979 'quang hợp' và các quá trình sinh học liên quan khác.
Các thuật ngữ phân loại gen sinh học được chọn trong chú thích các gen biểu hiện khác biệt trong quá trình phản ứng phiên mã của cây lupin lá hẹp (NLL) được cấy nhiễm bệnh than trên cây lupin (chủng Col-08 thu được từ các cánh đồng lupin ở Wierzhenice, Ba Lan, năm 1999) đã bị phóng đại quá mức. Các dòng NLL được phân tích là: 83A:476 (kháng bệnh, mang alen Lanr1 đồng hợp tử), Boregine (kháng bệnh, nguồn gốc di truyền chưa rõ), Mandelup (kháng bệnh vừa phải, mang alen AnMan đồng hợp tử) và quần thể 22660 (mẫn cảm).
Vì nghiên cứu này nhằm mục đích xác định các gen góp phần vào khả năng kháng bệnh thán thư, nên các gen được gán cho các thuật ngữ GO “GO: 0006952 Phản ứng phòng vệ” và “GO: 0055114 Quá trình oxy hóa khử” đã được phân tích với ngưỡng cắt kể từ giá trị trung bình cơ sở ≥ 30 với ít nhất một dòng × điểm thời gian kết hợp các giá trị log2 (thay đổi gấp) có ý nghĩa thống kê. Số lượng gen đáp ứng các tiêu chí này là 65 đối với GO:0006952 và 524 đối với GO:0055114.
83A:476 cho thấy hai đỉnh DEG được chú thích bằng thuật ngữ GO:0006952, đỉnh đầu tiên ở 6 gen trên mỗi inch (64 gen, điều hòa tăng và giảm) và đỉnh thứ hai ở 24 gen trên mỗi inch (15 gen, chỉ điều hòa tăng). Boregine cũng cho thấy GO:0006952 đạt đỉnh tại cùng một thời điểm, nhưng với ít DEG hơn (11 và 8) và kích hoạt ưu tiên. Mandeloop cho thấy hai đỉnh GO:0006952 ở 12 và 48 HPI, cả hai đều mang 12 gen (đỉnh đầu tiên với các gen kích hoạt, và đỉnh thứ hai chỉ với các gen ức chế), trong khi quần thể 22660 ở 6 HPI (13 gen) có sự chiếm ưu thế lớn hơn của đỉnh tăng. Cần lưu ý rằng 96,4% DEG GO:0006952 trong các đỉnh này có cùng loại phản ứng (tăng hoặc giảm), cho thấy sự chồng chéo đáng kể trong các phản ứng phòng vệ bất chấp sự khác biệt về số lượng gen liên quan. Nhóm trình tự lớn nhất liên quan đến thuật ngữ GO:0006952 mã hóa Protein Thông điệp Liên quan đến Căng thẳng do Thiếu dinh dưỡng 22 (SAM22-like), thuộc nhóm protein liên quan đến bệnh lý lớp 10 (PR-10) và protein lõi tương tự latex (MLP-like) (Hình 3). Hai nhóm này khác nhau về bản chất biểu hiện và hướng phản ứng. Các gen mã hóa protein SAM22-like cho thấy sự cảm ứng nhất quán và đáng kể ở các thời điểm sớm (6 hoặc 12 giờ sau khi nhiễm bệnh) và nhìn chung không phản ứng vào cuối thí nghiệm (48 giờ sau khi nhiễm bệnh), trong khi protein MLP-like cho thấy sự phối hợp ở 6 giờ sau khi nhiễm bệnh. 83A:476 và Mandelup ở 48 giờ sau khi nhiễm bệnh, hầu hết các điểm dữ liệu khác đều không phản ứng. Ngoài ra, sự khác biệt trong hồ sơ biểu hiện của các gen protein SAM22-like tuân theo sự biến đổi quan sát được trong khả năng kháng bệnh thán thư, vì các dòng kháng bệnh hơn có nhiều thời điểm cảm ứng đáng kể các gen này hơn so với các dòng mẫn cảm hơn. Một gen PR-10 giống LlR18A/B khác cho thấy mô hình biểu hiện rất tương tự với gen protein giống SAM22.
Các thành phần chính của thuật ngữ quá trình sinh học “GO:0006952 Phản ứng phòng vệ” và các mô hình biểu hiện của các gen ứng cử viên của alen Lanr1 và AnMan đã được xác định. Thang Log2 biểu thị giá trị log2 (thay đổi gấp) giữa cây được tiêm chủng (Colletotrichum lupini, chủng Col-08, thu được từ ruộng lupin, Wizhenica, Ba Lan, 1999) và cây đối chứng (tiêm chủng giả) tại cùng một thời điểm. Các dòng lupin lá hẹp sau đây đã được phân tích: 83A:476 (kháng bệnh, mang alen Lanr1 đồng hợp tử), Boregine (kháng bệnh, nguồn gốc di truyền chưa rõ), Mandelup (kháng bệnh vừa phải, mang alen AnMan đồng hợp tử) và Quần thể 22660 (mẫn cảm).
Ngoài ra, hồ sơ biểu hiện của các gen ứng cử viên RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) và AnMan (TanjilG_12861) đã được đánh giá (Hình 3). Gen TanjilG_05042 cho thấy phản ứng đáng kể (kích hoạt) tại 83A:476 chỉ ở thời điểm đầu tiên (6 giờ sau tiêm), trong khi TanjilG_12861 chỉ có ý nghĩa thống kê ở Mandeloop tại hai thời điểm: 6 giờ sau tiêm (điều hòa giảm) và 24 giờ sau tiêm (6 giờ sau tiêm). Với.). có thể điều chỉnh) ).
Các gen biểu hiện quá mức nhiều nhất trong thuật ngữ GO:0055114 “quá trình oxy hóa khử” là các gen mã hóa protein cytochrome P450 và peroxidase (Hình 4). Đối với các mẫu được phân lập từ 83A:476 ở 6 giờ sau khi tiêm chủng (HPI), giá trị log2 (thay đổi gấp) tối đa hoặc tối thiểu (đối với 86,6% gen) thường được quan sát thấy giữa cây được tiêm chủng và cây đối chứng, làm nổi bật phản ứng cao của kiểu gen này đối với việc tiêm chủng. 83A:476 cho thấy DEG GO:0055114 đáng kể nhất ở 6 giờ sau khi tiêm chủng (503 gen), trong khi các dòng còn lại ở 48 giờ sau khi tiêm chủng (Boregine, 31 gen; Mandelup, 85 gen; và Quần thể 22660, 78 gen)). Trong hầu hết các gen của họ GO:0055114, hai loại phản ứng với việc tiêm chủng (kích hoạt và ức chế) đã được quan sát thấy. Điều thú vị là, có tới 97,6% các gen biểu hiện khác biệt (DEG) được xác định cho thuật ngữ GO: 0055114 ở giống Mandelupe tại thời điểm 48 giờ sau khi nhiễm bệnh. Những quan sát này cho thấy rằng, mặc dù quy mô nhỏ hơn đáng kể (tức là số lượng gen oxy hóa khử bị đột biến, 85 so với 503), mô hình phản ứng phiên mã chậm trễ của giống Mandelupe đối với bệnh thán thư tương tự như phản ứng sớm của giống 83A:476. Ở giống Boregine và quần thể 22660, sự hội tụ này thấp hơn, lần lượt là 51,6% và 75,6%.
Các mô hình biểu hiện của các thành phần chính trong thuật ngữ của quá trình sinh học “GO:0055114 Quá trình oxy hóa khử” đã được làm rõ. Thang Log2 biểu thị giá trị log2 (thay đổi gấp nhiều lần) giữa cây được cấy (Colletotrichum lupini, chủng Col-08, thu được từ ruộng lupin, Wizhenica, Ba Lan, 1999) và cây đối chứng (cấy giả) tại cùng một thời điểm. Các dòng lupin lá hẹp sau đây đã được phân tích: 83A:476 (kháng bệnh, mang alen Lanr1 đồng hợp tử), Boregine (kháng bệnh, nguồn gốc di truyền chưa rõ), Mandelup (kháng bệnh vừa phải, mang alen AnMan đồng hợp tử) và Quần thể 22660 (mẫn cảm).
Phản ứng phiên mã của dòng 83A:476 đối với việc tiêm chủng C. lupini (chủng Col-08) cũng bao gồm sự ức chế phối hợp các gen được gán cho thuật ngữ GO:0015979 “quang hợp” và các quá trình sinh học liên quan khác (Hình 5). Tập hợp DEG GO:0015979 này chứa 105 gen bị ức chế đáng kể ở 6 giờ sau khi tiêm chủng (hpi) ở dòng 83A:476. Trong tập hợp con này, 37 gen cũng bị giảm biểu hiện ở dòng Mandelup ở 48 giờ sau khi tiêm chủng và 35 gen ở cùng thời điểm trong quần thể 22660, bao gồm 19 DEG chung cho cả hai kiểu gen. Không có DEG nào liên quan đến thuật ngữ GO:0015979 được kích hoạt đáng kể trong bất kỳ sự kết hợp nào (dòng x thời gian).
Các mô hình biểu hiện của các thành phần chính trong thuật ngữ của quá trình sinh học “GO:0015979 Quang hợp” đã được làm rõ. Thang Log2 biểu thị giá trị log2 (thay đổi gấp nhiều lần) giữa cây được cấy (Colletotrichum lupini, chủng Col-08, thu được từ ruộng lupin, Wizhenica, Ba Lan, 1999) và cây đối chứng (cấy giả) tại cùng một thời điểm. Các dòng lupin lá hẹp sau đây đã được phân tích: 83A:476 (kháng bệnh, mang alen Lanr1 đồng hợp tử), Boregine (kháng bệnh, nguồn gốc di truyền chưa rõ), Mandelup (kháng bệnh vừa phải, mang alen AnMan đồng hợp tử) và Quần thể 22660 (mẫn cảm).
Dựa trên kết quả phân tích biểu hiện khác biệt và được cho là có liên quan đến phản ứng phòng vệ chống lại nấm gây bệnh, tập hợp bảy gen này đã được chọn để định lượng hồ sơ biểu hiện bằng PCR thời gian thực (Bảng bổ sung S9).
Gen protein giả định TanjilG_10657 được cảm ứng đáng kể ở tất cả các dòng và thời điểm nghiên cứu so với cây đối chứng (mô phỏng) (Bảng bổ sung S10, S11). Ngoài ra, hồ sơ biểu hiện của TanjilG_10657 cho thấy xu hướng tăng dần trong suốt quá trình thí nghiệm đối với tất cả các dòng. Quần thể 22660 cho thấy độ nhạy cao nhất của TanjilG_10657 đối với việc cấy mầm bệnh với mức độ hoạt hóa gấp 114 lần và mức độ biểu hiện tương đối cao nhất (4,4 ± 0,4) ở 24 giờ sau khi cấy mầm bệnh (Hình 6a). Gen protein PR10 LlR18A TanjilG_27015 cũng cho thấy sự hoạt hóa trên tất cả các dòng và thời điểm, với ý nghĩa thống kê ở hầu hết các điểm dữ liệu (Hình 6b). Tương tự như TanjilG_10657, mức độ biểu hiện tương đối cao nhất của TanjilG_27015 được quan sát thấy ở quần thể được cấy 22660 sau 24 giờ (19,5 ± 2,4). Gen endochitinase axit TanjilG_04706 được điều chỉnh tăng đáng kể ở tất cả các dòng và ở tất cả các thời điểm ngoại trừ Boregine sau 6 giờ (Hình 6c). Nó được cảm ứng mạnh ở thời điểm đầu tiên (6 giờ) ở dòng 83A:476 (gấp 10,5 lần) và tăng vừa phải ở các dòng khác (gấp 6,6-7,5 lần). Trong suốt thí nghiệm, biểu hiện của TanjilG_04706 duy trì ở mức tương tự ở dòng 83A:476 và Boregine, trong khi ở Mandelup và quần thể 22660, nó tăng lên đáng kể, đạt giá trị tương đối cao (lần lượt là 5,9 ± 1,5 và 6,2 ± 1,5). Gen giống endoglucan-1,3-β-glucosidase TanjilG_23384 cho thấy sự hoạt hóa cao ở hai thời điểm đầu tiên (6 và 12 giờ sau khi nhiễm bệnh) ở tất cả các dòng ngoại trừ quần thể 22660 (Hình 6d). Mức độ biểu hiện tương đối cao nhất của TanjilG_23384 được quan sát thấy ở thời điểm thứ hai (12 giờ sau khi nhiễm bệnh) ở Mandelup (2,7 ± 0,3) và 83A:476 (1,5 ± 0,1). Ở 24 giờ sau khi nhiễm bệnh, biểu hiện của TanjilG_23384 tương đối thấp ở tất cả các dòng được nghiên cứu (từ 0,04 ± 0,009 đến 0,44 ± 0,12).
Biểu đồ biểu hiện của các gen được chọn (ag) được tiết lộ bằng PCR định lượng. Các số 6, 12 và 24 biểu thị số giờ sau khi tiêm chủng. Các gen LanDExH7 và LanTUB6 được sử dụng để chuẩn hóa và LanTUB6 được sử dụng để hiệu chuẩn giữa các loạt thí nghiệm. Vạch lỗi biểu thị độ lệch chuẩn dựa trên ba lần lặp lại sinh học, mỗi lần lặp lại là giá trị trung bình của ba lần lặp lại kỹ thuật. Ý nghĩa thống kê của sự khác biệt về mức độ biểu hiện giữa cây được cấy (Colletotrichum lupini, chủng Col-08, thu được năm 1999 từ cánh đồng lupin ở Wierzenica, Ba Lan) và cây đối chứng (cấy giả) được đánh dấu phía trên các điểm dữ liệu (*Giá trị P < 0,05, **Giá trị P ≤ 0,01, ***Giá trị P ≤ 0,001). Ý nghĩa thống kê của sự khác biệt về mức độ biểu hiện giữa cây được cấy (Colletotrichum lupini, chủng Col-08, thu được năm 1999 từ cánh đồng lupin ở Wierzenica, Ba Lan) và cây đối chứng (cấy giả) được đánh dấu phía trên các điểm dữ liệu (*Giá trị P < 0,05, **Giá trị P ≤ 0,01, ***Giá trị P ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, năm 1999 г. Верженице, Польша) và контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, *** значение P ≤ 0,001). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về mức độ biểu hiện giữa cây được cấy (Colletotrichum lupini, chủng Col-08, thu được năm 1999 từ một cánh đồng lupin ở Wierzhenice, Ba Lan) và cây đối chứng (cấy giả) được ghi chú phía trên các điểm dữ liệu (*Giá trị P < 0,05, **Giá trị P ≤ 0,01, ***Giá trị P ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini, Col-08株,1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得)和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值 0,01, ***P 值 0,001)。接种 （colletotrichum lupini , color-08 株 , 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得) 和 对照 （接种 植物 之间水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P 0,01, ***P 0,001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) và контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về mức độ biểu hiện giữa cây được cấy (Colletotrichum lupini, chủng Col-08, thu được từ các cánh đồng lupin ở Verzhenice, Ba Lan, năm 1999) và cây đối chứng (cấy giả) được ghi chú phía trên các điểm dữ liệu (*Giá trị P < 0,05, **Giá trị P ≤ 0,01, ***Giá trị P ≤ 0,001).Các dòng NLL được phân tích bao gồm: 83A:476 (kháng bệnh, mang alen Lanr1 đồng hợp tử), Mandelup (kháng bệnh vừa phải, mang alen AnMan đồng hợp tử), Boregine (kháng bệnh, nguồn gốc di truyền chưa rõ) và quần thể 22660 (mẫn cảm).
Gen ứng cử viên TanjilG_05042 tại vị trí Lanr1 cho thấy mô hình biểu hiện khác biệt rõ rệt so với các hồ sơ thu được từ nghiên cứu RNA-seq (Hình 6e). Sự hoạt hóa đáng kể của gen này được quan sát thấy ở quần thể Mandelup và 22660 (lần lượt lên đến 39,7 và 11,7 lần), dẫn đến mức độ biểu hiện tương đối cao (lần lượt lên đến 1,4 ± 0,14 và 7,2 ± 1,3). 83A:476 cũng cho thấy sự tăng biểu hiện của gen TanjilG_05042 (lên đến 3,8 lần), tuy nhiên, mức độ biểu hiện tương đối đạt được (0,044 ± 0,002) thấp hơn hơn 30 lần so với mức độ quan sát được ở quần thể Mandelup và 22660. Phân tích bằng qPCR cho thấy sự khác biệt đáng kể về mức độ biểu hiện giữa các kiểu gen ở các biến thể được tiêm giả dược (đối chứng), đạt mức chênh lệch gấp 58 lần giữa quần thể 22660 và 83A:476, cũng như giữa quần thể 22660 và 22660. Mức chênh lệch gấp đôi được ghi nhận giữa Boregine và Mandalup.
Gen ứng cử viên tại vị trí AnMan, TanjilG_12861, được kích hoạt để đáp ứng với việc tiêm chủng ở chủng 83A:476 và Mandelup, ở trạng thái trung tính trong quần thể 22660, và bị giảm biểu hiện ở Boregine (Hình 6f). Mức độ biểu hiện tương đối của gen TanjilG_12861 cao nhất ở chủng 83A:476 được tiêm chủng (0,14±0,01). Gen protein sốc nhiệt loại I 17,4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 cho thấy mức độ biểu hiện tương đối thấp hơn ở tất cả các chủng và thời điểm nghiên cứu (Hình 6g). Giá trị cao nhất được quan sát thấy ở 24 giờ sau tiêm chủng (HPI) trong quần thể 22660 (0,14 ± 0,02, tăng gấp tám lần để đáp ứng với việc tiêm chủng).
So sánh hồ sơ biểu hiện gen (Hình 7) cho thấy mối tương quan cao giữa TanjilG_10657 và bốn gen khác: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) và TanjilG_04706 (r = 0,79). Kết quả này có thể cho thấy sự điều hòa đồng thời của các gen này trong quá trình phản ứng phòng vệ. Các gen TanjilG_12861 và TanjilG_23384 cho thấy hồ sơ biểu hiện khác nhau với giá trị hệ số tương quan Pearson thấp hơn (lần lượt từ 0,08 đến 0,43 và -0,19 đến 0,28) so với các gen khác.
Mối tương quan giữa các hồ sơ biểu hiện gen được phát hiện bằng phương pháp PCR định lượng. Các dòng lupin lá hẹp sau đây đã được phân tích: 83A:476 (kháng bệnh, mang alen Lanr1 đồng hợp tử), Mandelup (kháng bệnh trung bình, mang alen AnMan đồng hợp tử), Boregine (kháng bệnh, nguồn gốc di truyền chưa rõ) và Quần thể 22660 (mẫn cảm). Ba thời điểm được tính toán (6, 12 và 24 giờ sau khi cấy mầm bệnh), bao gồm cây được cấy mầm bệnh (Colletotrichum lupini, chủng Col-08, thu được từ các cánh đồng lupin ở Wierzhenice, Ba Lan, năm 1999) và cây đối chứng (cấy giả). Thang đo thể hiện giá trị của hệ số tương quan Pearson.
Dựa trên dữ liệu thu được ở mức 6 mã lực/inch, WGCNA được thực hiện trên 9981 DEG được xác định bằng cách so sánh cây được tiêm chủng và cây đối chứng để tập trung vào các phản ứng phòng vệ sớm (Bảng bổ sung S12). Hai mươi hai mô-đun gen (cụm) được tìm thấy có hồ sơ biểu hiện tương quan (tích cực hoặc tiêu cực) giữa kiểu gen và các biến thể thực nghiệm. Trung bình, mức độ biểu hiện gen giảm dần theo thứ tự 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (tuy nhiên, ở cả hai biến thể, xu hướng này rõ rệt hơn ở cây đối chứng). Trung bình, mức độ biểu hiện gen giảm dần theo thứ tự 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (tuy nhiên, ở cả hai biến thể, xu hướng này rõ rệt hơn ở cây đối chứng). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Dân số 22660 (в обоих вариантах, однако, bạn có thể làm điều đó контрольных растений). Trung bình, mức độ biểu hiện gen giảm theo thứ tự 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (tuy nhiên, ở cả hai biến thể, xu hướng này mạnh hơn ở cây đối chứng).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Dân số 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> dân số 22660 的 顺序 下降 （, 在 种 中 , 这 种 在 在植物 中 更)。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Dân số 22660 (однако в обоих вариантах эта тенденция была сильнее у контрольных растений). Trung bình, mức độ biểu hiện gen giảm dần theo thứ tự 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (tuy nhiên, ở cả hai biến thể, xu hướng này rõ rệt hơn ở cây đối chứng).Việc tiêm chủng dẫn đến sự tăng cường biểu hiện gen, đặc biệt là ở các mô-đun 18, 19, 14, 6 và 1 (theo thứ tự hiệu quả giảm dần), điều hòa âm tính (ví dụ: mô-đun 9 và 20) hoặc có tác dụng trung tính (ví dụ: mô-đun 11, 22, 8 và 13). Phân tích làm giàu thuật ngữ GO (Bảng bổ sung S13) cho thấy “GO: 0006952 Phản ứng bảo vệ” đối với mô-đun được tiêm chủng (18) với sự kích hoạt tối đa, bao gồm các gen được phân tích bằng qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 và TanjilG_27015), cũng như nhiều mô-đun quang hợp bị ức chế nhiều nhất khi tiêm chủng (9). Bộ tập trung mô-đun 18 (Hình 8) được xác định là gen TanjilG_26536 mã hóa protein LlR18B giống PR-10, và bộ tập trung mô-đun 9 được xác định là gen TanjilG_28955 mã hóa protein PsbQ của hệ thống quang hợp II. Một gen kháng bệnh thán thư tiềm năng Lanr1, TanjilG_05042, được tìm thấy trong mô-đun 22 (Hình 9) và được liên kết với các thuật ngữ “GO:0044260 Quá trình trao đổi chất đại phân tử tế bào” và “GO:0006355 Điều hòa phiên mã, tạo khuôn DNA” mang trung tâm TanjilG_01212. Gen này mã hóa yếu tố phiên mã ứng suất nhiệt A-4a (HSFA4a).
Phân tích mạng có trọng số về sự biểu hiện đồng thời của gen trong các mô-đun với các thuật ngữ quy trình sinh học được biểu hiện quá mức “GO: 0006952 Phản ứng phòng vệ”. Quá trình nối gen được đơn giản hóa để làm nổi bật bốn gen được phân tích bằng qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 và TanjilG_27015).
Phân tích mạng có trọng số về sự biểu hiện đồng thời của gen trong một mô-đun với thuật ngữ quy trình sinh học được biểu hiện quá mức “GO: 0006355: Điều hòa phiên mã, tạo khuôn mẫu DNA” và mang gen kháng bệnh thán thư ứng cử viên Lanr1 TanjilG_05042. Quá trình nối gen được đơn giản hóa để phân lập gen TanjilG_05042 và gen trung tâm TanjilG_01212.
Việc sàng lọc khả năng kháng bệnh thán thư được thu thập ở Úc cho thấy hầu hết các giống được phát hành sớm đều dễ bị nhiễm bệnh; Kalya, Coromup và Mandelup được mô tả là có khả năng kháng bệnh ở mức độ trung bình, trong khi Wonga, Tanjil và 83A:476 được mô tả là có khả năng kháng bệnh cao26,27,31. có cùng một alen kháng bệnh, được ký hiệu là Lanr1, và Coromup và Mandelup có một alen khác, được ký hiệu là AnMan10, 26, 39, trong khi Kalya truyền lại một alen khác, Lanr2. Việc sàng lọc khả năng kháng bệnh thán thư ở Đức đã dẫn đến việc xác định một dòng kháng bệnh Bo7212 với một alen ứng cử viên khác với Lanr1, được ký hiệu là LanrBo36.
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tần suất xuất hiện của alen Lanr1 rất thấp (khoảng 6%) trong nguồn gen được thử nghiệm. Quan sát này phù hợp với kết quả sàng lọc nguồn gen Đông Âu bằng cách sử dụng các dấu hiệu Anseq3 và Anseq4, cho thấy alen Lanr1 chỉ có mặt trong hai dòng Belarus. Điều này cho thấy alen Lanr1 chưa được sử dụng rộng rãi trong các chương trình lai tạo giống địa phương, không giống như ở Úc, nơi nó là một trong những alen quan trọng cho lai tạo giống có hỗ trợ dấu hiệu phân tử. Điều này có thể là do mức độ kháng bệnh do alen Lanr1 mang lại trong điều kiện đồng ruộng ở châu Âu thấp hơn so với báo cáo của Úc. Ngoài ra, các nghiên cứu về bệnh thán thư ở các khu vực có lượng mưa cao ở Úc đã chỉ ra rằng phản ứng kháng bệnh do alen Lanr1 điều hòa có thể không hiệu quả trong điều kiện thời tiết thuận lợi cho sự phát triển nhanh chóng của mầm bệnh19,42. Trên thực tế, trong nghiên cứu hiện tại, một số triệu chứng của bệnh thán thư cũng được quan sát thấy ở các kiểu gen mang alen Lanr1, cho thấy khả năng kháng bệnh có thể biến mất trong điều kiện tối ưu cho sự phát triển của C. lupini. Ngoài ra, có thể xảy ra trường hợp diễn giải dương tính giả về sự hiện diện của các dấu hiệu Anseq3 và Anseq4, nằm cách vị trí Lanr1 khoảng 1 cM 28,30,43 .
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rằng dòng 83A:476, mang alen Lanr1, đã phản ứng với sự lây nhiễm C. lupini bằng cách lập trình lại hệ gen quy mô lớn ở thời điểm phân tích đầu tiên (6 giờ sau khi lây nhiễm), trong khi ở dòng Mandelup, mang alen AnMan, các phản ứng phiên mã được quan sát thấy muộn hơn nhiều (từ 24 đến 48 giờ sau khi lây nhiễm). Những biến đổi về thời gian trong phản ứng phòng vệ này có liên quan đến sự khác biệt về triệu chứng bệnh, làm nổi bật tầm quan trọng của việc nhận diện mầm bệnh sớm để có phản ứng kháng bệnh thành công. Để lây nhiễm mô thực vật, bào tử bệnh than phải trải qua một số giai đoạn phát triển trên bề mặt vật chủ, bao gồm nảy mầm, phân chia tế bào và hình thành cấu trúc bám dính. Cấu trúc bám dính là một cấu trúc lây nhiễm gắn vào bề mặt vật chủ và tạo điều kiện thuận lợi cho sự xâm nhập vào mô vật chủ. Do đó, bào tử C. gloeosporioides trong dịch chiết đậu Hà Lan cho thấy sự phân chia nhân đầu tiên sau 75-90 phút ủ, sự hình thành ống mầm sau 90-120 phút và sự ức chế sau 4 giờ 45. Nấm C. gloeosporioides trên xoài cho thấy hơn 40% bào tử nảy mầm sau 3 giờ ủ và khoảng 20% ​​hình thành bào tử bám sau 4 giờ. Gen CAP20 liên quan đến độc lực của C. gloeosporioides cho thấy hoạt động phiên mã trong bào tử hình thành trên bề mặt sau 3,5 giờ ủ trong sáp bề mặt quả bơ với nồng độ protein CAP20 cao sau 4 giờ 46 phút. Tương tự, hoạt động của các gen tổng hợp melanin trong C. trifolii được kích hoạt trong quá trình ủ 2 giờ, tiếp theo là sự hình thành bào tử bám sau 1 giờ. Các nghiên cứu về mô lá cho thấy dâu tây được cấy nhiễm C. acutatum có sự ức chế đầu tiên ở 8 giờ sau khi cấy nhiễm, trong khi cà chua được cấy nhiễm C. coccodes có sự ức chế đầu tiên ở 4 giờ sau khi cấy nhiễm48,49, phần lớn phù hợp với thang thời gian của quá trình lây nhiễm của Colletotrichum spp. Các phản ứng phòng vệ nhanh chóng đối với 83A:476 cho thấy sự tham gia của các gen kháng bệnh thực vật và miễn dịch kích hoạt bởi tác nhân gây bệnh (ETI) trong dòng này, trong khi các phản ứng chậm trễ của Mandelup hỗ trợ giả thuyết miễn dịch kích hoạt bởi các mẫu phân tử liên kết vi mô (MTI) 50. Các phản ứng sớm đối với 83A:476 và Mandelup. Sự chồng chéo một phần giữa các gen được điều chỉnh tăng hoặc giảm trong phản ứng chậm trễ cũng hỗ trợ khái niệm này, vì ETI thường được coi là phản ứng MTI được tăng tốc và tăng cường, dẫn đến chết tế bào theo chương trình tại vị trí nhiễm trùng, được gọi là sốc phản vệ 51,52.
Hầu hết các gen được gán cho thuật ngữ Gene Ontology GO:0006952 “Phản ứng phòng vệ” được biểu hiện quá mức là 11 gen tương đồng với protein thông điệp nhịn ăn do stress 22 (tương tự SAM22) và bảy protein giống protein latex chính (MLP) 31, 34, 43 và 423 cho thấy sự tương đồng về trình tự. Các gen giống SAM22 cho thấy sự hoạt hóa đáng kể kéo dài hơn, thể hiện mức độ kháng bệnh thán thư tăng lên (83A:476 và Boregine). Tuy nhiên, các gen giống MLP chỉ bị giảm biểu hiện ở các dòng mang alen kháng bệnh tiềm năng (83A:476/Lanr1 ở 6 giờ sau khi nhiễm bệnh và Mandelup/AnMan ở 24 giờ sau khi nhiễm bệnh). Cần lưu ý rằng tất cả các gen tương đồng giống SAM22 được xác định đều bắt nguồn từ một cụm gen trải dài khoảng 105 kb, trong khi các gen giống MLP bắt nguồn từ các vùng riêng biệt của bộ gen. Sự kích hoạt phối hợp của các gen giống SAM22 như vậy cũng được tìm thấy trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi về khả năng kháng bệnh NLL đối với sự lây nhiễm Diaporthetoxica, cho thấy chúng có liên quan đến các thành phần ngang của phản ứng phòng vệ. Kết luận này cũng được hỗ trợ bởi các báo cáo về phản ứng tích cực của các gen giống SAM22 đối với tổn thương hoặc điều trị bằng axit salicylic, chất gây cảm ứng nấm hoặc hydrogen peroxide.
Các gen giống MLP đã được chứng minh là phản ứng với nhiều loại stress phi sinh học và sinh học khác nhau, bao gồm nhiễm trùng do vi khuẩn, virus và nấm gây bệnh ở nhiều loài thực vật55. Hướng phản ứng với một số tương tác giữa thực vật và mầm bệnh dao động từ tăng mạnh (ví dụ: trong quá trình nhiễm Verticillium dahliae ở cây bông) đến giảm đáng kể (ví dụ: sau khi nhiễm Alternaria spp. ở cây táo)56,57. Sự điều hòa giảm đáng kể của gen giống MLP 423 đã được quan sát thấy trong quá trình phòng vệ của cây bơ chống lại nhiễm trùng F. niger và trong quá trình nhiễm trùng cây táo Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola và Alternaria alternata là các kiểu gây bệnh cho táo58,59. Ngoài ra, mô sẹo táo biểu hiện quá mức gen giống MLP 423 có biểu hiện thấp hơn của các gen liên quan đến khả năng kháng bệnh và dễ bị nhiễm nấm hơn59. Sau khi nhiễm Fusarium oxysporum f, gen giống MLP 423 cũng bị ức chế trong nguồn gen đậu tương kháng bệnh. cn. Nhiễm trùng đậu 60.
Các thành viên khác của họ PR-10 được xác định trong nghiên cứu RNA-seq của chúng tôi là các gen LlR18A và LlR18B đáp ứng với sự điều hòa tăng, cũng như gen điều hòa tăng (1 gen) hoặc điều hòa giảm (3 gen) cho protein vận chuyển lipid DIR1. Ngoài ra, WGCNA làm nổi bật gen LlR18B như một trung tâm trong mô-đun này, rất nhạy cảm với vắc-xin và mang một số gen phản ứng bảo vệ. Các gen LlR18A và LlR18B được cảm ứng trong lá lupin vàng để đáp ứng với vi khuẩn gây bệnh, cũng như trong thân cây NLL sau khi nhiễm D. toxica, trong khi gen tương đồng của các gen này ở lúa, RSOsPR10, được cảm ứng nhanh chóng bởi một bệnh nhiễm nấm được cho là có liên quan đến con đường truyền tín hiệu axit jasmonic53,61, 62. Gen DIR1 mã hóa các protein vận chuyển lipid không đặc hiệu cần thiết cho sự khởi phát của khả năng kháng bệnh toàn thân (SAR). Với sự phát triển của các phản ứng bảo vệ, protein DIR1 được vận chuyển từ ổ nhiễm trùng qua mạch rây để gây ra phản ứng kháng bệnh toàn thân (SAR) ở các cơ quan xa. Điều thú vị là, gen DIR1 của TanjilG_02313 được cảm ứng đáng kể ở thời điểm đầu tiên trong các dòng 84A:476 và quần thể 22660, nhưng khả năng kháng bệnh thán thư chỉ phát triển thành công ở dòng 84A:476. Điều này có thể cho thấy một số chức năng phụ của gen DIR1 trong NLL, vì ba gen tương đồng còn lại chỉ phản ứng với sự lây nhiễm ở dòng 83A:476 sau 6 giờ, và phản ứng này hướng xuống dưới.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, các thành phần phổ biến nhất tương ứng với quá trình sinh học được gọi là “GO:0055114 Quá trình oxy hóa khử” là protein cytochrome P450, peroxidase, linoleic acid 9S-/13S-lipoxygenase và 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase. Ngoài ra, WGCNA của chúng tôi xác định đồng đẳng HSFA4a là một trung tâm mang các mô-đun như gen kháng Lanr1 TanjilG_05042. HSFA4a là một thành phần của quá trình điều hòa phiên mã hạt nhân phụ thuộc vào oxy hóa khử ở thực vật.
Các protein cytochrome P450 là các oxidoreductase xúc tác các phản ứng hydroxyl hóa phụ thuộc NADPH và/hoặc O2 trong quá trình trao đổi chất sơ cấp và thứ cấp, bao gồm quá trình trao đổi chất của các chất ngoại lai, cũng như hormone, axit béo, sterol, các thành phần vách tế bào, polyme sinh học và quá trình sinh tổng hợp các hợp chất bảo vệ 69. Trong một nghiên cứu của chúng tôi, sự biến đổi trong chức năng cytochrome P450 thực vật đã giảm từ -10,6 log2 (thay đổi gấp) xuống 5,7 do số lượng lớn các đồng đẳng bị thay đổi (37) và sự khác biệt trong mô hình phản ứng giữa các gen cụ thể, phản ánh sự điều chỉnh tăng lên. Việc chỉ sử dụng dữ liệu RNA-seq để làm sáng tỏ chức năng sinh học giả định của các gen NLL trong siêu họ protein lớn như vậy sẽ mang tính suy đoán cao. Tuy nhiên, điều đáng chú ý là một số gen cytochrome P450 có liên quan đến khả năng kháng nấm hoặc vi khuẩn gây bệnh cao hơn, bao gồm cả sự đóng góp vào các phản ứng dị ứng69,70,71.
Peroxidase loại III là các enzyme thực vật đa chức năng tham gia vào nhiều quá trình trao đổi chất trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, cũng như phản ứng với các tác động từ môi trường như độ mặn, hạn hán, cường độ ánh sáng cao và sự tấn công của mầm bệnh72. Peroxidase tham gia vào tương tác của một số loài thực vật với Anthracis, bao gồm Stylosanthes humilis và C. gloeosporioides, Lens culinaris và C. truncatum, Phaseolus vulgaris và C. lindemuthianum, Cucumis sativus và C. lagenarium73,74,75,76. Phản ứng diễn ra rất nhanh, đôi khi chỉ sau 4 giờ nhiễm bệnh (HPI), trước khi nấm xâm nhập vào mô thực vật73. Gen peroxidase cũng phản ứng với sự lây nhiễm D. toxica NLL. Ngoài các chức năng điển hình là điều hòa sự bùng phát oxy hóa hoặc loại bỏ stress oxy hóa, peroxidase có thể can thiệp vào sự phát triển của mầm bệnh bằng cách tạo ra các rào cản vật lý dựa trên sự gia cố thành tế bào trong quá trình hóa gỗ, liên kết tiểu đơn vị hoặc liên kết chéo của các hợp chất cụ thể. Chức năng này có thể được giải thích bằng phương pháp tin sinh học là do gen TanjilG_03329 mã hóa một loại peroxidase anion tạo lignin giả định, được biểu hiện tăng đáng kể trong nghiên cứu của chúng tôi ở dòng kháng 83A:476 sau 6 giờ nhiễm bệnh, nhưng không thấy ở các chủng và thời điểm khác không phản ứng.
9S-/13S-lipoxygenase của axit linoleic là bước đầu tiên trong con đường oxy hóa của quá trình sinh tổng hợp lipid78. Các sản phẩm của con đường này có nhiều chức năng trong phòng vệ thực vật, bao gồm tăng cường thành tế bào thông qua sự hình thành các lắng đọng callose và pectin, và điều hòa stress oxy hóa thông qua việc sản xuất các loài oxy phản ứng79,80,81,82,83. Trong nghiên cứu này, sự biểu hiện của 9S-/13S-lipoxygenase axit linoleic đã bị thay đổi ở tất cả các chủng, nhưng ở quần thể mẫn cảm 22660, sự tăng biểu hiện chiếm ưu thế ở các thời điểm khác nhau, trong khi ở các chủng mang alen kháng Lanr1 và AnMan, nó nhấn mạnh sự đa dạng hóa của lớp oxylipin trong các phản ứng bệnh than bảo vệ giữa các kiểu gen này.
Đồng phân của 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase (ACO) được điều hòa tăng đáng kể (9 gen) hoặc điều hòa giảm (2 gen) khi được cấy với cây lupin. Ngoại trừ hai trường hợp, tất cả các phản ứng này đều xảy ra ở 6 ​​hp. tại 83A:476. Phản ứng enzym do protein ACO điều hòa là bước giới hạn tốc độ trong sản xuất ethylene và do đó được điều hòa rất chặt chẽ84. Ethylene là một hormone thực vật đóng nhiều vai trò trong việc điều hòa sự phát triển của cây và phản ứng với các điều kiện căng thẳng sinh học và phi sinh học. Sự cảm ứng phiên mã ACO và kích hoạt con đường tín hiệu ethylene có liên quan đến việc tăng khả năng kháng bệnh của lúa đối với nấm bán ký sinh Oryzae oryzae bằng cách điều hòa sản xuất các loài oxy phản ứng và phytoalexin. Một quá trình nhiễm bệnh lá rất tương tự được tìm thấy giữa M. oryzae và C. lupini88,89, trên nền tảng sự điều hòa tăng đáng kể của các đồng đẳng ACO trong dòng 83A:476 được báo cáo trong nghiên cứu này, làm thay đổi khả năng tạo ra khả năng kháng bệnh thán thư NLL. Ethylene là một bước trung tâm trong các con đường phân tử.
Trong nghiên cứu hiện tại, sự ức chế quy mô lớn của nhiều gen liên quan đến quang hợp đã được quan sát thấy ở 6 giờ sau khi nhiễm bệnh (hpi) ở giống 83A:476 và ở 48 hpi ở giống Mandeloop và quần thể 22660. Mức độ và sự tiến triển của những thay đổi này tỷ lệ thuận với mức độ nhiễm bệnh. Khả năng kháng bệnh thán thư đã được quan sát thấy trong thí nghiệm này. Gần đây, sự ức chế mạnh mẽ và sớm các bản sao liên quan đến quang hợp đã được báo cáo trong một số mô hình tương tác giữa thực vật và mầm bệnh, bao gồm cả vi khuẩn và nấm gây bệnh. Sự ức chế nhanh chóng (từ 2 HPI trong một số tương tác) và ức chế toàn cầu các gen liên quan đến quang hợp để đáp ứng với nhiễm trùng có thể kích hoạt khả năng miễn dịch của thực vật dựa trên việc sử dụng các loài oxy phản ứng và sự tương tác của chúng với con đường axit salicylic để điều hòa các phản ứng dị ứng 90,94.
Tóm lại, các cơ chế phản ứng phòng vệ được đề xuất cho dòng kháng bệnh nhất (83A:476) bao gồm nhận diện mầm bệnh nhanh chóng bởi gen R (có lẽ là TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) và tín hiệu axit salicylic và ethylene do phản ứng dị ứng điều hòa, tiếp theo là thiết lập SAR tầm xa. Hoạt động này được hỗ trợ bởi protein DIR-1. Cần lưu ý rằng giai đoạn sinh dưỡng của nhiễm trùng C. lupini rất ngắn (khoảng 2 ngày), sau đó là giai đoạn hoại tử95. Sự chuyển đổi giữa các giai đoạn này có thể liên quan đến hoại tử và biểu hiện của các protein cảm ứng ethylene hoạt động như tác nhân kích hoạt các phản ứng quá mẫn ở cây chủ. Do đó, cửa sổ thời gian để bắt giữ thành công C. lupini ở giai đoạn sinh dưỡng rất hẹp. Việc lập trình lại các gen liên quan đến quá trình oxy hóa khử và quang hợp được quan sát thấy ở 83A:476 sau 6 giờ nhiễm bệnh phù hợp với sự phát triển của sợi nấm và báo hiệu sự phát triển của phản ứng bảo vệ thành công ở giai đoạn sinh dưỡng. Phản ứng phiên mã của quần thể Mandelup và 22660 có thể bị chậm trễ quá mức để bắt giữ nấm trước khi chuyển sang giai đoạn hoại tử; tuy nhiên, Mandelup có thể hiệu quả hơn quần thể 22660 vì sự điều hòa tương đối nhanh của protein PR-10 thúc đẩy khả năng kháng bệnh theo chiều ngang.
ETI, được điều khiển bởi gen R chuẩn, dường như là một cơ chế phổ biến cho khả năng kháng bệnh thán thư ở đậu. Do đó, ở cây họ đậu mẫu Medicago truncatula, khả năng kháng bệnh thán thư được quy định bởi gen RCT1, một thành viên của lớp gen R thực vật TIR-NBS-LRR97. Gen này cũng quy định khả năng kháng bệnh thán thư phổ rộng ở cỏ linh lăng khi được chuyển sang cây mẫn cảm. Ở đậu thận (P. vulgaris), đến nay đã xác định được hơn hai chục gen kháng bệnh thán thư. Một số gen này được tìm thấy ở các vùng không có bất kỳ gen R chuẩn nào, tuy nhiên nhiều gen khác nằm ở rìa các nhiễm sắc thể mang cụm gen NBS-LRR, bao gồm cả TIR-NBS-LRRs99. Nghiên cứu SSR trên toàn bộ hệ gen cũng đã xác nhận mối liên hệ của gen NBS-LRR với khả năng kháng bệnh thán thư ở đậu thận. Gen R chuẩn cũng được tìm thấy trong vùng gen mang locus kháng bệnh thán thư chính ở lupin trắng 101.
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rằng phản ứng kháng bệnh tức thì, được kích hoạt ở giai đoạn đầu nhiễm bệnh (tốt nhất là không muộn hơn 12 giờ sau khi nhiễm), bảo vệ hiệu quả cây lupin lá hẹp khỏi bệnh thán thư do nấm gây bệnh Collelotrichum lupini gây ra. Sử dụng phương pháp giải trình tự tốc độ cao, chúng tôi đã chứng minh được các hồ sơ biểu hiện khác biệt của các gen kháng bệnh thán thư ở cây lupin lá hẹp được điều hòa bởi các gen kháng bệnh Lanr1 và AnMan. Khả năng phòng vệ thành công đòi hỏi phải thiết kế cẩn thận các gen mã hóa protein tham gia vào quá trình oxy hóa khử, quang hợp và gây bệnh trong vòng vài giờ sau khi cây tiếp xúc lần đầu với mầm bệnh. Các phản ứng bảo vệ tương tự, nhưng bị trì hoãn về thời gian, kém hiệu quả hơn nhiều trong việc bảo vệ cây khỏi bệnh tật. Khả năng kháng bệnh thán thư được điều hòa bởi gen Lanr1 giống với phản ứng nhanh điển hình của gen R (miễn dịch được kích hoạt bởi tác nhân gây bệnh), trong khi gen AnMan rất có thể cung cấp phản ứng ngang (miễn dịch được kích hoạt bởi một mô hình phân tử liên quan đến vi sinh vật), mang lại mức độ bền vững vừa phải.
215 dòng NLL được sử dụng để sàng lọc các dấu hiệu bệnh thán thư bao gồm 74 giống cây trồng, 60 dòng thu được bằng cách lai tạo, 5 dòng đột biến và 76 nguồn gen hoang dã hoặc nguyên bản. Các dòng này đến từ 17 quốc gia, chủ yếu từ Ba Lan (58), Tây Ban Nha (47), Đức (27), Úc (26), Nga (19), Belarus (7), Ý (5) và các dòng khác từ 10 quốc gia. Bộ dữ liệu cũng bao gồm các dòng kháng bệnh tham chiếu: 83A:476, Tanjil, Wonga mang alen Lanr1 và Mandelup mang alen AnMan. Các dòng này được lấy từ Cơ sở dữ liệu nguồn gen Lupine châu Âu do Công ty TNHH Giống cây trồng Poznań, Wiatrowo, Ba Lan duy trì (Bảng bổ sung S1).
Cây được trồng trong điều kiện kiểm soát (chu kỳ chiếu sáng 16 giờ, nhiệt độ 25°C ban ngày và 18°C ​​ban đêm). Hai mẫu sinh học được phân tích. DNA được phân lập từ lá ba tuần tuổi bằng bộ kit DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Đức) theo quy trình. Chất lượng và nồng độ DNA được phân lập được đánh giá bằng phương pháp quang phổ (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Hoa Kỳ). Chỉ thị AnManM1 đánh dấu gen kháng bệnh thán thư AnMan (có nguồn gốc từ giống Mandelup) và các chỉ thị Anseq3 và Anseq4 bao quanh gen Lanr1 (có nguồn gốc từ giống Tanjil) đã được phân tích 11,26,28. Thể đồng hợp tử cho alen kháng được chấm điểm là “1”, thể mẫn cảm – là “0”, và thể dị hợp tử – là 0,5.
Dựa trên kết quả sàng lọc các chỉ thị AnManM1, AnSeq3 và AnSeq4 và số lượng hạt giống có sẵn cho các thí nghiệm tiếp theo, 50 dòng NLL đã được chọn để phân tích kiểu hình kháng bệnh thán thư. Phân tích được thực hiện lặp lại hai lần trong nhà kính điều khiển bằng máy tính với chu kỳ chiếu sáng 14 giờ và nhiệt độ dao động từ 22°C ban ngày đến 19°C ban đêm. Hạt giống được cạo vỏ (cắt bỏ lớp vỏ hạt ở phía đối diện với phôi bằng lưỡi dao sắc) trước khi gieo để ngăn ngừa hiện tượng ngủ nghỉ của hạt do vỏ hạt quá cứng và đảm bảo sự nảy mầm đồng đều. Cây được trồng trong chậu (11 × 11 × 21 cm) với đất vô trùng (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warsaw, Ba Lan). Việc gây nhiễm được thực hiện bằng chủng Colletotrichum lupini Col-08, được nuôi cấy vào năm 1999 từ thân cây lupin lá hẹp trồng trên cánh đồng ở Verzhenitsa, vùng Đại Ba Lan (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Các chủng phân lập được nuôi cấy trong môi trường SNA ở 20°C dưới ánh sáng đen trong 21 ngày để kích thích sự hình thành bào tử. Bốn tuần sau khi gieo trồng, khi cây đạt giai đoạn 4-6 lá, việc gây nhiễm được thực hiện bằng cách phun dung dịch bào tử với nồng độ 0,5 x 10⁶ bào tử/ml. Sau khi gây nhiễm, cây được giữ trong bóng tối 24 giờ ở độ ẩm khoảng 98% và nhiệt độ 25°C để tạo điều kiện thuận lợi cho sự nảy mầm của bào tử và quá trình lây nhiễm. Các cây sau đó được trồng dưới chu kỳ chiếu sáng 14 giờ, nhiệt độ 22°C ban ngày/19°C ban đêm và độ ẩm 70%. Điểm bệnh được đánh giá 22 ngày sau khi gây nhiễm và dao động từ 0 (miễn dịch) đến 9 (rất mẫn cảm) tùy thuộc vào sự có hoặc không có các vết hoại tử trên thân và lá. Ngoài ra, sau khi đánh giá, trọng lượng của cây cũng được đo. Mối quan hệ giữa kiểu gen chỉ thị và kiểu hình bệnh được tính toán bằng hệ số tương quan hai chuỗi điểm (không có chỉ thị dị hợp tử trong tập hợp các dòng để phân tích kiểu hình kháng bệnh thán thư).