Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Ang bersyon sa browser nga imong gigamit adunay limitado nga suporta sa CSS. Para sa pinakamaayong kasinatian, among girekomendar nga mogamit ka og updated nga browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer). Samtang, aron masiguro ang padayon nga suporta, among i-render ang site nga walay mga style ug JavaScript.
Ang Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) usa ka tanom nga leguminous nga gigamit alang sa produksiyon sa pagkaon ug pagpaayo sa yuta. Ang tibuok kalibutan nga pagpalapad sa NLL isip usa ka tanom nakadani sa daghang mga pathogenic fungi, lakip ang lupine anthracnose, nga hinungdan sa makadaot nga sakit nga anthracnose. Duha ka alleles, ang Lanr1 ug AnMan, nga naghatag og dugang nga resistensya, ang gigamit sa pagpasanay sa NLL, apan ang nagpahiping mga mekanismo sa molekula wala pa mahibal-i. Niini nga pagtuon, ang mga marker sa Lanr1 ug AnMan gigamit aron masusi ang mga sample sa European NLL. Ang pagsulay sa bakuna sa usa ka kontrolado nga palibot nagpamatuod sa kaepektibo sa duha ka resistant donors. Ang differential gene expression profiling gihimo sa representante nga resistant ug susceptible nga mga linya. Ang resistensya sa anthracnose nalangkit sa sobra nga ekspresyon sa mga termino sa gene ontology nga "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process", ug "GO:0015979 Photosynthesis". Dugang pa, ang linya sa Lanr1(83A:476) nagpakita og dakong transcriptome reprogramming nga paspas human sa inoculation, samtang ang ubang mga linya nagpakita og pagkalangan niini nga tubag og mga 42 ka oras. Ang mga tubag sa depensa nalangkit sa mga gene sa TIR-NBS, CC-NBS-LRR ug NBS-LRR, 10 ka protina nga nalambigit sa pathogenesis, lipid transfer proteins, endoglucan-1,3-β-glucosidase, glycine-rich cell wall proteins, ug mga gene gikan sa reactive path of oxygen. Ang sayo nga mga tubag sa 83A:476, lakip ang maampingong pagpugong sa mga gene nga nalangkit sa photosynthesis, nahitabo uban sa malampuson nga proteksyon atol sa vegetative growth phase sa fungal biology, nga nagsugyot nga ang usa ka effector nagpalihok sa immunity. Ang reaksyon sa Mandeloop mihinay, ingon man ang kinatibuk-ang horizontal drag.
Ang narrow-leaved lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) usa ka cereal nga taas og protina nga naggikan sa kasadpang rehiyon sa Mediteranyo1,2. Kini karon gitanom isip usa ka tanom nga pagkaon para sa mga hayop ug tawo. Giisip usab kini nga green manure sa mga sistema sa crop rotation tungod sa nitrogen fixation sa symbiotic nitrogen fixing bacteria ug sa kinatibuk-ang pag-uswag sa istruktura sa yuta. Ang NLL nakaagi sa paspas nga proseso sa pag-domestimate sa miaging siglo ug anaa pa sa taas nga breeding pressure3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Uban sa kaylap nga pagtanom sa NLL, ang sunod-sunod nga pathogenic fungi nakaugmad og bag-ong mga agricultural niches ug hinungdan sa bag-ong mga sakit nga makadaot sa tanom. Ang labing talagsaon alang sa mga mag-uuma ug tigpasanay sa lupin mao ang pagtungha sa anthracnose, nga gipahinabo sa pathogenic fungus, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Ang labing talagsaon alang sa mga mag-uuma ug tigpasanay sa lupin mao ang pagtungha sa anthracnose, nga gipahinabo sa pathogenic fungus, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного памогинкрикого памогинкриком (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Ang labing talagsaon sa mga mag-uuma ug tigpasanay og lupine mao ang pagtungha sa anthracnose nga gipahinabo sa pathogenic fungus nga Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真由病原真菌 Lunenbergi Lui Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌菌它是由病原真菌真菌。 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемогего пtricкмто lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Ang labing nakapahingangha sa mga mag-uuma ug tigpasanay sa lupine mao ang pagtungha sa anthracnose nga gipahinabo sa pathogenic fungus nga Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Ang pinakaunang mga taho sa sakit gikan sa Brazil ug Estados Unidos, nga adunay tipikal nga mga simtomas nga nagpakita niadtong 1912 ug 1929 matag usa. Apan, human sa mga 30 ka tuig, ang pathogen gitudlo nga Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph of Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld sa Targeted Morphology. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .ug H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。ug H. Schlenk, .Ang pasiunang phenotyping sa sakit nga gihimo sa tunga-tunga sa ika-20 nga siglo nagpakita og pipila ka resistensya sa NLL ug yellow lupine (L. luteus L.) accessions, apan ang tanang white lupine (L. albus L.) accessions nga gisulayan dali ra maapektuhan15,16. Gipakita sa mga pagtuon nga ang pag-uswag sa anthracnose nalangkit sa pagtaas sa ulan (humidity sa hangin) ug temperatura (sa han-ay nga 12-28°C), nga mosangpot sa paglapas sa resistensya sa mas taas nga temperatura17, 18. Sa tinuud, ang oras nga gikinahanglan aron moturok ang conidia ug magsugod ang sakit, upat ka pilo nga mas mubo sa 24°C (4 ka oras) kaysa sa 12°C (16 ka oras) ubos sa taas nga humidity nga mga kondisyon19. Busa, ang nagpadayon nga pag-init sa kalibutan misangpot sa pagkaylap sa anthracnose. Bisan pa, ang sakit naobserbahan sa France (1982) ug Ukraine (1983) isip usa ka timaan sa usa ka umaabot nga hulga, apan daw wala tagda sa industriya sa lupine niadtong panahona20,21. Pipila ka tuig ang milabay, kining makadaot nga sakit mikaylap sa tibuok kalibutan ug nakaapekto usab sa mga dagkong nasud nga nagprodyus og lupine sama sa Australia, Poland ug Germany22,23,24. Human sa pag-ulbo sa anthracnose sa tunga-tunga sa 1990s, ang halapad nga screening miresulta sa pag-ila sa daghang resistant donors sa mga sample sa NLL19. Ang resistensya sa NLL sa anthracnose gikontrol sa duha ka managlahing dominant alleles nga makita sa lain-laing mga tinubdan sa germplasm: Lanr1 sa cultivar Tanjil ug Wonga ug AnMan sa cultivar. Mandalay 25, 26. Kini nga mga alleles nagkomplemento sa mga molecular marker nga nagsuporta sa pagpili sa resistant germplasm sa mga programa sa pagpasanay25,26,27,28,29,30. Ang resistant breeding line nga 83A:476 nga nagdala sa Lanr1 allele gi-cross sa susceptible wild line nga P27255 aron makakuha og RIL population nga nag-segregate para sa anthracnose resistance, nga naghimo niini nga posible nga i-assign ang Lanr1 locus sa chromosome NLL-1131, 32, 33. Pinaagi sa pag-align sa linkage map markers gikan sa flanking resistance loci ngadto sa anthracnose gamit ang genomic framework, ang NLL nagpadayag sa lokasyon sa tanang tulo ka alleles sa samang chromosome (NLL-11), apan sa lain-laing posisyon29,34,35. Bisan pa, tungod sa gamay nga gidaghanon sa RILs ug sa dako nga genetic distance tali sa mga marker ug katugbang nga mga alleles, walay kasaligang konklusyon nga mahimo bahin sa ilang nagpahiping mga gene. Sa laing bahin, ang paggamit sa reverse genetics sa mga lupin lisod tungod sa ilang ubos kaayo nga regeneration potential, nga naghimo sa genetic manipulation nga lisod37.
Ang pag-uswag sa gi-domesticated germplasm nga nagdala sa gitinguha nga allele sa homozygous nga estado, sama sa 83A:476 (Lanr1) ug Mandelup (AnMan), nagbukas sa pultahan sa pagtuon sa resistensya sa anthracnose atubangan sa presensya sa magkaatbang nga kombinasyon sa mga alleles sa mga wild population. Mga posibilidad sa mga mekanismo sa molekula. Itandi ang mga tubag sa depensa nga gihimo sa piho nga mga genotype. Kini nga pagtuon nag-evaluate sa sayo nga transcriptome response sa NLL sa pagbakuna sa C. lupini. Una, usa ka European NLL germplasm panel nga adunay 215 ka linya ang gi-screen gamit ang mga molecular marker nga nagtimaan sa mga alleles sa Lanr1 ug AnMan. Ang phenotyping sa Anthracnose gihimo dayon sa 50 ka linya sa NLL, nga kaniadto gipili alang sa mga molecular marker, ubos sa kontrolado nga mga kondisyon. Base sa kini nga mga eksperimento, upat ka linya nga managlahi sa resistensya sa anthracnose ug komposisyon sa allelic sa Lanr1/AnMan ang gipili alang sa differential defense gene expression profiling gamit ang duha ka komplementaryong pamaagi: high-throughput RNA sequencing ug real-time PCR quantification.
Ang pag-screen sa usa ka set sa NLL germplasm (N = 215) gamit ang mga marker nga Lanr1 (Anseq3 ug Anseq4) ug AnMan (Anseq4) ug AnMan (AnManM1) nagpakita nga usa ra ka linya (95726, duol sa Salamanca-b) ang nagpadako sa “resistance” allele para sa tanang marker, samtang ang “Presence of 'susceptible' alleles” nakakaplag sa proporsyon sa tanang marker sa 158 (~73.5%) nga mga linya. Trese ka linya ang nagpatunghag duha ka “resistant” alleles sa Lanr1 marker, ug 8 ka linya ang nagpatunghag “resistant” alleles sa Lanr1. marker. Ang “resistance” allele sa AnMan marker (Supplementary Table S1). Duha ka linya ang heterozygous para sa Anseq3 marker ug usa ang heterozygous para sa AnManM1 marker. 42 ka linya (19.5%) ang nagdala sa magkaatbang nga mga hugna sa mga alleles sa Anseq3 ug Anseq4, nga nagpakita sa taas nga frequency sa recombination tali niining duha ka loci. Ang mga phenotype sa Anthracnose ubos sa kontroladong mga kondisyon (Supplementary Table S2) nagpakita sa pagkalainlain sa resistensya sa gisulayan nga mga genotype, nga makita sa kagrabe sa anthracnose. Ang mga kalainan sa mean score gikan sa 1.8 (moderately resistant) hangtod 6.9 (susceptible) ug ang mga kalainan sa gibug-aton sa tanom gikan sa 0.62 (susceptible) hangtod 4.45 g (resistant). Adunay usa ka mahinungdanong korelasyon tali sa mga kantidad nga naobserbahan sa duha ka replikasyon sa eksperimento (0.51 para sa mga marka sa kagrabe sa sakit, P = 0.00017 ug 0.61 para sa gibug-aton sa tanom, P < 0.0001) ingon man tali niining duha ka parametro (− 0.59 ug − 0.77, P < 0.0001). Adunay dakong korelasyon tali sa mga kantidad nga naobserbahan sa duha ka replikasyon sa eksperimento (0.51 para sa mga marka sa kagrabe sa sakit, P = 0.00017 ug 0.61 para sa gibug-aton sa tanom, P < 0.0001) ingon man tali niining duha ka parametro (− 0.59 ug − 0.77, P < 0.0001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для тля = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, Р00 < 0,0). Usa ka hinungdanon nga korelasyon ang nakit-an tali sa mga kantidad nga naobserbahan sa duha ka pagsubli sa eksperimento (0.51 para sa mga marka sa kagrabe sa sakit, P = 0.00017 ug 0.61 para sa gibug-aton sa tanom, P < 0.0001), ingon man tali niining duha ka mga parameter (- 0.59 ug -0.77, P < 0.0001) 0.0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为 = P0. 0.00017，植物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P <0.0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 了 评 度 了0.51 ， p = 0.00017 ， 植物 为 为 0.61 ， p <0.0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（ 和 9.–5. 0.59 ug 0.59 和- 0.77，P < 0.0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести видео, 0 за 0, 0 0 и масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001. Adunay dakong korelasyon tali sa mga kantidad nga naobserbahan sa duplicate (score sa kagrabe sa sakit nga 0.51, P = 0.00017 ug gibug-aton sa tanom nga 0.61, P < 0.0001) ug tali niining duha ka parametro (-0.59 ug -0 .0001) 0.77, P<0.0001. ).Ang kasagarang mga simtomas nga makita sa mga tanom nga daling mataptan naglakip sa pagkiling ug pagtuyok sa punoan nga susama sa istruktura sa "pana sa magbalantay sa karnero", gisundan sa oval nga mga samad nga adunay orange/pink nga mga sporozoite (Supplementary Fig. 1). Ang mga accession sa Australia nga nagdala sa Lanr1 (83A:476 ug Tanjil) ug AnMan (Mandelup) nga mga gene kay kasarangan ang resistensya, 0.0331 ug 0.0036). Ang ubang mga linya nga nagdala usab og "resistant" nga mga alleles sa Lanr1 ug/o AnMan nagpakita og mga simtomas sa sakit.
Makapainteres nga ang pipila ka mga linya sa NLL nga walay bisan unsang "resistant" nga marker allele nagpakita og taas nga lebel sa resistensya sa anthracnose (itandi o mas taas kay sa Lanr1 o AnMan genotypes), sama sa Boregine (P value < 0.0001 para sa duha ka parameter), Bojar (P value < 0.0001 para sa score ug 0.001 para sa gibug-aton sa tanom) ug Population B-549/79b (P value < 0.0001 para sa score ug dili significant para sa gibug-aton). Makapainteres nga ang pipila ka mga linya sa NLL nga walay bisan unsang "resistant" nga marker allele nagpakita og taas nga lebel sa resistensya sa anthracnose (itandi o mas taas kay sa Lanr1 o AnMan genotypes), sama sa Boregine (P value < 0.0001 para sa duha ka parameter), Bojar (P value < 0.0001 para sa score ug 0.001 para sa gibug-aton sa tanom) ug Population B-549/79b (P value < 0.0001 para sa score ug dili significant para sa gibug-aton). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокний урость антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 o AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для проба), Boregine (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) ug популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Makapainteres, daghang mga linya sa NLL nga walay bisan unsang 'resistant' marker allele ang nagpakita og taas nga lebel sa resistensya sa anthracnose (itandi o mas taas kaysa sa Lanr1 o AnMan genotypes), sama sa Boregine (P value < 0.0001 para sa duha ka parameter), Bojar (P value < 0.0001 para sa ebalwasyon ug 0.001 para sa gibug-aton sa tanom) ug populasyon nga B-549/79b (P value < 0.0001 para sa ebalwasyon ug dili significant para sa gibug-aton).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性性病抗性基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显。 Makapainteres nga ang ubang mga sistema sa NLL nga walay bisan unsang "antigenic" markers nagpakita og taas nga horizontal resistance (katumbas sa Lanr1 o AnMan genes o mas taas pa), sama sa Boregine (parehong parameters nga P < 0.0001), Bojar (P value < 0.0001, plant weight 0.001) ug strain B-549/79b (P value < 0.0001, weight not significant). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уроикич антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 o AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001, Bojar <0,0001), Boregine масса растения 0,001) ug популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Makapainteres, ang ubang mga linya sa NLL nga walay bisan unsang 'resistance' marker alleles nagpakita og taas nga lebel sa anthracnose resistance (itandi o mas taas kay sa Lanr1 o AnMan genotypes), sama sa Boregine (P value para sa duha ka parameter <0.0001), Bojar (P-value < 0.0001, gibug-aton sa tanom 0.001) ug populasyon B-549/79b (P-value < 0.0001, gibug-aton dili significant).Kini nga panghitabo nagsugyot sa posibilidad sa usa ka bag-ong genetic nga tinubdan sa resistensya, nga nagpatin-aw sa naobserbahan nga kakulang sa korelasyon tali sa mga marker genotype ug mga phenotype sa sakit (P values ​​​​gikan sa ~0.42 hangtod ~0.98). Busa, ang Kolmogorov-Smirnov test nagpakita nga ang datos sa resistensya sa anthracnose halos normal nga giapod-apod alang sa mga iskor (P-values ​​​​0.25 ug 0.11) ug masa sa tanum (P-values ​​​​0.47 ug 0.55), nga nagsugyot nga ako nag-hypothesize nga mas daghang alleles kaysa Lanr1 ug AnMan ang nalambigit.
Base sa resulta sa anthracnose resistance screening, 4 ka linya ang gipili para sa transcriptome analysis: 83A:476, Boregine, Mandelup, ug Population 22660. Kini nga mga linya gisulayan pag-usab para sa anthrax resistance sa mga inoculation experiments pinaagi sa RNA sequencing, basta parehas ra kini sa miaging pagsulay. Ang score values ​​mao ang mosunod: Boregin (1.71 ± 1.39), 83A: 476 (2.09 ± 1.38), Mandelup (3.82 ± 1.42) ug populasyon 22660 (6.11 ± 1.29).
Ang Illumina NovaSeq 6000 protocol nakab-ot ang aberids nga 40.5 ka Mread pairs kada sample (29.7 ngadto sa 54.4 ka Mreads) (Supplementary Table S3). Ang mga alignment scores sa reference sequence gikan sa 75.5% ngadto sa 88.6%. Ang aberids nga correlation sa read count data tali sa experimental variants tali sa biological replicates gikan sa 0.812 ngadto sa 0.997 (mean 0.959). Sa 35,170 ka genes nga gisusi, 2917 ang walay gipakita nga ekspresyon, ug ang laing 4785 ka genes gipahayag sa gamay ra nga lebel (base mean < 5). Sa 35,170 ka genes nga gisusi, 2917 ang walay gipakita nga ekspresyon, ug ang laing 4785 ka genes gipahayag sa gamay ra nga lebel (base mean < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 walay проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались темурон (базовое среднее <5). Sa 35,170 ka gene nga gisusi, 2917 ang walay gipakita nga ekspresyon, ug ang nahibiling 4785 ka gene gipahayag sa gamay ra nga lebel (base mean <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以忽略可以忽略不计5).35,170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 walay экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительнсубю среднее значение <5). Sa 35,170 ka gene nga gisusi, 2917 ang wala ma-express ug ang nahibiling 4785 ka gene adunay gamay ra nga expression (base mean <5).Busa, ang gidaghanon sa mga gene nga gikonsiderar nga gipahayag (base mean ≥ 5) atol sa eksperimento kay 27,468 (78.1%) (Supplementary Table S4).
Sukad sa unang higayon, ang tanang linya sa NLL mitubag sa inoculation sa C. lupini (strain Col-08) pinaagi sa pag-reprogram sa transcriptome (Table 1), bisan pa, adunay nakitang dakong kalainan tali sa mga linya. Busa, ang resistance line 83A:476 (nga nagdala sa Lanr1 gene) nagpakita og dakong transcriptome reprogramming sa unang higayon (6 hpi) nga adunay 31-69 ka pilo nga pagtaas sa gidaghanon sa isolated up- ug down-genes kon itandi sa ubang time points niining higayona. Dugang pa, kini nga peak mubo ra ang gidugayon, tungod kay ang expression sa pipila lang ka genes ang nagpabilin nga dakong nausab sa ikaduhang higayon (12 hpi). Makapainteres, ang Boregine, nga nagpakita usab og taas nga lebel sa resistance sa graft test, wala moagi sa ingon ka dako nga transcriptional reprogramming atol sa eksperimento. Bisan pa, ang gidaghanon sa differentially expressed genes (DEG) parehas ra para sa Boregine ug 83A:476 sa 12 HPI. Ang Mandelup ug ang populasyon nga 22660 parehong nagpakita sa mga kinatas-ang DEG sa katapusang punto sa panahon (48 l/s), nga nagpakita sa usa ka relatibong pagkalangan sa mga tubag sa depensa.
Tungod kay ang 83A:476 gipailalom sa dakong transcriptome reprogramming isip tubag sa C. lupini sa 6 HPI kon itandi sa tanang ubang linya, ~91% sa mga DEG nga naobserbahan niining panahona kay lineage-specific (Fig. 1). Bisan pa, adunay pipila ka overlap sa mga sayo nga tubag tali sa mga linya sa pagtuon, tungod kay ang 68.5%, 50.9%, ug 52.6% DEG sa Boregine, Mandelup, ug populasyon 22660, matag usa, nag-overlap sa mga nakit-an sa 83A:476 sa pipila ka mga punto sa panahon. Bisan pa, kini nga mga DEG naglangkob lamang sa gamay nga bahin (0.97–1.70%) sa tanang DEG nga karon nakit-an gamit ang 83A:476. Dugang pa, 11 ka DEG gikan sa tanang linya ang nagkahiusa niining panahona (Supplementary Tables S4-S6), lakip ang komon nga mga sangkap sa mga tubag sa depensa sa tanom: lipid transfer protein (TanjilG_32225), endoglucan-1,3-β-glucoside enzyme (TanjilG_23384), duha ka stress-inducible protein sama sa SAM22 (TanjilG_31528 ug TanjilG_31531), basic latex protein (TanjilG_32352), ug duha ka glycine-rich structural cell wall protein (TanjilG_19701 ug TanjilG_19702). Adunay usab medyo taas nga overlap sa mga tubag sa transcriptome tali sa 83A:476 ug Boregine sa 24 HPI (total 16-38% DEG) ug tali sa Mandelup ug Population 22660 sa 48 HPI (total 14-20% DEG).
Usa ka Venn diagram nga nagpakita sa gidaghanon sa differentially expressed genes (DEG) sa narrow-leaved lupine (NLL) lines nga gi-inoculate sa Colletotrichum lupini (strain Col-08 nga nakuha gikan sa mga lupine field sa Wierzhenice, Poland, 1999). Ang mga NLL lines nga gisusi mao ang: 83A:476 (resistant, nagdala sa Lanr1 allele), Boregine (resistant, wala mahibal-i ang genetic background), Mandelup (moderately resistant, nagdala sa AnMan allele) ug populasyon nga 22660 (very susceptible). Ang abbreviation hpi nagpasabot og mga oras human sa pagbakuna. Ang zero nga mga kantidad gikuha aron pasimplehon ang graph.
Ang hugpong sa mga overexpressed genes sa 6 hpi gisusi alang sa presensya sa canonical R gene domains (Supplementary Table S7). Kini nga pagtuon nagpadayag sa transcriptome induction sa classic disease resistance genes nga adunay NBS-LRR domains lamang sa 83A:476. Kini nga hugpong gilangkoban sa usa ka TIR-NBS-LRR gene (tanjilg_05042), lima ka CC-NBS-LRR genes (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, ug tanjilg_16162), ug Upat ka NBS-LR, Tanjilg_16162), ug Upat ka NBS-LRRE (tanjilg_16162) ingon man Upat ka NBS-Lrr (tanjilg_16162) ug Upat ka NBS-LRR (TANJILG_16162). Kining tanan nga mga gene adunay canonical domains nga gihan-ay sa conserved sequences. Gawas pa sa mga NBS-LRR domain genes, daghang RLL kinases ang gi-activate sa 6 hpi, nga mao ang usa sa Boregine (TanjilG_19877), duha sa Mandelup (TanjilG_07141 ug TanjilG_19877) ug sa populasyon nga 22660 (TanjilG_09014 ug TanjilG_10361) ug duha sa 83A 27:476.
Ang mga gene nga adunay dakong kausaban sa ekspresyon isip tubag sa pagbakuna gamit ang C. lupini (strain Col-08) gipailalom sa Gene Ontology (GO) enrichment analysis (Supplementary Table S8). Ang labing kanunay nga girepresentahan nga termino sa proseso sa biyolohikal mao ang "GO:0006952 defense response" nga nagpakita sa 6 sa 16 (time × line) nga mga kombinasyon nga adunay taas nga kamahinungdanon (P value < 0.001) (Fig. 2). Ang labing kanunay nga girepresentahan nga termino sa proseso sa biyolohikal mao ang "GO:0006952 defense response" nga nagpakita sa 6 sa 16 (time × line) nga mga kombinasyon nga adunay taas nga kamahinungdanon (P value < 0.001) (Fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный отверт» 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Ang labing kanunay nga girepresentahan nga termino sa proseso sa biyolohikal mao ang 'GO:0006952 defense response', nga makita sa 6 sa 16 (time × lineage) nga mga kombinasyon nga adunay taas nga significance (P value < 0.001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（时间（时间）一们一们一一一么一一一一么一一上一一一一一一一一一么一一间个中，具有高显着性（P ‼< 0.001）（图2）。 Ang labing representante nga termino sa proseso sa biyolohikal mao ang "GO:0006952 defense response", nga makita sa 6 sa 16 (时间×线) nga mga kombinasyon, nga adunay taas nga kamahinungdanon (P value < 0.001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», котовлыл 6 позля 6 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Ang labing kanunay nga girepresentahan nga termino sa proseso sa biyolohikal mao ang 'GO:0006952 Defense Response', nga makita sa 6 sa 16 ka kombinasyon (time × line) nga adunay taas nga kamahinungdanon (P value < 0.001) (Fig. 2).Kini nga termino sobra nga girepresentahan sa duha ka punto sa panahon sa 83A: 476 ug Boregine (6 ug 24 hpi) ug sa usa ka punto sa panahon sa Mandelup ug Population 22660 (12 ug 6 hpi, matag usa). Kini usa ka gilauman nga resulta, nga nagpasiugda sa antifungal nga tubag sa mga resistensyado nga linya. Dugang pa, ang 83A:476 mitubag sa C. lupini pinaagi sa paspas nga pag-induce sa mga gene nga may kalabutan sa oxidative burst nga girepresentahan sa termino nga "GO:0055114 redox process", nga nagpakita sa usa ka piho nga tubag sa depensa, samtang ang Boregine nagpadayag sa piho nga mga tubag sa depensa, nga may kalabutan sa termino nga 'GO'. :0006950 Tubag sa stress”. Ang populasyon 22660 nagpaaktibo sa horizontal resistance response nga naglambigit sa mga secondary metabolite, nga nagpasiugda sa sobra nga gidaghanon sa mga termino nga "GO:0016104 Proseso sa triterpene biosynthesis" ug "GO:0006722 Proseso sa triterpene metabolism" (parehong termino nahisakop sa parehas nga hugpong sa mga gene), nga gikonsiderar ang mga resulta sa GO term enrichment analysis, ang kalig-on sa reaksyon sa Mandelup naa tali sa Boregine ug Populasyon 22660. Dugang pa, ang sayo nga reaksyon 83A:476 (6 hpi) ug nalangan nga reaksyon nga Mandelup ug Populasyon 22660 naglakip sa termino nga GO:0015979 'photosynthesis' ug uban pang may kalabutan nga mga proseso sa biyolohikal.
Ang mga termino sa bioprocess gene ontology nga gipili sa anotasyon sa lain-laing gipahayag nga mga gene atol sa mga tubag sa transcriptome sa narrow-leaved lupine (NLL) nga gi-inoculate og anthrax lupine (Col-08 strain nga nakuha gikan sa mga umahan sa lupine sa Wierzhenice, Poland, niadtong 1999) gipasobrahan pag-ayo. Ang mga linya sa NLL nga gisusi mao ang: 83A:476 (resistant, nga nagdala sa homozygous Lanr1 allele), Boregine (resistant, wala mahibal-i nga genetic background), Mandelup (moderately resistant, nga nagdala sa homozygous AnMan allele) ug populasyon 22660 (susceptible).
Tungod kay kini nga pagtuon nagtumong sa pag-ila sa mga gene nga nakatampo sa resistensya sa anthracnose, ang mga gene nga gi-assign sa mga termino nga GO nga "GO: 0006952 Defensive responses" ug "GO: 0055114 Redox processes" gi-analisa gamit ang mga cut-off tungod kay ang baseline means ≥ 30 nga adunay labing menos usa ka linya. × point in time nga naghiusa sa statistically significant values ​​​​sa log2 (fold change). Ang gidaghanon sa mga gene nga nakab-ot kini nga mga criteria kay 65 para sa GO:0006952 ug 524 para sa GO:0055114.
Ang 83A:476 nagbutyag ug duha ka DEG peak nga gimarkahan og termino nga GO:0006952, ang una sa 6 ka gene kada pulgada (64 ka gene, pataas ug paubos nga regulasyon) ug ang ikaduha sa 24 ka gene kada pulgada (15 ka gene, pataas nga regulasyon lamang). Gipakita usab sa Boregine nga ang GO:0006952 nakaabot sa kinapungkayan sa samang punto sa oras, apan adunay gamay nga DEG (11 ug 8) ug preferential activation. Ang Mandeloop nagpakita ug duha ka peak sa GO:0006952 sa 12 ug 48 ka HPI, parehong nagdala ug 12 ka gene (ang una nga adunay activating genes, ug ang ikaduha nga adunay suppressive genes lamang), samtang ang 22660 nga populasyon sa 6 ka HPI (13 ka genes) adunay mas dakong dominasyon sa pagtaas sa peak regulation. Kinahanglan matikdan nga 96.4% sa GO:0006952 DEG niining mga peak adunay parehas nga klase sa tubag (pataas o paubos), nga nagpakita sa usa ka hinungdanon nga overlap sa mga tubag sa depensa bisan pa sa mga kalainan sa gidaghanon sa mga gene nga nalambigit. Ang pinakadako nga grupo sa mga han-ay nga may kalabotan sa termino nga GO:0006952 nag-encode sa Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-like), nga nahisakop sa class 10 pathogenesis-associated protein (PR-10) protein clade ug sa core protein latex. susamang (MLP-like) protein) protein (Fig. 3). Ang duha ka grupo managlahi sa kinaiya sa ekspresyon ug sa direksyon sa tubag. Ang mga gene nga nag-encode sa mga protina nga sama sa SAM22 nagpakita og makanunayon ug hinungdanon nga induction sa sayo nga mga punto sa oras (6 o 12 hpi) ug kasagaran wala’y tubag sa katapusan sa eksperimento (48 hpi), samtang ang mga protina nga sama sa MLP nagpakita og koordinasyon sa 6 hpi. hpi. 83A:476 ug Mandelup sa 48 hp/in, halos tanan nga ubang mga punto sa datos wala’y tubag. Dugang pa, ang mga kalainan sa mga profile sa ekspresyon sa mga gene sa protina nga sama sa SAM22 nagsunod sa naobserbahan nga pagkalainlain sa resistensya sa anthracnose, tungod kay ang mas resistensyado nga mga linya adunay daghang mga punto sa oras nga hinungdanon nga nag-induce niini nga mga gene kaysa sa mas dali nga mataptan nga mga gene. Laing LlR18A/B-like nga PR-10 gene nagpakita ug susama kaayong sumbanan sa ekspresyon sa SAM22-like nga protina nga gene.
Ang mga nag-unang sangkap sa termino sa proseso sa biyolohiya nga "GO:0006952 Defense Response" ug ang mga sumbanan sa ekspresyon sa mga kandidato nga gene sa mga alleles sa Lanr1 ug AnMan giila. Ang sukdanan sa Log2 nagrepresentar sa mga kantidad sa log2 (pagbag-o sa pilo) taliwala sa mga tanom nga gi-inoculate (Colletotrichum lupini, strain Col-08, nga nakuha gikan sa mga umahan sa lupine, Wizhenica, Poland, 1999) ug kontrol (sham-inoculated) sa parehas nga oras. Ang mosunod nga mga linya sa narrowleaf lupine gisusi: 83A:476 (resistant, nagdala sa homozygous Lanr1 allele), Boregine (resistant, wala mahibal-i ang genetic background), Mandelup (moderately resistant, nagdala sa homozygous AnMan allele), ug Populasyon 22660 (susceptible).
Dugang pa, ang mga expression profile sa RNA-seq candidate genes nga Lanr1 (TanjilG_05042) ug AnMan (TanjilG_12861) gisusi (Fig. 3). Ang TanjilG_05042 gene nagpakita og significant response (activation) sa 83A:476 sa unang time point lang (6 hpi), samtang ang TanjilG_12861 significant sa Mandeloop sa duha lang ka time points: 6 hpi (down regulation) ug 24 hpi (6 hpi). Uban sa.). adjustable) ).
Ang mga gene nga labing gi-overexpress sa terminong GO:0055114 nga “redox process” mao ang mga gene nga nag-encode sa cytochrome P450 proteins ug peroxidase (Fig. 4). Para sa mga sample nga nahimulag gikan sa 83A:476 sa 6 HPI, ang maximum o minimum nga log2 (fold change) nga mga kantidad (para sa 86.6% sa mga gene) kasagarang naobserbahan tali sa mga gi-inoculate ug control nga mga tanom, nga nagpakita sa taas nga tubag niini nga genotype sa pag-inoculate sa sex. Ang 83A:476 nagpakita sa labing hinungdanon nga GO: 0055114 DEG sa 6 hpi (503 genes), samtang ang nahabilin nga mga linya sa 48 hpi (Boregine, 31 genes; Mandelup, 85 genes; ug Population 22660, 78 genes)). Sa kadaghanan sa mga gene sa pamilyang GO:0055114, duha ka klase sa tubag sa pagbakuna (activation ug inhibition) ang naobserbahan. Makapainteres, hangtod sa 97.6% sa mga DEG nga giila alang sa termino nga GO: 0055114 sa Mandelupe sa 48 hp. Kini nga mga obserbasyon nagsugyot nga, bisan pa sa mas gamay nga sukod (ie, ang gidaghanon sa mga mutated redox genes, 85 batok sa 503), ang sumbanan sa nalangan nga mga tubag sa transcriptome sa mandeloup ngadto sa anthracnose susama sa sayo nga tubag sa 83A:476. Sa Boregine ug Population 22660, kini nga panagtagbo mas ubos sa 51.6% ug 75.6%, matag usa.
Ang mga sumbanan sa ekspresyon sa mga nag-unang sangkap sa termino sa prosesong biyolohikal nga "GO:0055114 Redox process" gipadayag. Ang Log2 scale nagrepresentar sa mga kantidad sa log2 (pagbag-o sa pilo) taliwala sa mga tanom nga gi-inoculate (Colletotrichum lupini, strain Col-08, nga nakuha gikan sa mga umahan sa lupine, Wizhenica, Poland, 1999) ug kontrol (sham-inoculated) sa parehas nga oras. Ang mosunod nga mga linya sa narrowleaf lupine gisusi: 83A:476 (resistant, nagdala sa homozygous Lanr1 allele), Boregine (resistant, wala mahibal-i ang genetic background), Mandelup (moderately resistant, nagdala sa homozygous AnMan allele), ug Populasyon 22660 (susceptible).
83A:476 Ang mga tubag sa transcriptomic sa inoculation gamit ang C. lupini (strain Col-08) naglakip usab sa koordinado nga pagpahilom sa mga gene nga gipahinungod sa termino nga GO:0015979 nga "photosynthesis" ug uban pang may kalabutan nga mga proseso sa biyolohikal (FIG. 5). Kini nga set sa GO:0015979 DEG adunay sulud nga 105 ka mga gene nga napugngan pag-ayo sa 6 hpi sa 83A:476. Niini nga subset, 37 ka mga gene ang gipaubos usab sa Mandelup sa 48 HPI ug 35 sa parehas nga punto sa oras sa 22660 nga populasyon, lakip ang 19 ka DEG nga komon sa duha ka genotype. Walay mga DEG nga may kalabutan sa termino nga GO: 0015979 ang naaktibo pag-ayo sa bisan unsang kombinasyon (linya x oras).
Ang mga sumbanan sa ekspresyon sa mga nag-unang sangkap sa termino sa prosesong biyolohikal nga "GO:0015979 Photosynthesis" gipadayag. Ang Log2 scale nagrepresentar sa mga kantidad sa log2 (pagbag-o sa pilo) taliwala sa mga tanom nga gi-inoculate (Colletotrichum lupini, strain Col-08, nga nakuha gikan sa mga umahan sa lupine, Wizhenica, Poland, 1999) ug kontrol (sham-inoculated) sa parehas nga oras. Ang mosunod nga mga linya sa narrowleaf lupine gisusi: 83A:476 (resistant, nagdala sa homozygous Lanr1 allele), Boregine (resistant, wala mahibal-i ang genetic background), Mandelup (moderately resistant, nagdala sa homozygous AnMan allele), ug Populasyon 22660 (susceptible).
Base sa mga resulta sa differential expression analysis ug gituohang nalambigit sa mga tubag sa depensa batok sa pathogenic fungi, kini nga hugpong sa pito ka genes gipili alang sa pagkwenta sa mga expression profile pinaagi sa real-time PCR (Supplementary Table S9).
Ang gituohang protein gene nga TanjilG_10657 na-induce og dako sa tanang gitun-an nga linya ug time points kon itandi sa control (mimic) nga mga tanom (Supplementary Tables S10, S11). Dugang pa, ang expression profile sa TanjilG_10657 nagpakita og nagkataas nga trend sa tibuok eksperimento para sa tanang linya. Ang populasyon nga 22660 nagpakita sa pinakataas nga sensitivity sa TanjilG_10657 sa inoculation nga adunay 114-fold activation ug ang pinakataas nga relative expression level (4.4 ± 0.4) sa 24 HPI (Fig. 6a). Ang PR10 LlR18A protein gene nga TanjilG_27015 nagpakita usab og activation sa tanang linya ug time points, nga adunay statistical significance sa kadaghanan sa data points (Fig. 6b). Sama sa TanjilG_10657, ang pinakataas nga relative expression level sa TanjilG_27015 naobserbahan sa 22660 nga inoculated population sa 24 HPI (19.5 ± 2.4). Ang acid endochitinase gene nga TanjilG_04706 miusbaw pag-ayo sa tanang linya ug sa tanang oras gawas sa Boregine 6 hpi (Fig. 6c). Kusganon kining gi-induce sa unang oras (6 HPI) sa 83A:476 (sa 10.5 ka pilo) ug kasarangang misaka sa ubang linya (sa 6.6-7.5 ka pilo). Atol sa eksperimento, ang ekspresyon sa TanjilG_04706 nagpabilin sa parehas nga lebel sa 83A:476 ug Boregine, samtang sa Mandelup ug Population 22660 kini miusbaw pag-ayo, nga nakaabot sa medyo taas nga mga kantidad (5.9 ± 1.5 ug 6.2 ± 1.5, matag usa). Ang endoglucan-1,3-β-glucosidase-like gene nga TanjilG_23384 nagpakita og taas nga activation sa unang duha ka oras (6 ug 12 hpi) sa tanang linya gawas sa populasyon 22660 (Fig. 6d). Ang pinakataas nga relatibong lebel sa ekspresyon sa TanjilG_23384 naobserbahan sa ikaduhang punto sa oras (12 hpi) sa Mandelup (2.7 ± 0.3) ug 83A:476 (1.5 ± 0.1). Sa 24 HPI, ang ekspresyon sa TanjilG_23384 medyo ubos sa tanang gitun-an nga linya (gikan sa 0.04 ± 0.009 ngadto sa 0.44 ± 0.12).
Mga profile sa ekspresyon sa piniling mga gene (ag) nga gipakita pinaagi sa quantitative PCR. Ang mga numero nga 6, 12 ug 24 nagrepresentar sa mga oras human sa pagbakuna. Ang mga gene nga LanDExH7 ug LanTUB6 gigamit alang sa normalization ug ang LanTUB6 gigamit alang sa inter-series calibration. Ang mga error bar nagrepresentar sa standard deviation base sa tulo ka biological replicates, nga ang matag usa mao ang average sa tulo ka technical replicates. Ang istatistikal nga kamahinungdanon sa mga kalainan sa lebel sa ekspresyon tali sa mga tanom nga gi-inokulate (Colletotrichum lupini, strain Col-08, nga nakuha niadtong 1999 gikan sa umahan sa lupin sa Wierzenica, Poland) ug kontrol (mock-inoculated) gimarkahan sa ibabaw sa mga punto sa datos (*P value < 0.05, **P value ≤ 0.01, ***P value ≤ 0.001). Ang istatistikal nga kamahinungdanon sa mga kalainan sa lebel sa ekspresyon tali sa mga tanom nga gi-inokulate (Colletotrichum lupini, strain Col-08, nga nakuha niadtong 1999 gikan sa umahan sa lupin sa Wierzenica, Poland) ug kontrol (mock-inoculated) gimarkahan sa ibabaw sa mga punto sa datos (*P value < 0.05, **P value ≤ 0.01, ***P value ≤ 0.001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен ля г. 999 г. в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*знач0,ние P. 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Ang mga kalainan sa lebel sa ekspresyon tali sa mga tanom nga gi-inoculate (Colletotrichum lupini, strain Col-08, nga nakuha niadtong 1999 gikan sa usa ka umahan sa lupine sa Wierzhenice, Poland) ug kontrol (sham-inoculated) nakita sa ibabaw sa mga punto sa datos (*P value < 0.05, **P-value ≤ 0.01, ***P-value ≤ 0.001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据為0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （ 接秗水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001). Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученплый спол. Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками (*, низих ден, 5 ** данныч P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Ang mga kalainan sa lebel sa ekspresyon tali sa mga tanom nga gi-inoculate (Colletotrichum lupini, strain Col-08, nga nakuha gikan sa mga umahan sa lupine sa Verzhenice, Poland, niadtong 1999) ug kontrol (sham-inoculated) nakita sa ibabaw sa mga punto sa datos (*P value < 0.05, **P-value ≤ 0.01, ***P-value ≤ 0.001).Ang mga linya sa NLL nga gisusi mao ang: 83A:476 (resistant, nga nagdala sa homozygous Lanr1 allele), Mandelup (moderately resistant, nga nagdala sa homozygous AnMan allele), Boregine (resistant, wala mahibal-i nga genetic background) ug populasyon 22660 (susceptible).
Ang kandidato nga gene nga TanjilG_05042 sa Lanr1 locus nagpakita og lahi kaayo nga sumbanan sa ekspresyon gikan sa mga profile nga nakuha gikan sa mga pagtuon sa RNA-seq (Fig. 6e). Ang dakong pagpaaktibo niini nga gene naobserbahan sa Mandelup ug sa populasyon sa 22660 (hangtod sa 39.7 ug 11.7 ka beses, matag usa), nga miresulta sa medyo taas nga lebel sa ekspresyon (hangtod sa 1.4 ± 0.14 ug 7.2 ± 1.3, matag usa). Ang 83A:476 nagpadayag usab og pipila ka pag-usbaw sa gene sa TanjilG_05042 (hangtod sa 3.8 ka pilo), bisan pa, ang relatibong lebel sa ekspresyon nga nakab-ot (0.044 ± 0.002) labaw pa sa 30 ka pilo nga mas ubos kaysa sa naobserbahan sa Mandelup ug sa populasyon sa 22660. Ang gisusi gamit ang qPCR nagpakita og dakong kalainan sa lebel sa ekspresyon tali sa mga genotype sa mga mock-vaccinated (kontrol) nga mga variant, nga nakaabot sa 58 ka pilo nga kalainan tali sa mga populasyon nga 22660 ug 83A:476, ingon man tali sa mga populasyon nga 22660 ug 22660. Duha ka pilo nga kalainan ang nakab-ot tali sa Boregine ug Mandalup.
Ang kandidato nga gene sa AnMan locus, ang TanjilG_12861, gi-activate isip tubag sa pagbakuna sa 83A:476 ug Mandelup, neyutral sa populasyon sa 22660, ug gipaubos sa Boregine (Fig. 6f). Ang relatibong ekspresyon sa gene sa TanjilG_12861 mao ang pinakataas sa inoculated 83A: 476 (0.14±0.01). Ang 17.4 kDa class I heat shock protein gene nga TanjilG_05080 HSP17.4 nagpakita og mas ubos nga relatibong lebel sa ekspresyon sa tanang gitun-an nga mga strain ug mga time point (Fig. 6g). Ang pinakataas nga bili naobserbahan sa 24 HPI sa populasyon sa 22660 (0.14 ± 0.02, usa ka walo ka pilo nga pagtaas sa tubag sa pagbakuna).
Ang pagtandi sa mga profile sa ekspresyon sa gene (Fig. 7) nagpadayag ug taas nga korelasyon tali sa TanjilG_10657 ug upat pa ka gene: TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.80), ug TanjilG_04706 (r = 0.79). Ang maong mga resulta mahimong magpakita sa co-regulation niining mga gene atol sa mga tubag sa depensa. Ang mga gene sa TanjilG_12861 ug TanjilG_23384 nagpakita ug lain-laing mga profile sa ekspresyon nga adunay mas ubos nga mga kantidad sa Pearson correlation coefficient (gikan sa 0.08 ngadto sa 0.43 ug -0.19 ngadto sa 0.28, matag usa) kon itandi sa ubang mga gene.
Ang mga korelasyon tali sa mga profile sa ekspresyon sa gene nakita gamit ang quantitative PCR. Ang mosunod nga mga linya sa narrowleaf lupine gisusi: 83A:476 (resistant, nagdala sa homozygous Lanr1 allele), Mandelup (moderately resistant, nagdala sa homozygous AnMan allele), Boregine (resistant, wala mahibal-i ang genetic background), ug Population 22660 (susceptible). Tulo ka time point ang gikalkulo (6, 12 ug 24 oras human sa inoculation), lakip ang inoculated (Colletotrichum lupini, strain Col-08, nga nakuha gikan sa mga umahan sa lupine sa Wierzhenice, Poland, niadtong 1999) ug control (sham-inoculated) nga mga tanom. Ang sukdanan nagpakita sa bili sa Pearson correlation coefficient.
Base sa datos nga nakuha sa 6 horsepower kada pulgada, ang WGCNA gihimo sa 9981 DEG nga giila pinaagi sa pagtandi sa mga inoculated ug control plant aron mag-focus sa sayo nga mga tubag sa depensa (Supplementary Table S12). Baynte dos ka gene modules (clusters) ang nakit-an nga adunay correlated (positibo o negatibo) nga mga expression profile tali sa mga genotype ug experimental variants. Sa aberids, ang lebel sa ekspresyon sa gene mikunhod sa han-ay nga 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasyon 22660 (apan sa duha ka variant, kini nga uso mas kusog sa mga tanom nga kontrol). Sa aberids, ang lebel sa ekspresyon sa gene mikunhod sa han-ay nga 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasyon 22660 (apan sa duha ka variant, kini nga uso mas kusog sa mga tanom nga kontrol). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasyon 22660 сильнее у контрольных растений). Sa aberids, ang lebel sa ekspresyon sa gene mikunhod sa han-ay nga 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasyon 22660 (apan sa duha ka variant, kini nga uso mas kusog sa mga tanom nga kontrol).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasyon 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> populasyon 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 在 种 中植物 中 更） . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 контрольных растений). Sa aberids, ang lebel sa ekspresyon sa gene mikunhod sa serye nga 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasyon 22660 (bisan pa, sa duha ka variant, kini nga uso mas kusog sa mga tanom nga kontrol).Ang pagbakuna miresulta sa pagsaka sa gene expression, labi na sa mga module 18, 19, 14, 6 ug 1 (sa paubos nga han-ay sa epekto), negatibo nga regulasyon (pananglitan modules 9 ug 20) o adunay neutral nga mga epekto (pananglitan modules 11, 22, 8 ug 13). Ang GO term enrichment analysis (Supplementary Table S13) nagpadayag sa "GO: 0006952 Protective responses" para sa inoculated module (18) nga adunay pinakataas nga activation, lakip ang mga gene nga gisusi sa qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 ug TanjilG_27015), ingon man daghang Inoculate nga labing gipugngan nga photosynthesis modules (9). Ang Module 18 concentrator (Fig. 8) giila nga TanjilG_26536 gene nga nag-encode sa PR-10-like LlR18B protein, ug ang module 9 concentrator giila nga TanjilG_28955 gene nga nag-encode sa photosystem II PsbQ protein. Usa ka candidate anthracnose resistance gene nga Lanr1, TanjilG_05042, nakit-an sa module 22 (Fig. 9) ug nalangkit sa mga termino nga “GO:0044260 Cellular macromolecular metabolic processes” ug “GO:0006355 Transcriptional regulation, DNA templating” nga nagdala sa TanjilG_01212 hub. Ang gene nag-encode sa heat stress transcription factor A-4a (HSFA4a).
Ang weighted network analysis sa gene co-expression sa mga module nga adunay sobra nga girepresentahan nga biological process terms nga "GO: 0006952 Defense responses". Gipasimple ang ligation aron ipasiugda ang upat ka gene nga gisusi sa qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 ug TanjilG_27015).
Gitimbang nga pag-analisa sa network sa gene co-expression sa usa ka module nga adunay sobra nga girepresentahan nga biological process term nga "GO: 0006355: Transcriptional regulation, DNA templating" ug nagdala sa usa ka kandidato nga anthracnose resistance gene nga Lanr1 TanjilG_05042. Gipasimple ang ligation aron ibulag ang TanjilG_05042 gene ug ang sentral nga TanjilG_01212 gene.
Ang screening sa resistensya sa anthracnose nga nakolekta sa Australia nagpakita nga kadaghanan sa mga unang gipagawas nga cultivars daling mataptan; Ang Kalya, Coromup ug Mandelup gihulagway nga kasarangan nga resistensya, samtang ang Wonga, Tanjil ug 83A:476 gihulagway nga taas og resistensya26,27,31. adunay parehas nga resistance allele, nga gitawag og Lanr1, ug ang Coromup ug Mandelup adunay lahi nga allele, nga gitawag og AnMan10, 26, 39, samtang ang Kalya nagpasa og lahi nga allele., Lanr2. Ang screening para sa resistensya sa anthracnose sa Germany miresulta sa pag-ila sa usa ka resistensyado nga linya nga Bo7212 nga adunay kandidato nga allele gawas sa Lanr1, nga gitawag og LanrBo36.
Ang among pagtuon nagbutyag ug ubos kaayo nga frequency (mga 6%) sa Lanr1 allele sa gisulayan nga germplasm. Kini nga obserbasyon nahiuyon sa mga resulta sa screening sa East European germplasm gamit ang Anseq3 ug Anseq4 markers, nga nagpakita nga ang Lanr1 allele anaa lamang sa duha ka Belarusian lines. Kini nagsugyot nga ang Lanr1 allele wala pa kaylap nga gigamit sa mga lokal nga programa sa pagpasanay, dili sama sa Australia, diin kini usa sa mga importanteng alleles para sa marker-assisted breeding. Mahimo kini tungod sa mas ubos nga lebel sa resistensya nga gihatag sa Lanr1 allele sa mga kondisyon sa uma sa Europa kon itandi sa report sa Australia. Dugang pa, ang mga pagtuon sa anthracnose sa mga lugar nga taas ang ulan sa Australia nagpakita nga ang mga tubag sa resistensya nga gipaagi sa Lanr1 allele mahimong dili epektibo sa mga kondisyon sa panahon nga pabor sa pagtubo ug paspas nga pag-uswag sa pathogen19,42. Sa tinuud, sa karon nga pagtuon, ang pipila ka mga sintomas sa anthracnose naobserbahan usab sa mga genotype nga nagdala sa Lanr1 allele, nga nagsugyot nga ang resistensya mahimong mawala ubos sa labing maayo nga mga kondisyon para sa pag-uswag sa C. lupini. Dugang pa, posible ang mga sayop nga positibo nga interpretasyon sa presensya sa mga marker sa Anseq3 ug Anseq4, nga gibana-bana nga 1 cM gikan sa Lanr1 locus, 28,30,43.
Ang among pagtuon nagpakita nga ang 83A:476, nga nagdala sa Lanr1 allele, mitubag sa C. lupini inoculation gamit ang large-scale transcriptome reprogramming sa unang gisusi nga time point (6 hpi), samtang sa Mandelup, nga nagdala sa AnMan allele, ang transcriptomic responses naobserbahan sa ulahi (gikan sa 24 ngadto sa 48 hp). Kini nga mga temporal nga kalainan sa mga tubag sa depensa nalangkit sa mga kalainan sa mga sintomas sa sakit, nga nagpasiugda sa kamahinungdanon sa sayo nga pag-ila sa pathogen alang sa usa ka malampuson nga tubag sa resistensya. Aron mataptan ang tisyu sa tanom, ang mga spore sa anthrax kinahanglan nga moagi sa daghang mga yugto sa paglambo sa ibabaw sa host, lakip ang germination, cell division, ug pagporma sa usa ka appressorium. Ang appendage usa ka infective structure nga motapot sa ibabaw sa host ug mopadali sa pagsulod sa mga tisyu sa host. Busa, ang mga spore sa C. gloeosporioides sa pea extract nagpakita sa unang pagbahin sa nucleus human sa 75-90 minutos nga incubation, ang pagporma sa usa ka germ tube human sa 90-120 minutos, ug suppression human sa 4 ka oras 45. Ang Mango C. gloeosporioides nagpakita og sobra sa 40% nga conidial germination human sa 3 ka oras nga incubation ug mga 20% nga pagporma sa appressors human sa 4 ka oras. Ang virulence-associated CAP20 gene sa C. gloeosporioides nagpakita og transcriptional activity sa epiphyte-forming conidia human sa 3.5 ka oras nga incubation sa avocado surface wax nga adunay taas nga konsentrasyon sa CAP20 protein human sa 4 ka oras ug 46 ka minuto. Sa susama, ang kalihokan sa melanin biosynthesis genes sa C. trifolii na-induce atol sa 2 ka oras nga incubation gisundan sa pagporma sa appressorium human sa 1 ka oras. Ang mga pagtuon sa mga tisyu sa dahon nagpakita nga ang mga strawberry nga gi-inoculate og C. acutatum adunay unang suppression sa 8 hpi, samtang ang mga kamatis nga gi-inoculate og C. coccodes adunay unang suppression sa 4 hpi48,49. Kini kasagaran nahiuyon sa time scale sa Colletotrichum spp. infectious process. Ang paspas nga mga tubag sa depensa sa 83A:476 nagsugyot sa kalambigitan sa resistensya sa tanom ug mga gene sa effector-triggered immunity (ETI) niini nga linya, samtang ang nalangan nga mga tubag ni Mandelup nagsuporta sa micro-associated molecular pattern-triggered immunity (MTI) hypothesis 50. Sayo nga mga tubag sa 83A: 476 ug Mandelup. Ang partial overlap tali sa up- o down-regulated genes sa nalangan nga tubag nagsuporta usab niini nga konsepto, tungod kay ang ETI kanunay nga giisip nga usa ka gipadali ug gipauswag nga tubag sa MTI nga natapos sa programmed cell death sa lugar sa impeksyon, nga nailhan nga anaphylactic shock 51,52.
Kadaghanan sa mga gene nga gipahinungod sa sobra nga girepresentahan nga termino nga Gene Ontology GO:0006952 nga "Defense Response" mao ang 11 ka homologue sa stress-induced fasting message 22 protein (parehas sa SAM22) ug ang pito ka mayor nga latex protein-likes (MLPs). Ang -like proteins 31, 34, 43 ug 423 nagpakita og pagkaparehas sa han-ay. Ang mga SAM22-like genes nagpakita og dakong pagpaaktibo nga milungtad og mas dugay, nga nagpakita sa dugang nga lebel sa anthracnose resistance (83A:476 ug Boregine). Bisan pa, ang mga MLP-like genes gipaubos lamang sa mga linya nga nagdala sa candidate resistance allele (83A:476/Lanr1 sa 6 hpi ug Mandelup/AnMan sa 24 hpi). Kinahanglan nga matikdan nga ang tanan nga nailhan nga SAM22-like homologues naggikan sa usa ka gene cluster nga mikabat sa gibana-bana nga 105 kb, samtang ang mga MLP-like genes naggikan sa managlahing rehiyon sa genome. Ang koordinado nga pagpaaktibo sa ingon nga mga gene nga sama sa SAM22 nakit-an usab sa among miaging pagtuon sa resistensya sa NLL sa inoculation sa Diaporthetoxica, nga nagsugyot nga sila nalambigit sa pinahigda nga mga sangkap sa tubag sa depensa. Kini nga konklusyon gisuportahan usab sa mga taho sa positibo nga tubag sa mga gene nga sama sa SAM22 sa kadaot o pagtambal gamit ang salicylic acid, fungal inducers, o hydrogen peroxide.
Ang mga gene nga sama sa MLP napamatud-an nga motubag sa lainlaing mga abiotic ug biotic stress, lakip ang mga impeksyon sa bakterya, virus ug pathogenic fungal sa daghang mga espisye sa tanum55. Ang mga direksyon sa tubag sa pipila ka mga interaksyon tali sa mga tanum ug mga pathogen gikan sa kusog nga pagtaas (pananglitan, atol sa pag-atake sa gapas gamit ang Verticillium dahliae) hangtod sa hinungdanon nga pagkunhod (pananglitan, pagkahuman sa impeksyon sa punoan sa mansanas gamit ang Alternaria spp.)56,57. Ang hinungdanon nga pag-ubos sa MLP-like 423 gene naobserbahan atol sa mga depensa sa avocado sa impeksyon sa F. niger ug atol sa impeksyon sa punoan sa mansanas nga Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola ug Alternaria alternata mga apple pathotypes58,59. Dugang pa, ang apple calli nga sobra nga nagpahayag sa MLP-like 423 gene adunay mas ubos nga ekspresyon sa mga gene nga may kalabutan sa resistensya ug mas dali nga mataptan sa impeksyon sa fungal59. Pagkahuman sa Fusarium oxysporum f, ang MLP-like 423 gene gipugngan usab sa resistensyado nga common bean germplasm. cn. Impeksyon sa bean 60.
Ang ubang mga miyembro sa pamilyang PR-10 nga nailhan sa among RNA-seq nga pagtuon mao ang mga gene nga LlR18A ug LlR18B isip tubag sa upregulation, ingon man ang upregulated (1 gene) o downregulated (3 genes) nga gene para sa lipid transfer protein nga DIR1. Dugang pa, gipasiugda sa WGCNA ang gene nga LlR18B isip sentro niini nga module, nga dali ra kaayong mabakunahan ug adunay daghang protective response genes. Ang mga gene nga LlR18A ug LlR18B gi-induce sa mga dahon sa yellow lupine isip tubag sa pathogenic bacteria, ingon man sa mga punoan sa NLL human sa inoculation sa D. toxica, samtang ang homologue sa bugas niini nga mga gene, ang RSOsPR10, dali nga gi-induce sa usa ka fungal infection nga gituohang nalambigit sa jasmonic acid signaling pathway53,61, 62. Ang gene nga DIR1 nag-encode sa mga nonspecific lipid transport protein nga gikinahanglan para sa pagsugod sa systemic acquired resistance (SAR). Uban sa pag-uswag sa mga protective reactions, ang DIR1 protein gidala gikan sa focus sa impeksyon agi sa phloem aron ma-induce ang SAR sa lagyong mga organo. Makapainteres, ang TanjilG_02313 DIR1 gene na-induce pag-ayo sa unang higayon sa linya 84A:476 ug Population 22660, apan ang anthracnose resistance malampusong naugmad lamang sa linya 84A:476. Kini mahimong magpakita sa pipila ka subfunctionalization sa DIR1 gene sa NLL, tungod kay ang nahibiling tulo ka homologue mitubag sa inoculation lamang sa linya 83A:476 sa 6 hpi, ug kini nga tubag gipunting paubos.
Sa among pagtuon, ang labing komon nga mga sangkap nga katumbas sa prosesong biyolohikal nga gitawag og "GO:0055114 Redox process" mao ang cytochrome P450 protein, peroxidase, linoleic acid 9S-/13S-lipoxygenase, ug 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase. Dugang pa, ang among WGCNA naghubit sa HSFA4a homologue isip usa ka hub carrying modules sama sa Lanr1 resistance gene candidate nga TanjilG_05042. Ang HSFA4a usa ka sangkap sa redox-dependent regulation sa nuclear transcription sa mga tanom.
Ang mga protina sa Cytochrome P450 mga oxidoreductases nga nag-catalyze sa mga reaksyon sa hydroxylation nga nagsalig sa NADPH ug/o O2 sa panguna ug sekondaryang metabolismo, lakip ang metabolismo sa xenobiotics, ingon man mga hormone, fatty acid, sterol, mga sangkap sa cell wall, biopolymer, ug ang biosynthesis sa mga protective compound 69. Sa among Sa usa ka pagtuon, ang pagkalainlain sa function sa cytochrome P450 sa tanum mikunhod gikan sa -10.6 log2 (fold change) ngadto sa 5.7 tungod sa daghang gidaghanon sa giusab nga mga homologue (37) ug mga kalainan sa mga sumbanan sa tubag tali sa piho nga mga gene, nga nagpakita sa usa ka pataas nga rebisyon. . Ang paggamit lamang sa datos sa RNA-seq aron maklaro ang gituohan nga biological function sa mga gene sa NLL sa ingon ka dako nga superfamily sa protina mahimong espekulatibo kaayo. Bisan pa, angay nga matikdan nga ang pipila ka mga gene sa cytochrome P450 nalangkit sa dugang nga resistensya sa mga pathogenic fungi o bakterya, lakip ang usa ka kontribusyon sa mga reaksiyon sa alerdyi 69,70,71.
Ang Class III peroxidases kay mga multifunctional nga enzyme sa tanom nga nalambigit sa lain-laing mga proseso sa metabolismo atol sa pagtubo ug paglambo sa tanom, ingon man usab sa tubag sa mga stress sa palibot sama sa kaasinan, hulaw, kusog nga kahayag, ug pag-atake sa pathogen72. Ang mga peroxidases nalambigit sa interaksyon sa daghang mga espisye sa tanom uban sa Anthracis, lakip ang Stylosanthes humilis ug C. gloeosporioides, Lens culinaris ug C. truncatum, Phaseolus vulgaris ug C. lindemuthianum, Cucumis sativus ug C. lagenarium73,74,75,76. Ang tubag paspas kaayo, usahay bisan sa 4 HPI, sa dili pa makasulod ang fungus sa tisyu sa tanom73. Ang peroxidase gene mitubag usab sa inoculation sa D. toxica NLL. Gawas pa sa ilang tipikal nga mga gimbuhaton sa pag-regulate sa oxidative burst o pagwagtang sa oxidative stress, ang mga peroxidases mahimong makabalda sa pagtubo sa pathogen pinaagi sa paghimo og pisikal nga mga babag base sa pagpalig-on sa cell wall atol sa lignification, subunit o cross-linking sa mga piho nga compound. Kini nga gimbuhaton mahimong ikapasangil in silico sa TanjilG_03329 gene nga nag-encode sa usa ka putative lignin-forming anion peroxidase nga miusbaw pag-ayo sa among pagtuon sa 83A:476 resistant line sa 6 HPI, apan dili sa ubang mga strain ug time points nga wala motubag.
Ang 9S-/13S-lipoxygenase sa linoleic acid mao ang unang lakang sa oxidative pathway sa lipid biosynthesis78. Ang mga produkto niini nga pathway adunay daghang mga gimbuhaton sa depensa sa tanom, lakip ang pagpalig-on sa cell wall pinaagi sa pagporma sa callose ug pectin deposits, ug regulasyon sa oxidative stress pinaagi sa paghimo sa reactive oxygen species79,80,81,82,83. Sa kasamtangang pagtuon, ang ekspresyon sa linoleic acid 9S-/13S-lipoxygenase nausab sa tanang strains, apan sa susceptible population 22660, ang upregulation mipatigbabaw sa lain-laing mga time points, samtang sa mga strain nga nagdala sa resistant Lanr1 ug AnMan allele, kini nagpasiugda sa diversification sa oxylipin layer sa protective anthrax reactions tali niining mga genotypes.
Ang 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase (ACO) homologue miusbaw pag-ayo (9 ka gene) o miubos (2 ka gene) sa dihang gi-inoculate og lupine. Gawas sa duha ka eksepsiyon, kining tanan nga mga tubag nahitabo sa 6 hp. sa 83A:476. Ang enzymatic reaction nga gipaagi sa ACO proteins mao ang rate-limiting step sa ethylene production ug busa highly regulated84. Ang Ethylene usa ka plant hormone nga adunay lain-laing papel sa pag-regulate sa paglambo sa tanom ug pagtubag sa abiotic ug biotic stress conditions. Ang induction sa ACO transcription ug activation sa ethylene signaling pathway nalambigit sa pagdugang sa resistensya sa humay sa hemibiotrophic fungus oryzae oryzae pinaagi sa pag-regulate sa produksyon sa reactive oxygen species ug phytoalexins. Usa ka susama kaayong proseso sa impeksyon sa dahon nga nakit-an tali sa M. oryzae ug C. lupini88,89, batok sa backdrop sa usa ka hinungdanon nga pagtaas sa mga homologue sa ACO sa linya nga 83A:476 nga gitaho niini nga pagtuon, nagbalhin sa posibilidad sa paghatag og resistensya sa NLL anthracnose Ethylene usa ka sentral nga lakang sa pagsenyas sa mga agianan sa molekula.
Sa kasamtangang pagtuon, ang dakong pagpugong sa daghang mga gene nga nalangkit sa photosynthesis naobserbahan sa 6 hpi sa 83A:476 ug sa 48 hpi sa Mandeloop ug sa 22660 nga populasyon. Ang gilapdon ug pag-uswag niini nga mga pagbag-o proporsyonal sa lebel. Ang resistensya sa anthracnose naobserbahan niini nga eksperimento. Bag-ohay lang, ang kusog ug sayo nga pagpugong sa mga transcript nga may kalabutan sa photosynthesis gitaho sa daghang mga modelo sa interaksyon sa tanum-pathogen, lakip ang pathogenic bacteria ug fungi. Ang pagdali (gikan sa 2 HPI sa pipila ka mga interaksyon) ug ang tibuok kalibutan nga pagpugong sa mga gene nga nalangkit sa photosynthesis isip tubag sa impeksyon mahimong makapukaw sa resistensya sa tanum base sa pag-deploy sa reactive oxygen species ug ang ilang interaksyon sa salicylic acid pathway aron ma-mediate ang mga reaksiyon sa alerdyi 90,94.
Sa konklusyon, ang mga mekanismo sa tubag sa depensa nga gisugyot alang sa labing resistensyado nga linya sa kaliwatan (83A:476) naglakip sa paspas nga pag-ila sa pathogen sa R ​​gene (gituohan nga TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) ug ang allergic response-mediated salicylic acid ug ethylene signaling, gisundan sa pagtukod sa long-range SAR. Ang aksyon gisuportahan sa DIR-1 protein. Kinahanglan nga matikdan nga ang biotrophic nga panahon alang sa impeksyon sa C. lupini mubo ra kaayo (gibana-bana nga 2 ka adlaw), gisundan sa necrotic growth95. Ang transisyon tali niining mga yugto mahimong nalangkit sa necrosis ug ekspresyon sa ethylene-inducible nga mga protina nga nagsilbing mga hinungdan sa mga reaksyon sa hypersensitivity sa mga tanom nga host. Busa, ang time window alang sa malampuson nga pagdakop sa C. lupini sa biotrophic stage pig-ot ra kaayo. Ang pag-reprogramming sa mga gene nga nalangkit sa redox ug photosynthesis nga naobserbahan sa 83A:476 sa 6 hpi nahiuyon sa pag-uswag sa fungal hyphae ug nagpahibalo sa pag-uswag sa usa ka malampuson nga protective response sa biotrophic stage. Ang transcriptomic responses sa Mandelup ug sa 22660 nga populasyon mahimong nalangan kaayo aron makuha ang fungus sa dili pa mobalhin ngadto sa necrotic growth, bisan pa, ang Mandelup mahimong mas epektibo kay sa 22660 nga populasyon tungod kay ang medyo paspas nga regulasyon sa PR-10 nga protina nagpasiugda sa horizontal resistance.
Ang ETI, nga gimaneho sa canonical R gene, daw usa ka komon nga mekanismo alang sa resistensya sa bean sa anthracnose. Busa, sa modelo nga legume nga Medicago truncatula, ang resistensya sa anthracnose gihatag sa gene nga RCT1, usa ka miyembro sa klase sa gene nga TIR-NBS-LRR97 plant R. Kini nga gene naghatag usab og broad-spectrum anthracnose resistance sa alfalfa kung ibalhin sa mga tanom nga dali maapektuhan. Sa komon nga bean (P. vulgaris), kapin sa duha ka dosena nga anthracnose resistance genes ang nailhan hangtod karon. Ang uban niini nga mga gene makita sa mga rehiyon nga walay bisan unsang canonical R genes, apan daghan pa ang nahimutang sa mga ngilit sa mga chromosome nga nagdala sa NBS-LRR gene cluster, lakip ang TIR-NBS-LRRs99. Ang genome-wide SSR study nagpamatuod usab sa asosasyon sa NBS-LRR gene sa anthracnose resistance sa komon nga bean. Ang canonical R gene nakit-an usab sa genomic region nga nagdala sa major anthracnose resistance locus sa white lupine 101.
Ang among trabaho nagpakita nga ang usa ka diha-diha nga reaksyon sa resistensya, nga gi-aktibo sa sayo nga yugto sa impeksyon sa tanom (mas maayo nga dili molapas sa 12 hpi), epektibo nga nanalipod sa narrow-leaved lupine gikan sa anthracnose nga gipahinabo sa pathogenic fungus nga Collelotrichum lupini. Gamit ang taas nga throughput sequencing, among gipakita ang lain-laing mga expression profile sa anthracnose resistance genes sa mga tanom nga NLL nga gipaagi sa Lanr1 ug AnMan resistance genes. Ang malampuson nga depensa naglakip sa maampingong pagdesinyo sa mga gene para sa mga protina nga nalambigit sa redox, photosynthesis, ug pathogenesis sulod sa mga oras sa unang kontak sa tanom sa usa ka pathogen. Ang susamang mga reaksyon sa pagpanalipod, apan nalangan sa panahon, dili kaayo epektibo sa pagpanalipod sa mga tanom gikan sa mga sakit. Ang resistensya sa anthrax nga gipaagi sa Lanr1 gene susama sa tipikal nga paspas nga tubag sa R ​​gene (effector-triggered immunity), samtang ang AnMan gene lagmit naghatag og horizontal response (immunity nga gipahinabo sa microbe-associated molecular pattern), nga naghatag og kasarangan nga lebel sa pagpadayon.
Ang 215 ka linya sa NLL nga gigamit sa pag-screen para sa mga marker sa anthracnose gilangkoban sa 74 ka cultivars, 60 ka linya nga nakuha pinaagi sa crossing o breeding, 5 ka mutants, ug 76 ka wild o original germplasms. Ang mga linya gikan sa 17 ka mga nasud, kasagaran gikan sa Poland (58), Spain (47), Germany (27), Australia (26), Russia (19), Belarus (7), Italy (5) ug uban pang mga linya gikan sa 10 ka mga nasud. Ang set naglakip usab sa mga linya nga reference resistant: 83A:476, Tanjil, Wonga nga nagdala sa Lanr1 allele, ug Mandelup nga nagdala sa AnMan allele. Ang mga linya nakuha gikan sa European Lupine Genetic Resource Database nga gimentinar sa Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Poland (Supplementary Table S1).
Ang mga tanom gipatubo ubos sa kontroladong mga kondisyon (photoperiod 16 ka oras, temperatura 25°C sa adlaw ug 18°C ​​sa gabii). Duha ka biological replicates ang gi-analisa. Ang DNA gi-isolate gikan sa tulo ka semana nga mga dahon gamit ang DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) sumala sa protocol. Ang kalidad ug konsentrasyon sa gi-isolate nga DNA gi-assess pinaagi sa spectrophotometric methods (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Ang AnManM1 marker nga nagtimaan sa anthracnose resistance gene nga AnMan (gikan sa cv. Mandelup) ug ang mga marker nga Anseq3 ug Anseq4 nga nag-flank sa gene nga Lanr1 (gikan sa cv. Tanjil) gi-analisa 11,26,28. Ang mga homozygotes para sa resistant allele gi-iskor nga “1″, susceptible – nga “0″, ug heterozygotes – nga 0.5.
Base sa resulta sa screening para sa mga marker nga AnManM1, AnSeq3 ug AnSeq4 ug sa pagkaanaa sa mga liso para sa katapusang follow-up nga mga eksperimento, 50 ka NLL lines ang gipili para sa anthracnose resistance phenotyping. Ang pag-analisa gihimo nga doble sa usa ka computer controlled greenhouse nga adunay 14 ka oras nga photoperiod nga adunay temperatura nga 22°C sa maadlaw ug 19°C sa gabii. Ang mga liso gikalot (giputol ang seed coat sa pikas nga bahin sa embryo gamit ang hait nga blade) sa dili pa isabwag aron malikayan ang dormancy sa liso tungod sa katig-a sa seed coat ug aron masiguro ang parehas nga pagtubo. Ang mga tanom gipatubo sa mga kaldero (11 × 11 × 21 cm) nga adunay sterile nga yuta (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warsaw, Poland). Ang pagbakuna gihimo gamit ang Colletotrichum lupini Col-08 strain, nga gipatubo niadtong 1999 gikan sa mga punoan sa mga tanom nga lupine nga nipis ang dahon nga gipatubo sa usa ka umahan sa Verzhenitsa, Greater Poland (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Pagkuha og lugar. Ang mga isolate gipatubo sa SNA medium sa 20° C. ubos sa itom nga kahayag sulod sa 21 ka adlaw aron maaghat ang sporulation. Upat ka semana human sa pagpugas, sa dihang ang mga tanom nakaabot na sa 4-6 ka dahon nga yugto, ang pagbakuna gihimo pinaagi sa pag-spray og suspension sa conidia sa konsentrasyon nga 0.5 x 106 conidia kada ml. Human sa pagbakuna, ang mga tanom gibutang sa kangitngit sulod sa 24 oras sa humidity nga mga 98% ug temperatura nga 25°C aron mapadali ang pagtubo sa conidia ug ang proseso sa impeksyon. Ang mga tanom gipatubo dayon ubos sa 14-oras nga photoperiod sa 22°C nga adlaw/19°C nga gabii ug 70% nga humidity. Ang score sa sakit gihimo 22 ka adlaw human sa inoculation ug gikan sa 0 (immune) ngadto sa 9 (dali ra mataptan) depende sa presensya o pagkawala sa necrotic lesions sa mga punoan ug dahon. Dugang pa, human sa pag-iskor, gisukod ang gibug-aton sa mga tanom. Ang mga relasyon tali sa marker genotypes ug disease phenotypes gikalkulo isip point two-sequence correlations (kawalay heterozygous markers sa hugpong sa mga linya alang sa pag-analisar sa anthracnose resistance phenotype).