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O tremoço-angustifolius (NLL, Lupinus angustifolius L.) é uma planta leguminosa utilizada na produção de alimentos e na melhoria do solo. A expansão global do NLL como cultura atraiu muitos fungos patogênicos, incluindo o fungo da antracnose do tremoço, causador da devastadora doença da antracnose. Dois alelos, Lanr1 e AnMan, que conferem maior resistência, têm sido utilizados no melhoramento genético do NLL, mas os mecanismos moleculares subjacentes permanecem desconhecidos. Neste estudo, os marcadores Lanr1 e AnMan foram utilizados para selecionar amostras europeias de NLL. Testes da vacina em ambiente controlado confirmaram a eficácia de ambos os doadores resistentes. O perfil de expressão gênica diferencial foi realizado em linhagens representativas resistentes e suscetíveis. A resistência à antracnose foi associada à superexpressão dos termos de ontologia gênica “GO:0006952 Resposta de Defesa”, “GO:0055114 Processo Redox” e “GO:0015979 Fotossíntese”. Além disso, a linhagem Lanr1(83A:476) apresentou reprogramação significativa do transcriptoma logo após a inoculação, enquanto as outras linhagens mostraram um atraso nessa resposta de cerca de 42 horas. As respostas de defesa estão associadas aos genes TIR-NBS, CC-NBS-LRR e NBS-LRR, 10 proteínas envolvidas na patogênese, proteínas de transferência de lipídios, endoglucano-1,3-β-glicosidase, proteínas da parede celular ricas em glicina e genes da via reativa do oxigênio. As respostas iniciais ao 83A:476, incluindo a supressão cuidadosa de genes associados à fotossíntese, coincidiram com a proteção bem-sucedida durante a fase de crescimento vegetativo do fungo, sugerindo que um efetor desencadeia a imunidade. A reação de Mandeloop é retardada, assim como o arrasto horizontal geral.
O tremoço-de-folhas-estreitas (NLL, Lupinus angustifolius L.) é um cereal rico em proteínas originário da região do Mediterrâneo Ocidental^1,2. Atualmente, é cultivado como alimento para animais e humanos. Também é considerado adubo verde em sistemas de rotação de culturas devido à fixação de nitrogênio por bactérias simbióticas fixadoras de nitrogênio e à melhoria geral da estrutura do solo. O NLL passou por um rápido processo de domesticação no último século e ainda está sob forte pressão de melhoramento genético^{3,4,5,6,7,8,9,10,11,12}. Com o cultivo disseminado do NLL, a sucessão de fungos patogênicos desenvolveu novos nichos agrícolas e causou novas doenças que destroem as culturas. O mais notável para os agricultores e criadores de tremoço foi o aparecimento da antracnose, causada pelo fungo patogénico, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. O mais notável para os agricultores e criadores de tremoço foi o aparecimento da antracnose, causada pelo fungo patogénico, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. A escolha certa para fermicidades e seleções é feita de forma antrópica, útil грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. O mais notável para os agricultores e criadores de tremoço foi o surgimento da antracnose causada pelo fungo patogênico Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的。Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Cabeludo。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. O que mais impressiona os agricultores e criadores de tremoço é o surgimento da antracnose causada pelo fungo patogênico Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Os primeiros relatos da doença vieram do Brasil e dos Estados Unidos, com sintomas típicos aparecendo em 1912 e 1929, respectivamente. No entanto, após cerca de 30 anos, o patógeno foi designado como Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorfo Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfo Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorfo de Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.,有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.,有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld em morfologias famosas. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld em Morfologia Alvo. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .e H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。e H. Schlenk, .A fenotipagem preliminar da doença, realizada em meados do século XX, mostrou alguma resistência em acessos de tremoço amarelo (L. luteus L.) e tremoço-branco (L. albus L.), mas todos os acessos de tremoço-branco testados foram altamente suscetíveis^15,16. Estudos demonstraram que o desenvolvimento da antracnose está associado ao aumento da precipitação (umidade do ar) e da temperatura (na faixa de 12-28 °C), levando à quebra da resistência em temperaturas mais elevadas^17,18. De fato, o tempo necessário para a germinação dos conídios e o início da doença foi quatro vezes menor a 24 °C (4 horas) do que a 12 °C (16 horas) em condições de alta umidade¹⁹. Assim, o aquecimento global em curso levou à disseminação da antracnose. No entanto, a doença foi observada na França (1982) e na Ucrânia (1983) como um prenúncio de uma ameaça iminente, mas aparentemente foi ignorada pela indústria do tremoço na época^20,21. Alguns anos depois, essa doença devastadora se espalhou pelo mundo e também afetou importantes países produtores de tremoço, como Austrália, Polônia e Alemanha22,23,24. Após um surto de antracnose em meados da década de 1990, uma extensa triagem resultou na identificação de vários doadores resistentes em amostras de NLL19. A resistência do NLL à antracnose é controlada por dois alelos dominantes distintos encontrados em diferentes fontes de germoplasma: Lanr1 nas cultivares Tanjil e Wonga e AnMan na cultivar Mandalay25,26. Esses alelos complementam os marcadores moleculares que auxiliam na seleção de germoplasma resistente em programas de melhoramento25,26,27,28,29,30. A linhagem resistente 83A:476, portadora do alelo Lanr1, foi cruzada com a linhagem selvagem suscetível P27255 para obter uma população RIL segregante para resistência à antracnose, o que possibilitou a localização do lócus Lanr1 no cromossomo NLL-1131, 32, 33. O alinhamento de marcadores de mapa de ligação de lócus de resistência flanqueadores à antracnose com uma estrutura genômica, NLL, revelou a localização dos três alelos no mesmo cromossomo (NLL-11), porém em posições diferentes29,34,35. Contudo, devido ao pequeno número de RILs e à grande distância genética entre os marcadores e os alelos correspondentes, não é possível tirar conclusões confiáveis ​​sobre seus genes subjacentes. Por outro lado, o uso da genética reversa em tremoceiros é difícil devido ao seu baixíssimo potencial de regeneração, o que torna a manipulação genética trabalhosa37.
O desenvolvimento de germoplasma domesticado portador do alelo desejado em estado homozigoto, como 83A:476 (Lanr1) e Mandelup (AnMan), abriu caminho para o estudo da resistência à antracnose, mesmo diante da presença de combinações opostas de alelos em populações selvagens. Possibilidades de mecanismos moleculares. Comparação das respostas de defesa geradas por genótipos específicos. Este estudo avaliou a resposta inicial do transcriptoma de NLL à vacinação contra C. lupini. Inicialmente, um painel de germoplasma europeu de NLL contendo 215 linhagens foi triado utilizando marcadores moleculares que identificam os alelos Lanr1 e AnMan. A fenotipagem da antracnose foi então realizada em 50 linhagens de NLL, previamente selecionadas por marcadores moleculares, sob condições controladas. Com base nesses experimentos, quatro linhagens com diferentes níveis de resistência à antracnose e composição alélica Lanr1/AnMan foram selecionadas para o perfil de expressão diferencial de genes de defesa utilizando duas abordagens complementares: sequenciamento de RNA de alto rendimento e quantificação por PCR em tempo real.
A triagem de um conjunto de germoplasma NLL (N = 215) com os marcadores Lanr1 (Anseq3 e Anseq4), AnMan (Anseq4) e AnMan (AnManM1) mostrou que apenas uma linhagem (95726, próxima a Salamanca-b) amplifica o alelo de “resistência” para todos os marcadores, enquanto a “Presença de alelos 'suscetíveis'” foi encontrada em 158 linhagens (~73,5%). Treze linhagens produziram dois alelos “resistentes” para o marcador Lanr1 e oito linhagens produziram alelos “resistentes” para o marcador AnMan (Tabela Suplementar S1). Duas linhagens foram heterozigotas para o marcador Anseq3 e uma heterozigota para o marcador AnManM1. Quarenta e duas linhagens (19,5%) apresentaram fases opostas dos alelos Anseq3 e Anseq4, indicando uma alta frequência de recombinação entre esses dois loci. Os fenótipos de antracnose em condições controladas (Tabela Suplementar S2) revelaram variabilidade na resistência dos genótipos testados, o que se refletiu na severidade da antracnose. As diferenças nas pontuações médias variaram de 1,8 (moderadamente resistente) a 6,9 (suscetível) e as diferenças no peso das plantas variaram de 0,62 g (suscetível) a 4,45 g (resistente). Houve uma correlação significativa entre os valores observados em duas repetições do experimento (0,51 para os índices de severidade da doença, P = 0,00017 e 0,61 para o peso da planta, P < 0,0001), bem como entre esses dois parâmetros (− 0,59 e − 0,77, P < 0,0001). Houve uma correlação significativa entre os valores observados em duas repetições do experimento (0,51 para os índices de severidade da doença, P = 0,00017 e 0,61 para o peso da planta, P < 0,0001), bem como entre esses dois parâmetros (− 0,59 e − 0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 e 0,61 para o máximo de durabilidade, P < 0,0001), e também o mesmo valor do parâmetro (-0,59 e -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Foi encontrada uma correlação significativa entre os valores observados em duas repetições do experimento (0,51 para os escores de severidade da doença, P = 0,00017 e 0,61 para o peso da planta, P < 0,0001), bem como entre esses dois parâmetros (-0,59 e -0,77, P < 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为0,51，P = 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 e - 0,77，P < 0,0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为分为 0,51, p = 0,00017, 植物 为 为 0,61, p <0,0001）和 – 0,59 和– 0,59 和- 0,77，P < 0,0001)。 Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести Valor 0,51, P = 0,00017 e massa растения 0,61, P <0,0001), e между этими двумя параметрами (-0,59 e -0,0001) 0,77, P <0,0001. Houve uma correlação significativa entre os valores observados em duplicado (escore de severidade da doença 0,51, P = 0,00017 e peso da planta 0,61, P < 0,0001) e entre esses dois parâmetros (-0,59 e -0,0001) 0,77, P<0,0001. ).Os sintomas típicos observados em plantas suscetíveis incluem o encurvamento e a torção do caule, assemelhando-se a uma estrutura em “arco de pastor”, seguidos por lesões ovais com esporozoítos laranja/rosa (Figura Suplementar 1). Acessos australianos portadores dos genes Lanr1 (83A:476 e Tanjil) e AnMan (Mandelup) são moderadamente resistentes (p < 0,001, p < 0,001, p < 0,001). Algumas linhagens que também carregam alelos “resistentes” de Lanr1 e/ou AnMan apresentam sintomas da doença.
Curiosamente, algumas linhagens NLL que não possuíam nenhum alelo marcador de "resistência" revelaram um alto nível de resistência à antracnose (comparável ou superior ao dos genótipos Lanr1 ou AnMan), como Boregine (valor de P < 0,0001 para ambos os parâmetros), Bojar (valor de P < 0,0001 para pontuação e 0,001 para peso da planta) e População B-549/79b (valor de P < 0,0001 para pontuação e não significativo para peso). Curiosamente, algumas linhagens NLL que não possuíam nenhum alelo marcador de "resistência" revelaram um alto nível de resistência à antracnose (comparável ou superior ao dos genótipos Lanr1 ou AnMan), como Boregine (valor de P < 0,0001 para ambos os parâmetros), Bojar (valor de P < 0,0001 para pontuação e 0,001 para peso da planta) e População B-549/79b (valor de P < 0,0001 para pontuação e não significativo para peso). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 para оценки e 0,001 para массы растения) e популяции B-549/79b (значение P <0,0001 para оценки и незначимо для массы). Curiosamente, várias linhagens NLL que não possuíam nenhum alelo marcador de 'resistência' apresentaram um alto nível de resistência à antracnose (comparável ou superior ao dos genótipos Lanr1 ou AnMan), como Boregine (valor de P < 0,0001 para ambos os parâmetros), Bojar (valor de P < 0,0001 para avaliação e 0,001 para peso da planta) e a população B-549/79b (valor de P < 0,0001 para avaliação e não significativo para peso).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）。 É interessante notar que alguns sistemas NLL que não possuem marcadores “antigênicos” apresentam alta resistência horizontal (equivalente aos genes Lanr1 ou AnMan ou superior), como Boregine (ambos os parâmetros P < 0,0001), Bojar (valor de P < 0,0001, peso da planta 0,001) e a cepa B-549/79b (valor de P < 0,0001, peso não significativo). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 ou AnMan), assim como Boregine (значение P para обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) e população B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Curiosamente, algumas linhagens NLL que não possuíam nenhum alelo marcador de 'resistência' apresentaram altos níveis de resistência à antracnose (comparáveis ​​ou superiores aos genótipos Lanr1 ou AnMan), como Boregine (valor de P para ambos os parâmetros <0,0001), Bojar (valor de P < 0,0001, peso da planta 0,001) e a população B-549/79b (valor de P < 0,0001, peso não significativo).Este fenômeno sugere a possibilidade de uma nova fonte genética de resistência, explicando a falta de correlação observada entre os genótipos dos marcadores e os fenótipos da doença (valores de P de ~0,42 a ~0,98). Assim, o teste de Kolmogorov-Smirnov mostrou que os dados sobre a resistência à antracnose apresentaram distribuição aproximadamente normal para os escores (valores de P de 0,25 e 0,11) e para a massa da planta (valores de P de 0,47 e 0,55), sugerindo que, na minha hipótese, mais alelos além de Lanr1 e AnMan estejam envolvidos.
Com base nos resultados da triagem de resistência à antracnose, 4 linhagens foram selecionadas para análise do transcriptoma: 83A:476, Boregine, Mandelup e População 22660. Essas linhagens foram retestadas quanto à resistência ao antraz em experimentos de inoculação por sequenciamento de RNA, desde que os resultados fossem os mesmos do teste anterior. Os valores de pontuação foram os seguintes: Boregine (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) e População 22660 (6,11 ± 1,29).
O protocolo Illumina NovaSeq 6000 alcançou uma média de 40,5 Mreads pares por amostra (29,7 a 54,4 Mreads) (Tabela Suplementar S3). Os índices de alinhamento na sequência de referência variaram de 75,5% a 88,6%. A correlação média dos dados de contagem de leitura entre as variantes experimentais entre as réplicas biológicas variou de 0,812 a 0,997 (média de 0,959). Dos 35.170 genes analisados, 2.917 não apresentaram expressão e os outros 4.785 genes foram expressos em nível insignificante (média base < 5). Dos 35.170 genes analisados, 2.917 não apresentaram expressão e os outros 4.785 genes foram expressos em nível insignificante (média base < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5). Dos 35.170 genes analisados, 2.917 não apresentaram expressão e os 4.785 genes restantes foram expressos em um nível insignificante (média base <5).35.170 pessoas, 2917 pessoas, 4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35.170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 não экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительную экспрессию (em inglês) significado <5). Dos 35.170 genes analisados, 2.917 não foram expressos e os 4.785 genes restantes apresentaram expressão insignificante (média base <5).Assim, o número de genes considerados expressos (média base ≥ 5) durante o experimento foi de 27.468 (78,1%) (Tabela Suplementar S4).
Desde o primeiro ponto de coleta, todas as linhagens NLL responderam à inoculação de C. lupini (cepa Col-08) reprogramando o transcriptoma (Tabela 1); contudo, diferenças significativas foram observadas entre as linhagens. Assim, a linhagem resistente 83A:476 (portadora do gene Lanr1) apresentou reprogramação significativa do transcriptoma no primeiro ponto de coleta (6 hpi), com um aumento de 31 a 69 vezes no número de genes isolados com expressão aumentada e diminuída em comparação com os demais pontos de coleta. Além disso, esse pico foi de curta duração, visto que a expressão de apenas alguns genes permaneceu significativamente alterada no segundo ponto de coleta (12 hpi). Curiosamente, a linhagem Boregine, que também apresentou alto nível de resistência no teste de enxertia, não sofreu uma reprogramação transcricional tão expressiva durante o experimento. Entretanto, o número de genes diferencialmente expressos (DEGs) foi o mesmo para Boregine e 83A:476 às 12 hpi. Tanto Mandelup quanto a população 22660 apresentaram picos de DEG no último ponto de tempo (48 l/s), indicando um atraso relativo nas respostas de defesa.
Como a linhagem 83A:476 sofreu uma reprogramação transcriptômica massiva em resposta a *C. lupini* 6 horas após a inoculação (HPI), em comparação com todas as outras linhagens, aproximadamente 91% dos genes diferencialmente expressos (DEGs) observados nesse momento foram específicos da linhagem (Fig. 1). No entanto, houve alguma sobreposição nas respostas iniciais entre as linhagens estudadas, visto que 68,5%, 50,9% e 52,6% dos DEGs nas linhagens Boregine, Mandelup e na população 22660, respectivamente, coincidiram com aqueles encontrados na linhagem 83A:476 em determinados momentos. Contudo, esses DEGs representaram apenas uma pequena fração (0,97–1,70%) de todos os DEGs detectados até o momento utilizando a linhagem 83A:476. Além disso, 11 DEGs de todas as linhagens foram coerentes neste momento (Tabelas Suplementares S4-S6), incluindo componentes comuns das respostas de defesa da planta: proteína de transferência de lipídios (TanjilG_32225), enzima endoglucano-1,3-β-glicosídeo (TanjilG_23384), duas proteínas induzíveis por estresse como SAM22 (TanjilG_31528 e TanjilG_31531), proteína básica do látex (TanjilG_32352) e duas proteínas estruturais da parede celular ricas em glicina (TanjilG_19701 e TanjilG_19702). Observou-se também uma sobreposição relativamente alta nas respostas do transcriptoma entre 83A:476 e Boregine às 24 HPI (total de 16-38% de DEG) e entre Mandelup e População 22660 às 48 HPI (total de 14-20% de DEG).
Diagrama de Venn mostrando o número de genes diferencialmente expressos (DEG) em linhagens de tremoço-de-folhas-estreitas (NLL) inoculadas com Colletotrichum lupini (estirpe Col-08 obtida de campos de tremoço em Wierzhenice, Polônia, 1999). As linhagens de NLL analisadas foram: 83A:476 (resistente, portadora do alelo Lanr1), Boregine (resistente, fundo genético desconhecido), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo AnMan) e população 22660 (muito suscetível). A abreviação hpi significa horas após a vacinação. Os valores zero foram removidos para simplificar o gráfico.
O conjunto de genes superexpressos às 6 hpi foi analisado quanto à presença de domínios canônicos de genes R (Tabela Suplementar S7). Este estudo revelou a indução do transcriptoma de genes clássicos de resistência a doenças com domínios NBS-LRR apenas em 83A:476. Este conjunto consistia em um gene TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), cinco genes CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 e tanjilg_16162), quatro genes NBS-LR (tanjilg_16162), quatro genes NBS-LRRE (tanjilg_16162), quatro genes NBS-Lrr (tanjilg_16162) e quatro genes NBS-LRR (tanjilg_16162). Todos esses genes possuem domínios canônicos organizados em sequências conservadas. Além dos genes do domínio NBS-LRR, várias cinases RLL foram ativadas 6 hpi, nomeadamente uma em Boregine (TanjilG_19877), duas em Mandelup (TanjilG_07141 e TanjilG_19877) e na população 22660 (TanjilG_09014 e TanjilG_10361) e duas em 83A 27:476.
Os genes com expressão significativamente alterada em resposta à inoculação com C. lupini (cepa Col-08) foram submetidos à análise de enriquecimento de Gene Ontology (GO) (Tabela Suplementar S8). O termo de processo biológico mais frequentemente sobrerrepresentado foi “GO:0006952 resposta de defesa”, que apareceu em 6 das 16 combinações (tempo × linha) com alta significância (valor P < 0,001) (Fig. 2). O termo de processo biológico mais frequentemente sobrerrepresentado foi “GO:0006952 resposta de defesa”, que apareceu em 6 das 16 combinações (tempo × linha) com alta significância (valor P < 0,001) (Fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса por «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся em 6 de 16 (время × linha) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). O termo de processo biológico mais frequentemente sobrerrepresentado foi 'GO:0006952 resposta de defesa', que apareceu em 6 de 16 combinações (tempo × linhagem) com alta significância (valor P < 0,001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 O termo de processo biológico mais representativo é “GO:0006952 resposta de defesa”, que aparece em 6 das 16 combinações (tempo×linha), com alta significância (valor P < 0,001) (Figura 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», который disponível em 6 de 16 combinações (qualquer × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). O termo de processo biológico mais frequentemente sobrerrepresentado foi 'GO:0006952 Resposta de Defesa', que apareceu em 6 das 16 combinações (tempo × linha) com alta significância (valor P < 0,001) (Fig. 2).Este termo apresentou sobrerrepresentação em dois momentos distintos nas linhagens 83A:476 e Boregine (6 e 24 hpi) e em um momento nas linhagens Mandelup e População 22660 (12 e 6 hpi, respectivamente). Este é um resultado esperado, que destaca a resposta antifúngica das linhagens resistentes. Além disso, a linhagem 83A:476 respondeu ao C. lupini induzindo rapidamente genes relacionados à explosão oxidativa, representada pelo termo “GO:0055114 processo redox”, indicando uma resposta de defesa específica, enquanto a linhagem Boregine revelou respostas de defesa específicas, relacionadas ao termo 'GO'. :0006950 Resposta ao estresse”. A população 22660 ativou a resposta de resistência horizontal envolvendo metabólitos secundários, destacando o número excessivo dos termos “GO:0016104 Processo de biossíntese de triterpenos” e “GO:0006722 Processo de metabolismo de triterpenos” (ambos os termos pertencem ao mesmo conjunto de genes). Levando em consideração os resultados da análise de enriquecimento de termos GO, a estabilidade da reação de Mandelup ficou entre a da população Boregine e a da população 22660. Além disso, a reação precoce 83A:476 (6 hpi) e a reação tardia de Mandelup, ambas na população 22660, incluem o termo GO:0015979 'fotossíntese' e outros processos biológicos relacionados.
Os termos de ontologia gênica de bioprocessos selecionados na anotação de genes diferencialmente expressos durante as respostas do transcriptoma do tremoço-de-folhas-estreitas (NLL) inoculado com antraz em tremoço (cepa Col-08 obtida de campos de tremoço em Wierzhenice, Polônia, em 1999) são bastante exagerados. As linhagens de NLL analisadas foram: 83A:476 (resistente, portadora do alelo homozigoto Lanr1), Boregine (resistente, fundo genético desconhecido), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo homozigoto AnMan) e população 22660 (suscetível).
Como este estudo teve como objetivo identificar genes que contribuem para a resistência à antracnose, os genes atribuídos aos termos GO “GO: 0006952 Respostas defensivas” e “GO: 0055114 Processos redox” foram analisados ​​com pontos de corte, uma vez que as médias basais eram ≥ 30 com pelo menos uma linha × ponto no tempo, combinando valores estatisticamente significativos de log2 (razão de mudança). O número de genes que atenderam a esses critérios foi de 65 para GO:0006952 e 524 para GO:0055114.
A análise 83A:476 revelou dois picos de genes diferencialmente expressos (DEGs) anotados com o termo GO:0006952, o primeiro com 6 genes por polegada (64 genes, com regulação positiva e negativa) e o segundo com 24 genes por polegada (15 genes, apenas com regulação positiva). Boregine também mostrou que GO:0006952 atingiu o pico no mesmo ponto temporal, mas com menos DEGs (11 e 8) e ativação preferencial. Mandeloop mostrou dois picos de GO:0006952 em 12 e 48 horas pós-infecção (HPI), ambos contendo 12 genes (o primeiro com genes ativadores e o segundo com apenas genes supressores), enquanto a população 22660 em 6 HPI (13 genes) apresentou maior predominância do pico de regulação positiva. Deve-se notar que 96,4% dos DEGs com GO:0006952 nesses picos apresentaram o mesmo tipo de resposta (ativação ou negativa), indicando uma sobreposição significativa nas respostas de defesa, apesar das diferenças no número de genes envolvidos. O maior grupo de sequências relacionadas ao termo GO:0006952 codifica a Proteína de Mensagem Associada ao Estresse por Inanição 22 (SAM22-like), que pertence ao clado de proteínas associadas à patogênese da classe 10 (PR-10) e à proteína central semelhante ao látex (MLP-like) (Fig. 3). Os dois grupos diferiram na natureza da expressão e na direção da resposta. Os genes que codificam proteínas SAM22-like mostraram indução consistente e significativa em pontos de tempo iniciais (6 ou 12 hpi) e geralmente não responderam ao final do experimento (48 hpi), enquanto as proteínas MLP-like mostraram coordenação em 6 hpi. hpi. 83A:476 e Mandelup em 48 hpi, quase todos os outros pontos de dados não responderam. Além disso, as diferenças nos perfis de expressão dos genes da proteína semelhante a SAM22 acompanharam a variabilidade observada na resistência à antracnose, visto que as linhagens mais resistentes apresentaram mais pontos de tempo com indução significativa desses genes do que as linhagens mais suscetíveis. Outro gene PR-10, semelhante a LlR18A/B, apresentou um padrão de expressão muito similar ao do gene da proteína semelhante a SAM22.
Foram identificados os principais componentes do processo biológico denominado “GO:0006952 Resposta de Defesa” e os padrões de expressão dos genes candidatos dos alelos Lanr1 e AnMan. A escala Log2 representa os valores de log2 (variação relativa) entre plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, linhagem Col-08, obtida de campos de tremoço em Wizhenica, Polônia, 1999) e plantas controle (inoculadas com solução salina) no mesmo ponto temporal. As seguintes linhagens de tremoço-de-folha-estreita foram analisadas: 83A:476 (resistente, portadora do alelo homozigoto Lanr1), Boregine (resistente, fundo genético desconhecido), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo homozigoto AnMan) e População 22660 (suscetível).
Além disso, os perfis de expressão dos genes candidatos de RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) e AnMan (TanjilG_12861) foram avaliados (Fig. 3). O gene TanjilG_05042 apresentou uma resposta significativa (ativação) em 83A:476 apenas no primeiro ponto de tempo (6 hpi), enquanto TanjilG_12861 foi significativo em Mandeloop apenas em dois pontos de tempo: 6 hpi (regulação negativa) e 24 hpi (6 hpi). Com.). ajustável) ).
Os genes mais superexpressos no termo GO:0055114 “processo redox” foram os genes que codificam proteínas do citocromo P450 e peroxidase (Fig. 4). Para as amostras isoladas de 83A:476 às 6 horas pós-inoculação (HPI), os valores máximos ou mínimos de log2 (variação de expressão) (para 86,6% dos genes) foram geralmente observados entre as plantas inoculadas e as plantas controle, destacando a alta resposta desse genótipo à inoculação. 83A:476 apresentou o maior número de genes diferencialmente expressos (DEG) GO:0055114 às 6 hpi (503 genes), enquanto as demais linhagens apresentaram os valores mais significativos às 48 hpi (Boregine, 31 genes; Mandelup, 85 genes; e População 22660, 78 genes). Na maioria dos genes da família GO:0055114, foram observados dois tipos de resposta à vacinação (ativação e inibição). Curiosamente, até 97,6% dos genes diferencialmente expressos (DEGs) identificados para o termo GO: 0055114 em Mandelupe, após 48 horas de cultura, sugerem que, apesar da escala significativamente menor (ou seja, o número de genes redox mutados, 85 versus 503), o padrão de respostas transcriptômicas tardias de Mandelupe à antracnose é semelhante à resposta precoce de 83A:476. Em Boregine e na População 22660, essa convergência é menor, de 51,6% e 75,6%, respectivamente.
Foram revelados os padrões de expressão dos principais componentes do termo do processo biológico “GO:0055114 Processo Redox”. A escala Log2 representa os valores de log2 (variação relativa) entre plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, linhagem Col-08, obtida de campos de tremoço em Wizhenica, Polônia, 1999) e plantas controle (inoculadas com solução salina) no mesmo ponto temporal. As seguintes linhagens de tremoço-de-folha-estreita foram analisadas: 83A:476 (resistente, portadora do alelo homozigoto Lanr1), Boregine (resistente, fundo genético desconhecido), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo homozigoto AnMan) e População 22660 (suscetível).
As respostas transcriptômicas à inoculação com C. lupini (cepa Col-08) também incluíram o silenciamento coordenado de genes atribuídos ao termo GO:0015979 “fotossíntese” e outros processos biológicos relacionados (FIG. 5). Este conjunto de genes diferencialmente expressos (DEGs) GO:0015979 continha 105 genes que foram significativamente reprimidos 6 horas após a inoculação (hpi) em 83A:476. Nesse subconjunto, 37 genes também foram regulados negativamente em Mandelup 48 hpi e 35 no mesmo ponto temporal na população 22660, incluindo 19 DEGs comuns a ambos os genótipos. Nenhum DEG relacionado ao termo GO:0015979 foi significativamente ativado em qualquer combinação (linhagem x tempo).
Foram revelados os padrões de expressão dos principais componentes do termo do processo biológico “GO:0015979 Fotossíntese”. A escala Log2 representa os valores de log2 (variação relativa) entre plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, linhagem Col-08, obtida de campos de tremoço em Wizhenica, Polônia, 1999) e plantas controle (inoculadas com solução salina) no mesmo ponto temporal. As seguintes linhagens de tremoço-de-folha-estreita foram analisadas: 83A:476 (resistente, portadora do alelo homozigoto Lanr1), Boregine (resistente, fundo genético desconhecido), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo homozigoto AnMan) e População 22660 (suscetível).
Com base nos resultados da análise de expressão diferencial e presumivelmente envolvidos em respostas de defesa contra fungos patogênicos, esse conjunto de sete genes foi selecionado para quantificação dos perfis de expressão por PCR em tempo real (Tabela Suplementar S9).
O gene da proteína putativa TanjilG_10657 foi significativamente induzido em todas as linhagens e pontos de tempo estudados, em comparação com as plantas controle (mimetizadoras) (Tabelas Suplementares S10 e S11). Além disso, o perfil de expressão de TanjilG_10657 apresentou uma tendência crescente ao longo do experimento para todas as linhagens. A população 22660 apresentou a maior sensibilidade de TanjilG_10657 à inoculação, com ativação de 114 vezes e o maior nível de expressão relativa (4,4 ± 0,4) em 24 horas pós-inoculação (Figura 6a). O gene da proteína PR10 LlR18A, TanjilG_27015, também apresentou ativação em todas as linhagens e pontos de tempo, com significância estatística na maioria dos pontos de dados (Figura 6b). Semelhante ao TanjilG_10657, o nível de expressão relativa mais alto de TanjilG_27015 foi observado na população inoculada com a cepa 22660 às 24 horas pós-inoculação (19,5 ± 2,4). O gene da endoquitinase ácida TanjilG_04706 apresentou regulação positiva significativa em todas as linhagens e em todos os pontos de tempo, exceto na linhagem Boregine às 6 horas pós-inoculação (Figura 6c). Observou-se forte indução no primeiro ponto de tempo (6 horas pós-inoculação) na linhagem 83A:476 (aumento de 10,5 vezes) e aumento moderado nas demais linhagens (de 6,6 a 7,5 vezes). Durante o experimento, a expressão de TanjilG_04706 manteve-se em níveis semelhantes nas linhagens 83A:476 e Boregine, enquanto nas linhagens Mandelup e 22660 houve aumento significativo, atingindo valores relativamente altos (5,9 ± 1,5 e 6,2 ± 1,5, respectivamente). O gene TanjilG_23384, semelhante à endoglucana-1,3-β-glucosidase, apresentou alta ativação nos dois primeiros pontos de coleta (6 e 12 hpi) em todas as linhagens, exceto na população 22660 (Fig. 6d). Os níveis de expressão relativa mais elevados de TanjilG_23384 foram observados no segundo ponto de coleta (12 hpi) em Mandelup (2,7 ± 0,3) e 83A:476 (1,5 ± 0,1). Às 24 hpi, a expressão de TanjilG_23384 foi relativamente baixa em todas as linhagens estudadas (de 0,04 ± 0,009 a 0,44 ± 0,12).
Perfis de expressão de genes selecionados (ag) revelados por PCR quantitativo. Os números 6, 12 e 24 representam as horas após a vacinação. Os genes LanDExH7 e LanTUB6 foram usados ​​para normalização e o LanTUB6 foi usado para calibração entre séries. As barras de erro representam o desvio padrão com base em três réplicas biológicas, cada uma das quais é a média de três réplicas técnicas. A significância estatística das diferenças nos níveis de expressão entre as plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida em 1999 de um campo de tremoço em Wierzenica, Polônia) e as plantas controle (inoculadas com solução salina) está indicada acima dos pontos de dados (*valor de P < 0,05, **valor de P ≤ 0,01, ***valor de P ≤ 0,001). A significância estatística das diferenças nos níveis de expressão entre as plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida em 1999 de um campo de tremoço em Wierzenica, Polônia) e as plantas controle (inoculadas com solução salina) está indicada acima dos pontos de dados (*valor de P < 0,05, **valor de P ≤ 0,01, ***valor de P ≤ 0,001). Статистическая значимость различий уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен в 1999 por люпина em. Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***valor P ≤ 0,001). Diferenças estatisticamente significativas nos níveis de expressão entre plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida em 1999 de um campo de tremoços em Wierzhenice, Polônia) e plantas controle (inoculadas com solução salina) são indicadas acima dos pontos de dados (*valor de P < 0,05, **valor de P ≤ 0,01, ***valor de P ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini, Col-08株, 1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物 之间水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 A distribuição estatística da quantidade de sementes de inoculantes (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина em Верженице, Польша, em 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-valor ≤ 0,001). Diferenças estatisticamente significativas nos níveis de expressão entre plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, obtida de campos de tremoço em Verzhenice, Polônia, em 1999) e plantas controle (inoculadas com solução salina) são indicadas acima dos pontos de dados (*valor de P < 0,05, **valor de P ≤ 0,01, ***valor de P ≤ 0,001).As linhagens NLL analisadas foram: 83A:476 (resistente, portadora do alelo homozigoto Lanr1), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo homozigoto AnMan), Boregine (resistente, fundo genético desconhecido) e população 22660 (suscetível).
O gene candidato TanjilG_05042 no lócus Lanr1 apresentou um padrão de expressão marcadamente diferente dos perfis obtidos nos estudos de RNA-seq (Fig. 6e). Observou-se ativação significativa desse gene nas populações de Mandelup e 22660 (até 39,7 e 11,7 vezes, respectivamente), resultando em níveis de expressão relativamente altos (até 1,4 ± 0,14 e 7,2 ± 1,3, respectivamente). A linhagem 83A:476 também revelou alguma regulação positiva do gene TanjilG_05042 (até 3,8 vezes), porém, os níveis de expressão relativa alcançados (0,044 ± 0,002) foram mais de 30 vezes menores do que os observados nas populações de Mandelup e 22660. A análise por qPCR mostrou diferenças significativas nos níveis de expressão entre os genótipos nas variantes não vacinadas (controle), atingindo uma diferença de 58 vezes entre as populações 22660 e 83A:476, bem como entre as populações 22660 e 22660. Uma diferença de duas vezes foi observada entre Boregine e Mandalup.
O gene candidato no lócus AnMan, TanjilG_12861, foi ativado em resposta à vacinação nas cepas 83A:476 e Mandelup, permaneceu neutro na população 22660 e apresentou expressão reduzida na cepa Boregine (Fig. 6f). A expressão relativa do gene TanjilG_12861 foi maior na cepa 83A:476 inoculada (0,14 ± 0,01). O gene da proteína de choque térmico de classe I de 17,4 kDa, TanjilG_05080 HSP17.4, apresentou níveis de expressão relativa mais baixos em todas as cepas estudadas e em todos os pontos de tempo (Fig. 6g). O valor mais alto foi observado 24 horas após a inoculação (HPI) na população 22660 (0,14 ± 0,02, um aumento de oito vezes em resposta à vacinação).
A comparação dos perfis de expressão gênica (Fig. 7) revelou uma alta correlação entre TanjilG_10657 e outros quatro genes: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) e TanjilG_04706 (r = 0,79). Esses resultados podem indicar a co-regulação desses genes durante as respostas de defesa. Os genes TanjilG_12861 e TanjilG_23384 apresentaram perfis de expressão diferentes, com valores de coeficiente de correlação de Pearson mais baixos (de 0,08 a 0,43 e de -0,19 a 0,28, respectivamente) em comparação com os demais genes.
Correlações entre perfis de expressão gênica foram detectadas usando PCR quantitativo. As seguintes linhagens de tremoço-de-folha-estreita foram analisadas: 83A:476 (resistente, portadora do alelo homozigoto Lanr1), Mandelup (moderadamente resistente, portadora do alelo homozigoto AnMan), Boregine (resistente, fundo genético desconhecido) e População 22660 (suscetível). Três pontos de tempo foram calculados (6, 12 e 24 horas após a inoculação), incluindo plantas inoculadas (Colletotrichum lupini, linhagem Col-08, obtida de campos de tremoço em Wierzhenice, Polônia, em 1999) e plantas controle (inoculadas com solução salina). A escala mostra o valor do coeficiente de correlação de Pearson.
Com base nos dados obtidos a 6 cavalos de potência por polegada, a WGCNA foi realizada em 9981 DEGs identificados pela comparação de plantas inoculadas e de controle, com foco nas respostas iniciais de defesa (Tabela Suplementar S12). Vinte e dois módulos de genes (clusters) foram encontrados com perfis de expressão correlacionados (positivos ou negativos) entre genótipos e variantes experimentais. Em média, os níveis de expressão gênica estavam diminuindo na seguinte ordem: 83A:476 > Mandelup > Boregine > População 22660 (em ambas as variantes, no entanto, essa tendência foi mais forte nas plantas de controle). Em média, os níveis de expressão gênica estavam diminuindo na seguinte ordem: 83A:476 > Mandelup > Boregine > População 22660 (em ambas as variantes, no entanto, essa tendência foi mais forte nas plantas de controle). Na próxima semana, você encontrará uma estimativa de 83A: 476 > Mandelup > Boregine > População 22660 (na sua variante, однако, эта tendência de silencio контрольных растений). Em média, os níveis de expressão gênica diminuíram na seguinte ordem: 83A:476 > Mandelup > Boregine > População 22660 (em ambas as variantes, porém, essa tendência foi mais acentuada nas plantas de controle).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > População 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> população 22660 的 顺序 下降 （, 在 种 中 , 这 种 在 在植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 Em sua próxima avaliação, Genov foi informado no dia 83A:476 > Mandelup > Boregine > População 22660 (однако в обоих вариантах эта Tendência de silêncio no controle растений). Em média, os níveis de expressão gênica diminuíram na série 83A:476 > Mandelup > Boregine > População 22660 (contudo, em ambas as variantes, essa tendência foi mais acentuada nas plantas de controle).A vacinação resultou na regulação positiva da expressão gênica, especialmente nos módulos 18, 19, 14, 6 e 1 (em ordem decrescente de efeito), regulação negativa (por exemplo, módulos 9 e 20) ou com efeitos neutros (por exemplo, módulos 11, 22, 8 e 13). A análise de enriquecimento de termos GO (Tabela Suplementar S13) revelou “GO: 0006952 Respostas protetoras” para o módulo inoculado (18) com ativação máxima, incluindo genes analisados ​​por qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 e TanjilG_27015), bem como muitos módulos de fotossíntese mais suprimidos (9). O concentrador do módulo 18 (Fig. 8) foi identificado como o gene TanjilG_26536, que codifica a proteína LlR18B semelhante a PR-10, e o concentrador do módulo 9 foi identificado como o gene TanjilG_28955, que codifica a proteína PsbQ do fotossistema II. Um gene candidato de resistência à antracnose, Lanr1, TanjilG_05042, foi encontrado no módulo 22 (Fig. 9) e está associado aos termos “GO:0044260 Processos metabólicos macromoleculares celulares” e “GO:0006355 Regulação transcricional, molde de DNA”, que carregam o hub TanjilG_01212. O gene codifica o fator de transcrição de estresse térmico A-4a (HSFA4a).
Análise de rede ponderada da coexpressão gênica de módulos com termos de processos biológicos sobrerrepresentados “GO: 0006952 Respostas de defesa”. A ligação foi simplificada para destacar os quatro genes analisados ​​por qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 e TanjilG_27015).
Análise de rede ponderada da coexpressão gênica de um módulo com um termo de processo biológico sobrerrepresentado “GO: 0006355: Regulação transcricional, modelagem de DNA” e que carrega um gene candidato de resistência à antracnose Lanr1 TanjilG_05042. A ligação foi simplificada para isolar o gene TanjilG_05042 e o gene central TanjilG_01212.
A triagem de resistência à antracnose realizada na Austrália mostrou que a maioria das cultivares lançadas precocemente era suscetível; Kalya, Coromup e Mandelup foram descritas como moderadamente resistentes, enquanto Wonga, Tanjil e 83A:476 foram descritas como altamente resistentes.^26,27,31 As cultivares Wonga, Tanjil e 83A:476 possuíam o mesmo alelo de resistência, denominado Lanr1, e Coromup e Mandelup possuíam um alelo diferente, denominado AnMan^10,26,39, enquanto Kalya transmitia um alelo diferente, denominado Lanr2. A triagem para resistência à antracnose na Alemanha resultou na identificação de uma linhagem resistente, Bo7212, com um alelo candidato diferente de Lanr1, denominado LanrBo³⁶.
Nosso estudo revelou uma frequência muito baixa (cerca de 6%) do alelo Lanr1 no germoplasma testado. Essa observação é consistente com os resultados da triagem de germoplasma do Leste Europeu usando os marcadores Anseq3 e Anseq4, que mostraram que o alelo Lanr1 está presente em apenas duas linhagens bielorrussas. Isso sugere que o alelo Lanr1 ainda não é amplamente utilizado pelos programas de melhoramento locais, diferentemente da Austrália, onde é um dos alelos-chave para o melhoramento assistido por marcadores. Isso pode ser devido ao menor nível de resistência proporcionado pelo alelo Lanr1 em condições de campo europeias em comparação com o relato australiano. Além disso, estudos sobre antracnose em áreas de alta pluviosidade na Austrália mostraram que as respostas de resistência mediadas pelo alelo Lanr1 podem não ser eficazes em condições climáticas que favorecem o crescimento e o rápido desenvolvimento do patógeno^19,42. De fato, no presente estudo, alguns sintomas de antracnose também foram observados em genótipos portadores do alelo Lanr1, sugerindo que a resistência pode desaparecer em condições ótimas para o desenvolvimento de C. lupini. Além disso, interpretações falso-positivas da presença dos marcadores Anseq3 e Anseq4, que estão a aproximadamente 1 cM do locus Lanr1, são possíveis 28,30,43 .
Nosso estudo mostrou que a linhagem 83A:476, portadora do alelo Lanr1, respondeu à inoculação com C. lupini com reprogramação transcriptômica em larga escala no primeiro ponto de tempo analisado (6 hpi), enquanto na linhagem Mandelup, portadora do alelo AnMan, as respostas transcriptômicas foram observadas muito mais tarde (de 24 a 48 hp). Essas variações temporais nas respostas de defesa estão associadas a diferenças nos sintomas da doença, destacando a importância do reconhecimento precoce do patógeno para uma resposta de resistência bem-sucedida. Para infectar o tecido vegetal, os esporos do antraz devem passar por vários estágios de desenvolvimento na superfície do hospedeiro, incluindo germinação, divisão celular e formação de um apressório. Um apêndice é uma estrutura infectiva que se fixa à superfície do hospedeiro e facilita a penetração nos tecidos do mesmo. Assim, os esporos de C. gloeosporioides em extrato de ervilha mostraram a primeira divisão do núcleo após 75-90 minutos de incubação, a formação de um tubo germinativo após 90-120 minutos e supressão após 4 horas. A inoculação de C. gloeosporioides em mangas mostrou mais de 40% de germinação de conídios após 3 horas de incubação e cerca de 20% de formação de apressórios após 4 horas. O gene CAP20, associado à virulência de C. gloeosporioides, apresentou atividade transcricional em conídios formadores de epífitas após 3,5 horas de incubação em cera superficial de abacate, com altas concentrações da proteína CAP20 após 4 horas e 46 minutos. De forma semelhante, a atividade dos genes de biossíntese de melanina em C. trifolii foi induzida durante 2 horas de incubação, seguida pela formação de um apressório após 1 hora. Estudos em tecidos foliares mostraram que morangos inoculados com C. acutatum apresentam a primeira supressão às 8 horas após a inoculação (hpi), enquanto tomates inoculados com C. coccodes apresentam a primeira supressão às 4 hpi48,49, o que está em grande parte de acordo com a escala temporal do processo infeccioso de Colletotrichum spp. Respostas rápidas de defesa a 83A:476 sugerem o envolvimento de genes de resistência vegetal e imunidade desencadeada por efetores (ETI) nesta linhagem, enquanto as respostas tardias de Mandelup apoiam a hipótese de imunidade desencadeada por padrões moleculares associados microscópicos (MTI) 50. Respostas precoces a 83A:476 e Mandelup. A sobreposição parcial entre genes regulados positivamente ou negativamente na resposta tardia também apoia esse conceito, visto que a ETI é frequentemente considerada uma resposta MTI acelerada e intensificada que culmina em morte celular programada no local da infecção, conhecida como choque anafilático 51,52.
A maioria dos genes atribuídos ao termo super-representado da Gene Ontology GO:0006952 “Resposta de Defesa” são os 11 homólogos da proteína de mensagem 22 induzida por estresse (similar à SAM22) e as sete principais proteínas do tipo látex (MLPs). As proteínas do tipo 31, 34, 43 e 423 apresentaram similaridade de sequência. Os genes do tipo SAM22 mostraram ativação significativa e prolongada, demonstrando níveis aumentados de resistência à antracnose (83A:476 e Boregine). No entanto, os genes do tipo MLP foram regulados negativamente apenas em linhagens portadoras do alelo de resistência candidato (83A:476/Lanr1 às 6 hpi e Mandelup/AnMan às 24 hpi). Deve-se notar que todos os homólogos do tipo SAM22 identificados se originam de um agrupamento gênico que abrange aproximadamente 105 kb, enquanto os genes do tipo MLP se originam de regiões separadas do genoma. A ativação coordenada de genes semelhantes ao SAM22 também foi observada em nosso estudo anterior sobre a resistência de NLL à inoculação com Diaporthetoxica, sugerindo que eles estão envolvidos nos componentes horizontais da resposta de defesa. Essa conclusão também é corroborada por relatos de uma resposta positiva de genes semelhantes ao SAM22 a lesões ou tratamento com ácido salicílico, indutores fúngicos ou peróxido de hidrogênio.
Foi demonstrado que os genes do tipo MLP respondem a vários estresses abióticos e bióticos, incluindo infecções bacterianas, virais e fúngicas patogênicas em muitas espécies de plantas55. As direções da resposta a certas interações entre plantas e patógenos variaram de um forte aumento (ou seja, durante a infestação do algodão por Verticillium dahliae) a uma diminuição significativa (ou seja, após a infecção da macieira por Alternaria spp.)56,57. Uma regulação negativa significativa do gene do tipo MLP 423 foi observada durante as defesas do abacateiro contra a infecção por F. niger e durante a infecção da macieira por Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola e Alternaria alternata, que são patótipos da macieira58,59. Além disso, calos de macieira superexpressando o gene do tipo MLP 423 apresentaram menor expressão de genes associados à resistência e foram mais suscetíveis à infecção fúngica59. Após a infecção por Fusarium oxysporum f., o gene do tipo MLP 423 também foi suprimido em germoplasma resistente de feijão comum. Infecção do feijão 60.
Outros membros da família PR-10 identificados em nosso estudo de RNA-seq foram os genes LlR18A e LlR18B em resposta à regulação positiva, bem como o gene regulado positivamente (1 gene) ou negativamente (3 genes) para a proteína de transferência de lipídios DIR1. Além disso, a WGCNA destaca o gene LlR18B como um ponto central neste módulo, que é altamente suscetível à vacinação e carrega vários genes de resposta protetora. Os genes LlR18A e LlR18B foram induzidos em folhas de tremoço amarelo em resposta a bactérias patogênicas, bem como em caules de NLL após inoculação com D. toxica, enquanto o homólogo desses genes no arroz, RSOsPR10, foi rapidamente induzido por uma infecção fúngica presumivelmente envolvida na via de sinalização do ácido jasmônico53,61,62. O gene DIR1 codifica proteínas de transporte de lipídios não específicas que são necessárias para o início da resistência sistêmica adquirida (SAR). Com o desenvolvimento de reações protetoras, a proteína DIR1 é transportada do foco de infecção através do floema para induzir a SAR em órgãos distantes. Curiosamente, o gene DIR1 TanjilG_02313 foi significativamente induzido no primeiro ponto de coleta nas linhagens 84A:476 e na População 22660, mas a resistência à antracnose se desenvolveu com sucesso apenas na linhagem 84A:476. Isso pode indicar alguma subfuncionalização do gene DIR1 em NLL, visto que os três homólogos restantes responderam à inoculação apenas na linhagem 83A:476 às 6 horas pós-infecção, e essa resposta foi direcionada para baixo.
Em nosso estudo, os componentes mais comuns correspondentes ao processo biológico denominado “GO:0055114 Processo Redox” foram a proteína citocromo P450, a peroxidase, a linoleico ácido 9S-/13S-lipoxigenase e a 1-aminociclopropano-1-carboxilato oxidase. Além disso, nossa WGCNA define o homólogo HSFA4a como um núcleo que carrega módulos como o gene candidato à resistência Lanr1, TanjilG_05042. HSFA4a é um componente da regulação redox-dependente da transcrição nuclear em plantas.
As proteínas do citocromo P450 são oxidorredutases que catalisam reações de hidroxilação dependentes de NADPH e/ou O2 no metabolismo primário e secundário, incluindo o metabolismo de xenobióticos, bem como hormônios, ácidos graxos, esteróis, componentes da parede celular, biopolímeros e a biossíntese de compostos protetores 69. Em nosso estudo, a variabilidade na função do citocromo P450 em plantas foi reduzida de -10,6 log2 (variação relativa) para 5,7 devido a um grande número de homólogos alterados (37) e diferenças nos padrões de resposta entre genes específicos, refletindo uma revisão para cima. Usar apenas dados de RNA-seq para elucidar a função biológica putativa dos genes NLL em uma superfamília de proteínas tão grande seria altamente especulativo. No entanto, vale ressaltar que alguns genes do citocromo P450 estão associados ao aumento da resistência a fungos ou bactérias patogênicas, incluindo uma contribuição para reações alérgicas 69,70,71.
As peroxidases de classe III são enzimas vegetais multifuncionais envolvidas em uma ampla gama de processos metabólicos durante o crescimento e desenvolvimento das plantas, bem como em resposta a estresses ambientais como salinidade, seca, alta intensidade luminosa e ataque de patógenos72. As peroxidases estão envolvidas na interação de diversas espécies vegetais com Anthracis, incluindo Stylosanthes humilis e C. gloeosporioides, Lens culinaris e C. truncatum, Phaseolus vulgaris e C. lindemuthianum, Cucumis sativus e C. lagenarium73,74,75,76. A resposta é muito rápida, às vezes até mesmo em 4 horas pós-infecção (HPI), antes que o fungo penetre no tecido vegetal73. O gene da peroxidase também respondeu à inoculação com D. toxica NLL. Além de suas funções típicas de regular o burst oxidativo ou eliminar o estresse oxidativo, as peroxidases podem interferir no crescimento do patógeno criando barreiras físicas baseadas no reforço da parede celular durante a lignificação, na ligação de subunidades ou na reticulação de compostos específicos. Essa função pode ser atribuída in silico ao gene TanjilG_03329, que codifica uma possível peroxidase aniônica formadora de lignina, a qual apresentou regulação positiva significativa em nosso estudo na linhagem resistente 83A:476 em 6 HPI, mas não em outras linhagens e pontos de tempo que não responderam.
A 9S-/13S-lipoxigenase do ácido linoleico é a primeira etapa na via oxidativa da biossíntese de lipídios78. Os produtos dessa via têm múltiplas funções na defesa vegetal, incluindo o fortalecimento da parede celular por meio da formação de depósitos de calose e pectina, e a regulação do estresse oxidativo por meio da produção de espécies reativas de oxigênio79,80,81,82,83. No presente estudo, a expressão da 9S-/13S-lipoxigenase do ácido linoleico foi alterada em todas as linhagens, mas na população suscetível 22660, a regulação positiva prevaleceu em diferentes momentos, enquanto nas linhagens portadoras do alelo resistente Lanr1 e do alelo AnMan, isso enfatiza a diversificação da camada de oxilipina nas reações protetoras contra o antraz entre esses genótipos.
O homólogo da 1-aminociclopropano-1-carboxilato oxidase (ACO) apresentou regulação positiva (9 genes) ou negativa (2 genes) significativa após a inoculação com tremoço. Com duas exceções, todas essas respostas ocorreram às 6 horas após a inoculação, no códon 83A:476. A reação enzimática mediada pelas proteínas ACO é a etapa limitante da produção de etileno e, portanto, é altamente regulada. O etileno é um hormônio vegetal que desempenha diversas funções na regulação do desenvolvimento das plantas e na resposta a condições de estresse abiótico e biótico. A indução da transcrição de ACO e a ativação da via de sinalização do etileno estão envolvidas no aumento da resistência do arroz ao fungo hemibiotrófico Oryzae oryzae, por meio da regulação da produção de espécies reativas de oxigênio e fitoalexinas. Um processo de infecção foliar muito semelhante encontrado entre M. oryzae e C. lupini88,89, tendo como pano de fundo uma regulação positiva significativa de homólogos de ACO na linha 83A:476 relatada neste estudo, altera a possibilidade de conferir resistência à antracnose NLL. Etileno é uma etapa central de sinalização em vias moleculares.
No presente estudo, observou-se supressão em larga escala de muitos genes associados à fotossíntese 6 horas após a infecção (hpi) na linhagem 83A:476 e 48 hpi nas linhagens Mandeloop e 22660. A extensão e a progressão dessas alterações são proporcionais ao nível de infecção. Observou-se resistência à antracnose neste experimento. Recentemente, a repressão forte e precoce de transcritos relacionados à fotossíntese foi relatada em diversos modelos de interação planta-patógeno, incluindo bactérias e fungos patogênicos. A supressão rápida (a partir de 2 hpi em algumas interações) e global de genes associados à fotossíntese em resposta à infecção pode desencadear a imunidade da planta com base na liberação de espécies reativas de oxigênio e sua interação com a via do ácido salicílico para mediar reações alérgicas.
Em conclusão, os mecanismos de resposta de defesa propostos para a linhagem mais resistente (83A:476) incluem o reconhecimento rápido do patógeno pelo gene R (presumivelmente TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) e a sinalização mediada por ácido salicílico e etileno, seguida pelo estabelecimento de uma SAR de longo alcance. A ação é suportada pela proteína DIR-1. Deve-se notar que o período biotrófico para a infecção por C. lupini é muito curto (aproximadamente 2 dias), seguido por crescimento necrótico. A transição entre esses estágios pode estar associada à necrose e à expressão de proteínas induzíveis por etileno que atuam como gatilhos para reações de hipersensibilidade em plantas hospedeiras. Portanto, a janela de tempo para a captura bem-sucedida de C. lupini no estágio biotrófico é muito estreita. A reprogramação de genes associados ao redox e à fotossíntese observada em 83A:476 às 6 hpi é consistente com a progressão das hifas do fungo e anuncia o desenvolvimento de uma resposta protetora bem-sucedida no estágio biotrófico. As respostas transcriptômicas de Mandelup e da população 22660 podem ser muito tardias para capturar o fungo antes da transição para o crescimento necrótico; no entanto, Mandelup pode ser mais eficaz do que a população 22660 porque a regulação relativamente rápida da proteína PR-10 promove a resistência horizontal.
A ETI, impulsionada pelo gene R canônico, parece ser um mecanismo comum de resistência à antracnose em feijões. Assim, na leguminosa modelo Medicago truncatula, a resistência à antracnose é conferida pelo gene RCT1, um membro da classe de genes R de plantas TIR-NBS-LRR97. Este gene também confere resistência de amplo espectro à antracnose em alfafa quando transferido para plantas suscetíveis. No feijão comum (P. vulgaris), mais de duas dezenas de genes de resistência à antracnose foram identificados até o momento. Alguns desses genes são encontrados em regiões que não possuem genes R canônicos, enquanto muitos outros estão localizados nas extremidades dos cromossomos que carregam o agrupamento de genes NBS-LRR, incluindo TIR-NBS-LRRs99. O estudo de SSR em todo o genoma também confirmou a associação do gene NBS-LRR com a resistência à antracnose no feijão comum. O gene R canônico também foi encontrado na região genômica que contém o principal lócus de resistência à antracnose no tremoço branco 101.
Nosso trabalho demonstra que uma reação de resistência imediata, ativada em um estágio inicial da infecção da planta (preferencialmente em até 12 horas após a infecção), protege eficazmente o tremoço-de-folhas-estreitas da antracnose causada pelo fungo patogênico Collelotrichum lupini. Utilizando sequenciamento de alto rendimento, demonstramos perfis de expressão diferencial de genes de resistência à antracnose em plantas de tremoço-de-folhas-estreitas mediados pelos genes de resistência Lanr1 e AnMan. Uma defesa bem-sucedida envolve o planejamento cuidadoso dos genes para proteínas envolvidas em redox, fotossíntese e patogênese poucas horas após o primeiro contato da planta com o patógeno. Reações protetoras semelhantes, porém tardias, são muito menos eficazes na proteção das plantas contra doenças. A resistência ao antraz mediada pelo gene Lanr1 assemelha-se à resposta rápida típica do gene R (imunidade desencadeada por efetores), enquanto o gene AnMan provavelmente proporciona uma resposta horizontal (imunidade desencadeada por um padrão molecular associado a microrganismos), oferecendo um nível moderado de sustentabilidade.
As 215 linhagens NLL utilizadas para a triagem de marcadores de antracnose consistiam em 74 cultivares, 60 linhagens obtidas por cruzamento ou melhoramento genético, 5 mutantes e 76 germoplasmas selvagens ou originais. As linhagens provinham de 17 países, principalmente da Polônia (58), Espanha (47), Alemanha (27), Austrália (26), Rússia (19), Bielorrússia (7), Itália (5) e outras linhagens de 10 países. O conjunto também inclui linhagens resistentes de referência: 83A:476, Tanjil, Wonga portadoras do alelo Lanr1 e Mandelup portadora do alelo AnMan. As linhagens foram obtidas do Banco de Dados Europeu de Recursos Genéticos de Tremoço, mantido pela Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polônia (Tabela Suplementar S1).
As plantas foram cultivadas em condições controladas (fotoperíodo de 16 horas, temperatura de 25 °C durante o dia e 18 °C à noite). Foram analisadas duas repetições biológicas. O DNA foi isolado de folhas com três semanas de idade utilizando o kit DNeasy Plant Mini (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com o protocolo. A qualidade e a concentração do DNA isolado foram avaliadas por métodos espectrofotométricos (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). O marcador AnManM1, que identifica o gene de resistência à antracnose AnMan (derivado da cultivar Mandelup), e os marcadores Anseq3 e Anseq4, que flanqueiam o gene Lanr1 (derivado da cultivar Tanjil), foram analisados. Os homozigotos para o alelo resistente receberam pontuação “1”, os suscetíveis, “0”, e os heterozigotos, “0,5”.
Com base nos resultados da triagem para os marcadores AnManM1, AnSeq3 e AnSeq4 e na disponibilidade de sementes para experimentos de acompanhamento final, 50 linhagens NLL foram selecionadas para fenotipagem de resistência à antracnose. A análise foi realizada em duplicata em uma estufa controlada por computador, com fotoperíodo de 14 horas e temperatura variando de 22 °C durante o dia a 19 °C à noite. As sementes foram raspadas (removendo-se a casca da semente no lado oposto ao embrião com uma lâmina afiada) antes da semeadura para evitar a dormência devido à dureza excessiva da casca e para garantir a germinação uniforme. As plantas foram cultivadas em vasos (11 × 11 × 21 cm) com solo estéril (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsóvia, Polônia). A inoculação foi realizada com a cepa Colletotrichum lupini Col-08, cultivada em 1999 a partir de caules de plantas de tremoço-de-folhas-estreitas cultivadas em um campo em Verzhenitsa, Grande Polônia (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Os isolados foram cultivados em meio SNA a 20°C sob luz negra por 21 dias para induzir a esporulação. Quatro semanas após a semeadura, quando as plantas atingiram o estágio de 4 a 6 folhas, a inoculação foi realizada por pulverização com uma suspensão de conídios na concentração de 0,5 x 10⁶ conídios por ml. Após a inoculação, as plantas foram mantidas no escuro por 24 horas a uma umidade de cerca de 98% e temperatura de 25°C para facilitar a germinação dos conídios e o processo de infecção. As plantas foram então cultivadas sob um fotoperíodo de 14 horas a 22°C (dia)/19°C (noite) e 70% de umidade. A avaliação da doença foi realizada 22 dias após a inoculação e variou de 0 (imune) a 9 (muito suscetível), dependendo da presença ou ausência de lesões necróticas nos caules e folhas. Além disso, após a avaliação, o peso das plantas foi medido. As relações entre os genótipos dos marcadores e os fenótipos da doença foram calculadas como correlações ponto-sequência (ausência de marcadores heterozigotos no conjunto de linhagens para análise do fenótipo de resistência à antracnose).