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Die Schmalblättrige Lupine (Lupinus angustifolius L.) ist eine Leguminose, die zur Nahrungsmittelproduktion und Bodenverbesserung genutzt wird. Die weltweite Ausweitung des Anbaus der Schmalblättrigen Lupine hat zahlreiche pathogene Pilze angelockt, darunter den Erreger der Lupinen-Anthraknose, der die verheerende Krankheit Anthraknose verursacht. Zwei Allele, Lanr1 und AnMan, die eine erhöhte Resistenz vermitteln, wurden in der Züchtung der Schmalblättrigen Lupine eingesetzt, die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen sind jedoch noch unbekannt. In dieser Studie wurden die Marker Lanr1 und AnMan verwendet, um europäische Proben der Schmalblättrigen Lupine zu screenen. Die Prüfung des Impfstoffs unter kontrollierten Bedingungen bestätigte die Wirksamkeit beider resistenter Linien. An repräsentativen resistenten und anfälligen Linien wurde ein differentielles Genexpressionsprofil erstellt. Die Anthraknose-Resistenz war mit einer Überexpression der Genontologie-Terme „GO:0006952 Abwehrreaktion“, „GO:0055114 Redoxprozess“ und „GO:0015979 Photosynthese“ assoziiert. Darüber hinaus zeigte die Lanr1(83A:476)-Linie unmittelbar nach der Inokulation eine signifikante Umprogrammierung des Transkriptoms, während die anderen Linien eine Verzögerung dieser Reaktion von etwa 42 Stunden aufwiesen. Die Abwehrreaktionen sind mit den Genen TIR-NBS, CC-NBS-LRR und NBS-LRR, zehn an der Pathogenese beteiligten Proteinen, Lipidtransferproteinen, Endoglucan-1,3-β-Glucosidase, glycinreichen Zellwandproteinen und Genen des reaktiven Sauerstoffwegs assoziiert. Frühe Reaktionen auf 83A:476, einschließlich der gezielten Unterdrückung von Genen, die mit der Photosynthese in Zusammenhang stehen, fielen mit einem erfolgreichen Schutz während der vegetativen Wachstumsphase des Pilzes zusammen, was darauf hindeutet, dass ein Effektor die Immunität auslöst. Die Mandeloop-Reaktion ist verlangsamt, ebenso wie der gesamte horizontale Widerstand.
Die Schmalblättrige Lupine (Lupinus angustifolius L.) ist ein proteinreiches Getreide, das ursprünglich aus dem westlichen Mittelmeerraum stammt^1,2. Sie wird heute als Futterpflanze für Mensch und Tier angebaut. Aufgrund der Stickstofffixierung durch symbiotische Stickstoffbakterien und der damit einhergehenden Verbesserung der Bodenstruktur dient sie auch als Gründüngung in Fruchtfolgen. Die Schmalblättrige Lupine wurde im letzten Jahrhundert rasant domestiziert und steht weiterhin unter hohem Züchtungsdruck^{3,4,5,6,7,8,9,10,11,12}. Mit dem weitverbreiteten Anbau der Schmalblättrigen Lupine besiedelten pathogene Pilze neue ökologische Nischen und verursachten neue, pflanzenzerstörende Krankheiten. Am bemerkenswertesten für Lupinenbauern und -züchter war das Auftreten der Anthraknose, verursacht durch den pathogenen Pilz Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Am bemerkenswertesten für Lupinenbauern und -züchter war das Auftreten der Anthraknose, verursacht durch den pathogenen Pilz Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Die wichtigsten Beispiele für die Bekämpfung von Krankheiten und Krankheiten durch Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Am auffälligsten für Lupinenzüchter und -bauern war das Auftreten der Anthraknose, die durch den pathogenen Pilz Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 verursacht wird.对于羽扇豆农民和饲养者来说,最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 Artikel.Sie haben die Möglichkeit, die Pflanze mit Colletotrichum lupini zu ernähren (Bondar)嵵Behaart。1 Die häufigste Verwendung für Fermenter und Selektoren von Lupinen ermöglicht die Ansteckung, Auswahl eines Krankheitserregers Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Am auffälligsten für Lupinenzüchter und -bauern ist das Auftreten der Anthraknose, die durch den pathogenen Pilz Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 verursacht wird.Die ersten Berichte über die Krankheit stammten aus Brasilien und den Vereinigten Staaten, wobei typische Symptome 1912 bzw. 1929 auftraten. Nach etwa 30 Jahren wurde der Erreger jedoch als Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. bezeichnet. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Telemorphon Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Teleomorph von Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., eine Gattung von Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., eine Gattung von Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in einer uralten Morphologie. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in Targeted Morphology. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .und H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。und H. Schlenk, .Vorläufige Phänotypisierungen der Krankheit Mitte des 20. Jahrhunderts zeigten eine gewisse Resistenz bei NLL- und Gelblupinen-Akzessionen (L. luteus L.), während alle getesteten Weißlupinen-Akzessionen (L. albus L.) hochgradig anfällig waren^15,16. Studien haben gezeigt, dass die Entwicklung der Anthraknose mit erhöhten Niederschlägen (Luftfeuchtigkeit) und Temperaturen (im Bereich von 12–28 °C) einhergeht, was bei höheren Temperaturen zu einem Verlust der Resistenz führt^17,18. Tatsächlich war die Zeit, die für die Keimung der Konidien und den Ausbruch der Krankheit benötigt wurde, bei 24 °C (4 Stunden) viermal kürzer als bei 12 °C (16 Stunden) unter Bedingungen hoher Luftfeuchtigkeit¹⁹. Somit hat die fortschreitende globale Erwärmung zur Ausbreitung der Anthraknose beigetragen. Die Krankheit wurde jedoch in Frankreich (1982) und der Ukraine (1983) als Vorbote einer drohenden Gefahr beobachtet, von der Lupinenindustrie damals aber offenbar ignoriert^20,21. Wenige Jahre später breitete sich diese verheerende Krankheit weltweit aus und befiel auch wichtige Lupinenanbauländer wie Australien, Polen und Deutschland^22,23,24. Nach einem Anthraknose-Ausbruch Mitte der 1990er-Jahre führte ein umfassendes Screening zur Identifizierung mehrerer resistenter Spender in NLL¹⁹-Proben. Die NLL-Resistenz gegen Anthraknose wird durch zwei separate dominante Allele kontrolliert, die in verschiedenen Genpools vorkommen: Lanr1 in den Sorten Tanjil und Wonga sowie AnMan in der Sorte Mandalay^25,26. Diese Allele ergänzen die molekularen Marker, die die Selektion resistenten Genmaterials in Zuchtprogrammen unterstützen^{25,26,27,28,29,30}. Die resistente Zuchtlinie 83A:476 mit dem Lanr1-Allel wurde mit der anfälligen Wildlinie P27255 gekreuzt, um eine RIL-Population mit segregierender Anthraknose-Resistenz zu erhalten. Dies ermöglichte die Zuordnung des Lanr1-Locus zu Chromosom NLL-11^{31, 32, 33}. Die Ausrichtung von Kopplungskartenmarkern flankierender Resistenzloci gegen Anthraknose mit einem genomischen Rahmen, NLL, zeigte die Lage aller drei Allele auf demselben Chromosom (NLL-11), jedoch an unterschiedlichen Positionen^{29, 34, 35}. Aufgrund der geringen Anzahl an RILs und der großen genetischen Distanz zwischen Markern und entsprechenden Allelen lassen sich jedoch keine verlässlichen Rückschlüsse auf die zugrundeliegenden Gene ziehen. Andererseits ist die Anwendung der reversen Genetik bei Lupinen aufgrund ihres sehr geringen Regenerationspotenzials schwierig, was die genetische Manipulation aufwendig macht³⁷.
Die Entwicklung domestizierter Keimplasmalinien mit dem gewünschten Allel im homozygoten Zustand, wie z. B. 83A:476 (Lanr1) und Mandelup (AnMan), hat die Erforschung der Anthraknoseresistenz trotz des Vorkommens gegensätzlicher Allelkombinationen in Wildpopulationen ermöglicht. Mögliche molekulare Mechanismen und der Vergleich von Abwehrreaktionen spezifischer Genotypen wurden untersucht. Diese Studie evaluierte die frühe Transkriptomreaktion von NLL auf die Impfung mit C. lupini. Zunächst wurde ein europäisches NLL-Keimplasmapanel mit 215 Linien mithilfe molekularer Marker, die die Allele Lanr1 und AnMan markieren, gescreent. Anschließend wurde die Anthraknose-Phänotypisierung von 50 zuvor anhand molekularer Marker selektierten NLL-Linien unter kontrollierten Bedingungen durchgeführt. Basierend auf diesen Experimenten wurden vier Linien mit unterschiedlicher Anthraknoseresistenz und Lanr1/AnMan-Allelzusammensetzung für die differentielle Analyse der Abwehrgenexpression mittels zweier komplementärer Ansätze ausgewählt: Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung und quantitative Echtzeit-PCR.
Die Untersuchung eines NLL-Keimplasmas (N = 215) mit den Markern Lanr1 (Anseq3 und Anseq4), AnMan (Anseq4) und AnMan (AnManM1) zeigte, dass nur eine Linie (95726, nahe Salamanca-b) das Resistenzallel für alle Marker amplifizierte. Die Untersuchung auf das Vorhandensein von anfälligen Allelen ergab einen Anteil von 158 Linien (~73,5 %) für alle Marker. Dreizehn Linien produzierten zwei resistente Allele des Lanr1-Markers, und acht Linien produzierten zwei resistente Allele des Lanr1-Markers. Das Resistenzallel des AnMan-Markers ist in Tabelle S1 (Ergänzungsmaterial) aufgeführt. Zwei Linien waren heterozygot für den Anseq3-Marker und eine heterozygot für den AnManM1-Marker. 42 Linien (19,5 %) trugen entgegengesetzte Phasen der Allele Anseq3 und Anseq4, was auf eine hohe Rekombinationsrate zwischen diesen beiden Loci hindeutet. Die Anthraknose-Phänotypen unter kontrollierten Bedingungen (Ergänzungstabelle S2) zeigten eine Variabilität in der Resistenz der getesteten Genotypen, die sich im Schweregrad der Anthraknose widerspiegelte. Die Unterschiede in den Mittelwerten reichten von 1,8 (mäßig resistent) bis 6,9 (anfällig), und die Unterschiede im Pflanzengewicht reichten von 0,62 g (anfällig) bis 4,45 g (resistent). Es bestand eine signifikante Korrelation zwischen den Werten, die in zwei Wiederholungen des Experiments beobachtet wurden (0,51 für die Schweregrade der Krankheit, P = 0,00017 und 0,61 für das Pflanzengewicht, P < 0,0001) sowie zwischen diesen beiden Parametern (− 0,59 und − 0,77, P < 0,0001). Es gab eine signifikante Korrelation zwischen den Werten, die in zwei Wiederholungen des Experiments beobachtet wurden (0,51 für die Schweregrade der Krankheit, P = 0,00017 und 0,61 für das Pflanzengewicht, P < 0,0001) sowie zwischen diesen beiden Parametern (− 0,59 und − 0,77, P < 0,0001). Die meisten Ergebnisse wurden in zwei verschiedenen Tests ermittelt (0,51 für die meisten Tests, P = 0,00017 und). 0,61 für Massenabmessungen, P < 0,0001), zusätzlich zu diesen beiden Parametern (-0,59 und -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Es wurde eine signifikante Korrelation zwischen den in zwei Wiederholungen des Experiments beobachteten Werten festgestellt (0,51 für die Schweregrade der Krankheit, P = 0,00017 und 0,61 für das Pflanzengewicht, P < 0,0001), sowie zwischen diesen beiden Parametern (- 0,59 und -0,77, P < 0,0001) 0,0001.Der Wert beträgt 0,51, P = 0,00017, 0,61, P < 0,0001, 0,59 0,77, P < 0,0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为0,51, p = 0,00017, 0,61, p <0,0001) 0,59 0,59和– 0,59 和– 0,59 和- 0,77，P < 0,0001)。 Es wurden innerhalb von 14 Stunden erste Korrelationen ermittelt, die auf zwei Ebenen festgelegt wurden (Zielpunktzahl 0,51, P = 0,00017 und Masse). Größe 0,61, P <0,0001) und zwischen diesen beiden Parametern (-0,59 und -0,0001) 0,77, P <0,0001. Es bestand eine signifikante Korrelation zwischen den in Doppelbestimmung beobachteten Werten (Krankheitsschweregrad 0,51, P = 0,00017 und Pflanzengewicht 0,61, P < 0,0001) und zwischen diesen beiden Parametern (-0,59 und -0,0001) 0,77, P<0,0001. ).Typische Symptome anfälliger Pflanzen sind Knicke und Verdrehungen des Stängels, die an einen Hirtenbogen erinnern, gefolgt von ovalen Läsionen mit orange-rosa Sporozoiten (Ergänzende Abb. 1). Australische Linien mit den Genen Lanr1 (83A:476 und Tanjil) und AnMan (Mandelup) weisen eine moderate Resistenz auf (0,0331 bzw. 0,0036). Einige Linien, die auch „resistente“ Allele von Lanr1 und/oder AnMan tragen, zeigen Krankheitssymptome.
Interessanterweise zeigten einige NLL-Linien, denen ein „resistentes“ Marker-Allel fehlte, eine hohe Anthraknose-Resistenz (vergleichbar oder höher als bei den Genotypen Lanr1 oder AnMan), wie zum Beispiel Boregine (P-Wert < 0,0001 für beide Parameter), Bojar (P-Wert < 0,0001 für den Score und 0,001 für das Pflanzengewicht) und Population B-549/79b (P-Wert < 0,0001 für den Score und nicht signifikant für das Gewicht). Interessanterweise zeigten einige NLL-Linien, denen ein „resistentes“ Marker-Allel fehlte, eine hohe Anthraknose-Resistenz (vergleichbar oder höher als bei den Genotypen Lanr1 oder AnMan), wie zum Beispiel Boregine (P-Wert < 0,0001 für beide Parameter), Bojar (P-Wert < 0,0001 für den Score und 0,001 für das Pflanzengewicht) und Population B-549/79b (P-Wert < 0,0001 für den Score und nicht signifikant für das Gewicht). Interessant ist, dass die NLL-Linie, die mit der „Resistenz“-Markierung begonnen hat, eine Reihe von Anträgen auf die Ansteckung gestellt hat (kompatibel oder sehr beliebt, z. B. für Lanr1-Genotypen oder AnMan), ebenso wie Boregine (Wert P <0,0001 für bestimmte Parameter), Bojar (Wert P < 0,0001 für Faktoren und 0,001 für die Masse растения) и популяции B-549/79b (Sendung P <0,0001 für оценки и незначимо for массы). Interessanterweise zeigten mehrere NLL-Linien, denen ein „resistentes“ Marker-Allel fehlte, eine hohe Resistenz gegen Anthraknose (vergleichbar mit oder höher als bei den Genotypen Lanr1 oder AnMan), wie zum Beispiel Boregine (P-Wert < 0,0001 für beide Parameter), Bojar (P-Wert < 0,0001 für die Bewertung und 0,001 für das Pflanzengewicht) und die Population B-549/79b (P-Wert < 0,0001 für die Bewertung und nicht signifikant für das Gewicht).有趣的是,一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1或AnMan 基因型相当或更高）, 例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0,0001,植物重量为0,001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001,重量不显着）. Interessanterweise weisen einige NLL-Systeme, die keine „antigenen“ Marker besitzen, eine hohe horizontale Resistenz auf (entsprechend den Lanr1- oder AnMan-Genen oder höher), wie beispielsweise Boregine (beide Parameter P < 0,0001), Bojar (P-Wert < 0,0001, Pflanzengewicht 0,001) und der Stamm B-549/79b (P-Wert < 0,0001, Gewicht nicht signifikant). Interessanterweise haben die NLL-Vertreter, die sich mit der „Resistenzsicherung“ auskennen, eine Reihe von Anträgen auf eine Ansteckungsmethode gestellt oder andere, einschließlich der Gentypen Lanr1 oder AnMan), wie Boregine (Wert P für Parameter <0,0001), Bojar (Wert P <0,0001, Mindestgröße 0,001) und Bevölkerung B-549/79b (Ozean P-Zitat <0,0001, nicht ausreichend). Interessanterweise zeigten einige NLL-Linien, denen jegliche Resistenzmarker-Allele fehlten, eine hohe Anthraknose-Resistenz (vergleichbar mit oder höher als die Genotypen Lanr1 oder AnMan), wie beispielsweise Boregine (P-Wert für beide Parameter <0,0001), Bojar (P-Wert < 0,0001, Pflanzengewicht 0,001) und die Population B-549/79b (P-Wert < 0,0001, Gewicht nicht signifikant).Dieses Phänomen deutet auf eine mögliche neue genetische Resistenzquelle hin und erklärt die beobachtete fehlende Korrelation zwischen Markergenotypen und Krankheitsphänotypen (P-Werte von ca. 0,42 bis ca. 0,98). Der Kolmogorov-Smirnov-Test zeigte, dass die Daten zur Anthraknoseresistenz für die Werte (P-Werte 0,25 und 0,11) und die Pflanzenmasse (P-Werte 0,47 und 0,55) annähernd normalverteilt waren. Dies legt die Hypothese nahe, dass neben Lanr1 und AnMan weitere Allele beteiligt sind.
Basierend auf den Ergebnissen des Anthraknose-Resistenz-Screenings wurden vier Linien für die Transkriptomanalyse ausgewählt: 83A:476, Boregin, Mandelup und Population 22660. Diese Linien wurden in Inokulationsexperimenten mittels RNA-Sequenzierung erneut auf Anthrax-Resistenz getestet, sofern sie mit den Ergebnissen des vorherigen Tests übereinstimmten. Die Score-Werte waren wie folgt: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) und Population 22660 (6,11 ± 1,29).
Das Illumina NovaSeq 6000-Protokoll erzielte durchschnittlich 40,5 Mread-Paare pro Probe (29,7 bis 54,4 Mreads) (Ergänzungstabelle S3). Die Alignment-Scores in der Referenzsequenz lagen zwischen 75,5 % und 88,6 %. Die durchschnittliche Korrelation der Read-Count-Daten zwischen experimentellen Varianten in biologischen Replikaten lag zwischen 0,812 und 0,997 (Mittelwert 0,959). Von den 35.170 analysierten Genen zeigten 2917 keine Expression, und die übrigen 4785 Gene wurden nur in vernachlässigbarem Maße exprimiert (Basismittelwert < 5). Von den 35.170 analysierten Genen zeigten 2917 keine Expression, und die übrigen 4785 Gene wurden nur in vernachlässigbarem Maße exprimiert (Basismittelwert < 5). Im Jahr 2917 wurden 35.170 Personen nicht per E-Mail versendet, 4.785 Personen wurden am nächsten Tag (basiert) veröffentlicht Mitte <5). Von den 35.170 analysierten Genen zeigten 2917 keine Expression, und die verbleibenden 4785 Gene wurden auf einem vernachlässigbaren Niveau exprimiert (Basismittelwert <5).Mehr als 35.170 US-Dollar, 2917 US-Dollar und 4785 US-Dollar个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）.35.170 Von 35.170 geprüften Personen im Jahr 2917 wurde keine Prüfung durchgeführt, während 4.785 Personen keine Prüfung durchführten (basierend auf der Website). значение <5). Von den 35.170 analysierten Genen wurden 2917 nicht exprimiert und die verbleibenden 4785 Gene wiesen eine vernachlässigbare Expression auf (Basismittelwert <5).Somit betrug die Anzahl der Gene, die während des Experiments als exprimiert galten (Basismittelwert ≥ 5), 27.468 (78,1 %) (Ergänzungstabelle S4).
Ab dem ersten Messzeitpunkt reagierten alle NLL-Linien auf die Inokulation mit C. lupini (Stamm Col-08) mit einer Umprogrammierung des Transkriptoms (Tabelle 1). Dabei zeigten sich jedoch signifikante Unterschiede zwischen den Linien. So wies die resistente Linie 83A:476 (mit dem Lanr1-Gen) bereits zum ersten Messzeitpunkt (6 hpi) eine signifikante Umprogrammierung des Transkriptoms auf, mit einem 31- bis 69-fachen Anstieg der Anzahl isolierter hoch- und herunterregulierter Gene im Vergleich zu anderen Messzeitpunkten. Dieser Peak war jedoch nur von kurzer Dauer, da die Expression nur weniger Gene zum zweiten Messzeitpunkt (12 hpi) signifikant verändert blieb. Interessanterweise zeigte Boregine, die im Pfropftest ebenfalls eine hohe Resistenz aufwies, während des Experiments keine derart massive Umprogrammierung des Transkriptoms. Die Anzahl der differentiell exprimierten Gene (DEG) war jedoch für Boregine und 83A:476 12 hpi gleich. Sowohl Mandelup als auch die Population 22660 zeigten DEG-Peaks zum letzten Messzeitpunkt (48 l/s), was auf eine relative Verzögerung der Abwehrreaktionen hindeutet.
Da die Linie 83A:476 im Vergleich zu allen anderen Linien 6 Stunden nach der Infektion mit C. lupini eine massive Umprogrammierung des Transkriptoms aufwies, waren etwa 91 % der zu diesem Zeitpunkt beobachteten differentiell exprimierten Gene (DEGs) linienspezifisch (Abb. 1). Es gab jedoch Überschneidungen in den frühen Reaktionen zwischen den untersuchten Linien: 68,5 %, 50,9 % bzw. 52,6 % der DEGs in Boregine, Mandelup bzw. Population 22660 überschnitten sich zu bestimmten Zeitpunkten mit denen in 83A:476. Diese DEGs machten jedoch nur einen geringen Anteil (0,97–1,70 %) aller aktuell mit 83A:476 detektierten DEGs aus. Darüber hinaus waren zu diesem Zeitpunkt 11 DEGs aus allen Linien kohärent (Ergänzungstabellen S4-S6), darunter gemeinsame Komponenten der pflanzlichen Abwehrreaktionen: Lipidtransferprotein (TanjilG_32225), Endoglucan-1,3-β-Glucosid-Enzym (TanjilG_23384), zwei stressinduzierbare Proteine ​​wie SAM22 (TanjilG_31528 und TanjilG_31531), basisches Latexprotein (TanjilG_32352) und zwei glycinreiche Strukturproteine ​​der Zellwand (TanjilG_19701 und TanjilG_19702). Es gab auch eine relativ hohe Überlappung der Transkriptom-Reaktionen zwischen 83A:476 und Boregine 24 Stunden nach der Infektion (insgesamt 16-38% DEG) und zwischen Mandelup und Population 22660 48 Stunden nach der Infektion (insgesamt 14-20% DEG).
Venn-Diagramm mit der Anzahl differentiell exprimierter Gene (DEG) in Linien der Schmalblättrigen Lupine (NLL), die mit Colletotrichum lupini (Stamm Col-08, isoliert 1999 aus Lupinenfeldern in Wierzhenice, Polen) inokuliert wurden. Die analysierten NLL-Linien waren: 83A:476 (resistent, trägt das Allel Lanr1), Boregine (resistent, genetischer Hintergrund unbekannt), Mandelup (mäßig resistent, trägt das Allel AnMan) und Population 22660 (sehr anfällig). Die Abkürzung hpi steht für Stunden nach der Impfung. Nullwerte wurden zur Vereinfachung der Grafik entfernt.
Die Gruppe der 6 Stunden nach Infektion überexprimierten Gene wurde auf das Vorhandensein kanonischer R-Gendomänen analysiert (Ergänzungstabelle S7). Diese Studie zeigte eine Transkriptominduktion klassischer Krankheitsresistenzgene mit NBS-LRR-Domänen ausschließlich an Position 83A:476. Diese Gruppe bestand aus einem TIR-NBS-LRR-Gen (tanjilg_05042), fünf CC-NBS-LRR-Genen (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 und tanjilg_16162), vier NBS-LR-Domänen (tanjilg_16162), vier NBS-LRRE-Domänen (tanjilg_16162), vier NBS-Lrr-Domänen (tanjilg_16162) und vier NBS-LRR-Domänen (TANJILG_16162). Alle diese Gene weisen kanonische Domänen in konservierten Sequenzen auf. Zusätzlich zu den NBS-LRR-Domänengenen wurden mehrere RLL-Kinasen 6 Stunden nach der Infektion aktiviert, nämlich eine in Boregine (TanjilG_19877), zwei in Mandelup (TanjilG_07141 und TanjilG_19877) und in Population 22660 (TanjilG_09014 und TanjilG_10361) sowie zwei in 83A 27:476.
Gene, deren Expression sich als Reaktion auf die Infektion mit C. lupini (Stamm Col-08) signifikant veränderte, wurden einer Gen-Ontologie (GO)-Anreicherung-Analyse unterzogen (Ergänzungstabelle S8). Der am häufigsten überrepräsentierte biologische Prozessbegriff war „GO:0006952 Abwehrreaktion“, der in 6 von 16 (Zeit × Linie) Kombinationen mit hoher Signifikanz (P-Wert < 0,001) auftrat (Abb. 2). Der am häufigsten überrepräsentierte biologische Prozessbegriff war „GO:0006952 Abwehrreaktion“, der in 6 von 16 (Zeit × Linie) Kombinationen mit hoher Signifikanz (P-Wert < 0,001) auftrat (Abb. 2). Der erste Teil des biologischen Prozesses lautete: „GO: 0006952 gesperrter Kommentar“, gefolgt von 6 von 16 (Zeit × Zeit) Kombination mit einem bestimmten Wert (Wert P <0,001) (Risk. 2). Der am häufigsten überrepräsentierte biologische Prozessbegriff war „GO:0006952 Abwehrreaktion“, der in 6 von 16 (Zeit × Abstammung)-Kombinationen mit hoher Signifikanz (P-Wert < 0,001) auftrat (Abb. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应“, 它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 Der repräsentativste biologische Prozessbegriff ist „GO:0006952 Abwehrreaktion“, der in 6 der 16 (Zeit×Linie)-Kombinationen mit hoher Signifikanz (P-Wert < 0,001) auftritt (Abbildung 2). Der erste Teil des vorläufigen biologischen Prozesses lautete „GO: 0006952 Defense Response“ und war in Kombination mit 6 von 16 (Zeiten) verfügbar × Linien) mit высокой значимостью (значение P <0,001) (Ris. 2). Der am häufigsten überrepräsentierte biologische Prozessbegriff war „GO:0006952 Abwehrreaktion“, der in 6 von 16 Kombinationen (Zeit × Linie) mit hoher Signifikanz (P-Wert < 0,001) auftrat (Abb. 2).Dieser Term war in 83A:476 und Boregine zu zwei Zeitpunkten (6 und 24 hpi) und in Mandelup und Population 22660 zu einem Zeitpunkt (12 bzw. 6 hpi) überrepräsentiert. Dies ist ein erwartetes Ergebnis und unterstreicht die antimykotische Reaktion der resistenten Linien. Darüber hinaus reagierte 83A:476 auf C. lupini mit einer schnellen Induktion von Genen, die mit dem oxidativen Burst (repräsentiert durch den Term „GO:0055114 Redoxprozess“) in Zusammenhang stehen, was auf eine spezifische Abwehrreaktion hindeutet. Boregine zeigte ebenfalls spezifische Abwehrreaktionen, die mit dem Term „GO“ assoziiert sind. Population 22660 aktivierte die horizontale Resistenzreaktion unter Beteiligung von Sekundärmetaboliten, was auf die übermäßige Anzahl der Begriffe „GO:0016104 Prozess der Triterpenbiosynthese“ und „GO:0006722 Prozess des Triterpenstoffwechsels“ (beide Begriffe gehören zum selben Gensatz) hinweist. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse der GO-Term-Anreicherung lag die Stabilität der Mandelup-Reaktion zwischen Boregine und Population 22660. Darüber hinaus umfassen die frühe Reaktion 83A:476 (6 hpi) und die verzögerte Reaktion Mandelup und Population 22660 den Begriff GO:0015979 „Photosynthese“ und andere verwandte biologische Prozesse.
Die in der Annotation differentiell exprimierter Gene während der Transkriptomreaktionen von mit Milzbrand-Lupine (Stamm Col-08, isoliert aus Lupinenfeldern in Wierzhenice, Polen, 1999) infizierten Schmalblättrigen Lupinen (NLL) ausgewählten Bioprozess-Gen-Ontologie-Begriffe sind stark übertrieben. Die analysierten NLL-Linien waren: 83A:476 (resistent, homozygot für das Lanr1-Allel), Boregine (resistent, unbekannter genetischer Hintergrund), Mandelup (mäßig resistent, homozygot für das AnMan-Allel) und Population 22660 (anfällig).
Da diese Studie die Identifizierung von Genen zum Ziel hatte, die zur Anthraknoseresistenz beitragen, wurden die den GO-Termen „GO:0006952 Abwehrreaktionen“ und „GO:0055114 Redoxprozesse“ zugeordneten Gene anhand von Schwellenwerten analysiert, da der Basislinienmittelwert ≥ 30 mit mindestens einer Linie × Zeitpunkt statistisch signifikante Werte des Log2-Fold-Change kombinierte. Die Anzahl der Gene, die diese Kriterien erfüllten, betrug 65 für GO:0006952 und 524 für GO:0055114.
83A:476 identifizierte zwei differentiell exprimierte Gene (DEG), die mit dem Begriff GO:0006952 annotiert waren: ein erstes bei 6 Genen pro Zoll (64 Gene, sowohl hoch- als auch herunterreguliert) und ein zweites bei 24 Genen pro Zoll (15 Gene, ausschließlich hochreguliert). Boregine zeigte ebenfalls, dass GO:0006952 zum gleichen Zeitpunkt einen Peak aufwies, jedoch mit weniger DEG (11 und 8) und bevorzugter Aktivierung. Mandeloop identifizierte zwei Peaks von GO:0006952 bei 12 und 48 Stunden nach der Infektion (HPI), die jeweils 12 Gene umfassten (der erste mit aktivierenden, der zweite ausschließlich mit suppressiven Genen). Die Population 22660 zeigte bei 6 HPI (13 Gene) eine stärkere Dominanz des Peaks mit erhöhter Expression. Es ist anzumerken, dass 96,4 % der in diesen Peaks enthaltenen differentiell exprimierten Gene (DEG) mit GO:0006952 die gleiche Art der Reaktion (hoch- oder herunterreguliert) zeigten, was trotz Unterschieden in der Anzahl der beteiligten Gene auf eine signifikante Überlappung der Abwehrreaktionen hindeutet. Die größte Gruppe von Sequenzen, die mit dem Begriff GO:0006952 verwandt sind, kodiert das Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-ähnlich), welches zur Klasse 10 der Pathogenese-assoziierten Proteine ​​(PR-10) und zum Kernprotein Latex (MLP-ähnlich) gehört (Abb. 3). Die beiden Gruppen unterschieden sich in der Art der Expression und der Richtung der Reaktion. Die Gene, die für SAM22-ähnliche Proteine ​​kodieren, zeigten eine konsistente und signifikante Induktion zu frühen Zeitpunkten (6 oder 12 hpi) und waren am Ende des Experiments (48 hpi) im Allgemeinen nicht mehr reaktionsfähig, während MLP-ähnliche Proteine ​​6 hpi eine Koordination aufwiesen. Bei 83A:476 und Mandelup bei 48 hp/in reagierten fast alle anderen Datenpunkte nicht. Darüber hinaus korrelierten die Unterschiede in den Expressionsprofilen von SAM22-ähnlichen Proteingenen mit der beobachteten Variabilität der Anthraknoseresistenz: Resistentere Linien zeigten zu mehr Zeitpunkten eine signifikante Induktion dieser Gene als anfälligere Linien. Ein weiteres LlR18A/B-ähnliches PR-10-Gen wies ein sehr ähnliches Expressionsmuster wie das SAM22-ähnliche Proteingen auf.
Die Hauptkomponenten des biologischen Prozessbegriffs „GO:0006952 Abwehrreaktion“ und die Expressionsmuster von Kandidatengenen der Allele Lanr1 und AnMan wurden identifiziert. Die Log2-Skala stellt die Log2-Werte (Veränderungsfaktor) zwischen inokulierten (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, isoliert aus Lupinenfeldern, Wizhenica, Polen, 1999) und Kontrollpflanzen (Scheininokulation) zum gleichen Zeitpunkt dar. Folgende Schmalblättrige Lupinenlinien wurden analysiert: 83A:476 (resistent, homozygot für das Lanr1-Allel), Boregine (resistent, genetischer Hintergrund unbekannt), Mandelup (mäßig resistent, homozygot für das AnMan-Allel) und Population 22660 (anfällig).
Zusätzlich wurden die Expressionsprofile der RNA-Seq-Kandidatengene Lanr1 (TanjilG_05042) und AnMan (TanjilG_12861) ausgewertet (Abb. 3). Das Gen TanjilG_05042 zeigte eine signifikante Reaktion (Aktivierung) an Position 83A:476 nur zum ersten Messzeitpunkt (6 hpi), während TanjilG_12861 in Mandeloop nur zu zwei Zeitpunkten signifikant war: 6 hpi (Herunterregulierung) und 24 hpi (6 hpi).
Die am stärksten überexprimierten Gene im GO:0055114-Term „Redoxprozess“ kodierten für Cytochrom-P450-Proteine ​​und Peroxidase (Abb. 4). Bei Proben, die 6 Stunden nach der Infektion (hpi) aus 83A:476 isoliert wurden, zeigten sich zwischen inokulierten und Kontrollpflanzen im Allgemeinen maximale oder minimale log2-Werte (Fold Change) (für 86,6 % der Gene), was die hohe Reaktion dieses Genotyps auf das inokulierte Geschlecht unterstreicht. 83A:476 wies 6 hpi die meisten signifikanten differentiell exprimierten Gene (DEG) im GO:0055114-Term auf (503 Gene), während die übrigen Linien 48 hpi signifikante Unterschiede zeigten (Boregine: 31 Gene; Mandelup: 85 Gene; Population 22660: 78 Gene). Bei den meisten Genen der GO:0055114-Familie wurden zwei Arten von Reaktionen auf die Impfung beobachtet (Aktivierung und Hemmung). Interessanterweise wurden bis zu 97,6 % der für den Begriff GO: 0055114 identifizierten differentiell exprimierten Gene (DEGs) in Mandelupe nach 48 Stunden identifiziert. Diese Beobachtungen legen nahe, dass das Muster der verzögerten Transkriptomreaktionen von Mandelup auf Anthraknose trotz des deutlich geringeren Umfangs (d. h. der Anzahl mutierter Redoxgene, 85 gegenüber 503) dem Muster der frühen Reaktion von 83A:476 ähnelt. In Boregine und Population 22660 ist diese Übereinstimmung mit 51,6 % bzw. 75,6 % geringer.
Die Expressionsmuster der Hauptkomponenten des biologischen Prozesses „GO:0055114 Redoxprozess“ wurden ermittelt. Die Log2-Skala stellt die Log2-Werte (Veränderungsfaktor) zwischen inokulierten (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, isoliert aus Lupinenfeldern, Wizhenica, Polen, 1999) und unbehandelten Kontrollpflanzen (Scheininokulation) zum gleichen Zeitpunkt dar. Folgende Schmalblättrige Lupinenlinien wurden analysiert: 83A:476 (resistent, homozygot für das Lanr1-Allel), Boregine (resistent, genetischer Hintergrund unbekannt), Mandelup (mäßig resistent, homozygot für das AnMan-Allel) und Population 22660 (anfällig).
Die transkriptomischen Reaktionen auf die Inokulation mit C. lupini (Stamm Col-08) umfassten auch die koordinierte Stilllegung von Genen, die dem GO-Term „Photosynthese“ (GO:0015979) zugeordnet sind, sowie anderer verwandter biologischer Prozesse (Abb. 5). Dieser GO:0015979-DEG-Satz enthielt 105 Gene, die 6 Stunden nach der Infektion (hpi) in 83A:476 signifikant reprimiert waren. In dieser Untergruppe waren 37 Gene auch in Mandelup 48 hpi und 35 zum gleichen Zeitpunkt in der Population 22660 herunterreguliert, darunter 19 DEGs, die beiden Genotypen gemeinsam waren. Keine DEGs, die mit dem GO-Term 0015979 in Verbindung stehen, wurden in irgendeiner Kombination (Linie x Zeit) signifikant aktiviert.
Die Expressionsmuster der Hauptkomponenten des biologischen Prozesses „GO:0015979 Photosynthese“ wurden ermittelt. Die Log2-Skala stellt die Log2-Werte (Veränderungsfaktor) zwischen inokulierten (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, isoliert aus Lupinenfeldern, Wizhenica, Polen, 1999) und unbehandelten Kontrollpflanzen (Scheininokulation) zum gleichen Zeitpunkt dar. Analysiert wurden folgende Schmalblättrige Lupinenlinien: 83A:476 (resistent, homozygot für das Lanr1-Allel), Boregine (resistent, genetischer Hintergrund unbekannt), Mandelup (mäßig resistent, homozygot für das AnMan-Allel) und Population 22660 (anfällig).
Aufgrund der Ergebnisse der differentiellen Expressionsanalyse und der Annahme, dass diese Gene an Abwehrreaktionen gegen pathogene Pilze beteiligt sind, wurde dieser Satz von sieben Genen für die Quantifizierung der Expressionsprofile mittels Echtzeit-PCR ausgewählt (Ergänzungstabelle S9).
Das mutmaßliche Proteingen TanjilG_10657 wurde in allen untersuchten Linien und zu allen Zeitpunkten im Vergleich zu Kontrollpflanzen (Mimikry-Pflanzen) signifikant induziert (Ergänzungstabellen S10, S11). Darüber hinaus zeigte das Expressionsprofil von TanjilG_10657 im Verlauf des Experiments für alle Linien einen steigenden Trend. Population 22660 wies die höchste Sensitivität von TanjilG_10657 gegenüber der Inokulation mit einer 114-fachen Aktivierung und dem höchsten relativen Expressionsniveau (4,4 ± 0,4) 24 Stunden nach der Inokulation auf (Abb. 6a). Das PR10-LlR18A-Proteingen TanjilG_27015 zeigte ebenfalls eine Aktivierung in allen Linien und zu allen Zeitpunkten, wobei die meisten Datenpunkte statistisch signifikant waren (Abb. 6b). Ähnlich wie bei TanjilG_10657 wurde die höchste relative Expressionsstärke von TanjilG_27015 in der mit 22660 inokulierten Population 24 Stunden nach der Infektion (HPI) beobachtet (19,5 ± 2,4). Das Gen für die saure Endochitinase TanjilG_04706 war in allen Linien und zu allen Zeitpunkten außer Boregine 6 hpi signifikant hochreguliert (Abb. 6c). Es wurde zum ersten Zeitpunkt (6 hPI) in 83A:476 stark induziert (um das 10,5-Fache) und in den anderen Linien moderat erhöht (um das 6,6- bis 7,5-Fache). Im Verlauf des Experiments blieb die Expression von TanjilG_04706 in 83A:476 und Boregine auf einem ähnlichen Niveau, während sie in Mandelup und der Population 22660 signifikant anstieg und relativ hohe Werte erreichte (5,9 ± 1,5 bzw. 6,2 ± 1,5). Das Endoglucan-1,3-β-Glucosidase-ähnliche Gen TanjilG_23384 zeigte in allen Linien außer Population 22660 zu den ersten beiden Messzeitpunkten (6 und 12 hpi) eine hohe Aktivierung (Abb. 6d). Die höchsten relativen Expressionswerte von TanjilG_23384 wurden zum zweiten Messzeitpunkt (12 hpi) in Mandelup (2,7 ± 0,3) und 83A:476 (1,5 ± 0,1) beobachtet. 24 hpi war die Expression von TanjilG_23384 in allen untersuchten Linien relativ niedrig (0,04 ± 0,009 bis 0,44 ± 0,12).
Expressionsprofile ausgewählter Gene (ag), ermittelt mittels quantitativer PCR. Die Zahlen 6, 12 und 24 beziehen sich auf die Stunden nach der Impfung. Die Gene LanDExH7 und LanTUB6 dienten zur Normalisierung, LanTUB6 zusätzlich zur Kalibrierung zwischen den Messreihen. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung basierend auf drei biologischen Replikaten an, wobei jedes Replik den Mittelwert aus drei technischen Replikaten darstellt. Die statistische Signifikanz der Unterschiede in den Expressionsniveaus zwischen den inokulierten (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, gewonnen 1999 auf einem Lupinenfeld in Wierzenica, Polen) und den Kontrollpflanzen (Scheininokulierte) ist über den Datenpunkten gekennzeichnet (*P-Wert < 0,05, **P-Wert ≤ 0,01, ***P-Wert ≤ 0,001). Die statistische Signifikanz der Unterschiede in den Expressionsniveaus zwischen den inokulierten (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, gewonnen 1999 auf einem Lupinenfeld in Wierzenica, Polen) und den Kontrollpflanzen (Scheininokulierte) ist über den Datenpunkten gekennzeichnet (*P-Wert < 0,05, **P-Wert ≤ 0,01, ***P-Wert ≤ 0,001). Statistische Untersuchung der Verbreitung in den letzten Jahren der Kulturexpression (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, geboren 1999). Верженице, Польша) и Kontrollsysteme (nicht fehlerbehaftet) werden auf bestimmte Werte eingestellt (*Wert P < 0,05, **Wert P ≤ 0,01, **Wert P ≤ 0,001). Statistisch signifikante Unterschiede in den Expressionsniveaus zwischen inokulierten (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, gewonnen 1999 von einem Lupinenfeld in Wierzhenice, Polen) und Kontrollpflanzen (Schein-inokuliert) sind über den Datenpunkten vermerkt (*P-Wert < 0,05, **P-Wert ≤ 0,01, ***P-Wert ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini, Col-08, 1999, 1999, 1999, Wierzenica, 1999 ）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001)。Pflanze (Colletotrichum lupini, Farbe-08), 1999水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001)。 Statistische Stichproben in den letzten Jahren der Kulturexpression (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, beliebt mit einer Stecklingspflanze in der Nähe von Verzhen, Polen, 1999) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* P-Wert < 0,05, ** P-Wert ≤ 0,01, ***P-Wert ≤ 0,001). Statistisch signifikante Unterschiede in den Expressionsniveaus zwischen inokulierten (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, gewonnen 1999 aus Lupinenfeldern in Verzhenice, Polen) und Kontrollpflanzen (Schein-inokuliert) sind über den Datenpunkten vermerkt (*P-Wert < 0,05 , **P-Wert ≤ 0,01, ***P-Wert ≤ 0,001).Die analysierten NLL-Linien waren: 83A:476 (resistent, trägt das homozygote Lanr1-Allel), Mandelup (mäßig resistent, trägt das homozygote AnMan-Allel), Boregine (resistent, unbekannter genetischer Hintergrund) und Population 22660 (anfällig).
Das Kandidatengen TanjilG_05042 am Lanr1-Locus zeigte ein deutlich anderes Expressionsmuster als die in RNA-Seq-Studien ermittelten Profile (Abb. 6e). In Mandelup und der Population 22660 wurde eine signifikante Aktivierung dieses Gens beobachtet (bis zu 39,7- bzw. 11,7-fach), was zu relativ hohen Expressionsniveaus führte (bis zu 1,4 ± 0,14 bzw. 7,2 ± 1,3). Auch in 83A:476 zeigte sich eine gewisse Hochregulation des Gens TanjilG_05042 (bis zu 3,8-fach), die erreichten relativen Expressionsniveaus (0,044 ± 0,002) waren jedoch mehr als 30-fach niedriger als in Mandelup und der Population 22660. Die mittels qPCR analysierten Ergebnisse zeigten signifikante Unterschiede in den Expressionsniveaus zwischen den Genotypen in den scheingeimpften (Kontroll-)Varianten. Der Unterschied betrug das 58-Fache zwischen den Populationen 22660 und 83A:476 sowie zwischen den Populationen 22660 und 22660. Zwischen Boregine und Mandalup wurde ein zweifacher Unterschied festgestellt.
Das Kandidatengen TanjilG_12861 am AnMan-Locus wurde in den Stämmen 83A:476 und Mandelup nach Impfung aktiviert, war in der Population 22660 neutral und in Boregine herunterreguliert (Abb. 6f). Die relative Expression des Gens TanjilG_12861 war im geimpften Stamm 83A:476 am höchsten (0,14 ± 0,01). Das Gen für das 17,4 kDa große Hitzeschockprotein der Klasse I, TanjilG_05080 HSP17.4, zeigte in allen untersuchten Stämmen und zu allen Zeitpunkten niedrigere relative Expressionswerte (Abb. 6g). Der höchste Wert wurde 24 Stunden nach der Impfung in der Population 22660 beobachtet (0,14 ± 0,02, eine achtfache Steigerung nach Impfung).
Der Vergleich der Genexpressionsprofile (Abb. 7) zeigte eine hohe Korrelation zwischen TanjilG_10657 und vier weiteren Genen: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) und TanjilG_04706 (r = 0,79). Diese Ergebnisse deuten möglicherweise auf eine Koregulation dieser Gene während Abwehrreaktionen hin. Die Gene TanjilG_12861 und TanjilG_23384 wiesen im Vergleich zu den anderen Genen abweichende Expressionsprofile mit niedrigeren Pearson-Korrelationskoeffizienten (0,08 bis 0,43 bzw. -0,19 bis 0,28) auf.
Korrelationen zwischen Genexpressionsprofilen wurden mittels quantitativer PCR ermittelt. Analysiert wurden folgende Linien der Schmalblättrigen Lupine: 83A:476 (resistent, homozygot für das Lanr1-Allel), Mandelup (mäßig resistent, homozygot für das AnMan-Allel), Boregine (resistent, genetischer Hintergrund unbekannt) und Population 22660 (anfällig). Es wurden drei Zeitpunkte (6, 12 und 24 Stunden nach der Inokulation) erfasst, darunter inokulierte (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, isoliert 1999 aus Lupinenfeldern in Wierzhenice, Polen) und Kontrollpflanzen (Scheininokulation). Die Skala zeigt den Wert des Pearson-Korrelationskoeffizienten.
Basierend auf Daten, die bei 6 PS pro Zoll gewonnen wurden, wurde eine WGCNA an 9981 differentiell exprimierten Genen (DEG) durchgeführt, die durch den Vergleich von inokulierten und Kontrollpflanzen identifiziert wurden, um den Fokus auf frühe Abwehrreaktionen zu legen (Ergänzungstabelle S12). Es wurden 22 Genmodule (Cluster) mit korrelierten (positiven oder negativen) Expressionsprofilen zwischen Genotypen und experimentellen Varianten gefunden. Im Durchschnitt waren die Genexpressionsniveaus in der Reihenfolge 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 absteigend (in beiden Varianten war dieser Trend jedoch bei den Kontrollpflanzen stärker ausgeprägt). Im Durchschnitt waren die Genexpressionsniveaus in der Reihenfolge 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 absteigend (in beiden Varianten war dieser Trend jedoch bei den Kontrollpflanzen stärker ausgeprägt). Im Laufe der letzten Generationen wurde diese Tendenz im Abschnitt 83A:476 > Mandelup > Boregine > Bevölkerung 22660 (in den oben genannten Varianten, seltsamerweise) gelöscht контрольных растений). Im Durchschnitt sanken die Genexpressionsniveaus in der Reihenfolge 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (in beiden Varianten war dieser Trend jedoch bei den Kontrollpflanzen stärker ausgeprägt).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Bevölkerung 22660的顺序下降（然而,在两种变体中,这种趋势在对照植物中更强）.平均 而 言, 基因 水平 按 按 83a: 476> Mandelup> Boregine> Bevölkerung 22660 的 顺序 下降 （, 在 种 中, 这 种 在 在植物 中 更）。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 Im Laufe der letzten 83A:476 > Mandelup > Boregine > Bevölkerung 22660 (aufgrund der oben genannten Varianten und dieser Tendenz wurde ich nicht mehr gesehen контрольных растений). Im Durchschnitt sanken die Genexpressionsniveaus in der Reihe 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (allerdings war dieser Trend in beiden Varianten bei den Kontrollpflanzen stärker ausgeprägt).Die Impfung führte zu einer Hochregulierung der Genexpression, insbesondere in den Modulen 18, 19, 14, 6 und 1 (in absteigender Reihenfolge der Wirkung), zu einer negativen Regulation (z. B. Module 9 und 20) oder zu neutralen Effekten (z. B. Module 11, 22, 8 und 13). Die GO-Term-Anreicherung (Ergänzungstabelle S13) ergab für das am stärksten aktivierte Modul (18), das geimpft wurde, den GO-Term „0006952 Schutzreaktionen“. Dieser umfasst die mittels qPCR analysierten Gene (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 und TanjilG_27015) sowie viele der am stärksten unterdrückten Photosynthese-Module (9). Der Konzentrator von Modul 18 (Abb. 8) wurde als das Gen TanjilG_26536 identifiziert, das für das PR-10-ähnliche Protein LlR18B kodiert. Der Konzentrator von Modul 9 wurde als das Gen TanjilG_28955 identifiziert, das für das Photosystem-II-Protein PsbQ kodiert. Ein Kandidatengen für Anthraknose-Resistenz, Lanr1, TanjilG_05042, wurde in Modul 22 (Abb. 9) gefunden und ist mit den Begriffen „GO:0044260 Zelluläre makromolekulare Stoffwechselprozesse“ und „GO:0006355 Transkriptionsregulation, DNA-Templatierung“ assoziiert. Es enthält den Hub TanjilG_01212 und kodiert für den Hitzestress-Transkriptionsfaktor A-4a (HSFA4a).
Gewichtete Netzwerkanalyse der Gen-Koexpression von Modulen mit überrepräsentierten biologischen Prozessbegriffen „GO: 0006952 Abwehrreaktionen“. Die Ligation wurde vereinfacht, um die vier mittels qPCR analysierten Gene (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 und TanjilG_27015) hervorzuheben.
Gewichtete Netzwerkanalyse der Gen-Koexpression eines Moduls mit einem überrepräsentierten biologischen Prozessterm „GO: 0006355: Transkriptionsregulation, DNA-Templatierung“ und dem Kandidatengen für Anthraknoseresistenz Lanr1 TanjilG_05042. Die Ligation wurde vereinfacht, um das Gen TanjilG_05042 und das zentrale Gen TanjilG_01212 zu isolieren.
Die in Australien durchgeführte Resistenzprüfung auf Anthraknose ergab, dass die meisten der früh zugelassenen Sorten anfällig waren. Kalya, Coromup und Mandelup wurden als mäßig resistent beschrieben, während Wonga, Tanjil und 83A:476 als hochresistent beschrieben wurden.^26,27,31 Alle drei Sorten trugen das gleiche Resistenzallel, Lanr1, Coromup und Mandelup hingegen ein anderes Allel, AnMan^10,26,39, während Kalya ein anderes Allel, Lanr2, vererbte. Die Resistenzprüfung auf Anthraknose in Deutschland führte zur Identifizierung der resistenten Linie Bo7212 mit einem anderen Kandidatenallel als Lanr1, LanrBo36.
Unsere Studie ergab eine sehr geringe Häufigkeit (ca. 6 %) des Lanr1-Allels im untersuchten Genmaterial. Diese Beobachtung deckt sich mit den Ergebnissen des Screenings osteuropäischen Genmaterials mittels der Marker Anseq3 und Anseq4, die das Vorhandensein des Lanr1-Allels nur in zwei belarussischen Linien zeigten. Dies deutet darauf hin, dass das Lanr1-Allel – anders als in Australien, wo es eines der Schlüsselallele für die markergestützte Züchtung ist – in lokalen Zuchtprogrammen noch nicht weit verbreitet ist. Dies könnte an der geringeren Resistenz liegen, die das Lanr1-Allel unter europäischen Feldbedingungen im Vergleich zu den australischen Ergebnissen vermittelt. Darüber hinaus haben Studien zur Anthraknose in Gebieten mit hohen Niederschlägen in Australien gezeigt, dass die durch das Lanr1-Allel vermittelten Resistenzreaktionen unter Wetterbedingungen, die das Wachstum und die schnelle Entwicklung des Pathogens begünstigen, möglicherweise nicht wirksam sind.^19,42 Tatsächlich wurden in der vorliegenden Studie auch bei Genotypen mit dem Lanr1-Allel einige Symptome der Anthraknose beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Resistenz unter optimalen Entwicklungsbedingungen für C. lupini verschwinden kann. Darüber hinaus sind falsch-positive Interpretationen des Vorhandenseins der Marker Anseq3 und Anseq4, die etwa 1 cM vom Lanr1-Locus entfernt liegen, möglich.^28,30,43
Unsere Studie zeigte, dass der Stamm 83A:476, der das Lanr1-Allel trägt, auf die Infektion mit C. lupini zum ersten analysierten Zeitpunkt (6 hpi) mit einer umfassenden Umprogrammierung des Transkriptoms reagierte, während bei Mandelup, der das AnMan-Allel trägt, transkriptomische Reaktionen erst deutlich später (24 bis 48 hpi) beobachtet wurden. Diese zeitlichen Unterschiede in den Abwehrreaktionen korrelieren mit Unterschieden in den Krankheitssymptomen und unterstreichen die Bedeutung der frühen Pathogenerkennung für eine erfolgreiche Resistenzentwicklung. Um Pflanzengewebe zu infizieren, müssen Anthraxsporen mehrere Entwicklungsstadien auf der Wirtsoberfläche durchlaufen, darunter Keimung, Zellteilung und die Bildung eines Appressoriums. Ein Appressorium ist eine infektiöse Struktur, die sich an die Oberfläche des Wirts anheftet und das Eindringen in das Wirtsgewebe ermöglicht. So zeigten Sporen von C. gloeosporioides in Erbsenextrakt nach 75–90 Minuten Inkubation die erste Kernteilung, nach 90–120 Minuten die Bildung eines Keimschlauchs und nach 4 Stunden eine Suppression. Mango-C. gloeosporioides zeigte nach 3 Stunden Inkubation eine Konidienkeimung von über 40 % und nach 4 Stunden die Bildung von Appressoren in etwa 20 % der Fälle. Das Virulenz-assoziierte CAP20-Gen von C. gloeosporioides wies nach 3,5 Stunden Inkubation in Avocado-Oberflächenwachs mit hohen CAP20-Proteinkonzentrationen Transkriptionsaktivität in epiphytenbildenden Konidien auf, die nach 4 Stunden und 46 Minuten nachgewiesen wurde. Ebenso wurde die Aktivität von Melanin-Biosynthesegenen in C. trifolii während einer 2-stündigen Inkubation induziert, gefolgt von der Bildung eines Appressoriums nach 1 Stunde. Untersuchungen an Blattgewebe haben gezeigt, dass Erdbeeren nach der Infektion mit C. acutatum eine erste Suppression nach 8 Stunden aufweisen, während Tomaten nach der Infektion mit C. coccodes bereits nach 4 Stunden eine erste Suppression zeigen^48,49. Dies stimmt weitgehend mit dem zeitlichen Verlauf des Infektionsprozesses von Colletotrichum spp. überein. Schnelle Abwehrreaktionen auf 83A:476 deuten auf die Beteiligung von Pflanzenresistenz- und Effektor-getriggerten Immunitätsgenen (ETI) in dieser Linie hin, während Mandelups verzögerte Reaktionen die Hypothese der durch mikroassoziierte molekulare Muster ausgelösten Immunität (MTI) stützen⁵⁰. Frühe Reaktionen auf 83A:476 und Mandelup. Die teilweise Überlappung zwischen hoch- oder herunterregulierten Genen in der verzögerten Reaktion unterstützt dieses Konzept ebenfalls, da ETI häufig als beschleunigte und verstärkte MTI-Reaktion betrachtet wird, die im programmierten Zelltod am Infektionsort, dem sogenannten anaphylaktischen Schock, gipfelt^51,52.
Die meisten Gene, die dem überrepräsentierten Gen-Ontologie-Term GO:0006952 „Abwehrreaktion“ zugeordnet sind, sind die elf Homologen des stressinduzierten Fasten-mRNA-Proteins 22 (ähnlich SAM22) und die sieben wichtigsten Latexprotein-ähnlichen Proteine ​​(MLPs). Die Proteine ​​31, 34, 43 und 423 zeigten Sequenzähnlichkeit. SAM22-ähnliche Gene wiesen eine signifikante und länger anhaltende Aktivierung auf, die zu einer erhöhten Anthraknose-Resistenz führte (83A:476 und Boregine). MLP-ähnliche Gene hingegen waren nur in Linien mit dem Kandidaten-Resistenzallel herunterreguliert (83A:476/Lanr1 nach 6 Stunden und Mandelup/AnMan nach 24 Stunden). Es ist anzumerken, dass alle identifizierten SAM22-ähnlichen Homologen aus einem Gencluster von etwa 105 kb stammen, während die MLP-ähnlichen Gene aus separaten Genombereichen hervorgehen. Eine koordinierte Aktivierung solcher SAM22-ähnlicher Gene wurde auch in unserer früheren Studie zur NLL-Resistenz gegenüber Diaporthetoxica-Infektionen festgestellt, was darauf hindeutet, dass sie an den horizontalen Komponenten der Abwehrreaktion beteiligt sind. Diese Schlussfolgerung wird zudem durch Berichte über eine positive Reaktion von SAM22-ähnlichen Genen auf Verletzungen oder Behandlungen mit Salicylsäure, Pilzinduktoren oder Wasserstoffperoxid gestützt.
Es wurde gezeigt, dass MLP-ähnliche Gene auf verschiedene abiotische und biotische Stressfaktoren reagieren, darunter bakterielle, virale und pathogene Pilzinfektionen in vielen Pflanzenarten⁵⁵. Die Reaktionen auf bestimmte Interaktionen zwischen Pflanzen und Pathogenen reichten von einer starken Steigerung (z. B. bei Befall von Baumwolle mit Verticillium dahliae) bis zu einer signifikanten Abschwächung (z. B. nach Infektion von Apfelbäumen mit Alternaria spp.)^56,57. Eine signifikante Herunterregulierung des MLP-ähnlichen Gens 423 wurde bei der Abwehr von Avocados gegen Fusarium niger und bei der Infektion von Apfelbäumen mit Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola und Alternaria alternata beobachtet. Apfelpathotypen sind 58,59. Darüber hinaus wiesen Apfelkallusgewebe, das das MLP-ähnliche Gen 423 überexprimierte, eine geringere Expression von Resistenzgenen auf und waren anfälliger für Pilzinfektionen⁵⁹. Nach der Infektion mit Fusarium oxysporum f wurde auch das MLP-ähnliche Gen 423 in resistentem Bohnenkeimplasma unterdrückt. cn. Bohneninfektion 60.
Weitere Mitglieder der PR-10-Familie, die in unserer RNA-Seq-Studie identifiziert wurden, waren die Gene LlR18A und LlR18B, die als Reaktion auf eine Hochregulation exprimiert wurden, sowie das für das Lipidtransferprotein DIR1 hochregulierte (1 Gen) bzw. herunterregulierte (3 Gene). Darüber hinaus hebt WGCNA das Gen LlR18B als zentralen Knotenpunkt dieses Moduls hervor, das stark auf Impfungen anspricht und mehrere schützende Immunantwortgene trägt. Die Gene LlR18A und LlR18B wurden in Gelblupinenblättern als Reaktion auf pathogene Bakterien sowie in NLL-Stängeln nach Infektion mit D. toxica induziert. Das Reishomolog dieser Gene, RSOsPR10, wurde hingegen durch eine Pilzinfektion, die vermutlich am Jasmonsäure-Signalweg beteiligt ist, rasch induziert^53,61,62. Das Gen DIR1 kodiert für unspezifische Lipidtransportproteine, die für den Beginn der systemischen erworbenen Resistenz (SAR) erforderlich sind. Mit der Entwicklung von Schutzreaktionen wird das DIR1-Protein vom Infektionsherd über das Phloem transportiert, um SAR in entfernten Organen zu induzieren. Interessanterweise wurde das DIR1-Gen TanjilG_02313 in den Linien 84A:476 und der Population 22660 zum ersten Messzeitpunkt signifikant induziert, jedoch entwickelte sich die Anthraknose-Resistenz nur in der Linie 84A:476 erfolgreich. Dies könnte auf eine Subfunktionalisierung des DIR1-Gens in NLL hindeuten, da die verbleibenden drei Homologen nur in der Linie 83A:476 nach 6 Stunden auf die Inokulation reagierten und diese Reaktion nach unten gerichtet war.
In unserer Studie waren die häufigsten Komponenten des biologischen Prozesses „GO:0055114 Redoxprozess“ Cytochrom-P450-Protein, Peroxidase, Linolsäure-9S-/13S-Lipoxygenase und 1-Aminocyclopropan-1-carbonsäure-Oxidase. Darüber hinaus identifizierte unsere WGCNA das HSFA4a-Homolog als zentralen Knotenpunkt, der Module wie das Lanr1-Resistenzgenkandidat TanjilG_05042 trägt. HSFA4a ist an der redoxabhängigen Regulation der nukleären Transkription in Pflanzen beteiligt.
Cytochrom-P450-Proteine ​​sind Oxidoreduktasen, die NADPH- und/oder O₂-abhängige Hydroxylierungsreaktionen im Primär- und Sekundärstoffwechsel katalysieren. Dazu gehören der Metabolismus von Xenobiotika sowie von Hormonen, Fettsäuren, Sterolen, Zellwandbestandteilen, Biopolymeren und die Biosynthese von Schutzstoffen (69). In einer Studie wurde die Variabilität der Cytochrom-P450-Funktion in Pflanzen aufgrund einer großen Anzahl veränderter Homologe (37) und unterschiedlicher Reaktionsmuster zwischen spezifischen Genen von -10,6 log₂ (Veränderungsfaktor) auf 5,7 reduziert, was einer Aufwärtskorrektur entspricht. Die alleinige Verwendung von RNA-Seq-Daten zur Aufklärung der mutmaßlichen biologischen Funktion der NLL-Gene in einer so großen Proteinfamilie wäre höchst spekulativ. Es ist jedoch erwähnenswert, dass einige Cytochrom-P450-Gene mit einer erhöhten Resistenz gegenüber pathogenen Pilzen oder Bakterien assoziiert sind und unter anderem zu allergischen Reaktionen beitragen (69,70,71).
Peroxidasen der Klasse III sind multifunktionelle Pflanzenenzyme, die an einer Vielzahl von Stoffwechselprozessen während des Pflanzenwachstums und der -entwicklung sowie an der Reaktion auf Umweltstress wie Salinität, Trockenheit, hohe Lichtintensität und Pathogenbefall beteiligt sind⁷². Peroxidasen spielen eine Rolle bei der Interaktion verschiedener Pflanzenarten mit Anthracis, darunter Stylosanthes humilis und C. gloeosporioides, Lens culinaris und C. truncatum, Phaseolus vulgaris und C. lindemuthianum sowie Cucumis sativus und C. lagenarium^73,74,75,76. Die Reaktion erfolgt sehr schnell, manchmal sogar schon 4 Stunden nach der Infektion (HPI), bevor der Pilz in das Pflanzengewebe eindringt⁷³. Das Peroxidase-Gen reagierte auch auf die Inokulation mit D. toxica NLL. Zusätzlich zu ihren typischen Funktionen der Regulation des oxidativen Ausbruchs oder der Beseitigung von oxidativem Stress können Peroxidasen das Pathogenwachstum hemmen, indem sie physikalische Barrieren durch Zellwandverstärkung während der Lignifizierung, Untereinheitenbildung oder Vernetzung spezifischer Verbindungen schaffen. Diese Funktion lässt sich in silico dem Gen TanjilG_03329 zuschreiben, das für eine mutmaßliche ligninbildende Anionenperoxidase kodiert. Dieses Gen war in unserer Studie in der resistenten Linie 83A:476 sechs Stunden nach der Infektion signifikant hochreguliert, nicht jedoch in anderen Stämmen und zu anderen Zeitpunkten, die keine Reaktion zeigten.
Die 9S-/13S-Lipoxygenase der Linolsäure ist der erste Schritt im oxidativen Stoffwechselweg der Lipidbiosynthese⁷⁸. Die Produkte dieses Stoffwechselwegs erfüllen vielfältige Funktionen in der Pflanzenabwehr, darunter die Stärkung der Zellwand durch die Bildung von Callose- und Pektinablagerungen sowie die Regulation von oxidativem Stress durch die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies^{79,80,81,82,83}. In der vorliegenden Studie war die Expression der Linolsäure-9S-/13S-Lipoxygenase in allen Stämmen verändert. In der anfälligen Population 22660 überwog jedoch zu verschiedenen Zeitpunkten eine Hochregulation, während sie in Stämmen mit dem resistenten Lanr1-Allel und dem AnMan-Allel die Diversifizierung der Oxylipinschicht in den Schutzreaktionen gegen Anthrax zwischen diesen Genotypen unterstreicht.
Das Homolog der 1-Aminocyclopropan-1-carboxylat-Oxidase (ACO) wurde nach Inokulation mit Lupin signifikant hochreguliert (9 Gene) bzw. herunterreguliert (2 Gene). Mit zwei Ausnahmen traten alle diese Reaktionen 6 Stunden nach der Inokulation (hp) auf. Die durch ACO-Proteine ​​vermittelte enzymatische Reaktion ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Ethylenproduktion und wird daher streng reguliert.⁸⁴ Ethylen ist ein Pflanzenhormon, das vielfältige Funktionen bei der Regulation der Pflanzenentwicklung und der Reaktion auf abiotische und biotische Stressbedingungen erfüllt. Die Induktion der ACO-Transkription und die Aktivierung des Ethylen-Signalwegs tragen zur Erhöhung der Resistenz von Reis gegenüber dem hemibiotrophen Pilz Oryzae oryzae bei, indem sie die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies und Phytoalexine regulieren. Ein sehr ähnlicher Blattinfektionsprozess, der zwischen M. oryzae und C. lupini88,89 gefunden wurde, vor dem Hintergrund einer signifikanten Hochregulierung von ACO-Homologen in der in dieser Studie beschriebenen Linie 83A:476, verschiebt die Möglichkeit, Resistenz gegen NLL-Anthraknose zu verleihen. Ethylen ist ein zentraler Signalwegschritt in molekularen Signalwegen.
In der vorliegenden Studie wurde 6 Stunden nach der Infektion (hpi) in 83A:476 und 48 hpi in Mandeloop und der Population 22660 eine umfassende Unterdrückung zahlreicher mit der Photosynthese assoziierter Gene beobachtet. Ausmaß und Verlauf dieser Veränderungen korrelieren mit dem Infektionsniveau. In diesem Experiment wurde Anthraknoseresistenz festgestellt. Kürzlich wurde eine starke und frühe Repression von Transkripten, die mit der Photosynthese in Zusammenhang stehen, in verschiedenen Modellen von Pflanzen-Pathogen-Interaktionen, einschließlich pathogener Bakterien und Pilze, beschrieben. Eine rasche (in einigen Fällen ab 2 hpi) und globale Unterdrückung von mit der Photosynthese assoziierten Genen als Reaktion auf eine Infektion kann die Pflanzenimmunität auslösen. Diese beruht auf der Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies und deren Interaktion mit dem Salicylsäure-Signalweg, wodurch allergische Reaktionen vermittelt werden (90, 94).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die für die resistenteste Linie (83A:476) vorgeschlagenen Abwehrmechanismen die schnelle Pathogenerkennung durch das R-Gen (vermutlich TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) und die allergische Reaktion-vermittelte Signalübertragung von Salicylsäure und Ethylen umfassen, gefolgt von der Etablierung einer systemisch erworbenen Resistenz (SAR) über größere Entfernungen. Diese Wirkung wird durch das DIR-1-Protein unterstützt. Es ist anzumerken, dass die biotrophe Phase einer C. lupini-Infektion sehr kurz ist (etwa 2 Tage) und von nekrotischem Wachstum gefolgt wird. Der Übergang zwischen diesen Stadien könnte mit Nekrose und der Expression von Ethylen-induzierbaren Proteinen einhergehen, die als Auslöser für Überempfindlichkeitsreaktionen in Wirtspflanzen wirken. Daher ist das Zeitfenster für einen erfolgreichen Nachweis von C. lupini im biotrophen Stadium sehr kurz. Die in 83A:476 sechs Stunden nach der Infektion beobachtete Umprogrammierung von Genen, die mit Redoxreaktionen und Photosynthese assoziiert sind, korreliert mit dem Fortschreiten der Pilzhyphen und deutet auf die Entwicklung einer erfolgreichen Schutzreaktion im biotrophen Stadium hin. Die transkriptomischen Reaktionen von Mandelup und der Population 22660 könnten zu verzögert sein, um den Pilz vor dem Übergang zum nekrotischen Wachstum zu erfassen. Mandelup könnte jedoch effektiver sein als die Population 22660, da die relativ schnelle Regulation des PR-10-Proteins die horizontale Resistenz fördert.
ETI, gesteuert durch das kanonische R-Gen, scheint ein häufiger Mechanismus für die Anthraknoseresistenz bei Bohnen zu sein. So wird in der Modellleguminose Medicago truncatula die Anthraknoseresistenz durch das Gen RCT1 vermittelt, ein Mitglied der pflanzlichen R-Genklasse TIR-NBS-LRR97. Dieses Gen verleiht auch Luzerne eine Breitbandresistenz gegen Anthraknose, wenn es auf anfällige Pflanzen übertragen wird. In der Gartenbohne (P. vulgaris) wurden bisher mehr als zwei Dutzend Anthraknoseresistenzgene identifiziert. Einige dieser Gene befinden sich in Regionen ohne kanonische R-Gene, viele andere jedoch an den Rändern von Chromosomen, die den NBS-LRR-Gencluster, einschließlich TIR-NBS-LRRs99, tragen. Die genomweite SSR-Studie bestätigte ebenfalls den Zusammenhang des NBS-LRR-Gens mit der Anthraknoseresistenz in der Gartenbohne. Das kanonische R-Gen wurde auch in der genomischen Region gefunden, die den wichtigsten Anthraknose-Resistenzlocus in der weißen Lupine 101 trägt.
Unsere Arbeit zeigt, dass eine sofortige Resistenzreaktion, die in einem frühen Stadium der Pflanzeninfektion (vorzugsweise spätestens 12 Stunden nach Infektion) aktiviert wird, die Schmalblättrige Lupine (Lupine spp.) wirksam vor der durch den pathogenen Pilz Collelotrichum lupini verursachten Anthraknose schützt. Mithilfe von Hochdurchsatzsequenzierung konnten wir differentielle Expressionsprofile von Anthraknose-Resistenzgenen in Schmalblättrigen Lupinen nachweisen, die durch die Resistenzgene Lanr1 und AnMan vermittelt werden. Eine erfolgreiche Abwehr erfordert die sorgfältige Gestaltung der Gene für Proteine, die an Redoxprozessen, Photosynthese und Pathogenese beteiligt sind, innerhalb weniger Stunden nach dem ersten Kontakt der Pflanze mit einem Pathogen. Ähnliche Schutzreaktionen, die jedoch zeitlich verzögert auftreten, sind deutlich weniger wirksam. Die durch das Lanr1-Gen vermittelte Anthrax-Resistenz ähnelt der typischen schnellen Reaktion des R-Gens (Effektor-induzierte Immunität), während das AnMan-Gen höchstwahrscheinlich eine horizontale Immunantwort (durch ein mikrobielles Muster ausgelöste Immunität) vermittelt und somit eine moderate Nachhaltigkeit gewährleistet.
Die 215 NLL-Linien, die für das Screening auf Anthraknose-Marker verwendet wurden, umfassten 74 Sorten, 60 durch Kreuzung oder Züchtung entstandene Linien, 5 Mutanten und 76 Wild- oder Originalgenotypen. Die Linien stammten aus 17 Ländern, hauptsächlich aus Polen (58), Spanien (47), Deutschland (27), Australien (26), Russland (19), Belarus (7), Italien (5) und weiteren 10 Ländern. Der Satz enthielt auch die resistenten Referenzlinien 83A:476, Tanjil, Wonga mit dem Lanr1-Allel und Mandelup mit dem AnMan-Allel. Die Linien wurden der Europäischen Lupinen-Genressourcendatenbank der Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polen, entnommen (Ergänzungstabelle S1).
Die Pflanzen wurden unter kontrollierten Bedingungen kultiviert (Photoperiode 16 Stunden, Temperatur 25 °C tagsüber und 18 °C nachts). Zwei biologische Replikate wurden analysiert. Die DNA wurde aus drei Wochen alten Blättern mit dem DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß Protokoll isoliert. Qualität und Konzentration der isolierten DNA wurden spektrophotometrisch bestimmt (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Der Marker AnManM1, der das Anthraknose-Resistenzgen AnMan (aus der Sorte Mandelup) markiert, sowie die Marker Anseq3 und Anseq4, die das Gen Lanr1 (aus der Sorte Tanjil) flankieren, wurden analysiert^11,26,28. Homozygote für das resistente Allel wurden mit „1“, anfällige mit „0“ und heterozygote mit 0,5 bewertet.
Basierend auf den Ergebnissen des Screenings der Marker AnManM1, AnSeq3 und AnSeq4 sowie der Verfügbarkeit von Saatgut für abschließende Folgeexperimente wurden 50 NLL-Linien für die Phänotypisierung der Anthraknoseresistenz ausgewählt. Die Analyse wurde in doppelter Ausführung in einem computergesteuerten Gewächshaus mit einer 14-stündigen Photoperiode und einer Temperaturspanne von 22 °C tagsüber und 19 °C nachts durchgeführt. Vor der Aussaat wurden die Samen angeritzt (die Samenschale wurde auf der dem Embryo gegenüberliegenden Seite mit einer scharfen Klinge abgetrennt), um die Keimruhe aufgrund einer zu harten Samenschale zu verhindern und eine gleichmäßige Keimung zu gewährleisten. Die Pflanzen wurden in Töpfen (11 × 11 × 21 cm) mit steriler Erde (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warschau, Polen) angezogen. Die Inokulation erfolgte mit dem Stamm Colletotrichum lupini Col-08, der 1999 aus den Stängeln von Schmalblättrigen Lupinenpflanzen isoliert wurde. Diese Pflanzen wuchsen auf einem Feld in Verzhenitsa, Großpolen (52° 27′ 42″ N, 17° 04′ 05″ O). Die Isolate wurden 21 Tage lang in SNA-Medium bei 20 °C unter Schwarzlicht kultiviert, um die Sporulation anzuregen. Vier Wochen nach der Aussaat, als die Pflanzen das 4- bis 6-Blatt-Stadium erreicht hatten, erfolgte die Inokulation durch Besprühen mit einer Konidiensuspension (0,5 × 10⁶ Konidien/ml). Anschließend wurden die Pflanzen 24 Stunden lang im Dunkeln bei einer Luftfeuchtigkeit von ca. 98 % und einer Temperatur von 25 °C gehalten, um die Keimung der Konidien und den Infektionsprozess zu fördern. Die Pflanzen wurden anschließend unter einer 14-stündigen Photoperiode bei 22 °C (Tag) / 19 °C (Nacht) und 70 % Luftfeuchtigkeit kultiviert. Der Krankheitsbefall wurde 22 Tage nach der Inokulation bewertet und reichte von 0 (immun) bis 9 (sehr anfällig), abhängig vom Vorhandensein oder Fehlen nekrotischer Läsionen an Stängeln und Blättern. Zusätzlich wurde nach der Bewertung das Gewicht der Pflanzen gemessen. Die Beziehungen zwischen Markergenotypen und Krankheitsphänotypen wurden als Zwei-Sequenz-Korrelationen berechnet (Fehlen heterozygoter Marker in den Linien zur Analyse des Anthraknose-Resistenzphänotyps).