Kiitos käynnistäsi Nature.com-sivustolla. Käyttämäsi selainversio tukee CSS:ää rajoitetusti. Parhaan käyttökokemuksen saavuttamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan yhteensopivuustilan käytöstä Internet Explorerissa). Sillä välin tuen jatkuvuuden varmistamiseksi renderöimme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) on palkokasvi, jota käytetään elintarviketuotantoon ja maaperän parantamiseen. NLL:n maailmanlaajuinen laajentuminen viljelykasvina on houkutellut monia patogeenisiä sieniä, mukaan lukien lupiiniantraknoosi, joka aiheuttaa tuhoisan antraknoositaudin. Kahta alleelia, Lanr1 ja AnMan, jotka lisäävät resistenssiä, on käytetty NLL-sienten jalostuksessa, mutta taustalla olevat molekyylimekanismit ovat edelleen tuntemattomia. Tässä tutkimuksessa Lanr1- ja AnMan-markkereita käytettiin eurooppalaisten NLL-näytteiden seulontaan. Rokotteen testaaminen kontrolloidussa ympäristössä vahvisti molempien resistenttien luovuttajien tehon. Erilaisten geenien ilmentymisen profilointi suoritettiin edustavilla resistenteillä ja alttiilla linjoilla. Antraknoosiresistenssi liittyi geeniontologian termien "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process" ja "GO:0015979 Photosynthesis" yli-ilmentymiseen. Lisäksi Lanr1(83A:476)-linjassa havaittiin merkittävää transkriptomiuudelleenohjelmointia nopeasti rokotuksen jälkeen, kun taas muissa linjoissa tämä vaste viivästyi noin 42 tuntia. Puolustusvasteet liittyvät TIR-NBS-, CC-NBS-LRR- ja NBS-LRR-geeneihin, 10 patogeneesiin osallistuvaan proteiiniin, lipidikuljetusproteiineihin, endoglukaani-1,3-β-glukosidaasiin, glysiinirikkaisiin soluseinäproteiineihin ja hapen reaktiivisen reitin geeneihin. Varhaiset vasteet 83A:476:lle, mukaan lukien fotosynteesiin liittyvien geenien huolellinen tukahduttaminen, osuivat yksiin onnistuneen suojan kanssa sienibiologian vegetatiivisen kasvuvaiheen aikana, mikä viittaa siihen, että efektori laukaisee immuniteetin. Mandeloop-reaktio hidastuu, samoin kuin yleinen horisontaalinen vastus.
Kapealehtinen lupiini (NLL, Lupinus angustifolius L.) on runsasproteiininen viljakasvi, joka on peräisin läntiseltä Välimeren alueelta1,2. Sitä viljellään nykyään eläinten ja ihmisten ravintokasvina. Sitä pidetään myös viherlannoitteena viljelykiertojärjestelmissä, koska symbioottiset typpeä sitovat bakteerit sitovat typpeä ja parantavat maaperän rakennetta yleisesti. NLL on käynyt läpi nopean kesytysprosessin viime vuosisadalla ja siihen kohdistuu edelleen voimakasta lisääntymispainetta3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. NLL:n laajalle levinneen viljelyn myötä patogeenisten sienten peräkkäiset kasvustot kehittivät uusia viljelylokeroita ja aiheuttivat uusia satoja tuhoavia tauteja. Lupiininviljelijöille ja -jalostajille merkittävin oli antraknoosin esiintyminen, jonka aiheutti patogeeninen sieni Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Lupiininviljelijöille ja -jalostajille merkittävin oli antraknoosin esiintyminen, jonka aiheutti patogeeninen sieni Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванногрикомноза, вызванногриконы памермеров (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Lupiinien viljelijöille ja jalostajille merkittävin oli antraknoosin ilmaantuminen, jonka aiheutti patogeeninen sieni Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由痘otum养菏(Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由痘otum养菏(Bondar)嵵Tukkainen.1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызбонковагогонынкоемого Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Lupiinien viljelijöille ja jalostajille silmiinpistävintä on antraknoosin ilmaantuminen, jonka aiheuttaa patogeeninen sieni Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Varhaisimmat raportit taudista tulivat Brasiliasta ja Yhdysvalloista, ja tyypillisiä oireita ilmeni vuosina 1912 ja 1929. Noin 30 vuoden kuluttua taudinaiheuttajalle annettiin kuitenkin nimeksi Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorfi Glomerella cingulata (Kivimies) Spauld. & Sacc., teleomorfi Glomerella cingulata (Kivimies) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauldin teleomorfi. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (kivimies) Spauld kohdennetussa morfologiassa. & H. Schrenk. & H. Schrenk,.ja H. Schrenk. & H.施伦克，. & H.施伦克，.ja H. Schlenk,.1900-luvun puolivälissä tehty alustava taudin fenotyypitys osoitti jonkin verran resistenssiä NLL- ja keltalupiini (L. luteus L.) -kannat, mutta kaikki testatut valkolupiini (L. albus L.) -kannat olivat erittäin alttiita15,16. Tutkimukset ovat osoittaneet, että antraknoosin kehittyminen liittyy lisääntyneeseen sademäärään (ilmankosteuteen) ja lämpötilaan (12–28 °C:n välillä), mikä johtaa resistenssin heikkenemiseen korkeammissa lämpötiloissa17,18. Itse asiassa konidioiden itämiseen ja taudin alkamiseen kuluva aika oli neljä kertaa lyhyempi 24 °C:ssa (4 tuntia) kuin 12 °C:ssa (16 tuntia) korkeassa ilmankosteudessa19. Jatkuva ilmaston lämpeneminen on siis johtanut antraknoosin leviämiseen. Tautia havaittiin kuitenkin Ranskassa (1982) ja Ukrainassa (1983) uhkaavan uhan ennenä, mutta lupiiniteollisuus jätti sen ilmeisesti tuolloin huomiotta20,21. Muutamaa vuotta myöhemmin tämä tuhoisa tauti levisi kaikkialle maailmaan ja vaikutti myös tärkeimpiin lupiinia tuottaviin maihin, kuten Australiaan, Puolaan ja Saksaan22,23,24. Antraknoosiepidemian jälkeen 1990-luvun puolivälissä laaja seulonta johti useiden resistenttien luovuttajien tunnistamiseen NLL19-näytteistä. NLL:n antraknoosiresistenssiä kontrolloivat kaksi erillistä dominanttia alleelia, joita löytyy eri sukusolulähteistä: Lanr1 Tanjil-lajikkeessa ja Wonga ja AnMan Mandalay-lajikkeessa25, 26. Nämä alleelit täydentävät molekyylimarkkereita, jotka tukevat resistentin sukusolun valintaa jalostusohjelmissa25,26,27,28,29,30. Lanr1-alleelia kantava resistentti jalostuslinja 83A:476 risteytettiin alttiiden villien linjojen P27255 kanssa, jolloin saatiin antraknoosiresistenssin suhteen segregoituva RIL-populaatio. Tämä mahdollisti Lanr1-lokuksen sijoittamisen kromosomiin NLL-1131, 32, 33. Antraknoosia reunustavien resistenssilokusten kytkentäkarttamarkkereiden linjaaminen genomiseen viitekehykseen paljasti, että NLL paljasti kaikkien kolmen alleelin sijainnin samassa kromosomissa (NLL-11), mutta eri paikoissa29,34,35. RIL-markkereiden pienen määrän ja markkereiden ja vastaavien alleelien välisen suuren geneettisen etäisyyden vuoksi niiden taustalla olevista geeneistä ei kuitenkaan voida tehdä luotettavia johtopäätöksiä. Toisaalta käänteisgenetiikan käyttö lupiineilla on vaikeaa niiden erittäin alhaisen regeneraatiopotentiaalin vuoksi, mikä tekee geneettisestä manipuloinnista hankalaa37.
Haluttua alleelia homotsygoottisessa tilassa kantavien kesyjen sukusolujen, kuten 83A:476 (Lanr1) ja Mandelup (AnMan), kehittäminen on avannut oven antraknoosiresistenssin tutkimiselle vastakkaisten alleeliyhdistelmien esiintymisen edessä villipopulaatioissa. Molekyylimekanismien mahdollisuudet. Vertaile tiettyjen genotyyppien tuottamia puolustusvasteita. Tässä tutkimuksessa arvioitiin NLL:n varhaista transkriptomisvastetta C. lupini -rokotukselle. Ensin seulottiin eurooppalainen NLL-sukusolujen paneeli, joka sisälsi 215 linjaa, käyttämällä molekyylimarkkereita, jotka merkitsevät Lanr1- ja AnMan-alleeleja. Antraknoosifenotyypitys suoritettiin sitten 50 NLL-linjalle, jotka oli aiemmin valittu molekyylimarkkereiden suhteen, kontrolloiduissa olosuhteissa. Näiden kokeiden perusteella valittiin neljä linjaa, jotka erosivat toisistaan ​​antraknoosiresistenssin ja Lanr1/AnMan-alleelikoostumuksen suhteen, erilaista puolustusgeenien ilmentymisprofilointia varten käyttämällä kahta toisiaan täydentävää lähestymistapaa: suuren läpimenon RNA-sekvensointia ja reaaliaikaista PCR-kvantifiointia.
NLL-ituplasman (N = 215) seulonta markkereilla Lanr1 (Anseq3 ja Anseq4) sekä AnMan (Anseq4) ja AnMan (AnManM1) osoitti, että vain yksi linja (95726, lähellä Salamanca-b:tä) monistaa kaikkien markkereiden "resistenssi"-alleelin, kun taas "herkkien" alleelien esiintyminen -analyysillä havaittiin kaikkien markkereiden osuus 158 (~73,5 %) linjassa. Kolmetoista linjaa tuotti kaksi Lanr1-markkerin "resistenttiä" alleelia ja kahdeksan linjaa Lanr1-markkerin "resistenttejä" alleeleja. AnMan-markkerin "resistenssi"-alleeli (lisätaulukko S1). Kaksi linjaa oli heterotsygoottisia Anseq3-markkerille ja yksi heterotsygoottinen AnManM1-markkerille. 42 linjaa (19,5 %) kantoi Anseq3- ja Anseq4-alleelien vastakkaisia ​​vaiheita, mikä viittaa näiden kahden lokuksen väliseen korkeaan rekombinaatiofrekvenssiin. Kontrolloiduissa olosuhteissa tehdyt antraknoosifenotyypit (lisätaulukko S2) paljastivat testattujen genotyyppien resistenssin vaihtelua, mikä heijastui antraknoosin vakavuuteen. Keskiarvojen erot vaihtelivat 1,8:sta (kohtalaisen resistentti) 6,9:ään (herkkä) ja kasvien painoerot vaihtelivat 0,62:sta (herkkä) 4,45 grammaan (resistentti). Kahdessa kokeen toistossa havaittujen arvojen (0,51 taudin vakavuuspisteille, P = 0,00017 ja 0,61 kasvin painolle, P < 0,0001) sekä näiden kahden parametrin (−0,59 ja −0,77, P < 0,0001) välillä havaittiin merkittävä korrelaatio. Kahdessa kokeen toistossa havaittujen arvojen (0,51 taudin vakavuuspisteille, P = 0,00017 ja 0,61 kasvin painolle, P < 0,0001) sekä näiden kahden parametrin välillä (−0,59 ja −0,77, P < 0,0001) havaittiin merkitsevä korrelaatio. Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 тваверимента) болезни, P = 0,00017 ja 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,57, Ри) 0,0001) 0,0001). Merkittävä korrelaatio havaittiin kokeen kahdessa toistossa havaittujen arvojen välillä (0,51 taudin vakavuusasteelle, P = 0,00017 ja 0,61 kasvin painolle, P < 0,0001), sekä näiden kahden parametrin välillä (-0,59 ja -0,77, P < 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评P0.51︺ 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77,00P <1)在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严釺庍 程度 评分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p < 0,0001） 以及 两 伪 参 数 之闈 ， . 0,59 和 – 0,59 和 – 0,59 和 - 0,77, P < 0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях, повторностях, повторностях, повторностях, повторностях, повторностях, по в 1 = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 ja -0,0001) 0,77, P <0,0001 Kaksoisnäytteissä havaittujen arvojen (taudin vakavuuspistemäärä 0,51, P = 0,00017 ja kasvin paino 0,61, P < 0,0001) ja näiden kahden parametrin (-0,59 ja -0,0001) välillä oli merkitsevä korrelaatio 0,77, P < 0,0001. ).Tyypillisiä alttiissa kasveissa havaittuja oireita ovat varren mutkitteleminen ja kiertyminen, jotka muistuttavat "paimenenkaaren" muotoista rakennetta, jota seuraavat soikeat leesiot, joissa on oransseja/vaaleanpunaisia ​​sporotsoiitteja (lisäkuva 1). Australialaiset kantakannat, joissa on Lanr1- (83A:476 ja Tanjil) ja AnMan- (Mandelup) geenit, ovat kohtalaisen resistenttejä, 0,0331 ja 0,0036). Joillakin linjoilla, joissa on myös "resistenttejä" Lanr1- ja/tai AnMan-alleeleja, on taudin oireita.
Mielenkiintoista kyllä, muutamat NLL-linjat, joilta puuttui mikään ”resistentti” markkerialleeli, osoittivat korkeaa antraknoosiresistenssiä (verrattavissa Lanr1- tai AnMan-genotyyppeihin tai sitä korkeampaa). Tällaisia ​​linjoja olivat Boregine (P-arvo < 0,0001 molemmille parametreille), Bojar (P-arvo < 0,0001 pistemäärälle ja 0,001 kasvin painolle) ja populaatio B-549/79b (P-arvo < 0,0001 pistemäärälle ja ei-merkitsevä painolle). Mielenkiintoista kyllä, muutamat NLL-linjat, joilta puuttui mikään ”resistentti” markkerialleeli, osoittivat korkeaa antraknoosiresistenssiä (verrattavissa Lanr1- tai AnMan-genotyyppeihin tai sitä korkeampaa). Tällaisia ​​linjoja olivat Boregine (P-arvo < 0,0001 molemmille parametreille), Bojar (P-arvo < 0,0001 pistemäärälle ja 0,001 kasvin painolle) ja populaatio B-549/79b (P-arvo < 0,0001 pistemäärälle ja ei-merkitsevä painolle). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высовейх выказали высокий антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) ja популяции B-549/790,0дзначе 0е1. оценки и незначимо для массы). Mielenkiintoista kyllä, useilla NLL-linjoilla, joilta puuttui yhtään 'resistenttiä' markkerialleelia, oli korkea antraknoosiresistenssi (verrattavissa Lanr1- tai AnMan-genotyyppeihin tai sitä korkeampi). Tällaisia ​​linjoja olivat Boregine (P-arvo < 0,0001 molemmille parametreille), Bojar (P-arvo < 0,0001 arvioinnille ja 0,001 kasvin painolle) ja populaatio B-549/79b (P-arvo < 0,0001 arvioinnille, eikä merkitsevä painolle).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的位基因的位基因的位基因的.或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值睂扩才量丏不重龇 On mielenkiintoista, että joillakin NLL-järjestelmillä, joilla ei ole ”antigeenisiä” markkereita, on korkea horisontaalinen resistenssi (vastaa Lanr1- tai AnMan-geenejä tai on korkeampi), kuten Boregine (molemmat parametrit P < 0,0001), Bojar (P-arvo < 0,0001, kasvin paino 0,001) ja kanta B-549/79b (P-arvo < 0,0001, paino ei ole merkitsevä). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показалие высок к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих парамет00в1),
(значение P <0,0001, масса растения 0,001) ja популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначитначи). Mielenkiintoista kyllä, joillakin NLL-linjoilla, joilta puuttui yhtään 'resistenssi'-markkerialleelia, havaittiin korkea antraknoosiresistenssi (verrattavissa Lanr1- tai AnMan-genotyyppeihin tai niitä korkeampi). Tällaisia ​​linjoja ovat Boregine (molempien parametrien P-arvo <0,0001), Bojar (P-arvo <0,0001, kasvin paino 0,001) ja populaatio B-549/79b (P-arvo <0,0001, paino ei tilastollisesti merkitsevä).Tämä ilmiö viittaa mahdolliseen uuteen geneettiseen resistenssin lähteeseen, mikä selittää havaitun korrelaation puutteen markkerigenotyyppien ja tautifenotyyppien välillä (P-arvot ~0,42 - ~0,98). Kolmogorov-Smirnov-testi osoitti siis, että antraknoosiresistenssiä koskevat tiedot jakautuivat suunnilleen normaalisti pistemäärien (P-arvot 0,25 ja 0,11) ja kasvimassan (P-arvot 0,47 ja 0,55) osalta, mikä viittaa siihen, että hypoteesini mukaan mukana on useampia alleeleja kuin Lanr1 ja AnMan.
Antraknoosiresistenssiseulonnan tulosten perusteella transkriptomianalyysiin valittiin neljä linjaa: 83A:476, Boregine, Mandelup ja populaatio 22660. Näitä linjoja testattiin uudelleen pernaruttoresistenssin varalta inokulaatiokokeissa RNA-sekvensoinnilla, edellyttäen, että ne olivat samat kuin edellisessä testissä. Pisteytysarvot olivat seuraavat: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) ja populaatio 22660 (6,11 ± 1,29).
Illumina NovaSeq 6000 -protokollalla saavutettiin keskimäärin 40,5 M lukuparia näytettä kohden (29,7–54,4 M lukukertaa) (lisätaulukko S3). Vertailusekvenssin kohdistuspisteet vaihtelivat 75,5 %:sta 88,6 %:iin. Biologisten replikaattien kokeellisten varianttien lukumäärätietojen keskimääräinen korrelaatio vaihteli 0,812:sta 0,997:ään (keskiarvo 0,959). Analysoiduista 35 170 geenistä 2917:ssä ei havaittu ilmentymistä, ja loput 4785 geeniä ilmentyivät merkityksettömällä tasolla (peruskeskiarvo < 5). Analysoiduista 35 170 geenistä 2917:ssä ei havaittu ilmentymistä, ja loput 4785 geeniä ilmentyivät merkityksettömällä tasolla (peruskeskiarvo < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались новспрессировались (базовое среднее <5). Analysoiduista 35 170 geenistä 2917 ei ilmentynyt lainkaan, ja loput 4785 geeniä ilmentyivät merkityksettömällä tasolla (peruskeskiarvo <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）.35 170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительсюпо среднее значение <5). Analysoiduista 35 170 geenistä 2917 ei ilmentynyt ja lopuilla 4785 geenillä ilmentyminen oli merkityksetöntä (peruskeskiarvo <5).Siten kokeen aikana ilmentyneiksi katsottujen geenien lukumäärä (perusarvo ≥ 5) oli 27 468 (78, 1%) (lisätaulukko S4).
Ensimmäisestä ajankohdasta lähtien kaikki NLL-linjat reagoivat C. lupini -rokotteeseen (kanta Col-08) ohjelmoimalla transkriptominsa uudelleen (taulukko 1), mutta linjojen välillä havaittiin merkittäviä eroja. Näin ollen resistenssilinja 83A:476 (joka kantaa Lanr1-geeniä) osoitti merkittävää transkriptominsa uudelleenohjelmointia ensimmäisessä ajankohdassa (6 hpi), ja eristettyjen ylös- ja alas-geenien määrä oli 31–69-kertainen verrattuna muihin ajankohtiin tässä ajankohdassa. Lisäksi tämä piikki oli lyhytaikainen, koska vain muutamien geenien ilmentyminen pysyi merkittävästi muuttuneena toisessa ajankohdassa (12 hpi). Mielenkiintoista kyllä, Boregine, jolla oli myös korkea resistenssiaste siirrännäistestissä, ei läpikäynyt yhtä massiivista transkriptionaalista uudelleenohjelmointia kokeen aikana. Differentiaalisesti ilmentyvien geenien (DEG) määrä oli kuitenkin sama Boreginella ja 83A:476:lla 12 HPI:n kohdalla. Sekä Mandelupilla että populaatiolla 22660 havaittiin DEG-piikkejä viimeisenä ajanhetkenä (48 l/s), mikä viittaa suhteelliseen viiveeseen puolustusvasteissa.
Koska 83A:476:ssa tapahtui massiivinen transkriptomiuudelleenohjelmointi vasteena C. lupinille 6. HPI:ssä verrattuna kaikkiin muihin linjoihin, ~91 % tässä ajankohtana havaituista differentiaalisista geeneistä (DEG) oli sukulinjakohtaisia ​​(kuva 1). Tutkimuslinjojen varhaisissa vasteissa oli kuitenkin jonkin verran päällekkäisyyttä, sillä 68,5 %, 50,9 % ja 52,6 % DEG:istä Boregine-, Mandelup- ja populaatiossa 22660 oli päällekkäisiä 83A:476:ssa tiettyinä ajankohtina havaittujen differentiaalisten geenejä kanssa. Nämä differentiaaliset geenejä muodostivat kuitenkin vain pienen osan (0,97–1,70 %) kaikista 83A:476:lla tällä hetkellä havaituista differentiaalisista geeneistä. Lisäksi 11 DEG:tä kaikista linjoista oli koherentteja tässä vaiheessa (lisätaulukot S4-S6), mukaan lukien kasvin puolustusvasteiden yhteiset komponentit: lipidiensiirtoproteiini (TanjilG_32225), endoglukaani-1,3-β-glukosidientsyymi (TanjilG_23384), kaksi stressin indusoimaa proteiinia, kuten SAM22 (TanjilG_31528 ja TanjilG_31531), emäksinen lateksiproteiini (TanjilG_32352) ja kaksi glysiinirikastettua soluseinän rakenneproteiinia (TanjilG_19701 ja TanjilG_19702). Transkriptomivasteissa oli myös suhteellisen suuri päällekkäisyys 83A:476:n ja Boreginen välillä 24 HPI:n kohdalla (yhteensä 16-38 % DEG) ja Mandelupin ja populaation 22660 välillä 48 HPI:n kohdalla (yhteensä 14-20 % DEG).
Venn-diagrammi, joka näyttää Colletotrichum lupinilla (kanta Col-08, saatu lupiinipelloilta Wierzhenicessä, Puolassa, 1999) inokuloiduissa kapealehtisissä lupiinilinjoissa (NLL). Analysoidut NLL-linjat olivat: 83A:476 (resistentti, kantaa Lanr1-alleelia), Boregine (resistentti, geneettinen tausta tuntematon), Mandelup (kohtalaisen resistentti, kantaa AnMan-alleelia) ja populaatio 22660 (erittäin altis). Lyhenne hpi tarkoittaa tunteja rokotuksen jälkeen (hours after vaccination). Nolla-arvot on poistettu kaavion yksinkertaistamiseksi.
6 hpi:n kohdalla yliekspressoitujen geenien joukkoa analysoitiin kanonisten R-geenidomeenien esiintymisen varalta (lisätaulukko S7). Tämä tutkimus paljasti klassisten tautiresistenssigeenien transkriptomi-induktion, jossa oli vain NBS-LRR-domeeneja kohdassa 83A:476. Tämä joukko koostui yhdestä TIR-NBS-LRR-geenistä (tanjilg_05042), viidestä CC-NBS-LRR-geenistä (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 ja tanjilg_16162), neljästä NBS-LR-geenistä (Tanjilg_16162), neljästä NBS-LRRE-geenistä (tanjilg_16162), sekä neljästä NBS-Lrr-geenistä (tanjilg_16162) ja neljästä NBS-LRR-geenistä (TANJILG_16162). Kaikilla näillä geeneillä on kanoniset domeenit konservoituneissa sekvensseissä. NBS-LRR-domeenigeenien lisäksi useita RLL-kinaaseja aktivoitui 6 hpi:n kohdalla, nimittäin yksi Boreginessa (TanjilG_19877), kaksi Mandelupissa (TanjilG_07141 ja TanjilG_19877) ja populaatiossa 22660 (TanjilG_09014 ja TanjilG_10361) sekä kaksi 83A 27:476:ssa.
Geeneille, joiden ilmentyminen muuttui merkittävästi vasteena C. lupini -inokulaatioon (kanta Col-08), tehtiin geeniontologian (GO) rikastusanalyysi (lisätaulukko S8). Yleisimmin yliedustettu biologisen prosessin termi oli ”GO:0006952 puolustusvaste”, joka esiintyi 6:ssa 16:sta (aika × viiva) yhdistelmästä ja osoitti korkean merkitsevyyden (P-arvo < 0,001) (kuva 2). Yleisimmin yliedustettu biologisen prosessin termi oli ”GO:0006952 puolustusvaste”, joka esiintyi 6:ssa 16:sta (aika × viiva) yhdistelmästä ja osoitti korkean merkitsevyyden (P-arvo < 0,001) (kuva 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный», откоретый» появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (riis. 2). Yleisimmin yliedustettu biologisen prosessin termi oli 'GO:0006952 puolustusvaste', joka esiintyi 6:ssa 16:sta (aika × sukulinja) yhdistelmästä ja osoitti korkean merkitsevyyden (P-arvo < 0,001) (kuva 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）. Edustavin biologisen prosessin termi on ”GO:0006952 puolustusvaste”, joka esiintyy kuudessa kuudestatoista (时间×线) yhdistelmästä, ja sen merkitsevyys on korkea (P-arvo < 0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», копяры 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (ris. 2). Yleisimmin yliedustettu biologisen prosessin termi oli 'GO:0006952 Defense Response', joka esiintyi 6:ssa 16 yhdistelmästä (aika × viiva) suurella merkitsevyydellä (P-arvo < 0,001) (kuva 2).Tämä termi oli yliedustettuna kahtena ajankohtana 83A:ssa: 476 ja Boregine (6 ja 24 hpi) sekä yhdessä ajankohtana Mandelupissa ja populaatiossa 22660 (12 ja 6 hpi). Tämä on odotettu tulos, joka korostaa resistenttien linjojen sienilääkeresistenssiä. Lisäksi 83A:476 reagoi C. lupiniin indusoimalla nopeasti oksidatiiviseen purskeeseen liittyviä geenejä, joita edustaa termi "GO:0055114 redox-prosessi", mikä viittaa spesifiseen puolustusvasteeseen, kun taas Boregine paljasti spesifisiä puolustusvasteita, jotka liittyivät termiin "GO". :0006950 Stressivaste”. Populaatio 22660 aktivoi horisontaalisen resistenssivasteen, johon liittyi sekundaarisia metaboliitteja, mikä korostaa termien ”GO:0016104 Triterpeenibiosynteesin prosessi” ja ”GO:0006722 Triterpeenimetabolian prosessi” liiallista määrää (molemmat termit kuuluvat samaan geenijoukkoon). GO-termien rikastusanalyysin tulokset huomioon ottaen Mandelup-reaktion stabiilius oli Boreginen ja populaation 22660 välillä. Lisäksi varhainen reaktio 83A:476 (6 hpi) ja viivästynyt reaktio Mandelupissa ja populaatiossa 22660 sisältävät termin GO:0015979 'fotosynteesi' ja muita siihen liittyviä biologisia prosesseja.
Pernarutto-lupiinilla (Col-08-kanta, saatu lupiinipelloilta Wierzhenicessä, Puolassa, vuonna 1999) inokuloidun kapealehtisen lupiinin (NLL) transkriptomivasteiden aikana erilaisesti ilmentyvien geenien annotaatiossa valitut bioprosessigeenien ontologian termit ovat suuresti liioiteltuja. Analysoidut NLL-linjat olivat: 83A:476 (resistentti, kantaa homotsygoottista Lanr1-alleelia), Boregine (resistentti, tuntematon geneettinen tausta), Mandelup (kohtalaisen resistentti, kantaa homotsygoottista AnMan-alleelia) ja populaatio 22660 (herkkä).
Koska tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa antraknoosiresistenssiin vaikuttavia geenejä, analysoitiin termeihin GO ”GO: 0006952 Puolustusvasteet” ja ”GO: 0055114 Redox-prosessit” liitettyjä geenejä käyttäen raja-arvoja lähtötilanteen keskiarvoista ≥ 30 alkaen, ja vähintään yksi viiva × ajankohta yhdisti tilastollisesti merkitsevät log2-arvot (muutoskertaisesti). Nämä kriteerit täyttävien geenien lukumäärä oli 65 GO:0006952:lle ja 524 GO:0055114:lle.
83A:476 paljasti kaksi DEG-huippua, joihin oli merkitty termi GO:0006952, ensimmäinen 6 geenillä tuumalla (64 geeniä, ylös- ja alassäätely) ja toinen 24 geenillä tuumalla (15 geeniä, vain ylössäätely). Boregine osoitti myös, että GO:0006952 saavutti huippunsa samaan aikaan, mutta vähemmän DEG:tä (11 ja 8) ja ensisijaisesti aktivoituneena. Mandeloop osoitti kaksi GO:0006952-huippua 12 ja 48 HPI:n kohdalla, molemmissa oli 12 geeniä (ensimmäisessä aktivoivat geenit ja toisessa vain suppressoivat geenit), kun taas 22660-populaatiossa 6 HPI:n kohdalla (13 geeniä) oli suurempi nousu- ja säätelyhuipun hallitsevuus. On huomattava, että 96,4 %:lla GO:0006952 DEG:istä näissä huipuissa oli samanlainen vastetyyppi (ylös- tai alaspäin), mikä viittaa merkittävään päällekkäisyyteen puolustusvasteissa huolimatta geenien lukumäärän eroista. Suurin termiin GO:0006952 liittyvien sekvenssien ryhmä koodaa nälkään liittyvää stressiin liittyvää viestiproteiinia 22 (SAM22-kaltainen), joka kuuluu luokkaan 10 patogeneesiin liittyvän proteiinin (PR-10) proteiinikladiin ja ydinproteiini lateksiin. Samankaltainen (MLP-kaltainen) proteiini) (kuva 3). Nämä kaksi ryhmää erosivat ilmentymisen luonteen ja vasteen suunnan suhteen. SAM22:n kaltaisia ​​proteiineja koodaavat geenit osoittivat johdonmukaista ja merkittävää induktiota varhaisissa aikapisteissä (6 tai 12 hpi) ja olivat yleensä reagoimattomia kokeen lopussa (48 hpi), kun taas MLP:n kaltaiset proteiinit osoittivat koordinaatiota 6 hpi:ssä. 83A:476 ja Mandelup 48 hpi:ssä, lähes kaikki muut datapisteet olivat reagoimattomia. Lisäksi SAM22:n kaltaisten proteiinien geenien ilmentymisprofiilien erot seurasivat antraknoosiresistenssin havaittua vaihtelua, sillä resistenteimmillä linjoilla oli enemmän aikapisteitä, jotka indusoivat näitä geenejä merkittävästi kuin alttiimpia geenejä. Toinen LlR18A/B:n kaltainen PR-10-geeni osoitti hyvin samanlaista ilmentymiskuviota kuin SAM22:n kaltainen proteiinigeeni.
Biologisen prosessitermin ”GO:0006952 Defense Response” pääkomponentit ja Lanr1- ja AnMan-alleelien kandidaattigeenien ilmentymismallit tunnistettiin. Log2-asteikko edustaa log2-arvoja (muutoskertaluku) inokuloitujen (Colletotrichum lupini, kanta Col-08, saatu lupiinipelloilta, Wizhenica, Puola, 1999) ja kontrollikasvien (valeinokuloitu) välillä samassa ajankohtana. Analysoitiin seuraavat kapealehtiset lupiinilinjat: 83A:476 (resistentti, kantaa homotsygoottista Lanr1-alleelia), Boregine (resistentti, geneettinen tausta tuntematon), Mandelup (kohtalaisen resistentti, kantaa homotsygoottista AnMan-alleelia) ja populaatio 22660 (herkkä).
Lisäksi arvioitiin RNA-sekvensointikandidaattigeenien Lanr1 (TanjilG_05042) ja AnMan (TanjilG_12861) ilmentymisprofiileja (kuva 3). TanjilG_05042-geeni osoitti merkittävää vastetta (aktivaatiota) kohdassa 83A:476 vain ensimmäisessä aikapisteessä (6 hpi), kun taas TanjilG_12861 oli merkitsevä Mandeloopissa vain kahdessa aikapisteessä: 6 hpi (alassäätely) ja 24 hpi (6 hpi). Kanssa. (säädettävä) ).
Termillä GO:0055114 ”redox-prosessi” eniten ilmentyneet geenit olivat sytokromi P450 -proteiineja ja peroksidaasia koodaavia geenejä (kuva 4). Näytteillä, jotka eristettiin 83A:476:sta 6. syntymäpäivänä (HPI), havaittiin yleisesti maksimi- tai minimilog2-arvot (kerranmuutos) (86,6 %:lla geeneistä) inokuloitujen ja kontrollikasvien välillä, mikä korostaa tämän genotyypin voimakasta vastetta inokuloivaan sukupuoleen. 83A:476 osoitti merkittävimmän GO:0055114 DEG:n 6. syntymäpäivänä (503 geeniä), kun taas muut linjat 48. syntymäpäivänä (Boregine, 31 geeniä; Mandelup, 85 geeniä; ja populaatio 22660, 78 geeniä). Useimmissa GO:0055114-perheen geeneissä havaittiin kahdenlaisia ​​rokotusvasteita (aktivaatio ja esto). Mielenkiintoista kyllä, jopa 97,6 % termille GO: 0055114 tunnistetuista differentiaalisesti muunnelmista Mandelupessa 48 hv:n teholla. Nämä havainnot viittaavat siihen, että huomattavasti pienemmästä mittakaavasta huolimatta (eli mutatoituneiden redox-geenien lukumäärä 85 vs. 503), mandeloupin viivästyneiden transkriptoomivasteiden kuvio antraknoosiin on samanlainen kuin 83A:476:n varhainen vaste. Boregine-populaatiossa ja populaatiossa 22660 tämä konvergenssi on alhaisempi, 51,6 % ja 75,6 %.
Biologisen prosessin ”GO:0055114 Redox-prosessi” termin pääkomponenttien ilmentymismallit paljastettiin. Log2-asteikko edustaa log2-arvoja (muutoskertaluku) inokuloitujen (Colletotrichum lupini, kanta Col-08, saatu lupiinipelloilta, Wizhenica, Puola, 1999) ja kontrollikasvien (valeinokuloitu) välillä samassa ajankohtana. Analysoitiin seuraavat kapealehtiset lupiinilinjat: 83A:476 (resistentti, kantaa homotsygoottista Lanr1-alleelia), Boregine (resistentti, geneettinen tausta tuntematon), Mandelup (kohtalaisen resistentti, kantaa homotsygoottista AnMan-alleelia) ja populaatio 22660 (herkkä).
83A:476 Transkriptoomiset vasteet C. lupini -rokotukselle (kanta Col-08) sisälsivät myös termiin GO:0015979 "fotosynteesi" ja muihin vastaaviin biologisiin prosesseihin liittyvien geenien koordinoidun hiljentämisen (KUVA 5). Tämä GO:0015979 DEG-joukko sisälsi 105 geeniä, jotka olivat merkittävästi repressoituneita 6 hpi:n kohdalla 83A:476:ssa. Tässä osajoukossa 37 geeniä oli myös vähentynyt Mandelupissa 48 hpi:n kohdalla ja 35 samaan aikaan 22660-populaatiossa, mukaan lukien 19 DEG:tä, jotka olivat yhteisiä molemmille genotyypeille. Yhtään termiin GO:0015979 liittyvää DEG:tä ei aktivoitu merkittävästi missään yhdistelmässä (linja x aika).
Biologisen prosessin ”GO:0015979 Photosynthesis” pääkomponenttien ilmentymismallit paljastettiin. Log2-asteikko edustaa log2-arvoja (muutoskertaluku) inokuloitujen (Colletotrichum lupini, kanta Col-08, saatu lupiinipelloilta, Wizhenica, Puola, 1999) ja kontrollikasvien (valeinokuloitu) välillä samassa ajankohtana. Analysoitiin seuraavat kapealehtiset lupiinilinjat: 83A:476 (resistentti, kantaa homotsygoottista Lanr1-alleelia), Boregine (resistentti, geneettinen tausta tuntematon), Mandelup (kohtalaisen resistentti, kantaa homotsygoottista AnMan-alleelia) ja populaatio 22660 (herkkä).
Differentiaalisen ilmentymisanalyysin tulosten perusteella ja oletettavasti patogeenisiä sieniä vastaan ​​​​suunnattuihin puolustusvasteisiin osallistuen, tämä seitsemän geenin joukko valittiin ilmentymisprofiilien kvantifiointiin reaaliaikaisella PCR:llä (lisätaulukko S9).
Oletettu proteiinigeeni TanjilG_10657 indusoitui merkittävästi kaikissa tutkituissa linjoissa ja aikapisteissä verrattuna kontrolli(jäljitteleviin) kasveihin (lisätaulukot S10, S11). Lisäksi TanjilG_10657:n ilmentymisprofiili osoitti nousevaa trendiä kokeen aikana kaikissa linjoissa. Populaatio 22660 osoitti TanjilG_10657:n korkeinta herkkyyttä inokulaatiolle, 114-kertaisella aktivaatiolla ja korkeimmalla suhteellisella ilmentymistasolla (4,4 ± 0,4) 24 HPI:n kohdalla (kuva 6a). Myös PR10 LlR18A -proteiinigeeni TanjilG_27015 osoitti aktivaatiota kaikissa linjoissa ja aikapisteissä, ja tilastollisesti merkitsevä useimmissa datapisteissä (kuva 6b). Samoin kuin TanjilG_10657:n kohdalla, TanjilG_27015:n korkein suhteellinen ilmentymistaso havaittiin 22660:n inokuloidussa populaatiossa 24 HPI:n kohdalla (19,5 ± 2,4). Happaman endokitinaasigeenin TanjilG_04706 ilmentyminen lisääntyi merkittävästi kaikissa linjoissa ja kaikkina ajankohtina paitsi Boregine 6 hpi:llä (kuva 6c). Se indusoitui voimakkaasti ensimmäisessä ajankohdassa (6 HPI) kohdassa 83A:476 (10,5-kertaisesti) ja lisääntyi kohtalaisesti muissa linjoissa (6,6–7,5-kertaisesti). Kokeen aikana TanjilG_04706:n ilmentyminen pysyi samalla tasolla 83A:476:ssa ja Boregine:ssa, kun taas Mandelupissa ja populaatiossa 22660 se lisääntyi merkittävästi saavuttaen suhteellisen korkeita arvoja (5,9 ± 1,5 ja 6,2 ± 1,5). Endoglukaani-1,3-β-glukosidaasin kaltainen geeni TanjilG_23384 osoitti voimakasta aktivaatiota kahtena ensimmäisenä ajanhetkenä (6 ja 12 hpi) kaikissa linjoissa paitsi populaatiossa 22660 (kuva 6d). TanjilG_23384:n suhteelliset korkeimmat ilmentymistasot havaittiin toisella aikapisteellä (12. syntymäpäivä) Mandelupissa (2,7 ± 0,3) ja 83A:476:ssa (1,5 ± 0,1). 24. syntymäpäivän kohdalla TanjilG_23384:n ilmentyminen oli suhteellisen alhainen kaikissa tutkituissa linjoissa (0,04 ± 0,009 - 0,44 ± 0,12).
Valittujen geenien (ag) ilmentymisprofiilit, jotka paljastettiin kvantitatiivisella PCR:llä. Numerot 6, 12 ja 24 edustavat tunteja rokotuksen jälkeen. LanDExH7- ja LanTUB6-geenejä käytettiin normalisointiin ja LanTUB6-geenejä sarjojen väliseen kalibrointiin. Virhepalkit edustavat keskihajontaa, joka perustuu kolmeen biologiseen toistoon, joista jokainen on kolmen teknisen toiston keskiarvo. Inokuloitujen (Colletotrichum lupini, kanta Col-08, saatu vuonna 1999 lupiiniviljelmältä Wierzenicassa, Puolassa) ja kontrollikasvien (valeinokuloitu) ilmentymistasojen erojen tilastollinen merkitsevyys on merkitty yllä oleviin datapisteisiin (*P-arvo < 0,05, **P-arvo ≤ 0,01, ***P-arvo ≤ 0,001). Inokuloitujen (Colletotrichum lupini, kanta Col-08, saatu vuonna 1999 lupiiniviljelmältä Wierzenicassa, Puolassa) ja kontrollikasvien (valeinokuloitu) ilmentymistasojen erojen tilastollinen merkitsevyys on merkitty yllä oleviin datapisteisiin (*P-arvo < 0,05, **P-arvo ≤ 0,01, ***P-arvo ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм нпо Col-08, 1999 Col-08 с поля люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Tilastollisesti merkitsevät erot ilmentymistasoissa inokuloitujen (Colletotrichum lupini, kanta Col-08, saatu vuonna 1999 lupiinipellolta Wierzhenicessä, Puolassa) ja kontrollikasvien (valeinokuloitu) välillä on merkitty datapisteiden yläpuolelle (*P-arvo < 0,05, **P-arvo ≤ 0,01, ***P-arvo ≤ 0,001).接种 (Colletotrichum lupiini, Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数（标记在数） 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 姹煤 ）之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, **P ≤ 0,01, ***P.01, ***P.01 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штаменныйполулче, Col-08, люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены намхи отмечены над значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Tilastollisesti merkitsevät erot ilmentymistasoissa inokuloitujen (Colletotrichum lupini, kanta Col-08, saatu lupiinipelloilta Verzhenicessä, Puolassa, vuonna 1999) ja kontrollikasvien (valeinokuloitu) välillä on merkitty datapisteiden yläpuolelle (*P-arvo < 0,05, **P-arvo ≤ 0,01, ***P-arvo ≤ 0,001).Analysoidut NLL-kannat olivat: 83A:476 (resistentti, kantaa homotsygoottista Lanr1-alleelia), Mandelup (kohtalaisen resistentti, kantaa homotsygoottista AnMan-alleelia), Boregine (resistentti, tuntematon geneettinen tausta) ja populaatio 22660 (herkkä).
Lanr1-lokuksen kandidaattigeeni TanjilG_05042 osoitti huomattavasti erilaisen ilmentymiskuvion RNA-sekvensointitutkimuksista saatuihin profiileihin verrattuna (kuva 6e). Tämän geenin merkittävää aktivoitumista havaittiin Mandelupissa ja 22660-populaatiossa (jopa 39,7- ja 11,7-kertaisesti), mikä johti suhteellisen korkeisiin ilmentymistasoihin (jopa 1,4 ± 0,14- ja 7,2 ± 1,3-kertaisesti). 83A:476 paljasti myös TanjilG_05042-geenin jonkin verran lisääntynyttä ilmentymistä (jopa 3,8-kertaisesti), mutta saavutetut suhteelliset ilmentymistasot (0,044 ± 0,002) olivat yli 30 kertaa alhaisemmat kuin Mandelupissa ja 22660-populaatiossa havaitut. qPCR:llä analysoiduissa genotyyppien ilmentymistasoissa havaittiin merkittäviä eroja kontrollirokotetuissa (kontrolli) varianteissa, ja ero oli 58-kertainen populaatioiden 22660 ja 83A:476 sekä populaatioiden 22660 ja 22660 välillä. Boreginen ja Mandalupin välillä saavutettiin kaksinkertainen ero.
AnMan-lokuksen kandidaattigeeni, TanjilG_12861, aktivoitui rokotusvasteena 83A:476- ja Mandelup-kannoilla, oli neutraali 22660-populaatiossa ja sen ilmentyminen oli vähentynyt Boregine-kannalla (kuva 6f). TanjilG_12861-geenin suhteellinen ilmentyminen oli korkeinta inokuloidussa 83A:476-kannassa (0,14±0,01). 17,4 kDa:n luokan I lämpöshokkiproteiinigeenin TanjilG_05080 HSP17.4 suhteelliset ilmentymistasot olivat alhaisemmat kaikissa tutkituissa kannoissa ja aikapisteissä (kuva 6g). Korkein arvo havaittiin 24. päivän rokotuspäivänä 22660-populaatiossa (0,14 ± 0,02, kahdeksankertainen kasvu rokotusvasteessa).
Geeniekspressioprofiilien vertailu (kuva 7) paljasti korkean korrelaation TanjilG_10657:n ja neljän muun geenin välillä: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) ja TanjilG_04706 (r = 0,79). Tällaiset tulokset voivat viitata näiden geenien yhteissäätelyyn puolustusvasteiden aikana. TanjilG_12861- ja TanjilG_23384-geenit osoittivat erilaisia ​​ilmentymisprofiileja ja matalampia Pearsonin korrelaatiokertoimien arvoja (0,08–0,43 ja -0,19–0,28) verrattuna muihin geeneihin.
Geeniekspressioprofiilien välisiä korrelaatioita havaittiin kvantitatiivisella PCR:llä. Seuraavat kapealehtiset lupiinilinjat analysoitiin: 83A:476 (resistentti, kantaa homotsygoottista Lanr1-alleelia), Mandelup (kohtalaisen resistentti, kantaa homotsygoottista AnMan-alleelia), Boregine (resistentti, geneettinen tausta tuntematon) ja populaatio 22660 (herkkä). Laskettiin kolme ajankohtaa (6, 12 ja 24 tuntia rokotuksen jälkeen), mukaan lukien inokuloidut (Colletotrichum lupini, kanta Col-08, saatu lupiinipelloilta Wierzhenicessä, Puolassa, vuonna 1999) ja kontrollikasvit (valeinokuloitu). Asteikko näyttää Pearsonin korrelaatiokertoimen arvon.
6 hevosvoiman tuumalla teholla saatujen tietojen perusteella WGCNA suoritettiin 9981 DEG:llä, joka tunnistettiin vertaamalla inokuloituja ja kontrollikasveja keskittyen varhaisiin puolustusvasteisiin (lisätaulukko S12). Löydettiin 22 geenimoduulia (klusteria), joilla oli korreloivia (positiivisia tai negatiivisia) ilmentymisprofiileja genotyyppien ja kokeellisten varianttien välillä. Geenien ilmentymistasot olivat keskimäärin laskevassa järjestyksessä 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populaatio 22660 (molemmissa varianteissa tämä suuntaus oli kuitenkin voimakkaampi kontrollikasveissa). Geenien ilmentymistasot olivat keskimäärin laskevassa järjestyksessä 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populaatio 22660 (molemmissa varianteissa tämä suuntaus oli kuitenkin voimakkaampi kontrollikasveissa). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Asukasluku 22660 (в обоих вариантац, эдентац, эдентах, нотац, была сильнее у контрольных растений). Geenien ilmentymistasot laskivat keskimäärin järjestyksessä 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populaatio 22660 (molemmissa varianteissa tämä suuntaus oli kuitenkin voimakkaampi kontrollikasveissa).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Asukasluku 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）.平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> väkiluku 22660 的 顺序 伋降 （Ｇ 在在 在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。... В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Asukasluku 22660 (однако в обоих варинянтахледебентах сильнее у контрольных растений). Geenien ilmentymistasot laskivat keskimäärin sarjassa 83A:476 > Mandelup > Boregine > populaatio 22660 (molemmissa varianteissa tämä trendi oli kuitenkin voimakkaampi kontrollikasveissa).Rokottaminen johti geenien ilmentymisen lisääntymiseen, erityisesti moduuleissa 18, 19, 14, 6 ja 1 (vaikutuksen laskevassa järjestyksessä), negatiivisessa säätelyssä (esim. moduulit 9 ja 20) tai neutraaleissa vaikutuksissa (esim. moduulit 11, 22, 8 ja 13). GO-termien rikastusanalyysi (lisätaulukko S13) paljasti "GO: 0006952 Suojaavat vasteet" inokuloidulle moduulille (18) maksimaalisella aktivaatiolla, mukaan lukien qPCR:llä analysoidut geenit (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 ja TanjilG_27015), sekä monet eniten inokuloidut fotosynteesimoduulit (9). Moduulin 18 konsentraattori (kuva 8) tunnistettiin TanjilG_26536-geeniksi, joka koodaa PR-10:n kaltaista LlR18B-proteiinia, ja moduulin 9 konsentraattori tunnistettiin TanjilG_28955-geeniksi, joka koodaa fotosysteemi II:n PsbQ-proteiinia. Antraknoosiresistenssigeenin Lanr1-kandidaatti, TanjilG_05042, löydettiin moduulista 22 (kuva 9), ja se yhdistetään termeihin ”GO:0044260 Cellular macromolecular metabolic processes” ja ”GO:0006355 Transkriptionaalinen säätely, DNA-templaatti”, jotka sisältävät TanjilG_01212-keskittimen. Geeni koodaa lämpöstressin transkriptiotekijää A-4a (HSFA4a).
Yliedustettujen biologisten prosessitermien ”GO: 0006952 Defense responses” moduulien geenien koekspression painotettu verkostoanalyysi. Ligaatiota yksinkertaistettiin korostamaan neljä qPCR:llä analysoitua geeniä (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 ja TanjilG_27015).
Yliedustetun biologisen prosessitermin ”GO: 0006355: Transkriptionaalinen säätely, DNA-templaatti” sisältävän ja antraknoosiresistenssigeenin Lanr1 TanjilG_05042 kandidaattia kantavan moduulin geenien koekspression painotettu verkostoanalyysi. Ligaatiota yksinkertaistettiin TanjilG_05042-geenin ja keskeisen TanjilG_01212-geenin eristämiseksi.
Australiassa tehdyt antraknoosiresistenssiseulonnat osoittivat, että useimmat aikaisin julkaistut lajikkeet olivat alttiita; Kalya, Coromup ja Mandelup on kuvattu kohtalaisen resistenteiksi, kun taas Wonga, Tanjil ja 83A:476 on kuvattu erittäin resistenteiksi26,27,31. niillä oli sama resistenssialleeli, nimeltään Lanr1, ja Coromupilla ja Mandelupilla oli eri alleeli, nimeltään AnMan10,26,39, kun taas Kalya siirtyi eteenpäin eri alleelilla, Lanr2. Saksassa tehdyssä antraknoosiresistenssin seulonnassa tunnistettiin resistentti linja Bo7212, jonka kandidaattialleeli oli jokin muu kuin Lanr1, nimeltään LanrBo36.
Tutkimuksemme paljasti Lanr1-alleelin erittäin alhaisen esiintymistiheyden (noin 6 %) testatussa sukusolulinjassa. Tämä havainto on yhdenmukainen itäeurooppalaisten sukusolujen seulonnan tulosten kanssa, joissa käytettiin Anseq3- ja Anseq4-markkereita. Nämä osoittivat, että Lanr1-alleelia esiintyy vain kahdessa valkovenäläisessä linjassa. Tämä viittaa siihen, että Lanr1-alleelia ei vielä käytetä laajalti paikallisissa jalostusohjelmissa, toisin kuin Australiassa, jossa se on yksi markkeriavusteisen jalostuksen keskeisistä alleeleista. Tämä voi johtua Lanr1-alleelin tarjoamasta alhaisemmasta resistenssistä eurooppalaisissa kenttäolosuhteissa verrattuna australialaiseen raporttiin. Lisäksi antraknoosin tutkimukset Australian runsassateisilla alueilla ovat osoittaneet, että Lanr1-alleelin välittämät resistenssivasteet eivät välttämättä ole tehokkaita sääolosuhteissa, jotka suosivat patogeenin kasvua ja nopeaa kehitystä19,42. Itse asiassa tässä tutkimuksessa havaittiin joitakin antraknoosin oireita myös Lanr1-alleelia kantavissa genotyypeissä, mikä viittaa siihen, että resistenssi voi kadota C. lupinin kehitystä edistävissä optimaalisissa olosuhteissa. Lisäksi noin 1 cM:n päässä Lanr1-lokuksesta olevien Anseq3- ja Anseq4-markkereiden läsnäolosta on mahdollista saada vääriä positiivisia tulkintoja [28,30,43].
Tutkimuksemme osoitti, että Lanr1-alleelia kantava 83A:476 reagoi C. lupini -rokotukseen laajamittaisella transkriptomiuudelleenohjelmoinnilla ensimmäisessä analysoidussa ajankohdassa (6 hpi), kun taas Mandelupissa, jossa oli AnMan-alleeli, transkriptoomisia vasteita havaittiin paljon myöhemmin (24–48 hv). Nämä puolustusvasteiden ajalliset vaihtelut liittyvät taudin oireiden eroihin, mikä korostaa varhaisen patogeenin tunnistamisen merkitystä onnistuneelle resistenssivasteelle. Kasvikudoksen infektoimiseksi pernaruttoitiöiden on käytävä läpi useita kehitysvaiheita isännän pinnalla, mukaan lukien itäminen, solunjakautuminen ja appressoriumin muodostuminen. Lisäke on infektiivinen rakenne, joka kiinnittyy isännän pintaan ja helpottaa tunkeutumista isäntäkudoksiin. Näin ollen herneuutteessa olevat C. gloeosporioides -itiöt osoittivat tuman ensimmäisen jakautumisen 75–90 minuutin inkuboinnin jälkeen, ituputken muodostumisen 90–120 minuutin kuluttua ja suppression 4 tunnin kuluttua. Mango C. gloeosporioides -bakteerin konidioiden itävyys oli yli 40 % kolmen tunnin inkuboinnin jälkeen ja noin 20 % appressorien muodostuminen neljän tunnin kuluttua. C. gloeosporioides -bakteerin virulenssiin liittyvä CAP20-geeni osoitti transkriptionaalista aktiivisuutta epifyyttejä muodostavissa konidioissa 3,5 tunnin inkuboinnin jälkeen avokadon pintavahassa, jossa oli korkeita CAP20-proteiinipitoisuuksia, 4 tunnin 46 minuutin kuluttua. Vastaavasti melaniinin biosynteesigeenien aktiivisuus indusoitiin C. trifoliissa kahden tunnin inkuboinnin aikana, minkä jälkeen muodostui appressorium tunnin kuluttua. Lehtikudostutkimukset ovat osoittaneet, että C. acutatumilla inokuloiduilla mansikoilla on ensimmäinen suppressio 8 tunnin kuluttua inkuboinnista, kun taas C. coccodes -bakteerilla inokuloiduilla tomaateilla on ensimmäinen suppressio 4 tunnin kuluttua inkuboinnista48,49. Tämä on pitkälti yhdenmukaista Colletotrichum spp.:n tartuntaprosessin aikaskaalan kanssa. Nopeat puolustusvasteet 83A:476:lle viittaavat kasvien resistenssi- ja efektorien laukaiseman immuniteetin (ETI) geenien osallisuuteen tässä solussa, kun taas Mandelupin viivästyneet vasteet tukevat mikro-assosioituneen molekyylikuvioiden laukaiseman immuniteetin (MTI) hypoteesia 50. Varhaiset vasteet 83A:476:lle ja Mandelupille. Osittainen päällekkäisyys ylös- tai alassäädeltyjen geenien välillä viivästyneessä vasteessa tukee myös tätä käsitystä, sillä ETI:tä pidetään usein nopeutuneena ja tehostuneena MTI-vasteena, joka huipentuu ohjelmoituun solukuolemaan infektiokohdassa, joka tunnetaan anafylaktisena sokkina 51,52.
Suurin osa yliedustetulla termillä Gene Ontology GO:0006952 ”Defense Response” yhdistetyistä geeneistä on stressin indusoiman paastoproteiinin 22 (samanlainen kuin SAM22) 11 homologia ja seitsemän tärkeintä lateksiproteiinin kaltaista (MLP) proteiinia. SAM22:n kaltaiset proteiinit 31, 34, 43 ja 423 osoittivat sekvenssien samankaltaisuutta. SAM22:n kaltaiset geenit osoittivat merkittävää ja pidempään kestävää aktivaatiota, mikä osoitti antraknoosiresistenssin lisääntymistä (83A:476 ja Boregine). MLP:n kaltaisten geenien ilmentyminen väheni kuitenkin vain linjoissa, joissa oli ehdokasresistenssialleeli (83A:476/Lanr1 6 hpi:n kohdalla ja Mandelup/AnMan 24 hpi:n kohdalla). On huomattava, että kaikki tunnistetut SAM22:n kaltaiset homologit ovat peräisin noin 105 kb:n kokoisesta geeniklusterista, kun taas MLP:n kaltaiset geenit ovat peräisin genomin eri alueilta. Tällaisten SAM22:n kaltaisten geenien koordinoitua aktivaatiota havaittiin myös aiemmassa tutkimuksessamme, jossa käsiteltiin NLL-solujen resistenssiä Diaporthetoxica-rokotukselle, mikä viittaa siihen, että ne osallistuvat puolustusvasteen horisontaalisiin komponentteihin. Tätä johtopäätöstä tukevat myös raportit SAM22:n kaltaisten geenien positiivisesta vasteesta vaurioon tai hoitoon salisyylihapolla, sieni-indusoijilla tai vetyperoksidilla.
MLP:n kaltaisten geenien on osoitettu reagoivan erilaisiin abioottisiin ja bioottisiin stressitekijöihin, mukaan lukien bakteeri-, virus- ja patogeeniset sieni-infektiot monissa kasvilajeissa55. Vasteiden suunnat tiettyihin kasvien ja patogeenien välisiin vuorovaikutuksiin vaihtelivat voimakkaasti lisääntyvästä (esim. puuvillan Verticillium dahliae -infektion aikana) merkittävästi vähenevään (esim. omenapuun Alternaria spp. -infektion jälkeen)56,57. MLP:n kaltaisen 423-geenin merkittävää vähenemistä on havaittu avokadon puolustusreaktioiden aikana F. niger -infektiota vastaan ​​ja omenapuun Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola ja Alternaria alternata -infektion aikana, jotka ovat omenan patotyyppejä58,59. Lisäksi MLP:n kaltaista 423-geeniä yliekspressoivilla omenakalluksilla oli alhaisempi resistenssiin liittyvien geenien ilmentyminen ja ne olivat alttiimpia sieni-infektioille59. Fusarium oxysporum f:n jälkeen MLP:n kaltainen 423-geeni oli myös suppressoitunut resistentissä tavallisen pavun alkioplasmassa. cn. Pavun infektio 60.
Muita RNA-sekvensointitutkimuksessamme tunnistettuja PR-10-perheen jäseniä olivat LlR18A- ja LlR18B-geenit vasteena ylössäätelylle, sekä lipidisiirtoproteiini DIR1:n ylössäädelty (1 geeni) tai alassäädelty (3 geeniä) geeni. Lisäksi WGCNA korostaa LlR18B-geeniä tämän moduulin keskuksena, joka on erittäin altis rokotukselle ja kantaa useita suojaavia vastegeenejä. LlR18A- ja LlR18B-geenit indusoitiin keltaisissa lupiinin lehdissä vasteena patogeenisille bakteereille, sekä NLL-varsissa D. toxica -rokotuksen jälkeen, kun taas näiden geenien riisihomologi, RSOsPR10, indusoitui nopeasti sieni-infektion vaikutuksesta, jonka oletetaan liittyvän jasmonihapon signalointireittiin53,61,62. DIR1-geeni koodaa epäspesifisiä lipidikuljetusproteiineja, joita tarvitaan systeemisen hankitun resistenssin (SAR) alkamiseen. Suojaavien reaktioiden kehittyessä DIR1-proteiini kulkeutuu infektiopesäkkeestä nilan läpi indusoiden SAR:n kaukaisissa elimissä. Mielenkiintoista kyllä, TanjilG_02313 DIR1 -geeni indusoitui merkittävästi ensimmäisessä aikapisteessä linjoissa 84A:476 ja populaatiossa 22660, mutta antraknoosiresistenssi kehittyi onnistuneesti vain linjassa 84A:476. Tämä voi viitata DIR1-geenin jonkinlaiseen alifunktionaalistumiseen NLL:ssä, koska loput kolme homologia reagoivat rokotukseen vain 83A:476-linjassa 6 hpi:n kohdalla, ja tämä vaste suuntautui alaspäin.
Tutkimuksessamme yleisimmät "GO:0055114 Redox-prosessiksi" kutsutun biologisen prosessin komponentit olivat sytokromi P450 -proteiini, peroksidaasi, linolihappo-9S-/13S-lipoksigenaasi ja 1-aminosyklopropaani-1-karboksyylihappooksidaasi. Lisäksi WGCNA määrittelee HSFA4a-homologin keskukseksi, joka kantaa moduuleja, kuten Lanr1-resistenssigeenikandidaatin TanjilG_05042. HSFA4a on osa kasvien ydintranskription redox-riippuvaista säätelyä.
Sytokromi P450 -proteiinit ovat oksidoreduktaaseja, jotka katalysoivat NADPH:ta ja/tai O2-riippuvaisia ​​hydroksylaatioreaktioita primaarisessa ja sekundaarisessa aineenvaihdunnassa, mukaan lukien vierasaineiden, hormonien, rasvahappojen, sterolien, soluseinän komponenttien, biopolymeerien ja suojaavien yhdisteiden biosynteesin aineenvaihdunta 69. Eräässä tutkimuksessamme kasvien sytokromi P450 -toiminnan vaihtelu väheni -10,6 log2:sta (kertalukumuutos) 5,7:ään suuren määrän muuttuneiden homologien (37) ja tiettyjen geenien vastekuvioiden erojen vuoksi, mikä heijastaa ylöspäin suuntautuvaa tarkistusta. Pelkästään RNA-sekvensointidatan käyttäminen NLL-geenien oletetun biologisen toiminnan selvittämiseen niin suuressa proteiinisuperperheessä olisi hyvin spekulatiivista. On kuitenkin syytä huomata, että jotkut sytokromi P450 -geenit liittyvät lisääntyneeseen resistenssiin patogeenisiä sieniä tai bakteereja vastaan, mukaan lukien osallisuus allergisiin reaktioihin 69,70,71.
Luokan III peroksidaasit ovat monitoiminnallisia kasvientsyymejä, jotka osallistuvat laajaan valikoimaan aineenvaihduntaprosesseja kasvien kasvun ja kehityksen aikana sekä reagoivat ympäristöstresseihin, kuten suolapitoisuuteen, kuivuuteen, korkeaan valon intensiteettiin ja patogeenien hyökkäyksiin72. Peroksidaasit osallistuvat useiden kasvilajien ja Anthracis-sienen (Anthracis) vuorovaikutukseen, mukaan lukien Stylosanthes humilis ja C. gloeosporioides, Lens culinaris ja C. truncatum, Phaseolus vulgaris ja C. lindemuthianum, Cucumis sativus ja C. lagenarium73,74,75,76. Vaste on erittäin nopea, joskus jopa 4 HPI:ssä, ennen kuin sieni tunkeutuu kasvikudokseen73. Peroksidaasigeeni reagoi myös D. toxica NLL -rokotukseen. Tyypillisten tehtäviensä lisäksi, jotka ovat oksidatiivisen purkauksen säätely tai oksidatiivisen stressin poistaminen, peroksidaasit voivat häiritä patogeenien kasvua luomalla fyysisiä esteitä, jotka perustuvat soluseinän vahvistumiseen tiettyjen yhdisteiden lignifioinnin, alayksiköiden muodostumisen tai silloittumisen aikana. Tämä toiminto voidaan in silico selittää TanjilG_03329-geenillä, joka koodaa oletettua ligniiniä muodostavaa anioniperoksidaasia. Tämän geenin ilmentyminen lisääntyi merkittävästi tutkimuksessamme 83A:476-resistentissä linjassa 6 HPI:n kohdalla, mutta ei muissa kannoissa ja aikapisteissä, jotka eivät reagoineet.
Linolihapon 9S-/13S-lipoksigenaasi on lipidien biosynteesin oksidatiivisen reitin ensimmäinen vaihe78. Tämän reitin tuotteilla on useita tehtäviä kasvinpuolustuksessa, mukaan lukien soluseinän vahvistaminen kalloosi- ja pektiinikerrostumien muodostumisen kautta sekä oksidatiivisen stressin säätely reaktiivisten happilajien tuotannon kautta79,80,81,82,83. Tässä tutkimuksessa linolihapon 9S-/13S-lipoksigenaasin ilmentyminen muuttui kaikissa kannoissa, mutta alttiissa populaatiossa 22660 lisääntynyt ilmentyminen vallitsi eri aikapisteissä, kun taas resistenttiä Lanr1:tä ja AnMan-alleelia kantavissa kannoissa se korostaa oksylipiinikerroksen monimuotoistumista suojaavissa pernaruttoreaktioissa näiden genotyyppien välillä.
1-aminosyklopropaani-1-karboksylaattioksidaasin (ACO) homologin ilmentyminen lisääntyi merkittävästi (9 geeniä) tai väheni (2 geeniä), kun se inokuloitiin lupiinilla. Kahta poikkeusta lukuun ottamatta kaikki nämä vasteet ilmenivät 6 hv:n kohdalla ajanhetkellä 83A:476. ACO-proteiinien välittämä entsymaattinen reaktio on etyleenin tuotannon nopeutta rajoittava vaihe ja on siksi erittäin säädelty84. Etyleeni on kasvihormoni, jolla on useita rooleja kasvien kehityksen ja abioottisiin ja bioottisiin stressiolosuhteisiin reagoinnin säätelyssä. ACO-transkription induktio ja etyleenin signalointireitin aktivointi lisäävät riisin vastustuskykyä hemibiotrofiselle oryzae oryzae -sienelle säätelemällä reaktiivisten happilajien ja fytoaleksiinien tuotantoa. Hyvin samankaltainen lehtien infektioprosessi, joka havaittiin M. oryzaen ja C. lupinin välillä88,89, tässä tutkimuksessa raportoidun 83A:476-linjan ACO-homologien merkittävän lisääntymisen taustalla muuttaa mahdollisuutta, että NLL-antraknoosieteenille, joka on keskeinen signalointivaihe molekyylireiteissä, aiheutuu resistenssi.
Tässä tutkimuksessa havaittiin monien fotosynteesiin liittyvien geenien laajamittaista suppressiota 6 hpi:n kohdalla 83A:476-populaatiossa ja 48 hpi:n kohdalla Mandeloopissa ja 22660-populaatiossa. Näiden muutosten laajuus ja eteneminen ovat verrannollisia tasoon. Tässä kokeessa havaittiin antraknoosiresistenssiä. Äskettäin fotosynteesiin liittyvien transkriptien voimakasta ja varhaista repressiota on raportoitu useissa kasvien ja patogeenien vuorovaikutusmalleissa, mukaan lukien patogeeniset bakteerit ja sienet. Fotosynteesiin liittyvien geenien nopea (joistakin vuorovaikutuksista alkaen 2 HPI:stä) ja globaali suppressio infektion seurauksena voi laukaista kasvien immuniteetin reaktiivisten happilajien käyttöön ja niiden vuorovaikutukseen salisyylihapporeitin kanssa allergisten reaktioiden välittämiseksi 90,94.
Yhteenvetona voidaan todeta, että vastustuskykyisimmän linjan (83A:476) puolustusvastemekanismeihin kuuluvat R-geenin nopea patogeenin tunnistus (oletettavasti TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) ja allergisen vasteen välittämä salisyylihapon ja etyleenin signalointi, jota seuraa pitkän kantaman SAR:n muodostuminen. Toimintaa tukee DIR-1-proteiini. On huomattava, että C. lupini -infektion biotrofinen jakso on hyvin lyhyt (noin 2 päivää), jota seuraa nekroottinen kasvu95. Siirtymä näiden vaiheiden välillä voi liittyä nekroosiin ja etyleenin indusoimien proteiinien ilmentymiseen, jotka toimivat isäntäkasvien yliherkkyysreaktioiden laukaisevina. Siksi aikaikkuna C. lupinin onnistuneelle kiinniotolle biotrofisessa vaiheessa on hyvin kapea. Redoksiin ja fotosynteesiin liittyvien geenien uudelleenohjelmointi, joka havaittiin 83A:476:ssa 6 hpi:n kohdalla, on yhdenmukainen sienirihmastojen etenemisen kanssa ja enteilee onnistuneen suojaavan vasteen kehittymistä biotrofisessa vaiheessa. Mandelupin ja 22660-populaation transkriptoomiset vasteet saattavat olla liian viivästyneitä sienen kiinniottamiseksi ennen nekroottiseen kasvuun siirtymistä, mutta Mandelup voi olla tehokkaampi kuin 22660-populaatio, koska PR-10-proteiinin suhteellisen nopea säätely edistää horisontaalista resistenssiä.
Kanonisen R-geenin ohjaama ETI näyttää olevan yleinen mekanismi pavun antraknoosiresistenssille. Näin ollen mallipalkokasvissa Medicago truncatula antraknoosiresistenssin välittää RCT1-geeni, joka kuuluu TIR-NBS-LRR97-kasvin R-geeniluokkaan. Tämä geeni antaa myös laaja-alaisen antraknoosiresistenssin sinimailaiselle, kun se siirretään alttiisiin kasveihin. Tavallisessa pavussa (P. vulgaris) on tähän mennessä tunnistettu yli kaksi tusinaa antraknoosiresistenssigeeniä. Joitakin näistä geeneistä löytyy alueilta, joilta puuttuu kanonisia R-geenejä, mutta monet muut sijaitsevat NBS-LRR-geeniryppään sisältävien kromosomien reunoilla, mukaan lukien TIR-NBS-LRR99. Koko genomin kattava SSR-tutkimus vahvisti myös NBS-LRR-geenin yhteyden antraknoosiresistenssiin tavallisessa pavussa. Kanoninen R-geeni löydettiin myös valkoisesta lupiinista 101 genomialueelta, joka sisältää tärkeimmän antraknoosiresistenssilokuksen.
Työmme osoittaa, että välitön resistenssireaktio, joka aktivoituu kasvitartunnan varhaisessa vaiheessa (mieluiten viimeistään 12 hpi), suojaa tehokkaasti kapealehtistä lupiinia patogeenisen Colletrichum lupini -sienen aiheuttamalta antraknoosilta. Käyttämällä suurta läpimenoaikaista sekvensointia osoitimme antraknoosiresistenssigeenien erilaiset ilmentymisprofiilit NLL-kasveissa Lanr1- ja AnMan-resistenssigeenien välittämänä. Onnistunut puolustus edellyttää redoksiin, fotosynteesiin ja patogeneesiin osallistuvien proteiinien geenien huolellista suunnittelua muutaman tunnin sisällä kasvin ensimmäisestä kosketuksesta patogeenin kanssa. Samankaltaiset suojaavat reaktiot, mutta ajallisesti viivästyneet, ovat paljon vähemmän tehokkaita kasvien suojaamisessa taudeilta. Lanr1-geenin välittämä pernaruttoresistenssi muistuttaa R-geenin tyypillistä nopeaa vastetta (efektorin laukaisema immuniteetti), kun taas AnMan-geeni todennäköisimmin tarjoaa horisontaalisen vasteen (mikrobiin liittyvän molekyylikuvion laukaisema immuniteetti), mikä tarjoaa kohtalaisen kestävyyden.
Antraknoosimerkkiaineiden seulontaan käytetyt 215 NLL-linjaa koostuivat 74 lajikkeesta, 60 risteyttämällä tai jalostamalla saadusta linjasta, 5 mutantista linjasta ja 76 villistä tai alkuperäisestä sukusolusta. Linjat tulivat 17 maasta, pääasiassa Puolasta (58), Espanjasta (47), Saksasta (27), Australiasta (26), Venäjältä (19), Valko-Venäjältä (7), Italiasta (5) ja muista linjoista 10 maasta. Joukko sisältää myös resistenttejä referenssilinjoja: 83A:476, Tanjil, Wonga, jolla on Lanr1-alleeli, ja Mandelup, jolla on AnMan-alleeli. Linjat saatiin Poznań Plant Breeding Ltd.:n (Wiatrowo, Puola) ylläpitämästä Euroopan lupiinien geenivaratietokannasta (lisätaulukko S1).
Kasveja kasvatettiin kontrolloiduissa olosuhteissa (valojakso 16 tuntia, lämpötila 25 °C päivällä ja 18 °C yöllä). Kaksi biologista toistoa analysoitiin. DNA eristettiin kolmen viikon ikäisistä lehdistä käyttämällä DNeasy Plant Mini Kit -pakkausta (Qiagen, Hilden, Saksa) protokollan mukaisesti. Eristetyn DNA:n laatu ja pitoisuus arvioitiin spektrofotometrisilla menetelmillä (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Analysoitiin antraknoosiresistenssigeeniä AnMan merkitsevä AnManM1-markkeri (peräisin lajikkeesta Mandelup) ja Lanr1-geeniä (peräisin lajikkeesta Tanjil) reunustavat markkerit Anseq3 ja Anseq4 (1,26,28). Resistentin alleelin homotsygootit pisteytettiin arvolla "1", alttiit "0" ja heterotsygootit 0,5.
Markkereiden AnManM1, AnSeq3 ja AnSeq4 seulonnan tulosten ja lopullisia seurantakokeita varten saatavien siementen perusteella valittiin 50 NLL-linjaa antraknoosiresistenssifenotyypitystä varten. Analyysi tehtiin kahtena rinnakkaisena tietokoneohjatussa kasvihuoneessa, jossa oli 14 tunnin valojakso ja lämpötila-alue 22 °C päivällä ja 19 °C yöllä. Siemenet raaputetaan (leikkaamalla siemenkuori pois alkion vastakkaiselta puolelta terävällä terällä) ennen kylvöä, jotta estetään siementen lepotila liian kovan siemenkuoren vuoksi ja varmistetaan tasainen itäminen. Kasvit kasvatettiin ruukuissa (11 × 11 × 21 cm) steriilillä mullalla (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsova, Puola). Inokulaatio tehtiin Colletotrichum lupini Col-08 -kannalla, joka oli kasvatettu vuonna 1999 kapealehtisten lupiinien varsista Verzhenitsassa, Suur-Puolassa (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E) pellolla. Hanki alue. Isolaatteja viljeltiin SNA-elatusaineessa 20 °C:ssa mustassa valossa 21 päivän ajan itiöiden muodostumisen indusoimiseksi. Neljä viikkoa kylvöstä, kun kasvit olivat saavuttaneet 4–6 lehtivaiheen, inokulaatio suoritettiin ruiskuttamalla konidiosuspensiota, jonka pitoisuus oli 0,5 x 106 konidiaa millilitraa kohden. Inokulaation jälkeen kasveja pidettiin pimeässä 24 tuntia noin 98 %:n kosteudessa ja 25 °C:n lämpötilassa konidioiden itämisen ja tartuntaprosessin helpottamiseksi. Kasveja kasvatettiin sitten 14 tunnin valoisassa jaksossa 22 °C päivällä ja 19 °C yöllä ja 70 % kosteudessa. Tautipisteytys tehtiin 22 päivää rokotuksen jälkeen ja vaihteli välillä 0 (immuuni) - 9 (erittäin altis) riippuen nekroottisten vaurioiden esiintymisestä tai puuttumisesta varsissa ja lehdissä. Lisäksi pisteytyksen jälkeen kasvien paino mitattiin. Markkerigenotyyppien ja tautifenotyyppien väliset suhteet laskettiin piste-kaksi-sekvenssikorrelaatioina (heterotsygoottisten markkerien puuttuminen antraknoosiresistenssifenotyypin analyysissä käytetystä linjajoukosta).