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O tremoço Angustifolius (NLL, Lupinus angustifolius L.) é uma leguminosa utilizada na produção de alimentos e na melhoria do solo. A expansão global do NLL como cultura atraiu muitos fungos patogênicos, incluindo a antracnose do tremoço, que causa a devastadora doença da antracnose. Dois alelos, Lanr1 e AnMan, que conferem maior resistência, têm sido utilizados no melhoramento genético do NLL, mas os mecanismos moleculares subjacentes permanecem desconhecidos. Neste estudo, os marcadores Lanr1 e AnMan foram utilizados para rastrear amostras europeias de NLL. O teste da vacina em ambiente controlado confirmou a eficácia de ambos os doadores resistentes. O perfil de expressão gênica diferencial foi realizado em linhagens representativas resistentes e suscetíveis. A resistência à antracnose foi associada à superexpressão dos termos da ontologia genética "GO:0006952 Resposta de Defesa", "GO:0055114 Processo Redox" e "GO:0015979 Fotossíntese". Além disso, a linhagem Lanr1(83A:476) apresentou reprogramação transcriptômica significativa e rápida após a inoculação, enquanto as demais linhagens apresentaram um atraso nessa resposta em cerca de 42 horas. As respostas de defesa estão associadas aos genes TIR-NBS, CC-NBS-LRR e NBS-LRR, 10 proteínas envolvidas na patogênese, proteínas de transferência de lipídios, endoglucano-1,3-β-glicosidase, proteínas da parede celular ricas em glicina e genes da via reativa do oxigênio. As respostas iniciais à linhagem 83A:476, incluindo a supressão cuidadosa de genes associados à fotossíntese, coincidiram com a proteção bem-sucedida durante a fase de crescimento vegetativo da biologia fúngica, sugerindo que um efetor desencadeia a imunidade. A reação de Mandeloop é retardada, assim como o arrasto horizontal geral.
O tremoço-de-folhas-estreitas (NLL, Lupinus angustifolius L.) é um cereal rico em proteínas originário da região do Mediterrâneo Ocidental1,2. Atualmente, é cultivado como alimento para animais e humanos. Também é considerado adubo verde em sistemas de rotação de culturas devido à fixação de nitrogênio por bactérias fixadoras de nitrogênio simbióticas e à melhoria geral da estrutura do solo. O NLL passou por um rápido processo de domesticação no último século e ainda está sob alta pressão reprodutiva3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Com o cultivo generalizado do NLL, a sucessão de fungos patogênicos desenvolveu novos nichos agrícolas e causou novas doenças destruidoras de culturas. O mais notável para os produtores e criadores de tremoço foi o aparecimento da antracnose, causada pelo fungo patogênico Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. O mais notável para os produtores e criadores de tremoço foi o aparecimento da antracnose, causada pelo fungo patogênico Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. A escolha certa para fermicidades e seleções é feita de forma antrópica, útil грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. O mais notável para os criadores e produtores de tremoço foi o surgimento da antracnose causada pelo fungo patogênico Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的。Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Cabeludo。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler e Hagedorn13. O mais impressionante para os produtores e criadores de tremoço é o surgimento da antracnose causada pelo fungo patogênico Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Os primeiros relatos da doença vieram do Brasil e dos Estados Unidos, com sintomas típicos surgindo em 1912 e 1929, respectivamente. No entanto, após cerca de 30 anos, o patógeno foi designado como Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorfo Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfo Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfo de Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.,有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.,有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld em morfologias famosas. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld em Morfologia Direcionada. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .e H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。e H. Schlenk, .A fenotipagem preliminar da doença feita em meados do século XX mostrou alguma resistência em acessões de NLL e tremoço amarelo (L. luteus L.), mas todas as acessões de tremoço branco (L. albus L.) testadas foram altamente suscetíveis15,16. Estudos mostraram que o desenvolvimento da antracnose está associado ao aumento da precipitação (umidade do ar) e da temperatura (na faixa de 12-28 °C), levando a uma violação da resistência em temperaturas mais altas17, 18. De fato, o tempo necessário para os conídios germinarem e a doença começar foi quatro vezes menor a 24 °C (4 horas) do que a 12 °C (16 horas) sob condições de alta umidade19. Assim, o aquecimento global em curso levou à disseminação da antracnose. No entanto, a doença foi observada na França (1982) e na Ucrânia (1983) como um prenúncio de uma ameaça iminente, mas foi aparentemente ignorada pela indústria do tremoço na época20,21. Poucos anos depois, essa doença devastadora se espalhou pelo mundo e também afetou importantes países produtores de tremoço, como Austrália, Polônia e Alemanha22,23,24. Após um surto de antracnose em meados da década de 1990, uma triagem extensiva resultou na identificação de vários doadores resistentes em amostras de NLL19. A resistência de NLL à antracnose é controlada por dois alelos dominantes distintos encontrados em diferentes fontes de germoplasma: Lanr1 na cultivar Tanjil e Wonga e AnMan na cultivar Mandalay 25, 26. Esses alelos complementam os marcadores moleculares que sustentam a seleção de germoplasma resistente em programas de melhoramento25, 26, 27, 28, 29, 30. A linhagem de reprodução resistente 83A:476 portadora do alelo Lanr1 foi cruzada com a linhagem selvagem suscetível P27255 para obter uma população RIL segregante para resistência à antracnose, o que tornou possível atribuir o locus Lanr1 ao cromossomo NLL-1131, 32, 33. O alinhamento dos marcadores do mapa de ligação dos loci de resistência à antracnose que flanqueiam com uma estrutura genômica, NLL, revelou a localização de todos os três alelos no mesmo cromossomo (NLL-11), mas em posições diferentes29,34,35. No entanto, devido ao pequeno número de RILs e à grande distância genética entre os marcadores e os alelos correspondentes, nenhuma conclusão confiável pode ser tirada sobre seus genes subjacentes. Por outro lado, o uso da genética reversa em tremoços é difícil devido ao seu baixíssimo potencial de regeneração, o que torna a manipulação genética complexa37.
O desenvolvimento de germoplasma domesticado carregando o alelo desejado no estado homozigoto, como 83A:476 (Lanr1) e Mandelup (AnMan), abriu as portas para o estudo da resistência à antracnose em face da presença de combinações opostas de alelos em populações selvagens. Possibilidades de mecanismos moleculares. Comparar respostas de defesa geradas por genótipos específicos. Este estudo avaliou a resposta transcriptômica inicial de NLL à vacinação contra C. lupini. Primeiramente, um painel de germoplasma europeu de NLL contendo 215 linhagens foi rastreado usando marcadores moleculares que marcam os alelos Lanr1 e AnMan. A fenotipagem da antracnose foi então realizada em 50 linhagens de NLL, previamente selecionadas para marcadores moleculares, sob condições controladas. Com base nesses experimentos, quatro linhagens diferindo em resistência à antracnose e composição alélica Lanr1/AnMan foram selecionadas para perfil de expressão diferencial de genes de defesa usando duas abordagens complementares: sequenciamento de RNA de alto rendimento e quantificação por PCR em tempo real.
A triagem de um conjunto de germoplasma NLL (N = 215) com marcadores Lanr1 (Anseq3 e Anseq4) e AnMan (Anseq4) e AnMan (AnManM1) mostrou que apenas uma linha (95726, perto de Salamanca-b) amplifica o alelo de "resistência" para todos os marcadores, enquanto "Presença de alelos 'suscetíveis'" encontrou a proporção de todos os marcadores em 158 (~73,5%) linhagens. Treze linhagens produziram dois alelos "resistentes" do marcador Lanr1, e 8 linhagens produziram alelos "resistentes" do marcador Lanr1. O alelo de "resistência" do marcador AnMan (Tabela S1 Suplementar). Duas linhagens foram heterozigotas para o marcador Anseq3 e uma heterozigota para o marcador AnManM1. Quarenta e duas linhagens (19,5%) apresentaram fases opostas dos alelos Anseq3 e Anseq4, indicando uma alta frequência de recombinação entre esses dois loci. Fenótipos de antracnose em condições controladas (Tabela Suplementar S2) revelaram variabilidade na resistência dos genótipos testados, o que se refletiu na severidade da antracnose. As diferenças nas pontuações médias variaram de 1,8 (moderadamente resistente) a 6,9 (suscetível), e as diferenças no peso das plantas variaram de 0,62 (suscetível) a 4,45 g (resistente). Houve correlação significativa entre os valores observados em duas repetições do experimento (0,51 para escores de severidade da doença, P = 0,00017 e 0,61 para peso da planta, P < 0,0001), bem como entre esses dois parâmetros (− 0,59 e − 0,77, P < 0,0001). Houve correlação significativa entre os valores observados em duas repetições do experimento (0,51 para escores de severidade da doença, P = 0,00017 e 0,61 para peso da planta, P < 0,0001), bem como entre esses dois parâmetros (− 0,59 e − 0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 e 0,61 para o máximo de durabilidade, P < 0,0001), e também o mesmo valor do parâmetro (-0,59 e -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Foi encontrada correlação significativa entre os valores observados em duas repetições do experimento (0,51 para os escores de severidade da doença, P = 0,00017 e 0,61 para o peso da planta, P < 0,0001), bem como entre esses dois parâmetros (- 0,59 e -0,77, P < 0,0001) 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为0,51，P = 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 e - 0,77，P < 0,0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为分为 0,51, p = 0,00017, 植物 为 为 0,61, p <0,0001）和- 0,59 和– 0,59 和- 0,77，P < 0,0001)。 Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести valor 0,51, P = 0,00017 e масса растения 0,61, P <0,0001), e между этими двумя параметрами (-0,59 e -0,0001) 0,77, P <0,0001. Houve correlação significativa entre os valores observados em duplicata (pontuação de severidade da doença 0,51, P = 0,00017 e peso da planta 0,61, P < 0,0001) e entre esses dois parâmetros (-0,59 e -0,0001) 0,77, P < 0,0001. ).Os sintomas típicos observados em plantas suscetíveis incluem torção e torção do caule, assemelhando-se a uma estrutura de "arco de pastor", seguida de lesões ovais com esporozoítos laranja/rosa (Fig. Suplementar 1). As linhagens australianas portadoras dos genes Lanr1 (83A:476 e Tanjil) e AnMan (Mandelup) são moderadamente resistentes, 0,0331 e 0,0036. Algumas linhagens que também apresentam os alelos "resistentes" Lanr1 e/ou AnMan apresentam sintomas da doença.
Curiosamente, algumas linhas NLL sem qualquer alelo marcador “resistente” revelaram um alto nível de resistência à antracnose (comparável ou superior aos genótipos Lanr1 ou AnMan), como Boregine (valor de P < 0,0001 para ambos os parâmetros), Bojar (valor de P < 0,0001 para pontuação e 0,001 para peso da planta) e População B-549/79b (valor de P < 0,0001 para pontuação e não significativo para peso). Curiosamente, algumas linhas NLL sem qualquer alelo marcador “resistente” revelaram um alto nível de resistência à antracnose (comparável ou superior aos genótipos Lanr1 ou AnMan), como Boregine (valor de P < 0,0001 para ambos os parâmetros), Bojar (valor de P < 0,0001 para pontuação e 0,001 para peso da planta) e População B-549/79b (valor de P < 0,0001 para pontuação e não significativo para peso). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 para оценки e 0,001 para массы растения) e популяции B-549/79b (значение P <0,0001 para оценки и незначимо для массы). Curiosamente, várias linhas NLL sem nenhum alelo marcador 'resistente' mostraram um alto nível de resistência à antracnose (comparável ou superior aos genótipos Lanr1 ou AnMan), como Boregine (valor de P < 0,0001 para ambos os parâmetros), Bojar (valor de P < 0,0001 para avaliação e 0,001 para peso da planta) e população B-549/79b (valor de P < 0,0001 para avaliação e não significativo para peso).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）。 É interessante que alguns sistemas NLL que não possuem nenhum marcador “antigênico” apresentam alta resistência horizontal (equivalente aos genes Lanr1 ou AnMan ou superior), como Boregine (ambos os parâmetros P < 0,0001), Bojar (valor P < 0,0001, peso da planta 0,001) e cepa B-549/79b (valor P < 0,0001, peso não significativo). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 ou AnMan), assim como Boregine (значение P para обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) e população B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Curiosamente, algumas linhas NLL sem quaisquer alelos marcadores de "resistência" apresentaram altos níveis de resistência à antracnose (comparáveis ​​ou superiores aos genótipos Lanr1 ou AnMan), como Boregine (valor de P para ambos os parâmetros < 0,0001), Bojar (valor de P < 0,0001, peso da planta 0,001) e população B-549/79b (valor de P < 0,0001, peso não significativo).Esse fenômeno sugere a possibilidade de uma nova fonte genética de resistência, explicando a ausência de correlação observada entre os genótipos marcadores e os fenótipos da doença (valores de P de ~0,42 a ~0,98). Assim, o teste de Kolmogorov-Smirnov mostrou que os dados de resistência à antracnose apresentaram distribuição aproximadamente normal para os escores (valores de P 0,25 e 0,11) e massa da planta (valores de P 0,47 e 0,55), sugerindo a hipótese de que mais alelos do que Lanr1 e AnMan estão envolvidos.
Com base nos resultados da triagem de resistência à antracnose, quatro linhagens foram selecionadas para análise do transcriptoma: 83A:476, Boregine, Mandelup e População 22660. Essas linhagens foram testadas novamente para resistência ao antraz em experimentos de inoculação por sequenciamento de RNA, desde que fossem as mesmas do teste anterior. Os valores de pontuação foram os seguintes: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) e População 22660 (6,11 ± 1,29).
O protocolo Illumina NovaSeq 6000 atingiu uma média de 40,5 pares de Mreads por amostra (29,7 a 54,4 Mreads) (Tabela Suplementar S3). As pontuações de alinhamento na sequência de referência variaram de 75,5% a 88,6%. A correlação média dos dados de contagem de leituras entre variantes experimentais entre réplicas biológicas variou de 0,812 a 0,997 (média de 0,959). Dos 35.170 genes analisados, 2.917 não revelaram expressão, e os outros 4.785 genes foram expressos em nível insignificante (média base < 5). Dos 35.170 genes analisados, 2.917 não revelaram expressão, e os outros 4.785 genes foram expressos em nível insignificante (média base < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на não conhecido (базовое среднее <5). Dos 35.170 genes analisados, 2.917 não apresentaram expressão, e os 4.785 genes restantes foram expressos em um nível insignificante (média base < 5).35.170 pessoas, 2917 pessoas, 4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35.170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 não экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительную экспрессию (em inglês) número <5). Dos 35.170 genes analisados, 2.917 não foram expressos e os 4.785 genes restantes tiveram expressão insignificante (média base < 5).Assim, o número de genes considerados expressos (média base ≥ 5) durante o experimento foi de 27.468 (78,1%) (Tabela Suplementar S4).
Desde o primeiro momento, todas as linhagens NLL responderam à inoculação de C. lupini (cepa Col-08) reprogramando o transcriptoma (Tabela 1); no entanto, diferenças significativas foram observadas entre as linhagens. Assim, a linhagem de resistência 83A:476 (carregando o gene Lanr1) apresentou reprogramação transcriptômica significativa no primeiro momento (6 hpi), com um aumento de 31 a 69 vezes no número de genes positivos e negativos isolados em comparação com outros momentos nesse momento. Além disso, esse pico teve curta duração, pois a expressão de apenas alguns genes permaneceu significativamente alterada no segundo momento (12 hpi). Curiosamente, Boregine, que também apresentou alto nível de resistência no teste de enxerto, não sofreu reprogramação transcricional tão massiva durante o experimento. No entanto, o número de genes diferencialmente expressos (DEG) foi o mesmo para Boregine e 83A:476 em 12 HPI. Tanto Mandelup quanto a população 22660 apresentaram picos de DEG no último ponto de tempo (48 l/s), indicando um atraso relativo nas respostas de defesa.
Como 83A:476 sofreu uma reprogramação transcriptômica maciça em resposta a C. lupini em 6 HPI, em comparação com todas as outras linhagens, ~91% dos DEGs observados nesse momento foram específicos da linhagem (Fig. 1). No entanto, houve alguma sobreposição nas respostas iniciais entre as linhagens estudadas, visto que 68,5%, 50,9% e 52,6% dos DEGs em Boregine, Mandelup e na população 22660, respectivamente, sobrepuseram-se aos encontrados em 83A:476 em determinados momentos. No entanto, esses DEGs representaram apenas uma pequena fração (0,97-1,70%) de todos os DEGs atualmente detectados usando 83A:476. Além disso, 11 DEGs de todas as linhagens eram coerentes neste momento (Tabelas Suplementares S4-S6), incluindo componentes comuns de respostas de defesa de plantas: proteína de transferência de lipídios (TanjilG_32225), enzima endoglucan-1,3-β-glicosídeo (TanjilG_23384), duas proteínas induzíveis por estresse como SAM22 (TanjilG_31528 e TanjilG_31531), proteína básica do látex (TanjilG_32352) e duas proteínas estruturais de parede celular ricas em glicina (TanjilG_19701 e TanjilG_19702). Houve também uma sobreposição relativamente alta nas respostas do transcriptoma entre 83A:476 e Boregine em 24 HPI (total 16-38% DEG) e entre Mandelup e População 22660 em 48 HPI (total 14-20% DEG).
Diagrama de Venn mostrando o número de genes diferencialmente expressos (GDE) em linhagens de tremoço de folhas estreitas (NLL) inoculadas com Colletotrichum lupini (cepa Col-08 obtida de campos de tremoço em Wierzhenice, Polônia, 1999). As linhagens NLL analisadas foram: 83A:476 (resistente, portadora do alelo Lanr1), Boregine (resistente, histórico genético desconhecido), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo AnMan) e população 22660 (muito suscetível). A abreviatura hpi significa horas após a vacinação. Os valores zero foram removidos para simplificar o gráfico.
O conjunto de genes superexpressos em 6 hpi foi analisado quanto à presença de domínios canônicos do gene R (Tabela Suplementar S7). Este estudo revelou a indução transcriptômica de genes clássicos de resistência a doenças com domínios NBS-LRR apenas em 83A:476. Este conjunto consistiu em um gene TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), cinco genes CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 e tanjilg_16162), quatro genes NBS-LR, Tanjilg_16162, quatro genes NBS-LRRE (tanjilg_16162), bem como quatro genes NBS-Lrr (tanjilg_16162) e quatro genes NBS-LRR (TANJILG_16162). Todos esses genes possuem domínios canônicos organizados em sequências conservadas. Além dos genes do domínio NBS-LRR, várias cinases RLL foram ativadas em 6 hpi, a saber, uma em Boregine (TanjilG_19877), duas em Mandelup (TanjilG_07141 e TanjilG_19877) e na população 22660 (TanjilG_09014 e TanjilG_10361) e duas em 83A 27:476.
Genes com expressão significativamente alterada em resposta à inoculação com C. lupini (cepa Col-08) foram submetidos à análise de enriquecimento por Ontologia Gênica (GO) (Tabela Suplementar S8). O termo de processo biológico mais frequentemente super-representado foi “resposta de defesa GO:0006952”, que apareceu em 6 de 16 combinações (tempo × linha) com alta significância (valor de P < 0,001) (Fig. 2). O termo de processo biológico mais frequentemente super-representado foi “resposta de defesa GO:0006952”, que apareceu em 6 de 16 combinações (tempo × linha) com alta significância (valor de P < 0,001) (Fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса por «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся em 6 de 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). O termo de processo biológico mais frequentemente super-representado foi 'resposta de defesa GO:0006952', que apareceu em 6 de 16 combinações (tempo × linhagem) com alta significância (valor de P < 0,001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 O termo de processo biológico mais representativo é “resposta de defesa GO:0006952”, que aparece em 6 das 16 combinações (时间×线), com alta significância (valor de P < 0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», который disponível em 6 de 16 combinações (qualquer × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). O termo de processo biológico mais frequentemente super-representado foi 'GO:0006952 Resposta de Defesa', que apareceu em 6 de 16 combinações (tempo × linha) com alta significância (valor de P < 0,001) (Fig. 2).Este termo foi super-representado em dois momentos em 83A: 476 e Boregine (6 e 24 hpi) e em um momento em Mandelup e População 22660 (12 e 6 hpi, respectivamente). Este é um resultado esperado, destacando a resposta antifúngica das linhagens resistentes. Além disso, 83A:476 respondeu a C. lupini induzindo rapidamente genes relacionados à explosão oxidativa representada pelo termo "processo redox GO:0055114", indicando uma resposta de defesa específica, enquanto Boregine revelou respostas de defesa específicas, relacionadas ao termo "GO". :0006950 Resposta ao estresse”. A população 22660 ativou a resposta de resistência horizontal envolvendo metabólitos secundários, destacando o número excessivo de termos “GO:0016104 Processo de biossíntese de triterpeno” e “GO:0006722 Processo de metabolismo de triterpeno” (ambos os termos pertencem ao mesmo conjunto de genes), levando em consideração os resultados da análise de enriquecimento de termos GO, a estabilidade da reação de Mandelup foi entre Boregine e a população 22660. Além disso, a reação precoce 83A:476 (6 hpi) e a reação tardia Mandelup e a população 22660 incluem o termo GO:0015979 'fotossíntese' e outros processos biológicos relacionados.
Os termos da ontologia de genes de bioprocessos selecionados na anotação de genes diferencialmente expressos durante as respostas transcriptômicas de tremoço-de-folhas-estreitas (NLL) inoculado com tremoço-de-antraz (cepa Col-08 obtida de campos de tremoço em Wierzhenice, Polônia, em 1999) são bastante exagerados. As linhagens NLL analisadas foram: 83A:476 (resistente, portadora do alelo Lanr1 homozigoto), Boregine (resistente, histórico genético desconhecido), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo AnMan homozigoto) e população 22660 (suscetível).
Como este estudo teve como objetivo identificar genes que contribuem para a resistência à antracnose, os genes atribuídos aos termos GO "GO: 0006952 Respostas defensivas" e "GO: 0055114 Processos redox" foram analisados ​​com pontos de corte, uma vez que a média da linha de base era ≥ 30, com pelo menos uma linha. × ponto no tempo, combinando valores estatisticamente significativos de log2 (mudança de dobra). O número de genes que atenderam a esses critérios foi de 65 para GO:0006952 e 524 para GO:0055114.
83A:476 revelou dois picos de DEG anotados com o termo GO:0006952, o primeiro com 6 genes por polegada (64 genes, regulação positiva e negativa) e o segundo com 24 genes por polegada (15 genes, apenas regulação positiva). Boregine também mostrou que GO:0006952 atingiu o pico no mesmo ponto temporal, mas com menos DEG (11 e 8) e ativação preferencial. Mandeloop apresentou dois picos de GO:0006952 em 12 e 48 HPI, ambos carregando 12 genes (o primeiro com genes ativadores e o segundo apenas com genes supressores), enquanto a população de 22660 em 6 HPI (13 genes) apresentou maior predominância do pico de aumento da regulação. Deve-se notar que 96,4% dos GO:0006952 DEG nesses picos apresentaram o mesmo tipo de resposta (para cima ou para baixo), indicando uma sobreposição significativa nas respostas de defesa, apesar das diferenças no número de genes envolvidos. O maior grupo de sequências relacionadas ao termo GO:0006952 codifica a Proteína de Mensagem Associada ao Estresse por Fome 22 (semelhante a SAM22), que pertence ao clado proteico da proteína associada à patogênese da classe 10 (PR-10) e à proteína do núcleo semelhante ao látex (semelhante a MLP) (Fig. 3). Os dois grupos diferiram na natureza da expressão e na direção da resposta. Os genes que codificam proteínas semelhantes a SAM22 apresentaram indução consistente e significativa nos primeiros momentos (6 ou 12 hpi) e geralmente não responderam ao final do experimento (48 hpi), enquanto proteínas semelhantes a MLP apresentaram coordenação em 6 hpi. 83A:476 e Mandelup a 48 hp/in, quase todos os outros pontos de dados não apresentaram resposta. Além disso, diferenças nos perfis de expressão dos genes da proteína semelhante à SAM22 acompanharam a variabilidade observada na resistência à antracnose, visto que linhagens mais resistentes apresentaram mais pontos temporais induzindo significativamente esses genes do que genes mais suscetíveis. Outro gene PR-10 semelhante à LlR18A/B apresentou um padrão de expressão muito semelhante ao do gene da proteína semelhante à SAM22.
Os principais componentes do termo de processo biológico "GO:0006952 Defense Response" e os padrões de expressão de genes candidatos dos alelos Lanr1 e AnMan foram identificados. A escala Log2 representa os valores de log2 (variação de vezes) entre plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida de campos de tremoço, Wizhenica, Polônia, 1999) e controle (inoculação simulada) no mesmo ponto temporal. As seguintes linhagens de tremoço de folhas estreitas foram analisadas: 83A:476 (resistente, portadora do alelo Lanr1 homozigoto), Boregine (resistente, histórico genético desconhecido), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo AnMan homozigoto) e População 22660 (suscetível).
Além disso, os perfis de expressão dos genes candidatos a RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) e AnMan (TanjilG_12861) foram avaliados (Fig. 3). O gene TanjilG_05042 apresentou uma resposta significativa (ativação) em 83A:476 apenas no primeiro ponto de tempo (6 hpi), enquanto TanjilG_12861 foi significativo em Mandeloop apenas em dois pontos de tempo: 6 hpi (regulação negativa) e 24 hpi (6 hpi). Com.). ajustável).
Os genes mais superexpressos no termo GO:0055114 “processo redox” foram genes que codificam proteínas do citocromo P450 e peroxidase (Fig. 4). Para amostras isoladas de 83A:476 em 6 HPI, valores máximos ou mínimos de log2 (mudança de dobra) (para 86,6% dos genes) foram geralmente observados entre plantas inoculadas e controle, destacando a alta resposta deste genótipo ao sexo inoculante. 83A:476 apresentou o GO:0055114 DEG mais significativo em 6 hpi (503 genes), enquanto o restante das linhagens em 48 hpi (Boregine, 31 genes; Mandelup, 85 genes; e População 22660, 78 genes)). Na maioria dos genes da família GO:0055114, foram observados dois tipos de respostas à vacinação (ativação e inibição). Curiosamente, até 97,6% dos DEGs identificados para o termo GO: 0055114 em Mandelupe a 48 hp. Essas observações sugerem que, apesar da escala significativamente menor (ou seja, o número de genes redox mutados, 85 versus 503), o padrão de respostas transcriptômicas tardias de Mandelupe à antracnose é semelhante à resposta inicial de 83A:476. Em Boregine e População 22660, essa convergência é menor, com 51,6% e 75,6%, respectivamente.
Os padrões de expressão dos principais componentes do termo do processo biológico "GO:0055114 Processo Redox" foram revelados. A escala Log² representa os valores de log² (variação de dobra) entre plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida de campos de tremoço, Wizhenica, Polônia, 1999) e controle (inoculação simulada) no mesmo ponto temporal. As seguintes linhagens de tremoço de folhas estreitas foram analisadas: 83A:476 (resistente, portadora do alelo homozigoto Lanr1), Boregine (resistente, histórico genético desconhecido), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo homozigoto AnMan) e População 22660 (suscetível).
83A:476 As respostas transcriptômicas à inoculação com C. lupini (cepa Col-08) também incluíram o silenciamento coordenado de genes atribuídos ao termo GO:0015979 "fotossíntese" e outros processos biológicos relacionados (FIG. 5). Este conjunto de DEGs GO:0015979 continha 105 genes que foram significativamente reprimidos em 6 hpi em 83A:476. Neste subconjunto, 37 genes também foram sub-regulados em Mandelup em 48 HPI e 35 no mesmo ponto temporal na população de 22660, incluindo 19 DEGs comuns a ambos os genótipos. Nenhum DEG relacionado ao termo GO: 0015979 foi significativamente ativado em qualquer combinação (linha x tempo).
Os padrões de expressão dos principais componentes do termo do processo biológico "GO:0015979 Fotossíntese" foram revelados. A escala Log² representa os valores de log² (variação de dobra) entre plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida de campos de tremoço, Wizhenica, Polônia, 1999) e controle (inoculação simulada) no mesmo ponto temporal. As seguintes linhagens de tremoço de folhas estreitas foram analisadas: 83A:476 (resistente, portadora do alelo homozigoto Lanr1), Boregine (resistente, histórico genético desconhecido), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo homozigoto AnMan) e População 22660 (suscetível).
Com base nos resultados da análise de expressão diferencial e presumivelmente envolvido em respostas de defesa contra fungos patogênicos, este conjunto de sete genes foi selecionado para quantificação de perfis de expressão por PCR em tempo real (Tabela Suplementar S9).
O gene proteico putativo TanjilG_10657 foi induzido significativamente em todas as linhagens e pontos temporais estudados, em comparação com plantas controle (mímicas) (Tabelas Suplementares S10 e S11). Além disso, o perfil de expressão de TanjilG_10657 apresentou uma tendência crescente ao longo do experimento para todas as linhagens. A população 22660 apresentou a maior sensibilidade de TanjilG_10657 à inoculação, com ativação de 114 vezes e o maior nível de expressão relativa (4,4 ± 0,4) em 24 HPI (Fig. 6a). O gene proteico PR10 LlR18A TanjilG_27015 também apresentou ativação em todas as linhagens e pontos temporais, com significância estatística na maioria dos pontos de dados (Fig. 6b). Semelhante a TanjilG_10657, o maior nível de expressão relativa de TanjilG_27015 foi observado na população inoculada de 22660 em 24 HPI (19,5 ± 2,4). O gene da endoquitinase ácida TanjilG_04706 foi significativamente regulado positivamente em todas as linhagens e em todos os pontos de tempo, exceto para Boregine 6 hpi (Fig. 6c). Foi fortemente induzido no primeiro ponto de tempo (6 HPI) em 83A:476 (em 10,5 vezes) e moderadamente aumentado em outras linhagens (em 6,6-7,5 vezes). Durante o experimento, a expressão de TanjilG_04706 permaneceu em níveis semelhantes em 83A:476 e Boregine, enquanto em Mandelup e na População 22660 aumentou significativamente, atingindo valores relativamente altos (5,9 ± 1,5 e 6,2 ± 1,5, respectivamente). O gene TanjilG_23384, semelhante à endoglucana-1,3-β-glicosidase, apresentou alta ativação nos dois primeiros momentos (6 e 12 hpi) em todas as linhagens, exceto na população 22660 (Fig. 6d). Os maiores níveis de expressão relativa de TanjilG_23384 foram observados no segundo momento (12 hpi) em Mandelup (2,7 ± 0,3) e 83A:476 (1,5 ± 0,1). Aos 24 HPI, a expressão de TanjilG_23384 foi relativamente baixa em todas as linhagens estudadas (de 0,04 ± 0,009 a 0,44 ± 0,12).
Perfis de expressão de genes selecionados (ag) revelados por PCR quantitativa. Os números 6, 12 e 24 representam horas após a vacinação. Os genes LanDExH7 e LanTUB6 foram utilizados para normalização, e o LanTUB6 foi utilizado para calibração intersérie. As barras de erro representam o desvio padrão com base em três réplicas biológicas, cada uma das quais é a média de três réplicas técnicas. A significância estatística das diferenças nos níveis de expressão entre as plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida em 1999 no campo de tremoço em Wierzenica, Polônia) e as plantas de controle (inoculadas simuladamente) são marcadas acima dos pontos de dados (*valor P < 0,05, **valor P ≤ 0,01, ***valor P ≤ 0,001). A significância estatística das diferenças nos níveis de expressão entre as plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida em 1999 no campo de tremoço em Wierzenica, Polônia) e as plantas de controle (inoculadas simuladamente) são marcadas acima dos pontos de dados (*valor P < 0,05, **valor P ≤ 0,01, ***valor P ≤ 0,001). Статистическая значимость различий уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен в 1999 por люпина em. Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***valor P ≤ 0,001). Diferenças estatisticamente significativas nos níveis de expressão entre plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida em 1999 de um campo de tremoço em Wierzhenice, Polônia) e plantas de controle (inoculadas falsamente) são observadas acima dos pontos de dados (*valor de P < 0,05, **valor de P ≤ 0,01, ***valor de P ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini, Col-08株, 1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物 之间水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 A distribuição estatística da quantidade de sementes de inoculantes (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина em Верженице, Польша, em 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-valor ≤ 0,001). Diferenças estatisticamente significativas nos níveis de expressão entre plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida de campos de tremoço em Verzhenice, Polônia, em 1999) e plantas de controle (inoculadas falsamente) são observadas acima dos pontos de dados (*valor P < 0,05, **valor P ≤ 0,01, ***valor P ≤ 0,001).As linhagens NLL analisadas foram: 83A:476 (resistente, portadora do alelo homozigoto Lanr1), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo homozigoto AnMan), Boregine (resistente, histórico genético desconhecido) e população 22660 (suscetível).
O gene candidato TanjilG_05042 no locus Lanr1 apresentou um padrão de expressão marcadamente diferente dos perfis obtidos em estudos de RNA-sequenciamento (Fig. 6e). A ativação significativa desse gene foi observada em Mandelup e na população 22660 (até 39,7 e 11,7 vezes, respectivamente), resultando em níveis de expressão relativamente altos (até 1,4 ± 0,14 e 7,2 ± 1,3, respectivamente). 83A:476 também revelou alguma regulação positiva do gene TanjilG_05042 (até 3,8 vezes); no entanto, os níveis de expressão relativos alcançados (0,044 ± 0,002) foram mais de 30 vezes menores do que os observados em Mandelup e na população 22660. analisados ​​por qPCR mostraram diferenças significativas nos níveis de expressão entre genótipos em variantes simuladas vacinadas (controle), atingindo uma diferença de 58 vezes entre as populações 22660 e 83A:476, bem como entre as populações 22660 e 22660. Uma diferença de duas vezes foi alcançada entre Boregine e Mandalup.
O gene candidato no locus AnMan, TanjilG_12861, foi ativado em resposta à vacinação em 83A:476 e Mandelup, foi neutro na população 22660 e foi regulado negativamente em Boregine (Fig. 6f). A expressão relativa do gene TanjilG_12861 foi a mais alta em 83A:476 inoculado (0,14 ± 0,01). O gene TanjilG_05080 HSP17.4, proteína de choque térmico de classe I de 17,4 kDa, apresentou níveis de expressão relativa mais baixos em todas as cepas e pontos temporais estudados (Fig. 6g). O valor mais alto foi observado em 24 HPI na população 22660 (0,14 ± 0,02, um aumento de oito vezes na resposta à vacinação).
A comparação dos perfis de expressão gênica (Fig. 7) revelou uma alta correlação entre TanjilG_10657 e quatro outros genes: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) e TanjilG_04706 (r = 0,79). Tais resultados podem indicar corregulação desses genes durante as respostas de defesa. Os genes TanjilG_12861 e TanjilG_23384 apresentaram perfis de expressão distintos, com valores de coeficiente de correlação de Pearson mais baixos (de 0,08 a 0,43 e -0,19 a 0,28, respectivamente) em comparação aos demais genes.
Correlações entre perfis de expressão gênica foram detectadas por PCR quantitativa. As seguintes linhagens de tremoço de folhas estreitas foram analisadas: 83A:476 (resistente, portadora do alelo homozigoto Lanr1), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo homozigoto AnMan), Boregine (resistente, histórico genético desconhecido) e População 22660 (suscetível). Três pontos temporais foram calculados (6, 12 e 24 horas após a inoculação), incluindo plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida de campos de tremoço em Wierzhenice, Polônia, em 1999) e controle (inoculação simulada). A escala mostra o valor do coeficiente de correlação de Pearson.
Com base nos dados obtidos a 6 cavalos de potência por polegada, a análise de WGCNA foi realizada em 9981 DEG identificados pela comparação de plantas inoculadas e controle, com foco nas respostas de defesa precoce (Tabela Suplementar S12). Vinte e dois módulos gênicos (clusters) foram encontrados com perfis de expressão correlacionados (positivos ou negativos) entre genótipos e variantes experimentais. Em média, os níveis de expressão genética estavam decrescentes na ordem 83A:476 > Mandelup > Boregine > População 22660 (em ambas as variantes, no entanto, essa tendência foi mais forte nas plantas de controle). Em média, os níveis de expressão genética estavam decrescentes na ordem 83A:476 > Mandelup > Boregine > População 22660 (em ambas as variantes, no entanto, essa tendência foi mais forte nas plantas de controle). Na próxima semana, você encontrará uma estimativa de 83A:476 > Mandelup > Boregine > População 22660 (em uma variante, однако, эта tendência de silencio контрольных растений). Em média, os níveis de expressão genética diminuíram na ordem 83A:476 > Mandelup > Boregine > População 22660 (em ambas as variantes, no entanto, essa tendência foi mais forte nas plantas de controle).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > População 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> população 22660 的 顺序 下降 （, 在 种 中 , 这 种 在 在植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 Em sua próxima avaliação, Genov foi informado em 83A:476 > Mandelup > Boregine > População 22660 (однако в обоих вариантах эта Tendência de silêncio no controle russo). Em média, os níveis de expressão genética diminuíram na série 83A:476 > Mandelup > Boregine > População 22660 (no entanto, em ambas as variantes, essa tendência foi mais forte nas plantas de controle).A vacinação resultou em regulação positiva da expressão gênica, especialmente nos módulos 18, 19, 14, 6 e 1 (em ordem decrescente de efeito), regulação negativa (por exemplo, módulos 9 e 20) ou com efeitos neutros (por exemplo, módulos 11, 22, 8 e 13). A análise de enriquecimento do termo GO (Tabela Suplementar S13) revelou “GO: 0006952 Respostas protetoras” para o módulo inoculado (18) com ativação máxima, incluindo genes analisados ​​por qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 e TanjilG_27015), bem como muitos dos módulos de fotossíntese mais suprimidos (9). O concentrador do módulo 18 (Fig. 8) foi identificado como o gene TanjilG_26536, que codifica a proteína LlR18B semelhante a PR-10, e o concentrador do módulo 9 foi identificado como o gene TanjilG_28955, que codifica a proteína PsbQ do fotossistema II. Um gene candidato à resistência à antracnose, Lanr1, TanjilG_05042, foi encontrado no módulo 22 (Fig. 9) e está associado aos termos "GO:0044260 Processos metabólicos macromoleculares celulares" e "GO:0006355 Regulação transcricional, modelagem de DNA", contendo o hub TanjilG_01212. O gene codifica o fator de transcrição de estresse térmico A-4a (HSFA4a).
Análise de rede ponderada da coexpressão gênica de módulos com termos de processos biológicos super-representados "GO: 0006952 Respostas de defesa". A ligação foi simplificada para destacar os quatro genes analisados ​​por qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 e TanjilG_27015).
Análise de rede ponderada da coexpressão gênica de um módulo com um termo de processo biológico super-representado "GO: 0006355: Regulação transcricional, modelagem de DNA" e portador de um gene candidato à resistência à antracnose, Lanr1 TanjilG_05042. A ligação foi simplificada para isolar o gene TanjilG_05042 e o gene central TanjilG_01212.
A triagem de resistência à antracnose coletada na Austrália mostrou que a maioria das cultivares lançadas precocemente eram suscetíveis; Kalya, Coromup e Mandelup foram descritas como moderadamente resistentes, enquanto Wonga, Tanjil e 83A:476 foram descritas como altamente resistentes26,27,31. tinham o mesmo alelo de resistência, designado Lanr1, e Coromup e Mandelup tinham um alelo diferente, designado AnMan10, 26, 39, enquanto Kalya transmitiu um alelo diferente. , Lanr2. A triagem de resistência à antracnose na Alemanha resultou na identificação de uma linhagem resistente Bo7212 com um alelo candidato diferente de Lanr1, designado LanrBo36.
Nosso estudo revelou uma frequência muito baixa (cerca de 6%) do alelo Lanr1 no germoplasma testado. Essa observação é consistente com os resultados da triagem de germoplasma do Leste Europeu usando os marcadores Anseq3 e Anseq4, que mostraram que o alelo Lanr1 está presente em apenas duas linhagens bielorrussas. Isso sugere que o alelo Lanr1 ainda não é amplamente utilizado por programas de melhoramento locais, ao contrário da Austrália, onde é um dos alelos-chave para o melhoramento assistido por marcadores. Isso pode ser devido ao menor nível de resistência fornecido pelo alelo Lanr1 em condições de campo europeias em comparação com o relatório australiano. Além disso, estudos de antracnose em áreas de alta pluviosidade na Austrália mostraram que as respostas de resistência mediadas pelo alelo Lanr1 podem não ser eficazes em condições climáticas que favorecem o crescimento e o rápido desenvolvimento do patógeno19,42. De fato, no presente estudo, alguns sintomas de antracnose também foram observados em genótipos portadores do alelo Lanr1, sugerindo que a resistência pode desaparecer em condições ideais para o desenvolvimento de C. lupini. Além disso, interpretações falso-positivas da presença dos marcadores Anseq3 e Anseq4, que estão aproximadamente 1 cM do locus Lanr1, são possíveis 28,30,43 .
Nosso estudo mostrou que 83A:476, portador do alelo Lanr1, respondeu à inoculação de C. lupini com reprogramação transcriptômica em larga escala no primeiro momento analisado (6 hpi), enquanto em Mandelup, portador do alelo AnMan, as respostas transcriptômicas foram observadas muito mais tarde (de 24 a 48 hp). Essas variações temporais nas respostas de defesa estão associadas a diferenças nos sintomas da doença, destacando a importância do reconhecimento precoce do patógeno para uma resposta bem-sucedida à resistência. Para infectar o tecido vegetal, os esporos de antraz devem passar por vários estágios de desenvolvimento na superfície do hospedeiro, incluindo germinação, divisão celular e formação de um apressório. Um apêndice é uma estrutura infecciosa que se liga à superfície do hospedeiro e facilita a penetração nos tecidos do hospedeiro. Assim, esporos de C. gloeosporioides em extrato de ervilha mostraram a primeira divisão do núcleo após 75-90 minutos de incubação, a formação de um tubo germinativo após 90-120 minutos e supressão após 4 horas 45 . C. gloeosporioides de manga mostrou mais de 40% de germinação de conídios após 3 horas de incubação e cerca de 20% de formação de apressores após 4 horas. O gene CAP20 associado à virulência de C. gloeosporioides mostrou atividade transcricional em conídios formadores de epífitas após 3,5 h de incubação em cera de superfície de abacate com altas concentrações de proteína CAP20 após 4 h 46 min. Similarmente, a atividade dos genes de biossíntese de melanina em C. trifolii foi induzida durante uma incubação de 2 horas seguida pela formação de um apressório após 1 hora. Estudos de tecidos foliares mostraram que morangos inoculados com C. acutatum apresentam primeira supressão em 8 hpi, enquanto tomates inoculados com C. coccodes apresentam primeira supressão em 4 hpi48,49. Isso é amplamente consistente com a escala de tempo do processo infeccioso de Colletotrichum spp. Respostas rápidas de defesa a 83A:476 sugerem o envolvimento de genes de resistência de plantas e de imunidade desencadeada por efetores (ETI) nessa linhagem, enquanto as respostas tardias de Mandelup apoiam a hipótese de imunidade desencadeada por padrões moleculares microassociados (MTI) 50. Respostas precoces a 83A:476 e Mandelup. A sobreposição parcial entre genes regulados para cima ou para baixo na resposta tardia também apoia esse conceito, já que a ETI é frequentemente considerada uma resposta de MTI acelerada e intensificada que culmina na morte celular programada no local da infecção, conhecida como choque anafilático 51,52.
A maioria dos genes atribuídos ao termo super-representado Gene Ontology GO:0006952 “Resposta de Defesa” são os 11 homólogos da proteína 22 da mensagem de jejum induzida por estresse (semelhante a SAM22) e as sete principais proteínas semelhantes à proteína do látex (MLPs). As proteínas semelhantes a SAM22 31, 34, 43 e 423 apresentaram similaridade de sequência. Os genes semelhantes a SAM22 apresentaram ativação significativa e duradoura, apresentando níveis aumentados de resistência à antracnose (83A:476 e Boregine). No entanto, os genes semelhantes a MLP foram regulados negativamente apenas em linhagens portadoras do alelo candidato à resistência (83A:476/Lanr1 em 6 hpi e Mandelup/AnMan em 24 hpi). Deve-se notar que todos os homólogos semelhantes a SAM22 identificados se originam de um cluster de genes abrangendo aproximadamente 105 kb, enquanto os genes semelhantes a MLP se originam de regiões separadas do genoma. A ativação coordenada desses genes semelhantes a SAM22 também foi encontrada em nosso estudo anterior sobre a resistência de NLL à inoculação de Diaporthetoxica, sugerindo que eles estão envolvidos nos componentes horizontais da resposta de defesa. Essa conclusão também é corroborada por relatos de uma resposta positiva de genes semelhantes a SAM22 a lesões ou tratamentos com ácido salicílico, indutores fúngicos ou peróxido de hidrogênio.
Genes semelhantes a MLP demonstraram responder a vários estresses abióticos e bióticos, incluindo infecções bacterianas, virais e fúngicas patogênicas em muitas espécies de plantas55. As direções de resposta a certas interações entre plantas e patógenos variaram de forte aumento (ou seja, durante a infestação de algodão com Verticillium dahliae) a significativamente decrescente (ou seja, após a infecção de macieira com Alternaria spp.)56,57. Uma regulação negativa significativa do gene 423 semelhante a MLP foi observada durante as defesas do abacate à infecção por F. niger e durante a infecção da macieira Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola e Alternaria alternata são patótipos de maçã58,59. Além disso, calos de macieira que superexpressam o gene 423 semelhante a MLP apresentaram menor expressão de genes associados à resistência e foram mais suscetíveis à infecção fúngica59. Após Fusarium oxysporum f, o gene 423 semelhante a MLP também foi suprimido em germoplasma de feijão comum resistente. cn. Infecção do feijão 60.
Outros membros da família PR-10 identificados em nosso estudo de RNA-seq foram os genes LlR18A e LlR18B em resposta à regulação positiva, bem como o gene regulado positivamente (1 gene) ou regulado negativamente (3 genes) para a proteína de transferência de lipídios DIR1. Além disso, a WGCNA destaca o gene LlR18B como um centro neste módulo, que é altamente suscetível à vacinação e carrega vários genes de resposta protetora. Os genes LlR18A e LlR18B foram induzidos em folhas de tremoço amarelo em resposta a bactérias patogênicas, bem como em caules NLL após inoculação de D. toxica, enquanto o homólogo de arroz desses genes, RSOsPR10, foi rapidamente induzido por uma infecção fúngica presumivelmente envolvida na via de sinalização do ácido jasmônico53,61, 62. O gene DIR1 codifica proteínas de transporte de lipídios não específicas que são necessárias para o início da resistência adquirida sistêmica (SAR). Com o desenvolvimento de reações protetoras, a proteína DIR1 é transportada do foco de infecção através do floema para induzir SAR em órgãos distantes. Curiosamente, o gene TanjilG_02313 DIR1 foi induzido significativamente no primeiro momento nas linhagens 84A:476 e na População 22660, mas a resistência à antracnose desenvolveu-se com sucesso apenas na linhagem 84A:476. Isso pode indicar alguma subfuncionalização do gene DIR1 em NLL, uma vez que os três homólogos restantes responderam à inoculação apenas na linhagem 83A:476, às 6 hpi, e essa resposta foi direcionada para baixo.
Em nosso estudo, os componentes mais comuns correspondentes ao processo biológico denominado "GO:0055114 Processo Redox" foram a proteína do citocromo P450, a peroxidase, a 9S-/13S-lipoxigenase do ácido linoleico e a 1-aminociclopropano-1-ácido carboxílico oxidase. Além disso, nosso WGCNA define o homólogo HSFA4a como um hub que carrega módulos como o candidato a gene de resistência à Lanr1, TanjilG_05042. HSFA4a é um componente da regulação dependente de redox da transcrição nuclear em plantas.
As proteínas do citocromo P450 são oxidorredutases que catalisam reações de hidroxilação dependentes de NADPH e/ou O2 no metabolismo primário e secundário, incluindo o metabolismo de xenobióticos, bem como hormônios, ácidos graxos, esteróis, componentes da parede celular, biopolímeros e a biossíntese de compostos protetores 69. Em nosso estudo, a variabilidade na função do citocromo P450 em plantas foi reduzida de -10,6 log2 (mudança de dobra) para 5,7 devido a um grande número de homólogos alterados (37) e diferenças nos padrões de resposta entre genes específicos, refletindo uma revisão para cima. Usar apenas dados de RNA-seq para elucidar a suposta função biológica dos genes NLL em uma superfamília de proteínas tão grande seria altamente especulativo. No entanto, vale a pena notar que alguns genes do citocromo P450 estão associados ao aumento da resistência a fungos ou bactérias patogênicos, incluindo uma contribuição para reações alérgicas 69,70,71.
Peroxidases de classe III são enzimas vegetais multifuncionais envolvidas em uma ampla gama de processos metabólicos durante o crescimento e desenvolvimento da planta, bem como em resposta a estresses ambientais, como salinidade, seca, alta intensidade de luz e ataque de patógenos72. As peroxidases estão envolvidas na interação de várias espécies de plantas com Anthracis, incluindo Stylosanthes humilis e C. gloeosporioides, Lens culinaris e C. truncatum, Phaseolus vulgaris e C. lindemuthianum, Cucumis sativus e C. lagenarium73,74,75,76. A resposta é muito rápida, às vezes até mesmo em 4 HPI, antes do fungo penetrar no tecido da planta73. O gene da peroxidase também respondeu à inoculação de NLL de D. toxica. Além de suas funções típicas de regular a explosão oxidativa ou eliminar o estresse oxidativo, as peroxidases podem interferir no crescimento do patógeno criando barreiras físicas baseadas no reforço da parede celular durante a lignificação, subunidade ou reticulação de compostos específicos. Essa função pode ser atribuída in silico ao gene TanjilG_03329 que codifica uma suposta peroxidase aniônica formadora de lignina que foi significativamente regulada positivamente em nosso estudo na linhagem resistente 83A:476 em 6 HPI, mas não em outras cepas e pontos de tempo que não responderam.
A 9S-/13S-lipoxigenase do ácido linoleico é a primeira etapa da via oxidativa da biossíntese de lipídios78. Os produtos dessa via têm múltiplas funções na defesa vegetal, incluindo o fortalecimento da parede celular por meio da formação de depósitos de calose e pectina, e a regulação do estresse oxidativo por meio da produção de espécies reativas de oxigênio79,80,81,82,83. No presente estudo, a expressão da 9S-/13S-lipoxigenase do ácido linoleico foi alterada em todas as linhagens, mas na população suscetível 22660, a regulação positiva prevaleceu em diferentes momentos, enquanto nas linhagens portadoras do alelo Lanr1 resistente e do alelo AnMan, isso enfatiza a diversificação da camada de oxilipina nas reações protetoras contra o antraz entre esses genótipos.
O homólogo da 1-aminociclopropano-1-carboxilato oxidase (ACO) foi significativamente regulado positivamente (9 genes) ou negativamente (2 genes) quando inoculado com tremoço. Com duas exceções, todas essas respostas ocorreram a 6 hp em 83A:476. A reação enzimática mediada por proteínas ACO é a etapa limitante da taxa de produção de etileno e, portanto, é altamente regulada84. O etileno é um hormônio vegetal que desempenha uma variedade de papéis na regulação do desenvolvimento vegetal e na resposta a condições de estresse abiótico e biótico. A indução da transcrição da ACO e a ativação da via de sinalização do etileno estão envolvidas no aumento da resistência do arroz ao fungo hemibiotrófico Oryzae oryzae, regulando a produção de espécies reativas de oxigênio e fitoalexinas. Um processo de infecção foliar muito semelhante encontrado entre M. oryzae e C. lupini88,89, no contexto de uma regulação positiva significativa de homólogos de ACO na linha 83A:476 relatada neste estudo, muda a possibilidade de conferir resistência à antracnose NLL Etileno uma etapa central de sinalização nas vias moleculares.
No presente estudo, a supressão em larga escala de muitos genes associados à fotossíntese foi observada em 6 hpi em 83A:476 e em 48 hpi em Mandeloop e na população de 22660. A extensão e a progressão dessas alterações são proporcionais ao nível. A resistência à antracnose foi observada neste experimento. Recentemente, a repressão forte e precoce de transcritos relacionados à fotossíntese foi relatada em vários modelos de interações planta-patógeno, incluindo bactérias e fungos patogênicos. A aceleração (a partir de 2 HPI em algumas interações) e a supressão global de genes associados à fotossíntese em resposta à infecção podem desencadear a imunidade da planta com base na implantação de espécies reativas de oxigênio e sua interação com a via do ácido salicílico para mediar reações alérgicas 90,94.
Em conclusão, os mecanismos de resposta de defesa propostos para a linhagem mais resistente (83A:476) incluem o rápido reconhecimento do patógeno pelo gene R (presumivelmente TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) e a sinalização por ácido salicílico e etileno mediada por resposta alérgica, seguida pelo estabelecimento de SAR de longo alcance. A ação é apoiada pela proteína DIR-1. Deve-se notar que o período biotrófico para a infecção por C. lupini é muito curto (aproximadamente 2 dias), seguido por crescimento necrótico95. A transição entre esses estágios pode estar associada à necrose e à expressão de proteínas induzíveis por etileno que atuam como gatilhos para reações de hipersensibilidade em plantas hospedeiras. Portanto, a janela de tempo para a captura bem-sucedida de C. lupini no estágio biotrófico é muito estreita. A reprogramação de genes associados à redox e à fotossíntese observada em 83A:476 a 6 hpi é consistente com a progressão das hifas fúngicas e prenuncia o desenvolvimento de uma resposta protetora bem-sucedida no estágio biotrófico. As respostas transcriptômicas de Mandelup e da população 22660 podem ser muito tardias para capturar o fungo antes da transição para o crescimento necrótico. No entanto, Mandelup pode ser mais eficaz do que a população 22660, pois a regulação relativamente rápida da proteína PR-10 promove a resistência horizontal.
A ETI, impulsionada pelo gene R canônico, parece ser um mecanismo comum para a resistência do feijão à antracnose. Assim, na leguminosa modelo Medicago truncatula, a resistência à antracnose é conferida pelo gene RCT1, um membro da classe de genes R da planta TIR-NBS-LRR97. Este gene também confere resistência de amplo espectro à antracnose na alfafa quando transferido para plantas suscetíveis. No feijão comum (P. vulgaris), mais de duas dúzias de genes de resistência à antracnose foram identificados até o momento. Alguns desses genes são encontrados em regiões sem quaisquer genes R canônicos, no entanto, muitos outros estão localizados nas bordas dos cromossomos que carregam o cluster de genes NBS-LRR, incluindo TIR-NBS-LRRs99. O estudo SSR de todo o genoma também confirmou a associação do gene NBS-LRR com a resistência à antracnose no feijão comum. O gene R canônico também foi encontrado na região genômica que contém o principal locus de resistência à antracnose no tremoço branco 101.
Nosso trabalho demonstra que uma reação de resistência imediata, ativada em um estágio inicial da infecção da planta (preferencialmente não depois de 12 hpi), protege efetivamente o tremoço-de-folhas-estreitas da antracnose causada pelo fungo patogênico Collelotrichum lupini. Utilizando sequenciamento de alto rendimento, demonstramos perfis de expressão diferencial de genes de resistência à antracnose em plantas NLL mediados pelos genes de resistência Lanr1 e AnMan. A defesa bem-sucedida envolve o planejamento cuidadoso dos genes para proteínas envolvidas em redox, fotossíntese e patogênese dentro de horas do primeiro contato da planta com um patógeno. Reações de proteção semelhantes, mas retardadas no tempo, são muito menos eficazes na proteção de plantas contra doenças. A resistência ao antraz mediada pelo gene Lanr1 assemelha-se à resposta rápida típica do gene R (imunidade desencadeada por efetor), enquanto o gene AnMan provavelmente fornece uma resposta horizontal (imunidade desencadeada por um padrão molecular associado a micróbios), proporcionando um nível moderado de sustentabilidade.
As 215 linhagens NLL utilizadas para triagem de marcadores de antracnose consistiram em 74 cultivares, 60 linhagens obtidas por cruzamento ou melhoramento genético, 5 mutantes e 76 germoplasmas selvagens ou originais. As linhagens vieram de 17 países, principalmente da Polônia (58), Espanha (47), Alemanha (27), Austrália (26), Rússia (19), Bielorrússia (7), Itália (5) e outras linhagens de 10 países. O conjunto também inclui linhagens resistentes de referência: 83A:476, Tanjil, Wonga portadoras do alelo Lanr1 e Mandelup portadora do alelo AnMan. As linhagens foram obtidas do Banco de Dados Europeu de Recursos Genéticos de Lupino mantido pela Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polônia (Tabela Suplementar S1).
As plantas foram cultivadas sob condições controladas (fotoperíodo de 16 horas, temperatura de 25°C durante o dia e 18°C ​​à noite). Duas réplicas biológicas foram analisadas. O DNA foi isolado de folhas de três semanas de idade usando o DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com o protocolo. A qualidade e a concentração do DNA isolado foram avaliadas por métodos espectrofotométricos (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). O marcador AnManM1 marcando o gene de resistência à antracnose AnMan (derivado da cv. Mandelup) e os marcadores Anseq3 e Anseq4 flanqueando o gene Lanr1 (derivado da cv. Tanjil) foram analisados ​​11,26,28. Homozigotos para o alelo resistente foram pontuados como "1", suscetíveis - como "0" e heterozigotos - como 0,5.
Com base nos resultados da triagem dos marcadores AnManM1, AnSeq3 e AnSeq4 e na disponibilidade de sementes para experimentos finais de acompanhamento, 50 linhagens de NLL foram selecionadas para fenotipagem de resistência à antracnose. A análise foi realizada em duplicata em uma estufa controlada por computador com fotoperíodo de 14 horas e faixa de temperatura de 22 °C durante o dia e 19 °C à noite. As sementes são raspadas (cortando o tegumento no lado oposto do embrião com uma lâmina afiada) antes da semeadura para evitar dormência devido ao tegumento ser muito duro e para garantir germinação uniforme. As plantas foram cultivadas em vasos (11 × 11 × 21 cm) com solo estéril (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsóvia, Polônia). A inoculação foi realizada com a cepa Colletotrichum lupini Col-08, cultivada em 1999 a partir de caules de plantas de tremoço de folhas estreitas cultivadas em um campo em Verzhenitsa, Grande Polônia (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Obtenha uma área. Os isolados foram cultivados em meio SNA a 20° C sob luz negra por 21 dias para induzir a esporulação. Quatro semanas após a semeadura, quando as plantas atingiram o estágio de 4-6 folhas, a inoculação foi realizada por pulverização com uma suspensão de conídios a uma concentração de 0,5 x 106 conídios por ml. Após a inoculação, as plantas foram mantidas no escuro por 24 horas a uma umidade de cerca de 98% e uma temperatura de 25° C para facilitar a germinação dos conídios e o processo de infecção. As plantas foram então cultivadas sob fotoperíodo de 14 horas a 22°C durante o dia/19°C durante a noite e 70% de umidade. A pontuação da doença foi obtida 22 dias após a inoculação e variou de 0 (imune) a 9 (muito suscetível), dependendo da presença ou ausência de lesões necróticas nos caules e folhas. Além disso, após a pontuação, o peso das plantas foi medido. As relações entre os genótipos marcadores e os fenótipos da doença foram calculadas como correlações de sequência de ponto dois (ausência de marcadores heterozigotos no conjunto de linhagens para análise do fenótipo de resistência à antracnose).