Grazzi talli żort Nature.com. Il-verżjoni tal-browser li qed tuża għandha appoġġ limitat għas-CSS. Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew tiddiżattiva l-Modalità ta' Kompatibilità fl-Internet Explorer). Sadanittant, biex niżguraw appoġġ kontinwu, se nirrendu s-sit mingħajr stili u JavaScript.
L-Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) hija pjanta leguminuża użata għall-produzzjoni tal-ikel u t-titjib tal-ħamrija. L-espansjoni globali tal-NLL bħala wiċċ tar-raba’ ġibdet ħafna fungi patoġeniċi, inkluż l-antraknosi tal-lupin, li tikkawża l-marda devastanti tal-antraknosi. Żewġ alleli, Lanr1 u AnMan, li jikkonferixxu reżistenza akbar, intużaw fit-tnissil tal-NLL, iżda l-mekkaniżmi molekulari sottostanti għadhom mhux magħrufa. F’dan l-istudju, il-markaturi Lanr1 u AnMan intużaw biex jiġu skrinjati kampjuni Ewropej tal-NLL. L-ittestjar tal-vaċċin f’ambjent ikkontrollat ​​ikkonferma l-effikaċja taż-żewġ donaturi reżistenti. Sar profiling differenzjali tal-espressjoni tal-ġeni fuq linji rappreżentattivi reżistenti u suxxettibbli. Ir-reżistenza għall-antraknosi kienet assoċjata ma’ espressjoni żejda tat-termini tal-ontoloġija tal-ġeni “GO:0006952 Defense Response”, “GO:0055114 Redox Process”, u “GO:0015979 Photosynthesis”. Barra minn hekk, il-linja Lanr1(83A:476) uriet riprogrammazzjoni sinifikanti tat-traskrittoma malajr wara l-inokulazzjoni, filwaqt li l-linji l-oħra wrew dewmien f'din ir-rispons b'madwar 42 siegħa. Ir-risponsi tad-difiża huma assoċjati mal-ġeni TIR-NBS, CC-NBS-LRR u NBS-LRR, 10 proteini involuti fil-patoġenesi, proteini tat-trasferiment tal-lipidi, endoglucan-1,3-β-glucosidase, proteini tal-ħajt taċ-ċelluli rikki fil-gliċina, u ġeni mill-mogħdija reattiva tal-ossiġnu. Ir-risponsi bikrija għal 83A:476, inkluża s-soppressjoni bir-reqqa tal-ġeni assoċjati mal-fotosintesi, ikkoinċidew ma' protezzjoni b'suċċess matul il-fażi tat-tkabbir veġetattiv tal-bijoloġija fungali, li jissuġġerixxi li effettur jattiva l-immunità. Ir-reazzjoni ta' Mandeloop hija aktar bil-mod, kif ukoll il-ġibda orizzontali ġenerali.
Il-lupin b'weraq dejjaq (NLL, Lupinus angustifolius L.) huwa ċereali b'ħafna proteini li joriġina fir-reġjun tal-Punent tal-Mediterran1,2. Bħalissa jitkabbar bħala għelejjel tal-ikel għall-annimali u l-bnedmin. Huwa wkoll meqjus bħala demel aħdar fis-sistemi ta' rotazzjoni tal-għelejjel minħabba l-fissazzjoni tan-nitroġenu minn batterji simbjotiċi li jiffissaw in-nitroġenu u t-titjib ġenerali tal-istruttura tal-ħamrija. L-NLL għadda minn proċess rapidu ta' domestikazzjoni fl-aħħar seklu u għadu taħt pressjoni għolja ta' tnissil3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Bil-kultivazzjoni mifruxa tal-NLL, is-suċċessjoni ta' fungi patoġeniċi żviluppat niċeċ agrikoli ġodda u kkawżat mard ġdid li jeqred l-għelejjel. L-aktar ħaġa notevoli għall-bdiewa u dawk li jrabbu l-lupini kienet id-dehra tal-antraknosi, ikkawżata mill-fungus patoġeniku, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. L-aktar ħaġa notevoli għall-bdiewa u dawk li jrabbu l-lupini kienet id-dehra tal-antraknosi, ikkawżata mill-fungus patoġeniku, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракнозав, патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. L-aktar notevoli għall-bdiewa u dawk li jrabbu l-lupini kien il-feġġ tal-antraknosi kkawżata mill-fungus patoġeniku Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是现，它是现它是由眗腟 目的是炭目的是的出现，它是玟真hum Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是现，它是玟眗Colletric (Bondar)嵵Haired。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракнозозакнозозонеров патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. L-aktar ħaġa impressjonanti għall-bdiewa u dawk li jrabbu l-lupini hija l-emerġenza tal-antraknosi kkawżata mill-fungus patoġeniku Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.L-ewwel rapporti tal-marda ġew mill-Brażil u l-Istati Uniti, b'sintomi tipiċi li dehru fl-1912 u l-1929 rispettivament. Madankollu, wara madwar 30 sena, il-patoġenu ġie ddeżinjat bħala Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorfa Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfa Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfu ta' Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld f'Morfoloġija Mmirata. & H. Schrenk,. & H. Schrenk,.u H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。u H. Schlenk,.Il-fenotipazzjoni preliminari tal-marda li saret f'nofs is-seklu 20 wriet xi reżistenza fl-aċċessjonijiet NLL u tal-lupin isfar (L. luteus L.), iżda l-aċċessjonijiet kollha tal-lupin abjad (L. albus L.) ittestjati kienu suxxettibbli ħafna15,16. Studji wrew li l-iżvilupp tal-antraknożju huwa assoċjat ma' żieda fil-preċipitazzjoni (umdità tal-arja) u fit-temperatura (fil-medda ta' 12-28°C), li twassal għal ksur tar-reżistenza f'temperaturi ogħla17, 18. Fil-fatt, il-ħin meħtieġ biex il-konidji jiġġerminaw u l-marda tibda, kien erba' darbiet iqsar f'24°C (4 sigħat) milli f'12°C (16-il siegħa) taħt kundizzjonijiet ta' umdità għolja19. Għalhekk, it-tisħin globali li għaddej wassal għat-tixrid tal-antraknożju. Madankollu, il-marda ġiet osservata fi Franza (1982) u fl-Ukrajna (1983) bħala sinjal ta' theddida imminenti, iżda apparentement ġiet injorata mill-industrija tal-lupin dak iż-żmien20,21. Ftit snin wara, din il-marda devastanti nfirxet mad-dinja kollha u affettwat ukoll pajjiżi ewlenin li jipproduċu l-lupin bħall-Awstralja, il-Polonja u l-Ġermanja22,23,24. Wara tifqigħa tal-antraknożi f'nofs is-snin disgħin, skrinjar estensiv irriżulta fl-identifikazzjoni ta' diversi donaturi reżistenti f'kampjuni NLL19. Ir-reżistenza NLL għall-antraknożi hija kkontrollata minn żewġ alleli dominanti separati misjuba f'sorsi differenti ta' ġermplażma: Lanr1 fil-kultivar Tanjil u Wonga u AnMan fil-kultivar Mandalay 25, 26. Dawn l-alleli jikkomplementaw il-markaturi molekulari li jappoġġjaw l-għażla ta' ġermplażma reżistenti fi programmi ta' tnissil25,26,27,28,29,30. Il-linja ta' tnissil reżistenti 83A:476 li ġġorr l-allel Lanr1 ġiet imqassma mal-linja selvaġġa suxxettibbli P27255 biex tinkiseb popolazzjoni RIL li tissegrega għar-reżistenza għall-antracnose, li għamlitha possibbli li l-locus Lanr1 jiġi assenjat lill-kromożoma NLL-1131, 32, 33. L-allinjament tal-markaturi tal-mappa tal-kollegament mil-loci tar-reżistenza tal-ġenb għall-antracnose b'qafas ġenomiku, NLL żvela l-post tat-tliet alleli kollha fuq l-istess kromożoma (NLL-11), iżda f'pożizzjonijiet differenti29,34,35. Madankollu, minħabba n-numru żgħir ta' RILs u d-distanza ġenetika kbira bejn il-markaturi u l-alleli korrispondenti, l-ebda konklużjoni affidabbli ma tista' tinġibed dwar il-ġeni sottostanti tagħhom. Min-naħa l-oħra, l-użu ta' ġenetika inversa fil-lupini huwa diffiċli minħabba l-potenzjal ta' riġenerazzjoni baxx ħafna tagħhom, li jagħmel il-manipulazzjoni ġenetika kkumplikata37.
L-iżvilupp ta' ġermplażma domestikata li ġġorr l-allel mixtieq fl-istat omożigut, bħal 83A:476 (Lanr1) u Mandelup (AnMan), fetaħ il-bieb għall-istudju tar-reżistenza għall-antracnose fid-dawl tal-preżenza ta' kombinazzjonijiet opposti ta' alleli f'popolazzjonijiet selvaġġi. Possibbiltajiet ta' mekkaniżmi molekulari. Qabbel ir-risponsi ta' difiża ġġenerati minn ġenotipi speċifiċi. Dan l-istudju evalwa r-rispons bikri tat-traskrittoma ta' NLL għat-tilqima ta' C. lupini. L-ewwel, ġie skrinjat bord Ewropew ta' ġermplażma NLL li fih 215-il linja bl-użu ta' markaturi molekulari li jimmarkaw l-alleli Lanr1 u AnMan. Il-fenotipazzjoni tal-antracnose mbagħad twettqet fuq 50 linja NLL, magħżula qabel għal markaturi molekulari, taħt kundizzjonijiet ikkontrollati. Abbażi ta' dawn l-esperimenti, erba' linji li jvarjaw fir-reżistenza għall-antracnose u l-kompożizzjoni allelika Lanr1/AnMan intgħażlu għall-profiling tal-espressjoni tal-ġeni tad-difiża differenzjali bl-użu ta' żewġ approċċi komplementari: sekwenzar tal-RNA b'rendiment għoli u kwantifikazzjoni tal-PCR f'ħin reali.
L-iskrinjar ta' sett ta' ġermplażma NLL (N = 215) bil-markaturi Lanr1 (Anseq3 u Anseq4) u AnMan (Anseq4) u AnMan (AnManM1) wera li linja waħda biss (95726, ħdejn Salamanca-b) tamplifika l-allel ta' "reżistenza" għall-markaturi kollha, filwaqt li "Preżenza ta' alleli 'suxxettibbli'" sab il-proporzjon tal-markaturi kollha f'158 (~73.5%) linja. Tlettax-il linja pproduċew żewġ alleli "reżistenti" tal-markatur Lanr1, u 8 linji pproduċew alleli "reżistenti" tal-markatur Lanr1. L-allel ta' "reżistenza" tal-markatur AnMan (Tabella Supplimentari S1). Żewġ linji kienu eterożigoti għall-markatur Anseq3 u waħda eterożigota għall-markatur AnManM1. 42 linja (19.5%) kellhom fażijiet opposti tal-alleli Anseq3 u Anseq4, li jindika frekwenza għolja ta' rikombinazzjoni bejn dawn iż-żewġ loci. Il-fenotipi tal-antraknosi taħt kundizzjonijiet ikkontrollati (Tabella Supplimentari S2) żvelaw varjabbiltà fir-reżistenza tal-ġenotipi ttestjati, li kienet riflessa fis-severità tal-antraknosi. Id-differenzi fil-punteġġi medji varjaw minn 1.8 (moderatament reżistenti) sa 6.9 (suxxettibbli) u d-differenzi fil-piż tal-pjanti varjaw minn 0.62 (suxxettibbli) sa 4.45 g (reżistenti). Kien hemm korrelazzjoni sinifikanti bejn il-valuri osservati f'żewġ replikazzjonijiet tal-esperiment (0.51 għall-punteġġi tas-severità tal-marda, P = 0.00017 u 0.61 għall-piż tal-pjanta, P < 0.0001) kif ukoll bejn dawn iż-żewġ parametri (− 0.59 u − 0.77, P < 0.0001). Kien hemm korrelazzjoni sinifikanti bejn il-valuri osservati f'żewġ repliki tal-esperiment (0.51 għall-punteġġi tas-severità tal-marda, P = 0.00017 u 0.61 għall-piż tal-pjanta, P < 0.0001) kif ukoll bejn dawn iż-żewġ parametri (− 0.59 u − 0.77, P < 0.0001). Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция э0, слентера э0, баллов тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также межезу эвтамиду эвтамду эрастения (-0,59 è -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Instabet korrelazzjoni sinifikanti bejn il-valuri osservati f'żewġ ripetizzjonijiet tal-esperiment (0.51 għall-punteġġi tas-severità tal-marda, P = 0.00017 u 0.61 għall-piż tal-pjanta, P < 0.0001), kif ukoll bejn dawn iż-żewġ parametri (-0.59 u -0.77, P < 0.0001) 0.0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分1︺0.51为0. 0.00017，植物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P 0.001)在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 诸 庈 诸分为 0.51 ， p = 0.00017 ， 植物 为 为 0.61 ， p <0.0001） 以及 两 个 参数 之（ 参数 之（ （ 0.0001） 0.59 和– 0.59 和– 0.59 和- 0.77，P <0.0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух постениями (постениями) тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 u масса растения 0,61, P <0,0001), u между этими двуме пара9ми ме-0,5 -0,0001) 0,77, P <0,0001. Kien hemm korrelazzjoni sinifikanti bejn il-valuri osservati f'duplikat (punteġġ tas-severità tal-marda 0.51, P = 0.00017 u piż tal-pjanta 0.61, P < 0.0001) u bejn dawn iż-żewġ parametri (-0.59 u -0.0001) 0.77, P<0.0001. ).Sintomi tipiċi li jidhru f'pjanti suxxettibbli jinkludu tgħawwiġ u brim taz-zokk li jixbah struttura ta' "pruwa tar-ragħaj", segwiti minn leżjonijiet ovali b'sporożojti oranġjo/roża (Fig. Supplimentari 1). L-aċċessjonijiet Awstraljani li jġorru l-ġeni Lanr1 (83A:476 u Tanjil) u AnMan (Mandelup) huma moderatament reżistenti, 0.0331 u 0.0036). Xi linji li jġorru wkoll alleli "reżistenti" ta' Lanr1 u/jew AnMan juru sintomi tal-marda.
Interessanti, ftit linji NLL li m'għandhomx xi allel markatur "reżistenti" żvelaw livell għoli ta' reżistenza għall-antraknosi (komparabbli jew ogħla minn dak tal-ġenotipi Lanr1 jew AnMan), bħal Boregine (valur P < 0.0001 għaż-żewġ parametri), Bojar (valur P < 0.0001 għall-punteġġ u 0.001 għall-piż tal-pjanta) u l-Popolazzjoni B-549/79b (valur P < 0.0001 għall-punteġġ u mhux sinifikanti għall-piż). Interessanti, ftit linji NLL li m'għandhomx xi allel markatur "reżistenti" żvelaw livell għoli ta' reżistenza għall-antraknosi (komparabbli jew ogħla minn dak tal-ġenotipi Lanr1 jew AnMan), bħal Boregine (valur P < 0.0001 għaż-żewġ parametri), Bojar (valur P < 0.0001 għall-punteġġ u 0.001 għall-piż tal-pjanta) u l-Popolazzjoni B-549/79b (valur P < 0.0001 għall-punteġġ u mhux sinifikanti għall-piż). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллокавизполеля, слокива, уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 илаи или более высокий, чем для генотипов Lanr1 илаи кинх (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы массы). Interessanti, diversi linji NLL li m'għandhomx xi allele markatur 'reżistenti' wrew livell għoli ta' reżistenza għall-antraknosi (komparabbli ma' jew ogħla minn dak tal-ġenotipi Lanr1 jew AnMan), bħal Boregine (valur P < 0.0001 għaż-żewġ parametri), Bojar (valur P < 0.0001 għall-evalwazzjoni u 0.001 għall-piż tal-pjanta) u l-popolazzjoni B-549/79b (valur P < 0.0001 għall-evalwazzjoni u mhux sinifikanti għall-piż).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭水平的炭水平的炭等位基因的NLL或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重显睂怍量一 Huwa interessanti li xi sistemi NLL li m'għandhom l-ebda markatur "antiġeniku" juru reżistenza orizzontali għolja (ekwivalenti għall-ġeni Lanr1 jew AnMan jew ogħla), bħal Boregine (iż-żewġ parametri P < 0.0001), Bojar (valur P < 0.0001, piż tal-pjanta 0.001) u r-razza B-549/79b (valur P < 0.0001, piż mhux sinifikanti). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентноста», споликава уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие какачдле каник Boregine обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) и популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Interessanti, xi linji NLL li m'għandhomx alleli markaturi ta' 'reżistenza' wrew livelli għoljin ta' reżistenza għall-antraknosi (komparabbli ma' jew ogħla mill-ġenotipi Lanr1 jew AnMan), bħal Boregine (valur P għaż-żewġ parametri <0.0001), Bojar (valur P < 0.0001, piż tal-pjanta 0.001) u l-popolazzjoni B-549/79b (valur P < 0.0001, piż mhux sinifikanti).Dan il-fenomenu jissuġġerixxi l-possibbiltà ta' sors ġenetiku ġdid ta' reżistenza, u dan jispjega n-nuqqas osservat ta' korrelazzjoni bejn il-ġenotipi tal-markaturi u l-fenotipi tal-mard (valuri P minn ~0.42 sa ~0.98). Għalhekk, it-test Kolmogorov-Smirnov wera li d-dejta dwar ir-reżistenza għall-antraknosi kienet bejn wieħed u ieħor imqassma b'mod normali għall-punteġġi (valuri P 0.25 u 0.11) u l-massa tal-pjanta (valuri P 0.47 u 0.55), u dan jissuġġerixxi li nissoponi li huma involuti aktar alleli minn Lanr1 u AnMan.
Abbażi tar-riżultati tal-iskrinjar tar-reżistenza għall-antraċnosi, intgħażlu 4 linji għall-analiżi tat-traskrittoma: 83A:476, Boregine, Mandelup, u l-Popolazzjoni 22660. Dawn il-linji ġew ittestjati mill-ġdid għar-reżistenza għall-antraċ f'esperimenti ta' inokulazzjoni permezz ta' sekwenzar tal-RNA, sakemm kienu l-istess bħal fit-test preċedenti. Il-valuri tal-punteġġ kienu kif ġej: Boregin (1.71 ± 1.39), 83A: 476 (2.09 ± 1.38), Mandelup (3.82 ± 1.42) u l-popolazzjoni 22660 (6.11 ± 1.29).
Il-protokoll Illumina NovaSeq 6000 kiseb medja ta' 40.5 par ta' Mreads għal kull kampjun (29.7 sa 54.4 Mreads) (Tabella Supplimentari S3). Il-punteġġi tal-allinjament fis-sekwenza ta' referenza varjaw minn 75.5% sa 88.6%. Il-korrelazzjoni medja tad-dejta tal-għadd tal-qari bejn varjanti sperimentali bejn repliki bijoloġiċi varjat minn 0.812 sa 0.997 (medja ta' 0.959). Mill-35,170 ġene analizzati, 2917 ma wrew l-ebda espressjoni, u l-4785 ġene l-oħra ġew espressi f'livell negliġibbli (medja bażi < 5). Mill-35,170 ġene analizzati, 2917 ma wrew l-ebda espressjoni, u l-4785 ġene l-oħra ġew espressi f'livell negliġibbli (medja bażi < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов слсинов экспрессии незначительном уровне (базовое среднее <5). Mill-35,170 ġene analizzati, 2917 ma wrew l-ebda espressjoni, u l-4785 ġene li fadal ġew espressi f'livell negliġibbli (medja bażi <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35,170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 геннов имелисуч имелись экспрессию (базовое среднее значение <5). Mill-35,170 ġene analizzati, 2917 ma ġewx espressi u l-4785 ġene li fadal kellhom espressjoni negliġibbli (medja bażi <5).Għalhekk, in-numru ta' ġeni kkunsidrati espressi (medja bażi ≥ 5) matul l-esperiment kien ta' 27,468 (78.1%) (Tabella Supplimentari S4).
Mill-ewwel punt ta' żmien, il-linji NLL kollha wieġbu għall-inokulazzjoni ta' C. lupini (razza Col-08) billi pprogrammaw mill-ġdid it-traskrittoma (Tabella 1), madankollu, ġew osservati differenzi sinifikanti bejn il-linji. Għalhekk, il-linja ta' reżistenza 83A:476 (li ġġorr il-ġene Lanr1) uriet riprogrammar sinifikanti tat-traskrittoma fl-ewwel punt ta' żmien (6 hpi) b'żieda ta' 31-69 darba fin-numru ta' ġeni up- u down-iżolati meta mqabbla ma' punti ta' żmien oħra f'dan il-punt ta' żmien. Barra minn hekk, dan il-quċċata kien ta' żmien qasir, peress li l-espressjoni ta' ftit ġeni biss baqgħet mibdula b'mod sinifikanti fit-tieni punt ta' żmien (12 hpi). Interessanti, Boregine, li wera wkoll livell għoli ta' reżistenza fit-test tat-tilqim, ma għaddiex minn riprogrammar traskrizzjonali daqshekk massiv matul l-esperiment. Madankollu, in-numru ta' ġeni espressi b'mod differenzjali (DEG) kien l-istess għal Boregine u 83A:476 fi 12 HPI. Kemm Mandelup kif ukoll il-popolazzjoni 22660 urew qċaċet ta' DEG fl-aħħar punt ta' żmien (48 l/s), li jindika dewmien relattiv fir-risponsi tad-difiża.
Minħabba li 83A:476 għadda minn riprogrammazzjoni massiva tat-traskrittoma b'reazzjoni għal C. lupini f'6 HPI meta mqabbel mal-linji l-oħra kollha, ~91% tad-DEGs osservati f'dan il-punt ta' żmien kienu speċifiċi għal-linjaġġ (Fig. 1). Madankollu, kien hemm xi koinċidenza fir-risponsi bikrija bejn il-linji tal-istudju, peress li 68.5%, 50.9%, u 52.6% DEG f'Boregine, Mandelup, u l-popolazzjoni 22660, rispettivament, ikkoinċidew ma' dawk misjuba f'83A:476 f'ċerti punti fiż-żmien. Madankollu, dawn id-DEGs ammontaw għal frazzjoni żgħira biss (0.97–1.70%) tad-DEGs kollha li bħalissa qed jiġu skoperti bl-użu ta' 83A:476. Barra minn hekk, 11-il DEG mil-linji kollha kienu koerenti f'dan il-ħin (Tabelli Supplimentari S4-S6), inklużi komponenti komuni tar-risponsi tad-difiża tal-pjanti: proteina tat-trasferiment tal-lipidi (TanjilG_32225), enzima endoglucan-1,3-β-glucoside (TanjilG_23384), żewġ proteini li jistgħu jiġu indotti mill-istress bħal SAM22 (TanjilG_31528 u TanjilG_31531), proteina bażika tal-latex (TanjilG_32352), u żewġ proteini strutturali tal-ħajt taċ-ċelluli rikki fil-gliċina (TanjilG_19701 u TanjilG_19702). Kien hemm ukoll sovrappożizzjoni relattivament għolja fir-risponsi tat-traskrittoma bejn 83A:476 u Boregine f'24 HPI (total ta' 16-38% DEG) u bejn Mandelup u l-Popolazzjoni 22660 f'48 HPI (total ta' 14-20% DEG).
Dijagramma ta' Venn li turi n-numru ta' ġeni espressi b'mod differenzjali (DEG) f'linji ta' lupini b'weraq dojoq (NLL) inokulati b'Colletotrichum lupini (razza Col-08 miksuba minn għelieqi tal-lupini f'Wierzhenice, il-Polonja, 1999). Il-linji NLL analizzati kienu: 83A:476 (reżistenti, li jġorru l-allel Lanr1), Boregine (reżistenti, sfond ġenetiku mhux magħruf), Mandelup (moderatament reżistenti, li jġorru l-allel AnMan) u l-popolazzjoni 22660 (suxxettibbli ħafna). L-abbrevjazzjoni hpi tfisser sigħat wara t-tilqima. Valuri żero tneħħew biex tissimplifika l-graff.
Is-sett ta' ġeni espressi żżejjed f'6 hpi ġie analizzat għall-preżenza ta' dominji kanoniċi tal-ġeni R (Tabella Supplimentari S7). Dan l-istudju żvela induzzjoni tat-traskrittoma ta' ġeni klassiċi ta' reżistenza għall-mard b'dominji NBS-LRR biss f'83A:476. Dan is-sett kien jikkonsisti minn ġene TIR-NBS-LRR wieħed (tanjilg_05042), ħames ġeni CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, u tanjilg_16162), u Erba' NBS-LR, Tanjilg_16162), u Erba' NBS-LRRE (tanjilg_16162) kif ukoll Erba' NBS-Lrr (tanjilg_16162) u Erba' NBS-LRR (TANJILG_16162). Dawn il-ġeni kollha għandhom dominji kanoniċi rranġati f'sekwenzi konservati. Minbarra l-ġeni tad-dominju NBS-LRR, diversi kinases RLL ġew attivati ​​f'6 hpi, jiġifieri waħda f'Boregine (TanjilG_19877), tnejn f'Mandelup (TanjilG_07141 u TanjilG_19877) u fil-popolazzjoni 22660 (TanjilG_09014 u TanjilG_10361) u tnejn f'83A 27:476.
Ġeni b'espressjoni mibdula b'mod sinifikanti b'reazzjoni għall-inokulazzjoni b'C. lupini (razza Col-08) ġew soġġetti għal analiżi ta' arrikkiment tal-Ontoloġija tal-Ġeni (GO) (Tabella Supplimentari S8). L-aktar terminu ta' proċess bijoloġiku rappreżentat iżżejjed ta' spiss kien "GO:0006952 defense response" li deher f'6 minn 16-il kombinazzjoni (ħin × linja) b'sinifikat għoli (valur P < 0.001) (Fig. 2). L-aktar terminu ta' proċess bijoloġiku rappreżentat iżżejjed ta' spiss kien "GO:0006952 defense response" li deher f'6 minn 16-il kombinazzjoni (ħin × linja) b'sinifikat għoli (valur P < 0.001) (Fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса, был «GO: 0006952 тетвлеческого процесса который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P) (значение P <0,ирс. L-aktar terminu ta' proċess bijoloġiku rappreżentat iżżejjed ta' spiss kien 'GO:0006952 defense response', li deher f'6 minn 16-il kombinazzjoni (ħin × nisel) b'sinifikat għoli (valur P < 0.001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 L-aktar terminu rappreżentattiv tal-proċess bijoloġiku huwa “GO:0006952 defense response”, li jidher f'6 mis-16-il kombinazzjoni (时间×线), b'sinifikat għoli (valur P < 0.001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Risposta», Risposta 0006952рой появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис.2). L-aktar terminu ta' proċess bijoloġiku rappreżentat iżżejjed ta' spiss kien 'GO:0006952 Defense Response', li deher f'6 minn 16-il kombinazzjoni (ħin × linja) b'sinifikat għoli (valur P < 0.001) (Fig. 2).Dan it-terminu kien rappreżentat żżejjed f'żewġ punti ta' żmien f'83A: 476 u Boregine (6 u 24 hpi) u f'punt wieħed ta' żmien f'Mandelup u l-Popolazzjoni 22660 (12 u 6 hpi, rispettivament). Dan huwa riżultat mistenni, li jenfasizza r-rispons antifungali tal-linji reżistenti. Barra minn hekk, 83A:476 wieġeb għal C. lupini billi induċa malajr ġeni relatati mat-tifqigħa ossidattiva rappreżentata mit-terminu "GO:0055114 redox process", li jindika rispons ta' difiża speċifiku, filwaqt li Boregine żvela risponsi ta' difiża speċifiċi, relatati mat-terminu 'GO'. :0006950 Rispons għall-istress”. Il-Popolazzjoni 22660 attivat ir-rispons ta' reżistenza orizzontali li jinvolvi metaboliti sekondarji, u b'hekk enfasizzat in-numru eċċessiv ta' termini “GO:0016104 Proċess ta' bijosintesi tat-triterpeni” u “GO:0006722 Proċess ta' metaboliżmu tat-triterpeni” (iż-żewġ termini jappartjenu għall-istess sett ta' ġeni), filwaqt li jitqiesu r-riżultati tal-analiżi tal-arrikkiment tat-terminu GO, l-istabbiltà tar-reazzjoni ta' Mandelup kienet bejn Boregine u l-Popolazzjoni 22660. Barra minn hekk, ir-reazzjoni bikrija 83A:476 (6 hpi) u r-reazzjoni mdewma Mandelup u l-Popolazzjoni 22660 jinkludu t-terminu GO:0015979 'fotosintesi' u proċessi bijoloġiċi relatati oħra.
It-termini tal-ontoloġija tal-ġeni tal-bijoproċess magħżula fl-annotazzjoni tal-ġeni espressi b'mod differenzjali matul ir-risponsi tat-traskrittoma tal-lupin b'weraq dojoq (NLL) inokulat bil-lupin tal-antraċe (razza Col-08 miksuba minn għelieqi tal-lupin f'Wierzhenice, il-Polonja, fl-1999) huma esaġerati ħafna. Il-linji NLL analizzati kienu: 83A:476 (reżistenti, li jġorru l-allel omożigot Lanr1), Boregine (reżistenti, sfond ġenetiku mhux magħruf), Mandelup (moderatament reżistenti, li jġorru l-allel omożigot AnMan) u l-popolazzjoni 22660 (suxxettibbli).
Peress li dan l-istudju kellu l-għan li jidentifika ġeni li jikkontribwixxu għar-reżistenza għall-antraknosi, il-ġeni assenjati lit-termini GO “GO: 0006952 Defensive responses” u “GO: 0055114 Redox processes” ġew analizzati b'valuri cut-off peress li l-medja tal-linja bażi hija ≥ 30 b'mill-inqas linja waħda × punt fil-ħin li jikkombinaw valuri statistikament sinifikanti ta' log2 (bidla fil-ħin). L-għadd ta' ġeni li laħqu dawn il-kriterji kien 65 għal GO:0006952 u 524 għal GO:0055114.
83A:476 żvela żewġ qċaċet DEG annotati bit-terminu GO:0006952, l-ewwel b'6 ġeni kull pulzier (64 ġene, regolazzjoni 'l fuq u 'l isfel) u t-tieni b'24 ġene kull pulzier (15-il ġene, regolazzjoni 'l fuq biss). Boregine wera wkoll li GO:0006952 laħaq il-quċċata fl-istess punt ta' żmien, iżda b'inqas DEG (11 u 8) u attivazzjoni preferenzjali. Mandeloop wera żewġ qċaċet ta' GO:0006952 fi 12 u 48 HPI, it-tnejn li huma jġorru 12-il ġene (l-ewwel b'ġeni attivanti, u t-tieni b'ġeni soppressivi biss), filwaqt li l-popolazzjoni 22660 f'6 HPI (13-il ġene) kellha predominanza akbar tar-regolazzjoni tal-quċċata taż-żieda. Ta' min jinnota li 96.4% tad-DEG GO:0006952 f'dawn il-qċaċet kellhom l-istess tip ta' rispons ('il fuq jew 'l isfel), li jindika sovrappożizzjoni sinifikanti fir-risponsi tad-difiża minkejja d-differenzi fin-numru ta' ġeni involuti. L-akbar grupp ta’ sekwenzi relatati mat-terminu GO:0006952 jikkodifika l-Proteina 22 tal-Messaġġ Assoċjata mal-Istress tal-Ġuħ (SAM22-like), li tappartjeni għall-klade tal-proteina tal-klassi 10 tal-proteina assoċjata mal-patoġenesi (PR-10) u l-proteina ewlenija latex. proteina simili (proteina MLP-like) (Fig. 3). Iż-żewġ gruppi kienu differenti fin-natura tal-espressjoni u d-direzzjoni tar-rispons. Il-ġeni li jikkodifikaw proteini simili għal SAM22 urew induzzjoni konsistenti u sinifikanti f’punti ta’ żmien bikrija (6 jew 12 hpi) u ġeneralment ma kinux jirrispondu fi tmiem l-esperiment (48 hpi), filwaqt li proteini simili għal MLP urew koordinazzjoni f’6 hpi. hpi. 83A:476 u Mandelup f’48 hp/in, kważi l-punti tad-dejta l-oħra kollha ma kinux jirrispondu. Barra minn hekk, id-differenzi fil-profili tal-espressjoni tal-ġeni tal-proteini simili għal SAM22 segwew il-varjabbiltà osservata fir-reżistenza għall-antracnose, peress li linji aktar reżistenti kellhom aktar punti ta’ żmien li jinduċu dawn il-ġeni b’mod sinifikanti minn ġeni aktar suxxettibbli. Ġene PR-10 ieħor simili għal LlR18A/B wera xejra ta' espressjoni simili ħafna għall-ġene tal-proteina simili għal SAM22.
Ġew identifikati l-komponenti ewlenin tat-terminu tal-proċess bijoloġiku “GO:0006952 Defense Response” u l-mudelli ta’ espressjoni tal-ġeni kandidati tal-alleli Lanr1 u AnMan. L-iskala Log2 tirrappreżenta l-valuri log2 (bidla fil-ħin) bejn pjanti inokulati (Colletotrichum lupini, razza Col-08, miksuba minn għelieqi tal-lupini, Wizhenica, Polonja, 1999) u pjanti ta’ kontroll (inokulati b’mod finta) fl-istess punt ta’ żmien. Ġew analizzati l-linji tal-lupini b’weraq dojoq li ġejjin: 83A:476 (reżistenti, li jġorru l-allel omożigot Lanr1), Boregine (reżistenti, sfond ġenetiku mhux magħruf), Mandelup (moderatament reżistenti, li jġorru l-allel omożigot AnMan), u l-Popolazzjoni 22660 (suxxettibbli).
Barra minn hekk, ġew evalwati l-profili tal-espressjoni tal-ġeni kandidati tal-RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) u AnMan (TanjilG_12861) (Fig. 3). Il-ġene TanjilG_05042 wera rispons sinifikanti (attivazzjoni) f'83A:476 biss fl-ewwel punt ta' żmien (6 hpi), filwaqt li TanjilG_12861 kien sinifikanti f'Mandeloop biss f'żewġ punti ta' żmien: 6 hpi (tnaqqis fir-regolazzjoni) u 24 hpi (6 hpi). B'.). aġġustabbli) ).
L-aktar ġeni espressi żżejjed fit-terminu GO:0055114 "proċess redox" kienu ġeni li jikkodifikaw il-proteini taċ-ċitokromu P450 u l-perossidasi (Fig. 4). Għal kampjuni iżolati minn 83A:476 f'6 HPI, valuri massimi jew minimi ta' log2 (bidla fil-ħin) (għal 86.6% tal-ġeni) ġeneralment ġew osservati bejn pjanti inokulati u ta' kontroll, li jenfasizzaw ir-rispons għoli ta' dan il-ġenotip għas-sess inokulat. 83A:476 wera l-aktar DEG sinifikanti ta' GO:0055114 f'6 hpi (503 ġene), filwaqt li l-bqija tal-linji f'48 hpi (Boregine, 31 ġene; Mandelup, 85 ġene; u l-Popolazzjoni 22660, 78 ġene)). Fil-biċċa l-kbira tal-ġeni tal-familja GO:0055114, ġew osservati żewġ tipi ta' risponsi għat-tilqim (attivazzjoni u inibizzjoni). Interessanti, sa 97.6% tad-DEGs identifikati għat-terminu GO: 0055114 f'Mandelupe f'48 hp. Dawn l-osservazzjonijiet jissuġġerixxu li, minkejja l-iskala sinifikament iżgħar (jiġifieri, in-numru ta' ġeni redox mutati, 85 kontra 503), il-mudell ta' risponsi mdewma tat-traskrittoma ta' mandeloup għall-antraknosju huwa simili għar-rispons bikri ta' 83A:476. F'Boregine u l-Popolazzjoni 22660, din il-konverġenza hija aktar baxxa b'51.6% u 75.6%, rispettivament.
Ġew żvelati x-xejriet ta' espressjoni tal-komponenti ewlenin tat-terminu tal-proċess bijoloġiku "GO:0055114 Redox process". L-iskala Log2 tirrappreżenta l-valuri log2 (bidla fil-ħin) bejn pjanti inokulati (Colletotrichum lupini, razza Col-08, miksuba minn għelieqi tal-lupini, Wizhenica, Polonja, 1999) u pjanti ta' kontroll (inokulati b'mod finta) fl-istess punt ta' żmien. Ġew analizzati l-linji tal-lupini b'weraq dojoq li ġejjin: 83A:476 (reżistenti, li jġorru l-allel omożigot Lanr1), Boregine (reżistenti, sfond ġenetiku mhux magħruf), Mandelup (moderatament reżistenti, li jġorru l-allel omożigot AnMan), u l-Popolazzjoni 22660 (suxxettibbli).
83A:476 Ir-risponsi traskrittomiċi għall-inokulazzjoni b'C. lupini (razza Col-08) inkludew ukoll silenzjar ikkoordinat ta' ġeni attribwiti lit-terminu GO:0015979 "fotosintesi" u proċessi bijoloġiċi relatati oħra (FIG. 5). Dan is-sett DEG GO:0015979 kien fih 105 ġeni li ġew repressi b'mod sinifikanti f'6 hpi f'83A:476. F'dan is-subset, 37 ġene ġew ukoll regolati 'l isfel f'Mandelup f'48 HPI u 35 fl-istess punt ta' żmien fil-popolazzjoni 22660, inklużi 19 DEGs komuni għaż-żewġ ġenotipi. L-ebda DEG relatat mat-terminu GO: 0015979 ma ġie attivat b'mod sinifikanti f'xi kombinazzjoni (linja x ħin).
Ġew żvelati x-xejriet ta' espressjoni tal-komponenti ewlenin tat-terminu tal-proċess bijoloġiku "GO:0015979 Fotosintesi". L-iskala Log2 tirrappreżenta l-valuri log2 (bidla fil-ħin) bejn pjanti inokulati (Colletotrichum lupini, razza Col-08, miksuba minn għelieqi tal-lupini, Wizhenica, Polonja, 1999) u pjanti ta' kontroll (inokulati b'mod finta) fl-istess punt ta' żmien. Ġew analizzati l-linji tal-lupini b'weraq dojoq li ġejjin: 83A:476 (reżistenti, li jġorru l-allel omożigot Lanr1), Boregine (reżistenti, sfond ġenetiku mhux magħruf), Mandelup (moderatament reżistenti, li jġorru l-allel omożigot AnMan), u l-Popolazzjoni 22660 (suxxettibbli).
Abbażi tar-riżultati tal-analiżi tal-espressjoni differenzjali u preżumibbilment involuti fir-risponsi ta' difiża kontra fungi patoġeniċi, dan is-sett ta' seba' ġeni ntgħażel għall-kwantifikazzjoni tal-profili tal-espressjoni permezz ta' PCR f'ħin reali (Tabella Supplimentari S9).
Il-ġene putattiv tal-proteina TanjilG_10657 ġie indott b'mod sinifikanti fil-linji u l-punti ta' żmien kollha studjati meta mqabbel mal-pjanti ta' kontroll (mimika) (Tabelli Supplimentari S10, S11). Barra minn hekk, il-profil tal-espressjoni ta' TanjilG_10657 wera xejra ta' żieda matul l-esperiment għal-linji kollha. Il-Popolazzjoni 22660 uriet l-ogħla sensittività ta' TanjilG_10657 għall-inokulazzjoni b'attivazzjoni ta' 114-il darba u l-ogħla livell relattiv ta' espressjoni (4.4 ± 0.4) f'24 HPI (Fig. 6a). Il-ġene tal-proteina PR10 LlR18A TanjilG_27015 wera wkoll attivazzjoni fil-linji u l-punti ta' żmien kollha, b'sinifikat statistiku fil-biċċa l-kbira tal-punti tad-dejta (Fig. 6b). Simili għal TanjilG_10657, l-ogħla livell relattiv ta' espressjoni ta' TanjilG_27015 ġie osservat fil-popolazzjoni inokulata 22660 f'24 HPI (19.5 ± 2.4). Il-ġene tal-endokitinażi tal-aċidu TanjilG_04706 kien regolat b'mod sinifikanti 'l fuq fil-linji kollha u fil-punti ta' żmien kollha ħlief għal Boregine 6 hpi (Fig. 6c). Ġie indott b'mod qawwi fl-ewwel punt ta' żmien (6 HPI) f'83A:476 (b'10.5 darbiet) u żdied moderatament f'linji oħra (b'6.6-7.5 darbiet). Matul l-esperiment, l-espressjoni ta' TanjilG_04706 baqgħet f'livelli simili f'83A:476 u Boregine, filwaqt li f'Mandelup u l-Popolazzjoni 22660 żdiedet b'mod sinifikanti, u laħqet valuri relattivament għoljin (5.9 ± 1.5 u 6.2 ± 1.5, rispettivament). Il-ġene simili għall-endoglucan-1,3-β-glucosidase TanjilG_23384 wera attivazzjoni għolja fl-ewwel żewġ punti ta' żmien (6 u 12 hpi) fil-linji kollha ħlief il-popolazzjoni 22660 (Fig. 6d). L-ogħla livelli ta' espressjoni relattiva ta' TanjilG_23384 ġew osservati fit-tieni punt ta' żmien (12 hpi) f'Mandelup (2.7 ± 0.3) u 83A:476 (1.5 ± 0.1). F'24 HPI, l-espressjoni ta' TanjilG_23384 kienet relattivament baxxa fil-linji kollha studjati (minn 0.04 ± 0.009 sa 0.44 ± 0.12).
Profili ta' espressjoni ta' ġeni magħżula (ag) żvelati permezz ta' PCR kwantitattiva. In-numri 6, 12 u 24 jirrappreżentaw is-sigħat wara t-tilqima. Il-ġeni LanDExH7 u LanTUB6 intużaw għan-normalizzazzjoni u LanTUB6 intuża għall-kalibrazzjoni inter-serje. Il-vireg tal-iżbalji jirrappreżentaw id-devjazzjoni standard ibbażata fuq tliet repliki bijoloġiċi, li kull waħda minnhom hija l-medja ta' tliet repliki tekniċi. Is-sinifikat statistiku tad-differenzi fil-livelli ta' espressjoni bejn il-pjanti inokulati (Colletotrichum lupini, razza Col-08, miksuba fl-1999 mill-għalqa tal-lupin f'Wierzenica, il-Polonja) u l-pjanti ta' kontroll (inokulati b'mod finta) huma mmarkati 'l fuq mill-punti tad-dejta (*valur P < 0.05, **valur P ≤ 0.01, ***valur P ≤ 0.001). Is-sinifikat statistiku tad-differenzi fil-livelli ta' espressjoni bejn il-pjanti inokulati (Colletotrichum lupini, razza Col-08, miksuba fl-1999 mill-għalqa tal-lupin f'Wierzenica, il-Polonja) u l-pjanti ta' kontroll (inokulati b'mod finta) huma mmarkati 'l fuq mill-punti tad-dejta (*valur P < 0.05, **valur P ≤ 0.01, ***valur P ≤ 0.001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, м-Colletotrichum lupini, получен в 1999 г с поля люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулиров) отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Differenzi statistikament sinifikanti fil-livelli ta' espressjoni bejn pjanti inokulati (Colletotrichum lupini, razza Col-08, miksuba fl-1999 minn għalqa tal-lupini f'Wierzhenice, il-Polonja) u pjanti ta' kontroll (inokulati b'mod finta) huma nnutati 'l fuq mill-punti tad-dejta (*valur P < 0.05, **valur P ≤ 0.01, ***valur P ≤ 0.001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数渍在敹乼水平差异的统计学显着性标记在数渍木敹乼水平差0.05, **P 值≤ 0.01, ***P 值≤ 0.001)。接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对煥秉 波兰 ）水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001)。001)。. Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, ш08тамм полученный с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно ино инокаулиро инокаули отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Differenzi statistikament sinifikanti fil-livelli ta' espressjoni bejn pjanti inokulati (Colletotrichum lupini, razza Col-08, miksuba minn għelieqi tal-lupini f'Verzhenice, il-Polonja, fl-1999) u pjanti ta' kontroll (inokulati b'mod finta) huma nnutati 'l fuq mill-punti tad-dejta (*valur P < 0.05, **valur P ≤ 0.01, ***valur P ≤ 0.001).Il-linji NLL analizzati kienu: 83A:476 (reżistenti, li jġorru l-allel omożigot Lanr1), Mandelup (moderatament reżistenti, li jġorru l-allel omożigot AnMan), Boregine (reżistenti, sfond ġenetiku mhux magħruf) u l-popolazzjoni 22660 (suxxettibbli).
Il-ġene kandidat TanjilG_05042 fil-locus Lanr1 wera mudell ta' espressjoni differenti b'mod notevoli mill-profili miksuba minn studji RNA-seq (Fig. 6e). Attivazzjoni sinifikanti ta' dan il-ġene ġiet osservata f'Mandelup u fil-popolazzjoni 22660 (sa 39.7 u 11.7 darba, rispettivament), li rriżultat f'livelli ta' espressjoni relattivament għoljin (sa 1.4 ± 0.14 u 7.2 ± 1.3, rispettivament). 83A:476 żvela wkoll xi żieda fil-ġene TanjilG_05042 (sa 3.8 darbiet), madankollu, il-livelli ta' espressjoni relattivi miksuba (0.044 ± 0.002) kienu aktar minn 30 darba aktar baxxi minn dawk osservati f'Mandelup u fil-popolazzjoni 22660. analizzati permezz ta' qPCR urew differenzi sinifikanti fil-livelli ta' espressjoni bejn il-ġenotipi f'varjanti mock-vaccined (kontroll), li laħqu differenza ta' 58 darba bejn il-popolazzjonijiet 22660 u 83A:476, kif ukoll bejn il-popolazzjonijiet 22660 u 22660. Inkisbet differenza doppja bejn Boregine u Mandalup.
Il-ġene kandidat fil-locus AnMan, TanjilG_12861, ġie attivat b'reazzjoni għat-tilqima f'83A:476 u Mandelup, kien newtrali fil-popolazzjoni 22660, u kien imnaqqas f'Boregine (Fig. 6f). L-espressjoni relattiva tal-ġene TanjilG_12861 kienet l-ogħla f'83A:476 inokulat (0.14±0.01). Il-ġene tal-proteina tax-xokk tas-sħana tal-klassi I ta' 17.4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 wera livelli ta' espressjoni relattiva aktar baxxi fir-razez u l-punti ta' żmien kollha studjati (Fig. 6g). L-ogħla valur ġie osservat f'24 HPI fil-popolazzjoni 22660 (0.14 ± 0.02, żieda ta' tmien darbiet b'reazzjoni għat-tilqima).
It-tqabbil tal-profili tal-espressjoni tal-ġeni (Fig. 7) żvela korrelazzjoni għolja bejn TanjilG_10657 u erba' ġeni oħra: TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.80), u TanjilG_04706 (r = 0.79). Riżultati bħal dawn jistgħu jindikaw ko-regolazzjoni ta' dawn il-ġeni waqt ir-risponsi ta' difiża. Il-ġeni TanjilG_12861 u TanjilG_23384 urew profili ta' espressjoni differenti b'valuri aktar baxxi tal-koeffiċjent ta' korrelazzjoni ta' Pearson (minn 0.08 sa 0.43 u -0.19 sa 0.28, rispettivament) meta mqabbla ma' ġeni oħra.
Il-korrelazzjonijiet bejn il-profili tal-espressjoni tal-ġeni ġew skoperti bl-użu ta' PCR kwantitattiva. Il-linji ta' lupini b'weraq dojoq li ġejjin ġew analizzati: 83A:476 (reżistenti, li jġorru l-allel omożigot Lanr1), Mandelup (moderatament reżistenti, li jġorru l-allel omożigot AnMan), Boregine (reżistenti, sfond ġenetiku mhux magħruf), u l-Popolazzjoni 22660 (suxxettibbli). Ġew ikkalkulati tliet punti ta' żmien (6, 12 u 24 siegħa wara l-inokulazzjoni), inklużi pjanti inokulati (Colletotrichum lupini, razza Col-08, miksuba minn għelieqi tal-lupini f'Wierzhenice, il-Polonja, fl-1999) u pjanti ta' kontroll (inokulati b'mod finta). L-iskala turi l-valur tal-koeffiċjent ta' korrelazzjoni ta' Pearson.
Abbażi tad-dejta miksuba b'6 horsepower kull pulzier, il-WGCNA twettqet fuq 9981 DEG identifikati billi tqabblu l-pjanti inokulati u l-pjanti ta' kontroll biex jiffokaw fuq ir-risponsi bikrija tad-difiża (Tabella Supplimentari S12). Instabu tnejn u għoxrin modulu tal-ġeni (clusters) bi profili ta' espressjoni korrelati (pożittivi jew negattivi) bejn il-ġenotipi u l-varjanti sperimentali. Bħala medja, il-livelli ta' espressjoni tal-ġeni kienu qed jonqsu fl-ordni 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazzjoni 22660 (fiż-żewġ varjanti, madankollu, din ix-xejra kienet aktar b'saħħitha fil-pjanti ta' kontroll). Bħala medja, il-livelli ta' espressjoni tal-ġeni kienu qed jonqsu fl-ordni 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazzjoni 22660 (fiż-żewġ varjanti, madankollu, din ix-xejra kienet aktar b'saħħitha fil-pjanti ta' kontroll). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazzjoni 22660 (в обоих, надова эта тенденция была сильнее у контрольных растений). Bħala medja, il-livelli ta' espressjoni tal-ġeni naqsu fl-ordni 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazzjoni 22660 (fiż-żewġ varjanti, madankollu, din ix-xejra kienet aktar b'saħħitha fil-pjanti ta' kontroll).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazzjoni 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> popolazzjoni 22660 的 顺序 下降 （， ， 在 翭 在在 在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazzjoni 22660 (однако в обтаэхтѱариэ тенденция была сильнее у контрольных растений). Bħala medja, il-livelli ta' espressjoni tal-ġeni naqsu fis-serje 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popolazzjoni 22660 (madankollu, fiż-żewġ varjanti, din ix-xejra kienet aktar b'saħħitha fil-pjanti ta' kontroll).It-tilqim irriżulta f'żieda fl-espressjoni tal-ġeni, speċjalment fil-moduli 18, 19, 14, 6 u 1 (f'ordni dixxendenti tal-effett), regolazzjoni negattiva (eż. moduli 9 u 20) jew b'effetti newtrali (eż. moduli 11, 22, 8 u 13). L-analiżi tal-arrikkiment tat-terminu GO (Tabella Supplimentari S13) żvelat "GO: 0006952 Risposti protettivi" għall-modulu inokulat (18) b'attivazzjoni massima, inklużi ġeni analizzati permezz ta' qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 u TanjilG_27015), kif ukoll ħafna moduli tal-fotosintesi li kienu l-aktar soppressi (9). Il-konċentratur tal-modulu 18 (Fig. 8) ġie identifikat bħala l-ġene TanjilG_26536 li jikkodifika l-proteina LlR18B simili għal PR-10, u l-konċentratur tal-modulu 9 ġie identifikat bħala l-ġene TanjilG_28955 li jikkodifika l-proteina PsbQ tal-fotosistema II. Ġene kandidat għar-reżistenza għall-antraknosi Lanr1, TanjilG_05042, instab fil-modulu 22 (Fig. 9) u huwa assoċjat mat-termini “GO:0044260 Proċessi metaboliċi makromolekulari ċellulari” u “GO:0006355 Regolazzjoni traskrizzjonali, mudellar tad-DNA” li jġorru ċ-ċentru TanjilG_01212. Il-ġene jikkodifika l-fattur ta' traskrizzjoni tal-istress tas-sħana A-4a (HSFA4a).
Analiżi tan-netwerk ponderata tal-ko-espressjoni tal-ġeni ta' moduli b'termini ta' proċess bijoloġiku rappreżentati żżejjed "GO: 0006952 Risposti ta' difiża". Il-ligatura ġiet simplifikata biex tenfasizza l-erba' ġeni analizzati permezz ta' qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 u TanjilG_27015).
Analiżi tan-netwerk ponderata tal-koespressjoni tal-ġeni ta' modulu b'terminu ta' proċess bijoloġiku rappreżentat żżejjed "GO: 0006355: Regolazzjoni traskrizzjonali, mudellar tad-DNA" u li jġorr ġene kandidat ta' reżistenza għall-antraknosi Lanr1 TanjilG_05042. Il-ligatura ġiet simplifikata biex tiżola l-ġene TanjilG_05042 u l-ġene ċentrali TanjilG_01212.
L-iskrinjar għar-reżistenza għall-antraknosi miġbur fl-Awstralja wera li l-biċċa l-kbira tal-kultivari rilaxxati bikrija kienu suxxettibbli; Kalya, Coromup u Mandelup ġew deskritti bħala moderatament reżistenti, filwaqt li Wonga, Tanjil u 83A:476 ġew deskritti bħala reżistenti ħafna26,27,31. kellhom l-istess allele ta' reżistenza, imsejjaħ Lanr1, u Coromup u Mandelup kellhom allele differenti, imsejjaħ AnMan10, 26, 39, filwaqt li Kalya għaddiet allele differenti, Lanr2. L-iskrinjar għar-reżistenza għall-antraknosi fil-Ġermanja rriżulta fl-identifikazzjoni ta' linja reżistenti Bo7212 b'allel kandidat għajr Lanr1, imsejjaħ LanrBo36.
L-istudju tagħna żvela frekwenza baxxa ħafna (madwar 6%) tal-allel Lanr1 fil-ġermplażma ttestjata. Din l-osservazzjoni hija konsistenti mar-riżultati tal-iskrinjar tal-ġermplażma tal-Ewropa tal-Lvant bl-użu tal-markaturi Anseq3 u Anseq4, li wrew li l-allel Lanr1 huwa preżenti f'żewġ linji Belarussi biss. Dan jissuġġerixxi li l-allel Lanr1 għadu mhux użat ħafna minn programmi lokali ta' tnissil, għall-kuntrarju tal-Awstralja, fejn huwa wieħed mill-alleli ewlenin għat-tnissil assistit minn markaturi. Dan jista' jkun minħabba l-livell aktar baxx ta' reżistenza pprovdut mill-allel Lanr1 f'kundizzjonijiet tal-għalqa Ewropej meta mqabbel mar-rapport Awstraljan. Barra minn hekk, studji dwar l-antraknożju f'żoni b'ħafna xita fl-Awstralja wrew li r-risponsi ta' reżistenza medjati mill-allel Lanr1 jistgħu ma jkunux effettivi f'kundizzjonijiet tat-temp li jiffavorixxu t-tkabbir u l-iżvilupp rapidu tal-patoġenu19,42. Fil-fatt, fl-istudju preżenti, xi sintomi ta' antraknożju ġew osservati wkoll f'ġenotipi li jġorru l-allel Lanr1, li jissuġġerixxu li r-reżistenza tista' tisparixxi taħt kundizzjonijiet ottimali għall-iżvilupp ta' C. lupini. Barra minn hekk, interpretazzjonijiet foloz pożittivi tal-preżenza tal-markaturi Anseq3 u Anseq4, li huma madwar 1 cM mil-locus Lanr1, huma possibbli 28,30,43.
L-istudju tagħna wera li 83A:476, li jġorr l-allel Lanr1, wieġeb għall-inokulazzjoni ta' C. lupini b'riprogrammazzjoni tat-traskrittoma fuq skala kbira fl-ewwel punt ta' żmien analizzat (6 hpi), filwaqt li f'Mandelup, li jġorr l-allel AnMan, ir-risponsi traskrittomiċi ġew osservati ħafna aktar tard (minn 24 sa 48 hp). Dawn il-varjazzjonijiet temporali fir-risponsi tad-difiża huma assoċjati ma' differenzi fis-sintomi tal-marda, li jenfasizzaw l-importanza tar-rikonoxximent bikri tal-patoġeni għal rispons ta' suċċess għar-reżistenza. Biex jinfettaw it-tessut tal-pjanti, l-ispori tal-antraċe jridu jgħaddu minn diversi stadji ta' żvilupp fuq il-wiċċ tal-ospitant, inkluż il-ġerminazzjoni, id-diviżjoni taċ-ċelluli, u l-formazzjoni ta' appressorium. Appendiċi hija struttura infettiva li teħel mal-wiċċ tal-ospitant u tiffaċilita l-penetrazzjoni fit-tessuti ospitanti. Għalhekk, l-ispori ta' C. gloeosporioides fl-estratt tal-piżelli wrew l-ewwel diviżjoni tan-nukleu wara 75-90 minuta ta' inkubazzjoni, il-formazzjoni ta' tubu ġerminali wara 90-120 minuta, u soppressjoni wara 4 sigħat 45. Il-mango C. gloeosporioides wera aktar minn 40% ġerminazzjoni konidjali wara 3 sigħat ta' inkubazzjoni u madwar 20% formazzjoni ta' appressuri wara 4 sigħat. Il-ġene CAP20 assoċjat mal-virulenza ta' C. gloeosporioides wera attività traskrizzjonali f'konidji li jiffurmaw epifiti wara 3.5 sigħat ta' inkubazzjoni fix-xama' tal-wiċċ tal-avokado b'konċentrazzjonijiet għoljin ta' proteina CAP20 wara 4 sigħat u 46 minuta. Bl-istess mod, l-attività tal-ġeni tal-bijosintesi tal-melanin f'C. trifolii ġiet indotta waqt inkubazzjoni ta' sagħtejn segwita mill-formazzjoni ta' appressorju wara siegħa. Studji fuq tessuti tal-weraq urew li l-frawli inokulati b'C. acutatum għandhom l-ewwel soppressjoni fi 8 hpi, filwaqt li t-tadam inokulati b'C. coccodes għandhom l-ewwel soppressjoni f'4 hpi48,49. Fil-biċċa l-kbira konsistenti mal-iskala ta' żmien tal-proċess infettiv ta' Colletotrichum spp. Reazzjonijiet ta' difiża rapida għal 83A:476 jissuġġerixxu l-involviment ta' reżistenza tal-pjanti u ġeni tal-immunità attivata mill-effettur (ETI) f'din il-linja, filwaqt li r-risponsi mdewma ta' Mandelup jappoġġjaw l-ipoteżi tal-immunità attivata mill-mudell molekulari mikro-assoċjat (MTI) 50. Reazzjonijiet bikrija għal 83A: 476 u Mandelup. Is-sovrappożizzjoni parzjali bejn ġeni regolati 'l fuq jew 'l isfel fir-rispons imdewma tappoġġja wkoll dan il-kunċett, peress li l-ETI ħafna drabi titqies bħala rispons MTI aċċellerat u msaħħaħ li jikkulmina fil-mewt taċ-ċelluli programmata fis-sit tal-infezzjoni, magħrufa bħala xokk anafilattiku 51,52.
Il-biċċa l-kbira tal-ġeni attribwiti għat-terminu rappreżentat iżżejjed Gene Ontology GO:0006952 "Defense Response" huma l-11-il omologu tal-proteina 22 tal-messaġġ tas-sawm indott mill-istress (simili għal SAM22) u s-seba' proteini ewlenin simili għal proteini tal-latex (MLPs). Il-proteini simili għal 31, 34, 43 u 423 urew similarità fis-sekwenza. Ġeni simili għal SAM22 urew attivazzjoni sinifikanti li damet aktar, u wrew livelli miżjuda ta' reżistenza għall-antracnose (83A:476 u Boregine). Madankollu, ġeni simili għal MLP ġew regolati 'l isfel biss f'linji li jġorru l-allel tar-reżistenza kandidat (83A:476/Lanr1 f'6 hpi u Mandelup/AnMan f'24 hpi). Ta' min jinnota li l-omologi kollha identifikati simili għal SAM22 joriġinaw minn raggruppament ta' ġeni li jkopri madwar 105 kb, filwaqt li ġeni simili għal MLP joriġinaw minn reġjuni separati tal-ġenoma. Attivazzjoni kkoordinata ta' ġeni simili għal SAM22 instabet ukoll fl-istudju preċedenti tagħna dwar ir-reżistenza NLL għall-inokulazzjoni ta' Diaporthetoxica, li jissuġġerixxi li huma involuti fil-komponenti orizzontali tar-rispons tad-difiża. Din il-konklużjoni hija appoġġjata wkoll minn rapporti ta' rispons pożittiv ta' ġeni simili għal SAM22 għal korriment jew trattament b'aċidu saliċiliku, indutturi fungali, jew perossidu tal-idroġenu.
Ġeni simili għal MLP intwerew li jirrispondu għal diversi stress abijotiku u bijotiku, inklużi infezzjonijiet fungali batteriċi, virali u patoġeniċi f'ħafna speċi ta' pjanti55. Id-direzzjonijiet tar-rispons għal ċerti interazzjonijiet bejn il-pjanti u l-patoġeni varjaw minn żieda qawwija (jiġifieri, waqt infestazzjoni tal-qoton b'Verticillium dahliae) għal tnaqqis sinifikanti (jiġifieri, wara infezzjoni tas-siġra tat-tuffieħ b'Alternaria spp.)56,57. Tnaqqis sinifikanti tal-ġene 423 simili għal MLP ġie osservat waqt id-difiżi tal-avokado għall-infezzjoni ta' F. niger u waqt l-infezzjoni tas-siġra tat-tuffieħ Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola u Alternaria alternata huma patotipi tat-tuffieħ58,59. Barra minn hekk, il-calli tat-tuffieħ li jesprimu żżejjed il-ġene 423 simili għal MLP kellhom espressjoni aktar baxxa ta' ġeni assoċjati mar-reżistenza u kienu aktar suxxettibbli għal infezzjoni fungali59. Wara Fusarium oxysporum f, il-ġene 423 simili għal MLP ġie wkoll soppress fil-ġermplażma reżistenti tal-fażola komuni. cn. Infezzjoni tal-fażola 60.
Membri oħra tal-familja PR-10 identifikati fl-istudju RNA-seq tagħna kienu l-ġeni LlR18A u LlR18B b'reazzjoni għal upregulation, kif ukoll il-ġene upregulated (ġene 1) jew downregulated (3 ġeni) għall-proteina tat-trasferiment tal-lipidi DIR1. Barra minn hekk, WGCNA jenfasizza l-ġene LlR18B bħala ċentru f'dan il-modulu, li huwa suxxettibbli ħafna għat-tilqim u jġorr diversi ġeni ta' rispons protettiv. Il-ġeni LlR18A u LlR18B ġew indotti fil-weraq tal-lupin isfar b'reazzjoni għal batterji patoġeniċi, kif ukoll fi zkuk NLL wara inokulazzjoni ta' D. toxica, filwaqt li l-omologu tar-ross ta' dawn il-ġeni, RSOsPR10, ġie indott malajr minn infezzjoni fungali preżumibbilment involuta fil-mogħdija tas-sinjalar tal-aċidu jasmonic53,61, 62. Il-ġene DIR1 jikkodifika proteini tat-trasport tal-lipidi mhux speċifiċi li huma meħtieġa għall-bidu tar-reżistenza sistemika akkwistata (SAR). Bl-iżvilupp ta' reazzjonijiet protettivi, il-proteina DIR1 tiġi ttrasportata mill-fokus tal-infezzjoni permezz tal-floema biex tinduċi SAR f'organi 'l bogħod. Interessanti, il-ġene TanjilG_02313 DIR1 ġie indott b'mod sinifikanti fl-ewwel punt ta' żmien fil-linji 84A:476 u l-Popolazzjoni 22660, iżda r-reżistenza għall-antraknosi żviluppat b'suċċess biss fil-linja 84A:476. Dan jista' jindika xi subfunzjonalizzazzjoni tal-ġene DIR1 f'NLL, peress li t-tliet omologi li fadal irrispondew għall-inokulazzjoni biss fil-linja 83A:476 f'6 hpi, u din ir-rispons kienet diretta 'l isfel.
Fl-istudju tagħna, l-aktar komponenti komuni li jikkorrispondu għall-proċess bijoloġiku msejjaħ “GO:0055114 Proċess Redox” kienu l-proteina taċ-ċitokromu P450, il-perossidasi, l-aċidu linolejku 9S-/13S-lipoxygenase, u l-aċidu 1-aminocyclopropane-1-karbossiliku ossidasi. Barra minn hekk, il-WGCNA tagħna tiddefinixxi l-omologu HSFA4a bħala ċentru li jġorr moduli bħall-kandidat tal-ġene tar-reżistenza Lanr1 TanjilG_05042. L-HSFA4a huwa komponent tar-regolazzjoni dipendenti mir-redox tat-traskrizzjoni nukleari fil-pjanti.
Il-proteini taċ-ċitokromu P450 huma ossidoriduttażi li jikkatalizzaw reazzjonijiet ta' idrossilazzjoni dipendenti fuq NADPH u/jew O2 fil-metaboliżmu primarju u sekondarju, inkluż il-metaboliżmu ta' ksenobijotiċi, kif ukoll ormoni, aċidi grassi, steroli, komponenti tal-ħajt taċ-ċelluli, bijopolimeri, u l-bijosintesi ta' komposti protettivi 69. Fi studju tagħna, il-varjabbiltà fil-funzjoni taċ-ċitokromu P450 tal-pjanti tnaqqset minn -10.6 log2 (bidla ta' drabi) għal 5.7 minħabba numru kbir ta' omologi mibdula (37) u differenzi fix-xejriet ta' rispons bejn ġeni speċifiċi, li jirriflettu reviżjoni 'l fuq. L-użu biss ta' dejta RNA-seq biex tiġi ċċarata l-funzjoni bijoloġika putattiva tal-ġeni NLL f'superfamilja ta' proteini daqshekk kbira jkun spekulattiv ħafna. Madankollu, ta' min jinnota li xi ġeni taċ-ċitokromu P450 huma assoċjati ma' reżistenza akbar għal fungi jew batterji patoġeniċi, inkluż kontribut għal reazzjonijiet allerġiċi 69,70,71.
Il-perossidażi tal-Klassi III huma enzimi tal-pjanti multifunzjonali involuti f'firxa wiesgħa ta' proċessi metaboliċi matul it-tkabbir u l-iżvilupp tal-pjanti, kif ukoll b'reazzjoni għal stress ambjentali bħas-salinità, in-nixfa, l-intensità għolja tad-dawl, u l-attakk tal-patoġeni72. Il-perossidażi huma involuti fl-interazzjoni ta' diversi speċi ta' pjanti ma' Anthracis, inklużi Stylosanthes humilis u C. gloeosporioides, Lens culinaris u C. truncatum, Phaseolus vulgaris u C. lindemuthianum, Cucumis sativus u C. lagenarium73,74,75,76. Ir-rispons huwa rapidu ħafna, xi kultant anke f'4 HPI, qabel ma l-fungus jippenetra t-tessut tal-pjanta73. Il-ġene tal-perossidażi wieġeb ukoll għall-inokulazzjoni ta' D. toxica NLL. Minbarra l-funzjonijiet tipiċi tagħhom li jirregolaw it-tifqigħ ossidattiv jew jeliminaw l-istress ossidattiv, il-perossidażi jistgħu jinterferixxu mat-tkabbir tal-patoġeni billi joħolqu ostakli fiżiċi bbażati fuq it-tisħiħ tal-ħitan taċ-ċelluli waqt il-lignifikazzjoni, is-subunità jew ir-rabta inkroċjata ta' komposti speċifiċi. Din il-funzjoni tista' tiġi attribwita in silico lill-ġene TanjilG_03329 li jikkodifika anion peroxidase putattiva li tifforma l-lignin li ġiet upregulata b'mod sinifikanti fl-istudju tagħna fil-linja reżistenti 83A:476 f'6 HPI, iżda mhux f'razez u punti ta' żmien oħra li ma rrispondewx.
9S-/13S-lipoxygenase tal-aċidu linolejku hija l-ewwel pass fil-mogħdija ossidattiva tal-bijosintesi tal-lipidi78. Il-prodotti ta’ din il-mogħdija għandhom funzjonijiet multipli fid-difiża tal-pjanti, inkluż it-tisħiħ tal-ħitan taċ-ċelluli permezz tal-formazzjoni ta’ depożiti ta’ callose u pektin, u r-regolazzjoni tal-istress ossidattiv permezz tal-produzzjoni ta’ speċi ta’ ossiġnu reattivi79,80,81,82,83. Fl-istudju preżenti, l-espressjoni ta’ 9S-/13S-lipoxygenase tal-aċidu linolejku nbidlet fir-razez kollha, iżda fil-popolazzjoni suxxettibbli 22660, ir-regolazzjoni ’l fuq prevaliet f’punti ta’ żmien differenti, filwaqt li fir-razez li jġorru Lanr1 reżistenti u l-allel AnMan, dan jenfasizza d-diversifikazzjoni tas-saff oxylipin f’reazzjonijiet protettivi tal-antrax bejn dawn il-ġenotipi.
L-omologu ta' 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase (ACO) kien regolat 'il fuq b'mod sinifikanti (9 ġeni) jew 'l isfel (2 ġeni) meta ġie inokulat bil-lupin. B'żewġ eċċezzjonijiet, dawn ir-risponsi kollha seħħew f'6 hp. f'83A:476. Ir-reazzjoni enżimatika medjata mill-proteini ACO hija l-pass li jillimita r-rata fil-produzzjoni tal-etilene u għalhekk hija regolata ħafna84. L-etilene huwa ormon tal-pjanti li għandu varjetà ta' rwoli fir-regolazzjoni tal-iżvilupp tal-pjanti u r-rispons għall-kundizzjonijiet ta' stress abijotiku u bijotiku. L-induzzjoni tat-traskrizzjoni tal-ACO u l-attivazzjoni tal-mogħdija tas-sinjalar tal-etilene huma involuti fiż-żieda tar-reżistenza tar-ross għall-fungus emibijotrofiku oryzae oryzae billi jirregolaw il-produzzjoni ta' speċi ta' ossiġnu reattiv u fitoalexins. Proċess ta' infezzjoni tal-weraq simili ħafna li nstab bejn M. oryzae u C. lupini88,89, fl-isfond ta' żieda sinifikanti fl-omologi tal-ACO fil-linja 83A:476 irrappurtata f'dan l-istudju, ibiddel il-possibbiltà li tingħata reżistenza għall-antraknosi NLL, l-etilene, pass ċentrali ta' sinjalazzjoni fil-mogħdijiet molekulari.
Fl-istudju preżenti, ġiet osservata soppressjoni fuq skala kbira ta' ħafna ġeni assoċjati mal-fotosintesi f'6 hpi f'83A:476 u f'48 hpi f'Mandeloop u l-popolazzjoni 22660. Il-firxa u l-progressjoni ta' dawn il-bidliet huma proporzjonali għal-livell. F'dan l-esperiment ġiet osservata reżistenza għall-antraknosi. Riċentement, ġiet irrappurtata repressjoni qawwija u bikrija tat-traskrizzjonijiet relatati mal-fotosintesi f'diversi mudelli ta' interazzjonijiet bejn il-pjanti u l-patoġeni, inklużi batterji u fungi patoġeniċi. L-għaġla (minn 2 HPI f'xi interazzjonijiet) u s-soppressjoni globali tal-ġeni assoċjati mal-fotosintesi b'reazzjoni għall-infezzjoni jistgħu jqanqlu immunità tal-pjanti bbażata fuq l-iskjerament ta' speċi ta' ossiġnu reattiv u l-interazzjoni tagħhom mal-mogħdija tal-aċidu saliċiliku biex iwasslu għal reazzjonijiet allerġiċi 90,94.
Bħala konklużjoni, il-mekkaniżmi ta' rispons għad-difiża proposti għall-aktar nisel reżistenti (83A:476) jinkludu rikonoxximent rapidu tal-patoġeni mill-ġene R (preżumibbilment TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) u sinjalazzjoni ta' aċidu saliċiliku u etilene medjata minn rispons allerġiku, segwita mill-istabbiliment ta' SAR fuq medda twila. L-azzjoni hija appoġġjata mill-proteina DIR-1. Ta' min jinnota li l-perjodu bijotrofiku għall-infezzjoni ta' C. lupini huwa qasir ħafna (madwar jumejn), segwit minn tkabbir nekrotiku95. It-tranżizzjoni bejn dawn l-istadji tista' tkun assoċjata man-nekrożi u l-espressjoni ta' proteini induċibbli mill-etilene li jaġixxu bħala triggers għal reazzjonijiet ta' sensittività eċċessiva fil-pjanti ospitanti. Għalhekk, it-tieqa ta' żmien għall-qbid b'suċċess ta' C. lupini fl-istadju bijotrofiku hija dejqa ħafna. L-ipprogrammar mill-ġdid tal-ġeni assoċjati mar-redox u l-fotosintesi osservata f'83A:476 f'6 hpi hija konsistenti mal-progressjoni tal-ifi fungali u tħabbar l-iżvilupp ta' rispons protettiv ta' suċċess fl-istadju bijotrofiku. Ir-risponsi traskrittomiċi ta' Mandelup u l-popolazzjoni 22660 jistgħu jkunu wisq ittardjati biex jaqbdu l-fungus qabel ma jaqilbu għal tkabbir nekrotiku, madankollu, Mandelup jista' jkun aktar effettiv mill-popolazzjoni 22660 għaliex ir-regolazzjoni relattivament mgħaġġla tal-proteina PR-10 tippromwovi reżistenza orizzontali.
L-ETI, immexxija mill-ġene kanoniku R, tidher li hija mekkaniżmu komuni għar-reżistenza tal-fażola għall-antracnose. Għalhekk, fil-legume mudell Medicago truncatula, ir-reżistenza għall-antracnose hija kkonferita mill-ġene RCT1, membru tal-klassi tal-ġene R tal-pjanta TIR-NBS-LRR97. Dan il-ġene jikkonferi wkoll reżistenza għall-antracnose ta' spettru wiesa' fl-alfalfa meta jiġi trasferit għal pjanti suxxettibbli. Fil-fażola komuni (P. vulgaris), sal-lum ġew identifikati aktar minn żewġ tużżani ġeni ta' reżistenza għall-antracnose. Uħud minn dawn il-ġeni jinstabu f'reġjuni li m'għandhomx xi ġeni R kanoniċi, madankollu ħafna oħrajn jinsabu fit-truf tal-kromożomi li jġorru l-grupp ta' ġeni NBS-LRR, inklużi TIR-NBS-LRRs99. L-istudju SSR ġenomatiku kollu kkonferma wkoll l-assoċjazzjoni tal-ġene NBS-LRR mar-reżistenza għall-antracnose fil-fażola komuni. Il-ġene kanoniku R instab ukoll fir-reġjun ġenomiku li jġorr il-locus ewlieni tar-reżistenza għall-antracnose fil-lupin abjad 101.
Ix-xogħol tagħna juri li reazzjoni ta' reżistenza immedjata, attivata fi stadju bikri tal-infezzjoni tal-pjanti (preferibbilment mhux aktar tard minn 12 hpi), tipproteġi b'mod effettiv il-lupin b'weraq dojoq mill-antraknożju kkawżat mill-fungus patoġeniku Collelotrichum lupini. Bl-użu ta' sekwenzar b'rendiment għoli, wrejna profili ta' espressjoni differenzjali ta' ġeni ta' reżistenza għall-antraknożju fi pjanti NLL medjati mill-ġeni ta' reżistenza Lanr1 u AnMan. Difiża ta' suċċess tinvolvi d-disinn bir-reqqa tal-ġeni għall-proteini involuti fir-redox, il-fotosintesi, u l-patoġenesi fi żmien sigħat mill-ewwel kuntatt tal-pjanta ma' patoġenu. Reazzjonijiet protettivi simili, iżda mdewma fiż-żmien, huma ħafna inqas effettivi fil-protezzjoni tal-pjanti mill-mard. Ir-reżistenza għall-antrakni medjata mill-ġene Lanr1 tixbaħ ir-rispons rapidu tipiku tal-ġene R (immunità attivata mill-effettur), filwaqt li l-ġene AnMan x'aktarx jipprovdi rispons orizzontali (immunità attivata minn mudell molekulari assoċjat mal-mikrobi), li jipprovdi livell moderat ta' sostenibbiltà.
Il-215-il linja NLL użati biex jiġu skrinjati l-markaturi tal-antraknosi kienu jikkonsistu minn 74 kultivari, 60 linja miksuba permezz ta' qsim jew tnissil, 5 mutanti, u 76 ġermplażma selvaġġa jew oriġinali. Il-linji ġew minn 17-il pajjiż, prinċipalment mill-Polonja (58), Spanja (47), il-Ġermanja (27), l-Awstralja (26), ir-Russja (19), il-Belarus (7), l-Italja (5) u linji oħra minn 10 pajjiżi. Is-sett jinkludi wkoll linji reżistenti ta' referenza: 83A:476, Tanjil, Wonga li jġorr l-allel Lanr1, u Mandelup li jġorr l-allel AnMan. Il-linji nkisbu mid-Database Ewropea tar-Riżorsi Ġenetiċi tal-Lupin miżmuma minn Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, il-Polonja (Tabella Supplimentari S1).
Il-pjanti tkabbru taħt kundizzjonijiet ikkontrollati (fotoperjodu 16-il siegħa, temperatura 25°C matul il-jum u 18°C ​​bil-lejl). Żewġ repliki bijoloġiċi ġew analizzati. Id-DNA ġie iżolat minn weraq ta’ tliet ġimgħat bl-użu tad-DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, il-Ġermanja) skont il-protokoll. Il-kwalità u l-konċentrazzjoni tad-DNA iżolata ġew ivvalutati b’metodi spettrofotometriċi (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Il-markatur AnManM1 li jimmarka l-ġene tar-reżistenza għall-antraknosi AnMan (derivat minn cv. Mandelup) u l-markaturi Anseq3 u Anseq4 li jdawru l-ġene Lanr1 (derivat minn cv. Tanjil) ġew analizzati 11,26,28. L-omożigoti għall-allel reżistenti ġew skorjati bħala “1”, suxxettibbli – bħala “0”, u l-eterożigoti – bħala 0.5.
Abbażi tar-riżultati tal-iskrinjar għall-markaturi AnManM1, AnSeq3 u AnSeq4 u d-disponibbiltà taż-żerriegħa għall-esperimenti ta' segwitu finali, intgħażlu 50 linja NLL għall-fenotipazzjoni tar-reżistenza għall-antraknosi. L-analiżi twettqet b'mod duplikat f'serra kkontrollata mill-kompjuter b'fotoperjodu ta' 14-il siegħa b'firxa ta' temperatura ta' 22°C matul il-jum u 19°C bil-lejl. Iż-żerriegħa tinqata' (il-qoxra taż-żerriegħa tinqata' fuq in-naħa opposta tal-embrijun b'xafra li taqta') qabel iż-żrigħ biex tiġi evitata r-rieken taż-żerriegħa minħabba li l-qoxra taż-żerriegħa tkun iebsa wisq u biex tiġi żgurata ġerminazzjoni uniformi. Il-pjanti tkabbru f'qsari (11 × 11 × 21 ċm) b'ħamrija sterili (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsavja, il-Polonja). L-inokulazzjoni twettqet bir-razza Colletotrichum lupini Col-08, imkabbra fl-1999 miz-zkuk ta' pjanti tal-lupin b'weraq dojoq imkabbra f'għalqa f'Verzhenitsa, il-Greater Poland (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Ikseb żona. L-iżolati ġew ikkultivati ​​f'mezz SNA f'20°C taħt dawl iswed għal 21 jum biex jinduċu l-isporulazzjoni. Erba' ġimgħat wara ż-żrigħ, meta l-pjanti kienu laħqu l-istadju ta' 4-6 weraq, l-inokulazzjoni twettqet billi ġiet sprejjata b'sospensjoni ta' konidji b'konċentrazzjoni ta' 0.5 x 106 konidji kull ml. Wara l-inokulazzjoni, il-pjanti nżammu fid-dlam għal 24 siegħa f'umdità ta' madwar 98% u temperatura ta' 25°C biex tiġi ffaċilitata l-ġerminazzjoni tal-konidji u l-proċess ta' infezzjoni. Il-pjanti mbagħad tkabbru taħt fotoperjodu ta' 14-il siegħa f'22°C binhar/19°C billejl u 70% umdità. Il-punteġġ tal-marda sar 22 jum wara l-inokulazzjoni u varja minn 0 (immuni) sa 9 (suxxettibbli ħafna) skont il-preżenza jew l-assenza ta' leżjonijiet nekrotiċi fuq iz-zkuk u l-weraq. Barra minn hekk, wara l-punteġġ, tkejjel il-piż tal-pjanti. Ir-relazzjonijiet bejn il-ġenotipi tal-markaturi u l-fenotipi tal-marda ġew ikkalkulati bħala korrelazzjonijiet ta' żewġ sekwenzi ta' punti (assenza ta' markaturi eterożiguti fis-sett ta' linji għall-analiżi tal-fenotip tar-reżistenza għall-antraknosi).