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U lupinu Angustifolius (NLL, Lupinus angustifolius L.) hè una pianta leguminosa aduprata per a pruduzzione alimentaria è u migliuramentu di u terrenu. L'espansione glubale di NLL cum'è cultura hà attrattu parechji funghi patogeni, cumprese l'antracnosi di lupinu, chì provoca a devastante malattia di l'antracnosi. Dui alleli, Lanr1 è AnMan, chì cunferiscenu una resistenza aumentata, sò stati aduprati in a ripruduzzione di NLL, ma i meccanismi moleculari sottostanti restanu scunnisciuti. In questu studiu, i marcatori Lanr1 è AnMan sò stati aduprati per screening di campioni europei di NLL. I testi di u vaccinu in un ambiente cuntrullatu anu cunfirmatu l'efficacia di i dui donatori resistenti. A prufilatura di l'espressione genica differenziale hè stata realizata nantu à linee resistenti è suscettibili rappresentative. A resistenza à l'antracnosi hè stata assuciata à a sovraespressione di i termini ontologichi di u gene "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process" è "GO:0015979 Photosynthesis". Inoltre, a linea Lanr1(83A:476) hà mostratu una riprogrammazione trascrittomica significativa rapidamente dopu l'inoculazione, mentre chì l'altre linee anu mostratu un ritardu in questa risposta di circa 42 ore. E risposte di difesa sò assuciate à i geni TIR-NBS, CC-NBS-LRR è NBS-LRR, 10 proteine ​​implicate in a patogenesi, proteine ​​di trasferimentu di lipidi, endoglucan-1,3-β-glucosidasi, proteine ​​di a parete cellulare ricche di glicina è geni da a via reattiva di l'ossigenu. E prime risposte à 83A:476, cumprese una attenta soppressione di i geni assuciati à a fotosintesi, anu cuincisu cù una prutezzione riescita durante a fase di crescita vegetativa di a biologia fungina, ciò chì suggerisce chì un effettore attiva l'immunità. A reazione di Mandeloop hè rallentata, cum'è a resistenza orizzontale generale.
U lupinu à foglie strette (NLL, Lupinus angustifolius L.) hè un cereale riccu in proteine ​​originariu di a regione di u Mediterraniu occidentale1,2. Attualmente hè cultivatu cum'è cultura alimentaria per l'animali è l'omu. Hè ancu cunsideratu letame verde in i sistemi di rotazione di e culture per via di a fissazione di l'azotu da i batteri simbiotici chì fissanu l'azotu è u miglioramentu generale di a struttura di u terrenu. NLL hà subitu un rapidu prucessu di domesticazione in l'ultimu seculu è hè sempre sottumessu à una forte pressione di ripruduzzione3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Cù a cultura diffusa di NLL, a successione di funghi patogeni hà sviluppatu nuove nicchie agricule è hà causatu nuove malatie chì distruggenu e culture. U più rimarchevule per i cultivatori è i criatori di lupini hè stata l'apparizione di l'antracnosi, causata da u fungu patogenu, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. U più rimarchevule per i cultivatori è i criatori di lupini hè stata l'apparizione di l'antracnosi, causata da u fungu patogenu, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза антракноза, патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. A cosa più rimarchevule per i cultivatori è i criatori di lupini hè stata l'emergenza di l'antracnosi causata da u fungu patogenu Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是现，它是现，它是由眗腏Collehum Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是现，它是玟眗Colletohum (Bondar)嵵Haired。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза,вакнозоза патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Ciò chì hè più impressiunante per i cultivatori è i criatori di lupini hè l'emergenza di l'antracnosi causata da u fungu patogenu Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.I primi rapporti di a malatia sò ghjunti da u Brasile è da i Stati Uniti, cù sintomi tipici chì sò apparsi rispettivamente in u 1912 è in u 1929. Tuttavia, dopu à circa 30 anni, l'agente patogenu hè statu designatu cum'è Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorfa Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfa Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfu di Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in Morfologia Mirata. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .è H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。è H. Schlenk,.A fenotipizzazione preliminare di a malatia fatta à a mità di u XXu seculu hà mostratu una certa resistenza in l'accessioni NLL è di lupinu giallu (L. luteus L.), ma tutte l'accessioni di lupinu biancu (L. albus L.) testate eranu assai suscettibili15,16. Studi anu dimustratu chì u sviluppu di l'antracnosi hè assuciatu à un aumentu di e precipitazioni (umidità di l'aria) è di a temperatura (in l'intervallu di 12-28 ° C), purtendu à una viulazione di a resistenza à temperature più elevate17, 18. In fatti, u tempu necessariu per chì e conidie germininu è a malatia cuminci, era quattru volte più cortu à 24 ° C (4 ore) chè à 12 ° C (16 ore) in cundizioni di alta umidità19. Cusì, u riscaldamentu climaticu in corsu hà purtatu à a diffusione di l'antracnosi. Tuttavia, a malatia hè stata osservata in Francia (1982) è Ucraina (1983) cum'è un presagiu di una minaccia imminente, ma hè stata apparentemente ignorata da l'industria di i lupini à l'epica20,21. Qualchi anni dopu, sta malatia devastante s'hè sparsa in u mondu sanu è hà ancu affettatu i principali paesi pruduttori di lupini cum'è l'Australia, a Pulonia è a Germania22,23,24. Dopu à un focu d'antracnosi à a mità di l'anni 1990, un screening estensivu hà purtatu à l'identificazione di parechji donatori resistenti in i campioni NLL19. A resistenza NLL à l'antracnosi hè cuntrullata da dui alleli dominanti separati truvati in diverse fonti di germoplasma: Lanr1 in a cultivar Tanjil è Wonga è AnMan in a cultivar Mandalay 25, 26. Quessi alleli cumplementanu i marcatori moleculari chì sustenenu a selezzione di germoplasma resistente in i prugrammi di ripruduzzione25,26,27,28,29,30. A linea di ripruduzzione resistente 83A:476 chì porta l'allele Lanr1 hè stata incruciata cù a linea salvatica suscettibile P27255 per ottene una pupulazione RIL chì si segrega per a resistenza à l'antracnosi, ciò chì hà permessu di assignà u locus Lanr1 à u cromusomu NLL-1131, 32, 33. Allineamentu di i marcatori di a mappa di ligamentu da i loci di resistenza fiancheggianti à l'antracnosi cù un quadru genomicu, NLL hà rivelatu a situazione di tutti i trè alleli nantu à u listessu cromusomu (NLL-11), ma in pusizioni diverse29,34,35. Tuttavia, per via di u picculu numeru di RIL è di a grande distanza genetica trà i marcatori è l'alleli currispondenti, ùn si ponu trarre cunclusioni affidabili nantu à i so geni sottostanti. D’altronde, l’usu di a genetica inversa in i lupini hè difficiule per via di u so putenziale di rigenerazione assai bassu, ciò chì rende a manipulazione genetica ingombrante37.
U sviluppu di germoplasma domesticatu chì porta l'allele desideratu in u statu omozigotu, cum'è 83A:476 (Lanr1) è Mandelup (AnMan), hà apertu a porta à u studiu di a resistenza à l'antracnosi di fronte à a presenza di cumminazzioni opposte di alleli in pupulazioni salvatiche. Pussibilità di meccanismi moleculari. Paragunate e risposte di difesa generate da genotipi specifici. Stu studiu hà valutatu a risposta precoce di u trascrittoma di NLL à a vaccinazione C. lupini. Prima, un pannellu europeu di germoplasma NLL chì cuntene 215 linee hè statu screening utilizendu marcatori moleculari chì marcanu l'alleli Lanr1 è AnMan. A fenotipizzazione di l'antracnosi hè stata poi realizata nantu à 50 linee NLL, precedentemente selezziunate per marcatori moleculari, in cundizioni cuntrullate. Basatu annantu à questi esperimenti, quattru linee chì differiscenu in a resistenza à l'antracnosi è a cumpusizione allelica Lanr1/AnMan sò state selezziunate per a prufilazione di l'espressione genica di difesa differenziale utilizendu dui approcci cumplementari: sequenziamentu di RNA à altu rendimentu è quantificazione PCR in tempu reale.
U screening di un inseme di germoplasma NLL (N = 215) cù marcatori Lanr1 (Anseq3 è Anseq4) è AnMan (Anseq4) è AnMan (AnManM1) hà dimustratu chì solu una linea (95726, vicinu à Salamanca-b) amplifica l'allele di "resistenza" per tutti i marcatori, mentre chì "Presenza di alleli 'suscettibili'" hà trovu a proporzione di tutti i marcatori in 158 (~73,5%) linee. Tredeci linee anu pruduttu dui alleli "resistenti" di u marcatore Lanr1, è 8 linee anu pruduttu alleli "resistenti" di u marcatore Lanr1. L'allele di "resistenza" di u marcatore AnMan (Tabella Supplementare S1). Dui linee eranu eterozigote per u marcatore Anseq3 è una eterozigota per u marcatore AnManM1. 42 linee (19,5%) purtavanu fasi opposte di l'alleli Anseq3 è Anseq4, chì indicanu una alta frequenza di ricombinazione trà questi dui loci. I fenotipi di l'antracnosi in cundizioni cuntrullate (Tabella Supplementare S2) anu rivelatu variabilità in a resistenza di i genotipi testati, chì si hè riflessa in a gravità di l'antracnosi. E differenze in i punteggi medi variavanu da 1,8 (moderatamente resistente) à 6,9 (suscettibile) è e differenze di pesu di e piante variavanu da 0,62 (suscettibile) à 4,45 g (resistente). Ci era una currelazione significativa trà i valori osservati in duie replicazioni di l'esperimentu (0,51 per i punteggi di gravità di a malatia, P = 0,00017 è 0,61 per u pesu di a pianta, P < 0,0001) è ancu trà questi dui parametri (− 0,59 è − 0,77, P < 0,0001). Ci era una currelazione significativa trà i valori osservati in duie repliche di l'esperimentu (0,51 per i punteggi di gravità di a malatia, P = 0,00017 è 0,61 per u pesu di a pianta, P < 0,0001) è ancu trà questi dui parametri (− 0,59 è − 0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция э0,стентера э0,стемыми баллов тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между эвтимимт эвтами (-0,59 è -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Una currelazione significativa hè stata trovata trà i valori osservati in duie ripetizioni di l'esperimentu (0,51 per i punteggi di gravità di a malatia, P = 0,00017 è 0,61 per u pesu di a pianta, P < 0,0001), è ancu trà questi dui parametri (- 0,59 è -0,77, P < 0,0001) 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分1︺0. 0.00017，植物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P < 0.0001)在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 诸 庈 诸分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之（ 参数 之（ （ 9. 0,59 和– 0,59 和– 0,59 和- 0,77，P <0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух потццонка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двуми двуме пара,5ми -0,0001) 0,77, P <0,0001. Ci era una currelazione significativa trà i valori osservati in duplicatu (puntu di gravità di a malatia 0,51, P = 0,00017 è pesu di a pianta 0,61, P < 0,0001) è trà questi dui parametri (-0,59 è -0,0001) 0,77, P < 0,0001. ).I sintomi tipici osservati in e piante suscettibili includenu piegature è torsioni di u fustu chì s'assumiglia à una struttura à "arcu di pastore", seguitate da lesioni ovali cù sporozoiti aranciu/rosa (Figura supplementare 1). L'accessioni australiane chì portanu i geni Lanr1 (83A:476 è Tanjil) è AnMan (Mandelup) sò moderatamente resistenti, 0,0331 è 0,0036). Alcune linee chì portanu ancu alleli Lanr1 è/o AnMan "resistenti" mostranu sintomi di a malattia.
Curiosamente, alcune linee NLL chì ùn anu micca allele marcatore "resistente" anu rivelatu un altu livellu di resistenza à l'antracnosi (paragunabile o più altu chè per i genotipi Lanr1 o AnMan), cum'è Boregine (valore P < 0,0001 per i dui parametri), Bojar (valore P < 0,0001 per u puntu è 0,001 per u pesu di a pianta) è a Pupulazione B-549/79b (valore P < 0,0001 per u puntu è micca significativu per u pesu). Curiosamente, alcune linee NLL chì ùn anu micca allele marcatore "resistente" anu rivelatu un altu livellu di resistenza à l'antracnosi (paragunabile o più altu chè per i genotipi Lanr1 o AnMan), cum'è Boregine (valore P < 0,0001 per i dui parametri), Bojar (valore P < 0,0001 per u puntu è 0,001 per u pesu di a pianta) è a Pupulazione B-549/79b (valore P < 0,0001 per u puntu è micca significativu per u pesu). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллокавы аллокавы залокавы, уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 илаки или более высокий, чем для генотипов Lanr1), илаи An Bokи (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Curiosamente, parechje linee NLL chì ùn anu micca allele marcatore "resistente" anu mostratu un altu livellu di resistenza à l'antracnosi (paragunabile o più altu chè per i genotipi Lanr1 o AnMan), cum'è Boregine (valore P < 0,0001 per i dui parametri), Bojar (valore P < 0,0001 per a valutazione è 0,001 per u pesu di a pianta) è a pupulazione B-549/79b (valore P < 0,0001 per a valutazione è micca significativu per u pesu).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭水平的炭等位基因的NLL或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重显一量一量 Hè interessante chì certi sistemi NLL chì ùn anu micca marcatori "antigenichi" mostranu una resistenza orizzontale elevata (equivalente à i geni Lanr1 o AnMan o superiore), cum'è Boregine (tramindui i parametri P < 0,0001), Bojar (valore P < 0,0001, pesu di a pianta 0,001) è a ceppa B-549/79b (valore P < 0,0001, pesu micca significativu). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», споких либо уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие какак Boregine выше обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) è популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Curiosamente, alcune linee NLL chì ùn anu micca alleli marcatori di "resistenza" anu mostratu alti livelli di resistenza à l'antracnosi (paragunabili o superiori à i genotipi Lanr1 o AnMan), cum'è Boregine (valore P per i dui parametri <0,0001), Bojar (valore P <0,0001, pesu di a pianta 0,001) è a pupulazione B-549/79b (valore P <0,0001, pesu micca significativu).Stu fenomenu suggerisce a pussibilità di una nova fonte genetica di resistenza, spiegendu a mancanza osservata di currelazione trà i genotipi marcatori è i fenotipi di e malatie (valori P da ~0,42 à ~0,98). Cusì, u test di Kolmogorov-Smirnov hà dimustratu chì i dati nantu à a resistenza à l'antracnosi eranu distribuiti apprussimativamente nurmalmente per i punteggi (valori P 0,25 è 0,11) è a massa vegetale (valori P 0,47 è 0,55), suggerendu chì ipotizzu chì più alleli chè Lanr1 è AnMan sò implicati.
Basatu annantu à i risultati di u screening di a resistenza à l'antracnosi, 4 linee sò state selezziunate per l'analisi di u trascrittoma: 83A:476, Boregine, Mandelup, è Pupulazione 22660. Queste linee sò state testate di novu per a resistenza à l'antrace in esperimenti d'inoculazione per sequenziamentu di l'ARN, à cundizione ch'elle fussinu listesse cum'è in u test precedente. I valori di u puntuatu eranu i seguenti: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) è pupulazione 22660 (6,11 ± 1,29).
U protocolu Illumina NovaSeq 6000 hà ottenutu una media di 40,5 coppie di Mread per campione (da 29,7 à 54,4 Mread) (Tabella Supplementare S3). I punteggi di allineamentu in a sequenza di riferimentu variavanu da 75,5% à 88,6%. A currelazione media di i dati di conteggio di lettura trà varianti sperimentali trà repliche biologiche variava da 0,812 à 0,997 (media 0,959). Di i 35.170 geni analizati, 2917 ùn anu rivelatu alcuna espressione, è l'altri 4785 geni sò stati espressi à un livellu trascurabile (media di basa < 5). Di i 35.170 geni analizati, 2917 ùn anu rivelatu alcuna espressione, è l'altri 4785 geni sò stati espressi à un livellu trascurabile (media di basa < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов сисров экспрессии незначительном уровне (базовое среднее <5). Di i 35.170 geni analizati, 2917 ùn anu mostratu nisuna espressione, è i 4785 geni rimanenti sò stati espressi à un livellu trascurabile (media di basa <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35.170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имелинов имелиссировались экспрессию (базовое среднее значение <5). Di i 35.170 geni analizati, 2917 ùn sò stati espressi è i 4785 geni rimanenti anu avutu una espressione trascurabile (media di basa <5).Cusì, u numeru di geni cunsiderati espressi (media di basa ≥ 5) durante l'esperimentu era 27.468 (78,1%) (Tabella Supplementare S4).
Da u primu puntu di tempu, tutte e linee NLL anu rispostu à l'inoculazione di C. lupini (ceppo Col-08) riprogrammendu u trascrittoma (Tavula 1), ma sò state osservate differenze significative trà e linee. Cusì, a linea di resistenza 83A:476 (chì porta u genu Lanr1) hà mostratu una riprogrammazione significativa di u trascrittoma à u primu puntu di tempu (6 hpi) cù un aumentu di 31-69 volte di u numeru di geni up- è down-isolati paragunatu à altri punti di tempu à questu puntu di tempu. Inoltre, questu piccu hè statu di corta durata, postu chì l'espressione di solu uni pochi di geni hè rimasta significativamente alterata à u secondu puntu di tempu (12 hpi). Hè interessante nutà chì Boregine, chì hà ancu mostratu un altu livellu di resistenza in u test di l'injertu, ùn hà micca subitu una tale riprogrammazione trascrizionale massiccia durante l'esperimentu. Tuttavia, u numeru di geni espressi differenzialmente (DEG) era u listessu per Boregine è 83A:476 à 12 HPI. Sia Mandelup sia a pupulazione 22660 anu mostratu picchi DEG à l'ultimu puntu di tempu (48 l/s), ciò chì indica un ritardu relativu in e risposte di difesa.
Siccomu 83A:476 hà subitu una riprogrammazione massiccia di u trascrittoma in risposta à C. lupini à 6 HPI paragunatu à tutte l'altre linee, ~91% di i DEG osservati à questu puntu in u tempu eranu specifichi di a ligna (Fig. 1). Tuttavia, ci era una certa sovrapposizione in e risposte iniziali trà e linee di studiu, postu chì 68,5%, 50,9% è 52,6% di DEG in Boregine, Mandelup è a pupulazione 22660, rispettivamente, si sovrapponevanu à quelli truvati in 83A:476 in certi punti in u tempu. Tuttavia, questi DEG rapprisentavanu solu una piccula frazione (0,97-1,70%) di tutti i DEG attualmente rilevati cù 83A:476. Inoltre, 11 DEG da tutte e linee eranu coerenti in questu mumentu (Tavule Supplementari S4-S6), cumpresi i cumpunenti cumuni di e risposte di difesa di e piante: proteina di trasferimentu di lipidi (TanjilG_32225), enzima endoglucan-1,3-β-glucoside (TanjilG_23384), duie proteine ​​inducibili da stress cum'è SAM22 (TanjilG_31528 è TanjilG_31531), proteina basica di lattice (TanjilG_32352), è duie proteine ​​strutturali di a parete cellulare ricche di glicina (TanjilG_19701 è TanjilG_19702). Ci era ancu una sovrapposizione relativamente alta in e risposte di u trascrittoma trà 83A:476 è Boregine à 24 HPI (totale 16-38% DEG) è trà Mandelup è a Pupulazione 22660 à 48 HPI (totale 14-20% DEG).
Diagramma di Venn chì mostra u numeru di geni espressi in modu differenziale (DEG) in linee di lupinu à foglie strette (NLL) inoculate cù Colletotrichum lupini (ceppo Col-08 ottenutu da campi di lupini in Wierzhenice, Pulonia, 1999). E linee NLL analizzate eranu: 83A:476 (resistente, chì porta l'allele Lanr1), Boregine (resistente, background geneticu scunnisciutu), Mandelup (moderatamente resistente, chì porta l'allele AnMan) è a pupulazione 22660 (moltu suscettibile). L'abbreviazione hpi significa ore dopu a vaccinazione. I valori zero sò stati eliminati per simplificà u graficu.
L'inseme di geni sovraespressi à 6 hpi hè statu analizatu per a presenza di duminii di geni R canonichi (Tabella Supplementare S7). Questu studiu hà revelatu l'induzione di u trascrittoma di geni classici di resistenza à e malatie cù duminii NBS-LRR solu à 83A:476. Questu inseme era custituitu da un genu TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), cinque geni CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, è tanjilg_16162), è Quattru NBS-LR, Tanjilg_16162), è Quattru NBS-LRRE (tanjilg_16162) è ancu Quattru NBS-Lrr (tanjilg_16162) è Quattru NBS-LRR (TANJILG_16162). Tutti questi geni anu duminii canonichi disposti in sequenze cunservate. In più di i geni di u duminiu NBS-LRR, parechje chinasi RLL sò state attivate à 6 hpi, vale à dì una in Boregine (TanjilG_19877), duie in Mandelup (TanjilG_07141 è TanjilG_19877) è in a pupulazione 22660 (TanjilG_09014 è TanjilG_10361) è duie in 83A 27:476.
I geni cù una espressione significativamente alterata in risposta à l'inoculazione cù C. lupini (ceppo Col-08) sò stati sottumessi à l'analisi di arricchimentu di Gene Ontology (GO) (Tabella Supplementare S8). U termine di prucessu biologicu u più spessu sovrarapprisentatu era "GO:0006952 risposta di difesa" chì hè apparsu in 6 di 16 cumminazzioni (tempu × linea) cù alta significatività (valore P < 0,001) (Fig. 2). U termine di prucessu biologicu u più spessu sovrarapprisentatu era "GO:0006952 risposta di difesa" chì hè apparsu in 6 di 16 cumminazzioni (tempu × linea) cù alta significatività (valore P < 0,001) (Fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952» который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значимостью (значение P) (0.001 P) (0). U termine di prucessu biologicu u più spessu sovrarapprisentatu era "GO:0006952 defense response", chì hè apparsu in 6 di 16 cumminazzioni (tempu × lignaggio) cù alta significatività (valore P < 0,001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 U termine di prucessu biologicu u più rappresentativu hè "GO:0006952 defense response", chì appare in 6 di e 16 cumbinazioni (时间×线), cù una significatività elevata (valore P < 0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response2ры появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис..2). U termine di prucessu biologicu u più spessu sovrarapprisentatu era "GO:0006952 Defense Response", chì hè apparsu in 6 di 16 cumminazzioni (tempu × linea) cù alta significatività (valore P < 0,001) (Fig. 2).Stu termine era sovrarapprisentatu in dui momenti in 83A: 476 è Boregine (6 è 24 hpi) è in un mumentu in Mandelup è a Pupulazione 22660 (12 è 6 hpi, rispettivamente). Questu hè un risultatu previstu, chì mette in risaltu a risposta antifungina di e linee resistenti. Inoltre, 83A:476 hà rispostu à C. lupini inducendu rapidamente geni ligati à u scoppiu ossidativu rapprisintatu da u termine "GO:0055114 prucessu redox", indicendu una risposta di difesa specifica, mentre chì Boregine hà rivelatu risposte di difesa specifiche, ligate à u termine "GO". :0006950 Risposta à u stress". A pupulazione 22660 hà attivatu a risposta di resistenza orizzontale chì implica metaboliti secundarii, mettendu in risaltu u numeru eccessivu di termini "GO:0016104 Prucessu di biosintesi di triterpeni" è "GO:0006722 Prucessu di metabolismu di triterpeni" (tramindui i termini appartenenu à u listessu inseme di geni), tenendu contu di i risultati di l'analisi di arricchimentu di termini GO, a stabilità di a reazione di Mandelup era trà Boregine è a Pupulazione 22660. Inoltre, a reazione precoce 83A:476 (6 hpi) è a reazione ritardata Mandelup è a Pupulazione 22660 includenu u termine GO:0015979 "fotosintesi" è altri prucessi biologichi cunnessi.
I termini ontologichi di i geni di bioprocessu selezziunati in l'annotazione di i geni espressi in modu differenziale durante e risposte di u trascrittoma di u lupinu à foglie strette (NLL) inoculatu cù u lupinu antrace (ceppo Col-08 ottenutu da i campi di lupini in Wierzhenice, Pulonia, in u 1999) sò assai esagerati. E linee NLL analizzate eranu: 83A:476 (resistente, chì porta l'allele omozigotu Lanr1), Boregine (resistente, sfondate geneticu scunnisciutu), Mandelup (moderatamente resistente, chì porta l'allele omozigotu AnMan) è a pupulazione 22660 (suscettibile).
Siccomu stu studiu hà avutu cum'è scopu d'identificà i geni chì cuntribuiscenu à a resistenza à l'antracnosi, i geni assignati à i termini GO "GO: 0006952 Risposte difensive" è "GO: 0055114 Processi redox" sò stati analizati cù limiti di tempu postu chì e medie di basa eranu ≥ 30 cù almenu una linea × puntu in u tempu cumbinendu valori statisticamente significativi di log2 (cambiamentu di piega). U numeru di geni chì rispondevanu à questi criteri era 65 per GO: 0006952 è 524 per GO: 0055114.
83A:476 hà revelatu dui picchi DEG annotati cù u termine GO:0006952, u primu à 6 geni per pollice (64 geni, regulazione in su è in giù) è u secondu à 24 geni per pollice (15 geni, solu regulazione in su). Boregine hà ancu dimustratu chì GO:0006952 hà righjuntu u piccu à u listessu puntu di tempu, ma cù menu DEG (11 è 8) è attivazione preferenziale. Mandeloop hà mostratu dui picchi di GO:0006952 à 12 è 48 HPI, tramindui purtendu 12 geni (u primu cù geni attivanti, è u secondu cù solu geni suppressivi), mentre chì a pupulazione 22660 à 6 HPI (13 geni) avia una più grande predominanza di u piccu di aumentu di regulazione. Ci vole à nutà chì u 96,4% di GO:0006952 DEG in questi picchi avianu u listessu tipu di risposta (in su o in giù), indicendu una sovrapposizione significativa in e risposte di difesa malgradu e differenze in u numeru di geni implicati. U più grande gruppu di sequenze ligate à u termine GO:0006952 codifica a Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-like), chì appartene à u clade di proteine ​​di a classa 10 di a proteina assuciata à a patogenesi (PR-10) è a proteina core latex. proteina simile (MLP-like) (Fig. 3). I dui gruppi differianu in a natura di l'espressione è in a direzzione di a risposta. I geni chì codificanu e proteine ​​SAM22-like anu mostratu una induzione consistente è significativa à i primi punti di tempu (6 o 12 hpi) è eranu generalmente insensibili à a fine di l'esperimentu (48 hpi), mentre chì e proteine ​​MLP-like anu mostratu coordinazione à 6 hpi. hpi. 83A:476 è Mandelup à 48 hp/in, quasi tutti l'altri punti di dati eranu insensibili. Inoltre, e differenze in i profili d'espressione di i geni di e proteine ​​SAM22-like anu seguitu a variabilità osservata in a resistenza à l'antracnosi, postu chì e linee più resistenti avianu più punti di tempu chì inducevanu significativamente questi geni chè i geni più suscettibili. Un altru genu PR-10 di tipu LlR18A/B hà mostratu un mudellu d'espressione assai simile à u genu di a proteina di tipu SAM22.
I cumpunenti principali di u termine di u prucessu biologicu "GO:0006952 Defense Response" è i mudelli d'espressione di i geni candidati di l'alleli Lanr1 è AnMan sò stati identificati. A scala Log2 rapprisenta i valori log2 (cambiamentu di piega) trà e piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenutu da campi di lupini, Wizhenica, Pulonia, 1999) è e piante di cuntrollu (inoculate in modu simulatu) à u listessu tempu. E seguenti linee di lupini à foglie strette sò state analizate: 83A:476 (resistente, chì porta l'allele Lanr1 omozigotu), Boregine (resistente, background geneticu scunnisciutu), Mandelup (moderatamente resistente, chì porta l'allele AnMan omozigotu) è a Pupulazione 22660 (suscettibile).
Inoltre, i profili d'espressione di i geni candidati RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) è AnMan (TanjilG_12861) sò stati valutati (Fig. 3). U genu TanjilG_05042 hà mostratu una risposta significativa (attivazione) à 83A:476 solu à u primu puntu di tempu (6 hpi), mentre chì TanjilG_12861 era significativu in Mandeloop solu à dui punti di tempu: 6 hpi (regulazione in calata) è 24 hpi (6 hpi). Cù.). regulabile)).
I geni i più sovraespressi in u termine GO:0055114 "prucessu redox" eranu geni chì codificanu e proteine ​​di u citocromu P450 è a perossidasi (Fig. 4). Per i campioni isolati da 83A:476 à 6 HPI, i valori massimi o minimi di log2 (cambiamentu di piega) (per l'86,6% di i geni) sò stati generalmente osservati trà e piante inoculate è quelle di cuntrollu, mettendu in risaltu l'alta risposta di questu genotipu à l'inoculazione di u sessu. 83A:476 hà mostratu u GO:0055114 DEG più significativu à 6 hpi (503 geni), mentre chì u restu di e linee à 48 hpi (Boregine, 31 geni; Mandelup, 85 geni; è Pupulazione 22660, 78 geni)). In a maiò parte di i geni di a famiglia GO:0055114, sò stati osservati dui tipi di risposte à a vaccinazione (attivazione è inibizione). Curiosamente, finu à u 97,6% di i DEG identificati per u termine GO: 0055114 in Mandelupe à 48 hp. Queste osservazioni suggerenu chì, malgradu a scala significativamente più chjuca (vale à dì, u numeru di geni redox mutati, 85 versus 503), u mudellu di risposte ritardate di u trascrittoma di mandeloup à l'antracnosi hè simile à a risposta precoce di 83A: 476. In Boregine è Population 22660, sta cunvergenza hè più bassa à 51,6% è 75,6%, rispettivamente.
I mudelli d'espressione di i cumpunenti principali di u termine di u prucessu biologicu "GO:0055114 Redox process" sò stati rivelati. A scala Log2 rapprisenta i valori log2 (cambiamentu di piega) trà e piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenutu da campi di lupini, Wizhenica, Pulonia, 1999) è e piante di cuntrollu (inoculate in modu simulatu) à u listessu tempu. E seguenti linee di lupini à foglie strette sò state analizzate: 83A:476 (resistente, chì porta l'allele omozigotu Lanr1), Boregine (resistente, background geneticu scunnisciutu), Mandelup (moderatamente resistente, chì porta l'allele omozigotu AnMan) è a Pupulazione 22660 (suscettibile).
83A:476 E risposte trascrittomiche à l'inoculazione cù C. lupini (ceppo Col-08) includenu ancu u silenziamentu coordinatu di i geni attribuiti à u termine GO:0015979 "fotosintesi" è altri prucessi biologichi cunnessi (FIG. 5). Questu inseme di DEG GO:0015979 cuntene 105 geni chì sò stati significativamente repressi à 6 hpi à 83A:476. In questu sottoinsieme, 37 geni sò stati ancu sottoregulati in Mandelup à 48 HPI è 35 à u listessu puntu di tempu in a pupulazione 22660, cumpresi 19 DEG cumuni à i dui genotipi. Nisun DEG ligatu à u termine GO: 0015979 hè statu attivatu significativamente in alcuna cumminazione (linea x tempu).
I mudelli d'espressione di i cumpunenti principali di u termine di u prucessu biologicu "GO:0015979 Fotosintesi" sò stati rivelati. A scala Log2 rapprisenta i valori log2 (cambiamentu di piega) trà e piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenutu da campi di lupini, Wizhenica, Pulonia, 1999) è e piante di cuntrollu (inoculate in modu simulatu) à u listessu tempu. E seguenti linee di lupini à foglie strette sò state analizzate: 83A:476 (resistente, chì porta l'allele omozigotu Lanr1), Boregine (resistente, background geneticu scunnisciutu), Mandelup (moderatamente resistente, chì porta l'allele omozigotu AnMan) è a Pupulazione 22660 (suscettibile).
Basatu annantu à i risultati di l'analisi di l'espressione differenziale è presumibilmente implicatu in e risposte di difesa contr'à i funghi patogeni, questu inseme di sette geni hè statu sceltu per a quantificazione di i profili d'espressione per PCR in tempu reale (Tabella Supplementare S9).
U genu di a proteina putativu TanjilG_10657 hè statu induttu significativamente in tutte e linee è i punti di tempu studiati paragunatu à e piante di cuntrollu (mimetiche) (Tabelle Supplementari S10, S11). Inoltre, u prufilu d'espressione di TanjilG_10657 hà mostratu una tendenza crescente durante u corsu di l'esperimentu per tutte e linee. A pupulazione 22660 hà mostratu a più alta sensibilità di TanjilG_10657 à l'inoculazione cù attivazione di 114 volte è u più altu livellu d'espressione relativa (4,4 ± 0,4) à 24 HPI (Fig. 6a). U genu di a proteina PR10 LlR18A TanjilG_27015 hà ancu mostratu attivazione in tutte e linee è i punti di tempu, cù significazione statistica à a maiò parte di i punti di dati (Fig. 6b). Simile à TanjilG_10657, u più altu livellu d'espressione relativa di TanjilG_27015 hè statu osservatu in a pupulazione inoculata 22660 à 24 HPI (19,5 ± 2,4). U genu di l'endochitinasi acida TanjilG_04706 hè statu significativamente sovraregulatu in tutte e linee è in tutti i punti di tempu, eccettu per Boregine 6 hpi (Fig. 6c). Hè statu fortemente induttu à u primu puntu di tempu (6 HPI) à 83A:476 (di 10,5 volte) è hè aumentatu moderatamente in altre linee (di 6,6-7,5 volte). Durante l'esperimentu, l'espressione di TanjilG_04706 hè rimasta à livelli simili in 83A:476 è Boregine, mentre chì in Mandelup è Pupulazione 22660 hè aumentata significativamente, righjunghjendu valori relativamente alti (5,9 ± 1,5 è 6,2 ± 1,5, rispettivamente). U genu simile à l'endoglucanu-1,3-β-glucosidasi TanjilG_23384 hà mostratu una alta attivazione à i primi dui punti di tempu (6 è 12 hpi) in tutte e linee, eccettu a pupulazione 22660 (Fig. 6d). I livelli d'espressione relativa più alti di TanjilG_23384 sò stati osservati à u secondu puntu di tempu (12 hpi) in Mandelup (2,7 ± 0,3) è 83A:476 (1,5 ± 0,1). À 24 HPI, l'espressione di TanjilG_23384 era relativamente bassa in tutte e linee studiate (da 0,04 ± 0,009 à 0,44 ± 0,12).
Profili d'espressione di geni selezziunati (ag) rivelati da PCR quantitativa. I numeri 6, 12 è 24 rapprisentanu l'ore dopu a vaccinazione. I geni LanDExH7 è LanTUB6 sò stati utilizati per a nurmalizazione è LanTUB6 hè statu utilizatu per a calibrazione inter-serie. E barre d'errore rapprisentanu a deviazione standard basata annantu à trè repliche biologiche, ognuna di e quali hè a media di trè repliche tecniche. A significatività statistica di e differenze in i livelli d'espressione trà e piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppa Col-08, ottenuta in u 1999 da u campu di lupini in Wierzenica, Pulonia) è e piante di cuntrollu (inoculate fintamente) sò marcate sopra i punti di dati (* valore P < 0,05, ** valore P ≤ 0,01, *** valore P ≤ 0,001). A significatività statistica di e differenze in i livelli d'espressione trà e piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppa Col-08, ottenuta in u 1999 da u campu di lupini in Wierzenica, Pulonia) è e piante di cuntrollu (inoculate fintamente) sò marcate sopra i punti di dati (* valore P < 0,05, ** valore P ≤ 0,01, *** valore P ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, м Статистическая) получен в 1999 г. с поля люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулиров) отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Differenze statisticamente significative in i livelli d'espressione trà e piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenutu in u 1999 da un campu di lupini in Wierzhenice, Pulonia) è e piante di cuntrollu (inoculate in modu simulatu) sò nutate sopra i punti di dati (* valore P < 0,05, ** valore P ≤ 0,01, *** valore P ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在敹之水平差异的统计学显着性标记在数（渊在敹伈水平差0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 秉 波兰水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.001, ***P ≤ 0.01)。0.01 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, ш0там, ш08м) полученный с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно ино инокаула отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Differenze statisticamente significative in i livelli d'espressione trà e piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenutu da campi di lupini in Verzhenice, Pulonia, in u 1999) è e piante di cuntrollu (inoculate cù una finta inoculazione) sò nutate sopra i punti di dati (* valore P < 0,05, ** valore P ≤ 0,01, *** valore P ≤ 0,001).E linee NLL analizzate eranu: 83A:476 (resistente, purtendu l'allele omozigotu Lanr1), Mandelup (moderatamente resistente, purtendu l'allele omozigotu AnMan), Boregine (resistente, background geneticu scunnisciutu) è a pupulazione 22660 (suscettibile).
U genu candidatu TanjilG_05042 à u locus Lanr1 hà mostratu un mudellu d'espressione marcatamente differente da i profili ottenuti da studii RNA-seq (Fig. 6e). Una attivazione significativa di stu genu hè stata osservata in Mandelup è in a pupulazione 22660 (finu à 39,7 è 11,7 volte, rispettivamente), risultendu in livelli d'espressione relativamente alti (finu à 1,4 ± 0,14 è 7,2 ± 1,3, rispettivamente). 83A:476 hà ancu rivelatu una certa sovraespressione di u genu TanjilG_05042 (finu à 3,8 volte), tuttavia, i livelli d'espressione relativi ottenuti (0,044 ± 0,002) eranu più di 30 volte inferiori à quelli osservati in Mandelup è in a pupulazione 22660. L'analisi da qPCR anu mostratu differenze significative in i livelli d'espressione trà i genotipi in e varianti vaccinate cù un vaccinu simulatu (di cuntrollu), righjunghjendu una differenza di 58 volte trà e pupulazioni 22660 è 83A:476, è ancu trà e pupulazioni 22660 è 22660. Una differenza di duie volte hè stata ottenuta trà Boregine è Mandalup.
U genu candidatu à u locus AnMan, TanjilG_12861, hè statu attivatu in risposta à a vaccinazione in 83A:476 è Mandelup, era neutru in a pupulazione 22660, è era sotturegulatu in Boregine (Fig. 6f). L'espressione relativa di u genu TanjilG_12861 era a più alta in 83A:476 inoculatu (0,14 ± 0,01). U genu di a proteina di shock termicu di classe I di 17,4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 hà mostratu livelli d'espressione relativa più bassi in tutti i ceppi è i punti di tempu studiati (Fig. 6g). U valore più altu hè statu osservatu à 24 HPI in a pupulazione 22660 (0,14 ± 0,02, un aumentu di ottu volte in risposta à a vaccinazione).
A paragunazione di i profili d'espressione genica (Fig. 7) hà rivelatu una alta currelazione trà TanjilG_10657 è quattru altri geni: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) è TanjilG_04706 (r = 0,79). Tali risultati ponu indicà a co-regulazione di sti geni durante e risposte di difesa. I geni TanjilG_12861 è TanjilG_23384 anu mostratu diversi profili d'espressione cù valori di cuefficiente di currelazione di Pearson più bassi (da 0,08 à 0,43 è da -0,19 à 0,28, rispettivamente) paragunatu à altri geni.
E correlazioni trà i profili d'espressione genica sò state rilevate per mezu di a PCR quantitativa. E seguenti linee di lupini à foglie strette sò state analizzate: 83A:476 (resistente, chì porta l'allele omozigotu Lanr1), Mandelup (moderatamente resistente, chì porta l'allele omozigotu AnMan), Boregine (resistente, background geneticu scunnisciutu) è a Pupulazione 22660 (suscettibile). Trè punti di tempu sò stati calculati (6, 12 è 24 ore dopu l'inoculazione), cumprese e piante inoculate (Colletotrichum lupini, ceppo Col-08, ottenutu da campi di lupini in Wierzhenice, Pulonia, in u 1999) è e piante di cuntrollu (inoculate in modu simulatu). A scala mostra u valore di u coefficientu di currelazione di Pearson.
Basatu annantu à i dati ottenuti à 6 cavalli per pollice, WGCNA hè statu realizatu annantu à 9981 DEG identificati paragunendu e piante inoculate è di cuntrollu per fucalizza si nantu à e risposte di difesa precoce (Tabella Supplementare S12). Ventidui moduli genichi (cluster) sò stati trovati cù profili d'espressione correlati (positivi o negativi) trà genotipi è varianti sperimentali. In media, i livelli d'espressione genica eranu in discendenza in ordine 83A:476 > Mandelup > Boregine > Pupulazione 22660 (in e duie varianti, però, sta tendenza era più forte in e piante di cuntrollu). In media, i livelli d'espressione genica eranu in discendenza in ordine 83A:476 > Mandelup > Boregine > Pupulazione 22660 (in e duie varianti, però, sta tendenza era più forte in e piante di cuntrollu). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populazione 22660 эта тенденция была сильнее у контрольных растений). In media, i livelli d'espressione genica sò diminuiti in l'ordine 83A:476 > Mandelup > Boregine > Pupulazione 22660 (in e duie varianti, però, sta tendenza era più forte in e piante di cuntrollu).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Populazione 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> populazione 22660 的 顺序 下降 （， ， 在 筌 在 筏 下降在 在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populazione 22660 тенденция была сильнее у контрольных растений). In media, i livelli d'espressione genica sò diminuiti in a serie 83A:476 > Mandelup > Boregine > Pupulazione 22660 (tuttavia, in e duie varianti, sta tendenza era più forte in e piante di cuntrollu).A vaccinazione hà risultatu in una sovra-regulazione di l'espressione genica, in particulare in i moduli 18, 19, 14, 6 è 1 (in ordine discendente d'effettu), regulazione negativa (per esempiu, i moduli 9 è 20) o cù effetti neutri (per esempiu, i moduli 11, 22, 8 è 13). L'analisi di l'arricchimentu di i termini GO (Tabella Supplementare S13) hà rivelatu "GO: 0006952 Risposte protettive" per u modulu inoculatu (18) cù attivazione massima, cumpresi i geni analizzati da qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 è TanjilG_27015), è ancu parechji moduli di fotosintesi più repressi (9). U cuncentratore di u modulu 18 (Fig. 8) hè statu identificatu cum'è u genu TanjilG_26536 chì codifica a proteina LlR18B di tipu PR-10, è u cuncentratore di u modulu 9 hè statu identificatu cum'è u genu TanjilG_28955 chì codifica a proteina PsbQ di u fotosistema II. Un genu candidatu di resistenza à l'antracnosi Lanr1, TanjilG_05042, hè statu trovu in u modulu 22 (Fig. 9) è hè assuciatu cù i termini "GO:0044260 Prucessi metabolichi macromoleculari cellulari" è "GO:0006355 Regolazione trascrizionale, mudelli di DNA" chì portanu u centru TanjilG_01212. U genu codifica u fattore di trascrizione di stress termicu A-4a (HSFA4a).
Analisi di rete ponderata di a coespressione genica di moduli cù termini di prucessu biologicu sovrarappresentati "GO: 0006952 Risposte di difesa". A ligazione hè stata simplificata per mette in risaltu i quattru geni analizzati da qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 è TanjilG_27015).
Analisi di rete ponderata di a coespressione genica di un modulu cù un termine di prucessu biologicu sovrarappresentatu "GO: 0006355: Regolazione trascrizionale, modelli di DNA" è chì porta un genu candidatu di resistenza à l'antracnosi Lanr1 TanjilG_05042. A ligazione hè stata simplificata per isolà u genu TanjilG_05042 è u genu centrale TanjilG_01212.
U screening di resistenza à l'antracnosi raccoltu in Australia hà dimustratu chì a maiò parte di e prime varietà liberate eranu suscettibili; Kalya, Coromup è Mandelup sò state descritte cum'è moderatamente resistenti, mentre chì Wonga, Tanjil è 83A:476 sò state descritte cum'è altamente resistenti26,27,31. avianu u listessu allele di resistenza, designatu Lanr1, è Coromup è Mandelup avianu un allele differente, designatu AnMan10, 26, 39, mentre chì Kalya hà trasmessu un allele differente, Lanr2. U screening per a resistenza à l'antracnosi in Germania hà risultatu in l'identificazione di una linea resistente Bo7212 cù un allele candidatu altru ch'è Lanr1, designatu LanrBo36.
U nostru studiu hà rivelatu una frequenza assai bassa (circa 6%) di l'allele Lanr1 in u germoplasma testatu. Questa osservazione hè coerente cù i risultati di u screening di u germoplasma di l'Europa orientale utilizendu i marcatori Anseq3 è Anseq4, chì anu dimustratu chì l'allele Lanr1 hè presente solu in duie linee bielorusse. Questu suggerisce chì l'allele Lanr1 ùn hè ancu largamente utilizatu da i prugrammi di ripruduzzione lucali, à u cuntrariu di l'Australia, induve hè unu di l'alleli chjave per a ripruduzzione assistita da marcatori. Questu pò esse duvutu à u livellu più bassu di resistenza furnitu da l'allele Lanr1 in e cundizioni di campu europee paragunatu à u rapportu australianu. Inoltre, studii di l'antracnosi in e zone à alta precipitazione in Australia anu dimustratu chì e risposte di resistenza mediate da l'allele Lanr1 ùn ponu micca esse efficaci in e cundizioni climatiche chì favuriscenu a crescita è u sviluppu rapidu di l'agente patogenu19,42. In fatti, in u presente studiu, alcuni sintomi di antracnosi sò stati osservati ancu in genotipi chì portanu l'allele Lanr1, suggerendu chì a resistenza pò sparisce in cundizioni ottimali per u sviluppu di C. lupini. Inoltre, sò pussibuli interpretazioni falsi pusitivi di a presenza di marcatori Anseq3 è Anseq4, chì sò à circa 1 cM da u locus Lanr1 28,30,43.
U nostru studiu hà dimustratu chì 83A:476, chì porta l'allele Lanr1, hà rispostu à l'inoculazione di C. lupini cù una riprogrammazione di u trascrittoma à grande scala à u primu puntu di tempu analizatu (6 hpi), mentre chì in Mandelup, chì porta l'allele AnMan, e risposte trascrittomiche sò state osservate assai più tardi (da 24 à 48 hp). Queste variazioni temporali in e risposte di difesa sò assuciate à differenze in i sintomi di a malattia, mettendu in risaltu l'impurtanza di u ricunniscenza precoce di i patogeni per una risposta riescita à a resistenza. Per infettà i tessuti vegetali, e spore di antrace devenu passà per parechje fasi di sviluppu nantu à a superficia di l'ospite, cumprese a germinazione, a divisione cellulare è a furmazione di un appressorium. Un appendice hè una struttura infettiva chì si attacca à a superficia di l'ospite è facilita a penetrazione in i tessuti ospiti. Cusì, e spore di C. gloeosporioides in l'estrattu di piselli anu dimustratu a prima divisione di u nucleu dopu à 75-90 minuti di incubazione, a furmazione di un tubu germinale dopu à 90-120 minuti è a soppressione dopu à 4 ore 45. U mango C. gloeosporioides hà mostratu più di 40% di germinazione conidiale dopu à 3 ore d'incubazione è circa 20% di furmazione d'appressori dopu à 4 ore. U genu CAP20 assuciatu à a virulenza di C. gloeosporioides hà mostratu attività trascrizionale in conidi chì formanu epifite dopu à 3,5 ore d'incubazione in cera superficiale d'avocado cù alte concentrazioni di proteina CAP20 dopu à 4 ore è 46 min. In listessu modu, l'attività di i geni di biosintesi di melanina in C. trifolii hè stata indotta durante una incubazione di 2 ore seguita da a furmazione di un appressoriu dopu à 1 ora. Studi di i tessuti fogliari anu dimustratu chì e fragole inoculate cù C. acutatum anu a prima soppressione à 8 hpi, mentre chì i pumati inoculati cù C. coccodes anu a prima soppressione à 4 hpi48,49. largamente coerente cù a scala di tempu di u prucessu infettivu di Colletotrichum spp. E risposte rapide di difesa à 83A:476 suggerenu l'implicazione di i geni di resistenza di e piante è di l'immunità scatenata da effettori (ETI) in questa linea, mentre chì e risposte ritardate di Mandelup sustenenu l'ipotesi di l'immunità scatenata da mudelli moleculari micro-associati (MTI) 50. E prime risposte à 83A: 476 è Mandelup. A sovrapposizione parziale trà i geni regulati in su o in giù in a risposta ritardata sustene ancu questu cuncettu, postu chì l'ETI hè spessu cunsiderata cum'è una risposta MTI accelerata è migliorata chì culmina in a morte cellulare prugrammata in u situ di l'infezione, cunnisciuta cum'è shock anafilatticu 51,52.
A maiò parte di i geni attribuiti à u termine sovrarapprisentatu Gene Ontology GO:0006952 "Defense Response" sò l'11 omologhi di a proteina 22 di u messagiu di digiunu induttu da u stress (simile à SAM22) è i sette principali proteine ​​simili à e proteine ​​di lattice (MLP). E proteine ​​simili à e proteine ​​31, 34, 43 è 423 anu mostratu similitudine di sequenza. I geni simili à SAM22 anu mostratu una attivazione significativa chì hè durata più longu, mustrendu livelli aumentati di resistenza à l'antracnosi (83A:476 è Boregine). Tuttavia, i geni simili à MLP sò stati regulati in calata solu in linee chì portanu l'allele di resistenza candidatu (83A:476/Lanr1 à 6 hpi è Mandelup/AnMan à 24 hpi). Ci vole à nutà chì tutti l'omologhi simili à SAM22 identificati sò originarii di un cluster di geni chì si estende per circa 105 kb, mentre chì i geni simili à MLP sò originarii di regioni separate di u genomu. L'attivazione cuurdinata di tali geni simili à SAM22 hè stata ancu trovata in u nostru studiu precedente di a resistenza NLL à l'inoculazione di Diaporthetoxica, ciò chì suggerisce ch'elli sò implicati in i cumpunenti urizzuntali di a risposta di difesa. Sta cunclusione hè ancu sustinuta da rapporti di una risposta pusitiva di geni simili à SAM22 à ferite o trattamentu cù acidu salicilicu, induttori fungini, o perossidu d'idrogenu.
I geni simili à MLP anu dimustratu di risponde à diversi stress abiotici è biotici, cumprese infezioni fungine batteriche, virali è patogene in parechje spezie di piante55. E direzzioni di risposta à certe interazzione trà e piante è i patogeni variavanu da un forte aumentu (vale à dì, durante l'infestazione di u cuttone cù Verticillium dahliae) à una diminuzione significativa (vale à dì, dopu l'infezzione di u melu cù Alternaria spp.)56,57. Una significativa diminuzione di u genu 423 simile à MLP hè stata osservata durante e difese di l'avocado contr'à l'infezzione da F. niger è durante l'infezzione di u melu Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola è Alternaria alternata sò patotipi di mela58,59. Inoltre, i calli di mela chì sovraesprimenu u genu 423 simile à MLP avianu una minore espressione di geni assuciati à a resistenza è eranu più suscettibili à l'infezzione fungina59. Dopu à Fusarium oxysporum f, u genu 423 simile à MLP hè statu ancu suppressu in u germoplasma di fagioli cumuni resistenti. cn. Infezzione da fagioli 60.
Altri membri di a famiglia PR-10 identificati in u nostru studiu RNA-seq eranu i geni LlR18A è LlR18B in risposta à a sovraregulazione, è ancu u genu sovraregulatu (1 genu) o sotturegulatu (3 geni) per a proteina di trasferimentu di lipidi DIR1. Inoltre, WGCNA mette in risaltu u genu LlR18B cum'è un centru in questu modulu, chì hè assai suscettibile à a vaccinazione è porta parechji geni di risposta protettiva. I geni LlR18A è LlR18B sò stati indutti in foglie di lupinu giallu in risposta à batteri patogeni, è ancu in steli NLL dopu l'inoculazione di D. toxica, mentre chì l'omologu di risu di questi geni, RSOsPR10, hè statu rapidamente induttu da una infezione fungina presumibilmente implicata in a via di segnalazione di l'acidu jasmonicu53,61, 62. U genu DIR1 codifica proteine ​​di trasportu di lipidi non specifiche chì sò necessarie per l'iniziu di a resistenza sistemica acquisita (SAR). Cù u sviluppu di reazzioni prutettive, a proteina DIR1 hè trasportata da u focu di l'infezzione attraversu u floema per induce SAR in organi distanti. Hè interessante nutà chì u genu TanjilG_02313 DIR1 hè statu induttu significativamente à u primu puntu di tempu in e linee 84A:476 è a Pupulazione 22660, ma a resistenza à l'antracnosi s'hè sviluppata cù successu solu in a linea 84A:476. Questu pò indicà una certa subfunzionalizazione di u genu DIR1 in NLL, postu chì i trè omologhi rimanenti anu rispostu à l'inoculazione solu in a linea 83A:476 à 6 hpi, è sta risposta hè stata diretta versu u bassu.
In u nostru studiu, i cumpunenti i più cumuni chì currispondenu à u prucessu biologicu chjamatu "GO:0055114 Prucessu Redox" eranu a proteina di u citocromu P450, a perossidasi, l'acidu linoleicu 9S-/13S-lipossigenasi, è l'acidu 1-aminociclopropano-1-carbossilicu ossidasi. Inoltre, u nostru WGCNA definisce l'omologu HSFA4a cum'è un centru chì porta moduli cum'è u candidatu di u genu di resistenza Lanr1 TanjilG_05042. HSFA4a hè un cumpunente di a regulazione redox-dipendente di a trascrizione nucleare in e piante.
E proteine ​​di u citocromu P450 sò ossidoreduttasi chì catalizanu e reazioni di idrossilazione dipendenti da NADPH è/o O2 in u metabolismu primariu è secundariu, cumpresu u metabolismu di xenobiotici, è ancu ormoni, acidi grassi, steroli, cumpunenti di a parete cellulare, biopolimeri è a biosintesi di cumposti protettivi 69. In u nostru In un studiu, a variabilità in a funzione di u citocromu P450 di a pianta hè stata ridutta da -10,6 log2 (cambiamentu di piega) à 5,7 per via di un gran numeru di omologhi alterati (37) è differenze in i mudelli di risposta trà geni specifici, riflettendu una revisione ascendente. . L'usu solu di dati RNA-seq per elucidà a presunta funzione biologica di i geni NLL in una superfamiglia di proteine ​​cusì grande seria assai speculativu. Tuttavia, vale a pena nutà chì alcuni geni di u citocromu P450 sò assuciati à una maggiore resistenza à funghi o batteri patogeni, cumpresu un cuntributu à reazioni allergiche 69,70,71.
E perossidasi di Classe III sò enzimi vegetali multifunzionali implicati in una vasta gamma di prucessi metabolichi durante a crescita è u sviluppu di e piante, è ancu in risposta à stress ambientali cum'è a salinità, a siccità, l'alta intensità luminosa è l'attaccu di patogeni72. E perossidasi sò implicate in l'interazione di parechje spezie vegetali cù Anthracis, cumprese Stylosanthes humilis è C. gloeosporioides, Lens culinaris è C. truncatum, Phaseolus vulgaris è C. lindemuthianum, Cucumis sativus è C. lagenarium73,74,75,76. A risposta hè assai rapida, qualchì volta ancu à 4 HPI, prima chì u fungu penetri in u tissutu vegetale73. U genu di a perossidasi hà ancu rispostu à l'inoculazione NLL di D. toxica. In più di e so funzioni tipiche per regulà u scoppiu ossidativu o eliminà u stress ossidativu, e perossidasi ponu interferisce cù a crescita di i patogeni creendu barriere fisiche basate nantu à u rinforzu di a parete cellulare durante a lignificazione, a subunità o u cross-linking di cumposti specifici. Sta funzione pò esse attribuita in silico à u genu TanjilG_03329 chì codifica una putativa perossidasi anionica chì forma lignina chì hè stata significativamente sovraregulata in u nostru studiu in a linea resistente 83A:476 à 6 HPI, ma micca in altre ceppe è punti di tempu chì ùn anu micca rispostu.
A 9S-/13S-lipossigenasi di l'acidu linoleicu hè u primu passu in a via ossidativa di a biosintesi di i lipidi78. I prudutti di sta via anu parechje funzioni in a difesa di e piante, cumprese u rinfurzamentu di a parete cellulare per via di a furmazione di depositi di callosa è pectina, è a regulazione di u stress ossidativu per via di a produzzione di spezie reattive di l'ossigenu79,80,81,82,83. In u presente studiu, l'espressione di a 9S-/13S-lipossigenasi di l'acidu linoleicu hè stata alterata in tutti i ceppi, ma in a pupulazione suscettibile 22660, a sovraregulazione hà prevalsu in diversi momenti, mentre chì in i ceppi chì portanu Lanr1 resistente è l'allele AnMan, mette in risaltu a diversificazione di u stratu di ossilipina in e reazioni protettive di l'antrace trà questi genotipi.
L'omologu di l'1-aminociclopropano-1-carbossilato ossidasi (ACO) hè statu significativamente sovraregulatu (9 geni) o sottoregulatu (2 geni) quandu hè statu inoculatu cù u lupinu. Cù duie eccezioni, tutte queste risposte si sò verificate à 6 hp. à 83A:476. A reazione enzimatica mediata da e proteine ​​ACO hè u passu limitante in a pruduzzione di etilene è hè dunque altamente regulata84. L'etilene hè un ormone vegetale chì ghjoca una varietà di roli in a regulazione di u sviluppu di e piante è di a risposta à e cundizioni di stress abioticu è bioticu. L'induzione di a trascrizione ACO è l'attivazione di a via di segnalazione di l'etilene sò implicate in l'aumentu di a resistenza di u risu à u fungu emibiotrofu oryzae oryzae regulendu a pruduzzione di specie reattive di l'ossigenu è di fitoalessine. Un prucessu d'infezzione di e foglie assai simile trovu trà M. oryzae è C. lupini88,89, in u cuntestu di una significativa sovraespressione di l'omologhi ACO in a linea 83A:476 riportata in questu studiu, sposta a pussibilità di cunferisce resistenza à l'etilene antracnose NLL, una tappa cintrale di segnalazione in e vie moleculari.
In u presente studiu, a soppressione à grande scala di parechji geni assuciati à a fotosintesi hè stata osservata à 6 hpi in 83A:476 è à 48 hpi in Mandeloop è a pupulazione 22660. L'estensione è a progressione di sti cambiamenti sò proporzionali à u livellu. A resistenza à l'antracnosi hè stata osservata in questu esperimentu. Recentemente, hè stata signalata una forte è precoce repressione di i trascritti ligati à a fotosintesi in parechji mudelli d'interazzione pianta-patogenu, cumpresi batteri è funghi patogeni. A fretta (da 2 HPI in alcune interazzione) è a soppressione glubale di i geni assuciati à a fotosintesi in risposta à l'infezzione ponu scatenà l'immunità di e piante basata annantu à u spiegamentu di spezie reattive di l'ossigenu è a so interazzione cù a via di l'acidu salicylicu per medià reazzioni allergiche 90,94.
In cunclusione, i meccanismi di risposta di difesa pruposti per a ligna più resistente (83A:476) includenu u ricunniscimentu rapidu di i patogeni da u genu R (presumibilmente TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) è a segnalazione di l'acidu salicilicu è di l'etilene mediata da a risposta allergica, seguita da a creazione di una SAR à longu andà. L'azione hè sustenuta da a proteina DIR-1. Ci vole à nutà chì u periodu biotroficu per l'infezzione da C. lupini hè assai cortu (circa 2 ghjorni), seguitu da una crescita necrotica95. A transizione trà queste tappe pò esse assuciata à a necrosi è à l'espressione di proteine ​​inducibili da l'etilene chì agiscenu cum'è fattori scatenanti per reazioni di ipersensibilità in e piante ospiti. Dunque, a finestra di tempu per a cattura riescita di C. lupini à u stadiu biotroficu hè assai stretta. A riprogrammazione di i geni assuciati à u redox è a fotosintesi osservata in 83A:476 à 6 hpi hè coerente cù a progressione di l'ife fungine è annuncia u sviluppu di una risposta protettiva riescita à u stadiu biotroficu. E risposte trascrittomiche di Mandelup è di a pupulazione 22660 puderanu esse troppu ritardate per catturà u fungu prima di passà à a crescita necrotica, ma Mandelup puderia esse più efficace chè a pupulazione 22660 perchè a regulazione relativamente rapida di a proteina PR-10 prumove a resistenza orizzontale.
L'ETI, guidata da u genu canonicu R, pare esse un mecanismu cumunu per a resistenza di i fasgioli à l'antracnosi. Cusì, in u legume mudellu Medicago truncatula, a resistenza à l'antracnosi hè cunferita da u genu RCT1, un membru di a classa di geni R di a pianta TIR-NBS-LRR97. Stu genu cunferisce ancu una resistenza à l'antracnosi à largu spettru in l'alfalfa quandu hè trasferitu à piante suscettibili. In u fasgiolu cumunu (P. vulgaris), più di duie decine di geni di resistenza à l'antracnosi sò stati identificati finu à oghje. Alcuni di sti geni si trovanu in regioni chì mancanu di qualsiasi genu R canonicu, ma parechji altri sò situati à i bordi di i cromusomi chì portanu u cluster di geni NBS-LRR, cumpresi TIR-NBS-LRRs99. U studiu SSR à livellu di genomu hà ancu cunfirmatu l'associazione di u genu NBS-LRR cù a resistenza à l'antracnosi in u fasgiolu cumunu. U genu canonicu R hè statu ancu trovu in a regione genomica chì porta u locus principale di resistenza à l'antracnosi in u lupinu biancu 101.
U nostru travagliu mostra chì una reazione di resistenza immediata, attivata in una fase iniziale di l'infezzione di a pianta (preferibilmente micca più tardi di 12 hpi), prutege efficacemente u lupinu à foglie strette da l'antracnosi causata da u fungu patogenu Collelotrichum lupini. Usendu u sequenziamentu à altu rendimentu, avemu dimustratu profili di espressione differenziale di i geni di resistenza à l'antracnosi in e piante NLL mediati da i geni di resistenza Lanr1 è AnMan. Una difesa riescita implica una cuncepimentu attenta di i geni per e proteine ​​​​​​implicate in u redox, a fotosintesi è a patogenesi in poche ore da u primu cuntattu di a pianta cù un patogenu. Reazioni protettive simili, ma ritardate in u tempu, sò assai menu efficaci per prutege e piante da e malatie. A resistenza à l'antrace mediata da u genu Lanr1 s'assumiglia à a tipica risposta rapida di u genu R (immunità scatenata da l'effettore), mentre chì u genu AnMan furnisce assai probabilmente una risposta orizzontale (immunità scatenata da un mudellu moleculare assuciatu à i microbi), furnendu un livellu moderatu di sustenibilità.
E 215 linee NLL aduprate per u screening di i marcatori di antracnosi eranu cumposte da 74 cultivar, 60 linee ottenute per incrociu o ripruduzzione, 5 mutanti è 76 germoplasmi salvatichi o originali. E linee sò venute da 17 paesi, principalmente da a Polonia (58), Spagna (47), Germania (27), Australia (26), Russia (19), Bielorussia (7), Italia (5) è altre linee da 10 paesi. L'inseme include ancu linee resistenti di riferimentu: 83A:476, Tanjil, Wonga chì porta l'allele Lanr1 è Mandelup chì porta l'allele AnMan. E linee sò state ottenute da a Base di Dati Europea di Risorse Genetiche di Lupini mantenuta da Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polonia (Tabella Supplementare S1).
E piante sò state cultivate in cundizioni cuntrullate (fotoperiodu 16 ore, temperatura 25°C durante u ghjornu è 18°C ​​di notte). Dui repliche biologiche sò state analizate. U DNA hè statu isolatu da foglie di trè settimane aduprendu u DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germania) secondu u protocolu. A qualità è a cuncentrazione di u DNA isolatu sò state valutate da metudi spettrofotometrichi (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). U marcatore AnManM1 chì marca u genu di resistenza à l'antracnosi AnMan (derivatu da u cv. Mandelup) è i marcatori Anseq3 è Anseq4 chì fiancheghjanu u genu Lanr1 (derivatu da u cv. Tanjil) sò stati analizati 11,26,28. L'omozigoti per l'allele resistente sò stati valutati cum'è "1", suscettibili - cum'è "0", è l'eterozigoti - cum'è 0,5.
Basatu annantu à i risultati di u screening per i marcatori AnManM1, AnSeq3 è AnSeq4 è a dispunibilità di sementi per l'esperimenti di seguitu finali, 50 linee NLL sò state selezziunate per a fenotipizzazione di a resistenza à l'antracnosi. L'analisi hè stata realizata in duplicatu in una serra cuntrullata da computer cù un fotoperiodu di 14 ore cù un intervallu di temperatura di 22 °C durante u ghjornu è 19 °C di notte. I sementi sò grattati (tagliendu u rivestimentu di i sementi da u latu oppostu di l'embrione cù una lama affilata) prima di a suminazione per impedisce a dormienza di i sementi per via di u rivestimentu troppu duru è per assicurà una germinazione uniforme. E piante sò state cultivate in vasi (11 × 11 × 21 cm) cù terra sterile (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsavia, Polonia). L'inoculazione hè stata realizata cù a ceppa Colletotrichum lupini Col-08, cultivata in u 1999 da i steli di piante di lupinu à foglie strette cultivate in un campu in Verzhenitsa, Grande Polonia (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Ottene una zona. L'isolati sò stati cultivati ​​in mezu SNA à 20° C sottu luce nera per 21 ghjorni per induce a sporulazione. Quattru settimane dopu a semina, quandu e piante avianu righjuntu u stadiu di 4-6 foglie, l'inoculazione hè stata realizata spruzzendu cù una sospensione di conidi à una cuncentrazione di 0,5 x 106 conidi per ml. Dopu l'inoculazione, e piante sò state tenute à u bughju per 24 ore à una umidità di circa 98% è una temperatura di 25°C per facilità a germinazione di e conidi è u prucessu d'infezzione. E piante sò state poi cultivate sottu un fotoperiodu di 14 ore à 22°C ghjornu / 19°C notte è 70% di umidità. U puntuatu di a malatia hè statu fattu 22 ghjorni dopu à l'inoculazione è variava da 0 (immune) à 9 (moltu suscettibile) secondu a presenza o l'assenza di lesioni necrotiche nantu à i steli è e foglie. Inoltre, dopu à u puntuatu, hè statu misuratu u pesu di e piante. E relazioni trà i genotipi marcatori è i fenotipi di a malatia sò state calculate cum'è correlazioni puntu-due-sequenza (assenza di marcatori eterozigoti in l'inseme di linee per l'analisi di u fenotipu di resistenza à l'antracnosi).