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Die Angustifolius-Lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) ist eine Hülsenfrucht, die zur Nahrungsmittelproduktion und Bodenverbesserung verwendet wird. Die weltweite Verbreitung der NLL als Nutzpflanze hat viele pathogene Pilze angezogen, darunter die Lupinen-Anthraknose, die die verheerende Anthraknose-Krankheit verursacht. Zwei Allele, Lanr1 und AnMan, die eine erhöhte Resistenz verleihen, wurden in der NLL-Züchtung verwendet, aber die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen sind unbekannt. In dieser Studie wurden die Marker Lanr1 und AnMan verwendet, um europäische NLL-Proben zu screenen. Die Prüfung des Impfstoffs in einer kontrollierten Umgebung bestätigte die Wirksamkeit beider resistenter Spender. Ein differentielles Genexpressionsprofil wurde an repräsentativen resistenten und anfälligen Linien durchgeführt. Anthraknose-Resistenz war mit einer Überexpression der Genontologie-Begriffe „GO:0006952 Abwehrreaktion“, „GO:0055114 Redoxprozess“ und „GO:0015979 Photosynthese“ verbunden. Darüber hinaus zeigte die Linie Lanr1(83A:476) rasch nach der Inokulation eine signifikante Transkriptom-Reprogrammierung, während die anderen Linien eine Verzögerung dieser Reaktion um etwa 42 Stunden zeigten. Abwehrreaktionen sind mit den Genen TIR-NBS, CC-NBS-LRR und NBS-LRR, zehn an der Pathogenese beteiligten Proteinen, Lipidtransferproteinen, Endoglucan-1,3-β-Glucosidase, glycinreichen Zellwandproteinen und Genen des reaktiven Sauerstofftransports assoziiert. Frühe Reaktionen auf 83A:476, einschließlich der sorgfältigen Unterdrückung von Genen, die mit der Photosynthese assoziiert sind, fielen mit einem erfolgreichen Schutz während der vegetativen Wachstumsphase der Pilzbiologie zusammen, was darauf hindeutet, dass ein Effektor die Immunität auslöst. Die Mandeloop-Reaktion wird verlangsamt, ebenso wie der gesamte horizontale Widerstand.
Die Schmalblättrige Lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) ist ein proteinreiches Getreide aus dem westlichen Mittelmeerraum1,2. Sie wird heute als Nutzpflanze für Tiere und Menschen angebaut. Aufgrund der Stickstofffixierung durch symbiotische stickstofffixierende Bakterien und der allgemeinen Verbesserung der Bodenstruktur gilt sie auch als Gründüngung in Fruchtfolgesystemen. Die NLL hat im letzten Jahrhundert einen rasanten Domestizierungsprozess durchlaufen und steht weiterhin unter hohem Züchtungsdruck3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Mit dem weit verbreiteten Anbau der NLL entwickelte sich durch die Ausbreitung pathogener Pilze eine neue landwirtschaftliche Nische und es entstanden neue, erntezerstörende Krankheiten. Das Bemerkenswerteste für Lupinenbauern und -züchter war das Auftreten der Anthraknose, die durch den pathogenen Pilz Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 verursacht wurde. Das Bemerkenswerteste für Lupinenbauern und -züchter war das Auftreten der Anthraknose, die durch den pathogenen Pilz Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 verursacht wurde. Die wichtigsten Beispiele für die Bekämpfung von Krankheiten und Krankheiten durch Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Besonders auffällig für Lupinenbauern und -züchter war das Auftreten der Anthraknose, die durch den pathogenen Pilz Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 verursacht wird.对于羽扇豆农民和饲养者来说,最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 Artikel.Sie haben die Möglichkeit, die Pflanze mit Colletotrichum lupini zu ernähren (Bondar)嵵Behaart。1 Die häufigste Verwendung für Fermenter und Selektoren von Lupinen ermöglicht die Ansteckung, Auswahl eines Krankheitserregers Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Am auffälligsten für Lupinenbauern und -züchter ist das Auftreten der Anthraknose, die durch den pathogenen Pilz Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 verursacht wird.Die ersten Berichte über die Krankheit kamen aus Brasilien und den USA. Typische Symptome traten dort 1912 bzw. 1929 auf. Etwa 30 Jahre später wurde der Erreger jedoch als Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz bezeichnet. & Sacc., Teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Telemorphon Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Teleomorph von Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., eine Gattung von Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., eine Gattung von Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in einer uralten Morphologie. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in „Gezielte Morphologie“. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .und H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。und H. Schlenk, .Vorläufige Phänotypisierungen der Krankheit aus der Mitte des 20. Jahrhunderts zeigten eine gewisse Resistenz bei NLL- und Gelblupinen (L. luteus L.), aber alle getesteten Weißlupinen (L. albus L.) waren sehr anfällig15,16. Studien haben gezeigt, dass die Entwicklung von Anthraknose mit erhöhten Niederschlägen (Luftfeuchtigkeit) und Temperaturen (im Bereich von 12 - 28 °C) einhergeht, was bei höheren Temperaturen zu einer Verletzung der Resistenz führt17, 18. Tatsächlich war die Zeit, die die Konidien zum Keimen und zum Ausbruch der Krankheit brauchten, bei 24 °C (4 Stunden) viermal kürzer als bei 12 °C (16 Stunden) unter Bedingungen hoher Luftfeuchtigkeit19. Die anhaltende globale Erwärmung hat also zur Verbreitung der Anthraknose geführt. Die Krankheit wurde jedoch in Frankreich (1982) und der Ukraine (1983) als Vorbote einer drohenden Gefahr beobachtet, damals von der Lupinenindustrie jedoch offenbar ignoriert20,21. Einige Jahre später verbreitete sich diese verheerende Krankheit über die ganze Welt und betraf auch wichtige Lupinenanbauländer wie Australien, Polen und Deutschland22,23,24. Nach einem Anthraknose-Ausbruch Mitte der 1990er Jahre konnten durch umfangreiche Screenings mehrere resistente Spender in NLL19-Proben identifiziert werden. Die Anthraknose-Resistenz von NLL wird durch zwei separate dominante Allele gesteuert, die in unterschiedlichen Keimplasmaquellen vorkommen: Lanr1 in den Sorten Tanjil und Wonga und AnMan in der Sorte Mandalay 25, 26. Diese Allele ergänzen die molekularen Marker, die die Selektion resistenten Keimplasmas in Züchtungsprogrammen unterstützen25,26,27,28,29,30. Die resistente Zuchtlinie 83A:476 mit dem Lanr1-Allel wurde mit der anfälligen Wildlinie P27255 gekreuzt, um eine RIL-Population zu erhalten, die sich hinsichtlich Anthraknose-Resistenz segregiert, wodurch es möglich wurde, den Lanr1-Locus dem Chromosom NLL-1131, 32, 33 zuzuordnen. Durch Abgleich der Kopplungskartenmarker flankierender Resistenzloci gegen Anthraknose mit einem genomischen Rahmenwerk NLL wurde die Lage aller drei Allele auf demselben Chromosom (NLL-11), jedoch an unterschiedlichen Positionen, ermittelt29,34,35. Aufgrund der geringen Zahl an RILs und der großen genetischen Distanz zwischen den Markern und den entsprechenden Allelen lassen sich jedoch keine verlässlichen Rückschlüsse auf die ihnen zugrunde liegenden Gene ziehen. Andererseits ist die Anwendung der Reverse Genetik bei Lupinen schwierig, da ihr Regenerationspotenzial sehr gering ist und die genetische Manipulation dadurch umständlich wird37.
Die Entwicklung domestizierten Keimplasmas, das das gewünschte Allel im homozygoten Zustand trägt, wie 83A:476 (Lanr1) und Mandelup (AnMan), hat die Tür zur Untersuchung der Anthraknose-Resistenz angesichts des Vorhandenseins gegensätzlicher Allelkombinationen in Wildpopulationen geöffnet. Möglichkeiten molekularer Mechanismen. Vergleich der von bestimmten Genotypen hervorgerufenen Abwehrreaktionen. In dieser Studie wurde die frühe Transkriptomreaktion von NLL auf eine Impfung mit C. lupini untersucht. Zunächst wurde ein europäisches NLL-Keimplasma-Panel mit 215 Linien mithilfe molekularer Marker gescreent, die die Allele Lanr1 und AnMan kennzeichnen. Anschließend wurde unter kontrollierten Bedingungen eine Anthraknose-Phänotypisierung an 50 NLL-Linien durchgeführt, die zuvor anhand molekularer Marker ausgewählt worden waren. Auf der Grundlage dieser Experimente wurden vier Linien mit unterschiedlicher Anthraknose-Resistenz und unterschiedlicher Lanr1/AnMan-Allelzusammensetzung für ein differentielles Profiling der Abwehrgenexpression ausgewählt. Dabei wurden zwei komplementäre Ansätze verwendet: Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung und Echtzeit-PCR-Quantifizierung.
Das Screening eines Satzes von NLL-Keimplasma (N = 215) mit den Markern Lanr1 (Anseq3 und Anseq4) und AnMan (Anseq4) und AnMan (AnManM1) zeigte, dass nur eine Linie (95726, nahe Salamanca-b) das „Resistenz“-Allel für alle Marker amplifiziert, während „Vorhandensein ‚anfälliger‘ Allele“ den Anteil aller Marker in 158 (~ 73,5 %) Linien fand. Dreizehn Linien produzierten zwei „resistente“ Allele des Lanr1-Markers und 8 Linien produzierten „resistente“ Allele des Lanr1-Markers. Das „Resistenz“-Allel des AnMan-Markers (Ergänzende Tabelle S1). Zwei Linien waren heterozygot für den Anseq3-Marker und eine heterozygot für den AnManM1-Marker. 42 Linien (19,5 %) trugen entgegengesetzte Phasen der Anseq3- und Anseq4-Allele, was auf eine hohe Rekombinationshäufigkeit zwischen diesen beiden Loci hindeutet. Anthraknose-Phänotypen unter kontrollierten Bedingungen (Ergänzungstabelle S2) zeigten eine Variabilität in der Resistenz der getesteten Genotypen, die sich im Schweregrad der Anthraknose widerspiegelte. Die Unterschiede in den Durchschnittswerten lagen zwischen 1,8 (mäßig resistent) und 6,9 (anfällig), und die Unterschiede im Pflanzengewicht lagen zwischen 0,62 (anfällig) und 4,45 g (resistent). Es gab eine signifikante Korrelation zwischen den in zwei Wiederholungen des Experiments beobachteten Werten (0,51 für den Schweregrad der Krankheit, P = 0,00017 und 0,61 für das Pflanzengewicht, P < 0,0001) sowie zwischen diesen beiden Parametern (− 0,59 und − 0,77, P < 0,0001). Es gab eine signifikante Korrelation zwischen den in zwei Wiederholungen des Experiments beobachteten Werten (0,51 für den Schweregrad der Krankheit, P = 0,00017 und 0,61 für das Pflanzengewicht, P < 0,0001) sowie zwischen diesen beiden Parametern (− 0,59 und − 0,77, P < 0,0001). Die meisten Ergebnisse wurden in zwei verschiedenen Tests ermittelt (0,51 für die meisten Tests, P = 0,00017 und). 0,61 für Massenabmessungen, P < 0,0001), zusätzlich zu diesen beiden Parametern (-0,59 und -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Es wurde eine signifikante Korrelation zwischen den in zwei Wiederholungen des Experiments beobachteten Werten (0,51 für Krankheitsschwerewerte, P = 0,00017 und 0,61 für Pflanzengewicht, P < 0,0001) sowie zwischen diesen beiden Parametern (- 0,59 und -0,77, P < 0,0001) 0,0001) festgestellt.Der Wert beträgt 0,51, P = 0,00017, 0,61, P < 0,0001, 0,59 0,77, P < 0,0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为0,51, p = 0,00017, 0,61, p <0,0001) 0,59 0,59和– 0,59 和– 0,59 和- 0,77，P < 0,0001)。 Es wurden innerhalb von 14 Stunden erste Korrelationen ermittelt, die auf zwei Ebenen festgelegt wurden (Zielpunktzahl 0,51, P = 0,00017 und Masse). Größe 0,61, P <0,0001) und zwischen diesen beiden Parametern (-0,59 und -0,0001) 0,77, P <0,0001. Es gab eine signifikante Korrelation zwischen den im Duplikat beobachteten Werten (Krankheitsschweregrad 0,51, P = 0,00017 und Pflanzengewicht 0,61, P < 0,0001) und zwischen diesen beiden Parametern (-0,59 und -0,0001) 0,77, P < 0,0001. ).Typische Symptome anfälliger Pflanzen sind das Knicken und Verdrehen des Stängels, das einer Hirtenbogenstruktur ähnelt, gefolgt von ovalen Läsionen mit orange-rosa Sporozoiten (Ergänzende Abbildung 1). Australische Akzessionen mit den Genen Lanr1 (83A:476 und Tanjil) und AnMan (Mandelup) sind mäßig resistent (0,0331 bzw. 0,0036). Einige Linien, die ebenfalls „resistente“ Lanr1- und/oder AnMan-Allele tragen, zeigen Krankheitssymptome.
Interessanterweise zeigten einige NLL-Linien ohne jegliches „resistente“ Markerallel eine hohe Anthraknose-Resistenz (vergleichbar oder höher als bei den Genotypen Lanr1 oder AnMan), wie beispielsweise Boregine (P-Wert < 0,0001 für beide Parameter), Bojar (P-Wert < 0,0001 für die Punktzahl und 0,001 für das Pflanzengewicht) und Population B-549/79b (P-Wert < 0,0001 für die Punktzahl und nicht signifikant für das Gewicht). Interessanterweise zeigten einige NLL-Linien ohne jegliches „resistente“ Markerallel eine hohe Anthraknose-Resistenz (vergleichbar oder höher als bei den Genotypen Lanr1 oder AnMan), wie beispielsweise Boregine (P-Wert < 0,0001 für beide Parameter), Bojar (P-Wert < 0,0001 für die Punktzahl und 0,001 für das Pflanzengewicht) und Population B-549/79b (P-Wert < 0,0001 für die Punktzahl und nicht signifikant für das Gewicht). Interessant ist, dass die NLL-Linie, die mit der „Resistenz“-Markierung begonnen hat, eine Reihe von Anträgen auf die Ansteckung gestellt hat (kompatibel oder sehr beliebt, z. B. für Lanr1-Genotypen oder AnMan), ebenso wie Boregine (Wert P <0,0001 für bestimmte Parameter), Bojar (Wert P < 0,0001 für Faktoren und 0,001 für die Masse растения) и популяции B-549/79b (Sendung P <0,0001 für оценки и незначимо for массы). Interessanterweise zeigten mehrere NLL-Linien ohne jegliches „resistente“ Markerallel eine hohe Resistenz gegen Anthraknose (vergleichbar mit oder höher als bei den Genotypen Lanr1 oder AnMan), wie z. B. Boregine (P-Wert < 0,0001 für beide Parameter), Bojar (P-Wert < 0,0001 für die Auswertung und 0,001 für das Pflanzengewicht) und die Population B-549/79b (P-Wert < 0,0001 für die Auswertung und nicht signifikant für das Gewicht).有趣的是,一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1或AnMan 基因型相当或更高）, 例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0,0001,植物重量为0,001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001,重量不显着）. Interessant ist, dass einige NLL-Systeme, die über keine „antigenen“ Marker verfügen, eine hohe horizontale Resistenz aufweisen (entsprechend den Genen Lanr1 oder AnMan oder höher), wie z. B. Boregine (beide Parameter P < 0,0001), Bojar (P-Wert < 0,0001, Pflanzengewicht 0,001) und Stamm B-549/79b (P-Wert < 0,0001, Gewicht nicht signifikant). Interessanterweise haben die NLL-Vertreter, die sich mit der „Resistenzsicherung“ auskennen, eine Reihe von Anträgen auf eine Ansteckungsmethode gestellt oder andere, einschließlich der Gentypen Lanr1 oder AnMan), wie Boregine (Wert P für Parameter <0,0001), Bojar (Wert P <0,0001, Mindestgröße 0,001) und Bevölkerung B-549/79b (Ozean P-Zitat <0,0001, nicht ausreichend). Interessanterweise zeigten einige NLL-Linien ohne jegliche „Resistenz“-Markerallele eine hohe Anthraknose-Resistenz (vergleichbar mit oder höher als die Genotypen Lanr1 oder AnMan), wie beispielsweise Boregine (P-Wert für beide Parameter < 0,0001), Bojar (P-Wert < 0,0001, Pflanzengewicht 0,001) und Population B-549/79b (P-Wert < 0,0001, Gewicht nicht signifikant).Dieses Phänomen deutet auf eine neue genetische Resistenzquelle hin und erklärt den beobachteten Mangel an Korrelation zwischen Markergenotypen und Krankheitsphänotypen (P-Werte von ~0,42 bis ~0,98). Der Kolmogorov-Smirnov-Test zeigte, dass die Daten zur Anthraknose-Resistenz für die Werte (P-Werte 0,25 und 0,11) und die Pflanzenmasse (P-Werte 0,47 und 0,55) annähernd normal verteilt waren. Dies legt die Hypothese nahe, dass neben Lanr1 und AnMan weitere Allele beteiligt sind.
Basierend auf den Ergebnissen des Anthraknose-Resistenzscreenings wurden vier Linien für die Transkriptomanalyse ausgewählt: 83A:476, Boregine, Mandelup und Population 22660. Diese Linien wurden in Inokulationsexperimenten mittels RNA-Sequenzierung erneut auf Anthrax-Resistenz getestet, sofern sie dieselben waren wie im vorherigen Test. Die Score-Werte waren wie folgt: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) und Population 22660 (6,11 ± 1,29).
Das Illumina NovaSeq 6000-Protokoll erreichte durchschnittlich 40,5 Mread-Paare pro Probe (29,7 bis 54,4 Mreads) (Ergänzende Tabelle S3). Die Alignment-Scores in der Referenzsequenz lagen zwischen 75,5 % und 88,6 %. Die durchschnittliche Korrelation der Read-Count-Daten zwischen experimentellen Varianten und biologischen Replikaten lag zwischen 0,812 und 0,997 (Mittelwert 0,959). Von den 35.170 analysierten Genen zeigten 2.917 keine Expression und die anderen 4.785 Gene wurden auf einem vernachlässigbaren Niveau exprimiert (Basismittelwert < 5). Von den 35.170 analysierten Genen zeigten 2.917 keine Expression und die anderen 4.785 Gene wurden auf einem vernachlässigbaren Niveau exprimiert (Basismittelwert < 5). Im Jahr 2917 wurden 35.170 Personen nicht per E-Mail versendet, 4.785 Personen wurden am nächsten Tag (basiert) veröffentlicht Mitte <5). Von den 35.170 analysierten Genen zeigten 2.917 keine Expression und die restlichen 4.785 Gene wurden auf einem vernachlässigbaren Niveau exprimiert (Basismittelwert <5).Mehr als 35.170 US-Dollar, 2917 US-Dollar und 4785 US-Dollar个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）.35.170 Von 35.170 geprüften Personen im Jahr 2917 wurde keine Prüfung durchgeführt, während 4.785 Personen keine Prüfung durchführten (basierend auf der Website). значение <5). Von den 35.170 analysierten Genen wurden 2.917 nicht exprimiert und die restlichen 4.785 Gene wiesen eine vernachlässigbare Expression auf (Basismittelwert < 5).Somit betrug die Anzahl der während des Experiments als exprimierten Gene (Basismittelwert ≥ 5) 27.468 (78,1 %) (Ergänzende Tabelle S4).
Vom ersten Zeitpunkt an reagierten alle NLL-Linien auf die Inokulation mit C. lupini (Stamm Col-08) mit einer Reprogrammierung des Transkriptoms (Tabelle 1); es zeigten sich jedoch signifikante Unterschiede zwischen den Linien. So zeigte die Resistenzlinie 83A:476 (mit dem Lanr1-Gen) zum ersten Zeitpunkt (6 hpi) eine signifikante Reprogrammierung des Transkriptoms mit einer 31- bis 69-fachen Zunahme der Anzahl isolierter Up- und Down-Gene im Vergleich zu anderen Zeitpunkten zu diesem Zeitpunkt. Dieser Höhepunkt war zudem nur von kurzer Dauer, da die Expression nur weniger Gene zum zweiten Zeitpunkt (12 hpi) noch signifikant verändert war. Interessanterweise erfuhr Boregine, das im Graft-Test ebenfalls eine hohe Resistenz zeigte, während des Experiments keine solch massive transkriptionelle Reprogrammierung. Die Anzahl differentiell exprimierter Gene (DEG) war jedoch bei 12 HPI für Boregine und 83A:476 gleich. Sowohl Mandelup als auch Population 22660 zeigten zum letzten Zeitpunkt DEG-Spitzen (48 l/s), was auf eine relative Verzögerung der Abwehrreaktionen hindeutet.
Da 83A:476 im Vergleich zu allen anderen Linien nach 6 HPI eine massive Transkriptom-Reprogrammierung als Reaktion auf C. lupini durchlief, waren etwa 91 % der zu diesem Zeitpunkt beobachteten DEGs linienspezifisch (Abb. 1). Es gab jedoch einige Überschneidungen in den frühen Reaktionen zwischen den untersuchten Linien, da sich 68,5 %, 50,9 % bzw. 52,6 % der DEGs in Boregine, Mandelup und Population 22660 zu bestimmten Zeitpunkten mit denen in 83A:476 überschnitten. Diese DEGs machten jedoch nur einen kleinen Teil (0,97–1,70 %) aller derzeit mit 83A:476 nachgewiesenen DEGs aus. Darüber hinaus waren zu diesem Zeitpunkt 11 DEGs aus allen Linien kohärent (Ergänzende Tabellen S4-S6), darunter gemeinsame Komponenten der Abwehrreaktionen von Pflanzen: Lipidtransferprotein (TanjilG_32225), Endoglucan-1,3-β-Glucosid-Enzym (TanjilG_23384), zwei stressinduzierbare Proteine ​​wie SAM22 (TanjilG_31528 und TanjilG_31531), basisches Latexprotein (TanjilG_32352) und zwei glycinreiche strukturelle Zellwandproteine ​​(TanjilG_19701 und TanjilG_19702). Es gab auch eine relativ hohe Überlappung der Transkriptomreaktionen zwischen 83A:476 und Boregine bei 24 HPI (insgesamt 16–38 % DEG) und zwischen Mandelup und Population 22660 bei 48 HPI (insgesamt 14–20 % DEG).
Venn-Diagramm, das die Anzahl der differentiell exprimierten Gene (DEG) in Schmalblättrigen Lupinenlinien (NLL) zeigt, die mit Colletotrichum lupini (Stamm Col-08, gewonnen aus Lupinenfeldern in Wierzhenice, Polen, 1999) geimpft wurden. Die analysierten NLL-Linien waren: 83A:476 (resistent, Träger des Lanr1-Allels), Boregine (resistent, genetischer Hintergrund unbekannt), Mandelup (mäßig resistent, Träger des AnMan-Allels) und Population 22660 (sehr anfällig). Die Abkürzung hpi steht für Stunden nach Impfung. Nullwerte wurden zur Vereinfachung der Grafik entfernt.
Der Satz überexprimierter Gene bei 6 hpi wurde auf das Vorhandensein kanonischer R-Gendomänen untersucht (Ergänzungstabelle S7). Diese Studie zeigte eine Transkriptominduktion klassischer Krankheitsresistenzgene mit NBS-LRR-Domänen nur bei 83A:476. Dieser Satz bestand aus einem TIR-NBS-LRR-Gen (tanjilg_05042), fünf CC-NBS-LRR-Genen (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 und tanjilg_16162), vier NBS-LR, Tanjilg_16162) und vier NBS-LRRE (tanjilg_16162) sowie vier NBS-Lrr (tanjilg_16162) und vier NBS-LRR (TANJILG_16162). Alle diese Gene haben kanonische Domänen, die in konservierten Sequenzen angeordnet sind. Zusätzlich zu den NBS-LRR-Domänengenen wurden mehrere RLL-Kinasen nach 6 hpi aktiviert, nämlich eine in Boregine (TanjilG_19877), zwei in Mandelup (TanjilG_07141 und TanjilG_19877) und in Population 22660 (TanjilG_09014 und TanjilG_10361) sowie zwei in 83A 27:476.
Gene mit signifikant veränderter Expression als Reaktion auf die Inokulation mit C. lupini (Stamm Col-08) wurden einer Gene Ontology (GO)-Anreicherungsanalyse unterzogen (Ergänzungstabelle S8). Der am häufigsten überrepräsentierte Begriff des biologischen Prozesses war „GO:0006952 Abwehrreaktion“, der in 6 von 16 (Zeit × Linie) Kombinationen mit hoher Signifikanz (P-Wert < 0,001) auftrat (Abb. 2). Der am häufigsten überrepräsentierte Begriff des biologischen Prozesses war „GO:0006952 Abwehrreaktion“, der in 6 von 16 (Zeit × Linie) Kombinationen mit hoher Signifikanz (P-Wert < 0,001) auftrat (Abb. 2). Der erste Teil des biologischen Prozesses lautete: „GO: 0006952 gesperrter Kommentar“, gefolgt von 6 von 16 (Zeitraum × Zeit) Kombination mit einem bestimmten Wert (Wert P <0,001) (Risk. 2). Der am häufigsten überrepräsentierte Begriff des biologischen Prozesses war „GO:0006952 Abwehrreaktion“, der in 6 von 16 (Zeit × Abstammung) Kombinationen mit hoher Signifikanz (P-Wert < 0,001) auftrat (Abb. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应“, 它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 Der repräsentativste Begriff für biologische Prozesse ist „GO:0006952 Abwehrreaktion“, der in 6 der 16 (Wort × Wort)-Kombinationen mit hoher Signifikanz (P-Wert < 0,001) (Zahl 2) vorkommt. Der erste Teil des vorläufigen biologischen Prozesses lautete „GO: 0006952 Defense Response“ und war in Kombination mit 6 von 16 (Zeiten) verfügbar × Linien) mit высокой значимостью (значение P <0,001) (Ris. 2). Der am häufigsten überrepräsentierte Begriff des biologischen Prozesses war „GO:0006952 Defense Response“, der in 6 von 16 Kombinationen (Zeit × Linie) mit hoher Signifikanz (P-Wert < 0,001) auftrat (Abb. 2).Dieser Begriff war zu zwei Zeitpunkten in 83A: 476 und Boregine (6 bzw. 24 hpi) sowie zu einem Zeitpunkt in Mandelup und Population 22660 (12 bzw. 6 hpi) überrepräsentiert. Dies ist ein erwartetes Ergebnis, das die antimykotische Reaktion der resistenten Linien unterstreicht. Darüber hinaus reagierte 83A:476 auf C. lupini mit der schnellen Induktion von Genen, die mit dem oxidativen Ausbruch in Zusammenhang stehen, der durch den Begriff „GO:0055114 Redoxprozess“ repräsentiert wird, was auf eine spezifische Abwehrreaktion hindeutet, während Boregine spezifische Abwehrreaktionen zeigte, die mit dem Begriff „GO“ in Zusammenhang stehen. :0006950 Stressreaktion“. Population 22660 aktivierte die horizontale Resistenzreaktion unter Beteiligung sekundärer Metaboliten, was die übermäßige Anzahl der Terme „GO:0016104 Prozess der Triterpenbiosynthese“ und „GO:0006722 Prozess des Triterpenstoffwechsels“ hervorhebt (beide Terme gehören zum selben Gensatz). Unter Berücksichtigung der Ergebnisse der GO-Term-Anreicherungsanalyse lag die Stabilität der Mandelup-Reaktion zwischen der von Boregine und Population 22660. Außerdem umfassen die frühe Reaktion 83A:476 (6 hpi) und die verzögerte Reaktion Mandelup und Population 22660 den Term GO:0015979 ‚Photosynthese‘ und andere damit verbundene biologische Prozesse.
Die in der Annotation der differentiell exprimierten Gene während der Transkriptomreaktionen der Schmalblättrigen Lupine (NLL), die 1999 mit Anthrax-Lupine (Stamm Col-08 aus Lupinenfeldern in Wierzhenice, Polen) geimpft wurde, ausgewählten Begriffe der Bioprozess-Genontologie sind stark übertrieben. Die analysierten NLL-Linien waren: 83A:476 (resistent, Träger des homozygoten Lanr1-Allels), Boregine (resistent, unbekannter genetischer Hintergrund), Mandelup (mäßig resistent, Träger des homozygoten AnMan-Allels) und Population 22660 (anfällig).
Da diese Studie darauf abzielte, Gene zu identifizieren, die zur Anthraknose-Resistenz beitragen, wurden die den Begriffen „GO: 0006952 Abwehrreaktionen“ und „GO: 0055114 Redoxprozesse“ zugeordneten Gene mit Cut-offs analysiert, da die Basislinienmittelwerte ≥ 30 waren und mindestens eine Zeile × Zeitpunkt statistisch signifikante Werte von log2 (Faltungsänderung) kombinierte. Die Anzahl der Gene, die diese Kriterien erfüllten, betrug 65 für GO:0006952 und 524 für GO:0055114.
83A:476 zeigte zwei DEG-Peaks, die mit dem Begriff GO:0006952 annotiert waren, den ersten bei 6 Genen pro Zoll (64 Gene, Hoch- und Herunterregulierung) und den zweiten bei 24 Genen pro Zoll (15 Gene, nur Hochregulierung). Boregine zeigte auch, dass GO:0006952 zum gleichen Zeitpunkt seinen Höhepunkt erreichte, jedoch mit weniger DEG (11 und 8) und bevorzugter Aktivierung. Mandeloop zeigte zwei Peaks von GO:0006952 bei 12 und 48 HPI, beide mit 12 Genen (der erste mit aktivierenden Genen, der zweite nur mit unterdrückenden Genen), während die 22660-Population bei 6 HPI (13 Gene) eine stärkere Dominanz des Anstiegs-Peaks aufwies. Regulierung. Es ist zu beachten, dass 96,4 % von GO:0006952 DEG in diesen Peaks dieselbe Art von Reaktion (nach oben oder unten) aufwiesen, was auf eine erhebliche Überschneidung der Abwehrreaktionen trotz Unterschieden in der Anzahl der beteiligten Gene hindeutet. Die größte Gruppe von Sequenzen, die mit dem Begriff GO:0006952 in Zusammenhang stehen, kodiert das Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-ähnlich), das zur Proteinklade der Pathogenese-assoziierten Proteine ​​(PR-10) der Klasse 10 und zum Kernprotein Latex gehört. Ähnliches (MLP-ähnlich) Protein) Protein (Abb. 3). Die beiden Gruppen unterschieden sich in der Art der Expression und der Richtung der Reaktion. Die Gene, die SAM22-ähnliche Proteine ​​kodieren, zeigten zu frühen Zeitpunkten (6 oder 12 hpi) eine konsistente und signifikante Induktion und reagierten am Ende des Experiments (48 hpi) im Allgemeinen nicht mehr, während MLP-ähnliche Proteine ​​bei 6 hpi eine Koordination zeigten. 83A:476 und Mandelup bei 48 hp/in reagierten fast alle anderen Datenpunkte nicht. Darüber hinaus folgten Unterschiede in den Expressionsprofilen von SAM22-ähnlichen Proteingenen der beobachteten Variabilität der Anthraknose-Resistenz, da resistentere Linien mehr Zeitpunkte hatten, die diese Gene signifikant induzierten als anfälligere Gene. Ein weiteres LlR18A/B-ähnliches PR-10-Gen zeigte ein sehr ähnliches Expressionsmuster wie das SAM22-ähnliche Proteingen.
Die Hauptkomponenten des biologischen Prozessbegriffs „GO:0006952 Abwehrreaktion“ und die Expressionsmuster von Kandidatengenen der Lanr1- und AnMan-Allele wurden identifiziert. Die Log2-Skala repräsentiert log2-Werte (Veränderungsfaktor) zwischen inokulierten (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, gewonnen aus Lupinenfeldern, Wizhenica, Polen, 1999) und Kontrollpflanzen (scheininokuliert) zum gleichen Zeitpunkt. Folgende schmalblättrige Lupinenlinien wurden analysiert: 83A:476 (resistent, Träger des homozygoten Lanr1-Allels), Boregine (resistent, genetischer Hintergrund unbekannt), Mandelup (mäßig resistent, Träger des homozygoten AnMan-Allels) und Population 22660 (anfällig).
Zusätzlich wurden die Expressionsprofile der RNA-seq-Kandidatengene Lanr1 (TanjilG_05042) und AnMan (TanjilG_12861) ausgewertet (Abb. 3). Das Gen TanjilG_05042 zeigte nur zum ersten Zeitpunkt (6 hpi) eine signifikante Reaktion (Aktivierung) bei 83A:476, während TanjilG_12861 in Mandeloop nur zu zwei Zeitpunkten signifikant war: 6 hpi (Herunterregulierung) und 24 hpi (6 hpi). Mit.). einstellbar) ).
Die am stärksten überexprimierten Gene im Begriff „Redoxprozess“ GO:0055114 waren Gene, die für Cytochrom-P450-Proteine ​​und Peroxidase kodieren (Abb. 4). Bei Proben, die bei 6 HPI aus 83A:476 isoliert wurden, wurden im Allgemeinen maximale oder minimale log2-Werte (Faltungsänderung) (für 86,6 % der Gene) zwischen inokulierten und Kontrollpflanzen beobachtet, was die hohe Reaktion dieses Genotyps auf inokuliertes Geschlecht unterstreicht. 83A:476 zeigte bei 6 hpi das signifikanteste GO:0055114-DEG (503 Gene), während die übrigen Linien bei 48 hpi (Boregine, 31 Gene; Mandelup, 85 Gene; und Population 22660, 78 Gene)) waren. Bei den meisten Genen der GO:0055114-Familie wurden zwei Arten von Reaktionen auf die Impfung (Aktivierung und Hemmung) beobachtet. Interessanterweise wurden bis zu 97,6 % der für den Begriff GO: 0055114 in Mandelupe bei 48 hp identifizierten DEGs gefunden. Diese Beobachtungen legen nahe, dass das Muster der verzögerten Transkriptomreaktionen von Mandeloup auf Anthraknose trotz des deutlich geringeren Maßstabs (d. h. der Anzahl mutierter Redoxgene, 85 gegenüber 503) der frühen Reaktion von 83A:476 ähnelt. In Boregine und Population 22660 ist diese Konvergenz mit 51,6 % bzw. 75,6 % geringer.
Die Expressionsmuster der Hauptkomponenten des Begriffs „GO:0055114 Redoxprozess“ wurden aufgedeckt. Die Log2-Skala repräsentiert log2-Werte (Veränderungsfaktor) zwischen inokulierten (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, gewonnen aus Lupinenfeldern, Wizhenica, Polen, 1999) und Kontrollpflanzen (scheininokuliert) zum gleichen Zeitpunkt. Folgende schmalblättrige Lupinenlinien wurden analysiert: 83A:476 (resistent, Träger des homozygoten Lanr1-Allels), Boregine (resistent, genetischer Hintergrund unbekannt), Mandelup (mäßig resistent, Träger des homozygoten AnMan-Allels) und Population 22660 (anfällig).
83A:476 Transkriptomische Reaktionen auf die Inokulation mit C. lupini (Stamm Col-08) umfassten auch die koordinierte Stilllegung von Genen, die dem Begriff GO:0015979 „Photosynthese“ zugeordnet sind, und anderen verwandten biologischen Prozessen (Abb. 5). Dieser GO:0015979-DEG-Satz enthielt 105 Gene, die bei 6 hpi bei 83A:476 signifikant unterdrückt waren. In dieser Untergruppe waren 37 Gene in Mandelup bei 48 hpi und 35 zum gleichen Zeitpunkt in der Population 22660 herunterreguliert, darunter 19 DEGs, die beiden Genotypen gemeinsam waren. Keine der mit dem Begriff GO:0015979 verbundenen DEGs wurden in irgendeiner Kombination (Linie x Zeit) signifikant aktiviert.
Die Expressionsmuster der Hauptkomponenten des Begriffs „GO:0015979 Photosynthese“ wurden aufgedeckt. Die Log2-Skala repräsentiert log2-Werte (Veränderungsfaktor) zwischen inokulierten (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, gewonnen aus Lupinenfeldern, Wizhenica, Polen, 1999) und Kontrollpflanzen (scheininokuliert) zum gleichen Zeitpunkt. Folgende schmalblättrige Lupinenlinien wurden analysiert: 83A:476 (resistent, Träger des homozygoten Lanr1-Allels), Boregine (resistent, genetischer Hintergrund unbekannt), Mandelup (mäßig resistent, Träger des homozygoten AnMan-Allels) und Population 22660 (anfällig).
Basierend auf den Ergebnissen der Analyse der differentiellen Expression und vermutlich beteiligt an Abwehrreaktionen gegen pathogene Pilze wurde dieser Satz von sieben Genen für die Quantifizierung von Expressionsprofilen mittels Echtzeit-PCR ausgewählt (Ergänzungstabelle S9).
Das mutmaßliche Proteingen TanjilG_10657 wurde in allen untersuchten Linien und zu allen Zeitpunkten im Vergleich zu Kontrollpflanzen (Mimikry-Pflanzen) signifikant induziert (Ergänzende Tabellen S10, S11). Darüber hinaus zeigte das Expressionsprofil von TanjilG_10657 im Verlauf des Experiments für alle Linien einen steigenden Trend. Population 22660 zeigte die höchste Sensitivität von TanjilG_10657 gegenüber der Inokulation mit 114-facher Aktivierung und dem höchsten relativen Expressionsniveau (4,4 ± 0,4) bei 24 HPI (Abb. 6a). Das PR10 LlR18A-Proteingen TanjilG_27015 zeigte ebenfalls eine Aktivierung über alle Linien und Zeitpunkte hinweg, mit statistischer Signifikanz an den meisten Datenpunkten (Abb. 6b). Ähnlich wie bei TanjilG_10657 wurde das höchste relative Expressionsniveau von TanjilG_27015 in der inokulierten Population 22660 bei 24 HPI (19,5 ± 2,4) beobachtet. Das saure Endochitinase-Gen TanjilG_04706 war in allen Linien und zu allen Zeitpunkten signifikant hochreguliert, außer in Boregine 6 hpi (Abb. 6c). Es wurde zum ersten Zeitpunkt (6 HPI) bei 83A:476 stark induziert (um das 10,5-fache) und in anderen Linien moderat erhöht (um das 6,6- bis 7,5-fache). Während des Experiments blieb die Expression von TanjilG_04706 in 83A:476 und Boregine auf ähnlichem Niveau, während sie in Mandelup und Population 22660 signifikant anstieg und relativ hohe Werte erreichte (5,9 ± 1,5 bzw. 6,2 ± 1,5). Das Endoglucan-1,3-β-Glucosidase-ähnliche Gen TanjilG_23384 zeigte zu den ersten beiden Zeitpunkten (6 und 12 hpi) in allen Linien außer Population 22660 eine hohe Aktivierung (Abb. 6d). Die höchsten relativen Expressionsniveaus von TanjilG_23384 wurden zum zweiten Zeitpunkt (12 hpi) in Mandelup (2,7 ± 0,3) und 83A:476 (1,5 ± 0,1) beobachtet. Zum 24. HPI war die TanjilG_23384-Expression in allen untersuchten Linien relativ niedrig (von 0,04 ± 0,009 bis 0,44 ± 0,12).
Expressionsprofile ausgewählter Gene (ag) wurden mittels quantitativer PCR ermittelt. Die Zahlen 6, 12 und 24 stehen für die Stunden nach der Impfung. Die Gene LanDExH7 und LanTUB6 wurden zur Normalisierung verwendet, LanTUB6 zur Kalibrierung zwischen den Serien. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung basierend auf drei biologischen Replikaten dar, die jeweils den Durchschnitt aus drei technischen Replikaten darstellen. Die statistische Signifikanz der Unterschiede in den Expressionsniveaus zwischen den inokulierten (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, 1999 vom Lupinenfeld in Wierzenica, Polen gewonnen) und Kontrollpflanzen (scheininokuliert) ist über den Datenpunkten markiert (*P-Wert < 0,05, **P-Wert ≤ 0,01, ***P-Wert ≤ 0,001). Die statistische Signifikanz der Unterschiede in den Expressionsniveaus zwischen den inokulierten (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, 1999 vom Lupinenfeld in Wierzenica, Polen gewonnen) und Kontrollpflanzen (scheininokuliert) ist über den Datenpunkten markiert (*P-Wert < 0,05, **P-Wert ≤ 0,01, ***P-Wert ≤ 0,001). Statistische Untersuchung der Verbreitung in den letzten Jahren der Kulturexpression (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, geboren 1999). Верженице, Польша) и Kontrollsysteme (nicht fehlerbehaftet) werden auf bestimmte Werte eingestellt (*Wert P < 0,05, **Wert P ≤ 0,01, **Wert P ≤ 0,001). Statistisch signifikante Unterschiede in den Expressionsniveaus zwischen inokulierten (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, 1999 von einem Lupinenfeld in Wierzhenice, Polen gewonnen) und Kontrollpflanzen (scheininokuliert) sind über den Datenpunkten vermerkt (*P-Wert < 0,05, **P-Wert ≤ 0,01, ***P-Wert ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini, Col-08, 1999, 1999, 1999, Wierzenica, 1999 ）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001)。Pflanze (Colletotrichum lupini, Farbe-08), 1999水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001)。 Statistische Stichproben in den letzten Jahren der Kulturexpression (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, beliebt mit einer Stecklingspflanze in der Nähe von Verzhen, Polen, 1999) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* P-Wert < 0,05, ** P-Wert ≤ 0,01, ***P-Wert ≤ 0,001). Statistisch signifikante Unterschiede in den Expressionsniveaus zwischen inokulierten (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, gewonnen 1999 von Lupinenfeldern in Verzhenice, Polen) und Kontrollpflanzen (scheininokuliert) sind über den Datenpunkten vermerkt (*P-Wert < 0,05, **P-Wert ≤ 0,01, ***P-Wert ≤ 0,001).Die analysierten NLL-Linien waren: 83A:476 (resistent, Träger des homozygoten Lanr1-Allels), Mandelup (mäßig resistent, Träger des homozygoten AnMan-Allels), Boregine (resistent, unbekannter genetischer Hintergrund) und Population 22660 (anfällig).
Das Kandidatengen TanjilG_05042 am Lanr1-Locus zeigte ein deutlich anderes Expressionsmuster als die aus RNA-Sequenzstudien gewonnenen Profile (Abb. 6e). Eine signifikante Aktivierung dieses Gens wurde in Mandelup und der Population 22660 beobachtet (bis zu 39,7- bzw. 11,7-fach), was zu relativ hohen Expressionsniveaus führte (bis zu 1,4 ± 0,14 bzw. 7,2 ± 1,3). 83A:476 zeigte ebenfalls eine gewisse Hochregulierung des TanjilG_05042-Gens (bis zu 3,8-fach), die erreichten relativen Expressionsniveaus (0,044 ± 0,002) waren jedoch mehr als 30-mal niedriger als die in Mandelup und der Population 22660 beobachteten. Die mittels qPCR analysierten Ergebnisse zeigten signifikante Unterschiede in den Expressionsniveaus zwischen den Genotypen in scheingeimpften (Kontroll-)Varianten, wobei zwischen den Populationen 22660 und 83A:476 ein 58-facher Unterschied sowie zwischen den Populationen 22660 und 22660 erreicht wurde. Zwischen Boregine und Mandalup wurde ein zweifacher Unterschied erreicht.
Das Kandidatengen am AnMan-Locus, TanjilG_12861, wurde als Reaktion auf die Impfung in 83A:476 und Mandelup aktiviert, war in der Population 22660 neutral und in Boregine herunterreguliert (Abb. 6f). Die relative Expression des Gens TanjilG_12861 war im geimpften 83A:476 am höchsten (0,14 ± 0,01). Das 17,4 kDa große Klasse-I-Hitzeschockprotein-Gen TanjilG_05080 HSP17.4 zeigte in allen untersuchten Stämmen und zu allen Zeitpunkten niedrigere relative Expressionsniveaus (Abb. 6g). Der höchste Wert wurde bei 24 HPI in der Population 22660 beobachtet (0,14 ± 0,02, eine achtfache Erhöhung der Impfreaktion).
Der Vergleich der Genexpressionsprofile (Abb. 7) ergab eine hohe Korrelation zwischen TanjilG_10657 und vier weiteren Genen: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) und TanjilG_04706 (r = 0,79). Diese Ergebnisse deuten auf eine Koregulierung dieser Gene bei Abwehrreaktionen hin. Die Gene TanjilG_12861 und TanjilG_23384 zeigten im Vergleich zu anderen Genen unterschiedliche Expressionsprofile mit niedrigeren Pearson-Korrelationskoeffizienten (von 0,08 bis 0,43 bzw. -0,19 bis 0,28).
Korrelationen zwischen Genexpressionsprofilen wurden mittels quantitativer PCR ermittelt. Folgende Schmalblättrige Lupinenlinien wurden analysiert: 83A:476 (resistent, Träger des homozygoten Lanr1-Allels), Mandelup (mäßig resistent, Träger des homozygoten AnMan-Allels), Boregine (resistent, genetischer Hintergrund unbekannt) und Population 22660 (anfällig). Drei Zeitpunkte (6, 12 und 24 Stunden nach der Inokulation) wurden berechnet, darunter inokulierte (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, gewonnen 1999 von Lupinenfeldern in Wierzhenice, Polen) und Kontrollpflanzen (scheininokuliert). Die Skala zeigt den Wert des Pearson-Korrelationskoeffizienten.
Basierend auf Daten, die bei 6 PS pro Zoll (ca. 1,6 kW) ermittelt wurden, wurde die WGCNA an 9981 DEG durchgeführt, die durch den Vergleich von inokulierten und Kontrollpflanzen identifiziert wurden, um frühe Abwehrreaktionen zu untersuchen (Ergänzende Tabelle S12). Es wurden 22 Genmodule (Cluster) mit korrelierten (positiven oder negativen) Expressionsprofilen zwischen Genotypen und experimentellen Varianten gefunden. Im Durchschnitt nahmen die Genexpressionswerte in der Reihenfolge 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 ab (in beiden Varianten war dieser Trend bei Kontrollpflanzen jedoch stärker). Im Durchschnitt nahmen die Genexpressionswerte in der Reihenfolge 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 ab (in beiden Varianten war dieser Trend bei Kontrollpflanzen jedoch stärker). Im Laufe der letzten Generationen wurde diese Tendenz im Abschnitt 83A:476 > Mandelup > Boregine > Bevölkerung 22660 (in den oben genannten Varianten, seltsamerweise) gelöscht контрольных растений). Im Durchschnitt nahmen die Genexpressionswerte in der Reihenfolge 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 ab (in beiden Varianten war dieser Trend bei Kontrollpflanzen jedoch stärker).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Bevölkerung 22660的顺序下降（然而,在两种变体中,这种趋势在对照植物中更强）.平均 而 言, 基因 水平 按 按 83a: 476> Mandelup> Boregine> Bevölkerung 22660 的 顺序 下降 （, 在 种 中, 这 种 在 在植物 中 更）。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 Im Laufe der letzten 83A:476 > Mandelup > Boregine > Bevölkerung 22660 (aufgrund der oben genannten Varianten und dieser Tendenz wurde ich nicht mehr gesehen контрольных растений). Im Durchschnitt nahmen die Genexpressionswerte in der Reihe 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 ab (in beiden Varianten war dieser Trend bei Kontrollpflanzen jedoch stärker).Die Impfung führte zu einer Hochregulierung der Genexpression, insbesondere in den Modulen 18, 19, 14, 6 und 1 (in absteigender Reihenfolge der Wirkung), einer negativen Regulierung (z. B. Module 9 und 20) oder mit neutralen Effekten (z. B. Module 11, 22, 8 und 13). Die GO-Term-Anreicherungsanalyse (Ergänzende Tabelle S13) ergab „GO: 0006952 Schutzreaktionen“ für das inokulierte Modul (18) mit maximaler Aktivierung, einschließlich der per qPCR analysierten Gene (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 und TanjilG_27015), sowie vieler Inoculate-Module mit der am stärksten unterdrückten Photosynthese (9). Der Konzentrator von Modul 18 (Abb. 8) wurde als das Gen TanjilG_26536 identifiziert, das das PR-10-ähnliche Protein LlR18B kodiert, und der Konzentrator von Modul 9 wurde als das Gen TanjilG_28955 identifiziert, das das Protein PsbQ des Photosystems II kodiert. Ein Kandidat für das Anthraknose-Resistenzgen Lanr1, TanjilG_05042, wurde in Modul 22 (Abb. 9) gefunden und ist mit den Begriffen „GO:0044260 Zelluläre makromolekulare Stoffwechselprozesse“ und „GO:0006355 Transkriptionelle Regulierung, DNA-Templating“ assoziiert und trägt den Hub TanjilG_01212. Das Gen kodiert den Hitzestress-Transkriptionsfaktor A-4a (HSFA4a).
Gewichtete Netzwerkanalyse der Gen-Koexpression von Modulen mit überrepräsentierten biologischen Prozessbegriffen „GO: 0006952 Abwehrreaktionen“. Die Ligation wurde vereinfacht, um die vier mittels qPCR analysierten Gene (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 und TanjilG_27015) hervorzuheben.
Gewichtete Netzwerkanalyse der Gen-Koexpression eines Moduls mit dem überrepräsentierten biologischen Prozessbegriff „GO: 0006355: Transkriptionelle Regulation, DNA-Templating“ und dem Kandidatengen für Anthraknose-Resistenz Lanr1 TanjilG_05042. Die Ligation wurde vereinfacht, um das Gen TanjilG_05042 und das zentrale Gen TanjilG_01212 zu isolieren.
Ein in Australien durchgeführtes Screening auf Anthraknose-Resistenz ergab, dass die meisten der früh freigegebenen Sorten anfällig waren; Kalya, Coromup und Mandelup wurden als mäßig resistent beschrieben, während Wonga, Tanjil und 83A:476 als hochresistent beschrieben wurden26,27,31. hatten das gleiche Resistenzallel, bezeichnet als Lanr1, und Coromup und Mandelup hatten ein anderes Allel, bezeichnet als AnMan10, 26, 39, während Kalya ein anderes Allel weitergab. , Lanr2. Ein Screening auf Anthraknose-Resistenz in Deutschland führte zur Identifizierung einer resistenten Linie Bo7212 mit einem anderen Kandidatenallel als Lanr1, bezeichnet als LanrBo36.
Unsere Studie ergab eine sehr geringe Häufigkeit (ca. 6 %) des Lanr1-Allels im getesteten Keimplasma. Diese Beobachtung steht im Einklang mit den Ergebnissen des Screenings von osteuropäischem Keimplasma mit den Markern Anseq3 und Anseq4, die zeigten, dass das Lanr1-Allel nur in zwei belarussischen Linien vorkommt. Dies deutet darauf hin, dass das Lanr1-Allel in lokalen Züchtungsprogrammen noch nicht weit verbreitet ist, anders als in Australien, wo es eines der Schlüsselallele für die markergestützte Züchtung ist. Dies kann an der geringeren Resistenz liegen, die das Lanr1-Allel unter europäischen Feldbedingungen bietet als im australischen Bericht. Darüber hinaus haben Studien zur Anthraknose in niederschlagsreichen Gebieten Australiens gezeigt, dass die durch das Lanr1-Allel vermittelten Resistenzreaktionen unter Wetterbedingungen, die das Wachstum und die schnelle Entwicklung des Erregers begünstigen, möglicherweise nicht wirksam sind19,42. Tatsächlich wurden in der vorliegenden Studie einige Symptome der Anthraknose auch bei Genotypen mit dem Lanr1-Allel beobachtet, was darauf schließen lässt, dass die Resistenz unter optimalen Bedingungen für die Entwicklung von C. lupini verschwinden könnte. Darüber hinaus sind falsch positive Interpretationen des Vorhandenseins von Anseq3- und Anseq4-Markern möglich, die etwa 1 cM vom Lanr1-Locus entfernt liegen 28,30,43 .
Unsere Studie ergab, dass 83A:476, Träger des Lanr1-Allels, auf die Inokulation mit C. lupini mit einer groß angelegten Transkriptom-Neuprogrammierung zum ersten analysierten Zeitpunkt (6 hpi) reagierte, während bei Mandelup, Träger des AnMan-Allels, transkriptomische Reaktionen viel später beobachtet wurden (von 24 bis 48 hp). Diese zeitlichen Variationen der Abwehrreaktionen sind mit Unterschieden in den Krankheitssymptomen verbunden, was die Bedeutung einer frühen Pathogenerkennung für eine erfolgreiche Reaktion auf Resistenzen unterstreicht. Um Pflanzengewebe zu infizieren, müssen Anthraxsporen auf der Wirtsoberfläche mehrere Entwicklungsstadien durchlaufen, darunter Keimung, Zellteilung und Bildung eines Appressoriums. Ein Anhängsel ist eine infektiöse Struktur, die sich an der Oberfläche des Wirts anheftet und das Eindringen in das Wirtsgewebe erleichtert. So zeigten Sporen von C. gloeosporioides in Erbsenextrakt nach 75–90 Minuten Inkubation die erste Kernteilung, nach 90–120 Minuten die Bildung eines Keimschlauchs und nach 4 Stunden und 45 Minuten eine Suppression. Mango C. gloeosporioides zeigte nach 3 Stunden Inkubation mehr als 40 % Konidienkeimung und nach 4 Stunden etwa 20 % Bildung von Appressoren. Das virulenzassoziierte CAP20-Gen von C. gloeosporioides zeigte nach 3,5 Stunden Inkubation in Avocado-Oberflächenwachs mit hohen Konzentrationen des CAP20-Proteins nach 4 Stunden und 46 Minuten transkriptionelle Aktivität in epiphytenbildenden Konidien. Ebenso wurde die Aktivität der Melanin-Biosynthese-Gene in C. trifolii während einer 2-stündigen Inkubation induziert, gefolgt von der Bildung eines Appressoriums nach 1 Stunde. Untersuchungen von Blattgewebe haben gezeigt, dass mit C. acutatum geimpfte Erdbeeren nach 8 hpi eine erste Suppression aufweisen, während mit C. coccodes geimpfte Tomaten nach 4 hpi eine erste Suppression aufweisen48,49. Dies entspricht weitgehend der Zeitskala des Infektionsprozesses von Colletotrichum spp. Schnelle Abwehrreaktionen auf 83A:476 weisen auf eine Beteiligung von Pflanzenresistenz- und Effektor-getriggerten Immunitätsgenen (ETI) in dieser Linie hin, während Mandelups verzögerte Reaktionen die Hypothese der mikroassoziierten, durch molekulare Muster ausgelösten Immunität (MTI) stützen 50. Frühe Reaktionen auf 83A:476 und Mandelup. Die teilweise Überlappung zwischen hoch- oder herunterregulierten Genen bei verzögerter Reaktion unterstützt dieses Konzept ebenfalls, da ETI häufig als beschleunigte und verstärkte MTI-Reaktion angesehen wird, die in einem programmierten Zelltod am Ort der Infektion gipfelt, der als anaphylaktischer Schock bezeichnet wird 51,52.
Die meisten der dem überrepräsentierten Begriff „Defense Response“ (Gene Ontology GO:0006952) zugeordneten Gene sind die 11 Homologen des Stress-Induced Fasting Message 22-Proteins (ähnlich SAM22) und die sieben wichtigsten Latexprotein-ähnlichen Gene (MLPs). Die -ähnlichen Proteine ​​31, 34, 43 und 423 zeigten Sequenzähnlichkeit. SAM22-ähnliche Gene zeigten eine signifikante und länger anhaltende Aktivierung, was auf eine erhöhte Anthraknose-Resistenz hindeutete (83A:476 und Boregine). MLP-ähnliche Gene wurden jedoch nur in Linien herunterreguliert, die das Kandidaten-Resistenzallel trugen (83A:476/Lanr1 bei 6 hpi und Mandelup/AnMan bei 24 hpi). Es ist zu beachten, dass alle identifizierten SAM22-ähnlichen Homologen aus einem etwa 105 kb langen Gencluster stammen, während MLP-ähnliche Gene aus unterschiedlichen Regionen des Genoms stammen. Eine koordinierte Aktivierung solcher SAM22-ähnlicher Gene wurde auch in unserer vorherigen Studie zur NLL-Resistenz gegen Diaporthetoxica-Inokulation festgestellt. Dies deutet darauf hin, dass sie an den horizontalen Komponenten der Abwehrreaktion beteiligt sind. Diese Schlussfolgerung wird auch durch Berichte über eine positive Reaktion SAM22-ähnlicher Gene auf Verletzungen oder Behandlungen mit Salicylsäure, Pilzinduktoren oder Wasserstoffperoxid gestützt.
Es wurde gezeigt, dass MLP-ähnliche Gene auf verschiedene abiotische und biotische Stressfaktoren reagieren, darunter bakterielle, virale und pathogene Pilzinfektionen bei vielen Pflanzenarten55. Die Reaktionsrichtungen auf bestimmte Interaktionen zwischen Pflanzen und Pathogenen reichten von stark zunehmend (z. B. während des Befalls von Baumwolle mit Verticillium dahliae) bis deutlich abnehmend (z. B. nach der Infektion von Apfelbäumen mit Alternaria spp.)56,57. Eine signifikante Herunterregulierung des MLP-ähnlichen Gens 423 wurde während der Abwehr von Avocados gegen eine Infektion mit F. niger sowie während einer Infektion des Apfelbaums mit Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola und Alternaria alternata beobachtet58,59. Außerdem wiesen Apfelkalli, die das MLP-ähnliche Gen 423 überexprimierten, eine geringere Expression von Resistenz-assoziierten Genen auf und waren anfälliger für Pilzinfektionen59. Nach Fusarium oxysporum f wurde das MLP-ähnliche Gen 423 auch im resistenten Keimplasma der Gartenbohne unterdrückt. cn. Bohneninfektion 60.
Weitere Mitglieder der PR-10-Familie, die in unserer RNA-Sequenzstudie identifiziert wurden, waren die Gene LlR18A und LlR18B als Reaktion auf eine Hochregulierung sowie das hochregulierte (1 Gen) oder herunterregulierte (3 Gene) Gen für das Lipidtransferprotein DIR1. Darüber hinaus hebt WGCNA das Gen LlR18B als Knotenpunkt in diesem Modul hervor, das sehr anfällig für Impfungen ist und mehrere schützende Reaktionsgene trägt. Die Gene LlR18A und LlR18B wurden in Blättern der Gelben Lupine als Reaktion auf pathogene Bakterien sowie in Stängeln von NLL nach Inokulation mit D. toxica induziert, während das Reishomolog dieser Gene, RSOsPR10, rasch durch eine Pilzinfektion induziert wurde, die vermutlich am Jasmonsäure-Signalweg beteiligt ist53,61, 62. Das DIR1-Gen kodiert unspezifische Lipidtransportproteine, die für die Entstehung einer systemisch erworbenen Resistenz (SAR) erforderlich sind. Mit der Entwicklung von Schutzreaktionen wird das DIR1-Protein vom Infektionsherd durch das Phloem transportiert, um in entfernten Organen eine SAR zu induzieren. Interessanterweise wurde das TanjilG_02313 DIR1-Gen zum ersten Zeitpunkt in den Linien 84A:476 und Population 22660 signifikant induziert, eine Anthraknose-Resistenz entwickelte sich jedoch nur in Linie 84A:476 erfolgreich. Dies könnte auf eine gewisse Subfunktionalisierung des DIR1-Gens in NLL hinweisen, da die verbleibenden drei Homologen nur in der Linie 83A:476 bei 6 hpi auf die Impfung reagierten und diese Reaktion nach unten gerichtet war.
In unserer Studie waren die häufigsten Komponenten des biologischen Prozesses „GO:0055114 Redoxprozess“ Cytochrom-P450-Protein, Peroxidase, Linolsäure-9S-/13S-Lipoxygenase und 1-Aminocyclopropan-1-carbonsäureoxidase. Darüber hinaus definiert unsere WGCNA das HSFA4a-Homolog als einen Knotenpunkt, der Module wie den Lanr1-Resistenzgenkandidaten TanjilG_05042 trägt. HSFA4a ist eine Komponente der redoxabhängigen Regulation der Kerntranskription in Pflanzen.
Cytochrom-P450-Proteine ​​sind Oxidoreduktasen, die NADPH- und/oder O2-abhängige Hydroxylierungsreaktionen im Primär- und Sekundärstoffwechsel katalysieren, darunter im Stoffwechsel von Xenobiotika sowie Hormonen, Fettsäuren, Sterolen, Zellwandbestandteilen, Biopolymeren und der Biosynthese von Schutzstoffen 69. In einer unserer Studien wurde die Variabilität der Cytochrom-P450-Funktion in Pflanzen von -10,6 log2 (Fachänderung) auf 5,7 reduziert. Dies ist auf eine große Zahl veränderter Homologe (37) und Unterschiede in den Reaktionsmustern zwischen bestimmten Genen zurückzuführen, was eine Korrektur nach oben darstellt. . Die Verwendung von RNA-Sequenzdaten allein zur Aufklärung der mutmaßlichen biologischen Funktion der NLL-Gene in einer so großen Protein-Superfamilie wäre höchst spekulativ. Es ist jedoch erwähnenswert, dass einige Cytochrom-P450-Gene mit einer erhöhten Resistenz gegen pathogene Pilze oder Bakterien in Verbindung gebracht werden, darunter eine Förderung allergischer Reaktionen 69,70,71.
Peroxidasen der Klasse III sind multifunktionale Pflanzenenzyme, die an einer Vielzahl von Stoffwechselprozessen während des Pflanzenwachstums und der Pflanzenentwicklung sowie als Reaktion auf Umweltbelastungen wie Salzgehalt, Dürre, hohe Lichtintensität und Krankheitserregerbefall beteiligt sind72. Peroxidasen sind an der Interaktion mehrerer Pflanzenarten mit Anthracis beteiligt, darunter Stylosanthes humilis und C. gloeosporioides, Lens culinaris und C. truncatum, Phaseolus vulgaris und C. lindemuthianum, Cucumis sativus und C. lagenarium73,74,75,76. Die Reaktion erfolgt sehr schnell, manchmal sogar schon nach 4 HPI, bevor der Pilz in das Pflanzengewebe eindringt73. Das Peroxidasegen reagierte auch auf die Inokulation mit D. toxica NLL. Zusätzlich zu ihren typischen Funktionen, den oxidativen Ausbruch zu regulieren oder oxidativen Stress zu eliminieren, können Peroxidasen das Wachstum von Pathogenen durch die Bildung physikalischer Barrieren auf Grundlage der Zellwandverstärkung während der Verholzung, der Untereinheit oder der Vernetzung spezifischer Verbindungen hemmen. Diese Funktion kann in silico dem Gen TanjilG_03329 zugeschrieben werden, das für eine mutmaßliche ligninbildende Anionenperoxidase kodiert. Diese war in unserer Studie in der resistenten Linie 83A:476 bei 6 HPI signifikant hochreguliert, nicht jedoch in anderen Stämmen und zu anderen Zeitpunkten, die nicht reagierten.
9S-/13S-Lipoxygenase der Linolsäure ist der erste Schritt im oxidativen Stoffwechselweg der Lipidbiosynthese78. Die Produkte dieses Stoffwechselwegs erfüllen mehrere Funktionen in der Pflanzenabwehr, darunter die Stärkung der Zellwände durch die Bildung von Kallose- und Pektinablagerungen und die Regulierung von oxidativem Stress durch die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies79,80,81,82,83. In der vorliegenden Studie war die Expression der Linolsäure-9S-/13S-Lipoxygenase in allen Stämmen verändert, aber in der anfälligen Population 22660 überwog die Hochregulierung zu verschiedenen Zeitpunkten, während sie in Stämmen mit resistentem Lanr1 und dem AnMan-Allel die Diversifizierung der Oxylipinschicht bei schützenden Anthrax-Reaktionen zwischen diesen Genotypen betont.
Das Homolog der 1-Aminocyclopropan-1-carboxylat-Oxidase (ACO) wurde bei Inokulation mit Lupinen signifikant hochreguliert (9 Gene) oder herunterreguliert (2 Gene). Mit zwei Ausnahmen traten alle diese Reaktionen bei 6 hp. bei 83A:476 auf. Die durch ACO-Proteine ​​vermittelte enzymatische Reaktion ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Ethylenproduktion und unterliegt daher einer strengen Regulierung84. Ethylen ist ein Pflanzenhormon, das vielfältige Rollen bei der Regulierung der Pflanzenentwicklung und der Reaktion auf abiotische und biotische Stressbedingungen spielt. Die Induktion der ACO-Transkription und die Aktivierung des Ethylen-Signalwegs tragen dazu bei, die Resistenz von Reis gegen den hemibiotrophen Pilz Oryzae oryzae zu erhöhen, indem sie die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies und Phytoalexine regulieren. Ein sehr ähnlicher Blattinfektionsprozess, der bei M. oryzae und C. lupini88,89 vor dem Hintergrund einer signifikanten Hochregulierung von ACO-Homologen in der in dieser Studie berichteten Linie 83A:476 festgestellt wurde, verschiebt die Möglichkeit, eine Resistenz gegen NLL-Anthraknose zu verleihen. Ethylen ist ein zentraler Signalschritt in molekularen Pfaden.
In der vorliegenden Studie wurde eine großflächige Unterdrückung vieler mit der Photosynthese assoziierter Gene bei 6 hpi in 83A:476 und bei 48 hpi in Mandeloop und der Population 22660 beobachtet. Ausmaß und Verlauf dieser Veränderungen sind proportional zum Level. In diesem Experiment wurde eine Anthraknose-Resistenz beobachtet. Kürzlich wurde eine starke und frühe Unterdrückung photosynthesebezogener Transkripte in mehreren Modellen der Pflanzen-Pathogen-Interaktion, einschließlich pathogener Bakterien und Pilze, berichtet. Eile (ab 2 HPI in einigen Interaktionen) und eine globale Unterdrückung photosyntheseassoziierter Gene als Reaktion auf eine Infektion können eine pflanzliche Immunität auslösen, die auf der Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies und deren Interaktion mit dem Salicylsäureweg beruht und allergische Reaktionen vermittelt 90,94.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die für die resistenteste Linie (83A:476) vorgeschlagenen Abwehrmechanismen eine schnelle Pathogenerkennung durch das R-Gen (vermutlich TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) und eine durch allergische Reaktion vermittelte Salicylsäure- und Ethylen-Signalgebung umfassen, gefolgt von der Etablierung einer SAR mit großer Reichweite. Die Aktion wird durch das DIR-1-Protein unterstützt. Es ist zu beachten, dass die biotrophe Periode einer C. lupini-Infektion sehr kurz ist (ungefähr 2 Tage), gefolgt von nekrotischem Wachstum95. Der Übergang zwischen diesen Stadien kann mit Nekrose und der Expression von Ethylen-induzierbaren Proteinen verbunden sein, die als Auslöser für Überempfindlichkeitsreaktionen in Wirtspflanzen wirken. Deshalb ist das Zeitfenster für die erfolgreiche Erfassung von C. lupini im biotrophen Stadium sehr eng. Die in 83A:476 nach 6 hpi beobachtete Neuprogrammierung von Genen, die mit Redox und Photosynthese assoziiert sind, steht im Einklang mit der Entwicklung von Pilzhyphen und kündigt die Entwicklung einer erfolgreichen Schutzreaktion im biotrophen Stadium an. Die transkriptomischen Reaktionen von Mandelup und der Population 22660 könnten zu spät einsetzen, um den Pilz vor dem Wechsel zu nekrotischem Wachstum zu erfassen. Mandelup könnte jedoch wirksamer sein als die Population 22660, da die relativ schnelle Regulation des PR-10-Proteins die horizontale Resistenz fördert.
ETI, gesteuert durch das kanonische R-Gen, scheint ein häufiger Mechanismus für die Resistenz von Bohnen gegen Anthraknose zu sein. So wird bei der Modellleguminose Medicago truncatula die Resistenz gegen Anthraknose durch das Gen RCT1 vermittelt, das zur Klasse der pflanzlichen R-Gene TIR-NBS-LRR97 gehört. Dieses Gen verleiht auch Luzerne eine Breitbandresistenz gegen Anthraknose, wenn es auf anfällige Pflanzen übertragen wird. In der Gartenbohne (P. vulgaris) wurden bisher mehr als zwei Dutzend Anthraknose-Resistenzgene identifiziert. Einige dieser Gene befinden sich in Regionen, in denen kanonische R-Gene fehlen, viele andere jedoch befinden sich an den Rändern von Chromosomen, die den NBS-LRR-Gencluster tragen, darunter TIR-NBS-LRRs99. Die genomweite SSR-Studie bestätigte auch den Zusammenhang des NBS-LRR-Gens mit der Anthraknose-Resistenz der Gartenbohne. Das kanonische R-Gen wurde auch in der Genomregion gefunden, die den wichtigsten Anthraknose-Resistenzlocus in der Weißen Lupine 101 trägt.
Unsere Arbeit zeigt, dass eine sofortige Resistenzreaktion, die in einem frühen Stadium der Pflanzeninfektion (vorzugsweise spätestens nach 12 hpi) aktiviert wird, Schmalblättrige Lupinen wirksam vor Anthraknose schützt, die durch den pathogenen Pilz Collelotrichum lupini verursacht wird. Mittels Hochdurchsatzsequenzierung konnten wir differenzielle Expressionsprofile von Anthraknose-Resistenzgenen in NLL-Pflanzen nachweisen, die durch die Resistenzgene Lanr1 und AnMan vermittelt werden. Eine erfolgreiche Abwehr erfordert die sorgfältige Entwicklung der Gene für Proteine, die an Redox, Photosynthese und Pathogenese beteiligt sind, innerhalb weniger Stunden nach dem ersten Kontakt der Pflanze mit einem Pathogen. Ähnliche, jedoch zeitlich verzögerte Schutzreaktionen sind deutlich weniger wirksam beim Schutz von Pflanzen vor Krankheiten. Die durch das Lanr1-Gen vermittelte Anthrax-Resistenz ähnelt der typischen schnellen Reaktion des R-Gens (Effektor-getriggerte Immunität), während das AnMan-Gen höchstwahrscheinlich eine horizontale Reaktion (Immunität, die durch ein mikrobenassoziiertes molekulares Muster ausgelöst wird) vermittelt und so ein moderates Maß an Nachhaltigkeit gewährleistet.
Die 215 NLL-Linien, die zum Screening auf Anthraknose-Marker verwendet wurden, bestanden aus 74 Sorten, 60 durch Kreuzung oder Züchtung gewonnenen Linien, 5 Mutanten und 76 wilden oder ursprünglichen Keimplasmen. Die Linien stammten aus 17 Ländern, hauptsächlich aus Polen (58), Spanien (47), Deutschland (27), Australien (26), Russland (19), Weißrussland (7), Italien (5) und weitere Linien aus 10 Ländern. Das Set enthält außerdem resistente Referenzlinien: 83A:476, Tanjil, Wonga mit dem Lanr1-Allel und Mandelup mit dem AnMan-Allel. Die Linien wurden der European Lupine Genetic Resource Database entnommen, die von Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polen, verwaltet wird (Ergänzende Tabelle S1).
Die Pflanzen wurden unter kontrollierten Bedingungen (Photoperiode 16 Stunden, Temperatur 25 °C tagsüber und 18 °C nachts) gezüchtet. Zwei biologische Replikate wurden analysiert. DNA wurde aus drei Wochen alten Blättern mithilfe des DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß Protokoll isoliert. Die Qualität und Konzentration der isolierten DNA wurde mithilfe spektrophotometrischer Methoden (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) beurteilt. Der Marker AnManM1, der das Anthraknose-Resistenzgen AnMan (abgeleitet von der Sorte Mandelup) markiert, und die Marker Anseq3 und Anseq4, die das Gen Lanr1 (abgeleitet von der Sorte Tanjil) flankieren, wurden analysiert 11,26,28. Homozygote für das resistente Allel wurden mit „1“, anfällig mit „0“ und Heterozygote mit 0,5 bewertet.
Basierend auf den Ergebnissen des Screenings auf die Marker AnManM1, AnSeq3 und AnSeq4 und der Verfügbarkeit von Saatgut für abschließende Folgeexperimente wurden 50 NLL-Linien für die Phänotypisierung der Anthraknose-Resistenz ausgewählt. Die Analyse wurde in Doppelbestimmung in einem computergesteuerten Gewächshaus mit einer 14-stündigen Photoperiode und einer Temperaturspanne von 22 °C tagsüber und 19 °C nachts durchgeführt. Die Samen werden vor der Aussaat angeritzt (die Samenschale auf der dem Embryo gegenüberliegenden Seite wird mit einer scharfen Klinge abgeschnitten), um eine Samenruhe aufgrund einer zu harten Samenschale zu verhindern und eine gleichmäßige Keimung zu gewährleisten. Die Pflanzen wurden in Töpfen (11 × 11 × 21 cm) mit steriler Erde (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warschau, Polen) angezogen. Die Inokulation erfolgte mit dem Stamm Colletotrichum lupini Col-08, der 1999 aus den Stengeln von Schmalblättrigen Lupinenpflanzen gezüchtet wurde, die auf einem Feld in Verzhenitsa, Großpolen (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ O ) gewachsen sind. Erhalten Sie eine Fläche. Die Isolate wurden 21 Tage lang in SNA-Medium bei 20 °C unter Schwarzlicht kultiviert, um die Sporulation zu induzieren. Vier Wochen nach der Aussaat, als die Pflanzen das 4- bis 6-Blatt-Stadium erreicht hatten, erfolgte die Inokulation durch Besprühen mit einer Konidiensuspension in einer Konzentration von 0,5 x 106 Konidien pro ml. Nach der Inokulation wurden die Pflanzen 24 Stunden lang im Dunkeln bei einer Luftfeuchtigkeit von etwa 98 % und einer Temperatur von 25 °C gehalten, um die Keimung der Konidien und den Infektionsprozess zu erleichtern. Die Pflanzen wurden anschließend einer 14-stündigen Photoperiode bei 22 °C tagsüber/19 °C nachts und 70 % Luftfeuchtigkeit ausgesetzt. Der Krankheitswert wurde 22 Tage nach der Inokulation ermittelt und reichte von 0 (immun) bis 9 (sehr anfällig), abhängig vom Vorhandensein oder Fehlen nekrotischer Läsionen an Stängeln und Blättern. Zusätzlich wurde nach der Bewertung das Gewicht der Pflanzen gemessen. Die Beziehungen zwischen Markergenotypen und Krankheitsphänotypen wurden als Punkt-Zwei-Sequenz-Korrelationen berechnet (Fehlen heterozygoter Marker im Satz der Linien zur Analyse des Anthraknose-Resistenzphänotyps).