Terima kasih kerana melayari Nature.com. Versi pelayar yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad. Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan pelayar yang dikemas kini (atau melumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan memaparkan laman web tanpa gaya dan JavaScript.
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) ialah tumbuhan kekacang yang digunakan untuk pengeluaran makanan dan penambahbaikan tanah. Pengembangan global NLL sebagai tanaman telah menarik banyak kulat patogen, termasuk lupin antraknos, yang menyebabkan penyakit antraknos yang dahsyat. Dua alel, Lanr1 dan AnMan, yang memberikan peningkatan rintangan, telah digunakan dalam pembiakan NLL, tetapi mekanisme molekul yang mendasari masih tidak diketahui. Dalam kajian ini, penanda Lanr1 dan AnMan digunakan untuk menyaring sampel NLL Eropah. Pengujian vaksin dalam persekitaran terkawal mengesahkan keberkesanan kedua-dua penderma yang tahan. Profil ekspresi gen berbeza dilakukan pada garisan yang representatif tahan dan mudah terdedah. Rintangan antraknos dikaitkan dengan ekspresi berlebihan istilah ontologi gen "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process", dan "GO:0015979 Photosynthesis". Di samping itu, barisan Lanr1(83A:476) menunjukkan pengaturcaraan semula transkriptom yang ketara dengan cepat selepas inokulasi, manakala barisan lain menunjukkan kelewatan dalam tindak balas ini kira-kira 42 jam. Tindak balas pertahanan dikaitkan dengan gen TIR-NBS, CC-NBS-LRR dan NBS-LRR, 10 protein yang terlibat dalam patogenesis, protein pemindahan lipid, endoglucan-1,3-β-glukosidase, protein dinding sel kaya glisin, dan gen daripada laluan reaktif oksigen. Tindak balas awal terhadap 83A:476, termasuk penindasan gen yang berkaitan dengan fotosintesis dengan teliti, bertepatan dengan perlindungan yang berjaya semasa fasa pertumbuhan vegetatif biologi kulat, menunjukkan bahawa efektor mencetuskan imuniti. Tindak balas Mandeloop diperlahankan, begitu juga dengan seretan mendatar keseluruhan.
Lupin berdaun sempit (NLL, Lupinus angustifolius L.) ialah bijirin protein tinggi yang berasal dari wilayah Mediterranean barat1,2. Ia kini ditanam sebagai tanaman makanan untuk haiwan dan manusia. Ia juga dianggap sebagai baja hijau dalam sistem penggiliran tanaman disebabkan oleh fiksasi nitrogen oleh bakteria pengikat nitrogen simbiotik dan peningkatan keseluruhan struktur tanah. NLL telah mengalami proses penjinakan yang pesat dalam abad yang lalu dan masih berada di bawah tekanan pembiakan yang tinggi3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Dengan penanaman NLL yang meluas, penggantian kulat patogen telah membangunkan niche pertanian baharu dan menyebabkan penyakit pemusnah tanaman baharu. Yang paling luar biasa bagi petani dan penternak lupin ialah kemunculan antraknos, yang disebabkan oleh kulat patogen, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Yang paling luar biasa bagi petani dan penternak lupin ialah kemunculan antraknos, yang disebabkan oleh kulat patogen, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного памогингринкбто памингринком (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Paling ketara bagi petani dan penternak lupin ialah kemunculan antraknos yang disebabkan oleh kulat patogen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真由病原真由病原真菌 Lunenbergi Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌lu。 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемогого прикмто прикмто lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Paling menarik perhatian petani dan penternak lupin ialah kemunculan antraknos yang disebabkan oleh kulat patogen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Laporan terawal penyakit ini datang dari Brazil dan Amerika Syarikat, dengan gejala tipikal muncul masing-masing pada tahun 1912 dan 1929. Walau bagaimanapun, selepas kira-kira 30 tahun, patogen tersebut telah ditetapkan sebagai Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf bagi Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld dalam Morfologi Sasaran. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .dan H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。dan H. Schlenk, .Fenotip penyakit awal yang dilakukan pada pertengahan abad ke-20 menunjukkan sedikit rintangan dalam aksesi NLL dan lupin kuning (L. luteus L.), tetapi semua aksesi lupin putih (L. albus L.) yang diuji sangat mudah terdedah15,16. Kajian telah menunjukkan bahawa perkembangan antraknos dikaitkan dengan peningkatan hujan (kelembapan udara) dan suhu (dalam julat 12-28°C), yang membawa kepada pelanggaran rintangan pada suhu yang lebih tinggi17, 18. Malah, masa yang diperlukan untuk konidia bercambah dan penyakit bermula, adalah empat kali lebih pendek pada 24°C (4 jam) berbanding pada 12°C (16 jam) di bawah keadaan kelembapan yang tinggi19. Oleh itu, pemanasan global yang berterusan telah menyebabkan penyebaran antraknos. Walau bagaimanapun, penyakit ini diperhatikan di Perancis (1982) dan Ukraine (1983) sebagai petanda ancaman yang akan datang, tetapi nampaknya diabaikan oleh industri lupin pada masa itu20,21. Beberapa tahun kemudian, penyakit dahsyat ini merebak ke seluruh dunia dan turut menjejaskan negara-negara pengeluar lupin utama seperti Australia, Poland dan Jerman22,23,24. Berikutan wabak antraknos pada pertengahan 1990-an, saringan meluas menghasilkan pengenalpastian beberapa penderma tahan dalam sampel NLL19. Rintangan NLL terhadap antraknos dikawal oleh dua alel dominan berasingan yang terdapat dalam sumber plasma nutfah yang berbeza: Lanr1 dalam kultivar Tanjil dan Wonga dan AnMan dalam kultivar. Mandalay 25, 26. Alel ini melengkapi penanda molekul yang menyokong pemilihan plasma nutfah tahan dalam program pembiakan25,26,27,28,29,30. Garis pembiakan tahan 83A:476 yang membawa alel Lanr1 telah disilangkan dengan garis liar mudah terdedah P27255 untuk mendapatkan populasi RIL yang diasingkan untuk rintangan antraknos, yang membolehkan lokus Lanr1 diberikan kepada kromosom NLL-1131, 32, 33. Penjajaran penanda peta perkaitan daripada lokus rintangan mengapit kepada antraknos dengan rangka kerja genomik, NLL mendedahkan lokasi ketiga-tiga alel pada kromosom yang sama (NLL-11), tetapi dalam kedudukan yang berbeza29,34,35. Walau bagaimanapun, disebabkan bilangan RIL yang kecil dan jarak genetik yang besar antara penanda dan alel yang sepadan, tiada kesimpulan yang boleh dipercayai dapat dibuat tentang gen asasnya. Sebaliknya, penggunaan genetik terbalik dalam lupin adalah sukar kerana potensi regenerasinya yang sangat rendah, yang menjadikan manipulasi genetik membebankan37.
Perkembangan plasma nutfah yang dijinakkan yang membawa alel yang dikehendaki dalam keadaan homozigot, seperti 83A:476 (Lanr1) dan Mandelup (AnMan), telah membuka pintu untuk mengkaji rintangan antraknos dalam menghadapi kehadiran kombinasi alel yang bertentangan dalam populasi liar. Kemungkinan mekanisme molekul. Bandingkan tindak balas pertahanan yang dihasilkan oleh genotip tertentu. Kajian ini menilai tindak balas transkriptom awal NLL terhadap vaksinasi C. lupini. Pertama, panel plasma nutfah NLL Eropah yang mengandungi 215 baris telah ditapis menggunakan penanda molekul yang menandakan alel Lanr1 dan AnMan. Fenotip antraknos kemudiannya dilakukan pada 50 baris NLL, yang sebelum ini dipilih untuk penanda molekul, di bawah keadaan terkawal. Berdasarkan eksperimen ini, empat baris yang berbeza dalam rintangan antraknos dan komposisi alel Lanr1/AnMan telah dipilih untuk pemprofilan ekspresi gen pertahanan berbeza menggunakan dua pendekatan pelengkap: penjujukan RNA daya pemprosesan tinggi dan kuantifikasi PCR masa nyata.
Penyaringan satu set plasma nutfah NLL (N = 215) dengan penanda Lanr1 (Anseq3 dan Anseq4) dan AnMan (Anseq4) dan AnMan (AnManM1) menunjukkan bahawa hanya satu baris (95726, berhampiran Salamanca-b) menguatkan alel "rintangan" untuk semua penanda , manakala "Kehadiran alel 'rentan'" mendapati perkadaran semua penanda dalam 158 baris (~73.5%). Tiga belas baris menghasilkan dua alel "tahan" bagi penanda Lanr1, dan 8 baris menghasilkan alel "tahan" bagi penanda Lanr1. Alel "rintangan" bagi penanda AnMan (Jadual Tambahan S1). Dua baris adalah heterozigot untuk penanda Anseq3 dan satu heterozigot untuk penanda AnManM1. 42 baris (19.5%) membawa fasa alel Anseq3 dan Anseq4 yang bertentangan, menunjukkan frekuensi penggabungan semula yang tinggi antara kedua-dua lokus ini. Fenotip antraknos di bawah keadaan terkawal (Jadual Tambahan S2) mendedahkan kebolehubahan dalam rintangan genotip yang diuji, yang tercermin dalam keterukan antraknos. Perbezaan skor min adalah antara 1.8 (sederhana tahan) hingga 6.9 (mudah terdedah) dan perbezaan berat tumbuhan adalah antara 0.62 (mudah terdedah) hingga 4.45 g (tahan). Terdapat korelasi yang signifikan antara nilai yang diperhatikan dalam dua ulangan eksperimen (0.51 untuk skor keterukan penyakit, P = 0.00017 dan 0.61 untuk berat tumbuhan, P < 0.0001) serta antara kedua-dua parameter ini (− 0.59 dan − 0.77, P < 0.0001). Terdapat korelasi yang signifikan antara nilai yang diperhatikan dalam dua ulangan eksperimen (0.51 untuk skor keterukan penyakit, P = 0.00017 dan 0.61 untuk berat tumbuhan, P < 0.0001) serta antara kedua-dua parameter ini (− 0.59 dan − 0.77, P < 0.0001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0.51 для тля та = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, Р00 < 0,0). Satu korelasi yang ketara telah ditemui antara nilai yang diperhatikan dalam dua ulangan eksperimen (0.51 untuk skor keterukan penyakit, P = 0.00017 dan 0.61 untuk berat tumbuhan, P < 0.0001), serta antara kedua-dua parameter ini (- 0.59 dan -0.77, P < 0.0001) 0.0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为 = P0. 0.00017，植物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P < 0.0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 了了了 评0.51 ， p = 0.00017 ， 植物 为 为 0.61 ， p <0.0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（ 和 5.–5 和 5.–5. 0.59 和– 0.59 和- 0.77, P < 0.0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести ва,10 тяжести за,10 тяжести за 1 и масса растения 0,61, P <0,0001), dan между этими двумя параметрами (-0,59 dan -0,0001) 0,77, P <0,0001. Terdapat korelasi yang signifikan antara nilai yang diperhatikan secara berganda (skor keterukan penyakit 0.51, P = 0.00017 dan berat tumbuhan 0.61, P < 0.0001) dan antara kedua-dua parameter ini (-0.59 dan -0.0001) 0.77, P<0.0001. ).Simptom tipikal yang dilihat pada tumbuhan yang mudah terdedah termasuk kekusutan dan putaran batang yang menyerupai struktur "busur gembala", diikuti oleh lesi bujur dengan sporozoit oren/merah jambu (Rajah Tambahan 1). Aksesi Australia yang membawa gen Lanr1 (83A:476 dan Tanjil) dan AnMan (Mandelup) adalah sederhana tahan, 0.0331 dan 0.0036). Sesetengah keturunan yang juga membawa alel Lanr1 dan/atau AnMan yang "tahan" menunjukkan simptom penyakit.
Menariknya, beberapa garisan NLL yang kekurangan alel penanda "tahan" mendedahkan tahap rintangan antraknos yang tinggi (setanding atau lebih tinggi daripada genotip Lanr1 atau AnMan), seperti Boregine (nilai P < 0.0001 untuk kedua-dua parameter), Bojar (nilai P < 0.0001 untuk skor dan 0.001 untuk berat tumbuhan) dan Populasi B-549/79b (nilai P < 0.0001 untuk skor dan tidak signifikan untuk berat). Menariknya, beberapa garisan NLL yang kekurangan alel penanda "tahan" mendedahkan tahap rintangan antraknos yang tinggi (setanding atau lebih tinggi daripada genotip Lanr1 atau AnMan), seperti Boregine (nilai P < 0.0001 untuk kedua-dua parameter), Bojar (nilai P < 0.0001 untuk skor dan 0.001 untuk berat tumbuhan) dan Populasi B-549/79b (nilai P < 0.0001 untuk skor dan tidak signifikan untuk berat). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокнийчикостного антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 atau AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для пробраба) (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) dan популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Menariknya, beberapa garisan NLL yang kekurangan alel penanda 'tahan' menunjukkan tahap rintangan yang tinggi terhadap antraknos (setanding atau lebih tinggi daripada genotip Lanr1 atau AnMan), seperti Boregine (nilai P < 0.0001 untuk kedua-dua parameter), Bojar (nilai P < 0.0001 untuk penilaian dan 0.001 untuk berat tumbuhan) dan populasi B-549/79b (nilai P < 0.0001 untuk penilaian dan tidak signifikan untuk berat).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗中性病抗他们基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显。 Adalah menarik bahawa sesetengah sistem NLL yang tidak mempunyai sebarang penanda "antigenik" menunjukkan rintangan mendatar yang tinggi (bersamaan dengan gen Lanr1 atau AnMan atau lebih tinggi), seperti Boregine (kedua-dua parameter P < 0.0001), Bojar (nilai P < 0.0001, berat tumbuhan 0.001) dan strain B-549/79b (nilai P < 0.0001, berat tidak signifikan). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уостоикич антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 atau AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001, Boregine, <0,0001), Boregine масса растения 0,001) dan популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Menariknya, beberapa garisan NLL yang kekurangan alel penanda 'rintangan' menunjukkan tahap rintangan antraknos yang tinggi (setanding atau lebih tinggi daripada genotip Lanr1 atau AnMan), seperti Boregine (nilai P untuk kedua-dua parameter <0.0001), Bojar (nilai-P < 0.0001, berat tumbuhan 0.001) dan populasi B-549/79b (nilai-P < 0.0001, berat tidak signifikan).Fenomena ini mencadangkan kemungkinan sumber rintangan genetik baharu, menjelaskan kekurangan korelasi yang diperhatikan antara genotip penanda dan fenotip penyakit (nilai P dari ~0.42 hingga ~0.98). Oleh itu, ujian Kolmogorov-Smirnov menunjukkan bahawa data tentang rintangan antraknos adalah hampir bertaburan normal untuk skor (nilai-P 0.25 dan 0.11) dan jisim tumbuhan (nilai-P 0.47 dan 0.55), menunjukkan bahawa saya membuat hipotesis bahawa lebih banyak alel daripada Lanr1 dan AnMan terlibat.
Berdasarkan keputusan saringan rintangan antraknos, 4 baris telah dipilih untuk analisis transkriptom: 83A:476, Boregine, Mandelup, dan Populasi 22660. Barisan ini telah diuji semula untuk rintangan antraks dalam eksperimen inokulasi melalui penjujukan RNA, dengan syarat ia sama seperti dalam ujian sebelumnya. Nilai skor adalah seperti berikut: Boregin (1.71 ± 1.39), 83A: 476 (2.09 ± 1.38), Mandelup (3.82 ± 1.42) dan populasi 22660 (6.11 ± 1.29).
Protokol Illumina NovaSeq 6000 mencapai purata 40.5 pasangan Mread setiap sampel (29.7 hingga 54.4 Mread) (Jadual Tambahan S3). Skor penjajaran dalam jujukan rujukan adalah antara 75.5% hingga 88.6%. Korelasi purata data kiraan bacaan antara varian eksperimen antara replika biologi adalah antara 0.812 hingga 0.997 (min 0.959). Daripada 35,170 gen yang dianalisis, 2917 gen tidak menunjukkan sebarang ekspresi, dan 4785 gen yang lain diekspresikan pada tahap yang boleh diabaikan (min asas < 5). Daripada 35,170 gen yang dianalisis, 2917 gen tidak menunjukkan sebarang ekspresi, dan 4785 gen yang lain diekspresikan pada tahap yang boleh diabaikan (min asas < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессиронвались темирон (базовое среднее <5). Daripada 35,170 gen yang dianalisis, 2917 tidak menunjukkan ekspresi, dan baki 4785 gen diekspresikan pada tahap yang boleh diabaikan (min asas <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以忽略可以忽略不埡5）.35,170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительнсубю незначительнсубю среднее значение <5). Daripada 35,170 gen yang dianalisis, 2917 tidak diekspresikan dan baki 4785 gen mempunyai ekspresi yang boleh diabaikan (min asas <5).Oleh itu, bilangan gen yang dipertimbangkan diekspresikan (min asas ≥ 5) semasa eksperimen ialah 27,468 (78.1%) (Jadual Tambahan S4).
Dari titik masa pertama, semua garisan NLL bertindak balas terhadap inokulasi C. lupini (strain Col-08) dengan memprogram semula transkriptom (Jadual 1), walau bagaimanapun, perbezaan ketara diperhatikan antara garisan. Oleh itu, garisan rintangan 83A:476 (membawa gen Lanr1) menunjukkan pemrograman semula transkriptom yang ketara pada titik masa pertama (6 hpi) dengan peningkatan 31-69 kali ganda dalam bilangan gen atas dan bawah yang terasing berbanding titik masa lain pada titik masa ini. Di samping itu, puncak ini tidak bertahan lama, kerana ekspresi hanya beberapa gen yang kekal berubah dengan ketara pada titik masa kedua (12 hpi). Menariknya, Boregine, yang juga menunjukkan tahap rintangan yang tinggi dalam ujian cantuman, tidak menjalani pemrograman semula transkripsi yang begitu besar semasa eksperimen. Walau bagaimanapun, bilangan gen yang diekspresikan secara berbeza (DEG) adalah sama untuk Boregine dan 83A:476 pada 12 HPI. Kedua-dua Mandelup dan populasi 22660 menunjukkan puncak DEG pada titik masa terakhir (48 l/s), menunjukkan kelewatan relatif dalam tindak balas pertahanan.
Oleh kerana 83A:476 menjalani pengaturcaraan semula transkriptom secara besar-besaran sebagai tindak balas kepada C. lupini pada 6 HPI berbanding semua keturunan lain, ~91% daripada DEG yang diperhatikan pada masa ini adalah khusus keturunan (Rajah 1). Walau bagaimanapun, terdapat beberapa pertindihan dalam tindak balas awal antara keturunan kajian, kerana 68.5%, 50.9%, dan 52.6% DEG dalam Boregine, Mandelup, dan populasi 22660, masing-masing, bertindih dengan yang terdapat dalam 83A:476 pada titik masa tertentu. Walau bagaimanapun, DEG ini hanya menyumbang sebahagian kecil (0.97–1.70%) daripada semua DEG yang dikesan pada masa ini menggunakan 83A:476. Di samping itu, 11 DEG daripada semua galur adalah koheren pada masa ini (Jadual Tambahan S4-S6), termasuk komponen umum tindak balas pertahanan tumbuhan: protein pemindahan lipid (TanjilG_32225), enzim endoglucan-1,3-β-glukosida (TanjilG_23384), dua protein boleh induksi tekanan seperti SAM22 (TanjilG_31528 dan TanjilG_31531), protein lateks asas (TanjilG_32352), dan dua protein dinding sel struktur kaya glisin (TanjilG_19701 dan TanjilG_19702). Terdapat juga pertindihan yang agak tinggi dalam tindak balas transkriptom antara 83A:476 dan Boregine pada 24 HPI (jumlah 16-38% DEG) dan antara Mandelup dan Populasi 22660 pada 48 HPI (jumlah 14-20% DEG).
Gambar rajah Venn menunjukkan bilangan gen yang diekspresikan secara berbeza (DEG) dalam garisan lupin berdaun sempit (NLL) yang diinokulasi dengan Colletotrichum lupini (strain Col-08 yang diperoleh daripada ladang lupin di Wierzhenice, Poland, 1999). Garisan NLL yang dianalisis ialah: 83A:476 (tahan, membawa alel Lanr1), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui), Mandelup (sederhana tahan, membawa alel AnMan) dan populasi 22660 (sangat mudah terdedah). Singkatan hpi bermaksud jam selepas vaksinasi. Nilai sifar telah dialih keluar untuk memudahkan graf.
Set gen yang diekspres secara berlebihan pada 6 hpi telah dianalisis untuk kehadiran domain gen R kanonik (Jadual Tambahan S7). Kajian ini mendedahkan induksi transkriptom gen rintangan penyakit klasik dengan domain NBS-LRR hanya pada 83A:476. Set ini terdiri daripada satu gen TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), lima gen CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, dan tanjilg_16162), dan Empat NBS-LR, Tanjilg_16162), dan Empat NBS-LRRE (tanjilg_16162) serta Empat NBS-Lrr (tanjilg_16162) dan Empat NBS-LRR (TANJILG_16162). Semua gen ini mempunyai domain kanonik yang disusun dalam urutan terpelihara. Selain gen domain NBS-LRR, beberapa kinase RLL diaktifkan pada 6 hpi, iaitu satu dalam Boregine (TanjilG_19877), dua dalam Mandelup (TanjilG_07141 dan TanjilG_19877) dan dalam populasi 22660 (TanjilG_09014 dan TanjilG_10361) dan dua dalam 83A 27:476.
Gen dengan ekspresi yang berubah dengan ketara sebagai tindak balas terhadap inokulasi dengan C. lupini (strain Col-08) telah tertakluk kepada analisis pengayaan Ontologi Gen (GO) (Jadual Tambahan S8). Istilah proses biologi yang paling kerap diwakili secara berlebihan ialah "GO:0006952 respons pertahanan" yang muncul dalam 6 daripada 16 kombinasi (masa × garis) dengan signifikansi yang tinggi (nilai P < 0.001) (Rajah 2). Istilah proses biologi yang paling kerap diwakili secara berlebihan ialah "GO:0006952 respons pertahanan" yang muncul dalam 6 daripada 16 kombinasi (masa × garis) dengan signifikansi yang tinggi (nilai P < 0.001) (Rajah 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответный» 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Istilah proses biologi yang paling kerap diwakili secara berlebihan ialah 'GO:0006952 respons pertahanan', yang muncul dalam 6 daripada 16 kombinasi (masa × keturunan) dengan kepentingan yang tinggi (nilai P < 0.001) (Rajah 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（时间）一一一一上个中，具有高显着性（P ‼< 0.001）（图2）。 Istilah proses biologi yang paling representatif ialah “GO:0006952 tindak balas pertahanan”, yang muncul dalam 6 daripada 16 kombinasi (时间×线), dengan keertian yang tinggi (nilai P < 0.001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defence Response», котовлыл 6 позля 6 tahun комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Istilah proses biologi yang paling kerap diwakili secara berlebihan ialah 'GO:0006952 Defense Response', yang muncul dalam 6 daripada 16 kombinasi (masa × garis) dengan keertian yang tinggi (nilai P < 0.001) (Rajah 2).Istilah ini diwakili secara berlebihan pada dua titik masa dalam 83A: 476 dan Boregine (6 dan 24 hpi) dan pada satu titik masa dalam Mandelup dan Populasi 22660 (masing-masing 12 dan 6 hpi). Ini merupakan hasil yang dijangkakan, yang menonjolkan tindak balas antikulat bagi garisan tahan. Di samping itu, 83A:476 bertindak balas terhadap C. lupini dengan mendorong gen yang berkaitan dengan letusan oksidatif yang diwakili oleh istilah “proses redoks GO:0055114”, yang menunjukkan tindak balas pertahanan tertentu, manakala Boregine mendedahkan tindak balas pertahanan tertentu, yang berkaitan dengan istilah 'GO'. :0006950 Tindak balas tekanan”. Populasi 22660 mengaktifkan tindak balas rintangan mendatar yang melibatkan metabolit sekunder, menonjolkan bilangan istilah “GO:0016104 Proses biosintesis triterpena” dan “GO:0006722 Proses metabolisme triterpena” yang berlebihan (kedua-dua istilah tergolong dalam set gen yang sama), dengan mengambil kira keputusan analisis pengayaan istilah GO, kestabilan tindak balas Mandelup adalah antara Boregine dan Populasi 22660. Di samping itu, tindak balas awal 83A:476 (6 hpi) dan tindak balas tertangguh Mandelup dan Populasi 22660 merangkumi istilah GO:0015979 'fotosintesis' dan proses biologi lain yang berkaitan.
Istilah ontologi gen bioproses yang dipilih dalam anotasi gen yang diekspresikan secara berbeza semasa tindak balas transkriptom lupin berdaun sempit (NLL) yang diinokulasi dengan antraks lupin (strain Col-08 yang diperoleh daripada ladang lupin di Wierzhenice, Poland, pada tahun 1999) sangat dibesar-besarkan. Garisan NLL yang dianalisis ialah: 83A:476 (tahan, membawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui), Mandelup (sederhana tahan, membawa alel AnMan homozigot) dan populasi 22660 (rentan).
Oleh kerana kajian ini bertujuan untuk mengenal pasti gen-gen yang menyumbang kepada rintangan antraknos, gen-gen yang diberikan kepada istilah GO “GO: 0006952 Respons pertahanan” dan “GO: 0055114 Proses redoks” telah dianalisis dengan pemotongan kerana min asas ≥ 30 dengan sekurang-kurangnya satu garisan. × titik masa yang menggabungkan nilai log2 yang signifikan secara statistik (perubahan lipatan). Bilangan gen yang memenuhi kriteria ini ialah 65 untuk GO:0006952 dan 524 untuk GO:0055114.
83A:476 mendedahkan dua puncak DEG yang dianotasi dengan istilah GO:0006952, yang pertama pada 6 gen seinci (64 gen, peraturan naik dan turun) dan yang kedua pada 24 gen seinci (15 gen, peraturan naik sahaja). Boregine juga menunjukkan bahawa GO:0006952 memuncak pada titik masa yang sama, tetapi dengan kurang DEG (11 dan 8) dan pengaktifan keutamaan. Mandeloop menunjukkan dua puncak GO:0006952 pada 12 dan 48 HPI, kedua-duanya membawa 12 gen (yang pertama dengan gen pengaktif, dan yang kedua dengan hanya gen penindas), manakala populasi 22660 pada 6 HPI (13 gen) mempunyai dominasi yang lebih besar dalam peraturan peningkatan puncak. Perlu diingatkan bahawa 96.4% DEG GO:0006952 dalam puncak ini mempunyai jenis tindak balas yang sama (naik atau turun), menunjukkan pertindihan yang ketara dalam tindak balas pertahanan walaupun terdapat perbezaan dalam bilangan gen yang terlibat. Kumpulan jujukan terbesar yang berkaitan dengan istilah GO:0006952 mengekod Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (seperti SAM22), yang tergolong dalam klad protein patogenesis-associated protein (PR-10) kelas 10 dan protein teras lateks. protein serupa (seperti MLP) (Rajah 3). Kedua-dua kumpulan berbeza dari segi sifat ekspresi dan arah tindak balas. Gen yang mengekod protein seperti SAM22 menunjukkan induksi yang konsisten dan signifikan pada titik masa awal (6 atau 12 hpi) dan secara amnya tidak responsif pada akhir eksperimen (48 hpi), manakala protein seperti MLP menunjukkan koordinasi pada 6 hpi. hpi. 83A:476 dan Mandelup pada 48 hp/in, hampir semua titik data lain tidak responsif. Di samping itu, perbezaan dalam profil ekspresi gen protein seperti SAM22 mengikuti kebolehubahan yang diperhatikan dalam rintangan antraknos, kerana garisan yang lebih tahan mempunyai lebih banyak titik masa yang mendorong gen ini dengan ketara berbanding gen yang lebih mudah terdedah. Satu lagi gen PR-10 seperti LlR18A/B menunjukkan corak ekspresi yang sangat serupa dengan gen protein seperti SAM22.
Komponen utama istilah proses biologi "GO:0006952 Defense Response" dan corak ekspresi gen calon alel Lanr1 dan AnMan telah dikenal pasti. Skala Log2 mewakili nilai log2 (perubahan lipatan) antara tumbuhan yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, yang diperoleh daripada ladang lupin, Wizhenica, Poland, 1999) dan tumbuhan kawalan (yang diinokulasi palsu) pada titik masa yang sama. Garisan lupin daun sempit berikut telah dianalisis: 83A:476 (tahan, membawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui), Mandelup (sederhana tahan, membawa alel AnMan homozigot), dan Populasi 22660 (rentan).
Di samping itu, profil ekspresi gen calon RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) dan AnMan (TanjilG_12861) telah dinilai (Rajah 3). Gen TanjilG_05042 menunjukkan tindak balas yang ketara (pengaktifan) pada 83A:476 hanya pada titik masa pertama (6 hpi), manakala TanjilG_12861 adalah signifikan dalam Mandeloop hanya pada dua titik masa: 6 hpi (penurunan regulasi) dan 24 hpi (6 hpi). Dengan.). boleh laras) ).
Gen yang paling banyak diekspres secara berlebihan dalam istilah "proses redoks" GO:0055114 ialah gen yang mengekod protein sitokrom P450 dan peroksidase (Rajah 4). Bagi sampel yang diasingkan daripada 83A:476 pada 6 HPI, nilai log2 maksimum atau minimum (perubahan lipatan) (untuk 86.6% gen) secara amnya diperhatikan antara tumbuhan yang diinokulasi dan kawalan, yang menonjolkan tindak balas genotip ini yang tinggi terhadap jantina yang diinokulasi. 83A:476 menunjukkan GO: 0055114 DEG yang paling ketara pada 6 hpi (503 gen), manakala selebihnya daripada garisan pada 48 hpi (Boregine, 31 gen; Mandelup, 85 gen; dan Populasi 22660, 78 gen)). Dalam kebanyakan gen keluarga GO:0055114, dua jenis tindak balas terhadap vaksinasi (pengaktifan dan perencatan) diperhatikan. Menariknya, sehingga 97.6% daripada DEG yang dikenal pasti untuk istilah GO: 0055114 dalam Mandelupe pada 48 hp. Pemerhatian ini menunjukkan bahawa, walaupun skalanya jauh lebih kecil (iaitu, bilangan gen redoks yang bermutasi, 85 berbanding 503), corak tindak balas transkriptom mandeloup yang tertangguh terhadap antraknos adalah serupa dengan tindak balas awal 83A:476. Dalam Boregine dan Population 22660, penumpuan ini adalah lebih rendah masing-masing pada 51.6% dan 75.6%.
Corak ekspresi komponen utama bagi istilah proses biologi “GO:0055114 Proses Redoks” telah didedahkan. Skala Log2 mewakili nilai log2 (perubahan lipatan) antara tumbuhan yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, yang diperoleh daripada ladang lupin, Wizhenica, Poland, 1999) dan tumbuhan kawalan (yang diinokulasi palsu) pada titik masa yang sama. Garisan lupin daun sempit berikut telah dianalisis: 83A:476 (tahan, membawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui), Mandelup (sederhana tahan, membawa alel AnMan homozigot), dan Populasi 22660 (rentan).
83A:476 Tindak balas transkriptomik terhadap inokulasi dengan C. lupini (strain Col-08) juga termasuk penyenyapan gen yang dikaitkan dengan istilah GO:0015979 "fotosintesis" dan proses biologi lain yang berkaitan (RAJAH 5). Set DEG GO:0015979 ini mengandungi 105 gen yang ditindas dengan ketara pada 6 hpi pada 83A:476. Dalam subset ini, 37 gen juga diturunkan regulasi dalam Mandelup pada 48 HPI dan 35 pada titik masa yang sama dalam populasi 22660, termasuk 19 DEG yang sama untuk kedua-dua genotip. Tiada DEG yang berkaitan dengan istilah GO: 0015979 diaktifkan dengan ketara dalam sebarang kombinasi (garis x masa).
Corak ekspresi komponen utama bagi istilah proses biologi “GO:0015979 Fotosintesis” telah didedahkan. Skala Log2 mewakili nilai log2 (perubahan lipatan) antara tumbuhan yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, yang diperoleh daripada ladang lupin, Wizhenica, Poland, 1999) dan tumbuhan kawalan (yang diinokulasi palsu) pada titik masa yang sama. Garisan lupin daun sempit berikut telah dianalisis: 83A:476 (tahan, membawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui), Mandelup (sederhana tahan, membawa alel AnMan homozigot), dan Populasi 22660 (mudah terdedah).
Berdasarkan hasil analisis ekspresi pembezaan dan mungkin terlibat dalam tindak balas pertahanan terhadap kulat patogen, set tujuh gen ini dipilih untuk kuantifikasi profil ekspresi melalui PCR masa nyata (Jadual Tambahan S9).
Gen protein putatif TanjilG_10657 telah diinduksi secara signifikan dalam semua garisan dan titik masa yang dikaji berbanding tumbuhan kawalan (mimik) (Jadual Tambahan S10, S11). Di samping itu, profil ekspresi TanjilG_10657 menunjukkan trend peningkatan sepanjang eksperimen untuk semua garisan. Populasi 22660 menunjukkan sensitiviti tertinggi TanjilG_10657 terhadap inokulasi dengan pengaktifan 114 kali ganda dan tahap ekspresi relatif tertinggi (4.4 ± 0.4) pada 24 HPI (Rajah 6a). Gen protein PR10 LlR18A TanjilG_27015 juga menunjukkan pengaktifan merentasi semua garisan dan titik masa, dengan kepentingan statistik pada kebanyakan titik data (Rajah 6b). Sama seperti TanjilG_10657, tahap ekspresi relatif tertinggi TanjilG_27015 diperhatikan dalam 22660 populasi yang diinokulasi pada 24 HPI (19.5 ± 2.4). Gen endokitinase asid TanjilG_04706 telah meningkat dengan ketara dalam semua garisan dan pada setiap titik masa kecuali Boregine 6 hpi (Rajah 6c). Ia telah diinduksi dengan kuat pada titik masa pertama (6 HPI) pada 83A:476 (sebanyak 10.5 kali ganda) dan meningkat secara sederhana dalam garisan lain (sebanyak 6.6-7.5 kali ganda). Semasa eksperimen, ekspresi TanjilG_04706 kekal pada tahap yang sama dalam 83A:476 dan Boregine, manakala dalam Mandelup dan Populasi 22660 ia meningkat dengan ketara, mencapai nilai yang agak tinggi (masing-masing 5.9 ± 1.5 dan 6.2 ± 1.5). Gen seperti endoglucan-1,3-β-glucosidase TanjilG_23384 menunjukkan pengaktifan yang tinggi pada dua titik masa pertama (6 dan 12 hpi) dalam semua garisan kecuali populasi 22660 (Rajah 6d). Tahap ekspresi relatif tertinggi TanjilG_23384 diperhatikan pada titik masa kedua (12 hpi) dalam Mandelup (2.7 ± 0.3) dan 83A:476 (1.5 ± 0.1). Pada 24 HPI, ekspresi TanjilG_23384 agak rendah dalam semua garisan yang dikaji (dari 0.04 ± 0.009 hingga 0.44 ± 0.12).
Profil ekspresi gen terpilih (ag) yang didedahkan melalui PCR kuantitatif. Nombor 6, 12 dan 24 mewakili jam selepas vaksinasi. Gen LanDExH7 dan LanTUB6 digunakan untuk penormalan dan LanTUB6 digunakan untuk penentukuran antara siri. Bar ralat mewakili sisihan piawai berdasarkan tiga replika biologi, setiap satunya adalah purata bagi tiga replika teknikal. Kepentingan statistik perbezaan dalam tahap ekspresi antara tumbuhan yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, yang diperoleh pada tahun 1999 dari ladang lupin di Wierzenica, Poland) dan tumbuhan kawalan (yang diinokulasi olok-olok) ditanda di atas titik data (*nilai P < 0.05, **nilai P ≤ 0.01, ***nilai P ≤ 0.001). Kepentingan statistik perbezaan dalam tahap ekspresi antara tumbuhan yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, yang diperoleh pada tahun 1999 dari ladang lupin di Wierzenica, Poland) dan tumbuhan kawalan (yang diinokulasi olok-olok) ditanda di atas titik data (*nilai P < 0.05, **nilai P ≤ 0.01, ***nilai P ≤ 0.001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен гля 1999 г. в Верженице, Польша) dan контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*знач0начех, **знач0начен P. 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Perbezaan tahap ekspresi yang signifikan secara statistik antara tumbuhan yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, yang diperoleh pada tahun 1999 dari ladang lupin di Wierzhenice, Poland) dan tumbuhan kawalan (yang diinokulasi palsu) dicatatkan di atas titik data (*nilai P < 0.05, **nilai P ≤ 0.01, ***nilai P ≤ 0.001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据為0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接秗 （接秗水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученлый спой Верженице, Польша, в 1999 г.) dan контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками (* , 0 нных для инокулированными) P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Perbezaan tahap ekspresi yang signifikan secara statistik antara tumbuhan yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, yang diperoleh daripada ladang lupin di Verzhenice, Poland, pada tahun 1999) dan tumbuhan kawalan (yang diinokulasi palsu) dicatatkan di atas titik data (*Nilai P < 0.05, **Nilai P ≤ 0.01, ***Nilai P ≤ 0.001).Garisan NLL yang dianalisis ialah: 83A:476 (tahan, membawa alel Lanr1 homozigot), Mandelup (sederhana tahan, membawa alel AnMan homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui) dan populasi 22660 (rentan).
Gen calon TanjilG_05042 pada lokus Lanr1 menunjukkan corak ekspresi yang sangat berbeza daripada profil yang diperoleh daripada kajian RNA-seq (Rajah 6e). Pengaktifan gen ini yang ketara diperhatikan dalam Mandelup dan populasi 22660 (sehingga 39.7 dan 11.7 kali ganda, masing-masing), menghasilkan tahap ekspresi yang agak tinggi (sehingga 1.4 ± 0.14 dan 7.2 ± 1.3, masing-masing). 83A:476 juga mendedahkan beberapa peningkatan regulasi gen TanjilG_05042 (sehingga 3.8 kali ganda), walau bagaimanapun, tahap ekspresi relatif yang dicapai (0.044 ± 0.002) adalah lebih daripada 30 kali ganda lebih rendah daripada yang diperhatikan dalam Mandelup dan populasi 22660. yang dianalisis melalui qPCR menunjukkan perbezaan ketara dalam tahap ekspresi antara genotip dalam varian yang divaksin olok-olok (kawalan), mencapai perbezaan 58 kali ganda antara populasi 22660 dan 83A:476, serta antara populasi 22660 dan 22660. Perbezaan dua kali ganda telah dicapai antara Boregine dan Mandalup.
Gen calon pada lokus AnMan, TanjilG_12861, diaktifkan sebagai tindak balas kepada vaksinasi dalam 83A:476 dan Mandelup, adalah neutral dalam populasi 22660, dan telah dikurangkan regulasi dalam Boregine (Rajah 6f). Ekspresi relatif gen TanjilG_12861 adalah yang tertinggi dalam 83A: 476 yang diinokulasi (0.14±0.01). Gen protein kejutan haba kelas I 17.4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 menunjukkan tahap ekspresi relatif yang lebih rendah dalam semua strain dan titik masa yang dikaji (Rajah 6g). Nilai tertinggi diperhatikan pada 24 HPI dalam populasi 22660 (0.14 ± 0.02, peningkatan lapan kali ganda dalam tindak balas kepada vaksinasi).
Perbandingan profil ekspresi gen (Rajah 7) mendedahkan korelasi yang tinggi antara TanjilG_10657 dan empat gen lain: TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.80), dan TanjilG_04706 (r = 0.79). Keputusan sedemikian mungkin menunjukkan pengawalaturan bersama gen ini semasa tindak balas pertahanan. Gen TanjilG_12861 dan TanjilG_23384 menunjukkan profil ekspresi yang berbeza dengan nilai pekali korelasi Pearson yang lebih rendah (masing-masing dari 0.08 hingga 0.43 dan -0.19 hingga 0.28) berbanding gen lain.
Korelasi antara profil ekspresi gen dikesan menggunakan PCR kuantitatif. Garisan lupin daun sempit berikut dianalisis: 83A:476 (tahan, membawa alel Lanr1 homozigot), Mandelup (sederhana tahan, membawa alel AnMan homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui), dan Populasi 22660 (mudah terdedah). Tiga titik masa dikira (6, 12 dan 24 jam selepas inokulasi), termasuk tumbuhan yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, diperoleh daripada ladang lupin di Wierzhenice, Poland, pada tahun 1999) dan tumbuhan kawalan (yang diinokulasi palsu). Skala tersebut menunjukkan nilai pekali korelasi Pearson.
Berdasarkan data yang diperoleh pada 6 kuasa kuda seinci, WGCNA telah dijalankan pada 9981 DEG yang dikenal pasti dengan membandingkan loji yang diinokulasi dan loji kawalan untuk menumpukan pada tindak balas pertahanan awal (Jadual Tambahan S12). Dua puluh dua modul gen (kelompok) ditemui dengan profil ekspresi berkorelasi (positif atau negatif) antara genotip dan varian eksperimen. Secara purata, tahap ekspresi gen menurun mengikut susunan 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (walau bagaimanapun, dalam kedua-dua varian, trend ini lebih kuat dalam tumbuhan kawalan). Secara purata, tahap ekspresi gen menurun mengikut susunan 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (walau bagaimanapun, dalam kedua-dua varian, trend ini lebih kuat dalam tumbuhan kawalan). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (в обоих вариантах, одтанакон, бел сильнее у контрольных растений). Secara purata, tahap ekspresi gen menurun dalam susunan 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (walau bagaimanapun, dalam kedua-dua varian, trend ini lebih kuat dalam tumbuhan kawalan).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> populasi 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 在 种 中植物 中 更） .. . . . . . . . . . . . . . . . . . В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (однако в обоих вариантах эта тенд контрольных растений). Secara purata, tahap ekspresi gen menurun dalam siri 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (walau bagaimanapun, dalam kedua-dua varian, trend ini lebih kuat dalam tumbuhan kawalan).Vaksinasi mengakibatkan peningkatan regulasi ekspresi gen, terutamanya dalam modul 18, 19, 14, 6 dan 1 (dalam susunan kesan menurun), regulasi negatif (cth. modul 9 dan 20) atau dengan kesan neutral (cth. modul 11, 22, 8 dan 13). Analisis pengayaan istilah GO (Jadual Tambahan S13) mendedahkan "GO: 0006952 Respons pelindung" untuk modul yang diinokulasi (18) dengan pengaktifan maksimum, termasuk gen yang dianalisis oleh qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 dan TanjilG_27015), serta banyak modul fotosintesis Inokulasi yang paling ditindas (9). Penumpu Modul 18 (Rajah 8) telah dikenal pasti sebagai gen TanjilG_26536 yang mengekod protein LlR18B seperti PR-10, dan penumpu modul 9 telah dikenal pasti sebagai gen TanjilG_28955 yang mengekod protein fotosistem II PsbQ. Satu calon gen rintangan antraknos Lanr1, TanjilG_05042, ditemui dalam modul 22 (Rajah 9) dan dikaitkan dengan istilah “GO:0044260 Proses metabolik makromolekul selular” dan “GO:0006355 Pengaturcaraan transkripsi, templat DNA” yang membawa hab TanjilG_01212. Gen tersebut mengekod faktor transkripsi tekanan haba A-4a (HSFA4a).
Analisis rangkaian berwajaran bagi ekspresi bersama gen modul dengan istilah proses biologi yang terlalu diwakili “GO: 0006952 Respons pertahanan”. Ligasi telah dipermudahkan untuk menonjolkan empat gen yang dianalisis oleh qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 dan TanjilG_27015).
Analisis rangkaian berwajaran bagi ekspresi bersama gen bagi modul dengan istilah proses biologi yang terlalu diwakili “GO: 0006355: Pengaturcaraan transkripsi, templat DNA” dan membawa calon gen rintangan antraknos Lanr1 TanjilG_05042. Ligasi telah dipermudahkan untuk mengasingkan gen TanjilG_05042 dan gen pusat TanjilG_01212.
Saringan rintangan antraknos yang dikumpulkan di Australia menunjukkan bahawa kebanyakan kultivar yang dikeluarkan awal adalah mudah terdedah; Kalya, Coromup dan Mandelup telah digambarkan sebagai tahan sederhana, manakala Wonga, Tanjil dan 83A:476 telah digambarkan sebagai sangat tahan26,27,31. mempunyai alel rintangan yang sama, yang dinamakan Lanr1, dan Coromup dan Mandelup mempunyai alel yang berbeza, yang dinamakan AnMan10, 26, 39, manakala Kalya mewariskan alel yang berbeza., Lanr2. Saringan untuk rintangan antraknos di Jerman menghasilkan pengenalpastian garisan tahan Bo7212 dengan alel calon selain Lanr1, yang dinamakan LanrBo36.
Kajian kami mendedahkan frekuensi yang sangat rendah (kira-kira 6%) bagi alel Lanr1 dalam plasma nutfah yang diuji. Pemerhatian ini selaras dengan keputusan penyaringan plasma nutfah Eropah Timur menggunakan penanda Anseq3 dan Anseq4, yang menunjukkan bahawa alel Lanr1 hanya terdapat dalam dua garisan Belarusia. Ini menunjukkan bahawa alel Lanr1 belum digunakan secara meluas oleh program pembiakan tempatan, tidak seperti di Australia, di mana ia merupakan salah satu alel utama untuk pembiakan berbantukan penanda. Ini mungkin disebabkan oleh tahap rintangan yang lebih rendah yang disediakan oleh alel Lanr1 dalam keadaan lapangan Eropah berbanding laporan Australia. Di samping itu, kajian antraknos di kawasan hujan tinggi di Australia telah menunjukkan bahawa tindak balas rintangan yang dimediasi oleh alel Lanr1 mungkin tidak berkesan dalam keadaan cuaca yang menggalakkan pertumbuhan dan perkembangan pesat patogen19,42. Malah, dalam kajian ini, beberapa gejala antraknos juga diperhatikan dalam genotip yang membawa alel Lanr1, menunjukkan bahawa rintangan mungkin hilang di bawah keadaan optimum untuk perkembangan C. lupini. Di samping itu, tafsiran positif palsu tentang kehadiran penanda Anseq3 dan Anseq4, yang terletak kira-kira 1 cM dari lokus Lanr1, adalah mungkin 28,30,43.
Kajian kami menunjukkan bahawa 83A:476, yang membawa alel Lanr1, bertindak balas terhadap inokulasi C. lupini dengan pengaturcaraan semula transkriptom berskala besar pada titik masa pertama yang dianalisis (6 hpi), manakala di Mandelup, yang membawa alel AnMan, tindak balas transkriptomik diperhatikan lebih lewat (dari 24 hingga 48 hp). Variasi temporal dalam tindak balas pertahanan ini dikaitkan dengan perbezaan dalam gejala penyakit, yang menonjolkan kepentingan pengecaman patogen awal untuk tindak balas yang berjaya terhadap rintangan. Untuk menjangkiti tisu tumbuhan, spora antraks mesti melalui beberapa peringkat perkembangan pada permukaan perumah, termasuk percambahan, pembahagian sel, dan pembentukan appressorium. Apendiks ialah struktur infektif yang melekat pada permukaan perumah dan memudahkan penembusan ke dalam tisu perumah. Oleh itu, spora C. gloeosporioides dalam ekstrak kacang pea menunjukkan pembahagian pertama nukleus selepas 75-90 minit pengeraman, pembentukan tiub germa selepas 90-120 minit, dan penindasan selepas 4 jam 45. Mangga C. gloeosporioides menunjukkan lebih daripada 40% percambahan konidia selepas 3 jam pengeraman dan kira-kira 20% pembentukan penahan selepas 4 jam. Gen CAP20 yang berkaitan dengan virulensi bagi C. gloeosporioides menunjukkan aktiviti transkripsi dalam konidia pembentuk epifit selepas pengeraman 3.5 jam dalam lilin permukaan avokado dengan kepekatan protein CAP20 yang tinggi selepas 4 jam 46 minit. Begitu juga, aktiviti gen biosintesis melanin dalam C. trifolii telah diinduksi semasa pengeraman 2 jam diikuti dengan pembentukan appressorium selepas 1 jam. Kajian tisu daun telah menunjukkan bahawa strawberi yang diinokulasi dengan C. acutatum mempunyai penekanan pertama pada 8 hpi, manakala tomato yang diinokulasi dengan C. coccodes mempunyai penekanan pertama pada 4 hpi48,49. sebahagian besarnya konsisten dengan skala masa proses jangkitan Colletotrichum spp. Respons pertahanan pantas terhadap 83A:476 mencadangkan penglibatan gen rintangan tumbuhan dan imuniti yang dicetuskan oleh efektor (ETI) dalam barisan ini, manakala respons tertangguh Mandelup menyokong hipotesis imuniti yang dicetuskan oleh corak molekul (MTI) yang berkaitan dengan mikro 50. Respons awal terhadap 83A: 476 dan Mandelup. Pertindihan separa antara gen yang dikawal selia naik atau turun dalam respons tertangguh juga menyokong konsep ini, kerana ETI sering dianggap sebagai respons MTI yang dipercepat dan dipertingkatkan yang memuncak dalam kematian sel terprogram di tapak jangkitan, yang dikenali sebagai kejutan anafilaksis 51,52.
Kebanyakan gen yang dikaitkan dengan istilah Gene Ontology GO:0006952 “Respons Pertahanan” yang terlalu banyak diwakili adalah 11 homolog protein mesej puasa 22 yang disebabkan oleh tekanan (serupa dengan SAM22) dan tujuh protein lateks utama (MLP). Protein seperti 31, 34, 43 dan 423 menunjukkan persamaan urutan. Gen seperti SAM22 menunjukkan pengaktifan yang ketara yang bertahan lebih lama, menunjukkan peningkatan tahap rintangan antraknos (83A:476 dan Boregine). Walau bagaimanapun, gen seperti MLP hanya dikurangkan regulasinya dalam garisan yang membawa alel rintangan calon (83A:476/Lanr1 pada 6 hpi dan Mandelup/AnMan pada 24 hpi). Perlu diingatkan bahawa semua homolog seperti SAM22 yang dikenal pasti berasal daripada gugusan gen yang merangkumi kira-kira 105 kb, manakala gen seperti MLP berasal daripada kawasan genom yang berasingan. Pengaktifan gen seperti SAM22 yang diselaraskan juga ditemui dalam kajian kami sebelum ini tentang rintangan NLL terhadap inokulasi Diaporthetoxica, menunjukkan bahawa ia terlibat dalam komponen mendatar tindak balas pertahanan. Kesimpulan ini juga disokong oleh laporan tindak balas positif gen seperti SAM22 terhadap kecederaan atau rawatan dengan asid salisilik, pendorong kulat, atau hidrogen peroksida.
Gen seperti MLP telah terbukti bertindak balas terhadap pelbagai tekanan abiotik dan biotik, termasuk jangkitan bakteria, virus dan kulat patogen dalam banyak spesies tumbuhan55. Arah tindak balas terhadap interaksi tertentu antara tumbuhan dan patogen adalah antara peningkatan yang ketara (iaitu, semasa serangan kapas dengan Verticillium dahliae) hingga penurunan yang ketara (iaitu, selepas jangkitan pokok epal dengan Alternaria spp.)56,57. Penurunan regulasi gen seperti MLP 423 yang ketara telah diperhatikan semasa pertahanan avokado terhadap jangkitan F. niger dan semasa jangkitan pokok epal Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola dan Alternaria alternata adalah patotip epal58,59. Di samping itu, kalus epal yang mengekspresikan gen seperti MLP 423 secara berlebihan mempunyai ekspresi gen berkaitan rintangan yang lebih rendah dan lebih mudah terdedah kepada jangkitan kulat59. Berikutan Fusarium oxysporum f, gen seperti MLP 423 juga ditindas dalam plasma nutfah kacang biasa yang tahan. cn. Jangkitan kacang 60.
Ahli lain dalam keluarga PR-10 yang dikenal pasti dalam kajian RNA-seq kami ialah gen LlR18A dan LlR18B sebagai tindak balas kepada peningkatan regulasi, serta gen yang meningkat regulasi (1 gen) atau menurun regulasi (3 gen) untuk protein pemindahan lipid DIR1. Di samping itu, WGCNA mengetengahkan gen LlR18B sebagai hab dalam modul ini, yang sangat mudah terdedah kepada vaksinasi dan membawa beberapa gen tindak balas perlindungan. Gen LlR18A dan LlR18B telah diinduksi dalam daun lupin kuning sebagai tindak balas kepada bakteria patogen, serta dalam batang NLL selepas inokulasi D. toxica, manakala homolog padi bagi gen ini, RSOsPR10, telah diinduksi dengan cepat oleh jangkitan kulat yang mungkin terlibat dalam laluan isyarat asid jasmonik53,61, 62. Gen DIR1 mengekod protein pengangkutan lipid bukan spesifik yang diperlukan untuk permulaan rintangan diperoleh sistemik (SAR). Dengan perkembangan tindak balas perlindungan, protein DIR1 diangkut dari fokus jangkitan melalui floem untuk mendorong SAR di organ yang jauh. Menariknya, gen TanjilG_02313 DIR1 telah diinduksi dengan ketara pada titik pertama dalam baris 84A:476 dan Populasi 22660, tetapi rintangan antraknos hanya berjaya berkembang dalam baris 84A:476. Ini mungkin menunjukkan beberapa subfungsionalisasi gen DIR1 dalam NLL, memandangkan tiga homolog yang tinggal bertindak balas terhadap inokulasi hanya dalam baris 83A:476 pada 6 hpi, dan tindak balas ini diarahkan ke bawah.
Dalam kajian kami, komponen paling biasa yang sepadan dengan proses biologi yang dipanggil "proses Redoks GO:0055114" ialah protein sitokrom P450, peroksidase, asid linoleik 9S-/13S-lipoksigenase dan 1-aminosiklopropana-1-karboksilik oksidase. Di samping itu, WGCNA kami mentakrifkan homolog HSFA4a sebagai modul pembawa hab seperti calon gen rintangan Lanr1 TanjilG_05042. HSFA4a ialah komponen pengawalaturan transkripsi nuklear yang bergantung kepada redoks dalam tumbuhan.
Protein sitokrom P450 ialah oksidoreduktase yang memangkinkan tindak balas hidroksilasi yang bergantung kepada NADPH dan/atau O2 dalam metabolisme primer dan sekunder, termasuk metabolisme xenobiotik, serta hormon, asid lemak, sterol, komponen dinding sel, biopolimer dan biosintesis sebatian pelindung 69. Dalam satu kajian kami, kebolehubahan dalam fungsi sitokrom P450 tumbuhan telah dikurangkan daripada -10.6 log2 (perubahan lipatan) kepada 5.7 disebabkan oleh sejumlah besar homolog yang diubah (37) dan perbezaan dalam corak tindak balas antara gen tertentu, yang mencerminkan semakan menaik. . Hanya menggunakan data RNA-seq untuk menjelaskan fungsi biologi putatif gen NLL dalam superfamili protein yang begitu besar adalah sangat spekulatif. Walau bagaimanapun, perlu diingatkan bahawa sesetengah gen sitokrom P450 dikaitkan dengan peningkatan rintangan terhadap kulat atau bakteria patogen, termasuk sumbangan kepada reaksi alahan 69,70,71.
Peroksidase Kelas III ialah enzim tumbuhan pelbagai fungsi yang terlibat dalam pelbagai proses metabolik semasa pertumbuhan dan perkembangan tumbuhan, serta sebagai tindak balas kepada tekanan persekitaran seperti kemasinan, kemarau, keamatan cahaya yang tinggi, dan serangan patogen72. Peroksidase terlibat dalam interaksi beberapa spesies tumbuhan dengan Anthracis, termasuk Stylosanthes humilis dan C. gloeosporioides, Lens culinaris dan C. truncatum, Phaseolus vulgaris dan C. lindemuthianum, Cucumis sativus dan C. lagenarium73,74,75,76. Tindak balasnya sangat pantas, kadangkala walaupun pada 4 HPI, sebelum kulat menembusi tisu tumbuhan73. Gen peroksidase juga bertindak balas terhadap inokulasi NLL D. toxica. Selain fungsi tipikalnya untuk mengawal letusan oksidatif atau menghapuskan tekanan oksidatif, peroksidase boleh mengganggu pertumbuhan patogen dengan mewujudkan halangan fizikal berdasarkan pengukuhan dinding sel semasa lignifikasi, subunit atau penghubung silang sebatian tertentu. Fungsi ini boleh dikaitkan secara in silico kepada gen TanjilG_03329 yang mengekodkan anion peroksidase pembentuk lignin putatif yang telah dikawal selia dengan ketara dalam kajian kami dalam garisan tahan 83A:476 pada 6 HPI, tetapi tidak dalam strain dan titik masa lain yang tidak bertindak balas.
9S-/13S-lipoksigenase asid linoleik merupakan langkah pertama dalam laluan oksidatif biosintesis lipid78. Hasil daripada laluan ini mempunyai pelbagai fungsi dalam pertahanan tumbuhan, termasuk pengukuhan dinding sel melalui pembentukan deposit kalos dan pektin, dan pengawalaturan tekanan oksidatif melalui penghasilan spesies oksigen reaktif79,80,81,82,83. Dalam kajian ini, ekspresi asid linoleik 9S-/13S-lipoksigenase telah diubah dalam semua strain, tetapi dalam populasi yang mudah terdedah 22660, peningkatan regulasi berlaku pada titik masa yang berbeza, manakala dalam strain yang membawa alel Lanr1 dan AnMan yang tahan, ia menekankan kepelbagaian lapisan oksilipin dalam tindak balas antraks pelindung antara genotip ini.
Homolog 1-aminosiklopropana-1-karboksilat oksidase (ACO) telah meningkat dengan ketara (9 gen) atau menurun (2 gen) apabila diinokulasi dengan lupin. Dengan dua pengecualian, semua tindak balas ini berlaku pada 6 hp. pada 83A:476. Tindak balas enzimatik yang dimediasi oleh protein ACO adalah langkah pengehad kadar dalam penghasilan etilena dan oleh itu sangat dikawal selia84. Etilena ialah hormon tumbuhan yang memainkan pelbagai peranan dalam mengawal selia perkembangan tumbuhan dan tindak balas terhadap keadaan tekanan abiotik dan biotik. Induksi transkripsi ACO dan pengaktifan laluan isyarat etilena terlibat dalam meningkatkan rintangan padi terhadap kulat hemibiotropik oryzae oryzae dengan mengawal selia penghasilan spesies oksigen reaktif dan fitoaleksin. Proses jangkitan daun yang sangat serupa yang ditemui antara M. oryzae dan C. lupini88,89, dengan latar belakang peningkatan ketara homolog ACO dalam garisan 83A:476 yang dilaporkan dalam kajian ini, mengubah kemungkinan memberikan rintangan kepada NLL antraknos Etilena, langkah pusat isyarat dalam laluan molekul.
Dalam kajian ini, penindasan berskala besar bagi banyak gen yang berkaitan dengan fotosintesis diperhatikan pada 6 hpi dalam 83A:476 dan pada 48 hpi di Mandeloop dan populasi 22660. Tahap dan perkembangan perubahan ini adalah berkadar terus dengan tahapnya. Rintangan antraknos diperhatikan dalam eksperimen ini. Baru-baru ini, penindasan transkrip berkaitan fotosintesis yang kuat dan awal telah dilaporkan dalam beberapa model interaksi tumbuhan-patogen, termasuk bakteria patogen dan kulat. Ketergesa-gesa (daripada 2 HPI dalam beberapa interaksi) dan penindasan global gen yang berkaitan dengan fotosintesis sebagai tindak balas terhadap jangkitan boleh mencetuskan imuniti tumbuhan berdasarkan penggunaan spesies oksigen reaktif dan interaksi mereka dengan laluan asid salisilik untuk menjadi perantara reaksi alahan 90,94.
Kesimpulannya, mekanisme tindak balas pertahanan yang dicadangkan untuk keturunan yang paling tahan (83A:476) termasuk pengecaman patogen yang cepat oleh gen R (mungkin TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) dan isyarat asid salisilik dan etilena yang dimediasi tindak balas alahan, diikuti dengan pembentukan SAR jarak jauh. Tindakan ini disokong oleh protein DIR-1. Perlu diingatkan bahawa tempoh biotropik untuk jangkitan C. lupini adalah sangat pendek (kira-kira 2 hari), diikuti oleh pertumbuhan nekrotik95. Peralihan antara peringkat ini mungkin dikaitkan dengan nekrosis dan ekspresi protein yang boleh diinduksi etilena yang bertindak sebagai pencetus untuk tindak balas hipersensitiviti dalam tumbuhan perumah. Oleh itu, tempoh masa untuk penangkapan C. lupini yang berjaya pada peringkat biotropik adalah sangat sempit. Pengaturcaraan semula gen yang berkaitan dengan redoks dan fotosintesis yang diperhatikan dalam 83A:476 pada 6 hpi adalah konsisten dengan perkembangan hifa kulat dan menandakan perkembangan tindak balas perlindungan yang berjaya pada peringkat biotropik. Respons transkriptomik Mandelup dan populasi 22660 mungkin terlalu lambat untuk menangkap kulat sebelum beralih kepada pertumbuhan nekrotik, walau bagaimanapun, Mandelup mungkin lebih berkesan daripada populasi 22660 kerana pengawalaturan protein PR-10 yang agak pantas menggalakkan rintangan mendatar.
ETI, didorong oleh gen R kanonik, nampaknya merupakan mekanisme biasa untuk rintangan kacang terhadap antraknos. Oleh itu, dalam model kekacang Medicago truncatula, rintangan terhadap antraknos diberikan oleh gen RCT1, ahli kelas gen R tumbuhan TIR-NBS-LRR97. Gen ini juga memberikan rintangan antraknos spektrum luas dalam alfalfa apabila dipindahkan kepada tumbuhan yang mudah terdedah. Dalam kacang biasa (P. vulgaris), lebih daripada dua dozen gen rintangan antraknos telah dikenal pasti setakat ini. Sebahagian daripada gen ini ditemui di kawasan yang kekurangan sebarang gen R kanonik, namun banyak lagi yang lain terletak di tepi kromosom yang membawa gugusan gen NBS-LRR, termasuk TIR-NBS-LRRs99. Kajian SSR seluruh genom juga mengesahkan perkaitan gen NBS-LRR dengan rintangan antraknos dalam kacang biasa. Gen R kanonik juga ditemui di kawasan genomik yang membawa lokus rintangan antraknos utama dalam lupin putih 101.
Kerja kami menunjukkan bahawa tindak balas rintangan segera, yang diaktifkan pada peringkat awal jangkitan tumbuhan (sebaik-baiknya tidak lewat daripada 12 hpi), berkesan melindungi lupin berdaun sempit daripada antraknos yang disebabkan oleh kulat patogen Collelotrichum lupini. Menggunakan penjujukan daya pemprosesan yang tinggi, kami menunjukkan profil ekspresi berbeza gen rintangan antraknos dalam tumbuhan NLL yang dimediasi oleh gen rintangan Lanr1 dan AnMan. Pertahanan yang berjaya melibatkan reka bentuk gen yang teliti untuk protein yang terlibat dalam redoks, fotosintesis dan patogenesis dalam beberapa jam selepas sentuhan pertama tumbuhan dengan patogen. Reaksi perlindungan yang serupa, tetapi tertangguh dari segi masa, adalah kurang berkesan dalam melindungi tumbuhan daripada penyakit. Rintangan antraks yang dimediasi oleh gen Lanr1 menyerupai tindak balas pantas tipikal gen R (imuniti yang dicetuskan oleh efektor), manakala gen AnMan kemungkinan besar memberikan tindak balas mendatar (imuniti yang dicetuskan oleh corak molekul yang berkaitan dengan mikrob), memberikan tahap kemampanan yang sederhana.
215 galur NLL yang digunakan untuk menyaring penanda antraknos terdiri daripada 74 kultivar, 60 galur yang diperoleh melalui kacukan atau pembiakan, 5 mutan, dan 76 plasma nutfah liar atau asli. Garisan tersebut berasal dari 17 negara, terutamanya dari Poland (58), Sepanyol (47), Jerman (27), Australia (26), Rusia (19), Belarus (7), Itali (5) dan galur lain dari 10 negara. Set ini juga merangkumi galur tahan rujukan: 83A:476, Tanjil, Wonga yang membawa alel Lanr1, dan Mandelup yang membawa alel AnMan. Garisan tersebut diperoleh daripada Pangkalan Data Sumber Genetik Lupin Eropah yang diselenggara oleh Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Poland (Jadual Tambahan S1).
Tumbuhan ditanam di bawah keadaan terkawal (fotoperiod 16 jam, suhu 25°C pada siang hari dan 18°C ​​pada waktu malam). Dua replika biologi telah dianalisis. DNA telah diasingkan daripada daun berusia tiga minggu menggunakan DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Jerman) mengikut protokol. Kualiti dan kepekatan DNA yang diasingkan telah dinilai melalui kaedah spektrofotometri (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Penanda AnManM1 yang menandakan gen rintangan antraknos AnMan (berasal daripada cv. Mandelup) dan penanda Anseq3 dan Anseq4 yang mengapit gen Lanr1 (berasal daripada cv. Tanjil) telah dianalisis 11,26,28. Homozigot untuk alel tahan telah dijaringkan sebagai “1”, mudah terdedah – sebagai “0”, dan heterozigot – sebagai 0.5.
Berdasarkan keputusan saringan untuk penanda AnManM1, AnSeq3 dan AnSeq4 serta ketersediaan benih untuk eksperimen susulan akhir, 50 galur NLL telah dipilih untuk fenotip rintangan antraknos. Analisis dilakukan secara berganda di rumah hijau terkawal komputer dengan fotokala 14 jam dengan julat suhu 22°C pada siang hari dan 19°C pada waktu malam. Benih dicakar (memotong lapisan benih di bahagian bertentangan embrio dengan bilah tajam) sebelum menyemai untuk mengelakkan dorman benih kerana lapisan benih terlalu keras dan untuk memastikan percambahan seragam. Tumbuhan ditanam di dalam pasu (11 × 11 × 21 cm) dengan tanah steril (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warsaw, Poland). Inokulasi telah dijalankan dengan strain Colletotrichum lupini Col-08, yang ditanam pada tahun 1999 daripada batang tumbuhan lupin berdaun sempit yang ditanam di ladang di Verzhenitsa, Greater Poland (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Dapatkan kawasan. Isolat telah dikultur dalam medium SNA pada suhu 20° C di bawah cahaya hitam selama 21 hari untuk mendorong sporulasi. Empat minggu selepas menyemai, apabila tumbuhan telah mencapai peringkat 4-6 daun, inokulasi telah dijalankan dengan menyembur dengan suspensi konidia pada kepekatan 0.5 x 106 konidia setiap ml. Selepas inokulasi, tumbuhan disimpan dalam gelap selama 24 jam pada kelembapan kira-kira 98% dan suhu 25°C untuk memudahkan percambahan konidia dan proses jangkitan. Tumbuhan kemudiannya ditanam di bawah fotoperiod selama 14 jam pada suhu 22°C siang/19°C malam dan kelembapan 70%. Skor penyakit dibuat 22 hari selepas inokulasi dan berkisar dari 0 (imun) hingga 9 (sangat mudah terdedah) bergantung pada kehadiran atau ketiadaan lesi nekrotik pada batang dan daun. Di samping itu, selepas pemarkahan, berat tumbuhan diukur. Hubungan antara genotip penanda dan fenotip penyakit dikira sebagai korelasi titik dua jujukan (ketiadaan penanda heterozigot dalam set garisan untuk analisis fenotip rintangan antraknos).