Спасибо за посещение сайта Nature.com. Версия вашего браузера имеет ограниченную поддержку CSS. Для наилучшего взаимодействия с сайтом мы рекомендуем использовать обновлённую версию браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В настоящее время, для обеспечения дальнейшей поддержки, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Люпин узколистный (Lupinus angustifolius L.) — бобовое растение, используемое в пищевой промышленности и для улучшения почвы. Глобальное распространение люпина узколистного как сельскохозяйственной культуры привлекло множество патогенных грибов, в том числе возбудителей антракноза люпина, вызывающих это разрушительное заболевание. В селекции люпина узколистного используются два аллеля, Lanr1 и AnMan, которые обеспечивают повышенную устойчивость, но лежащие в их основе молекулярные механизмы остаются неизвестными. В данном исследовании маркеры Lanr1 и AnMan были использованы для скрининга европейских образцов люпина узколистного. Тестирование вакцины в контролируемых условиях подтвердило эффективность обоих устойчивых доноров. Дифференциальное профилирование экспрессии генов было проведено на репрезентативных устойчивых и восприимчивых линиях. Устойчивость к антракнозу была связана с сверхэкспрессией терминов онтологии генов «GO:0006952 Защитный ответ», «GO:0055114 Редокс-процесс» и «GO:0015979 Фотосинтез». Кроме того, линия Lanr1(83A:476) продемонстрировала значительную перестройку транскриптома быстро после инокуляции, в то время как другие линии показали задержку в этой реакции примерно на 42 часа. Защитные реакции связаны с генами TIR-NBS, CC-NBS-LRR и NBS-LRR, 10 белками, участвующими в патогенезе, белками переноса липидов, эндоглюкан-1,3-β-глюкозидазой, богатыми глицином белками клеточной стенки и генами реактивного пути кислорода. Ранние реакции на 83A:476, включая тщательное подавление генов, связанных с фотосинтезом, совпали с успешной защитой во время вегетативной фазы роста грибковой биологии, что предполагает, что эффектор запускает иммунитет. Реакция Манделоупа замедляется, как и общее горизонтальное сопротивление.
Узколистный люпин (Lupinus angustifolius L.) — высокобелковая злаковая культура, происходящая из западного Средиземноморья1,2. В настоящее время его выращивают как кормовую культуру для животных и людей. Он также используется в качестве зеленого удобрения в севообороте благодаря фиксации азота симбиотическими азотфиксирующими бактериями и общему улучшению структуры почвы. В прошлом веке узколистный люпин претерпел быстрый процесс одомашнивания и до сих пор находится под сильным селекционным давлением3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. С широким распространением культивирования узколистного люпина произошла смена патогенных грибов, которые заняли новые сельскохозяйственные ниши и вызвали новые болезни, уничтожающие урожай. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина стало появление антракноза, вызываемого патогенным грибом Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина стало появление антракноза, вызываемого патогенным грибом Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина стало появление антракноза, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров, выращивающих люпин, стало появление антракноза, вызываемого патогенным грибом Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Бондар) Ниренберг, Фейлер и Хагедорн13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Бондар)嵵Волосатый。1 Наиболее заметным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее тревожным для фермеров и селекционеров, выращивающих люпин, является появление антракноза, вызываемого патогенным грибом Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Первые сообщения о заболевании поступили из Бразилии и США, при этом типичные симптомы появились в 1912 и 1929 годах соответственно. Однако примерно через 30 лет возбудитель был обозначен как Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в целенаправленной морфологии. & Х. Шренк. & Х. Шренк, .и Х. Шренк. И Х.施伦克，。 И Х.施伦克，。и Х. Шленк, .Предварительное фенотипирование заболевания, проведенное в середине XX века, показало некоторую устойчивость у образцов люпина белого (L. luteus L.) и желтого люпина (L. luteus L.), но все протестированные образцы белого люпина (L. albus L.) оказались высоко восприимчивыми15,16. Исследования показали, что развитие антракноза связано с увеличением количества осадков (влажности воздуха) и температуры (в диапазоне 12-28°C), что приводит к нарушению устойчивости при более высоких температурах17, 18. Фактически, время, необходимое для прорастания конидий и начала заболевания, было в четыре раза короче при 24°C (4 часа), чем при 12°C (16 часов) в условиях высокой влажности19. Таким образом, продолжающееся глобальное потепление привело к распространению антракноза. Однако заболевание наблюдалось во Франции (1982) и Украине (1983) как предвестник надвигающейся угрозы, но, по-видимому, было проигнорировано люпиновой промышленностью в то время20,21. Несколько лет спустя это разрушительное заболевание распространилось по всему миру и затронуло также основные страны-производители люпина, такие как Австралия, Польша и Германия22,23,24. После вспышки антракноза в середине 1990-х годов обширный скрининг позволил выявить несколько устойчивых доноров в образцах NLL19. Устойчивость NLL к антракнозу контролируется двумя отдельными доминантными аллелями, обнаруженными в разных источниках генетического материала: Lanr1 в сортах Tanjil и Wonga и AnMan в сорте Mandalay 25, 26. Эти аллели дополняют молекулярные маркеры, которые поддерживают отбор устойчивого генетического материала в селекционных программах25,26,27,28,29,30. Устойчивая селекционная линия 83A:476, несущая аллель Lanr1, была скрещена с восприимчивой дикой линией P27255 для получения популяции RIL, расщепляющейся по устойчивости к антракнозу, что позволило отнести локус Lanr1 к хромосоме NLL-1131, 32, 33. Выравнивание маркеров карты сцепления от фланкирующих локусов устойчивости к антракнозу с геномной структурой NLL выявило расположение всех трех аллелей на одной хромосоме (NLL-11), но в разных позициях29,34,35. Однако из-за небольшого числа RIL и большого генетического расстояния между маркерами и соответствующими аллелями нельзя сделать надежных выводов об их лежащих в основе генах. С другой стороны, использование обратной генетики у люпинов затруднено из-за их очень низкого регенерационного потенциала, что делает генетические манипуляции трудоемкими37.
Разработка одомашненного генофонда, несущего желаемый аллель в гомозиготном состоянии, например, 83A:476 (Lanr1) и Mandelup (AnMan), открыла возможности для изучения устойчивости к антракнозу в условиях наличия противоположных комбинаций аллелей в диких популяциях. Возможности молекулярных механизмов. Сравнение защитных реакций, генерируемых конкретными генотипами. В этом исследовании оценивалась ранняя транскриптомная реакция NLL на вакцинацию C. lupini. Сначала была проведена скрининговая оценка европейской панели генофонда NLL, содержащей 215 линий, с использованием молекулярных маркеров, которые отмечают аллели Lanr1 и AnMan. Затем было проведено фенотипирование антракноза на 50 линиях NLL, предварительно отобранных по молекулярным маркерам, в контролируемых условиях. На основе этих экспериментов были отобраны четыре линии, различающиеся по устойчивости к антракнозу и аллельному составу Lanr1/AnMan, для профилирования экспрессии генов защиты с использованием двух взаимодополняющих подходов: высокопроизводительного секвенирования РНК и количественного анализа методом ПЦР в реальном времени.
Скрининг набора генофонда NLL (N = 215) с использованием маркеров Lanr1 (Anseq3 и Anseq4), AnMan (Anseq4) и AnMan (AnManM1) показал, что только одна линия (95726, около Salamanca-b) амплифицирует «устойчивый» аллель для всех маркеров, в то время как «Наличие «восприимчивых» аллелей» выявило долю всех маркеров в 158 (~73,5%) линиях. Тринадцать линий продуцировали два «устойчивых» аллеля маркера Lanr1, а 8 линий — «устойчивые» аллели маркера Lanr1. «Устойчивый» аллель маркера AnMan (дополнительная таблица S1). Две линии были гетерозиготны по маркеру Anseq3, а одна — гетерозиготна по маркеру AnManM1. 42 линии (19,5%) несли противоположные фазы аллелей Anseq3 и Anseq4, что указывает на высокую частоту рекомбинации между этими двумя локусами. Фенотипы антракноза в контролируемых условиях (дополнительная таблица S2) выявили изменчивость устойчивости исследуемых генотипов, что отразилось на степени тяжести антракноза. Различия в средних показателях варьировались от 1,8 (умеренно устойчивые) до 6,9 (восприимчивые), а различия в массе растений — от 0,62 (восприимчивые) до 4,45 г (устойчивые). Была обнаружена значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторениях эксперимента (0,51 для показателей тяжести заболевания, P = 0,00017, и 0,61 для массы растений, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (−0,59 и −0,77, P < 0,0001). Была обнаружена значительная корреляция между значениями, полученными в двух повторениях эксперимента (0,51 для показателей тяжести заболевания, P = 0,00017, и 0,61 для массы растений, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (−0,59 и −0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторениях эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растений, P < 0,0001), а также между двумя двумя параметрами (-0,59 и -0,77, P < 0,0001) 0,0001). Была обнаружена значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторениях эксперимента (0,51 для показателей тяжести заболевания, P = 0,00017 и 0,61 для массы растений, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, P < 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为0,51，P = 0,00017, значение 0,61, P < 0,0001, значение P < 0,0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0,59 和– 0,59–0,59 和– 0,59 和- 0,77，P < 0,0001)。 Наблюдалась динамика изменения между значениями, наблюдаемыми в двух циклах (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 и масса растений 0,61, P <0,0001), и между двумя состояниями (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001. Была обнаружена значительная корреляция между значениями, измеренными в двух повторах (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 и масса растения 0,61, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, P<0,0001. ).Типичные симптомы, наблюдаемые у восприимчивых растений, включают искривление и скручивание стебля, напоминающее структуру «пастушьего лука», за которым следуют овальные поражения с оранжево-розовыми спорозоитами (дополнительный рис. 1). Австралийские образцы, несущие гены Lanr1 (83A:476 и Tanjil) и AnMan (Mandelup), обладают умеренной устойчивостью (0,0331 и 0,0036 соответственно). Некоторые линии, несущие также «устойчивые» аллели Lanr1 и/или AnMan, проявляют симптомы заболевания.
Интересно, что некоторые линии NLL, не имеющие аллелей «устойчивого» маркера, продемонстрировали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), например, Boregine (значение P < 0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и популяция B-549/79b (значение P < 0,0001 для оценки и статистически незначимо для массы). Интересно, что некоторые линии NLL, не имеющие аллелей «устойчивого» маркера, продемонстрировали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), например, Boregine (значение P < 0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и популяция B-549/79b (значение P < 0,0001 для оценки и статистически незначимо для массы). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» высокого маркерного аллеля, проявление уровня устойчивости к антракнозу (сопоставленный или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для измерения и 0,001 для основных растений) и существование B-549/79b (значение) P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Интересно, что несколько линий NLL, не имеющих аллелей «устойчивого» маркера, продемонстрировали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), например, Boregine (значение P < 0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и популяция B-549/79b (значение P < 0,0001 для оценки и статистически незначимо для массы).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1或AnMan 基因型相当或更高）,例如Борегин (两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分为0,0001, 植物重量为0,001), 和种群B-549/79b (得分P 值< 0,0001, 重量不显着). Интересно, что некоторые системы NLL, не имеющие каких-либо «антигенных» маркеров, демонстрируют высокую горизонтальную устойчивость (эквивалентную генам Lanr1 или AnMan или выше), такие как Boregine (оба параметра P < 0,0001), Bojar (значение P < 0,0001, масса растения 0,001) и штамм B-549/79b (значение P < 0,0001, масса не имеет значения). Интересно, что некоторые линии NLL, незначительные какие-либо маркерных аллелей «резистентности», показатели повышают устойчивость к антракнозу (сравнимые выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растений 0,001) и популяция B-549/79b (оценка P-значение). <0,0001, масса незначительна). Интересно, что некоторые линии NLL, не имеющие аллелей маркеров «устойчивости», продемонстрировали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), например, Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P < 0,0001, масса растения 0,001) и популяция B-549/79b (значение P < 0,0001, масса не имеет значения).Это явление предполагает возможность существования нового генетического источника устойчивости, объясняющего наблюдаемое отсутствие корреляции между генотипами маркеров и фенотипами заболевания (значения P от ~0,42 до ~0,98). Таким образом, тест Колмогорова-Смирнова показал, что данные по устойчивости к антракнозу приблизительно нормально распределены для показателей (значения P 0,25 и 0,11) и массы растений (значения P 0,47 и 0,55), что позволяет предположить, что в этом процессе задействовано больше аллелей, чем Lanr1 и AnMan.
На основании результатов скрининга устойчивости к антракнозу для транскриптомного анализа были отобраны 4 линии: 83A:476, Boregine, Mandelup и Population 22660. Эти линии были повторно протестированы на устойчивость к сибирской язве в экспериментах по инокуляции методом секвенирования РНК при условии, что они были такими же, как и в предыдущем тесте. Значения баллов были следующими: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) и Population 22660 (6,11 ± 1,29).
Протокол Illumina NovaSeq 6000 позволил получить в среднем 40,5 пар считываний на образец (от 29,7 до 54,4 считываний) (дополнительная таблица S3). Показатели выравнивания в референсной последовательности варьировались от 75,5% до 88,6%. Средняя корреляция данных о количестве считываний между экспериментальными вариантами в биологических репликатах составляла от 0,812 до 0,997 (среднее значение 0,959). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не показали экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее значение < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не показали экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее значение < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не постоянно экспрессировали, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не показали экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее значение <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35,170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительную экспрессию (базовое среднее значение <5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительную экспрессию (базовое среднее значение <5).Таким образом, число генов, считавшихся экспрессируемыми (среднее базовое значение ≥ 5) в ходе эксперимента, составило 27 468 (78,1%) (дополнительная таблица S4).
Начиная с первого момента времени, все линии NLL реагировали на инокуляцию C. lupini (штамм Col-08) перепрограммированием транскриптома (таблица 1), однако между линиями наблюдались значительные различия. Так, устойчивая линия 83A:476 (несущая ген Lanr1) показала значительное перепрограммирование транскриптома в первый момент времени (6 ч после инокуляции) с 31-69-кратным увеличением числа изолированных генов, экспрессия которых повышалась и понижалась, по сравнению с другими моментами времени. Кроме того, этот пик был кратковременным, поскольку экспрессия лишь нескольких генов оставалась значительно измененной во второй момент времени (12 ч после инокуляции). Интересно, что Boregine, который также показал высокий уровень устойчивости в тесте на прививку, не подвергся столь масштабному перепрограммированию транскрипции в течение эксперимента. Однако число дифференциально экспрессируемых генов (ДЭГ) было одинаковым для Boregine и 83A:476 через 12 ч после инокуляции. Как в популяции Манделуп, так и в популяции 22660 пики дифференциально экспрессирующихся генов наблюдались в последней временной точке (48 л/с), что указывает на относительную задержку в защитных реакциях.
Поскольку линия 83A:476 претерпела масштабную перестройку транскриптома в ответ на воздействие C. lupini через 6 часов после заражения по сравнению со всеми другими линиями, ~91% дифференциально экспрессирующихся генов (ДЭГ), наблюдаемых в этот момент времени, были специфичны для данной линии (рис. 1). Однако наблюдалось некоторое совпадение ранних реакций между исследуемыми линиями: 68,5%, 50,9% и 52,6% ДЭГ в линиях Boregine, Mandelup и популяции 22660, соответственно, совпадали с теми, которые были обнаружены в линии 83A:476 в определенные моменты времени. Однако эти ДЭГ составляли лишь небольшую долю (0,97–1,70%) всех ДЭГ, обнаруженных в настоящее время с использованием линии 83A:476. Кроме того, на данный момент 11 дифференциально экспрессирующихся генов (DEGs) из всех линий были согласованы (дополнительные таблицы S4-S6), включая общие компоненты защитных реакций растений: белок переноса липидов (TanjilG_32225), фермент эндоглюкан-1,3-β-глюкозид (TanjilG_23384), два стресс-индуцируемых белка, таких как SAM22 (TanjilG_31528 и TanjilG_31531), основной белок латекса (TanjilG_32352) и два богатых глицином структурных белка клеточной стенки (TanjilG_19701 и TanjilG_19702). Также наблюдалось относительно высокое совпадение транскриптомных ответов между 83A:476 и Boregine через 24 часа после заражения (общее количество дифференциально экспрессирующихся генов составляло 16-38%) и между Mandelup и Population 22660 через 48 часов после заражения (общее количество дифференциально экспрессирующихся генов составляло 14-20%).
Диаграмма Венна, показывающая количество дифференциально экспрессируемых генов (ДЭГ) в линиях узколистного люпина (НЛЛ), инокулированных Colletotrichum lupini (штамм Col-08, полученный с люпиновых полей в Верженице, Польша, 1999 г.). Анализировались следующие линии НЛЛ: 83A:476 (устойчивая, несущая аллель Lanr1), Boregine (устойчивая, генетический фон неизвестен), Mandelup (умеренно устойчивая, несущая аллель AnMan) и популяция 22660 (очень восприимчивая). Сокращение hpi означает часы после вакцинации. Нулевые значения были удалены для упрощения графика.
Набор генов с повышенной экспрессией через 6 часов после заражения был проанализирован на наличие канонических доменов R-генов (дополнительная таблица S7). Это исследование выявило транскриптомную индукцию классических генов устойчивости к болезням с доменами NBS-LRR только в 83A:476. Этот набор состоял из одного гена TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), пяти генов CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 и tanjilg_16162), а также четырех генов NBS-LR (tanjilg_16162) и четырех генов NBS-LRRE (tanjilg_16162), а также четырех генов NBS-Lrr (tanjilg_16162) и четырех генов NBS-LRR (TANJILG_16162). Все эти гены имеют канонические домены, расположенные в консервативных последовательностях. В дополнение к генам домена NBS-LRR, несколько RLL-киназ были активированы через 6 часов после заражения, а именно одна у Boregine (TanjilG_19877), две у Mandelup (TanjilG_07141 и TanjilG_19877) и у популяции 22660 (TanjilG_09014 и TanjilG_10361), а также две у 83A 27:476.
Гены со значительно измененной экспрессией в ответ на инокуляцию C. lupini (штамм Col-08) были подвергнуты анализу обогащения по онтологии генов (GO) (дополнительная таблица S8). Наиболее часто встречающимся термином, обозначающим биологический процесс, был «GO:0006952 защитная реакция», который появился в 6 из 16 комбинаций (время × строка) с высокой степенью значимости (значение P < 0,001) (рис. 2). Наиболее часто встречающимся термином, обозначающим биологический процесс, был «GO:0006952 защитная реакция», который появился в 6 из 16 комбинаций (время × строка) с высокой степенью значимости (значение P < 0,001) (рис. 2). Наиболее часто используемым представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой открытостью (значение P <0,001) (рис. 2). Наиболее часто встречающимся термином, обозначающим биологический процесс, был «GO:0006952 защитная реакция», который с высокой степенью значимости (значение P < 0,001) встречался в 6 из 16 комбинаций (время × линия происхождения) (рис. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 Наиболее репрезентативным термином биологического процесса является «GO:0006952 защитная реакция», который встречается в 6 из 16 комбинаций (время × расстояние) с высокой степенью значимости (значение P < 0,001) (рис. 2). Наиболее часто используемым представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», который появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой изобретательностью (значение P <0,001) (рис. 2). Наиболее часто встречающимся термином, обозначающим биологический процесс, был «GO:0006952 Защитная реакция», который появился в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой степенью значимости (значение P < 0,001) (рис. 2).Этот термин был чрезмерно представлен в двух временных точках у линий 83A: 476 и Boregine (6 и 24 ч после заражения) и в одной временной точке у линий Mandelup и Population 22660 (12 и 6 ч после заражения соответственно). Это ожидаемый результат, подчеркивающий противогрибковую реакцию устойчивых линий. Кроме того, линия 83A:476 отреагировала на C. lupini быстрой индукцией генов, связанных с окислительным взрывом, представленным термином «GO:0055114 redox process», что указывает на специфическую защитную реакцию, в то время как линия Boregine продемонстрировала специфические защитные реакции, связанные с термином «GO». :0006950 Реакция на стресс». Популяция 22660 активировала горизонтальную реакцию сопротивления, включающую вторичные метаболиты, что подчеркивает избыточное количество терминов «GO:0016104 Процесс биосинтеза тритерпенов» и «GO:0006722 Процесс метаболизма тритерпенов» (оба термина принадлежат к одному и тому же набору генов). Принимая во внимание результаты анализа обогащения терминов GO, стабильность реакции Манделупа была между Бореджином и популяцией 22660. Кроме того, ранняя реакция 83A:476 (6 ч после инокуляции) и отсроченная реакция Манделупа и популяции 22660 включают термин GO:0015979 «фотосинтез» и другие связанные биологические процессы.
Термины онтологии генов биопроцессов, выбранные при аннотации дифференциально экспрессируемых генов в ходе транскриптомных ответов узколистного люпина (NLL), инокулированного люпином сибирской язвы (штамм Col-08, полученный с люпиновых полей в Верженице, Польша, в 1999 году), значительно преувеличены. Анализировались следующие линии NLL: 83A:476 (устойчивая, несущая гомозиготный аллель Lanr1), Boregine (устойчивая, с неизвестным генетическим фоном), Mandelup (умеренно устойчивая, несущая гомозиготный аллель AnMan) и популяция 22660 (восприимчивая).
Поскольку целью данного исследования было выявление генов, способствующих устойчивости к антракнозу, гены, отнесенные к терминам GO «GO: 0006952 Защитные реакции» и «GO: 0055114 Редокс-процессы», анализировались с использованием пороговых значений, равных средним значениям на исходном уровне ≥ 30, при этом как минимум одна линия × точка во времени объединяла статистически значимые значения log2 (кратное изменение). Количество генов, соответствующих этим критериям, составило 65 для GO:0006952 и 524 для GO:0055114.
83A:476 выявил два пика DEG, аннотированных термином GO:0006952: первый — на уровне 6 генов на дюйм (64 гена, повышающая и понижающая регуляция), а второй — на уровне 24 генов на дюйм (15 генов, только повышающая регуляция). Boregine также показал, что пик GO:0006952 приходился на тот же момент времени, но с меньшим количеством DEG (11 и 8) и преимущественной активацией. Mandeloop показал два пика GO:0006952 на 12 и 48 часах после заражения, оба содержали по 12 генов (первый с активирующими генами, а второй только с подавляющими генами), в то время как популяция 22660 на 6 часах после заражения (13 генов) имела большее преобладание пика повышения регуляции. Следует отметить, что 96,4% дифференциально экспрессирующихся генов GO:0006952 в этих пиках имели одинаковый тип ответа (вверх или вниз), что указывает на значительное совпадение защитных реакций, несмотря на различия в количестве задействованных генов. Наибольшая группа последовательностей, связанных с термином GO:0006952, кодирует ассоциированный со стрессом голодания мРНК-белок 22 (SAM22-подобный), который относится к кладе белков, ассоциированных с патогенезом (PR-10) класса 10, и к основному белку, сходному с латексом (MLP-подобный белок) (рис. 3). Две группы различались по характеру экспрессии и направлению ответа. Гены, кодирующие SAM22-подобные белки, демонстрировали устойчивую и значительную индукцию на ранних этапах (6 или 12 ч после заражения) и в целом не реагировали к концу эксперимента (48 ч после заражения), в то время как MLP-подобные белки демонстрировали координацию на 6 ч после заражения. 83A:476 и Манделуп при 48 чп/мин, почти все остальные точки данных не реагировали. Кроме того, различия в профилях экспрессии генов SAM22-подобных белков соответствовали наблюдаемой изменчивости устойчивости к антракнозу, поскольку более устойчивые линии имели больше временных точек, значительно индуцирующих эти гены, чем более восприимчивые гены. Другой ген PR-10, подобный LlR18A/B, показал очень схожую картину экспрессии с геном SAM22-подобного белка.
Были определены основные компоненты термина биологического процесса «GO:0006952 Защитная реакция» и закономерности экспрессии генов-кандидатов аллелей Lanr1 и AnMan. Шкала Log2 представляет значения log2 (кратное изменение) между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с люпиновых полей, Виженица, Польша, 1999 г.) и контрольными (ложноинокулированными) растениями в один и тот же момент времени. Были проанализированы следующие линии узколистного люпина: 83A:476 (устойчивый, несущий гомозиготный аллель Lanr1), Boregine (устойчивый, генетический фон неизвестен), Mandelup (умеренно устойчивый, несущий гомозиготный аллель AnMan) и Population 22660 (восприимчивый).
Кроме того, были оценены профили экспрессии генов-кандидатов РНК-секвенирования Lanr1 (TanjilG_05042) и AnMan (TanjilG_12861) (рис. 3). Ген TanjilG_05042 показал значимый ответ (активацию) в 83A:476 только в первой временной точке (6 ч после инокуляции), в то время как TanjilG_12861 показал значимый ответ в Mandeloop только в двух временных точках: 6 ч после инокуляции (снижение экспрессии) и 24 ч после инокуляции (6 ч после инокуляции).
Наиболее сильно экспрессируемые гены в термине GO:0055114 «редокс-процесс» — это гены, кодирующие белки цитохрома P450 и пероксидазу (рис. 4). Для образцов, выделенных из 83A:476 через 6 часов после инокуляции, максимальные или минимальные значения log2 (кратное изменение) (для 86,6% генов) обычно наблюдались между инокулированными и контрольными растениями, что подчеркивает высокую реакцию этого генотипа на инокуляцию половых клеток. 83A:476 показал наиболее значимый дифференциально экспрессируемый ген GO:0055114 через 6 часов после инокуляции (503 гена), в то время как остальные линии — через 48 часов после инокуляции (Boregine, 31 ген; Mandelup, 85 генов; и Population 22660, 78 генов)). В большинстве генов семейства GO:0055114 наблюдались два типа реакции на вакцинацию (активация и ингибирование). Интересно, что до 97,6% дифференциально экспрессирующихся генов (DEGs), идентифицированных для термина GO: 0055114 у Mandelupe через 48 часов после начала заболевания, позволяют предположить, что, несмотря на значительно меньший масштаб (т.е. количество мутировавших редокс-генов, 85 против 503), характер замедленных транскриптомных ответов Mandelupe на антракноз аналогичен раннему ответу 83A:476. У Boregine и Population 22660 эта конвергенция ниже и составляет 51,6% и 75,6% соответственно.
Были выявлены закономерности экспрессии основных компонентов термина биологического процесса «GO:0055114 Редокс-процесс». Шкала Log2 представляет значения log2 (кратное изменение) между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с люпиновых полей, Виженица, Польша, 1999 г.) и контрольными (ложноинокулированными) растениями в один и тот же момент времени. Были проанализированы следующие линии узколистного люпина: 83A:476 (устойчивый, несущий гомозиготный аллель Lanr1), Boregine (устойчивый, генетический фон неизвестен), Mandelup (умеренно устойчивый, несущий гомозиготный аллель AnMan) и Population 22660 (восприимчивый).
Транскриптомные ответы 83A:476 на инокуляцию C. lupini (штамм Col-08) также включали скоординированное подавление генов, отнесенных к термину GO:0015979 «фотосинтез» и другим связанным биологическим процессам (рис. 5). Этот набор дифференциально экспрессирующихся генов GO:0015979 содержал 105 генов, которые были значительно подавлены через 6 часов после инокуляции в 83A:476. В этом подмножестве 37 генов также были подавлены в Манделупе через 48 часов после инокуляции, а 35 — в тот же момент времени в популяции 22660, включая 19 дифференциально экспрессирующихся генов, общих для обоих генотипов. Ни один из дифференциально экспрессирующихся генов, связанных с термином GO:0015979, не был значительно активирован ни в одной комбинации (линия x время).
Были выявлены закономерности экспрессии основных компонентов термина биологического процесса «GO:0015979 Фотосинтез». Шкала Log2 представляет значения log2 (кратное изменение) между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с люпиновых полей, Виженица, Польша, 1999 г.) и контрольными (ложноинокулированными) растениями в один и тот же момент времени. Были проанализированы следующие линии узколистного люпина: 83A:476 (устойчивый, несущий гомозиготный аллель Lanr1), Boregine (устойчивый, генетический фон неизвестен), Mandelup (умеренно устойчивый, несущий гомозиготный аллель AnMan) и Population 22660 (восприимчивый).
На основании результатов анализа дифференциальной экспрессии и предположительно участвующих в защитных реакциях против патогенных грибов, этот набор из семи генов был выбран для количественной оценки профилей экспрессии методом ПЦР в реальном времени (дополнительная таблица S9).
Предполагаемый ген белка TanjilG_10657 был значительно индуцирован во всех исследованных линиях и временных точках по сравнению с контрольными (имитирующими) растениями (дополнительные таблицы S10, S11). Кроме того, профиль экспрессии TanjilG_10657 показал тенденцию к увеличению в течение эксперимента для всех линий. Популяция 22660 показала наибольшую чувствительность TanjilG_10657 к инокуляции с 114-кратной активацией и самым высоким относительным уровнем экспрессии (4,4 ± 0,4) через 24 часа после инокуляции (рис. 6a). Ген белка PR10 LlR18A TanjilG_27015 также показал активацию во всех линиях и временных точках со статистической значимостью в большинстве точек данных (рис. 6b). Аналогично TanjilG_10657, самый высокий относительный уровень экспрессии TanjilG_27015 наблюдался в популяции, инокулированной 22660, через 24 часа после инокуляции (19,5 ± 2,4). Ген кислой эндохитиназы TanjilG_04706 был значительно повышен во всех линиях и во всех временных точках, за исключением Boregine через 6 часов после инокуляции (рис. 6c). Он был сильно индуцирован в первой временной точке (6 часов после инокуляции) у 83A:476 (в 10,5 раз) и умеренно увеличен в других линиях (в 6,6-7,5 раз). В ходе эксперимента экспрессия гена TanjilG_04706 оставалась на схожем уровне в линиях 83A:476 и Boregine, в то время как в линиях Mandelup и Population 22660 она значительно увеличилась, достигнув относительно высоких значений (5,9 ± 1,5 и 6,2 ± 1,5 соответственно). Ген, подобный эндоглюкан-1,3-β-глюкозидазе, TanjilG_23384 показал высокую активацию в первые две временные точки (6 и 12 ч после инокуляции) во всех линиях, кроме популяции 22660 (рис. 6d). Самые высокие относительные уровни экспрессии TanjilG_23384 наблюдались во второй временной точке (12 ч после инокуляции) в линиях Mandelup (2,7 ± 0,3) и 83A:476 (1,5 ± 0,1). Через 24 часа после заражения экспрессия TanjilG_23384 была относительно низкой во всех исследованных линиях (от 0,04 ± 0,009 до 0,44 ± 0,12).
Профили экспрессии выбранных генов (ag), полученные методом количественной ПЦР. Числа 6, 12 и 24 обозначают часы после вакцинации. Гены LanDExH7 и LanTUB6 использовались для нормализации, а ген LanTUB6 — для межсерийной калибровки. Погрешности на графиках представляют собой стандартное отклонение, рассчитанное на основе трех биологических повторов, каждый из которых является средним значением трех технических повторов. Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный в 1999 году с люпинового поля в Верженице, Польша) и контрольными (фиктивно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*P < 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный в 1999 году с люпинового поля в Верженице, Польша) и контрольными (фиктивно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*P < 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001). Статистическая закономерность в последовательной экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученная в 1999 г. с поляком Люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный в 1999 году с люпинового поля в Верженице, Польша) и контрольными (фиктивно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (*P < 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001).接种（Коллетотрихум lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001)。接种 （colletotrichum lupini ， цвет-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Статистически значимые различия в понижении экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями, отмеченными над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с люпиновых полей в Верженице, Польша, в 1999 году) и контрольными (фиктивно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (*P < 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001).Анализировались следующие линии NLL: 83A:476 (устойчивая, несущая гомозиготный аллель Lanr1), Mandelup (умеренно устойчивая, несущая гомозиготный аллель AnMan), Boregine (устойчивая, с неизвестным генетическим фоном) и популяция 22660 (восприимчивая).
Кандидатный ген TanjilG_05042 в локусе Lanr1 показал заметно отличающийся от профилей, полученных в результате исследований РНК-секвенирования (рис. 6e) характер экспрессии. Значительная активация этого гена наблюдалась в популяции Манделуп и популяции 22660 (до 39,7 и 11,7 раз соответственно), что привело к относительно высоким уровням экспрессии (до 1,4 ± 0,14 и 7,2 ± 1,3 соответственно). В популяции 83A:476 также было выявлено некоторое повышение экспрессии гена TanjilG_05042 (до 3,8 раз), однако достигнутые относительные уровни экспрессии (0,044 ± 0,002) были более чем в 30 раз ниже, чем наблюдаемые в популяции Манделуп и популяции 22660. Анализ методом количественной ПЦР показал значительные различия в уровнях экспрессии между генотипами в контрольных вариантах, получивших плацебо-вакцину, достигнув 58-кратной разницы между популяциями 22660 и 83A:476, а также между популяциями 22660 и 22660. Двукратная разница была достигнута между популяциями Бореджин и Мандалуп.
Кандидатный ген в локусе AnMan, TanjilG_12861, активировался в ответ на вакцинацию у штаммов 83A:476 и Mandelup, оставался нейтральным в популяции 22660 и был подавлен у штамма Boregine (рис. 6f). Относительная экспрессия гена TanjilG_12861 была самой высокой у инокулированного штамма 83A:476 (0,14±0,01). Ген белка теплового шока класса I TanjilG_05080 HSP17.4 с молекулярной массой 17,4 кДа показал более низкие относительные уровни экспрессии во всех исследованных штаммах и временных точках (рис. 6g). Самое высокое значение наблюдалось через 24 часа после инокуляции в популяции 22660 (0,14 ± 0,02, восьмикратное увеличение в ответ на вакцинацию).
Сравнение профилей экспрессии генов (рис. 7) выявило высокую корреляцию между TanjilG_10657 и четырьмя другими генами: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) и TanjilG_04706 (r = 0,79). Такие результаты могут указывать на совместную регуляцию этих генов во время защитных реакций. Гены TanjilG_12861 и TanjilG_23384 показали различные профили экспрессии с более низкими значениями коэффициента корреляции Пирсона (от 0,08 до 0,43 и от -0,19 до 0,28 соответственно) по сравнению с другими генами.
Корреляции между профилями экспрессии генов были выявлены с помощью количественной ПЦР. Были проанализированы следующие линии узколистного люпина: 83A:476 (устойчивый, несущий гомозиготный аллель Lanr1), Mandelup (умеренно устойчивый, несущий гомозиготный аллель AnMan), Boregine (устойчивый, генетический фон неизвестен) и Population 22660 (восприимчивый). Были рассчитаны три временные точки (6, 12 и 24 часа после инокуляции), включая инокулированные (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с люпиновых полей в Верженице, Польша, в 1999 году) и контрольные (ложноинокулированные) растения. Шкала показывает значение коэффициента корреляции Пирсона.
На основе данных, полученных при мощности 6 лошадиных сил на дюйм, был проведен анализ WGCNA 9981 дифференциально экспрессирующегося гена (DEG), выявленного путем сравнения инокулированных и контрольных растений, с целью изучения ранних защитных реакций (дополнительная таблица S12). Было обнаружено двадцать два генных модуля (кластера) с коррелированными (положительными или отрицательными) профилями экспрессии между генотипами и экспериментальными вариантами. В среднем уровни экспрессии генов убывали в следующем порядке: 83A:476 > Манделуп > Бореджин > Популяция 22660 (однако в обоих вариантах эта тенденция была сильнее выражена у контрольных растений). В среднем уровни экспрессии генов убывали в следующем порядке: 83A:476 > Манделуп > Бореджин > Популяция 22660 (однако в обоих вариантах эта тенденция была сильнее выражена у контрольных растений). В средних уровнях экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Манделуп > Борегин > Популяция 22660 (в нижних вариантах, однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). В среднем уровни экспрессии генов снижались в следующем порядке: 83A:476 > Манделуп > Бореджин > Популяция 22660 (однако в обоих вариантах эта тенденция была сильнее выражена у контрольных растений).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Манделуп > Борегин > Население 22660的顺序下降（然而, 在两种变体中, 这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> манделуп> борегин> население 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种在 在 植物中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 В средних уровнях экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Манделуп > Борегин > Население 22660 (однако в нижних вариантах эта тенденция была сильнее у контрольных растений). В среднем уровни экспрессии генов снижались в серии 83A:476 > Манделуп > Бореджин > Популяция 22660 (однако в обоих вариантах эта тенденция была сильнее выражена у контрольных растений).Вакцинация привела к повышению экспрессии генов, особенно в модулях 18, 19, 14, 6 и 1 (в порядке убывания эффекта), отрицательной регуляции (например, модули 9 и 20) или нейтральному эффекту (например, модули 11, 22, 8 и 13). Анализ обогащения терминов GO (дополнительная таблица S13) выявил «GO: 0006952 Защитные реакции» для инокулированного модуля (18) с максимальной активацией, включая гены, проанализированные методом qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 и TanjilG_27015), а также многие модули инокуляции, наиболее сильно подавляющие фотосинтез (9). В модуле 18 (рис. 8) был идентифицирован ген TanjilG_26536, кодирующий белок LlR18B, подобный PR-10, а в модуле 9 (рис. 9) — ген TanjilG_28955, кодирующий белок PsbQ фотосистемы II. В модуле 22 (рис. 9) был обнаружен кандидатный ген устойчивости к антракнозу Lanr1, TanjilG_05042, который ассоциирован с терминами «GO:0044260 Клеточные макромолекулярные метаболические процессы» и «GO:0006355 Регуляция транскрипции, матричное связывание ДНК», несущими хаб TanjilG_01212. Этот ген кодирует фактор транскрипции теплового стресса A-4a (HSFA4a).
Взвешенный сетевой анализ совместной экспрессии генов модулей с избыточно представленными терминами биологических процессов «GO: 0006952 Защитные реакции». Лигирование было упрощено для выделения четырех генов, проанализированных методом qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 и TanjilG_27015).
Взвешенный сетевой анализ совместной экспрессии генов модуля с избыточно представленным термином биологического процесса «GO: 0006355: Регуляция транскрипции, матричное связывание ДНК» и несущего потенциальный ген устойчивости к антракнозу Lanr1 TanjilG_05042. Лигирование было упрощено для выделения гена TanjilG_05042 и центрального гена TanjilG_01212.
Скрининг устойчивости к антракнозу, проведенный в Австралии, показал, что большинство ранневыпущенных сортов были восприимчивы; Kalya, Coromup и Mandelup были описаны как умеренно устойчивые, в то время как Wonga, Tanjil и 83A:476 были описаны как высокоустойчивые26,27,31. имели один и тот же аллель устойчивости, обозначенный как Lanr1, а Coromup и Mandelup имели другой аллель, обозначенный как AnMan10, 26, 39, в то время как Kalya передала другой аллель, Lanr2. Скрининг устойчивости к антракнозу в Германии привел к идентификации устойчивой линии Bo7212 с кандидатным аллелем, отличным от Lanr1, обозначенным как LanrBo36.
Наше исследование выявило очень низкую частоту (около 6%) аллеля Lanr1 в исследованном генофонде. Это наблюдение согласуется с результатами скрининга восточноевропейского генофонда с использованием маркеров Anseq3 и Anseq4, которые показали, что аллель Lanr1 присутствует только в двух белорусских линиях. Это говорит о том, что аллель Lanr1 пока не широко используется в местных селекционных программах, в отличие от Австралии, где он является одним из ключевых аллелей для селекции с использованием маркеров. Это может быть связано с более низким уровнем устойчивости, обеспечиваемым аллелем Lanr1 в европейских полевых условиях по сравнению с австралийскими данными. Кроме того, исследования антракноза в районах Австралии с высоким уровнем осадков показали, что резистентные реакции, опосредованные аллелем Lanr1, могут быть неэффективны в погодных условиях, благоприятствующих росту и быстрому развитию патогена19,42. В действительности, в данном исследовании некоторые симптомы антракноза наблюдались также у генотипов, несущих аллель Lanr1, что позволяет предположить, что устойчивость может исчезнуть в оптимальных условиях для развития C. lupini. Кроме того, возможны ложноположительные интерпретации наличия маркеров Anseq3 и Anseq4, которые находятся примерно в 1 сМ от локуса Lanr1 28,30,43.
Наше исследование показало, что у сорта 83A:476, несущего аллель Lanr1, реакция на инокуляцию C. lupini сопровождалась масштабным перепрограммированием транскриптома уже в первый анализируемый момент времени (6 ч после инокуляции), тогда как у сорта Mandelup, несущего аллель AnMan, транскриптомные реакции наблюдались значительно позже (от 24 до 48 ч после инокуляции). Эти временные вариации в защитных реакциях связаны с различиями в симптомах заболевания, что подчеркивает важность раннего распознавания патогена для успешного ответа на устойчивость. Для заражения растительной ткани споры сибирской язвы должны пройти несколько стадий развития на поверхности хозяина, включая прорастание, деление клеток и образование аппрессория. Придаток — это инфекционная структура, которая прикрепляется к поверхности хозяина и облегчает проникновение в его ткани. Таким образом, споры C. gloeosporioides в экстракте гороха показали первое деление ядра через 75-90 минут инкубации, образование ростковой трубки через 90-120 минут и подавление роста через 4 часа 45. C. gloeosporioides из манго показал более 40% прорастания конидий через 3 часа инкубации и около 20% образования аппрессориев через 4 часа. Связанный с вирулентностью ген CAP20 у C. gloeosporioides показал транскрипционную активность в эпифитообразующих конидиях после 3,5 часов инкубации на поверхности воска авокадо с высокими концентрациями белка CAP20 через 4 часа 46 минут. Аналогично, активность генов биосинтеза меланина у C. trifolii индуцировалась в течение 2-часовой инкубации с последующим образованием аппрессория через 1 час. Исследования листовых тканей показали, что у клубники, инокулированной C. acutatum, первое подавление инфекции наблюдается через 8 часов после инокуляции, тогда как у томатов, инокулированных C. coccodes, первое подавление инфекции наблюдается через 4 часа после инокуляции48,49, что в значительной степени соответствует временной шкале инфекционного процесса Colletotrichum spp. Быстрые защитные реакции на 83A:476 предполагают участие генов устойчивости растений и эффекторно-индуцированного иммунитета (ETI) в этой линии, в то время как замедленные реакции Манделупа подтверждают гипотезу микроассоциированного молекулярного паттерна-индуцированного иммунитета (MTI)50. Ранние реакции на 83A:476 и Манделупа. Частичное перекрытие между генами, регулируемыми вверх или вниз в замедленной реакции, также подтверждает эту концепцию, поскольку ETI часто рассматривается как ускоренная и усиленная реакция MTI, которая завершается запрограммированной гибелью клеток в месте инфекции, известной как анафилактический шок51,52.
Большинство генов, отнесенных к чрезмерно представленному термину онтологии генов GO:0006952 «Защитный ответ», представляют собой 11 гомологов стресс-индуцированного белка голодания 22 (аналогичного SAM22) и семь основных белков, подобных латексным белкам (MLP). Белки 31, 34, 43 и 423 показали сходство последовательностей. Гены, подобные SAM22, показали значительную активацию, которая длилась дольше, демонстрируя повышенный уровень устойчивости к антракнозу (83A:476 и Boregine). Однако гены, подобные MLP, были подавлены только в линиях, несущих предполагаемый аллель устойчивости (83A:476/Lanr1 через 6 ч после инокуляции и Mandelup/AnMan через 24 ч после инокуляции). Следует отметить, что все идентифицированные гомологи, подобные SAM22, происходят из кластера генов, охватывающего приблизительно 105 кб, в то время как гены, подобные MLP, происходят из отдельных областей генома. Скоординированная активация таких SAM22-подобных генов была также обнаружена в нашем предыдущем исследовании устойчивости NLL к инокуляции Diaporthetoxica, что предполагает их участие в горизонтальных компонентах защитной реакции. Этот вывод также подтверждается сообщениями о положительной реакции SAM22-подобных генов на повреждение или обработку салициловой кислотой, грибковыми индукторами или перекисью водорода.
Было показано, что гены, подобные MLP, реагируют на различные абиотические и биотические стрессы, включая бактериальные, вирусные и патогенные грибковые инфекции у многих видов растений55. Направления реакции на определенные взаимодействия между растениями и патогенами варьировались от сильного усиления (например, при заражении хлопка Verticillium dahliae) до значительного снижения (например, после заражения яблони Alternaria spp.)56,57. Значительное снижение экспрессии гена 423, подобного MLP, наблюдалось во время защиты авокадо от инфекции F. niger и во время заражения яблони Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola и Alternaria alternata, являющихся патотипами яблони58,59. Кроме того, каллусы яблони, сверхэкспрессирующие ген 423, подобный MLP, имели более низкую экспрессию генов, связанных с устойчивостью, и были более восприимчивы к грибковой инфекции59. После Fusarium oxysporum f ген MLP-подобный 423 также был подавлен в устойчивом генофонде фасоли обыкновенной. cn. Инфекция фасоли 60.
Другие члены семейства PR-10, идентифицированные в нашем исследовании РНК-секвенирования, включали гены LlR18A и LlR18B в ответ на повышение экспрессии, а также ген белка переноса липидов DIR1, экспрессия которого повышалась (1 ген) или понижалась (3 гена). Кроме того, WGCNA выделяет ген LlR18B как центральный элемент этого модуля, который очень восприимчив к вакцинации и содержит несколько генов защитного ответа. Гены LlR18A и LlR18B индуцировались в листьях желтого люпина в ответ на патогенные бактерии, а также в стеблях NLL после инокуляции D. toxica, в то время как рисовый гомолог этих генов, RSOsPR10, быстро индуцировался грибковой инфекцией, предположительно участвующей в сигнальном пути жасмоновой кислоты53,61, 62. Ген DIR1 кодирует неспецифические белки переноса липидов, необходимые для развития системной приобретенной устойчивости (SAR). В результате развития защитных реакций белок DIR1 транспортируется из очага инфекции по флоэме, вызывая системную приобретенной устойчивость (SAR) в отдаленных органах. Интересно, что ген DIR1 TanjilG_02313 был значительно индуцирован в первой временной точке в линиях 84A:476 и популяции 22660, но устойчивость к антракнозу успешно развилась только в линии 84A:476. Это может указывать на некоторую субфункционализацию гена DIR1 в NLL, поскольку оставшиеся три гомолога реагировали на инокуляцию только в линии 83A:476 через 6 часов после инокуляции, и эта реакция была направлена ​​вниз.
В нашем исследовании наиболее распространенными компонентами, соответствующими биологическому процессу, называемому «GO:0055114 Редокс-процесс», были белок цитохрома P450, пероксидаза, линолевая кислота 9S-/13S-липоксигеназа и 1-аминоциклопропан-1-карбоновая кислота оксидаза. Кроме того, наш анализ WGCNA определяет гомолог HSFA4a как центральный элемент, несущий модули, такие как кандидат на ген устойчивости Lanr1 TanjilG_05042. HSFA4a является компонентом редокс-зависимой регуляции ядерной транскрипции в растениях.
Белки цитохрома P450 представляют собой оксидоредуктазы, которые катализируют NADPH- и/или O2-зависимые реакции гидроксилирования в первичном и вторичном метаболизме, включая метаболизм ксенобиотиков, а также гормонов, жирных кислот, стеролов, компонентов клеточной стенки, биополимеров и биосинтез защитных соединений 69. В нашем исследовании вариабельность функции растительного цитохрома P450 снизилась с -10,6 log2 (кратное изменение) до 5,7 из-за большого числа измененных гомологов (37) и различий в характере ответа между конкретными генами, что отражает пересмотр в сторону увеличения. Использование только данных РНК-секвенирования для выяснения предполагаемой биологической функции генов NLL в таком большом суперсемействе белков было бы весьма спекулятивным. Однако стоит отметить, что некоторые гены цитохрома P450 связаны с повышенной устойчивостью к патогенным грибам или бактериям, включая вклад в аллергические реакции69,70,71.
Пероксидазы III класса — это многофункциональные растительные ферменты, участвующие в широком спектре метаболических процессов во время роста и развития растений, а также в ответ на стрессовые факторы окружающей среды, такие как засоление, засуха, высокая интенсивность света и атака патогенов72. Пероксидазы участвуют во взаимодействии нескольких видов растений с Anthracis, включая Stylosanthes humilis и C. gloeosporioides, Lens culinaris и C. truncatum, Phaseolus vulgaris и C. lindemuthianum, Cucumis sativus и C. lagenarium73,74,75,76. Реакция происходит очень быстро, иногда даже через 4 часа после заражения, до того, как гриб проникнет в растительную ткань73. Ген пероксидазы также реагировал на инокуляцию D. toxica NLL. Помимо своих типичных функций по регулированию окислительного взрыва или устранению окислительного стресса, пероксидазы могут препятствовать росту патогенов, создавая физические барьеры на основе укрепления клеточной стенки во время лигнификации, субъединичного или поперечного связывания специфических соединений. Эта функция может быть отнесена in silico к гену TanjilG_03329, кодирующему предполагаемую лигнинообразующую анионную пероксидазу, которая была значительно повышена в нашем исследовании в устойчивой линии 83A:476 через 6 часов после заражения, но не в других штаммах и временных точках, которые не реагировали.
9S-/13S-липоксигеназа линолевой кислоты является первым этапом окислительного пути биосинтеза липидов78. Продукты этого пути выполняют множество функций в защите растений, включая укрепление клеточной стенки за счет образования каллозных и пектиновых отложений, а также регуляцию окислительного стресса посредством образования активных форм кислорода79,80,81,82,83. В настоящем исследовании экспрессия 9S-/13S-липоксигеназы линолевой кислоты была изменена во всех штаммах, но в восприимчивой популяции 22660 наблюдалось повышение экспрессии в разные моменты времени, в то время как в штаммах, несущих устойчивый Lanr1 и аллель AnMan, подчеркивается диверсификация оксилипинового слоя в защитных реакциях на сибирскую язву между этими генотипами.
Гомолог 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат оксидазы (ACO) значительно повышался (9 генов) или понижался (2 гена) при инокуляции люпином. За двумя исключениями, все эти реакции наблюдались через 6 часов после инокуляции при 83A:476. Ферментативная реакция, опосредованная белками ACO, является лимитирующим этапом в производстве этилена и, следовательно, строго регулируется84. Этилен — это растительный гормон, играющий множество ролей в регуляции развития растений и их реакции на абиотические и биотические стрессовые условия. Индукция транскрипции ACO и активация сигнального пути этилена участвуют в повышении устойчивости риса к гемибиотрофному грибу Oryzae oryzae путем регулирования образования активных форм кислорода и фитоалексинов. Очень похожий процесс заражения листьев, обнаруженный у M. oryzae и C. lupini88,89, на фоне значительного повышения экспрессии гомологов ACO в линии 83A:476, описанной в этом исследовании, меняет возможность обеспечения устойчивости к антракнозу NLL. Этилен является центральным сигнальным этапом в молекулярных путях.
В настоящем исследовании было обнаружено масштабное подавление многих генов, связанных с фотосинтезом, через 6 часов после заражения у сорта 83A:476 и через 48 часов после заражения у сортов Mandeloop и 22660. Степень и прогрессирование этих изменений пропорциональны уровню. В этом эксперименте наблюдалась устойчивость к антракнозу. Недавно сообщалось о сильном и раннем подавлении транскриптов, связанных с фотосинтезом, в нескольких моделях взаимодействия растений с патогенами, включая патогенные бактерии и грибы. Быстрое (начиная с 2 часов после заражения в некоторых случаях) и глобальное подавление генов, связанных с фотосинтезом, в ответ на инфекцию может запускать иммунитет растений, основанный на использовании активных форм кислорода и их взаимодействии с салициловой кислотой для опосредования аллергических реакций 90,94.
В заключение, механизмы защитной реакции, предложенные для наиболее устойчивой линии (83A:476), включают быстрое распознавание патогена геном R (предположительно TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) и опосредованную аллергической реакцией передачу сигналов салициловой кислоты и этилена, за которой следует установление дальнедействующей системной приобретенной устойчивости. Действие поддерживается белком DIR-1. Следует отметить, что биотрофический период для заражения C. lupini очень короткий (приблизительно 2 дня), за которым следует некротический рост95. Переход между этими стадиями может быть связан с некрозом и экспрессией индуцируемых этиленом белков, которые действуют как триггеры реакций гиперчувствительности у растений-хозяев. Следовательно, временной интервал для успешного захвата C. lupini на биотрофической стадии очень узок. Перепрограммирование генов, связанных с окислительно-восстановительными процессами и фотосинтезом, наблюдаемое у штамма 83A:476 через 6 часов после инокуляции, согласуется с развитием грибковых гиф и свидетельствует о формировании успешной защитной реакции на биотрофной стадии. Транскриптомные реакции штаммов Mandelup и 22660 могут быть слишком запоздалыми, чтобы захватить грибок до перехода к некротическому росту, однако штамм Mandelup может быть более эффективным, чем штамм 22660, поскольку относительно быстрая регуляция белка PR-10 способствует горизонтальной устойчивости.
Механизм ETI, управляемый каноническим R-геном, по-видимому, является распространенным механизмом устойчивости фасоли к антракнозу. Так, у модельного бобового растения Medicago truncatula устойчивость к антракнозу обеспечивается геном RCT1, входящим в класс растительных R-генов TIR-NBS-LRR97. Этот ген также обеспечивает широкий спектр устойчивости к антракнозу у люцерны при переносе на восприимчивые растения. У обыкновенной фасоли (P. vulgaris) на сегодняшний день идентифицировано более двух десятков генов устойчивости к антракнозу. Некоторые из этих генов находятся в регионах, где отсутствуют канонические R-гены, однако многие другие расположены на краях хромосом, несущих кластер генов NBS-LRR, включая TIR-NBS-LRRs99. Полногеномное исследование SSR также подтвердило связь гена NBS-LRR с устойчивостью к антракнозу у обыкновенной фасоли. Канонический ген R был также обнаружен в геномном регионе, несущем основной локус устойчивости к антракнозу у белого люпина 101.
Наша работа показывает, что немедленная реакция устойчивости, активируемая на ранней стадии заражения растений (предпочтительно не позднее 12 часов после заражения), эффективно защищает узколистный люпин от антракноза, вызываемого патогенным грибом Collelotrichum lupini. Используя высокопроизводительное секвенирование, мы продемонстрировали дифференциальные профили экспрессии генов устойчивости к антракнозу у узколистных люпинов, опосредованные генами устойчивости Lanr1 и AnMan. Успешная защита включает в себя тщательное проектирование генов белков, участвующих в окислительно-восстановительных процессах, фотосинтезе и патогенезе, в течение нескольких часов после первого контакта растения с патогеном. Аналогичные защитные реакции, но с задержкой во времени, гораздо менее эффективны в защите растений от болезней. Устойчивость к сибирской язве, опосредованная геном Lanr1, напоминает типичную быструю реакцию гена R (иммунитет, запускаемый эффектором), в то время как ген AnMan, скорее всего, обеспечивает горизонтальный ответ (иммунитет, запускаемый молекулярным паттерном, связанным с микробом), обеспечивая умеренный уровень устойчивости.
Для скрининга маркеров антракноза использовалась коллекция из 215 линий NLL, включающая 74 сорта, 60 линий, полученных путем скрещивания или селекции, 5 мутантов и 76 диких или исходных образцов генофонда. Линии были получены из 17 стран, в основном из Польши (58), Испании (47), Германии (27), Австралии (26), России (19), Беларуси (7), Италии (5) и других стран. В набор также вошли референсные устойчивые линии: 83A:476, Tanjil, Wonga, несущие аллель Lanr1, и Mandelup, несущие аллель AnMan. Линии были получены из Европейской базы данных генетических ресурсов люпина, поддерживаемой компанией Poznań Plant Breeding Ltd., Виатрово, Польша (дополнительная таблица S1).
Растения выращивали в контролируемых условиях (фотопериод 16 часов, температура 25°C днем ​​и 18°C ​​ночью). Анализировали две биологические репликации. ДНК выделяли из трехнедельных листьев с использованием набора DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Хильден, Германия) в соответствии с протоколом. Качество и концентрацию выделенной ДНК оценивали спектрофотометрическими методами (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Анализировали маркер AnManM1, маркирующий ген устойчивости к антракнозу AnMan (полученный из сорта Манделуп), и маркеры Anseq3 и Anseq4, фланкирующие ген Lanr1 (полученный из сорта Танджил) 11,26,28. Гомозиготы по устойчивому аллелю оценивали как «1», восприимчивые – как «0», а гетерозиготы – как 0,5.
На основании результатов скрининга маркеров AnManM1, AnSeq3 и AnSeq4 и наличия семян для заключительных экспериментов, было отобрано 50 линий NLL для фенотипирования устойчивости к антракнозу. Анализ проводился в двух повторах в компьютеризированной теплице с 14-часовым фотопериодом и температурным диапазоном 22°C днем ​​и 19°C ночью. Перед посевом семена надрезают (срезают оболочку семязачатка с противоположной стороны зародыша острым лезвием), чтобы предотвратить спячку семян из-за слишком твердой оболочки и обеспечить равномерное прорастание. Растения выращивали в горшках (11 × 11 × 21 см) со стерильной почвой (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Варшава, Польша). Инокуляцию проводили штаммом Colletotrichum lupini Col-08, выращенным в 1999 году из стеблей узколистного люпина, произрастающего на поле в Верженице, Великопольское (52° 27′ 42″ с.ш. 17° 04′ 05″ в.д.). Изоляты культивировали на среде SNA при 20°C под ультрафиолетовым светом в течение 21 дня для индукции спорообразования. Через четыре недели после посева, когда растения достигли стадии 4-6 листьев, проводили инокуляцию путем опрыскивания суспензией конидий с концентрацией 0,5 x 10⁶ конидий на мл. После инокуляции растения выдерживали в темноте в течение 24 часов при влажности около 98% и температуре 25°C для облегчения прорастания конидий и процесса заражения. Растения выращивали при 14-часовом фотопериоде, температуре 22°C днем ​​и 19°C ночью, при влажности 70%. Оценка степени поражения проводилась через 22 дня после инокуляции и варьировалась от 0 (иммунный ответ) до 9 (очень восприимчивый ответ) в зависимости от наличия или отсутствия некротических поражений на стеблях и листьях. Кроме того, после оценки измеряли вес растений. Взаимосвязи между генотипами маркеров и фенотипами заболевания рассчитывались как точечные двухпоследовательностные корреляции (отсутствие гетерозиготных маркеров в наборе линий для анализа фенотипа устойчивости к антракнозу).