Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te blijven garanderen, zullen we de site in de tussentijd zonder stijlen en JavaScript weergeven.
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) is een peulvrucht die gebruikt wordt voor voedselproductie en bodemverbetering. De wereldwijde verspreiding van NLL als gewas heeft veel pathogene schimmels aangetrokken, waaronder lupine-anthracnose, de veroorzaker van de verwoestende anthracnoseziekte. Twee allelen, Lanr1 en AnMan, die een verhoogde resistentie verlenen, zijn gebruikt bij de veredeling van NLL, maar de onderliggende moleculaire mechanismen blijven onbekend. In deze studie werden de Lanr1- en AnMan-markers gebruikt om Europese NLL-monsters te screenen. Tests met het vaccin in een gecontroleerde omgeving bevestigden de werkzaamheid van beide resistente donoren. Differentiële genexpressieprofilering werd uitgevoerd op representatieve resistente en vatbare lijnen. Anthracnoseresistentie werd geassocieerd met overexpressie van de genontologietermen "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process" en "GO:0015979 Photosynthesis". Bovendien vertoonde de Lanr1(83A:476)-lijn een significante transcriptoomherprogrammering die snel na inoculatie optrad, terwijl de andere lijnen een vertraging van ongeveer 42 uur in deze respons lieten zien. Afweerreacties zijn geassocieerd met de TIR-NBS-, CC-NBS-LRR- en NBS-LRR-genen, 10 eiwitten die betrokken zijn bij pathogenese, lipidetransferproteïnen, endoglucan-1,3-β-glucosidase, glycine-rijke celwandproteïnen en genen uit de reactieve route van zuurstof. Vroege reacties op 83A:476, waaronder zorgvuldige onderdrukking van genen die geassocieerd zijn met fotosynthese, vielen samen met succesvolle bescherming tijdens de vegetatieve groeifase van de schimmelbiologie, wat suggereert dat een effector de immuniteit activeert. De Mandeloop-reactie wordt vertraagd, evenals de algehele horizontale sleep.
De smalbladige lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) is een eiwitrijk graangewas afkomstig uit het westelijke Middellandse Zeegebied1,2. Het wordt momenteel geteeld als voedselgewas voor dieren en mensen. Het wordt ook beschouwd als groenbemesting in vruchtwisselingssystemen vanwege stikstofbinding door symbiotische stikstofbindende bacteriën en de algehele verbetering van de bodemstructuur. NLL heeft de afgelopen eeuw een snel domesticatieproces doorgemaakt en staat nog steeds onder hoge veredelingsdruk3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Door de wijdverspreide teelt van NLL hebben pathogene schimmels nieuwe agrarische niches ontwikkeld en nieuwe gewasvernietigende ziekten veroorzaakt. Het meest opmerkelijke voor lupineboeren en -veredelaars was het verschijnen van anthracnose, veroorzaakt door de pathogene schimmel Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Het meest opmerkelijke voor lupineboeren en -veredelaars was het verschijnen van anthracnose, veroorzaakt door de pathogene schimmel Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Als u een probleem met de werking van het apparaat wilt bereiken, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Voor lupineboeren en -veredelaars was de opkomst van anthracnose, veroorzaakt door de pathogene schimmel Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13, het meest opvallend.Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 films.Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Harig。1 Als u een probleem met de werking van het apparaat wilt bereiken, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Het meest opvallend voor lupineboeren en -veredelaars is de opkomst van anthracnose, veroorzaakt door de pathogene schimmel Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.De eerste meldingen van de ziekte kwamen uit Brazilië en de Verenigde Staten, waar respectievelijk in 1912 en 1929 typische symptomen opdoken. Na ongeveer 30 jaar werd de ziekteverwekker echter aangeduid als Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf van Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.,有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.,有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in Targeted Morphology. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .en H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。en H. Schlenk, .Uit voorlopige fenotypering van de ziekte in het midden van de 20e eeuw bleek dat NLL- en gele lupine (L. luteus L.)-lijnen enige resistentie vertoonden, maar alle geteste witte lupine (L. albus L.)-lijnen bleken zeer vatbaar te zijn15,16. Studies hebben aangetoond dat de ontwikkeling van anthracnose samenhangt met verhoogde neerslag (luchtvochtigheid) en temperatuur (tussen 12 en 28 °C), wat leidt tot een doorbraak van de resistentie bij hogere temperaturen17, 18. De tijd die nodig is voor de kieming van conidia en het begin van de ziekte was zelfs vier keer korter bij 24 °C (4 uur) dan bij 12 °C (16 uur) onder omstandigheden met een hoge luchtvochtigheid19. De aanhoudende opwarming van de aarde heeft dus geleid tot de verspreiding van anthracnose. De ziekte werd echter in Frankrijk (1982) en Oekraïne (1983) waargenomen als een voorbode van een dreigende bedreiging, maar werd destijds kennelijk genegeerd door de lupine-industrie20,21. Enkele jaren later verspreidde deze verwoestende ziekte zich over de hele wereld en trof ook belangrijke lupineproducerende landen zoals Australië, Polen en Duitsland22,23,24. Na een uitbraak van anthracnose midden jaren negentig leidde uitgebreid onderzoek tot de identificatie van verschillende resistente donoren in NLL19-monsters. De resistentie van NLL tegen anthracnose wordt beheerst door twee afzonderlijke dominante allelen die in verschillende kiemplasmabronnen voorkomen: Lanr1 in de cultivars Tanjil en Wonga en AnMan in de cultivar Mandalay 25, 26. Deze allelen vormen een aanvulling op de moleculaire merkers die de selectie van resistent kiemplasma in veredelingsprogramma's ondersteunen25,26,27,28,29,30. De resistente veredelingslijn 83A:476, die het Lanr1-allel draagt, werd gekruist met de vatbare wilde lijn P27255 om een ​​RIL-populatie te verkrijgen die segregeert voor resistentie tegen anthracnose. Hierdoor kon de Lanr1-locus worden toegewezen aan chromosoom NLL-1131, 32, 33. Uitlijning van koppelingskaartmarkers van flankerende resistentieloci tegen anthracnose met een genomisch raamwerk, NLL, onthulde de locatie van alle drie de allelen op hetzelfde chromosoom (NLL-11), maar op verschillende posities29,34,35. Vanwege het kleine aantal RIL's en de grote genetische afstand tussen markers en corresponderende allelen kunnen echter geen betrouwbare conclusies worden getrokken over de onderliggende genen. Aan de andere kant is het gebruik van reverse genetics bij lupinen lastig vanwege hun zeer lage regeneratievermogen, wat genetische manipulatie omslachtig maakt37.
De ontwikkeling van gedomesticeerd kiemplasma met het gewenste allel in homozygote vorm, zoals 83A:476 (Lanr1) en Mandelup (AnMan), heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoek naar resistentie tegen anthracnose in het licht van de aanwezigheid van tegengestelde allelcombinaties in wilde populaties. Mogelijkheden voor moleculaire mechanismen. Vergelijking van afweerreacties gegenereerd door specifieke genotypen. Deze studie evalueerde de vroege transcriptoomrespons van NLL op vaccinatie met C. lupini. Eerst werd een Europees NLL-kiemplasmapanel met 215 lijnen gescreend met behulp van moleculaire merkers die de Lanr1- en AnMan-allelen markeren. Vervolgens werd anthracnose-fenotypering uitgevoerd op 50 NLL-lijnen, die eerder waren geselecteerd op basis van moleculaire merkers, onder gecontroleerde omstandigheden. Op basis van deze experimenten werden vier lijnen geselecteerd die verschilden in anthracnose-resistentie en Lanr1/AnMan-allelsamenstelling voor differentiële expressieprofilering van afweergenen met behulp van twee complementaire benaderingen: high-throughput RNA-sequencing en real-time PCR-kwantificatie.
Screening van een set NLL-kiemplasma (N = 215) met de merkers Lanr1 (Anseq3 en Anseq4) en AnMan (Anseq4) en AnMan (AnManM1) toonde aan dat slechts één lijn (95726, nabij Salamanca-b) het "resistentie"-allel voor alle merkers amplificeert, terwijl "Aanwezigheid van 'vatbare' allelen" het aandeel van alle merkers in 158 (~73,5%) lijnen aantoonde. Dertien lijnen produceerden twee "resistente" allelen van de Lanr1-merker en 8 lijnen produceerden "resistente" allelen van de Lanr1-merker. Het "resistentie"-allel van de AnMan-merker (aanvullende tabel S1). Twee lijnen waren heterozygoot voor de Anseq3-merker en één heterozygoot voor de AnManM1-merker. 42 lijnen (19,5%) vertoonden tegengestelde fasen van de Anseq3- en Anseq4-allelen, wat wijst op een hoge frequentie van recombinatie tussen deze twee loci. Anthracnose-fenotypen onder gecontroleerde omstandigheden (aanvullende tabel S2) lieten variabiliteit zien in de resistentie van de geteste genotypen, wat zich weerspiegelde in de ernst van de anthracnose. De verschillen in gemiddelde scores varieerden van 1,8 (matig resistent) tot 6,9 (vatbaar) en de verschillen in plantgewicht varieerden van 0,62 (vatbaar) tot 4,45 g (resistent). Er was een significante correlatie tussen de waarden die werden waargenomen in twee herhalingen van het experiment (0,51 voor de ernst van de ziekte, P = 0,00017 en 0,61 voor het plantgewicht, P < 0,0001), evenals tussen deze twee parameters (− 0,59 en − 0,77, P < 0,0001). Er was een significante correlatie tussen de waarden die werden waargenomen in twee herhalingen van het experiment (0,51 voor de ernst van de ziekte, P = 0,00017 en 0,61 voor het plantgewicht, P < 0,0001), evenals tussen deze twee parameters (−0,59 en −0,77, P < 0,0001). Als u een kredietkaart wilt kopen, kunt u deze in uw levensonderhoud voorzien эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 en 0,61 для массы растения, P < 0,0001), en также между двумя параметрами (-0,59 en -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Er werd een significante correlatie gevonden tussen de waarden die werden waargenomen in twee herhalingen van het experiment (0,51 voor de ernst van de ziekte, P = 0,00017 en 0,61 voor het plantgewicht, P < 0,0001), evenals tussen deze twee parameters (-0,59 en -0,77, P < 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为0,51，P = 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77，P < 0,0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0,59 和– 0,59 °C – 0,59 和– 0,59 和- 0,77，P < 0,0001)。 Als u een kredietverzekering wilt afsluiten, kunt u dit in de toekomst doen повторностях (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 en масса растения 0,61, P <0,0001), en между этими двумя параметрами (-0,59 en -0,0001) 0,77, P <0,0001. Er was een significante correlatie tussen de waarden die in duplo werden waargenomen (ziekte-ernstscore 0,51, P = 0,00017 en plantgewicht 0,61, P < 0,0001) en tussen deze twee parameters (-0,59 en -0,0001) 0,77, P<0,0001. ).Typische symptomen bij vatbare planten zijn onder andere knikken en verdraaien van de stengel, wat lijkt op een "herdersboog", gevolgd door ovale laesies met oranje/roze sporozoïeten (aanvullende figuur 1). Australische lijnen die de genen Lanr1 (83A:476 en Tanjil) en AnMan (Mandelup) dragen, zijn matig resistent (respectievelijk 0,0331 en 0,0036). Sommige lijnen die ook "resistente" Lanr1- en/of AnMan-allelen dragen, vertonen symptomen van de ziekte.
Interessant genoeg vertoonden enkele NLL-lijnen zonder resistentiemarker-allel een hoge mate van resistentie tegen anthracnose (vergelijkbaar met of hoger dan die van Lanr1- of AnMan-genotypen), zoals Boregine (P-waarde < 0,0001 voor beide parameters), Bojar (P-waarde < 0,0001 voor de score en 0,001 voor het plantgewicht) en Populatie B-549/79b (P-waarde < 0,0001 voor de score en niet significant voor het gewicht). Interessant genoeg vertoonden enkele NLL-lijnen zonder resistentiemarker-allel een hoge mate van resistentie tegen anthracnose (vergelijkbaar met of hoger dan die van Lanr1- of AnMan-genotypen), zoals Boregine (P-waarde < 0,0001 voor beide parameters), Bojar (P-waarde < 0,0001 voor de score en 0,001 voor het plantgewicht) en Populatie B-549/79b (P-waarde < 0,0001 voor de score en niet significant voor het gewicht). Als u NLL niet gebruikt, kunt u een «резистентного» аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый en более высокий, чем для генотипов Lanr1 en AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки en 0,001 для массы растения) en популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Interessant genoeg vertoonden verschillende NLL-lijnen zonder 'resistent' marker-allel een hoge mate van resistentie tegen anthracnose (vergelijkbaar met of hoger dan die van Lanr1- of AnMan-genotypen), zoals Boregine (P-waarde < 0,0001 voor beide parameters), Bojar (P-waarde < 0,0001 voor evaluatie en 0,001 voor plantgewicht) en populatie B-549/79b (P-waarde < 0,0001 voor evaluatie en niet significant voor gewicht).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1或AnMan 基因型相当或更高）,例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）,Bojar（P 值<得分为0,0001，植物重量为0,001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）。 Het is interessant dat sommige NLL-systemen die geen "antigene" merkers hebben, een hoge horizontale resistentie vertonen (gelijkwaardig aan of hoger dan de genen Lanr1 of AnMan), zoals Boregine (beide parameters P < 0,0001), Bojar (P-waarde < 0,0001, plantgewicht 0,001) en stam B-549/79b (P-waarde < 0,0001, gewicht niet significant). Als u NLL niet gebruikt, kunt u een "маркерных аллелей «резистентности» gebruiken, показали высокие уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 en ли AnMan), такие какак Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) en B-549/79b (P-значение <0,0001, масса незначительна). Interessant genoeg vertoonden sommige NLL-lijnen zonder 'resistentie'-marker-allelen een hoge mate van resistentie tegen anthracnose (vergelijkbaar met of hoger dan die van Lanr1- of AnMan-genotypen), zoals Boregine (P-waarde voor beide parameters <0,0001), Bojar (P-waarde < 0,0001, plantgewicht 0,001) en populatie B-549/79b (P-waarde < 0,0001, gewicht niet significant).Dit fenomeen suggereert de mogelijkheid van een nieuwe genetische bron van resistentie, wat de waargenomen afwezigheid van correlatie tussen markergenotypen en ziektefenotypen verklaart (P-waarden van ~0,42 tot ~0,98). De Kolmogorov-Smirnov-test toonde aan dat de gegevens over anthracnoseresistentie bij benadering normaal verdeeld waren voor scores (P-waarden 0,25 en 0,11) en plantmassa (P-waarden 0,47 en 0,55), wat mijn hypothese ondersteunt dat er meer allelen dan Lanr1 en AnMan bij betrokken zijn.
Op basis van de resultaten van de screening op resistentie tegen miltvuur werden 4 lijnen geselecteerd voor transcriptoomanalyse: 83A:476, Boregine, Mandelup en Population 22660. Deze lijnen werden opnieuw getest op resistentie tegen miltvuur in inoculatie-experimenten door middel van RNA-sequencing, mits ze dezelfde resultaten vertoonden als in de vorige test. De scorewaarden waren als volgt: Boregine (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) en Population 22660 (6,11 ± 1,29).
Het Illumina NovaSeq 6000-protocol behaalde gemiddeld 40,5 Mread-paren per monster (29,7 tot 54,4 Mreads) (aanvullende tabel S3). De alignmentscores in de referentiesequentie varieerden van 75,5% tot 88,6%. De gemiddelde correlatie van de read count-gegevens tussen experimentele varianten in biologische replicaten varieerde van 0,812 tot 0,997 (gemiddeld 0,959). Van de 35.170 geanalyseerde genen vertoonden 2917 geen expressie, en de overige 4785 genen werden op een verwaarloosbaar niveau tot expressie gebracht (basisgemiddelde < 5). Van de 35.170 geanalyseerde genen vertoonden 2917 geen expressie, en de overige 4785 genen werden op een verwaarloosbaar niveau tot expressie gebracht (basisgemiddelde < 5). Op 35 170 apparaten in 2917 zonder benodigdheden, en op 4785 stuks базовое среднее <5). Van de 35.170 geanalyseerde genen vertoonden 2917 geen expressie, en de overige 4785 genen werden op een verwaarloosbaar niveau tot expressie gebracht (gemiddelde basiswaarde <5).在分析的35.170 个基因中,2917 个没有表达,其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35.170 Er zijn 35 170 apparaten in 2917, zonder specificatie, en 4785 stuks незначительную экспрессию (базовое среднее значение <5). Van de 35.170 geanalyseerde genen werden er 2917 niet tot expressie gebracht en de overige 4785 genen vertoonden een verwaarloosbare expressie (basisgemiddelde <5).Het aantal genen dat tijdens het experiment als tot expressie gebracht werd beschouwd (basisgemiddelde ≥ 5) was dus 27.468 (78,1%) (aanvullende tabel S4).
Vanaf het eerste meetmoment reageerden alle NLL-lijnen op de inoculatie met C. lupini (stam Col-08) door het transcriptoom te herprogrammeren (Tabel 1). Er werden echter significante verschillen tussen de lijnen waargenomen. Zo vertoonde de resistente lijn 83A:476 (met het Lanr1-gen) een significante transcriptoomherprogrammering op het eerste meetmoment (6 uur na inoculatie), met een 31- tot 69-voudige toename van het aantal geïsoleerde genen die omhoog en omlaag werden getransformeerd in vergelijking met andere meetmomenten. Deze piek was echter van korte duur, aangezien de expressie van slechts enkele genen significant veranderd bleef op het tweede meetmoment (12 uur na inoculatie). Interessant genoeg onderging Boregine, die ook een hoge mate van resistentie vertoonde in de entproef, niet zo'n massale transcriptionele herprogrammering tijdens het experiment. Het aantal differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG) was echter gelijk voor Boregine en 83A:476 na 12 uur na inoculatie. Zowel Mandelup als populatie 22660 vertoonden DEG-pieken op het laatste meetmoment (48 l/s), wat wijst op een relatieve vertraging in de afweerreacties.
Omdat 83A:476 een massale transcriptoomherprogrammering onderging als reactie op C. lupini na 6 uur na infectie (HPI), in vergelijking met alle andere lijnen, was ongeveer 91% van de op dit tijdstip waargenomen differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGs) lijnspecifiek (Fig. 1). Er was echter enige overlap in de vroege reacties tussen de onderzochte lijnen, aangezien respectievelijk 68,5%, 50,9% en 52,6% van de DEGs in Boregine, Mandelup en populatie 22660 overlapten met die gevonden in 83A:476 op bepaalde tijdstippen. Deze DEGs vertegenwoordigden echter slechts een klein deel (0,97-1,70%) van alle momenteel gedetecteerde DEGs met behulp van 83A:476. Bovendien waren 11 differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGs) van alle lijnen op dit moment coherent (aanvullende tabellen S4-S6), waaronder gemeenschappelijke componenten van plantenafweerreacties: lipidetransferproteïne (TanjilG_32225), endoglucaan-1,3-β-glucoside-enzym (TanjilG_23384), twee stress-induceerbare eiwitten zoals SAM22 (TanjilG_31528 en TanjilG_31531), basisch latexproteïne (TanjilG_32352) en twee glycine-rijke structurele celwandproteïnen (TanjilG_19701 en TanjilG_19702). Er was ook een relatief grote overlap in transcriptoomreacties tussen 83A:476 en Boregine na 24 uur na infectie (totaal 16-38% differentieel tot expressie gebrachte genen) en tussen Mandelup en populatie 22660 na 48 uur na infectie (totaal 14-20% differentieel tot expressie gebrachte genen).
Venn-diagram dat het aantal differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG) weergeeft in smalbladige lupine (NLL)-lijnen geïnoculeerd met Colletotrichum lupini (stam Col-08, afkomstig van lupinevelden in Wierzhenice, Polen, 1999). De geanalyseerde NLL-lijnen waren: 83A:476 (resistent, met het Lanr1-allel), Boregine (resistent, genetische achtergrond onbekend), Mandelup (matig resistent, met het AnMan-allel) en populatie 22660 (zeer vatbaar). De afkorting hpi staat voor uren na vaccinatie. Nulwaarden zijn verwijderd om de grafiek te vereenvoudigen.
De set van overgeëxpresseerde genen na 6 uur na infectie werd geanalyseerd op de aanwezigheid van canonieke R-gendomeinen (aanvullende tabel S7). Deze studie onthulde transcriptoominductie van klassieke ziekteresistentiegenen met NBS-LRR-domeinen uitsluitend op positie 83A:476. Deze set bestond uit één TIR-NBS-LRR-gen (tanjilg_05042), vijf CC-NBS-LRR-genen (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 en tanjilg_16162), en vier NBS-LR (tanjilg_16162), en vier NBS-LRRE (tanjilg_16162), evenals vier NBS-Lrr (tanjilg_16162) en vier NBS-LRR (tanjilg_16162). Al deze genen hebben canonieke domeinen die in geconserveerde sequenties zijn gerangschikt. Naast de NBS-LRR-domeingenen werden verschillende RLL-kinasen geactiveerd bij 6 uur na infectie, namelijk één in Boregine (TanjilG_19877), twee in Mandelup (TanjilG_07141 en TanjilG_19877) en in populatie 22660 (TanjilG_09014 en TanjilG_10361) en twee in 83A 27:476.
Genen met een significant veranderde expressie als reactie op inoculatie met C. lupini (stam Col-08) werden onderworpen aan een Gene Ontology (GO)-verrijkingsanalyse (aanvullende tabel S8). De meest frequent oververtegenwoordigde term voor biologische processen was "GO:0006952 afweerreactie", die in 6 van de 16 (tijd × lijn) combinaties met hoge significantie voorkwam (P-waarde < 0,001) (Fig. 2). De meest frequent oververtegenwoordigde term voor biologische processen was "GO:0006952 afweerreactie", die in 6 van de 16 (tijd × lijn) combinaties met hoge significantie voorkwam (P-waarde < 0,001) (Fig. 2). Meer informatie over het gebruik van uw mobiele telefoon «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся in 6 of 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). De meest frequent oververtegenwoordigde term voor biologische processen was 'GO:0006952 afweerreactie', die in 6 van de 16 (tijd × afstamming) combinaties met hoge significantie voorkwam (P-waarde < 0,001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 De meest representatieve term voor een biologisch proces is "GO:0006952 afweerreactie", die in 6 van de 16 (tijd × lijn) combinaties voorkomt, met een hoge significantie (P-waarde < 0,001) (Figuur 2). Meer informatie over het antwoord op de vraag "GO: 0006952 Defense Response", который появлялся in 6 of 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (niveau 2). De meest frequent oververtegenwoordigde term voor biologische processen was 'GO:0006952 Defense Response', die in 6 van de 16 combinaties (tijd × lijn) met hoge significantie voorkwam (P-waarde < 0,001) (Fig. 2).Deze term was oververtegenwoordigd op twee tijdstippen in 83A: 476 en Boregine (6 en 24 uur na infectie) en op één tijdstip in Mandelup en Populatie 22660 (respectievelijk 12 en 6 uur na infectie). Dit is een verwacht resultaat, dat de antischimmelreactie van de resistente lijnen benadrukt. Bovendien reageerde 83A:476 op C. lupini door snel genen te induceren die gerelateerd zijn aan de oxidatieve burst, weergegeven door de term "GO:0055114 redoxproces", wat duidt op een specifieke afweerreactie, terwijl Boregine specifieke afweerreacties vertoonde, gerelateerd aan de term 'GO'. :0006950 Stressrespons”. Populatie 22660 activeerde de horizontale resistentiereactie waarbij secundaire metabolieten betrokken waren, wat het overmatige aantal termen “GO:0016104 Proces van triterpeenbiosynthese” en “GO:0006722 Proces van triterpeenmetabolisme” (beide termen behoren tot dezelfde set genen) benadrukte. Rekening houdend met de resultaten van de GO-termanalyse, lag de stabiliteit van de Mandelup-reactie tussen die van Boregine en populatie 22660. Daarnaast omvatten de vroege reactie 83A:476 (6 uur na infectie) en de vertraagde reactie Mandelup en populatie 22660 de term GO:0015979 'fotosynthese' en andere gerelateerde biologische processen.
De bioproces-genontologietermen die zijn geselecteerd bij de annotatie van differentieel tot expressie gebrachte genen tijdens transcriptoomreacties van smalbladige lupine (NLL) geïnoculeerd met antrax-lupine (stam Col-08, afkomstig van lupinevelden in Wierzhenice, Polen, in 1999) zijn sterk overdreven. De geanalyseerde NLL-lijnen waren: 83A:476 (resistent, met het homozygote Lanr1-allel), Boregine (resistent, onbekende genetische achtergrond), Mandelup (matig resistent, met het homozygote AnMan-allel) en populatie 22660 (vatbaar).
Omdat deze studie tot doel had genen te identificeren die bijdragen aan resistentie tegen anthracnose, werden de genen die waren toegewezen aan de GO-termen "GO: 0006952 Defensieve reacties" en "GO: 0055114 Redoxprocessen" geanalyseerd met drempelwaarden van basisgemiddelden ≥ 30 met ten minste één regel × tijdstip, waarbij statistisch significante waarden van log2 (vouwwijziging) werden gecombineerd. Het aantal genen dat aan deze criteria voldeed, was 65 voor GO:0006952 en 524 voor GO:0055114.
83A:476 onthulde twee DEG-pieken geannoteerd met de term GO:0006952, de eerste bij 6 genen per inch (64 genen, op- en neerregulatie) en de tweede bij 24 genen per inch (15 genen, alleen opregulatie). Boregine toonde ook aan dat GO:0006952 piekte op hetzelfde tijdstip, maar met minder DEG (11 en 8) en preferentiële activering. Mandeloop toonde twee pieken van GO:0006952 bij 12 en 48 HPI, beide met 12 genen (de eerste met activerende genen en de tweede met alleen onderdrukkende genen), terwijl de 22660-populatie bij 6 HPI (13 genen) een grotere dominantie van de opregulatiepiek vertoonde. Het is belangrijk op te merken dat 96,4% van de GO:0006952 DEG in deze pieken hetzelfde type respons vertoonde (omhoog of omlaag), wat wijst op een significante overlap in afweerreacties ondanks verschillen in het aantal betrokken genen. De grootste groep sequenties gerelateerd aan de term GO:0006952 codeert voor het Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-achtig), dat behoort tot de klasse 10 pathogenese-geassocieerde eiwitten (PR-10) en het kernproteïne latex-achtige (MLP-achtige) eiwit (Fig. 3). De twee groepen verschilden in de aard van de expressie en de richting van de respons. De genen die coderen voor SAM22-achtige eiwitten vertoonden een consistente en significante inductie op vroege tijdstippen (6 of 12 uur na infectie) en reageerden over het algemeen niet meer aan het einde van het experiment (48 uur na infectie), terwijl MLP-achtige eiwitten een gecoördineerde respons vertoonden bij 6 uur na infectie. Bij 83A:476 en Mandelup bij 48 hp/in reageerden vrijwel alle andere datapunten niet. Bovendien volgden de verschillen in expressieprofielen van SAM22-achtige eiwitgenen de waargenomen variabiliteit in anthracnoseresistentie, aangezien resistentere lijnen meer tijdpunten hadden waarop deze genen significant werden geïnduceerd dan vatbare lijnen. Een ander LlR18A/B-achtig PR-10-gen vertoonde een zeer vergelijkbaar expressiepatroon als het SAM22-achtige eiwitgen.
De belangrijkste componenten van het biologische proces met de term "GO:0006952 Verdedigingsreactie" en de expressiepatronen van kandidaatgenen van de Lanr1- en AnMan-allelen werden geïdentificeerd. De Log2-schaal geeft de log2-waarden (vouwwijziging) weer tussen geïnoculeerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, afkomstig van lupinevelden in Wizhenica, Polen, 1999) en controleplanten (schijngeïnoculeerd) op hetzelfde tijdstip. De volgende smalbladige lupinelijnen werden geanalyseerd: 83A:476 (resistent, met het homozygote Lanr1-allel), Boregine (resistent, genetische achtergrond onbekend), Mandelup (matig resistent, met het homozygote AnMan-allel) en Population 22660 (vatbaar).
Daarnaast werden de expressieprofielen van de RNA-seq-kandidaatgenen Lanr1 (TanjilG_05042) en AnMan (TanjilG_12861) geëvalueerd (Fig. 3). Het gen TanjilG_05042 vertoonde een significante respons (activering) bij 83A:476 alleen op het eerste tijdstip (6 uur na infectie), terwijl TanjilG_12861 significant was in Mandeloop alleen op twee tijdstippen: 6 uur na infectie (downregulatie) en 24 uur na infectie (6 uur na infectie). (instelbaar) ).
De meest overgeëxpresseerde genen in de term GO:0055114 “redoxproces” waren genen die coderen voor cytochroom P450-eiwitten en peroxidase (Fig. 4). Voor monsters geïsoleerd van 83A:476 na 6 uur na inoculatie (HPI) werden over het algemeen maximale of minimale log2-waarden (vouwwijziging) (voor 86,6% van de genen) waargenomen tussen geïnoculeerde en controleplanten, wat de hoge respons van dit genotype op inoculatie benadrukt. 83A:476 vertoonde de meest significante GO:0055114 DEG na 6 uur na inoculatie (503 genen), terwijl de rest van de lijnen na 48 uur na inoculatie (Boregine, 31 genen; Mandelup, 85 genen; en Populatie 22660, 78 genen) de meest significante vertoonde. Bij de meeste genen van de GO:0055114-familie werden twee soorten responsen op vaccinatie waargenomen (activering en remming). Interessant genoeg werd tot 97,6% van de voor de term GO: 0055114 geïdentificeerde differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGs) in Mandelupe na 48 uur aangetroffen. Deze waarnemingen suggereren dat, ondanks de significant kleinere schaal (d.w.z. het aantal gemuteerde redoxgenen, 85 versus 503), het patroon van vertraagde transcriptoomreacties van mandeloupe op anthracnose vergelijkbaar is met de vroege reactie van 83A:476. In Boregine en Populatie 22660 is deze convergentie lager, respectievelijk 51,6% en 75,6%.
De expressiepatronen van de belangrijkste componenten van de term "GO:0055114 Redoxproces" werden onthuld. De Log2-schaal geeft de log2-waarden (vouwwijziging) weer tussen geïnoculeerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, afkomstig van lupinevelden, Wizhenica, Polen, 1999) en controleplanten (schijngeïnoculeerd) op hetzelfde tijdstip. De volgende smalbladige lupinelijnen werden geanalyseerd: 83A:476 (resistent, met het homozygote Lanr1-allel), Boregine (resistent, genetische achtergrond onbekend), Mandelup (matig resistent, met het homozygote AnMan-allel) en Population 22660 (vatbaar).
83A:476 Transcriptomische reacties op inoculatie met C. lupini (stam Col-08) omvatten ook gecoördineerde silencing van genen die worden toegeschreven aan de term GO:0015979 "fotosynthese" en andere gerelateerde biologische processen (FIG. 5). Deze GO:0015979 DEG-set bevatte 105 genen die significant werden onderdrukt na 6 uur na inoculatie (hpi) bij 83A:476. In deze subset werden 37 genen ook omlaag gereguleerd in Mandelup na 48 uur na inoculatie (hpi) en 35 op hetzelfde tijdstip in de 22660-populatie, waaronder 19 DEGs die beide genotypen gemeen hadden. Geen enkele DEG gerelateerd aan term GO:0015979 werd significant geactiveerd in welke combinatie dan ook (lijn x tijd).
De expressiepatronen van de belangrijkste componenten van de term "GO:0015979 Fotosynthese" werden onthuld. De Log2-schaal geeft de log2-waarden (vouwwijziging) weer tussen geïnoculeerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, afkomstig van lupinevelden, Wizhenica, Polen, 1999) en controleplanten (schijngeïnoculeerd) op hetzelfde tijdstip. De volgende smalbladige lupinelijnen werden geanalyseerd: 83A:476 (resistent, met het homozygote Lanr1-allel), Boregine (resistent, genetische achtergrond onbekend), Mandelup (matig resistent, met het homozygote AnMan-allel) en Population 22660 (vatbaar).
Op basis van de resultaten van de differentiële expressieanalyse, en vermoedelijk betrokken bij afweerreacties tegen pathogene schimmels, werd deze set van zeven genen geselecteerd voor kwantificering van expressieprofielen door middel van real-time PCR (aanvullende tabel S9).
Het vermoedelijke eiwitgen TanjilG_10657 werd significant geïnduceerd in alle onderzochte lijnen en tijdstippen in vergelijking met controleplanten (mimic-planten) (Aanvullende tabellen S10, S11). Bovendien vertoonde het expressieprofiel van TanjilG_10657 een stijgende trend gedurende het experiment voor alle lijnen. Populatie 22660 vertoonde de hoogste gevoeligheid van TanjilG_10657 voor inoculatie met een 114-voudige activering en het hoogste relatieve expressieniveau (4,4 ± 0,4) na 24 uur na inoculatie (Fig. 6a). Het PR10 LlR18A-eiwitgen TanjilG_27015 vertoonde ook activering in alle lijnen en op alle tijdstippen, met statistische significantie bij de meeste datapunten (Fig. 6b). Net als bij TanjilG_10657 werd het hoogste relatieve expressieniveau van TanjilG_27015 waargenomen in de geïnoculeerde populatie 22660 na 24 uur na inoculatie (19,5 ± 2,4). Het gen voor zure endochitinase TanjilG_04706 werd significant opgereguleerd in alle lijnen en op alle tijdstippen, behalve in Boregine na 6 uur na inoculatie (Fig. 6c). Het werd sterk geïnduceerd op het eerste tijdstip (6 uur na inoculatie) in 83A:476 (met een factor 10,5) en matig verhoogd in de andere lijnen (met een factor 6,6-7,5). Gedurende het experiment bleef de expressie van TanjilG_04706 op een vergelijkbaar niveau in 83A:476 en Boregine, terwijl deze in Mandelup en populatie 22660 significant toenam en relatief hoge waarden bereikte (respectievelijk 5,9 ± 1,5 en 6,2 ± 1,5). Het endoglucan-1,3-β-glucosidase-achtige gen TanjilG_23384 vertoonde een hoge activatie op de eerste twee tijdstippen (6 en 12 uur na infectie) in alle lijnen, behalve populatie 22660 (Fig. 6d). De hoogste relatieve expressieniveaus van TanjilG_23384 werden waargenomen op het tweede tijdstip (12 uur na infectie) in Mandelup (2,7 ± 0,3) en 83A:476 (1,5 ± 0,1). Na 24 uur na infectie was de expressie van TanjilG_23384 relatief laag in alle onderzochte lijnen (van 0,04 ± 0,009 tot 0,44 ± 0,12).
Expressieprofielen van geselecteerde genen (ag) onthuld door kwantitatieve PCR. De getallen 6, 12 en 24 vertegenwoordigen uren na vaccinatie. De genen LanDExH7 en LanTUB6 werden gebruikt voor normalisatie en LanTUB6 werd gebruikt voor inter-serie kalibratie. Foutbalken representeren de standaarddeviatie gebaseerd op drie biologische replicaten, waarvan elk het gemiddelde is van drie technische replicaten. De statistische significantie van de verschillen in expressieniveaus tussen de geïnoculeerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkregen in 1999 van een lupineveld in Wierzenica, Polen) en de controleplanten (schijngeïnoculeerd) is boven de datapunten aangegeven (*P-waarde < 0,05, **P-waarde ≤ 0,01, ***P-waarde ≤ 0,001). De statistische significantie van de verschillen in expressieniveaus tussen de geïnoculeerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkregen in 1999 van een lupineveld in Wierzenica, Polen) en de controleplanten (schijngeïnoculeerd) is boven de datapunten aangegeven (*P-waarde < 0,05, **P-waarde ≤ 0,01, ***P-waarde ≤ 0,001). Colletotrichum lupini, van Col-08, geboren in 1999 in Верженице, Польша) en контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Statistisch significante verschillen in expressieniveaus tussen geïnoculeerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, verkregen in 1999 van een lupineveld in Wierzhenice, Polen) en controleplanten (schijngeïnoculeerd) worden boven de datapunten aangegeven (*P-waarde < 0,05, **P-waarde ≤ 0,01, ***P-waarde ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini, Col-08株, 1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001)。接种 (colletotrichum lupini, kleur-08 株, 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得) 和 对照 (接种 植物)之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина in Верженице, Sinds 1999 en контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Statistisch significante verschillen in expressieniveaus tussen geïnoculeerde (Colletotrichum lupini, stam Col-08, afkomstig van lupinevelden in Verzhenice, Polen, in 1999) en controleplanten (schijngeïnoculeerd) worden boven de datapunten aangegeven (*P-waarde < 0,05, **P-waarde ≤ 0,01, ***P-waarde ≤ 0,001).De geanalyseerde NLL-lijnen waren: 83A:476 (resistent, met het homozygote Lanr1-allel), Mandelup (matig resistent, met het homozygote AnMan-allel), Boregine (resistent, onbekende genetische achtergrond) en populatie 22660 (vatbaar).
Het kandidaatgen TanjilG_05042 op de Lanr1-locus vertoonde een opvallend ander expressiepatroon dan de profielen verkregen uit RNA-seq-onderzoeken (Fig. 6e). Significante activering van dit gen werd waargenomen in Mandelup en de 22660-populatie (respectievelijk tot 39,7 en 11,7 keer hoger), wat resulteerde in relatief hoge expressieniveaus (respectievelijk tot 1,4 ± 0,14 en 7,2 ± 1,3). 83A:476 liet ook enige opregulatie van het TanjilG_05042-gen zien (tot 3,8 keer hoger), maar de bereikte relatieve expressieniveaus (0,044 ± 0,002) waren meer dan 30 keer lager dan die waargenomen in Mandelup en de 22660-populatie. Analyse met qPCR toonde significante verschillen in expressieniveaus tussen genotypen in schijngevaccineerde (controle) varianten, met een 58-voudig verschil tussen populaties 22660 en 83A:476, en ook tussen populaties 22660 en 22660. Tussen Boregine en Mandalup werd een tweevoudig verschil bereikt.
Het kandidaatgen op de AnMan-locus, TanjilG_12861, werd geactiveerd als reactie op vaccinatie in 83A:476 en Mandelup, was neutraal in de 22660-populatie en werd gedownreguleerd in Boregine (Fig. 6f). De relatieve expressie van het TanjilG_12861-gen was het hoogst in geïnoculeerde 83A:476 (0,14 ± 0,01). Het gen voor het 17,4 kDa klasse I hitte-schokproteïne TanjilG_05080 HSP17.4 vertoonde lagere relatieve expressieniveaus in alle bestudeerde stammen en tijdstippen (Fig. 6g). De hoogste waarde werd waargenomen na 24 uur na vaccinatie in de 22660-populatie (0,14 ± 0,02, een achtvoudige toename als reactie op vaccinatie).
Vergelijking van genexpressieprofielen (Fig. 7) toonde een hoge correlatie aan tussen TanjilG_10657 en vier andere genen: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) en TanjilG_04706 (r = 0,79). Dergelijke resultaten kunnen wijzen op co-regulatie van deze genen tijdens afweerreacties. De genen TanjilG_12861 en TanjilG_23384 vertoonden verschillende expressieprofielen met lagere Pearson-correlatiecoëfficiëntwaarden (respectievelijk van 0,08 tot 0,43 en -0,19 tot 0,28) in vergelijking met de andere genen.
Correlaties tussen genexpressieprofielen werden gedetecteerd met behulp van kwantitatieve PCR. De volgende smalbladige lupinelijnen werden geanalyseerd: 83A:476 (resistent, met het homozygote Lanr1-allel), Mandelup (matig resistent, met het homozygote AnMan-allel), Boregine (resistent, genetische achtergrond onbekend) en Population 22660 (vatbaar). Er werden drie meetmomenten berekend (6, 12 en 24 uur na inoculatie), inclusief geïnoculeerde planten (Colletotrichum lupini, stam Col-08, afkomstig van lupinevelden in Wierzhenice, Polen, in 1999) en controleplanten (schijngeïnoculeerd). De schaal geeft de waarde van de Pearson-correlatiecoëfficiënt weer.
Op basis van gegevens verkregen bij 6 pk per inch werd WGCNA uitgevoerd op 9981 differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG) die werden geïdentificeerd door geïnoculeerde en controleplanten te vergelijken, met de focus op vroege afweerreacties (aanvullende tabel S12). Er werden 22 genmodules (clusters) gevonden met gecorreleerde (positieve of negatieve) expressieprofielen tussen genotypen en experimentele varianten. Gemiddeld daalden de genexpressieniveaus in de volgorde 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populatie 22660 (bij beide varianten was deze trend echter sterker bij de controleplanten). Gemiddeld daalden de genexpressieniveaus in de volgorde 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populatie 22660 (bij beide varianten was deze trend echter sterker bij de controleplanten). De gegevens over het land in порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populatie 22660 (in de regio, dan, dit is wat je wilt контрольных растений). Gemiddeld daalden de genexpressieniveaus in de volgorde 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populatie 22660 (bij beide varianten was deze trend echter sterker bij de controleplanten).平均而言,基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Populatie 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> Boregine> bevolking 22660 的 顺序 下降 ， 在 种 中 ， 这 种在 在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populatie 22660 (однако в обоих het is een goed idee om dit te doen растений). Gemiddeld daalden de genexpressieniveaus in de reeks 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populatie 22660 (deze trend was echter in beide varianten sterker bij de controleplanten).Vaccinatie resulteerde in een verhoogde genexpressie, met name in modules 18, 19, 14, 6 en 1 (in aflopende volgorde van effect), negatieve regulatie (bijv. modules 9 en 20) of met neutrale effecten (bijv. modules 11, 22, 8 en 13). GO-termanalyse (aanvullende tabel S13) onthulde "GO: 0006952 Beschermende reacties" voor de geïnoculeerde module (18) met maximale activering, inclusief genen geanalyseerd met qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 en TanjilG_27015), evenals vele modules met de meest onderdrukte fotosynthese (9). De concentrator van module 18 (Fig. 8) werd geïdentificeerd als het gen TanjilG_26536 dat codeert voor het PR-10-achtige LlR18B-eiwit, en de concentrator van module 9 werd geïdentificeerd als het gen TanjilG_28955 dat codeert voor het fotosysteem II PsbQ-eiwit. Een kandidaat-gen voor anthracnoseresistentie, Lanr1, TanjilG_05042, werd gevonden in module 22 (Fig. 9) en is geassocieerd met de termen "GO:0044260 Cellulaire macromoleculaire metabolische processen" en "GO:0006355 Transcriptieregulatie, DNA-templating" met de TanjilG_01212-hub. Het gen codeert voor de hittestress-transcriptiefactor A-4a (HSFA4a).
Gewogen netwerkanalyse van gen-co-expressie van modules met oververtegenwoordigde biologische procestermen “GO: 0006952 Afweerreacties”. De ligatie werd vereenvoudigd om de vier genen te benadrukken die geanalyseerd zijn met qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 en TanjilG_27015).
Gewogen netwerkanalyse van gen-co-expressie van een module met een oververtegenwoordigde biologische procesterm “GO: 0006355: Transcriptieregulatie, DNA-templating” en die een kandidaat-gen voor anthracnoseresistentie Lanr1 TanjilG_05042 bevat. De ligatie werd vereenvoudigd om het TanjilG_05042-gen en het centrale TanjilG_01212-gen te isoleren.
Uit screenings op resistentie tegen anthracnose in Australië bleek dat de meeste vroeg uitgebrachte cultivars vatbaar waren; Kalya, Coromup en Mandelup werden beschreven als matig resistent, terwijl Wonga, Tanjil en 83A:476 werden beschreven als zeer resistent26,27,31. De cultivars hadden hetzelfde resistentie-allel, aangeduid als Lanr1, terwijl Coromup en Mandelup een ander allel hadden, aangeduid als AnMan10, 26, 39, en Kalya een ander allel doorgaf, namelijk Lanr2. Screening op resistentie tegen anthracnose in Duitsland resulteerde in de identificatie van een resistente lijn Bo7212 met een kandidaat-allel anders dan Lanr1, aangeduid als LanrBo36.
Uit ons onderzoek bleek dat het Lanr1-allel in het geteste kiemplasma een zeer lage frequentie (ongeveer 6%) had. Deze waarneming komt overeen met de resultaten van screening van Oost-Europees kiemplasma met behulp van de Anseq3- en Anseq4-markers, waaruit bleek dat het Lanr1-allel slechts in twee Wit-Russische lijnen voorkomt. Dit suggereert dat het Lanr1-allel nog niet wijdverspreid wordt gebruikt in lokale veredelingsprogramma's, in tegenstelling tot Australië, waar het een van de belangrijkste allelen is voor marker-ondersteunde veredeling. Dit kan te wijten zijn aan de lagere mate van resistentie die het Lanr1-allel biedt onder Europese veldomstandigheden in vergelijking met het Australische rapport. Bovendien hebben studies naar anthracnose in gebieden met veel regenval in Australië aangetoond dat resistentiereacties die worden gemedieerd door het Lanr1-allel mogelijk niet effectief zijn onder weersomstandigheden die de groei en snelle ontwikkeling van de ziekteverwekker bevorderen19,42. In feite werden in de huidige studie ook enkele symptomen van anthracnose waargenomen bij genotypen die het Lanr1-allel dragen, wat suggereert dat resistentie kan verdwijnen onder optimale omstandigheden voor de ontwikkeling van C. lupini. Daarnaast zijn vals-positieve interpretaties van de aanwezigheid van de Anseq3- en Anseq4-markers, die zich op ongeveer 1 cM afstand van de Lanr1-locus bevinden, mogelijk 28,30,43.
Uit ons onderzoek bleek dat 83A:476, met het Lanr1-allel, reageerde op inoculatie met C. lupini met grootschalige transcriptoomherprogrammering op het eerste geanalyseerde tijdstip (6 uur na infectie), terwijl bij Mandelup, met het AnMan-allel, transcriptoomreacties veel later werden waargenomen (van 24 tot 48 uur na infectie). Deze temporele variaties in afweerreacties hangen samen met verschillen in ziekteverschijnselen, wat het belang van vroege herkenning van de ziekteverwekker voor een succesvolle resistentiereactie benadrukt. Om plantenweefsel te infecteren, moeten miltvuursporen verschillende ontwikkelingsstadia op het gastheeroppervlak doorlopen, waaronder kieming, celdeling en de vorming van een appressorium. Een appressorium is een infectieuze structuur die zich aan het oppervlak van de gastheer hecht en de penetratie in het gastheerweefsel vergemakkelijkt. Sporen van C. gloeosporioides in erwtenextract vertoonden de eerste deling van de kern na 75-90 minuten incubatie, de vorming van een kiembuis na 90-120 minuten en onderdrukking na 4 uur 45. Mango C. gloeosporioides vertoonde meer dan 40% conidiale kieming na 3 uur incubatie en ongeveer 20% vorming van appressoria na 4 uur. Het virulentie-geassocieerde CAP20-gen van C. gloeosporioides vertoonde transcriptionele activiteit in epifytvormende conidia na 3,5 uur incubatie in avocado-oppervlaktewas met hoge concentraties CAP20-eiwit na 4 uur 46 min. Op vergelijkbare wijze werd de activiteit van genen voor melaninebiosynthese in C. trifolii geïnduceerd tijdens een incubatie van 2 uur, gevolgd door de vorming van een appressorium na 1 uur. Uit onderzoek van bladweefsel is gebleken dat aardbeien die geïnoculeerd zijn met C. acutatum de eerste onderdrukking vertonen na 8 uur na infectie (hpi), terwijl tomaten die geïnoculeerd zijn met C. coccodes de eerste onderdrukking vertonen na 4 hpi48,49. Dit komt grotendeels overeen met de tijdschaal van het infectieproces van Colletotrichum spp. Snelle afweerreacties op 83A:476 suggereren de betrokkenheid van plantenresistentie- en effector-geïnduceerde immuniteitsgenen (ETI-genen) in deze lijn, terwijl de vertraagde reacties van Mandelup de hypothese van micro-geassocieerde moleculaire patroon-geïnduceerde immuniteit (MTI) ondersteunen 50. Vroege reacties op 83A:476 en Mandelup. De gedeeltelijke overlap tussen op- of neerwaarts gereguleerde genen in de vertraagde reactie ondersteunt dit concept ook, aangezien ETI vaak wordt beschouwd als een versnelde en versterkte MTI-reactie die culmineert in geprogrammeerde celdood op de infectieplaats, bekend als anafylactische shock 51,52.
De meeste genen die worden toegeschreven aan de oververtegenwoordigde term Gene Ontology GO:0006952 "Defense Response" zijn de 11 homologen van het stress-geïnduceerde vasten-boodschap 22-eiwit (vergelijkbaar met SAM22) en de zeven belangrijkste latex-eiwitachtige eiwitten (MLP's). De MLP-achtige eiwitten 31, 34, 43 en 423 vertoonden sequentieovereenkomst. SAM22-achtige genen vertoonden een significante activering die langer aanhield, wat leidde tot verhoogde niveaus van anthracnose-resistentie (83A:476 en Boregine). MLP-achtige genen werden echter alleen gedownreguleerd in lijnen die het kandidaat-resistentie-allel droegen (83A:476/Lanr1 na 6 uur na infectie en Mandelup/AnMan na 24 uur na infectie). Het is belangrijk op te merken dat alle geïdentificeerde SAM22-achtige homologen afkomstig zijn uit een gencluster van ongeveer 105 kb, terwijl MLP-achtige genen afkomstig zijn uit afzonderlijke regio's van het genoom. Gecoördineerde activering van dergelijke SAM22-achtige genen werd ook gevonden in ons eerdere onderzoek naar NLL-resistentie tegen Diaporthetoxica-inoculatie, wat suggereert dat ze betrokken zijn bij de horizontale componenten van de afweerreactie. Deze conclusie wordt ook ondersteund door rapporten over een positieve respons van SAM22-achtige genen op letsel of behandeling met salicylzuur, schimmelinductoren of waterstofperoxide.
Er is aangetoond dat MLP-achtige genen reageren op diverse abiotische en biotische stressfactoren, waaronder bacteriële, virale en pathogene schimmelinfecties bij veel plantensoorten55. De richting van de respons op bepaalde interacties tussen planten en pathogenen varieerde van sterk toenemend (bijvoorbeeld tijdens een besmetting van katoen met Verticillium dahliae) tot significant afnemend (bijvoorbeeld na infectie van een appelboom met Alternaria spp.)56,57. Een significante neerregulatie van het MLP-achtige 423-gen is waargenomen tijdens de afweerreactie van avocado's tegen een infectie met F. niger en tijdens infectie van de appelboom. Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola en Alternaria alternata zijn pathotypen van appels58,59. Bovendien vertoonden appelcallusweefsels die het MLP-achtige 423-gen overexpressieerden een lagere expressie van resistentie-geassocieerde genen en waren ze vatbaarder voor schimmelinfecties59. Na infectie met Fusarium oxysporum f werd ook het MLP-achtige 423-gen onderdrukt in resistent kiemplasma van gewone bonen. cn. Boneninfectie 60.
Andere leden van de PR-10-familie die in ons RNA-seq-onderzoek werden geïdentificeerd, waren de genen LlR18A en LlR18B als reactie op upregulatie, evenals het gen voor het lipidetransporteiwit DIR1 dat werd opgereguleerd (1 gen) of neerwaarts gereguleerd (3 genen). Bovendien benadrukt WGCNA het gen LlR18B als een knooppunt in deze module, dat zeer gevoelig is voor vaccinatie en verschillende beschermende responsgenen bevat. De genen LlR18A en LlR18B werden geïnduceerd in gele lupinebladeren als reactie op pathogene bacteriën, evenals in NLL-stengels na inoculatie met D. toxica, terwijl het rijsthomoloog van deze genen, RSOsPR10, snel werd geïnduceerd door een schimmelinfectie die vermoedelijk betrokken is bij de jasmijnzuursignaleringsroute53,61, 62. Het DIR1-gen codeert voor niet-specifieke lipidetransporteiwitten die nodig zijn voor het ontstaan ​​van systemische verworven resistentie (SAR). Tijdens de ontwikkeling van beschermende reacties wordt het DIR1-eiwit vanuit de infectiehaard via het floëem getransporteerd om systemische verworven resistentie (SAR) in verre organen te induceren. Interessant is dat het TanjilG_02313 DIR1-gen significant werd geïnduceerd op het eerste meetmoment in de lijnen 84A:476 en Populatie 22660, maar dat anthracnoseresistentie zich alleen succesvol ontwikkelde in lijn 84A:476. Dit kan duiden op een subfunctionalering van het DIR1-gen in NLL, aangezien de overige drie homologen alleen in lijn 83A:476 reageerden op inoculatie na 6 uur, en deze reactie was naar beneden gericht.
In ons onderzoek waren de meest voorkomende componenten die overeenkomen met het biologische proces genaamd "GO:0055114 Redoxproces" cytochroom P450-eiwit, peroxidase, linolzuur 9S-/13S-lipoxygenase en 1-aminocyclopropaan-1-carbonzuuroxidase. Bovendien definieert onze WGCNA het HSFA4a-homoloog als een hub die modules bevat zoals de Lanr1-resistentiegenkandidaat TanjilG_05042. HSFA4a is een component van de redoxafhankelijke regulatie van nucleaire transcriptie in planten.
Cytochroom P450-eiwitten zijn oxidoreductasen die NADPH- en/of O2-afhankelijke hydroxylatiereacties katalyseren in het primaire en secundaire metabolisme, waaronder het metabolisme van xenobiotica, evenals hormonen, vetzuren, sterolen, celwandcomponenten, biopolymeren en de biosynthese van beschermende verbindingen 69. In een onderzoek werd de variabiliteit in de functie van plantaardige cytochroom P450 gereduceerd van -10,6 log2 (vouwwijziging) tot 5,7 als gevolg van een groot aantal gewijzigde homologen (37) en verschillen in responspatronen tussen specifieke genen, wat een opwaartse herziening weerspiegelt. Het zou zeer speculatief zijn om alleen RNA-seq-gegevens te gebruiken om de vermeende biologische functie van de NLL-genen in zo'n grote eiwitsuperfamilie op te helderen. Het is echter de moeite waard om op te merken dat sommige cytochroom P450-genen geassocieerd zijn met een verhoogde resistentie tegen pathogene schimmels of bacteriën, waaronder een bijdrage aan allergische reacties69,70,71.
Peroxidases van klasse III zijn multifunctionele plantenenzymen die betrokken zijn bij een breed scala aan metabolische processen tijdens de groei en ontwikkeling van planten, evenals bij de reactie op omgevingsstress zoals zoutgehalte, droogte, hoge lichtintensiteit en pathogenenaanvallen72. Peroxidases spelen een rol in de interactie van verschillende plantensoorten met Anthracis, waaronder Stylosanthes humilis en C. gloeosporioides, Lens culinaris en C. truncatum, Phaseolus vulgaris en C. lindemuthianum, Cucumis sativus en C. lagenarium73,74,75,76. De reactie is zeer snel, soms zelfs al na 4 uur na infectie (HPI), voordat de schimmel het plantenweefsel binnendringt73. Het peroxidasegen reageerde ook op inoculatie met D. toxica NLL. Naast hun typische functies om de oxidatieve burst te reguleren of oxidatieve stress te elimineren, kunnen peroxidases de groei van pathogenen belemmeren door fysieke barrières te creëren op basis van celwandversterking tijdens lignificatie, subunitvorming of crosslinking van specifieke verbindingen. Deze functie kan in silico worden toegeschreven aan het gen TanjilG_03329, dat codeert voor een vermoedelijke ligninevormende anionperoxidase. Deze genexpressie was in ons onderzoek significant verhoogd in de resistente 83A:476-lijn na 6 uur na infectie, maar niet in andere stammen en op andere tijdstippen die niet reageerden.
9S-/13S-lipoxygenase van linolzuur is de eerste stap in de oxidatieve route van lipidebiosynthese78. De producten van deze route hebben meerdere functies in de plantenafweer, waaronder het versterken van de celwand door de vorming van callose- en pectine-afzettingen en het reguleren van oxidatieve stress door de productie van reactieve zuurstofsoorten79,80,81,82,83. In de huidige studie werd de expressie van linolzuur 9S-/13S-lipoxygenase gewijzigd in alle stammen, maar in de vatbare populatie 22660 was er sprake van opregulatie op verschillende tijdstippen, terwijl in stammen met het resistente Lanr1- en het AnMan-allel de diversificatie van de oxylipinelaag in beschermende antraxreacties tussen deze genotypen wordt benadrukt.
Het 1-aminocyclopropaan-1-carboxylaatoxidase (ACO)-homoloog werd significant opgereguleerd (9 genen) of neerwaarts gereguleerd (2 genen) bij inoculatie met lupine. Met twee uitzonderingen traden al deze reacties op na 6 uur bij 83A:476. De enzymatische reactie die door ACO-eiwitten wordt gemedieerd, is de snelheidsbeperkende stap in de ethyleenproductie en wordt daarom sterk gereguleerd84. Ethyleen is een plantenhormoon dat verschillende rollen speelt bij de regulering van de plantenontwikkeling en de reactie op abiotische en biotische stressomstandigheden. De inductie van ACO-transcriptie en de activering van de ethyleensignaleringsroute zijn betrokken bij het verhogen van de resistentie van rijst tegen de hemibiotrofe schimmel Oryzae oryzae door de productie van reactieve zuurstofsoorten en fytoalexinen te reguleren. Een zeer vergelijkbaar bladinfectieproces dat werd gevonden tussen M. oryzae en C. lupini88,89, tegen de achtergrond van een significante opregulatie van ACO-homologen in de 83A:476-lijn die in deze studie werd gerapporteerd, verschuift de mogelijkheid van het verlenen van resistentie tegen NLL-anthracnose-ethyleen naar een centrale signaalstap in moleculaire routes.
In de huidige studie werd grootschalige onderdrukking van veel genen geassocieerd met fotosynthese waargenomen na 6 uur na infectie (hpi) in 83A:476 en na 48 hpi in Mandeloop en de 22660-populatie. De omvang en de voortgang van deze veranderingen zijn evenredig met het niveau. Anthracnoseresistentie werd in dit experiment waargenomen. Recentelijk is sterke en vroege onderdrukking van fotosynthese-gerelateerde transcripten gerapporteerd in verschillende modellen van plant-pathogeeninteracties, waaronder pathogene bacteriën en schimmels. Snelle (vanaf 2 HPI in sommige interacties) en globale onderdrukking van genen geassocieerd met fotosynthese als reactie op infectie kunnen plantenimmuniteit opwekken op basis van de inzet van reactieve zuurstofsoorten en hun interactie met de salicylzuurroute om allergische reacties te mediëren 90,94.
Samenvattend omvatten de voorgestelde afweermechanismen voor de meest resistente lijn (83A:476) snelle pathogeenherkenning door het R-gen (vermoedelijk TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) en door allergische reacties gemedieerde signalering via salicylzuur en ethyleen, gevolgd door de totstandkoming van een SAR-werking over lange afstand. Deze werking wordt ondersteund door het DIR-1-eiwit. Het is belangrijk op te merken dat de biotrofe periode voor C. lupini-infectie zeer kort is (ongeveer 2 dagen), gevolgd door necrotische groei95. De overgang tussen deze stadia kan gepaard gaan met necrose en de expressie van ethyleen-induceerbare eiwitten die fungeren als triggers voor overgevoeligheidsreacties in waardplanten. Daarom is het tijdsvenster voor een succesvolle vangst van C. lupini in het biotrofe stadium zeer beperkt. De herprogrammering van genen geassocieerd met redox en fotosynthese, waargenomen in 83A:476 na 6 uur na infectie, is consistent met de voortgang van schimmelhyfen en luidt de ontwikkeling in van een succesvolle beschermende respons in het biotrofe stadium. De transcriptomische responsen van Mandelup en de 22660-populatie zijn mogelijk te laat om de schimmel te vangen voordat deze overgaat op necrotische groei. Mandelup is echter mogelijk effectiever dan de 22660-populatie, omdat de relatief snelle regulatie van het PR-10-eiwit horizontale resistentie bevordert.
ETI, aangedreven door het canonieke R-gen, lijkt een algemeen mechanisme te zijn voor resistentie tegen anthracnose bij bonen. Zo wordt in de modelleguminose Medicago truncatula resistentie tegen anthracnose verleend door het RCT1-gen, een lid van de TIR-NBS-LRR97 planten-R-genklasse. Dit gen verleent ook breedspectrumresistentie tegen anthracnose aan luzerne wanneer het wordt overgedragen aan vatbare planten. In de gewone boon (P. vulgaris) zijn tot nu toe meer dan twee dozijn genen voor anthracnoseresistentie geïdentificeerd. Sommige van deze genen bevinden zich in regio's zonder canonieke R-genen, maar vele andere liggen aan de randen van chromosomen die het NBS-LRR-gencluster dragen, waaronder TIR-NBS-LRRs99. Het genoombrede SSR-onderzoek bevestigde ook de associatie van het NBS-LRR-gen met anthracnoseresistentie in de gewone boon. Het canonieke R-gen werd ook aangetroffen in het genomische gebied dat het belangrijkste locus voor anthracnose-resistentie in witte lupine 101 bevat.
Ons onderzoek toont aan dat een onmiddellijke resistentiereactie, geactiveerd in een vroeg stadium van plantinfectie (bij voorkeur niet later dan 12 uur na infectie), smalbladige lupine effectief beschermt tegen anthracnose veroorzaakt door de pathogene schimmel Collelotrichum lupini. Met behulp van high-throughput sequencing hebben we differentiële expressieprofielen aangetoond van anthracnose-resistentiegenen in NLL-planten, gemedieerd door de resistentiegenen Lanr1 en AnMan. Succesvolle afweer vereist een zorgvuldige ontwerp van de genen voor eiwitten die betrokken zijn bij redoxprocessen, fotosynthese en pathogenese, binnen enkele uren na het eerste contact van de plant met een pathogeen. Soortgelijke beschermende reacties, maar met een vertraging, zijn veel minder effectief in het beschermen van planten tegen ziekten. Anthracnose-resistentie gemedieerd door het Lanr1-gen lijkt op de typische snelle respons van het R-gen (effector-geïnduceerde immuniteit), terwijl het AnMan-gen waarschijnlijk een horizontale respons levert (immuniteit geactiveerd door een micro-organisme-geassocieerd moleculair patroon), wat een gematigd niveau van duurzaamheid biedt.
De 215 NLL-lijnen die werden gebruikt voor de screening op anthracnose-markers bestonden uit 74 cultivars, 60 lijnen verkregen door kruising of veredeling, 5 mutanten en 76 wilde of oorspronkelijke kiemplasma's. De lijnen kwamen uit 17 landen, voornamelijk uit Polen (58), Spanje (47), Duitsland (27), Australië (26), Rusland (19), Wit-Rusland (7), Italië (5) en andere lijnen uit 10 landen. De set omvat ook referentieresistente lijnen: 83A:476, Tanjil, Wonga met het Lanr1-allel en Mandelup met het AnMan-allel. De lijnen werden verkregen uit de European Lupine Genetic Resource Database, beheerd door Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polen (aanvullende tabel S1).
Planten werden gekweekt onder gecontroleerde omstandigheden (fotoperiode 16 uur, temperatuur 25°C overdag en 18°C ​​'s nachts). Twee biologische replicaten werden geanalyseerd. DNA werd geïsoleerd uit drie weken oude bladeren met behulp van de DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Duitsland) volgens het protocol. De kwaliteit en concentratie van het geïsoleerde DNA werden beoordeeld met behulp van spectrofotometrische methoden (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS). De AnManM1-marker, die het anthracnose-resistentiegen AnMan markeert (afkomstig van cv. Mandelup), en de markers Anseq3 en Anseq4, die het gen Lanr1 flankeren (afkomstig van cv. Tanjil), werden geanalyseerd 11,26,28. Homozygoten voor het resistente allel werden gescoord als "1", vatbaar als "0" en heterozygoten als 0,5.
Op basis van de resultaten van de screening op de merkers AnManM1, AnSeq3 en AnSeq4 en de beschikbaarheid van zaden voor de uiteindelijke vervolgexperimenten, werden 50 NLL-lijnen geselecteerd voor fenotypering van anthracnoseresistentie. De analyse werd in duplo uitgevoerd in een computergestuurde kas met een fotoperiode van 14 uur en een temperatuur van 22 °C overdag en 19 °C 's nachts. Zaden werden vóór het zaaien ingekrast (de zaadhuid aan de tegenoverliggende zijde van het embryo werd met een scherp mesje afgesneden) om zaadkiemrust door een te harde zaadhuid te voorkomen en een uniforme kieming te garanderen. De planten werden gekweekt in potten (11 × 11 × 21 cm) met steriele grond (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warschau, Polen). De inoculatie werd uitgevoerd met de Colletotrichum lupini Col-08-stam, gekweekt in 1999 uit de stengels van smalbladige lupineplanten die groeiden op een veld in Verzhenitsa, Groot-Polen (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ O). De isolaten werden gedurende 21 dagen gekweekt in SNA-medium bij 20 °C onder zwart licht om sporulatie te induceren. Vier weken na het zaaien, toen de planten het 4-6 bladstadium hadden bereikt, werd de inoculatie uitgevoerd door te sproeien met een suspensie van conidia met een concentratie van 0,5 x 10⁶ conidia per ml. Na de inoculatie werden de planten 24 uur in het donker bewaard bij een luchtvochtigheid van ongeveer 98% en een temperatuur van 25 °C om de kieming van de conidia en het infectieproces te bevorderen. De planten werden vervolgens gekweekt onder een fotoperiode van 14 uur bij 22 °C overdag/19 °C 's nachts en een luchtvochtigheid van 70%. De ziektescore werd 22 dagen na inoculatie bepaald en varieerde van 0 (immuun) tot 9 (zeer vatbaar), afhankelijk van de aanwezigheid of afwezigheid van necrotische laesies op stengels en bladeren. Na de score werd ook het gewicht van de planten gemeten. De relaties tussen markergenotypen en ziektefenotypen werden berekend als punt-twee-sequentiecorrelaties (afwezigheid van heterozygote markers in de set lijnen voor analyse van het anthracnoseresistentiefenotype).