Спасибо за посещение Nature.com. Версия браузера, которую вы используете, имеет ограниченную поддержку CSS. Для наилучшего опыта мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В то же время, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Люпин узколистный (NLL, Lupinus angustifolius L.) — бобовое растение, используемое для производства продуктов питания и улучшения почвы. Глобальное распространение NLL как культуры привлекло множество патогенных грибов, включая люпиновый антракноз, который вызывает разрушительное заболевание антракноз. Два аллеля, Lanr1 и AnMan, которые обеспечивают повышенную устойчивость, использовались в селекции NLL, но основные молекулярные механизмы остаются неизвестными. В этом исследовании маркеры Lanr1 и AnMan использовались для скрининга европейских образцов NLL. Тестирование вакцины в контролируемой среде подтвердило эффективность обоих устойчивых доноров. Дифференциальное профилирование экспрессии генов было проведено на репрезентативных устойчивых и восприимчивых линиях. Устойчивость к антракнозу была связана с повышенной экспрессией терминов онтологии генов «GO:0006952 Defense Response», «GO:0055114 Redox Process» и «GO:0015979 Photosynthesis». Кроме того, линия Lanr1(83A:476) показала значительное перепрограммирование транскриптома быстро после инокуляции, в то время как другие линии показали задержку в этом ответе примерно на 42 часа. Защитные реакции связаны с генами TIR-NBS, CC-NBS-LRR и NBS-LRR, 10 белками, участвующими в патогенезе, белками переноса липидов, эндоглюкан-1,3-β-глюкозидазой, богатыми глицином белками клеточной стенки и генами из реактивного пути кислорода. Ранние реакции на 83A:476, включая осторожное подавление генов, связанных с фотосинтезом, совпали с успешной защитой во время вегетативной фазы роста биологии грибов, что предполагает, что эффектор запускает иммунитет. Реакция Манделупа замедляется, как и общее горизонтальное сопротивление.
Люпин узколистный (ЛУЛ, Lupinus angustifolius L.) — это злак с высоким содержанием белка, происходящий из западного Средиземноморья1,2. В настоящее время его выращивают как продовольственную культуру для животных и людей. Он также считается зеленым удобрением в системах севооборота из-за фиксации азота симбиотическими азотфиксирующими бактериями и общего улучшения структуры почвы. ЛУЛ претерпел быстрый процесс одомашнивания в прошлом веке и до сих пор находится под высоким селекционным давлением3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. С широким распространением ЛУЛ сукцессия патогенных грибов создала новые сельскохозяйственные ниши и вызвала новые болезни, уничтожающие урожай. Самым примечательным для фермеров и селекционеров люпина стало появление антракноза, вызываемого патогенным грибом Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Самым примечательным для фермеров и селекционеров люпина стало появление антракноза, вызываемого патогенным грибом Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина стало появление антракноза, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее заметным событием для фермеров и селекционеров, выращивающих люпин, стало появление антракноза, вызываемого патогенным грибом Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Бондар) Ниренберг, Фейлер и Хагедорн13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Бондар)嵵Волосатый。1 Наиболее заметным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным грибом Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Самые ранние сообщения о заболевании поступили из Бразилии и США, типичные симптомы появились в 1912 и 1929 годах соответственно. Однако примерно через 30 лет патоген был обозначен как Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целевой морфологии. и Х. Шренк,. и Х. Шренк, .и Х. Шренк. И Х.施伦克，。 И Х.施伦克，。и Х. Шленк, .Предварительное фенотипирование болезни, проведенное в середине 20-го века, показало некоторую устойчивость в образцах NLL и желтого люпина (L. luteus L.), но все протестированные образцы белого люпина (L. albus L.) были высоко восприимчивы15,16. Исследования показали, что развитие антракноза связано с повышенными осадками (влажностью воздуха) и температурой (в диапазоне 12-28 °C), что приводит к нарушению устойчивости при более высоких температурах17, 18. Фактически, время, необходимое для прорастания конидий и начала болезни, было в четыре раза короче при 24 °C (4 часа), чем при 12 °C (16 часов) в условиях высокой влажности19. Таким образом, продолжающееся глобальное потепление привело к распространению антракноза. Однако болезнь была отмечена во Франции (1982) и на Украине (1983) как предвестник надвигающейся угрозы, но, по-видимому, была проигнорирована люпиновой промышленностью в то время20,21. Несколько лет спустя эта разрушительная болезнь распространилась по всему миру и также затронула основные страны-производители люпина, такие как Австралия, Польша и Германия22,23,24. После вспышки антракноза в середине 1990-х годов обширный скрининг привел к выявлению нескольких устойчивых доноров в образцах NLL19. Устойчивость NLL к антракнозу контролируется двумя отдельными доминантными аллелями, обнаруженными в разных источниках зародышевой плазмы: Lanr1 в сортах Tanjil и Wonga и AnMan в сорте Mandalay25,26. Эти аллели дополняют молекулярные маркеры, которые поддерживают отбор устойчивой зародышевой плазмы в селекционных программах25,26,27,28,29,30. Устойчивая селекционная линия 83A:476, несущая аллель Lanr1, была скрещена с восприимчивой дикой линией P27255 для получения популяции RIL, сегрегирующей по устойчивости к антракнозу, что позволило приписать локус Lanr1 хромосоме NLL-1131, 32, 33. Выравнивание маркеров карты сцепления из фланкирующих локусов устойчивости к антракнозу с геномным каркасом NLL выявило расположение всех трех аллелей на одной хромосоме (NLL-11), но в разных позициях29,34,35. Однако из-за небольшого количества RIL и большого генетического расстояния между маркерами и соответствующими аллелями нельзя сделать надежных выводов об их базовых генах. С другой стороны, использование обратной генетики у люпинов затруднено из-за их очень низкого потенциала регенерации, что делает генетические манипуляции громоздкими37.
Развитие одомашненной зародышевой плазмы, несущей желаемый аллель в гомозиготном состоянии, такой как 83A:476 (Lanr1) и Mandelup (AnMan), открыло дверь для изучения устойчивости к антракнозу в условиях наличия противоположных комбинаций аллелей в диких популяциях. Возможности молекулярных механизмов. Сравните защитные реакции, генерируемые определенными генотипами. Это исследование оценивало раннюю транскриптомную реакцию NLL на вакцинацию C. lupini. Сначала европейская панель зародышевой плазмы NLL, содержащая 215 линий, была проверена с использованием молекулярных маркеров, которые маркируют аллели Lanr1 и AnMan. Затем было проведено фенотипирование антракноза на 50 линиях NLL, предварительно отобранных для молекулярных маркеров, в контролируемых условиях. На основании этих экспериментов были отобраны четыре линии, различающиеся по устойчивости к антракнозу и аллельному составу Lanr1/AnMan, для дифференциального профилирования экспрессии защитных генов с использованием двух взаимодополняющих подходов: высокопроизводительного секвенирования РНК и количественной оценки методом ПЦР в реальном времени.
Скрининг набора зародышевой плазмы NLL (N = 215) с маркерами Lanr1 (Anseq3 и Anseq4) и AnMan (Anseq4) и AnMan (AnManM1) показал, что только одна линия (95726, около Саламанки-b) усиливает аллель «устойчивости» для всех маркеров, в то время как «Наличие «восприимчивых» аллелей» обнаружило долю всех маркеров в 158 (~73,5%) линиях. Тринадцать линий произвели два «устойчивых» аллеля маркера Lanr1, а 8 линий произвели «устойчивые» аллели Lanr1. маркер. Аллель «устойчивости» маркера AnMan (Дополнительная таблица S1). Две линии были гетерозиготными по маркеру Anseq3 и одна гетерозиготная по маркеру AnManM1. 42 линии (19,5%) несли противоположные фазы аллелей Anseq3 и Anseq4, что указывает на высокую частоту рекомбинации между этими двумя локусами. Фенотипы антракноза в контролируемых условиях (Дополнительная таблица S2) выявили изменчивость в устойчивости тестируемых генотипов, что отразилось на тяжести антракноза. Различия в средних баллах варьировались от 1,8 (умеренно устойчивый) до 6,9 (восприимчивый), а различия в весе растений варьировались от 0,62 (восприимчивый) до 4,45 г (устойчивый). Была обнаружена значимая корреляция между значениями, полученными в двух повторениях эксперимента (0,51 для баллов тяжести заболевания, P = 0,00017 и 0,61 для веса растений, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (− 0,59 и − 0,77, P < 0,0001). Была обнаружена значимая корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторениях эксперимента (0,51 для баллов тяжести заболевания, P = 0,00017 и 0,61 для веса растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (− 0,59 и − 0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторениях эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растений, P < 0,0001), а также между двумя двумя параметрами (-0,59 и -0,77, P < 0,0001) 0,0001). Была обнаружена значимая корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторениях эксперимента (0,51 для баллов тяжести заболевания, P = 0,00017 и 0,61 для веса растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (- 0,59 и -0,77, P < 0,0001) 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为0,51，P = 0,00017, значение 0,61, P < 0,0001, значение P < 0,0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0,59 和– 0,59 和– 0,59–0,59–0,77，P < 0,0001)。 Наблюдалась динамика изменения между значениями, наблюдаемыми в двух повторениях (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 и масса растений 0,61, P <0,0001), и между двумя состояниями (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001. Была обнаружена значимая корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 и масса растения 0,61, P < 0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, P < 0,0001. ).Типичные симптомы, наблюдаемые у восприимчивых растений, включают перегиб и скручивание стебля, напоминающие структуру «пастушьего лука», за которыми следуют овальные поражения с оранжевыми/розовыми спорозоитами (Дополнительный рис. 1). Австралийские образцы, несущие гены Lanr1 (83A:476 и Tanjil) и AnMan (Mandelup), умеренно устойчивы, 0,0331 и 0,0036). Некоторые линии, которые также несут «устойчивые» аллели Lanr1 и/или AnMan, демонстрируют симптомы заболевания.
Интересно, что несколько линий NLL, не имеющих какого-либо «устойчивого» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сравнимый или более высокий, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), например, Boregine (значение P < 0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для веса растения) и популяция B-549/79b (значение P < 0,0001 для оценки и незначимо для веса). Интересно, что несколько линий NLL, не имеющих какого-либо «устойчивого» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сравнимый или более высокий, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), например, Boregine (значение P < 0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для веса растения) и популяция B-549/79b (значение P < 0,0001 для оценки и незначимо для веса). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» высокого маркерного аллеля, проявление уровня устойчивости к антракнозу (сопоставленный или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для измерения и 0,001 для основных растений) и существование B-549/79b (значение) P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Интересно, что несколько линий NLL, не имеющих какого-либо «устойчивого» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сравнимый или превышающий уровень для генотипов Lanr1 или AnMan), например, Boregine (значение P < 0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для веса растения) и популяция B-549/79b (значение P < 0,0001 для оценки и несущественно для веса).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1或AnMan 基因型相当或更高）,例如Борегин (两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分为0,0001, 植物重量为0,001), 和种群B-549/79b (得分P 值< 0,0001, 重量不显着). Интересно, что некоторые системы NLL, не имеющие никаких «антигенных» маркеров, демонстрируют высокую горизонтальную устойчивость (эквивалентную генам Lanr1 или AnMan или выше), такие как Boregine (оба параметра P < 0,0001), Bojar (значение P < 0,0001, вес растения 0,001) и штамм B-549/79b (значение P < 0,0001, вес незначителен). Интересно, что некоторые линии NLL, незначительное каких-либо маркерных аллелей «резистентности», уровень повышают устойчивость к антракнозу (сравнимые выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растений 0,001) и популяция B-549/79b (оценка P-значение). <0,0001, масса незначительна). Интересно, что некоторые линии NLL, не имеющие каких-либо аллелей маркеров «устойчивости», показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сравнимый или превышающий таковой у генотипов Lanr1 или AnMan), например, Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, вес растения 0,001) и популяция B-549/79b (значение P <0,0001, вес незначителен).Это явление предполагает возможность нового генетического источника устойчивости, объясняя наблюдаемое отсутствие корреляции между генотипами маркеров и фенотипами болезни (значения P от ~0,42 до ~0,98). Таким образом, тест Колмогорова-Смирнова показал, что данные по устойчивости к антракнозу были приблизительно нормально распределены для оценок (значения P 0,25 и 0,11) и массы растений (значения P 0,47 и 0,55), что позволяет мне предположить, что задействовано больше аллелей, чем Lanr1 и AnMan.
На основании результатов скрининга устойчивости к антракнозу для анализа транскриптома были отобраны 4 линии: 83A:476, Boregine, Mandelup и популяция 22660. Эти линии были повторно протестированы на устойчивость к сибирской язве в экспериментах по инокуляции методом секвенирования РНК, при условии, что они были такими же, как в предыдущем тесте. Значения баллов были следующими: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) и популяция 22660 (6,11 ± 1,29).
Протокол Illumina NovaSeq 6000 достиг в среднем 40,5 пар Mread на образец (от 29,7 до 54,4 Mread) (Дополнительная таблица S3). Оценки выравнивания в референтной последовательности варьировались от 75,5% до 88,6%. Средняя корреляция данных количества прочтений между экспериментальными вариантами между биологическими репликами варьировалась от 0,812 до 0,997 (среднее 0,959). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не выявили никакой экспрессии, а остальные 4785 генов были экспрессированы на незначительном уровне (базовое среднее < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не выявили никакой экспрессии, а остальные 4785 генов были экспрессированы на незначительном уровне (базовое среднее < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не постоянно экспрессировали, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не показали никакой экспрессии, а оставшиеся 4785 генов были экспрессированы на незначительном уровне (базовое среднее <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35,170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительную экспрессию (базовое среднее значение <5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не были экспрессированы, а оставшиеся 4785 генов имели незначительную экспрессию (базовое среднее <5).Таким образом, число генов, которые считались экспрессированными (базовое среднее значение ≥ 5) в ходе эксперимента, составило 27 468 (78,1%) (Дополнительная таблица S4).
С первой временной точки все линии NLL отреагировали на инокуляцию C. lupini (штамм Col-08) путем перепрограммирования транскриптома (таблица 1), однако между линиями наблюдались существенные различия. Так, линия резистентности 83A:476 (несущая ген Lanr1) показала значительное перепрограммирование транскриптома в первой временной точке (6 hpi) с 31-69-кратным увеличением числа изолированных up- и down-генов по сравнению с другими временными точками в этой временной точке. Кроме того, этот пик был кратковременным, так как экспрессия только нескольких генов оставалась значительно измененной во второй временной точке (12 hpi). Интересно, что Boregine, который также показал высокий уровень устойчивости в тесте на прививку, не подвергся такому массивному транскрипционному перепрограммированию во время эксперимента. Однако число дифференциально экспрессируемых генов (DEG) было одинаковым для Boregine и 83A:476 в 12 HPI. Как в Манделапе, так и в популяции 22660 наблюдались пики ДЭГ в последней временной точке (48 л/с), что указывает на относительную задержку защитных реакций.
Поскольку 83A:476 подверглась массивному перепрограммированию транскриптома в ответ на C. lupini на 6 HPI по сравнению со всеми другими линиями, ~91% DEG, наблюдавшихся в этот момент времени, были специфичными для линии (рис. 1). Однако имело место некоторое совпадение в ранних ответах между исследуемыми линиями, так как 68,5%, 50,9% и 52,6% DEG в Boregine, Mandelup и популяции 22660 соответственно перекрывались с теми, которые были обнаружены в 83A:476 в определенные моменты времени. Однако эти DEG составляли лишь небольшую часть (0,97–1,70%) всех DEG, в настоящее время обнаруженных с использованием 83A:476. Кроме того, 11 DEG из всех линий были когерентными в это время (Дополнительные таблицы S4–S6), включая общие компоненты защитных реакций растений: белок переноса липидов (TanjilG_32225), фермент эндоглюкан-1,3-β-глюкозид (TanjilG_23384), два стресс-индуцируемых белка, таких как SAM22 (TanjilG_31528 и TanjilG_31531), основной латексный белок (TanjilG_32352) и два богатых глицином структурных белка клеточной стенки (TanjilG_19701 и TanjilG_19702). Также наблюдалось относительно высокое совпадение в ответах транскриптома между 83A:476 и Boregine при 24 HPI (всего 16-38% DEG) и между Mandelup и Population 22660 при 48 HPI (всего 14-20% DEG).
Диаграмма Венна, показывающая количество дифференциально экспрессируемых генов (DEG) в линиях узколистного люпина (NLL), инокулированных Colletotrichum lupini (штамм Col-08, полученный с полей люпина в Веженице, Польша, 1999). Анализировались следующие линии NLL: 83A:476 (устойчивая, несущая аллель Lanr1), Boregine (устойчивая, генетический фон неизвестен), Mandelup (умеренно устойчивая, несущая аллель AnMan) и популяция 22660 (очень восприимчивая). Сокращение hpi обозначает часы после вакцинации. Нулевые значения были удалены для упрощения графика.
Набор сверхэкспрессированных генов на 6 hpi был проанализирован на наличие канонических доменов гена R (Дополнительная таблица S7). Это исследование выявило транскриптомную индукцию классических генов устойчивости к болезням с доменами NBS-LRR только на 83A:476. Этот набор состоял из одного гена TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), пяти генов CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 и tanjilg_16162), и четырех NBS-LR, Tanjilg_16162), и четырех NBS-LRRE (tanjilg_16162), а также четырех NBS-Lrr (tanjilg_16162) и четырех NBS-LRR (TANJILG_16162). Все эти гены имеют канонические домены, организованные в консервативных последовательностях. Помимо генов домена NBS-LRR, на 6-м часу после инфицирования активировались несколько киназ RLL, а именно одна у Boregine (TanjilG_19877), две у Mandelup (TanjilG_07141 и TanjilG_19877) и в популяции 22660 (TanjilG_09014 и TanjilG_10361) и две у 83A 27:476.
Гены со значительно измененной экспрессией в ответ на инокуляцию C. lupini (штамм Col-08) были подвергнуты анализу обогащения Gene Ontology (GO) (дополнительная таблица S8). Наиболее часто встречающимся термином биологического процесса был «GO:0006952 защитная реакция», который встречался в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P < 0,001) (рис. 2). Наиболее часто встречающимся термином биологического процесса был «GO:0006952 защитная реакция», который встречался в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P < 0,001) (рис. 2). Наиболее часто используемым представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой открытостью (значение P <0,001) (рис. 2). Наиболее часто встречающимся термином биологического процесса был «GO:0006952 защитная реакция», который встречался в 6 из 16 комбинаций (время × родословная) с высокой значимостью (значение P < 0,001) (рис. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 Наиболее представительным термином биологического процесса является «GO:0006952 защитная реакция», который появляется в 6 из 16 комбинаций (时间×线) с высокой значимостью (значение P < 0,001) (图2). Наиболее часто используемым представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», который появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой изобретательностью (значение P <0,001) (рис. 2). Наиболее часто встречающимся термином биологического процесса был «GO:0006952 Защитная реакция», который встречался в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P < 0,001) (рис. 2).Этот термин был перепредставлен в двух временных точках в 83A: 476 и Boregine (6 и 24 hpi) и в одной временной точке в Mandelup и Population 22660 (12 и 6 hpi соответственно). Это ожидаемый результат, подчеркивающий противогрибковый ответ устойчивых линий. Кроме того, 83A:476 отреагировал на C. lupini, быстро индуцируя гены, связанные с окислительным взрывом, представленным термином «окислительно-восстановительный процесс GO:0055114», что указывает на специфическую защитную реакцию, в то время как Boregine выявил специфические защитные реакции, связанные с термином «GO». :0006950 Реакция на стресс». Популяция 22660 активировала горизонтальную реакцию сопротивления с участием вторичных метаболитов, выделив чрезмерное количество терминов «GO:0016104 Процесс биосинтеза тритерпенов» и «GO:0006722 Процесс метаболизма тритерпенов» (оба термина относятся к одному и тому же набору генов), принимая во внимание результаты анализа обогащения терминов GO, стабильность реакции Манделупа была между Борегином и Популяцией 22660. Кроме того, ранняя реакция 83A:476 (6 hpi) и отсроченная реакция Манделупа и Популяция 22660 включают термин GO:0015979 «фотосинтез» и другие связанные биологические процессы.
Термины онтологии генов биопроцессов, выбранные в аннотации дифференциально экспрессируемых генов во время транскриптомных ответов узколистного люпина (NLL), инокулированного люпином сибиреязвенным люпином (штамм Col-08, полученный с полей люпина в Виженице, Польша, в 1999 году), сильно преувеличены. Анализировались следующие линии NLL: 83A:476 (устойчивая, несущая гомозиготный аллель Lanr1), Boregine (устойчивая, неизвестный генетический фон), Mandelup (умеренно устойчивая, несущая гомозиготный аллель AnMan) и популяция 22660 (восприимчивая).
Поскольку это исследование было направлено на выявление генов, которые способствуют устойчивости к антракнозу, гены, назначенные терминам GO «GO: 0006952 Защитные реакции» и «GO: 0055114 Окислительно-восстановительные процессы», были проанализированы с отсечками, поскольку базовые средние значения ≥ 30 с по крайней мере одной линией. × момент времени, объединяющий статистически значимые значения log2 (кратное изменение). Количество генов, соответствующих этим критериям, составило 65 для GO:0006952 и 524 для GO:0055114.
83A:476 выявил два пика DEG, аннотированных термином GO:0006952, первый при 6 генах на дюйм (64 гена, повышающая и понижающая регуляция), а второй при 24 генах на дюйм (15 генов, только повышающая регуляция). Boregine также показал, что GO:0006952 достиг пика в ту же временную точку, но с меньшим DEG (11 и 8) и предпочтительной активацией. Mandeloop показал два пика GO:0006952 при 12 и 48 HPI, оба несущих 12 генов (первый с активирующими генами, а второй только с подавляющими генами), в то время как популяция 22660 при 6 HPI (13 генов) имела большее преобладание пика увеличения. регуляции. Следует отметить, что 96,4% GO:0006952 DEG в этих пиках имели один и тот же тип ответа (вверх или вниз), что указывает на значительное перекрытие защитных реакций, несмотря на различия в количестве вовлеченных генов. Самая большая группа последовательностей, связанных с термином GO:0006952, кодирует белок сообщения, связанный со стрессом голодания 22 (SAM22-подобный), который относится к кладе белков патогенез-ассоциированного белка (PR-10) класса 10 и основному белку латекса. подобный (MLP-подобный) белок) белок (рис. 3). Две группы различались по характеру экспрессии и направлению ответа. Гены, кодирующие SAM22-подобные белки, показали постоянную и значительную индукцию в ранние временные точки (6 или 12 hpi) и в целом не реагировали в конце эксперимента (48 hpi), в то время как MLP-подобные белки показали координацию в 6 hpi. hpi. 83A:476 и Mandelup при 48 hp/in, почти все остальные точки данных не реагировали. Кроме того, различия в профилях экспрессии генов белка, подобного SAM22, следовали за наблюдаемой изменчивостью устойчивости к антракнозу, поскольку более устойчивые линии имели больше временных точек, значительно индуцирующих эти гены, чем более восприимчивые гены. Другой ген PR-10, подобный LlR18A/B, показал очень похожую картину экспрессии с геном белка, подобным SAM22.
Были идентифицированы основные компоненты термина биологического процесса «GO:0006952 Defense Response» и паттерны экспрессии генов-кандидатов аллелей Lanr1 и AnMan. Шкала Log2 представляет значения log2 (кратное изменение) между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина, Виженица, Польша, 1999) и контрольными (ложноинокулированными) растениями в один и тот же момент времени. Были проанализированы следующие линии узколистного люпина: 83A:476 (устойчивый, несущий гомозиготный аллель Lanr1), Boregine (устойчивый, генетический фон неизвестен), Mandelup (умеренно устойчивый, несущий гомозиготный аллель AnMan) и Популяция 22660 (восприимчивый).
Кроме того, были оценены профили экспрессии генов-кандидатов РНК-секвенирования Lanr1 (TanjilG_05042) и AnMan (TanjilG_12861) (рис. 3). Ген TanjilG_05042 показал значительный ответ (активацию) в 83A:476 только в первой временной точке (6 hpi), тогда как TanjilG_12861 был значимым в Mandeloop только в двух временных точках: 6 hpi (понижение регуляции) и 24 hpi (6 hpi). С.). регулируемый) ).
Наиболее сверхэкспрессированными генами в термине GO:0055114 «окислительно-восстановительный процесс» были гены, кодирующие белки цитохрома P450 и пероксидазу (рис. 4). Для образцов, выделенных из 83A:476 на 6 HPI, максимальные или минимальные значения log2 (кратность изменения) (для 86,6% генов) в целом наблюдались между инокулированными и контрольными растениями, что подчеркивает высокую реакцию этого генотипа на инокуляционный пол. 83A:476 показал наиболее значительный GO: 0055114 DEG на 6 hpi (503 гена), тогда как остальные линии на 48 hpi (Boregine, 31 ген; Mandelup, 85 генов; и Population 22660, 78 генов)). В большинстве генов семейства GO:0055114 наблюдались два типа ответов на вакцинацию (активация и ингибирование). Интересно, что до 97,6% DEG, идентифицированных для термина GO: 0055114 у Mandelupe при 48 hp Эти наблюдения предполагают, что, несмотря на значительно меньший масштаб (т. е. количество мутировавших редокс-генов, 85 против 503), паттерн отсроченных транскриптомных ответов mandeloup на антракноз аналогичен раннему ответу 83A:476. У Boregine и Population 22660 эта конвергенция ниже — 51,6% и 75,6% соответственно.
Были выявлены закономерности экспрессии основных компонентов термина биологического процесса «GO:0055114 Окислительно-восстановительный процесс». Шкала Log2 представляет значения log2 (кратное изменение) между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина, Виженица, Польша, 1999) и контрольными (ложноинокулированными) растениями в одну и ту же временную точку. Были проанализированы следующие линии узколистного люпина: 83A:476 (устойчивая, несущая гомозиготный аллель Lanr1), Boregine (устойчивая, генетический фон неизвестен), Mandelup (умеренно устойчивая, несущая гомозиготный аллель AnMan) и Популяция 22660 (восприимчивая).
83A:476 Транскриптомные ответы на инокуляцию C. lupini (штамм Col-08) также включали координированное подавление генов, относящихся к термину GO:0015979 «фотосинтез» и другим связанным биологическим процессам (РИС. 5). Этот набор DEG GO:0015979 содержал 105 генов, которые были значительно подавлены на 6 hpi в 83A:476. В этом подмножестве 37 генов также были подавлены в Mandelup на 48 HPI и 35 в ту же временную точку в популяции 22660, включая 19 DEG, общих для обоих генотипов. Ни один DEG, связанный с термином GO: 0015979, не был значительно активирован в любой комбинации (линия x время).
Были выявлены закономерности экспрессии основных компонентов термина биологического процесса «GO:0015979 Фотосинтез». Шкала Log2 представляет значения log2 (кратное изменение) между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина, Виженица, Польша, 1999) и контрольными (ложноинокулированными) растениями в одну и ту же временную точку. Были проанализированы следующие линии узколистного люпина: 83A:476 (устойчивая, несущая гомозиготный аллель Lanr1), Boregine (устойчивая, генетический фон неизвестен), Mandelup (умеренно устойчивая, несущая гомозиготный аллель AnMan) и Популяция 22660 (восприимчивая).
На основании результатов анализа дифференциальной экспрессии и предположительного участия в защитных реакциях против патогенных грибов этот набор из семи генов был выбран для количественной оценки профилей экспрессии с помощью ПЦР в реальном времени (дополнительная таблица S9).
Предполагаемый ген белка TanjilG_10657 был значительно индуцирован во всех исследованных линиях и временных точках по сравнению с контрольными (имитаторными) растениями (Дополнительные таблицы S10, S11). Кроме того, профиль экспрессии TanjilG_10657 показал тенденцию к росту в ходе эксперимента для всех линий. Популяция 22660 показала самую высокую чувствительность TanjilG_10657 к инокуляции с 114-кратной активацией и самый высокий относительный уровень экспрессии (4,4 ± 0,4) при 24 HPI (рис. 6a). Ген белка PR10 LlR18A TanjilG_27015 также показал активацию во всех линиях и временных точках со статистической значимостью в большинстве точек данных (рис. 6b). Подобно TanjilG_10657, самый высокий относительный уровень экспрессии TanjilG_27015 наблюдался в инокулированной популяции 22660 на 24 HPI (19,5 ± 2,4). Ген кислой эндохитиназы TanjilG_04706 был значительно повышен во всех линиях и во всех временных точках, за исключением Boregine 6 hpi (рис. 6c). Он был сильно индуцирован в первой временной точке (6 HPI) на 83A:476 (в 10,5 раз) и умеренно повышен в других линиях (в 6,6-7,5 раз). В ходе эксперимента экспрессия TanjilG_04706 оставалась на схожих уровнях в 83A:476 и Boregine, тогда как в Mandelup и Population 22660 она значительно увеличилась, достигнув относительно высоких значений (5,9 ± 1,5 и 6,2 ± 1,5 соответственно). Ген, подобный эндоглюкан-1,3-β-глюкозидазе TanjilG_23384, показал высокую активацию в первых двух временных точках (6 и 12 hpi) во всех линиях, за исключением популяции 22660 (рис. 6d). Самые высокие относительные уровни экспрессии TanjilG_23384 наблюдались во второй временной точке (12 hpi) в Mandelup (2,7 ± 0,3) и 83A:476 (1,5 ± 0,1). На 24-й неделе развития эмбриона экспрессия TanjilG_23384 была относительно низкой во всех исследованных линиях (от 0,04 ± 0,009 до 0,44 ± 0,12).
Профили экспрессии выбранных генов (ag), выявленные с помощью количественной ПЦР. Числа 6, 12 и 24 представляют часы после вакцинации. Гены LanDExH7 и LanTUB6 использовались для нормализации, а LanTUB6 использовался для калибровки между сериями. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение на основе трех биологических реплик, каждая из которых является средним значением трех технических реплик. Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный в 1999 году с поля люпина в Вежице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*P-значение < 0,05, **P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный в 1999 году с поля люпина в Вежице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*P-значение < 0,05, **P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Статистическая закономерность в последовательной экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученная в 1999 г. с поляком Люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный в 1999 году с поля люпина в Веженице, Польша) и контрольными (ложноинокулированными) растениями отмечены над точками данных (*P-значение < 0,05, **P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001).接种（Коллетотрихум lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001)。接种 （colletotrichum lupini ， цвет-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Статистически значимые различия в понижении экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями, отмеченными над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 году) и контрольными (ложноинокулированными) растениями отмечены над точками данных (*P-значение < 0,05, **P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001).Были проанализированы следующие линии NLL: 83A:476 (устойчивая, несущая гомозиготный аллель Lanr1), Mandelup (умеренно устойчивая, несущая гомозиготный аллель AnMan), Boregine (устойчивая, неизвестный генетический фон) и популяция 22660 (восприимчивая).
Ген-кандидат TanjilG_05042 в локусе Lanr1 показал заметно отличающуюся картину экспрессии от профилей, полученных в результате исследований РНК-секвенирования (рис. 6e). Значительная активация этого гена наблюдалась в популяции Mandelup и 22660 (до 39,7 и 11,7 раз соответственно), что привело к относительно высоким уровням экспрессии (до 1,4 ± 0,14 и 7,2 ± 1,3 соответственно). 83A:476 также выявил некоторую апрегуляцию гена TanjilG_05042 (до 3,8 раз), однако достигнутые относительные уровни экспрессии (0,044 ± 0,002) были более чем в 30 раз ниже, чем наблюдаемые в популяции Mandelup и 22660. Анализ методом ПЦР показал значительные различия в уровнях экспрессии между генотипами в вариантах с имитацией вакцинации (контроль), достигающие 58-кратной разницы между популяциями 22660 и 83A:476, а также между популяциями 22660 и 22660. Двукратная разница была достигнута между Boregine и Mandalup.
Ген-кандидат в локусе AnMan, TanjilG_12861, активировался в ответ на вакцинацию в 83A:476 и Mandelup, был нейтральным в популяции 22660 и был подавлен в Boregine (рис. 6f). Относительная экспрессия гена TanjilG_12861 была самой высокой в ​​инокулированных 83A:476 (0,14 ± 0,01). Ген белка теплового шока класса I TanjilG_05080 HSP17.4 массой 17,4 кДа показал более низкие уровни относительной экспрессии во всех исследованных штаммах и временных точках (рис. 6g). Самое высокое значение наблюдалось на 24 HPI в популяции 22660 (0,14 ± 0,02, восьмикратное увеличение ответа на вакцинацию).
Сравнение профилей экспрессии генов (рис. 7) выявило высокую корреляцию между TanjilG_10657 и четырьмя другими генами: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) и TanjilG_04706 (r = 0,79). Такие результаты могут указывать на совместную регуляцию этих генов во время защитных реакций. Гены TanjilG_12861 и TanjilG_23384 показали разные профили экспрессии с более низкими значениями коэффициента корреляции Пирсона (от 0,08 до 0,43 и от -0,19 до 0,28 соответственно) по сравнению с другими генами.
Корреляции между профилями экспрессии генов были обнаружены с помощью количественной ПЦР. Были проанализированы следующие линии узколистного люпина: 83A:476 (устойчивая, несущая гомозиготный аллель Lanr1), Mandelup (умеренно устойчивая, несущая гомозиготный аллель AnMan), Boregine (устойчивая, генетический фон неизвестен) и Population 22660 (восприимчивая). Были рассчитаны три временные точки (6, 12 и 24 часа после инокуляции), включая инокулированные (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина в Виженице, Польша, в 1999 году) и контрольные (ложноинокулированные) растения. Шкала показывает значение коэффициента корреляции Пирсона.
На основе данных, полученных при 6 лошадиных силах на дюйм, WGCNA был выполнен на 9981 DEG, идентифицированных путем сравнения инокулированных и контрольных растений, чтобы сосредоточиться на ранних защитных реакциях (Дополнительная таблица S12). Было обнаружено двадцать два генных модуля (кластера) с коррелированными (положительными или отрицательными) профилями экспрессии между генотипами и экспериментальными вариантами. В среднем уровни экспрессии генов снижались в следующем порядке: 83A:476 > Mandelup > Boregine > Популяция 22660 (однако в обоих вариантах эта тенденция была сильнее у контрольных растений). В среднем уровни экспрессии генов снижались в следующем порядке: 83A:476 > Mandelup > Boregine > Популяция 22660 (однако в обоих вариантах эта тенденция была сильнее у контрольных растений). В средних уровнях экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Манделуп > Борегин > Популяция 22660 (в нижних вариантах, однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Популяция 22660 (однако в обоих вариантах эта тенденция была сильнее у контрольных растений).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Манделуп > Борегин > Население 22660的顺序下降（然而, 在两种变体中, 这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> манделуп> борегин> население 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种在 在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 В средних уровнях экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Манделуп > Борегин > Население 22660 (однако в нижних вариантах эта тенденция была сильнее у контрольных растений). В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Популяция 22660 (однако в обоих вариантах эта тенденция была сильнее выражена у контрольных растений).Вакцинация привела к повышению регуляции экспрессии генов, особенно в модулях 18, 19, 14, 6 и 1 (в порядке убывания эффекта), отрицательной регуляции (например, модули 9 и 20) или с нейтральными эффектами (например, модули 11, 22, 8 и 13). Анализ обогащения термина GO (Дополнительная таблица S13) выявил «GO: 0006952 Защитные реакции» для инокулированного модуля (18) с максимальной активацией, включая гены, проанализированные с помощью qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 и TanjilG_27015), а также многие модули с наиболее подавленным фотосинтезом Inoculate (9). Концентратор модуля 18 (рис. 8) был идентифицирован как ген TanjilG_26536, кодирующий белок LlR18B, подобный PR-10, а концентратор модуля 9 был идентифицирован как ген TanjilG_28955, кодирующий белок фотосистемы II PsbQ. Кандидат на ген устойчивости к антракнозу Lanr1, TanjilG_05042, был обнаружен в модуле 22 (рис. 9) и связан с терминами «GO:0044260 Клеточные макромолекулярные метаболические процессы» и «GO:0006355 Транскрипционная регуляция, шаблонизация ДНК», содержащими концентратор TanjilG_01212. ген кодирует фактор транскрипции теплового стресса A-4a (HSFA4a).
Взвешенный сетевой анализ генной коэкспрессии модулей с перепредставленными терминами биологических процессов «GO: 0006952 Защитные реакции». Лигирование было упрощено для выделения четырех генов, проанализированных с помощью qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 и TanjilG_27015).
Взвешенный сетевой анализ коэкспрессии генов модуля с перепредставленным биологическим термином процесса «GO: 0006355: Транскрипционная регуляция, шаблонизация ДНК» и несущим кандидатный ген устойчивости к антракнозу Lanr1 TanjilG_05042. Лигирование было упрощено для изоляции гена TanjilG_05042 и центрального гена TanjilG_01212.
Скрининг на устойчивость к антракнозу, собранный в Австралии, показал, что большинство ранних выпущенных сортов были восприимчивы; Kalya, Coromup и Mandelup были описаны как умеренно устойчивые, в то время как Wonga, Tanjil и 83A:476 были описаны как высокоустойчивые26,27,31. имели один и тот же аллель устойчивости, обозначенный Lanr1, а Coromup и Mandelup имели другой аллель, обозначенный AnMan10, 26, 39, в то время как Kalya передала другой аллель. , Lanr2. Скрининг на устойчивость к антракнозу в Германии привел к идентификации устойчивой линии Bo7212 с кандидатным аллелем, отличным от Lanr1, обозначенным LanrBo36.
Наше исследование выявило очень низкую частоту (около 6%) аллеля Lanr1 в протестированной зародышевой плазме. Это наблюдение согласуется с результатами скрининга восточноевропейской зародышевой плазмы с использованием маркеров Anseq3 и Anseq4, которые показали, что аллель Lanr1 присутствует только в двух белорусских линиях. Это говорит о том, что аллель Lanr1 пока не используется широко местными селекционными программами, в отличие от Австралии, где он является одним из ключевых аллелей для селекции с помощью маркеров. Это может быть связано с более низким уровнем устойчивости, обеспечиваемым аллелем Lanr1 в европейских полевых условиях по сравнению с австралийским отчетом. Кроме того, исследования антракноза в районах с высоким количеством осадков в Австралии показали, что реакции устойчивости, опосредованные аллелем Lanr1, могут быть неэффективны в погодных условиях, которые благоприятствуют росту и быстрому развитию патогена19,42. Фактически, в настоящем исследовании некоторые симптомы антракноза также наблюдались в генотипах, несущих аллель Lanr1, что позволяет предположить, что устойчивость может исчезнуть при оптимальных условиях для развития C. lupini. Кроме того, возможны ложноположительные интерпретации наличия маркеров Anseq3 и Anseq4, которые находятся примерно в 1 cM от локуса Lanr1 28,30,43 .
Наше исследование показало, что 83A:476, несущий аллель Lanr1, отреагировал на инокуляцию C. lupini крупномасштабным перепрограммированием транскриптома в первой анализируемой временной точке (6 hpi), тогда как у Mandelup, несущего аллель AnMan, транскриптомные ответы наблюдались гораздо позже (с 24 по 48 hp). Эти временные вариации защитных реакций связаны с различиями в симптомах заболевания, подчеркивая важность раннего распознавания патогена для успешного ответа на резистентность. Чтобы заразить растительную ткань, споры сибирской язвы должны пройти несколько стадий развития на поверхности хозяина, включая прорастание, деление клеток и образование аппрессория. Придаток — это инфекционная структура, которая прикрепляется к поверхности хозяина и облегчает проникновение в ткани хозяина. Так, споры C. gloeosporioides в экстракте гороха показали первое деление ядра после 75-90 минут инкубации, образование ростковой трубки после 90-120 минут и подавление после 4 часов 45 . Манговый C. gloeosporioides показал более 40% прорастания конидий после 3 часов инкубации и около 20% образования аппрессоров после 4 часов. Ген CAP20, ассоциированный с вирулентностью, у C. gloeosporioides показал транскрипционную активность в эпифитобразующих конидиях после 3,5 часов инкубации в воске поверхности авокадо с высокими концентрациями белка CAP20 после 4 часов 46 минут. Аналогичным образом активность генов биосинтеза меланина у C. trifolii была индуцирована во время 2-часовой инкубации с последующим образованием аппрессория через 1 час. Исследования тканей листьев показали, что клубника, инокулированная C. acutatum, имеет первое подавление на 8 hpi, тогда как томаты, инокулированные C. coccodes, имеют первое подавление на 4 hpi48,49. в значительной степени соответствует временной шкале инфекционного процесса Colletotrichum spp. Быстрые защитные реакции на 83A:476 предполагают участие генов устойчивости растений и иммунитета, запускаемого эффекторами (ETI), в этой линии, в то время как отсроченные реакции Манделапа подтверждают гипотезу микроассоциированного молекулярного паттерна-запускаемого иммунитета (MTI) 50. Ранние реакции на 83A:476 и Манделапа. Частичное совпадение между генами с повышенной или пониженной регуляцией в отсроченном ответе также подтверждает эту концепцию, поскольку ETI часто считается ускоренной и усиленной реакцией MTI, которая достигает кульминации в запрограммированной гибели клеток в месте заражения, известной как анафилактический шок 51,52 .
Большинство генов, приписываемых чрезмерно представленному термину Gene Ontology GO:0006952 «Defense Response», представляют собой 11 гомологов белка стресс-индуцированного сообщения о голодании 22 (похожего на SAM22) и семь основных белков-подобных латексу (MLP). -подобные белки 31, 34, 43 и 423 показали сходство последовательностей. Гены, подобные SAM22, показали значительную активацию, которая длилась дольше, показывая повышенные уровни устойчивости к антракнозу (83A:476 и Boregine). Однако гены, подобные MLP, были подавлены только в линиях, несущих аллель-кандидат устойчивости (83A:476/Lanr1 на 6 hpi и Mandelup/AnMan на 24 hpi). Следует отметить, что все идентифицированные гомологи типа SAM22 происходят из генного кластера, охватывающего приблизительно 105 кб, в то время как гены типа MLP происходят из отдельных областей генома. Координированная активация таких генов типа SAM22 была также обнаружена в нашем предыдущем исследовании устойчивости NLL к инокуляции Diaporthetoxica, что позволяет предположить, что они участвуют в горизонтальных компонентах защитного ответа. Этот вывод также подтверждается сообщениями о положительной реакции генов типа SAM22 на травму или лечение салициловой кислотой, грибковыми индукторами или перекисью водорода.
Было показано, что гены, подобные MLP, реагируют на различные абиотические и биотические стрессы, включая бактериальные, вирусные и патогенные грибковые инфекции у многих видов растений55. Направления реакции на определенные взаимодействия между растениями и патогенами варьировались от сильного увеличения (например, во время заражения хлопка Verticillium dahliae) до значительного уменьшения (например, после заражения яблони Alternaria spp.)56,57. Значительное снижение экспрессии гена 423, подобного MLP, наблюдалось во время защиты авокадо от заражения F. niger и во время заражения яблони Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola и Alternaria alternata являются патотипами яблони58,59. Кроме того, яблоневые каллусы, сверхэкспрессирующие ген 423, подобно MLP, имели более низкую экспрессию генов, связанных с устойчивостью, и были более восприимчивы к грибковой инфекции59. Вслед за Fusarium oxysporum f ген 423, подобный MLP, также подавлялся в устойчивой зародышевой плазме фасоли обыкновенной. cn. Инфекция фасоли 60.
Другими членами семейства PR-10, идентифицированными в нашем исследовании РНК-секвенирования, были гены LlR18A и LlR18B в ответ на регуляцию, а также ген белка переноса липидов DIR1 с повышенной регуляцией (1 ген) или пониженной регуляцией (3 гена). Кроме того, WGCNA выделяет ген LlR18B как центральный элемент в этом модуле, который очень восприимчив к вакцинации и несет несколько генов защитного ответа. Гены LlR18A и LlR18B были индуцированы в листьях желтого люпина в ответ на патогенные бактерии, а также в стеблях NLL после инокуляции D. toxica, в то время как гомолог этих генов у риса, RSOsPR10, был быстро индуцирован грибковой инфекцией, предположительно вовлеченной в сигнальный путь жасмоновой кислоты53,61,62. Ген DIR1 кодирует неспецифические белки переноса липидов, которые необходимы для возникновения системной приобретенной устойчивости (SAR). При развитии защитных реакций белок DIR1 транспортируется из очага инфекции через флоэму, чтобы вызвать SAR в отдаленных органах. Интересно, что ген TanjilG_02313 DIR1 был значительно индуцирован в первую временную точку в линиях 84A:476 и Популяции 22660, но устойчивость к антракнозу успешно развилась только в линии 84A:476. Это может указывать на некоторую субфункционализацию гена DIR1 в NLL, поскольку оставшиеся три гомолога ответили на инокуляцию только в линии 83A:476 на 6 hpi, и эта реакция была направлена ​​вниз.
В нашем исследовании наиболее распространенными компонентами, соответствующими биологическому процессу под названием «GO:0055114 Redox process», были белок цитохрома P450, пероксидаза, 9S-/13S-липоксигеназа линолевой кислоты и оксидаза 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты. Кроме того, наш WGCNA определяет гомолог HSFA4a как хаб, несущий модули, такие как кандидат гена устойчивости Lanr1 TanjilG_05042. HSFA4a является компонентом окислительно-восстановительной регуляции ядерной транскрипции в растениях.
Белки цитохрома P450 являются оксидоредуктазами, которые катализируют реакции гидроксилирования, зависящие от НАДФН и/или O2, в первичном и вторичном метаболизме, включая метаболизм ксенобиотиков, а также гормонов, жирных кислот, стеринов, компонентов клеточной стенки, биополимеров и биосинтез защитных соединений 69. В нашем исследовании изменчивость функции цитохрома P450 растений была снижена с -10,6 log2 (кратное изменение) до 5,7 из-за большого количества измененных гомологов (37) и различий в моделях реагирования между конкретными генами, что отражает пересмотр в сторону повышения. . Использование только данных РНК-секвенирования для выяснения предполагаемой биологической функции генов NLL в таком большом суперсемействе белков было бы весьма спекулятивным. Однако стоит отметить, что некоторые гены цитохрома P450 связаны с повышенной устойчивостью к патогенным грибкам или бактериям, в том числе с участием в аллергических реакциях69,70,71.
Пероксидазы класса III — это многофункциональные растительные ферменты, участвующие в широком спектре метаболических процессов во время роста и развития растений, а также в ответ на экологические стрессы, такие как засоление, засуха, высокая интенсивность света и атака патогенов72. Пероксидазы участвуют во взаимодействии нескольких видов растений с Anthracis, включая Stylosanthes humilis и C. gloeosporioides, Lens culinaris и C. truncatum, Phaseolus vulgaris и C. lindemuthianum, Cucumis sativus и C. lagenarium73,74,75,76. Реакция наступает очень быстро, иногда даже за 4 HPI, до того, как грибок проникнет в ткань растения73. Ген пероксидазы также реагировал на инокуляцию D. toxica NLL. В дополнение к их типичным функциям регулирования окислительного взрыва или устранения окислительного стресса, пероксидазы могут препятствовать росту патогенов, создавая физические барьеры на основе укрепления клеточной стенки во время лигнификации, субъединицы или сшивания определенных соединений. Эту функцию можно отнести in silico к гену TanjilG_03329, кодирующему предполагаемую лигнинобразующую анионную пероксидазу, которая была значительно повышена в нашем исследовании в устойчивой линии 83A:476 при 6 HPI, но не в других штаммах и временных точках, которые не отреагировали.
9S-/13S-липоксигеназа линолевой кислоты является первым шагом в окислительном пути биосинтеза липидов78. Продукты этого пути выполняют множество функций в защите растений, включая укрепление клеточной стенки за счет образования отложений каллозы и пектина и регуляцию окислительного стресса за счет продукции активных форм кислорода79,80,81,82,83. В настоящем исследовании экспрессия 9S-/13S-липоксигеназы линолевой кислоты была изменена во всех штаммах, но в восприимчивой популяции 22660 в разные моменты времени преобладала повышенная регуляция, в то время как в штаммах, несущих устойчивый Lanr1 и аллель AnMan, это подчеркивает диверсификацию оксилипинового слоя в защитных реакциях сибирской язвы между этими генотипами.
Гомолог 1-аминоциклопропан-1-карбоксилатоксидазы (ACO) был значительно повышен (9 генов) или понижен (2 гена) при инокуляции люпином. За двумя исключениями, все эти реакции произошли при 6 hp. в 83A:476. Ферментативная реакция, опосредованная белками ACO, является этапом, ограничивающим скорость производства этилена, и поэтому строго регулируется84. Этилен является растительным гормоном, который играет различные роли в регуляции развития растений и реакции на абиотические и биотические стрессовые условия. Индукция транскрипции ACO и активация сигнального пути этилена участвуют в повышении устойчивости риса к гемибиотрофному грибу oryzae oryzae путем регулирования продукции активных форм кислорода и фитоалексинов. Очень похожий процесс заражения листьев, обнаруженный у M. oryzae и C. lupini88,89, на фоне значительного повышения уровня гомологов ACO в линии 83A:476, описанной в этом исследовании, смещает возможность придания устойчивости к антракнозу NLL. Этилен является центральным сигнальным этапом в молекулярных путях.
В настоящем исследовании крупномасштабное подавление многих генов, связанных с фотосинтезом, наблюдалось на 6 hpi в 83A:476 и на 48 hpi в Mandeloop и популяции 22660. Степень и прогрессирование этих изменений пропорциональны уровню. В этом эксперименте наблюдалась устойчивость к антракнозу. Недавно было сообщено о сильном и раннем подавлении транскриптов, связанных с фотосинтезом, в нескольких моделях взаимодействий растений и патогенов, включая патогенные бактерии и грибы. Спешка (от 2 HPI в некоторых взаимодействиях) и глобальное подавление генов, связанных с фотосинтезом, в ответ на инфекцию может вызвать иммунитет растений, основанный на развертывании активных форм кислорода и их взаимодействии с путем салициловой кислоты для опосредования аллергических реакций 90,94.
В заключение, механизмы защитного ответа, предложенные для наиболее устойчивой линии (83A:476), включают быстрое распознавание патогена геном R (предположительно TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) и опосредованную аллергической реакцией сигнализацию салициловой кислоты и этилена, за которой следует установление дальнего действия SAR. действие поддерживается белком DIR-1. Следует отметить, что биотрофный период для заражения C. lupini очень короткий (примерно 2 дня), за которым следует некротический рост95. Переход между этими стадиями может быть связан с некрозом и экспрессией индуцируемых этиленом белков, которые действуют как триггеры реакций гиперчувствительности в растениях-хозяевах. Следовательно, временное окно для успешного захвата C. lupini на биотрофной стадии очень узкое. Перепрограммирование генов, связанных с окислительно-восстановительным процессом и фотосинтезом, наблюдаемое в 83A:476 на 6 hpi, согласуется с прогрессированием грибковых гиф и возвещает о развитии успешного защитного ответа на биотрофной стадии. Транскриптомные ответы Mandelup и популяции 22660 могут быть слишком отсрочены, чтобы захватить грибок до переключения на некротический рост, однако Mandelup может быть более эффективным, чем популяция 22660, поскольку относительно быстрая регуляция белка PR-10 способствует горизонтальной устойчивости.
ETI, управляемая каноническим геном R, по-видимому, является распространенным механизмом устойчивости фасоли к антракнозу. Так, в модельном бобовом растении Medicago truncatula устойчивость к антракнозу обеспечивается геном RCT1, членом класса генов растений R TIR-NBS-LRR97. Этот ген также обеспечивает широкий спектр устойчивости к антракнозу у люцерны при переносе на восприимчивые растения. У фасоли обыкновенной (P. vulgaris) на сегодняшний день идентифицировано более двух десятков генов устойчивости к антракнозу. Некоторые из этих генов обнаружены в регионах, где отсутствуют какие-либо канонические гены R, однако многие другие расположены на краях хромосом, несущих кластер генов NBS-LRR, включая TIR-NBS-LRRs99. Исследование SSR по всему геному также подтвердило связь гена NBS-LRR с устойчивостью к антракнозу у фасоли обыкновенной. Канонический ген R также был обнаружен в геномной области, несущей основной локус устойчивости к антракнозу у белого люпина 101.
Наша работа показывает, что немедленная реакция устойчивости, активируемая на ранней стадии заражения растений (предпочтительно не позднее 12 hpi), эффективно защищает узколистный люпин от антракноза, вызываемого патогенным грибом Collelotrichum lupini. Используя высокопроизводительное секвенирование, мы продемонстрировали дифференциальные профили экспрессии генов устойчивости к антракнозу в растениях NLL, опосредованные генами устойчивости Lanr1 и AnMan. Успешная защита включает тщательное проектирование генов белков, участвующих в окислительно-восстановительном процессе, фотосинтезе и патогенезе в течение нескольких часов после первого контакта растения с патогеном. Подобные защитные реакции, но отсроченные по времени, гораздо менее эффективны в защите растений от болезней. Устойчивость к сибирской язве, опосредованная геном Lanr1, напоминает типичный быстрый ответ гена R (иммунитет, запускаемый эффектором), в то время как ген AnMan, скорее всего, обеспечивает горизонтальный ответ (иммунитет, запускаемый молекулярным паттерном, связанным с микробом), обеспечивая умеренный уровень устойчивости.
215 линий NLL, использованных для скрининга маркеров антракноза, состояли из 74 сортов, 60 линий, полученных путем скрещивания или селекции, 5 мутантов и 76 диких или оригинальных зародышевых плазм. Линии поступили из 17 стран, в основном из Польши (58), Испании (47), Германии (27), Австралии (26), России (19), Беларуси (7), Италии (5) и других линий. из 10 стран. В набор также входят референтные устойчивые линии: 83A:476, Tanjil, Wonga, несущие аллель Lanr1, и Mandelup, несущие аллель AnMan. Линии были получены из Европейской базы данных генетических ресурсов люпина, поддерживаемой Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Польша (Дополнительная таблица S1).
Растения выращивали в контролируемых условиях (фотопериод 16 часов, температура 25°C днем ​​и 18°C ​​ночью). Анализировали два биологических повтора. ДНК выделяли из трехнедельных листьев с помощью набора DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) в соответствии с протоколом. Качество и концентрацию выделенной ДНК оценивали спектрофотометрическими методами (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Анализировали маркер AnManM1, маркирующий ген устойчивости к антракнозу AnMan (происходящий от сорта Mandelup), и маркеры Anseq3 и Anseq4, фланкирующие ген Lanr1 (происходящий от сорта Tanjil)11,26,28. Гомозиготы по устойчивому аллелю оценивали как «1», восприимчивые – как «0», а гетерозиготы – как 0,5.
На основании результатов скрининга маркеров AnManM1, AnSeq3 и AnSeq4 и наличия семян для окончательных последующих экспериментов было отобрано 50 линий NLL для фенотипирования устойчивости к антракнозу. Анализ проводился в двух повторностях в управляемой компьютером теплице с 14-часовым фотопериодом с температурным диапазоном 22°C днем ​​и 19°C ночью. Семена царапают (срезают семенную оболочку с противоположной стороны зародыша острым лезвием) перед посевом, чтобы предотвратить покой семян из-за слишком твердой семенной оболочки и обеспечить равномерное прорастание. Растения выращивали в горшках (11 × 11 × 21 см) со стерильной почвой (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Варшава, Польша). Инокуляция проводилась штаммом Colletotrichum lupini Col-08, выращенным в 1999 году из стеблей узколистных растений люпина, выращенных на поле в Верженице, Великопольское воеводство (52° 27′ 42″ с.ш. 17° 04′ 05″ в.д.). Получить область. Изоляты культивировались в среде SNA при 20° C под черным светом в течение 21 дня для индукции споруляции. Через четыре недели после посева, когда растения достигли стадии 4-6 листьев, инокуляция проводилась путем опрыскивания суспензией конидий в концентрации 0,5 x 106 конидий на мл. После инокуляции растения выдерживались в темноте в течение 24 часов при влажности около 98% и температуре 25° C для облегчения прорастания конидий и процесса заражения. Затем растения выращивали при 14-часовом фотопериоде при 22°C днем/19°C ночью и влажности 70%. Оценка заболевания проводилась через 22 дня после инокуляции и варьировалась от 0 (иммунный) до 9 (очень восприимчивый) в зависимости от наличия или отсутствия некротических поражений на стеблях и листьях. Кроме того, после оценки измерялся вес растений. Взаимосвязи между генотипами маркеров и фенотипами заболеваний рассчитывались как точечные двухпоследовательные корреляции (отсутствие гетерозиготных маркеров в наборе линий для анализа фенотипа устойчивости к антракнозу).