Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com. Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts. Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, iesakām izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer). Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, mēs atveidosim vietni bez stiliem un JavaScript.
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) ir pākšaugs, ko izmanto pārtikas ražošanai un augsnes uzlabošanai. NLL globālā izplatība kā kultūraugam ir piesaistījusi daudzas patogēnas sēnītes, tostarp lupīnu antraknozi, kas izraisa postošo antraknozes slimību. NLL selekcijā ir izmantotas divas alēles, Lanr1 un AnMan, kas nodrošina paaugstinātu rezistenci, taču pamatā esošie molekulārie mehānismi joprojām nav zināmi. Šajā pētījumā Lanr1 un AnMan marķieri tika izmantoti, lai pārbaudītu Eiropas NLL paraugus. Vakcīnas testēšana kontrolētā vidē apstiprināja abu rezistento donoru efektivitāti. Diferenciālā gēnu ekspresijas profilēšana tika veikta reprezentatīvām rezistentām un uzņēmīgām līnijām. Antraknozes rezistence bija saistīta ar gēnu ontoloģijas terminu “GO:0006952 Aizsardzības reakcija”, “GO:0055114 Redoksprocess” un “GO:0015979 Fotosintēze” pārekspresiju. Turklāt Lanr1(83A:476) līnija pēc inokulācijas uzrādīja ievērojamu transkriptoma pārprogrammēšanu ātri, savukārt pārējās līnijās šī reakcija aizkavējās par aptuveni 42 stundām. Aizsardzības reakcijas ir saistītas ar TIR-NBS, CC-NBS-LRR un NBS-LRR gēniem, 10 proteīniem, kas iesaistīti patogenēzē, lipīdu pārneses proteīniem, endoglikāna-1,3-β-glikozidāzi, glicīnam bagātiem šūnu sieniņu proteīniem un gēniem no skābekļa reaktīvā ceļa. Agrīnās reakcijas uz 83A:476, tostarp rūpīga ar fotosintēzi saistīto gēnu nomākšana, sakrita ar veiksmīgu aizsardzību sēnīšu bioloģijas veģetatīvās augšanas fāzē, kas liecina, ka efektors izraisa imunitāti. Mandelūpa reakcija ir palēnināta, tāpat kā kopējā horizontālā pretestība.
Šaurlapu lupīna (NLL, Lupinus angustifolius L.) ir augs ar augstu olbaltumvielu saturu, kura izcelsmes vieta ir Vidusjūras rietumu reģions1,2. Pašlaik to audzē kā pārtikas kultūru dzīvniekiem un cilvēkiem. Tā tiek uzskatīta arī par zaļmēslojumu augsekas sistēmās, pateicoties slāpekļa fiksācijai ar simbiotiskām slāpekli fiksējošām baktērijām un vispārējai augsnes struktūras uzlabošanai. NLL pēdējā gadsimta laikā ir piedzīvojusi strauju pieradināšanas procesu un joprojām ir pakļauta lielam vairošanās spiedienam3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Līdz ar NLL plašu kultivēšanu patogēno sēnīšu secība attīstīja jaunas lauksaimniecības nišas un izraisīja jaunas kultūraugus iznīcinošas slimības. Visievērojamākā lupīnu audzētājiem un selekcionāriem bija antraknozes parādīšanās, ko izraisa patogēnā sēne Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Visievērojamākā lupīnu audzētājiem un selekcionāriem bija antraknozes parādīšanās, ko izraisa patogēnā sēne Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванногонконы фермеров, вызванногонrich памермеров (Bondars) Nirenbergs, Feilers un Hagedorns13. Lupīnu audzētājiem un selekcionāriem visievērojamākā bija antraknozes parādīšanās, ko izraisa patogēnā sēne Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是生痘otrich养菏(Bondars) Nirenbergs, Feilers un Hagedorns13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是生痘otrich养菏(Bondars)嵵Mati.1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызбонкогогогонынконеров Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Visspilgtākā lupīnu audzētāju un selekcionāru vidū ir antraknozes parādīšanās, ko izraisa patogēnā sēne Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Agrākie ziņojumi par slimību tika saņemti no Brazīlijas un Amerikas Savienotajām Valstīm, un tipiskie simptomi parādījās attiecīgi 1912. un 1929. gadā. Tomēr pēc aptuveni 30 gadiem patogēns tika apzīmēts kā Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorfa Glomerella cingulata (Akmeņcilvēks) Spauld. & Sacc., teleomorfa Glomerella cingulata (Akmeņcilvēks) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld teleomorfa. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld mērķtiecīgā morfoloģijā. & H. Šrenks,. & H. Šrenks,.un H. Šrenks. & H.施伦克，. & H.施伦克，.un H. Šlenks,.Sākotnējā slimības fenotipēšana, kas veikta 20. gadsimta vidū, uzrādīja zināmu rezistenci NLL un dzeltenās lupīnas (L. luteus L.) pieejās, bet visas testētās baltās lupīnas (L. albus L.) pieejās bija ļoti uzņēmīgas15,16. Pētījumi liecina, ka antraknozes attīstība ir saistīta ar paaugstinātu nokrišņu daudzumu (gaisa mitrumu) un temperatūru (12–28 °C diapazonā), kā rezultātā augstākā temperatūrā rezistence samazinās17, 18. Faktiski laiks, kas nepieciešams konidiju dīgšanai un slimības sākumam, 24 °C temperatūrā (4 stundas) bija četras reizes īsāks nekā 12 °C temperatūrā (16 stundas) augsta mitruma apstākļos19. Tādējādi notiekošā globālā sasilšana ir izraisījusi antraknozes izplatību. Tomēr slimība tika novērota Francijā (1982. gadā) un Ukrainā (1983. gadā) kā gaidāmo draudu vēstnesis, taču tolaik lupīnu nozare to acīmredzot ignorēja20,21. Dažus gadus vēlāk šī postošā slimība izplatījās visā pasaulē un skāra arī tādas galvenās lupīnu ražotājvalstis kā Austrālija, Polija un Vācija22,23,24. Pēc antraknozes uzliesmojuma 20. gs. deviņdesmito gadu vidū plašas skrīninga rezultātā NLL19 paraugos tika identificēti vairāki rezistenti donori. NLL rezistenci pret antraknozi kontrolē divas atsevišķas dominējošās alēles, kas atrodamas dažādos ģenētiskā materiāla avotos: Lanr1 šķirnē Tanjil un Wonga un AnMan šķirnē Mandalay25,26. Šīs alēles papildina molekulāros marķierus, kas atbalsta rezistenta ģenētiskā materiāla atlasi selekcijas programmās25,26,27,28,29,30. Rezistentā selekcijas līnija 83A:476, kas nes Lanr1 alēli, tika krustota ar jutīgo savvaļas līniju P27255, lai iegūtu RIL populāciju, kas segregējas antraknozes rezistencei, kas ļāva Lanr1 lokusu attiecināt uz NLL-11 hromosomu31, 32, 33. Saskaņojot saistīšanas kartes marķierus no flankējošajiem rezistences lokusiem uz antraknozi ar genoma karkasu, NLL atklāja visu trīs alēļu atrašanās vietu vienā hromosomā (NLL-11), bet dažādās pozīcijās29,34,35. Tomēr nelielā RIL skaita un lielā ģenētiskā attāluma starp marķieriem un atbilstošajiem alēļiem dēļ nevar izdarīt ticamus secinājumus par to pamatā esošajiem gēniem. No otras puses, reversās ģenētikas izmantošana lupīnām ir sarežģīta to ļoti zemā reģenerācijas potenciāla dēļ, kas apgrūtina ģenētisko manipulāciju37.
Domesticēta dīgļplazma, kas satur vēlamo alēli homozigotā stāvoklī, piemēram, 83A:476 (Lanr1) un Mandelup (AnMan), ir pavērusi durvis antraknozes rezistences izpētei, ņemot vērā pretējas alēļu kombinācijas savvaļas populācijās. Molekulāro mehānismu iespējas. Salīdziniet specifisku genotipu radītās aizsardzības reakcijas. Šajā pētījumā tika novērtēta NLL agrīnā transkriptoma reakcija uz C. lupini vakcināciju. Vispirms tika pārbaudīts Eiropas NLL dīgļplazmas panelis, kas saturēja 215 līnijas, izmantojot molekulāros marķierus, kas iezīmē Lanr1 un AnMan alēles. Pēc tam kontrolētos apstākļos tika veikta antraknozes fenotipēšana 50 NLL līnijām, kas iepriekš bija atlasītas molekulārajiem marķieriem. Pamatojoties uz šiem eksperimentiem, tika atlasītas četras līnijas, kas atšķīrās pēc antraknozes rezistences un Lanr1/AnMan alēļu sastāva, diferenciālai aizsardzības gēnu ekspresijas profilēšanai, izmantojot divas savstarpēji papildinošas pieejas: augstas caurlaidības RNS sekvencēšanu un reālā laika PCR kvantifikāciju.
NLL dīgļplazmas komplekta (N = 215) skrīnings ar marķieriem Lanr1 (Anseq3 un Anseq4) un AnMan (Anseq4) un AnMan (AnManM1) parādīja, ka tikai viena līnija (95726, netālu no Salamanca-b) pastiprina "rezistences" alēli visiem marķieriem, savukārt "uzņēmīgo" alēļu klātbūtne" atklāja visu marķieru īpatsvaru 158 (~73,5%) līnijās. Trīspadsmit līnijas producēja divus Lanr1 marķiera "rezistentus" alēlus, un 8 līnijas producēja Lanr1 "rezistentus" alēlus. AnMan marķiera "rezistences" alēle (1. papildtabula). Divas līnijas bija heterozigotas Anseq3 marķierim un viena heterozigota AnManM1 marķierim. 42 līnijas (19,5%) nesa pretējās Anseq3 un Anseq4 alēļu fāzes, kas norāda uz augstu rekombinācijas biežumu starp šiem diviem lokusiem. Antraknozes fenotipi kontrolētos apstākļos (S2. papildtabula) atklāja testēto genotipu rezistences mainīgumu, kas atspoguļojās antraknozes smaguma pakāpē. Vidējo punktu skaita atšķirības svārstījās no 1,8 (vidēji izturīgs) līdz 6,9 (uzņēmīgs), un augu svara atšķirības svārstījās no 0,62 (uzņēmīgs) līdz 4,45 g (rezistents). Bija novērojama būtiska korelācija starp vērtībām, kas novērotas divos eksperimenta atkārtojumos (0,51 slimības smaguma rādītājiem, P = 0,00017 un 0,61 auga svaram, P < 0,0001), kā arī starp šiem diviem parametriem (−0,59 un −0,77, P < 0,0001). Bija novērojama būtiska korelācija starp vērtībām, kas novērotas divos eksperimenta atkārtojumos (0,51 slimības smaguma pakāpei, P = 0,00017 un 0,61 auga svaram, P < 0,0001), kā arī starp šiem diviem parametriem (−0,59 un −0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 тверимента болезни, P = 0,00017 un 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,57, Ри) 0,0001) 0,0001). Tika konstatēta būtiska korelācija starp vērtībām, kas novērotas divos eksperimenta atkārtojumos (0,51 slimības smaguma pakāpei, P = 0,00017, un 0,61 auga svaram, P < 0,0001), kā arī starp šiem diviem parametriem (-0,59 un -0,77, P < 0,0001)).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分1︌P0.51︺ 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77,00P01)在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p < 0,0001） 以及 两 伪 咂 数 之闈 ， 咂 数 之闈 ， 0,59 和–0,59 和 – 0,59 和 – 0,77, P < 0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях, Pовторностях, повторностях, повторностях, p = 0,00017 un масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 un -0,0001) 0,77, P <0,0001 Starp divos atkārtojumos novērotajām vērtībām (slimības smaguma pakāpe 0,51, P = 0,00017 un auga masa 0,61, P < 0,0001) un starp šiem diviem parametriem (-0,59 un -0,0001) tika konstatēta būtiska korelācija 0,77, P < 0,0001. ).Tipiski simptomi, kas novērojami uzņēmīgiem augiem, ir stumbra locīšanās un savīšanās, kas atgādina “gana loka” struktūru, kam seko ovāli bojājumi ar oranžiem/rozā sporozoītiem (1. papildattēls). Austrālijas paraugi, kas satur Lanr1 (83A:476 un Tanjil) un AnMan (Mandelup) gēnus, ir vidēji rezistenti, 0,0331 un 0,0036). Dažām līnijām, kurām ir arī “rezistenti” Lanr1 un/vai AnMan alēļi, ir slimības simptomi.
Interesanti, ka dažām NLL līnijām, kurām trūka nevienas “rezistentas” marķiera alēles, bija augsts antraknozes rezistences līmenis (salīdzināms vai augstāks nekā Lanr1 vai AnMan genotipiem), piemēram, Boregine (P vērtība < 0,0001 abiem parametriem), Bojar (P vērtība < 0,0001 vērtējumam un 0,001 auga svaram) un populācijai B-549/79b (P vērtība < 0,0001 vērtējumam un nenozīmīga svaram). Interesanti, ka dažām NLL līnijām, kurām trūka nevienas “rezistentas” marķiera alēles, bija augsts antraknozes rezistences līmenis (salīdzināms vai augstāks nekā Lanr1 vai AnMan genotipiem), piemēram, Boregine (P vērtība < 0,0001 abiem parametriem), Bojar (P vērtība < 0,0001 vērtējumam un 0,001 auga svaram) un populācijai B-549/79b (P vērtība < 0,0001 vērtējumam un nenozīmīga svaram). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высовейх выказали высокий антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) un популяции B-549/7901, P оценки и незначимо для массы). Interesanti, ka vairākām NLL līnijām, kurām trūka nevienas “rezistentas” marķiera alēles, bija augsts rezistences līmenis pret antraknozi (salīdzināms ar Lanr1 vai AnMan genotipiem vai augstāks par to), piemēram, Boregine (P vērtība < 0,0001 abiem parametriem), Bojar (P vērtība < 0,0001 novērtēšanai un 0,001 auga svaram) un populācija B-549/79b (P vērtība < 0,0001 novērtēšanai un nav statistiski nozīmīga svaram).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭痊水平的炭疍或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分为0,0001，植物重量为0,001）和种群B-549/79b（得分P 值〼睂扩才量一不量丏 Interesanti, ka dažas NLL sistēmas, kurām nav nekādu “antigēnu” marķieru, uzrāda augstu horizontālo rezistenci (līdzvērtīgu Lanr1 vai AnMan gēniem vai augstāku), piemēram, Boregine (abu parametru P < 0,0001), Bojar (P vērtība < 0,0001, auga svars 0,001) un celms B-549/79b (P vērtība < 0,0001, svars nav statistiski nozīmīgs). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высрочвистустусроч к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих парамет00в1),
(значение P <0,0001, масса растения 0,001) un популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначит). Interesanti, ka dažām NLL līnijām, kurām trūka nekādu “rezistences” marķiera alēļu, bija augsts antraknozes rezistences līmenis (salīdzināms ar vai augstāks par Lanr1 vai AnMan genotipiem), piemēram, Boregine (P vērtība abiem parametriem <0,0001), Bojar (P vērtība < 0,0001, auga svars 0,001) un populācija B-549/79b (P vērtība < 0,0001, svars nav statistiski nozīmīgs).Šī parādība liek domāt par jauna ģenētiska rezistences avota iespējamību, izskaidrojot novēroto korelācijas trūkumu starp marķieru genotipiem un slimības fenotipiem (P vērtības no ~0,42 līdz ~0,98). Tādējādi Kolmogorova-Smirnova tests parādīja, ka dati par antraknozes rezistenci bija aptuveni normāli sadalīti gan punktu skaitam (P vērtības 0,25 un 0,11), gan auga masai (P vērtības 0,47 un 0,55), kas liek domāt, ka es izvirzu hipotēzi, ka ir iesaistītas vairāk alēļu nekā Lanr1 un AnMan.
Pamatojoties uz antraknozes rezistences skrīninga rezultātiem, transkriptoma analīzei tika atlasītas 4 līnijas: 83A:476, Boregine, Mandelup un populācija 22660. Šīs līnijas tika atkārtoti pārbaudītas attiecībā uz Sibīrijas mēra rezistenci inokulācijas eksperimentos, izmantojot RNS sekvencēšanu, ar nosacījumu, ka tās bija tādas pašas kā iepriekšējā testā. Punktu vērtības bija šādas: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) un populācija 22660 (6,11 ± 1,29).
Illumina NovaSeq 6000 protokols sasniedza vidēji 40,5 M nolasīšanas pārus uz paraugu (no 29,7 līdz 54,4 M nolasīšanas) (S3 papildtabula). Izlīdzināšanas rādītāji atsauces secībā svārstījās no 75,5% līdz 88,6%. Nolasīšanas skaita datu vidējā korelācija starp eksperimentālajiem variantiem starp bioloģiskajiem atkārtojumiem svārstījās no 0,812 līdz 0,997 (vidēji 0,959). No 35 170 analizētajiem gēniem 2917 neuzrādīja nekādu ekspresiju, bet pārējie 4785 gēni tika ekspresēti niecīgā līmenī (bāzes vidējais rādītājs < 5). No 35 170 analizētajiem gēniem 2917 neuzrādīja nekādu ekspresiju, bet pārējie 4785 gēni tika ekspresēti niecīgā līmenī (bāzes vidējais rādītājs < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировалисьночульельнесь (базовое среднее <5). No 35 170 analizētajiem gēniem 2917 neuzrādīja nekādu ekspresiju, bet atlikušie 4785 gēni tika ekspresēti niecīgā līmenī (bāzes vidējais rādītājs <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）.35 170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительсюпо среднее значение <5). No 35 170 analizētajiem gēniem 2917 netika ekspresēti, un atlikušajiem 4785 gēniem bija niecīga ekspresija (bāzes vidējais rādītājs <5).Tādējādi eksperimenta laikā ekspresēto gēnu skaits (bāzes vidējais rādītājs ≥ 5) bija 27 468 (78, 1%) (S4. papildtabula).
Sākot no pirmā laika punkta, visas NLL līnijas reaģēja uz C. lupini (celms Col-08) inokulāciju, pārprogrammējot transkriptomu (1. tabula), tomēr starp līnijām tika novērotas būtiskas atšķirības. Tādējādi rezistences līnija 83A:476 (kas nes Lanr1 gēnu) pirmajā laika punktā (6 hpi) uzrādīja ievērojamu transkriptoma pārprogrammēšanu ar 31–69 reižu lielāku izolēto augšup un lejup vērsto gēnu skaitu salīdzinājumā ar citiem laika punktiem šajā laika punktā. Turklāt šis maksimums bija īslaicīgs, jo tikai dažu gēnu ekspresija otrajā laika punktā (12 hpi) saglabājās būtiski izmainīta. Interesanti, ka Boregine, kas arī uzrādīja augstu rezistences līmeni transplantācijas testā, eksperimenta laikā netika pakļauta tik masīvai transkripcijas pārprogrammēšanai. Tomēr diferencēti ekspresēto gēnu (DEG) skaits Boregine un 83A:476 bija vienāds 12 hpi. Gan Mandelupā, gan populācijā 22660 pēdējā laika punktā (48 l/s) bija redzami DEG maksimumi, kas norāda uz relatīvu aizsardzības reakciju kavēšanos.
Tā kā 83A:476 6. dzimšanas dienā pēc inficēšanās ar C. lupini tika veikta ievērojama transkriptoma pārprogrammēšana, salīdzinot ar visām pārējām līnijām, ~91% no šajā laika punktā novērotajām diferenciācijas fāzēm (DEG) bija specifiskas līnijai (1. att.). Tomēr agrīnās atbildes reakcijās starp pētījuma līnijām bija zināma pārklāšanās, jo attiecīgi 68,5%, 50,9% un 52,6% DEG Boregine, Mandelup un populācijā 22660 pārklājās ar tām, kas noteiktos laika punktos tika konstatētas 83A:476. Tomēr šīs DEG veidoja tikai nelielu daļu (0,97–1,70%) no visām DEG, kas pašlaik tiek noteiktas, izmantojot 83A:476. Turklāt šajā laikā 11 diferenciālās spējas (DEG) no visām līnijām bija koherentas (S4.–S6. papildtabulas), tostarp augu aizsardzības reakciju kopīgās komponentes: lipīdu pārneses proteīns (TanjilG_32225), endoglikāna-1,3-β-glikozīda enzīms (TanjilG_23384), divi stresa inducējami proteīni, piemēram, SAM22 (TanjilG_31528 un TanjilG_31531), bāziskais lateksa proteīns (TanjilG_32352) un divi glicīnam bagāti strukturāli šūnu sieniņu proteīni (TanjilG_19701 un TanjilG_19702). Bija arī relatīvi augsta transkriptomu atbildreakciju pārklāšanās starp 83A:476 un Boregine 24 HPI (kopā 16–38% DEG) un starp Mandelup un populāciju 22660 48 HPI (kopā 14–20% DEG).
Venna diagramma, kurā parādīts diferencēti ekspresēto gēnu (DEG) skaits šaurlapu lupīnu (NLL) līnijās, kas inokulētas ar Colletotrichum lupini (celms Col-08, iegūts no lupīnu laukiem Veržeņicē, Polijā, 1999. gadā). Analizētās NLL līnijas bija: 83A:476 (rezistenta, nes Lanr1 alēli), Boregine (rezistenta, ģenētiskais fons nav zināms), Mandelup (vidēji rezistenta, nes AnMan alēli) un populācija 22660 (ļoti uzņēmīga). Saīsinājums hpi apzīmē stundas pēc vakcinācijas. Nulles vērtības ir noņemtas, lai vienkāršotu grafiku.
Pārmērīgi ekspresēto gēnu kopa 6 hpi laikā tika analizēta attiecībā uz kanonisko R gēna domēnu klātbūtni (S7. papildtabula). Šis pētījums atklāja klasisko slimību rezistences gēnu transkriptomas indukciju tikai ar NBS-LRR domēniem 83A:476. Šajā kopā bija viens TIR-NBS-LRR gēns (tanjilg_05042), pieci CC-NBS-LRR gēni (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 un tanjilg_16162), un četri NBS-LR, Tanjilg_16162), un četri NBS-LRRE (tanjilg_16162), kā arī četri NBS-Lrr (tanjilg_16162) un četri NBS-LRR (TANJILG_16162). Visiem šiem gēniem ir kanoniski domēni, kas sakārtoti konservatīvās secībās. Papildus NBS-LRR domēna gēniem, 6 hpi laikā tika aktivizētas vairākas RLL kināzes, proti, viena Boregine (TanjilG_19877), divas Mandelup (TanjilG_07141 un TanjilG_19877) un 22660. populācijā (TanjilG_09014 un TanjilG_10361) un divas 83A 27:476.
Gēni ar ievērojami mainītu ekspresiju, reaģējot uz inokulāciju ar C. lupini (celms Col-08), tika pakļauti gēnu ontoloģijas (GO) bagātināšanas analīzei (Papildu tabula S8). Visbiežāk pārprezentētais bioloģiskā procesa termins bija “GO:0006952 aizsardzības reakcija”, kas parādījās 6 no 16 (laika × līnijas) kombinācijām ar augstu nozīmīgumu (P vērtība <0, 001) (2. att.). Visbiežāk pārprezentētais bioloģiskā procesa termins bija “GO:0006952 aizsardzības reakcija”, kas parādījās 6 no 16 (laika × līnijas) kombinācijām ar augstu nozīmīgumu (P vērtība <0, 001) (2. att.). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный», отковетый» появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Visbiežāk pārprezentētais bioloģiskā procesa termins bija “GO:0006952 aizsardzības reakcija”, kas parādījās 6 no 16 (laiks × līnija) kombinācijām ar augstu nozīmīgumu (P vērtība <0,001) (2. att.).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）. Visreprezentatīvākais bioloģiskā procesa termins ir “GO:0006952 aizsardzības reakcija”, kas parādās 6 no 16 (时间×线) kombinācijām ar augstu nozīmību (P vērtība < 0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», копяры 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Visbiežāk pārprezentētais bioloģiskā procesa termins bija “GO:0006952 Defense Response”, kas parādījās 6 no 16 kombinācijām (laiks × līnija) ar augstu nozīmīgumu (P vērtība < 0,001) (2. att.).Šis termins bija pārpārstāvēts divos laika punktos 83A celmā: 476 un Boregine (6 un 24 hpi), un vienā laika punktā Mandelup un populācijā 22660 (attiecīgi 12 un 6 hpi). Šis ir paredzams rezultāts, kas izceļ rezistento līniju pretsēnīšu reakciju. Turklāt 83A:476 reaģēja uz C. lupini, ātri inducējot gēnus, kas saistīti ar oksidatīvo uzliesmojumu, ko attēlo termins “GO:0055114 redoksprocess”, norādot uz specifisku aizsardzības reakciju, savukārt Boregine atklāja specifiskas aizsardzības reakcijas, kas saistītas ar terminu “GO”. :0006950 Stresa reakcija”. Populācija 22660 aktivizēja horizontālo rezistences reakciju, iesaistot sekundāros metabolītus, izceļot pārmērīgo terminu “GO:0016104 Triterpēnu biosintēzes process” un “GO:0006722 Triterpēnu metabolisma process” skaitu (abi termini pieder pie viena un tā paša gēnu kopuma), ņemot vērā GO terminu bagātināšanas analīzes rezultātus, Mandelup reakcijas stabilitāte bija starp Boregine un populāciju 22660. Turklāt agrīnā reakcija 83A:476 (6 hpi) un aizkavētā reakcija Mandelup un populācija 22660 ietver terminu GO:0015979 “fotosintēze” un citus saistītus bioloģiskos procesus.
Ar Sibīrijas mēra lupīnu (Col-08 celms, iegūts no lupīnu laukiem Vīržeņicē, Polijā, 1999. gadā) inokulētas šaurlapu lupīnas (NLL) transkriptomas atbildēs diferencēti ekspresēto gēnu anotācijā izvēlētie bioprocesu gēnu ontoloģijas termini ir ievērojami pārspīlēti. Analizētās NLL līnijas bija: 83A:476 (rezistenta, nes homozigotu Lanr1 alēli), Boregine (rezistenta, nezināms ģenētiskais fons), Mandelup (vidēji rezistenta, nes homozigotu AnMan alēli) un populācija 22660 (uzņēmīga).
Tā kā šī pētījuma mērķis bija identificēt gēnus, kas veicina antraknozes rezistenci, gēni, kas piešķirti terminiem GO “GO: 0006952 Aizsardzības atbildes reakcijas” un “GO: 0055114 Redoksprocesi”, tika analizēti ar robežvērtībām, sākot no sākotnējā vidējā rādītāja ≥ 30, ar vismaz vienu līniju × laika punktu, apvienojot statistiski nozīmīgas log2 vērtības (reizes izmaiņas). Šiem kritērijiem atbilstošo gēnu skaits bija 65 GO:0006952 gadījumā un 524 GO:0055114 gadījumā.
83A:476 atklāja divus DEG maksimumus, kas anotēti ar terminu GO:0006952, pirmo pie 6 gēniem collā (64 gēni, augšupvērsta un lejupvērsta regulācija) un otro pie 24 gēniem collā (15 gēni, tikai augšupvērsta regulācija). Boregine arī parādīja, ka GO:0006952 maksimumu sasniedza vienā un tajā pašā laika punktā, bet ar mazāku DEG (11 un 8) un preferenciālu aktivāciju. Mandeloop parādīja divus GO:0006952 maksimumus pie 12 un 48 HPI, abos nesot 12 gēnus (pirmo ar aktivējošiem gēniem un otro tikai ar nomācošiem gēniem), savukārt 22660 populācijai pie 6 HPI (13 gēni) bija lielāks pieauguma maksimuma pārsvars. Jāatzīmē, ka 96,4% GO:0006952 DEG šajos maksimumos bija viena veida reakcija (augšupvērsta vai lejupvērsta), kas norāda uz ievērojamu aizsardzības reakciju pārklāšanos, neskatoties uz iesaistīto gēnu skaita atšķirībām. Lielākā ar terminu GO:0006952 saistīto secību grupa kodē bada stresa saistīto ziņojuma proteīnu 22 (SAM22 līdzīgu), kas pieder pie 10. klases patogenēzes saistītā proteīna (PR-10) proteīna klades un kodolproteīna lateksa. līdzīgs (MLP līdzīgs) proteīns) proteīns (3. att.). Abas grupas atšķīrās pēc ekspresijas rakstura un atbildes virziena. Gēni, kas kodē SAM22 līdzīgus proteīnus, uzrādīja konsekventu un nozīmīgu indukciju agrīnos laika punktos (6 vai 12 hpi) un parasti nebija atsaucīgi eksperimenta beigās (48 hpi), savukārt MLP līdzīgie proteīni uzrādīja koordināciju 6 hpi. 83A:476 un Mandelup pie 48 hpi/in, gandrīz visi pārējie datu punkti nebija atsaucīgi. Turklāt SAM22 līdzīgā proteīna gēnu ekspresijas profilu atšķirības sekoja novērotajai antraknozes rezistences mainībai, jo rezistentākām līnijām bija vairāk laika punktu, kas būtiski inducēja šos gēnus, nekā jutīgākiem gēniem. Cits LlR18A/B līdzīgs PR-10 gēns uzrādīja ļoti līdzīgu ekspresijas modeli kā SAM22 līdzīgais proteīna gēns.
Tika identificētas galvenās bioloģiskā procesa termina “GO:0006952 aizsardzības reakcija” sastāvdaļas un Lanr1 un AnMan alēļu kandidātu gēnu ekspresijas modeļi. Log2 skala atspoguļo log2 vērtības (reizes izmaiņas) starp inokulētiem (Colletotrichum lupini, celms Col-08, iegūts no lupīnu laukiem, Viženicā, Polijā, 1999. gadā) un kontroles (nepilnīgi inokulētiem) augiem vienā un tajā pašā laika punktā. Tika analizētas šādas šaurlapu lupīnu līnijas: 83A:476 (rezistenta, nes homozigotu Lanr1 alēli), Boregine (rezistenta, ģenētiskais fons nav zināms), Mandelup (vidēji rezistenta, nes homozigotu AnMan alēli) un populācija 22660 (uzņēmīga).
Turklāt tika novērtēti RNS sekvencēšanas kandidātu gēnu Lanr1 (TanjilG_05042) un AnMan (TanjilG_12861) ekspresijas profili (3. att.). TanjilG_05042 gēns uzrādīja nozīmīgu reakciju (aktivāciju) 83A:476 tikai pirmajā laika punktā (6 hpi), savukārt TanjilG_12861 bija nozīmīgs Mandeloop tikai divos laika punktos: 6 hpi (samazināšana) un 24 hpi (6 hpi). Ar. (regulējams) ).
Visvairāk pārekspresētie gēni terminā GO:0055114 “redoksprocesā” bija gēni, kas kodē citohroma P450 proteīnus un peroksidāzi (4. att.). Paraugiem, kas izolēti no 83A:476 6 HPI, maksimālās vai minimālās log2 (reizes izmaiņas) vērtības (86,6% gēnu) parasti tika novērotas starp inokulētajiem un kontroles augiem, kas uzsver šī genotipa augsto reakciju uz inokulācijas dzimumu. 83A:476 uzrādīja visnozīmīgāko GO:0055114 DEG 6 HPI (503 gēni), savukārt pārējām līnijām 48 HPI (Boregine, 31 gēns; Mandelup, 85 gēni; un populācija 22660, 78 gēni). Vairumā GO:0055114 saimes gēnu tika novērotas divu veidu reakcijas uz vakcināciju (aktivācija un inhibīcija). Interesanti, ka Mandelupē ar 48 ZS jaudu līdz pat 97,6 % no DEG, kas identificēti terminam GO: 0055114. Šie novērojumi liecina, ka, neskatoties uz ievērojami mazāku mērogu (t. i., mutēto redoksa gēnu skaits, 85 pret 503), mandelupa aizkavēto transkriptomas reakciju modelis uz antraknozi ir līdzīgs 83A:476 agrīnajai reakcijai. Boregīnā un populācijā 22660 šī konverģence ir zemāka – attiecīgi 51,6 % un 75,6 %.
Tika atklāti bioloģiskā procesa “GO:0055114 Redoksprocess” termina galveno komponentu ekspresijas modeļi. Log2 skala atspoguļo log2 vērtības (reizes izmaiņas) starp inokulētiem (Colletotrichum lupini, celms Col-08, iegūts lupīnu laukos, Viženicā, Polijā, 1999. gadā) un kontroles (nepilnīgi inokulētiem) augiem vienā un tajā pašā laika punktā. Tika analizētas šādas šaurlapu lupīnu līnijas: 83A:476 (rezistenta, nes homozigotu Lanr1 alēli), Boregine (rezistenta, ģenētiskais fons nav zināms), Mandelup (vidēji rezistenta, nes homozigotu AnMan alēli) un populācija 22660 (uzņēmīga).
83A:476 Transkriptomiskās atbildes reakcijas uz inokulāciju ar C. lupini (celms Col-08) ietvēra arī koordinētu gēnu, kas attiecināmi uz terminu GO:0015979 “fotosintēze” un citiem saistītiem bioloģiskiem procesiem, apklusināšanu (5. att.). Šajā GO:0015979 DEG komplektā bija 105 gēni, kas tika būtiski represēti 6 hpi pie 83A:476. Šajā apakškopā 37 gēni tika arī samazināti Mandelup 48 hpi un 35 gēni tajā pašā laika punktā 22660 populācijā, tostarp 19 DEG, kas ir kopīgi abiem genotipiem. Nevienā kombinācijā (rinda x laiks) ar terminu GO:0015979 saistītie DEG netika būtiski aktivizēti.
Tika atklāti bioloģiskā procesa “GO:0015979 Photosynthesis” termina galveno komponentu ekspresijas modeļi. Log2 skala atspoguļo log2 vērtības (reizes izmaiņas) starp inokulētiem (Colletotrichum lupini, celms Col-08, iegūts no lupīnu laukiem, Viženicā, Polijā, 1999. gadā) un kontroles (nepilnīgi inokulētiem) augiem vienā un tajā pašā laika punktā. Tika analizētas šādas šaurlapu lupīnu līnijas: 83A:476 (rezistenta, nes homozigotu Lanr1 alēli), Boregine (rezistenta, ģenētiskais fons nav zināms), Mandelup (vidēji rezistenta, nes homozigotu AnMan alēli) un populācija 22660 (uzņēmīga).
Pamatojoties uz diferenciālās ekspresijas analīzes rezultātiem un, iespējams, iesaistītiem aizsardzības reakcijās pret patogēnām sēnītēm, šis septiņu gēnu komplekts tika izvēlēts ekspresijas profilu kvantitatīvai noteikšanai ar reālā laika PCR (Papildu tabula S9).
Iespējamais proteīna gēns TanjilG_10657 tika ievērojami inducēts visās pētītajās līnijās un laika punktos, salīdzinot ar kontroles (mimikiskajiem) augiem (Papildu tabulas S10, S11). Turklāt TanjilG_10657 ekspresijas profils eksperimenta gaitā uzrādīja pieaugošu tendenci visās līnijās. Populācija 22660 uzrādīja visaugstāko TanjilG_10657 jutību pret inokulāciju ar 114 reižu aktivāciju un augstāko relatīvo ekspresijas līmeni (4,4 ± 0,4) 24 HPI (6.a att.). Arī PR10 LlR18A proteīna gēns TanjilG_27015 uzrādīja aktivāciju visās līnijās un laika punktos, ar statistisku nozīmīgumu lielākajā daļā datu punktu (6.b att.). Līdzīgi kā TanjilG_10657, augstākais TanjilG_27015 relatīvais ekspresijas līmenis tika novērots 22660 inokulētajā populācijā 24 HPI (19,5 ± 2,4). Skābes endohitināzes gēns TanjilG_04706 bija ievērojami paaugstināts visās līnijās un visos laika punktos, izņemot Boregine 6 hpi (6.c att.). Tas bija spēcīgi inducēts pirmajā laika punktā (6 hpi) pie 83A:476 (par 10,5 reizēm) un mēreni palielinājās citās līnijās (par 6,6–7,5 reizēm). Eksperimenta laikā TanjilG_04706 ekspresija saglabājās līdzīgā līmenī 83A:476 un Boregine, savukārt Mandelup un populācijā 22660 tā ievērojami palielinājās, sasniedzot relatīvi augstas vērtības (attiecīgi 5,9 ± 1,5 un 6,2 ± 1,5). Endoglikāna-1,3-β-glikozidāzei līdzīgais gēns TanjilG_23384 uzrādīja augstu aktivāciju pirmajos divos laika punktos (6 un 12 hpi) visās līnijās, izņemot populāciju 22660 (6.d att.). Augstākie TanjilG_23384 relatīvie ekspresijas līmeņi tika novēroti otrajā laika punktā (12 HPI) Mandelup (2,7 ± 0,3) un 83A:476 (1,5 ± 0,1). 24 HPI TanjilG_23384 ekspresija bija relatīvi zema visās pētītajās līnijās (no 0,04 ± 0,009 līdz 0,44 ± 0,12).
Atlasīto gēnu (ag) ekspresijas profili, kas atklāti ar kvantitatīvu PCR. Skaitļi 6, 12 un 24 apzīmē stundas pēc vakcinācijas. LanDExH7 un LanTUB6 gēni tika izmantoti normalizācijai, un LanTUB6 tika izmantots starpsēriju kalibrēšanai. Kļūdu joslas apzīmē standartnovirzi, pamatojoties uz trim bioloģiskiem atkārtojumiem, no kuriem katrs ir trīs tehnisko atkārtojumu vidējais rādītājs. Inokulēto (Colletotrichum lupini, celms Col-08, iegūts 1999. gadā no lupīnu lauka Verženicā, Polijā) un kontroles (kontroles inokulēto) augu ekspresijas līmeņu atšķirību statistiskā nozīmība ir atzīmēta virs datu punktiem (*P vērtība < 0,05, **P vērtība ≤ 0,01, ***P vērtība ≤ 0,001). Inokulēto (Colletotrichum lupini, celms Col-08, iegūts 1999. gadā no lupīnu lauka Verženicā, Polijā) un kontroles (kontroles inokulēto) augu ekspresijas līmeņu atšķirību statistiskā nozīmība ir atzīmēta virs datu punktiem (*P vērtība < 0,05, **P vērtība ≤ 0,01, ***P vērtība ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штаменпо Col-08, 1999). с поля люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Statistiski nozīmīgas atšķirības ekspresijas līmeņos starp inokulētajiem (Colletotrichum lupini, celms Col-08, iegūts 1999. gadā no lupīnu lauka Veržeņicē, Polijā) un kontroles (nepilnīgi inokulētiem) augiem ir norādītas virs datu punktiem (*P vērtība < 0,05, **P vērtība ≤ 0,01, ***P vērtība ≤ 0,001).接种 (Colletotrichum lupini, Col-08株, 1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性丧标记在数) 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 寈玤）之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, **P ≤ 0,01, ***P.01, ***P.01 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штаменныйполулче, 08. люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями (*анымхи отмечены над значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Statistiski nozīmīgas atšķirības ekspresijas līmeņos starp inokulētajiem (Colletotrichum lupini, celms Col-08, iegūts lupīnu laukos Veržeņicē, Polijā, 1999. gadā) un kontroles (nepilnīgi inokulētiem) augiem ir norādītas virs datu punktiem (*P vērtība < 0,05, **P vērtība ≤ 0,01, ***P vērtība ≤ 0,001).Analizētās NLL līnijas bija: 83A:476 (rezistenta, nes homozigotu Lanr1 alēli), Mandelup (vidēji rezistenta, nes homozigotu AnMan alēli), Boregine (rezistenta, nezināms ģenētiskais fons) un populācija 22660 (uzņēmīga).
Kandidātgēns TanjilG_05042 Lanr1 lokusā uzrādīja ievērojami atšķirīgu ekspresijas modeli no profiliem, kas iegūti RNS sekvencēšanas pētījumos (6.e att.). Mandelupā un 22660 populācijā tika novērota ievērojama šī gēna aktivācija (attiecīgi līdz 39,7 un 11,7 reizēm), kā rezultātā tika sasniegts relatīvi augsts ekspresijas līmenis (attiecīgi līdz 1,4 ± 0,14 un 7,2 ± 1,3). 83A:476 atklāja arī zināmu TanjilG_05042 gēna regulācijas palielināšanos (līdz 3,8 reizēm), tomēr sasniegtie relatīvie ekspresijas līmeņi (0,044 ± 0,002) bija vairāk nekā 30 reizes zemāki nekā tie, kas novēroti Mandelupā un 22660 populācijā. Ar kvantitatīvās PĶR analīzi tika konstatētas būtiskas atšķirības ekspresijas līmeņos starp genotipiem imitācijas vakcinācijas (kontroles) variantos, sasniedzot 58 reižu atšķirību starp populācijām 22660 un 83A:476, kā arī starp populācijām 22660 un 22660. Divkārša atšķirība tika sasniegta starp Boregine un Mandalup.
AnMan lokusa kandidāta gēns TanjilG_12861 tika aktivizēts, reaģējot uz vakcināciju 83A:476 un Mandelup populācijā, bija neitrāls 22660 populācijā un tika samazināts Boregine populācijā (6.f att.). TanjilG_12861 gēna relatīvā ekspresija bija visaugstākā inokulētajā 83A:476 (0,14±0,01). 17,4 kDa I klases karstuma šoka proteīna gēns TanjilG_05080 HSP17.4 uzrādīja zemākus relatīvos ekspresijas līmeņus visos pētītajos celmos un laika punktos (6.g att.). Visaugstākā vērtība tika novērota 24. dienā pēc vakcinācijas 22660 populācijā (0,14 ± 0,02, astoņas reizes lielāks atbildes reakcijas pieaugums uz vakcināciju).
Gēnu ekspresijas profilu salīdzinājums (7. att.) atklāja augstu korelāciju starp TanjilG_10657 un četriem citiem gēniem: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) un TanjilG_04706 (r = 0,79). Šādi rezultāti var liecināt par šo gēnu koregulāciju aizsardzības reakciju laikā. TanjilG_12861 un TanjilG_23384 gēni uzrādīja atšķirīgus ekspresijas profilus ar zemākām Pīrsona korelācijas koeficienta vērtībām (attiecīgi no 0,08 līdz 0,43 un no -0,19 līdz 0,28) salīdzinājumā ar citiem gēniem.
Korelācijas starp gēnu ekspresijas profiliem tika noteiktas, izmantojot kvantitatīvo PCR. Tika analizētas šādas šaurlapu lupīnu līnijas: 83A:476 (rezistenta, nes homozigotu Lanr1 alēli), Mandelup (vidēji rezistenta, nes homozigotu AnMan alēli), Boregine (rezistenta, ģenētiskais fons nav zināms) un populācija 22660 (uzņēmīga). Tika aprēķināti trīs laika punkti (6, 12 un 24 stundas pēc inokulācijas), ieskaitot inokulētos (Colletotrichum lupini, celms Col-08, iegūts no lupīnu laukiem Veržeņicē, Polijā, 1999. gadā) un kontroles (kontroles inokulētie) augi. Skala parāda Pīrsona korelācijas koeficienta vērtību.
Pamatojoties uz datiem, kas iegūti ar jaudu 6 zirgspēki collā, WGCNA tika veikta ar 9981 DEG, kas tika identificēts, salīdzinot inokulētos un kontroles augus, lai koncentrētos uz agrīnām aizsardzības reakcijām (12. papildtabula). Tika atrasti divdesmit divi gēnu moduļi (klasteri) ar korelētiem (pozitīviem vai negatīviem) ekspresijas profiliem starp genotipiem un eksperimentālajiem variantiem. Vidēji gēnu ekspresijas līmeņi bija dilstošā secībā 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populācija 22660 (tomēr abos variantos šī tendence bija spēcīgāka kontroles augos). Vidēji gēnu ekspresijas līmeņi bija dilstošā secībā 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populācija 22660 (tomēr abos variantos šī tendence bija spēcīgāka kontroles augos). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Iedzīvotāji 22660 (в обоих вариантац, ээац, нетац, нотац была сильнее у контрольных растений). Vidēji gēnu ekspresijas līmenis samazinājās secībā 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populācija 22660 (tomēr abos variantos šī tendence bija spēcīgāka kontroles augos).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Iedzīvotāji 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）.平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> iedzīvotāji 22660 的 顺序 伋 降 （Ｇ 在在 在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。. В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Iedzīvotāju skaits 22660 (однако в обоих варианетахлаидэбентах сильнее у контрольных растений). Vidēji gēnu ekspresijas līmenis samazinājās sērijā 83A:476 > Mandelup > Boregine > populācija 22660 (tomēr abos variantos šī tendence bija spēcīgāka kontroles augos).Vakcinācija izraisīja gēnu ekspresijas palielināšanos, īpaši 18., 19., 14., 6. un 1. modulī (dilstošā efekta secībā), negatīvu regulāciju (piemēram, 9. un 20. modulis) vai ar neitrālu efektu (piemēram, 11., 22., 8. un 13. modulis). GO terminu bagātināšanas analīze (S13. papildtabula) atklāja “GO: 0006952 aizsargājošās atbildes” inokulētajam modulim (18) ar maksimālu aktivāciju, ieskaitot gēnus, kas analizēti ar kvantitatīvās PĶR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 un TanjilG_27015), kā arī daudzus inokulētos visvairāk nomāktos fotosintēzes moduļus (9). 18. moduļa koncentrators (8. att.) tika identificēts kā TanjilG_26536 gēns, kas kodē PR-10 līdzīgo LlR18B proteīnu, un 9. moduļa koncentrators tika identificēts kā TanjilG_28955 gēns, kas kodē fotosistēmas II PsbQ proteīnu. Antraknozes rezistences gēna Lanr1 kandidāts, TanjilG_05042, tika atrasts 22. modulī (9. att.), un tas ir saistīts ar terminiem “GO:0044260 Šūnu makromolekulārie vielmaiņas procesi” un “GO:0006355 Transkripcijas regulācija, DNS veidņu veidošana”, kas satur TanjilG_01212 centru. Gēns kodē karstuma stresa transkripcijas faktoru A-4a (HSFA4a).
Moduļu ar pārreprezentētiem bioloģisko procesu terminiem “GO: 0006952 Aizsardzības atbildes reakcijas” gēnu koekspresijas svērtā tīkla analīze. Ligācija tika vienkāršota, lai izceltu četrus ar qPCR analizētos gēnus (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 un TanjilG_27015).
Moduļa ar pārreprezentētu bioloģiskā procesa terminu “GO: 0006355: Transkripcijas regulācija, DNS veidne” un antraknozes rezistences kandidāta gēnu Lanr1 TanjilG_05042 nesoša gēnu koekspresijas svērtā tīkla analīze. Ligācija tika vienkāršota, lai izolētu TanjilG_05042 gēnu un centrālo TanjilG_01212 gēnu.
Austrālijā veiktā antraknozes rezistences skrīninga rezultāti parādīja, ka lielākā daļa agrāk izlaisto šķirņu bija uzņēmīgas; Kalya, Coromup un Mandelup ir aprakstītas kā vidēji izturīgas, savukārt Wonga, Tanjil un 83A:476 ir aprakstītas kā ļoti izturīgas26,27,31. tām bija viena un tā pati rezistences alēle, kas apzīmēta kā Lanr1, un Coromup un Mandelup bija cita alēle, kas apzīmēta kā AnMan10,26,39, savukārt Kalya nodeva tālāk citu alēli, Lanr2. Antraknozes rezistences skrīninga rezultātā tika identificēta rezistenta līnija Bo7212 ar kandidāta alēli, kas nav Lanr1, un apzīmēta kā LanrBo36.
Mūsu pētījums atklāja ļoti zemu Lanr1 alēles biežumu (aptuveni 6%) testētajā ģenētiskajā materiālā. Šis novērojums atbilst Austrumeiropas ģenētiskā materiāla skrīninga rezultātiem, izmantojot Anseq3 un Anseq4 marķierus, kas parādīja, ka Lanr1 alēle ir sastopama tikai divās Baltkrievijas līnijās. Tas liecina, ka Lanr1 alēle vēl netiek plaši izmantota vietējās selekcijas programmās, atšķirībā no Austrālijas, kur tā ir viena no galvenajām alēlēm marķieru atbalstītai selekcijai. Tas varētu būt saistīts ar zemāku Lanr1 alēles nodrošināto rezistences līmeni Eiropas lauka apstākļos salīdzinājumā ar Austrālijas ziņojumu. Turklāt antraknozes pētījumi Austrālijas apgabalos ar augstu nokrišņu daudzumu ir parādījuši, ka Lanr1 alēles mediētās rezistences reakcijas var nebūt efektīvas laika apstākļos, kas veicina patogēna augšanu un strauju attīstību19,42. Faktiski šajā pētījumā daži antraknozes simptomi tika novēroti arī genotipos, kas nes Lanr1 alēli, kas liecina, ka rezistence var izzust optimālos apstākļos C. lupini attīstībai. Turklāt ir iespējamas kļūdaini pozitīvas Anseq3 un Anseq4 marķieru klātbūtnes interpretācijas, kas atrodas aptuveni 1 cM attālumā no Lanr1 lokusa [28,30,43].
Mūsu pētījums parādīja, ka 83A:476, kam ir Lanr1 alēle, reaģēja uz C. lupini inokulāciju ar plaša mēroga transkriptoma pārprogrammēšanu pirmajā analizētajā laika punktā (6 hpi), savukārt Mandelupā, kam ir AnMan alēle, transkriptomiskās atbildes tika novērotas daudz vēlāk (no 24 līdz 48 hpi). Šīs aizsardzības reakciju laika variācijas ir saistītas ar slimības simptomu atšķirībām, uzsverot agrīnas patogēnu atpazīšanas nozīmi veiksmīgai reakcijai uz rezistenci. Lai inficētu augu audus, Sibīrijas mēra sporām ir jāiziet cauri vairākiem attīstības posmiem uz saimnieka virsmas, tostarp dīgšanai, šūnu dalīšanai un appresorija veidošanās. Piedēklis ir infekcioza struktūra, kas piestiprinās pie saimnieka virsmas un atvieglo iekļūšanu saimnieka audos. Tādējādi C. gloeosporioides sporas zirņu ekstraktā uzrādīja pirmo kodola dalīšanos pēc 75–90 minūšu inkubācijas, dīgļstobriņa veidošanos pēc 90–120 minūtēm un nomākšanu pēc 4 stundām. Mango C. gloeosporioides uzrādīja vairāk nekā 40% konidiju dīgšanu pēc 3 stundu inkubācijas un aptuveni 20% apresoru veidošanos pēc 4 stundām. Ar virulenci saistītais C. gloeosporioides CAP20 gēns uzrādīja transkripcijas aktivitāti epifītus veidojošās konidijās pēc 3,5 stundu inkubācijas avokado virsmas vaskā ar augstu CAP20 proteīna koncentrāciju pēc 4 stundām 46 minūtēm. Līdzīgi melanīna biosintēzes gēnu aktivitāte C. trifolii tika inducēta 2 stundu inkubācijas laikā, kam sekoja apresorija veidošanās pēc 1 stundas. Lapu audu pētījumi liecina, ka zemenēm, kas inokulētas ar C. acutatum, pirmā nomākšana ir 8 stundas pēc inokulācijas, savukārt tomātiem, kas inokulēti ar C. coccodes, pirmā nomākšana ir 4 stundas pēc inokulācijas48,49. Tas lielā mērā atbilst Colletotrichum spp. infekcijas procesa laika skalai. Ātrās aizsardzības reakcijas uz 83A:476 liecina par augu rezistences un efektoru ierosinātas imunitātes (ETI) gēnu iesaistīšanos šajā līnijā, savukārt Mandelupa aizkavētās reakcijas apstiprina mikrosaistītās molekulārā modeļa ierosinātas imunitātes (MTI) hipotēzi 50. Agrīnās reakcijas uz 83A:476 un Mandelupu. Daļēja pārklāšanās starp augšup vai lejup regulētiem gēniem aizkavētajā reakcijā arī apstiprina šo koncepciju, jo ETI bieži tiek uzskatīta par paātrinātu un pastiprinātu MTI reakciju, kas kulminē ar ieprogrammētu šūnu nāvi infekcijas vietā, kas pazīstama kā anafilaktiskais šoks 51,52.
Lielākā daļa gēnu, kas tiek attiecināti uz pārprezentēto terminu Gene Ontology GO:0006952 “Aizsardzības reakcija”, ir 11 stresa izraisītā badošanās ziņojuma 22 proteīna homologi (līdzīgi SAM22) un septiņi galvenie lateksa proteīniem līdzīgie proteīni (MLP). SAM22 līdzīgie proteīni 31, 34, 43 un 423 uzrādīja secības līdzību. SAM22 līdzīgie gēni uzrādīja ievērojamu aktivāciju, kas ilga ilgāk, parādot paaugstinātu antraknozes rezistences līmeni (83A:476 un Boregine). Tomēr MLP līdzīgie gēni tika regulēti zemāk tikai līnijās, kurās bija kandidāta rezistences alēle (83A:476/Lanr1 6 hpi un Mandelup/AnMan 24 hpi). Jāatzīmē, ka visi identificētie SAM22 līdzīgie homologi cēlušies no gēnu klastera, kas aptver aptuveni 105 kb, savukārt MLP līdzīgie gēni cēlušies no atsevišķiem genoma reģioniem. Šādu SAM22 līdzīgu gēnu koordinēta aktivācija tika konstatēta arī mūsu iepriekšējā pētījumā par NLL rezistenci pret Diaporthetoxica inokulāciju, kas liecina, ka tie ir iesaistīti aizsardzības reakcijas horizontālajās komponentēs. Šo secinājumu apstiprina arī ziņojumi par SAM22 līdzīgu gēnu pozitīvu reakciju uz traumu vai ārstēšanu ar salicilskābi, sēnīšu induktoriem vai ūdeņraža peroksīdu.
Ir pierādīts, ka MLP līdzīgie gēni reaģē uz dažādiem abiotiskiem un biotiskiem stresa faktoriem, tostarp baktēriju, vīrusu un patogēnu sēnīšu infekcijām daudzās augu sugās55. Reakcijas virzieni uz noteiktām mijiedarbībām starp augiem un patogēniem svārstījās no spēcīga pieauguma (t. i., kokvilnas invāzijas laikā ar Verticillium dahliae) līdz ievērojamam samazinājumam (t. i., pēc ābeles inficēšanas ar Alternaria spp.)56,57. Avokado aizsardzības laikā pret F. niger infekciju un ābeles inficēšanās laikā ir novērota ievērojama MLP līdzīgā 423 gēna regulācijas pazemināšanās. Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola un Alternaria alternata ir ābolu patotipi58,59. Turklāt ābeļu kalvijiem, kas pārmērīgi ekspresēja MLP līdzīgo 423 gēnu, bija zemāka ar rezistenci saistīto gēnu ekspresija un tie bija jutīgāki pret sēnīšu infekciju59. Pēc Fusarium oxysporum f MLP līdzīgais 423 gēns tika nomākts arī rezistento parasto pupiņu dīgļplazmā. cn. Pupu infekcija 60.
Citi PR-10 saimes locekļi, kas tika identificēti mūsu RNS sekvencēšanas pētījumā, bija LlR18A un LlR18B gēni, reaģējot uz augšuregulāciju, kā arī augšupregulētais (1 gēns) vai lejupregulētais (3 gēni) gēns lipīdu pārneses proteīnam DIR1. Turklāt WGCNA izceļ LlR18B gēnu kā centru šajā modulī, kas ir ļoti uzņēmīgs pret vakcināciju un satur vairākus aizsargājošas atbildes gēnus. LlR18A un LlR18B gēni tika inducēti dzeltenajās lupīnu lapās, reaģējot uz patogēnām baktērijām, kā arī NLL stublos pēc D. toxica inokulācijas, savukārt šo gēnu rīsu homologs RSOsPR10 tika ātri inducēts ar sēnīšu infekciju, kas, iespējams, ir iesaistīta jasmonskābes signālceļā53,61,62. DIR1 gēns kodē nespecifiskus lipīdu transporta proteīnus, kas ir nepieciešami sistēmiskas iegūtas rezistences (SAR) sākumam. Attīstoties aizsargreakcijām, DIR1 proteīns tiek transportēts no infekcijas perēkļa caur floēmu, lai inducētu SAR attālos orgānos. Interesanti, ka TanjilG_02313 DIR1 gēns tika būtiski inducēts pirmajā laika punktā līnijās 84A:476 un populācijā 22660, bet antraknozes rezistence veiksmīgi attīstījās tikai līnijā 84A:476. Tas var liecināt par zināmu DIR1 gēna subfunkcionalizāciju NLL, jo atlikušie trīs homologi reaģēja uz inokulāciju tikai 83A:476 līnijā 6 hpi, un šī reakcija bija vērsta uz leju.
Mūsu pētījumā visbiežāk sastopamās sastāvdaļas, kas atbilst bioloģiskajam procesam ar nosaukumu “GO:0055114 Redoksprocess”, bija citohroma P450 proteīns, peroksidāze, linolskābes 9S-/13S-lipoksigenāze un 1-aminociklopropān-1-karbonskābes oksidāze. Turklāt mūsu WGCNA definē HSFA4a homologu kā centru, kas satur tādus moduļus kā Lanr1 rezistences gēna kandidātu TanjilG_05042. HSFA4a ir redoksatkarīgas kodola transkripcijas regulācijas sastāvdaļa augos.
Citohroma P450 proteīni ir oksidoreduktāzes, kas katalizē NADPH un/vai O2 atkarīgas hidroksilēšanas reakcijas primārajā un sekundārajā metabolismā, tostarp ksenobiotiku, kā arī hormonu, taukskābju, sterīnu, šūnu sieniņu komponentu, biopolimēru un aizsargājošu savienojumu biosintēzes metabolismā 69. Mūsu pētījumā augu citohroma P450 funkcijas mainīgums samazinājās no -10,6 log2 (reizes) līdz 5,7 liela skaita izmainītu homologu (37) un atšķirību reakcijas modeļos starp specifiskiem gēniem dēļ, kas atspoguļo augšupvērstu pārskatīšanu. Tikai RNS sekvencēšanas datu izmantošana, lai noskaidrotu NLL gēnu iespējamo bioloģisko funkciju tik lielā proteīnu superģimenē, būtu ļoti spekulatīva. Tomēr ir vērts atzīmēt, ka daži citohroma P450 gēni ir saistīti ar paaugstinātu rezistenci pret patogēnām sēnītēm vai baktērijām, tostarp ar ieguldījumu alerģiskās reakcijās 69,70,71.
III klases peroksidāzes ir daudzfunkcionāli augu enzīmi, kas iesaistīti plašā vielmaiņas procesu klāstā augu augšanas un attīstības laikā, kā arī reaģējot uz vides stresa faktoriem, piemēram, sāļumu, sausumu, augstu gaismas intensitāti un patogēnu uzbrukumu72. Peroksidāzes ir iesaistītas vairāku augu sugu mijiedarbībā ar Anthracis, tostarp Stylosanthes humilis un C. gloeosporioides, Lens culinaris un C. truncatum, Phaseolus vulgaris un C. lindemuthianum, Cucumis sativus un C. lagenarium73,74,75,76. Reakcija ir ļoti ātra, dažreiz pat 4 HPI, pirms sēne iekļūst augu audos73. Peroksidāzes gēns reaģēja arī uz D. toxica NLL inokulāciju. Papildus savām tipiskajām funkcijām regulēt oksidatīvo uzliesmojumu vai novērst oksidatīvo stresu, peroksidāzes var traucēt patogēnu augšanu, radot fiziskas barjeras, kuru pamatā ir šūnu sieniņu pastiprināšana lignifikācijas, apakšvienību vai specifisku savienojumu šķērssaistīšanas laikā. Šo funkciju in silico var attiecināt uz TanjilG_03329 gēnu, kas kodē iespējamu lignīnu veidojošu anjonu peroksidāzi, kuras ekspresija mūsu pētījumā 83A:476 rezistentajā līnijā tika ievērojami paaugstināta 6 HPI, bet ne citās celmos un laika punktos, kas nereaģēja.
Linolskābes 9S-/13S-lipoksigenāze ir pirmais solis lipīdu biosintēzes oksidatīvajā ceļā78. Šī ceļa produktiem ir vairākas funkcijas augu aizsardzībā, tostarp šūnu sieniņu stiprināšana, veidojot kalozi un pektīna nogulsnes, un oksidatīvā stresa regulēšana, ražojot reaktīvās skābekļa sugas79,80,81,82,83. Šajā pētījumā linolskābes 9S-/13S-lipoksigenāzes ekspresija bija mainījusies visos celmos, bet uzņēmīgajā populācijā 22660 dažādos laika punktos dominēja augšupregulācija, savukārt celmos, kas satur rezistentu Lanr1 un AnMan alēli, tas uzsver oksilipīna slāņa dažādošanos aizsargājošās Sibīrijas mēra reakcijās starp šiem genotipiem.
1-aminociklopropān-1-karboksilāta oksidāzes (ACO) homologs tika ievērojami paaugstināts (9 gēni) vai pazemināts (2 gēni), inokulējot ar lupīnu. Izņemot divus izņēmumus, visas šīs atbildes reakcijas notika 6 ZS vecumā pie 83A:476. Enzīmu reakcija, ko mediē ACO proteīni, ir ātrumu ierobežojošais solis etilēna ražošanā, un tāpēc tā ir ļoti regulēta84. Etilēns ir augu hormons, kam ir dažādas lomas augu attīstības regulēšanā un reakcijā uz abiotiskiem un biotiskiem stresa apstākļiem. ACO transkripcijas indukcija un etilēna signālceļa aktivācija ir iesaistīta rīsu rezistences palielināšanā pret hemibiotrofo sēnīti oryzae oryzae, regulējot reaktīvo skābekļa sugu un fitoaleksīnu ražošanu. Ļoti līdzīgs lapu inficēšanās process, kas konstatēts starp M. oryzae un C. lupini88,89, uz ievērojamas ACO homologu regulācijas fona 83A:476 līnijā, kas minēta šajā pētījumā, maina iespēju piešķirt rezistenci pret NLL antraknozi etilēnu, kas ir centrālais signālceļu solis molekulārajos ceļos.
Šajā pētījumā 83A:476 populācijā 6 hpi un Mandeloop un 22660 populācijā 48 hpi tika novērota daudzu ar fotosintēzi saistītu gēnu plaša mēroga nomākšana. Šo izmaiņu apmērs un progresēšana ir proporcionāla līmenim. Šajā eksperimentā tika novērota rezistence pret antracnozi. Nesen vairākos augu un patogēnu mijiedarbības modeļos, tostarp patogēnās baktērijās un sēnītēs, ir ziņots par spēcīgu un agrīnu ar fotosintēzi saistītu transkriptu nomākšanu. Paātrināšanās (dažās mijiedarbībās no 2 hpi) un globāla ar fotosintēzi saistīto gēnu nomākšana, reaģējot uz infekciju, var izraisīt augu imunitāti, pamatojoties uz reaktīvo skābekļa sugu izvietošanu un to mijiedarbību ar salicilskābes ceļu, lai mediētu alerģiskas reakcijas 90,94.
Noslēgumā jāsaka, ka visizturīgākajai līnijai (83A:476) ierosinātie aizsardzības reakcijas mehānismi ietver ātru patogēna atpazīšanu ar R gēna palīdzību (domājams, TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) un alerģiskas reakcijas mediētu salicilskābes un etilēna signalizāciju, kam seko tāla darbības rādiusa SAR izveidošanās. Darbību atbalsta DIR-1 proteīns. Jāatzīmē, ka C. lupini infekcijas biotrofiskais periods ir ļoti īss (aptuveni 2 dienas), kam seko nekrotiska augšana95. Pāreja starp šiem posmiem var būt saistīta ar nekrozi un etilēna inducējamo proteīnu ekspresiju, kas darbojas kā paaugstinātas jutības reakciju ierosinātāji saimniekaugos. Tāpēc laika logs veiksmīgai C. lupini notveršanai biotrofiskajā stadijā ir ļoti šaurs. Ar redoksu un fotosintēzi saistīto gēnu pārprogrammēšana, kas novērota 83A:476 6 hpi, atbilst sēnīšu hifu progresēšanai un liecina par veiksmīgas aizsardzības reakcijas attīstību biotrofiskajā stadijā. Mandelup un 22660 populācijas transkriptomiskās atbildes var būt pārāk aizkavētas, lai uztvertu sēnīti pirms pārejas uz nekrotisku augšanu, tomēr Mandelup var būt efektīvāks nekā 22660 populācija, jo PR-10 proteīna relatīvi ātrā regulācija veicina horizontālu rezistenci.
ETI, ko virza kanoniskais R gēns, šķiet, ir izplatīts mehānisms pupiņu rezistencei pret antraknozi. Tādējādi pākšaugu modeļa Medicago truncatula rezistenci pret antraknozi nodrošina RCT1 gēns, kas pieder pie TIR-NBS-LRR97 auga R gēnu klases. Šis gēns arī nodrošina plaša spektra antraknozes rezistenci lucernā, kad to pārnes uz jutīgiem augiem. Parastajām pupiņām (P. vulgaris) līdz šim ir identificēti vairāk nekā divi desmiti antraknozes rezistences gēnu. Daži no šiem gēniem atrodas reģionos, kuros nav neviena kanoniskā R gēna, tomēr daudzi citi atrodas hromosomu malās, kurās ir NBS-LRR gēnu klasteris, tostarp TIR-NBS-LRR99. Genomiskā SSR pētījumā tika apstiprināta arī NBS-LRR gēna saistība ar antraknozes rezistenci parastajām pupiņām. Kanoniskais R gēns tika atrasts arī genomiskajā reģionā, kurā ir galvenais antraknozes rezistences lokuss baltajai lupīnai 101.
Mūsu darbs rāda, ka tūlītēja rezistences reakcija, kas aktivizēta augu infekcijas agrīnā stadijā (vēlams ne vēlāk kā 12 hpi), efektīvi aizsargā šaurlapu lupīnu no antraknozes, ko izraisa patogēnā sēne Colletrichum lupini. Izmantojot augstas caurlaidības sekvencēšanu, mēs parādījām antraknozes rezistences gēnu atšķirīgus ekspresijas profilus NLL augos, ko mediē Lanr1 un AnMan rezistences gēni. Veiksmīga aizsardzība ietver rūpīgu gēnu izstrādi olbaltumvielām, kas iesaistītas redoksā, fotosintēzē un patogenēzē dažu stundu laikā pēc auga pirmā kontakta ar patogēnu. Līdzīgas aizsargājošas reakcijas, bet aizkavētas laikā, ir daudz mazāk efektīvas augu aizsardzībā no slimībām. Lanr1 gēna mediētā Sibīrijas mēra rezistence atgādina R gēna tipisko ātro reakciju (efektora ierosināta imunitāte), savukārt AnMan gēns, visticamāk, nodrošina horizontālu reakciju (imunitāti, ko izraisa ar mikrobu saistīts molekulārais modelis), nodrošinot mērenu ilgtspējības līmeni.
215 NLL līnijas, kas tika izmantotas antraknozes marķieru skrīningam, sastāvēja no 74 šķirnēm, 60 līnijām, kas iegūtas krustojot vai selekcionējot, 5 mutantiem un 76 savvaļas vai oriģināliem dīgļplazmiem. Līnijas nāca no 17 valstīm, galvenokārt no Polijas (58), Spānijas (47), Vācijas (27), Austrālijas (26), Krievijas (19), Baltkrievijas (7), Itālijas (5) un citām līnijām no 10 valstīm. Komplektā iekļautas arī references rezistentās līnijas: 83A:476, Tanjil, Wonga ar Lanr1 alēli un Mandelup ar AnMan alēli. Līnijas tika iegūtas no Eiropas lupīnu ģenētisko resursu datubāzes, ko uztur Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polija (1. papildtabula).
Augi tika audzēti kontrolētos apstākļos (fotoperiods 16 stundas, temperatūra 25°C dienā un 18°C ​​naktī). Tika analizēti divi bioloģiskie atkārtojumi. DNS tika izolēta no trīs nedēļas vecām lapām, izmantojot DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Vācija) saskaņā ar protokolu. Izolētās DNS kvalitāte un koncentrācija tika novērtēta ar spektrofotometriskām metodēm (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV). Tika analizēts AnManM1 marķieris, kas iezīmē antraknozes rezistences gēnu AnMan (iegūts no Mandelup šķirnes), un marķieri Anseq3 un Anseq4, kas ieskauj gēnu Lanr1 (iegūts no Tanjil šķirnes)11,26,28. Homozigoti pret rezistento alēli tika novērtēti kā “1”, uzņēmīgie – kā “0” un heterozigoti – kā 0,5.
Pamatojoties uz marķieru AnManM1, AnSeq3 un AnSeq4 skrīninga rezultātiem un sēklu pieejamību galīgajiem papildu eksperimentiem, antraknozes rezistences fenotipēšanai tika atlasītas 50 NLL līnijas. Analīze tika veikta divos eksemplāros datorvadāmā siltumnīcā ar 14 stundu fotoperiodu, temperatūras diapazonu no 22°C dienā un 19°C naktī. Pirms sēšanas sēklas tiek nokasītas (ar asu asmeni nogriežot sēklas apvalku embrija pretējā pusē), lai novērstu sēklu miera periodu pārāk cieta sēklas apvalka dēļ un nodrošinātu vienmērīgu dīgšanu. Augi tika audzēti podos (11 × 11 × 21 cm) ar sterilu augsni (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varšava, Polija). Inokulācija tika veikta ar Colletotrichum lupini Col-08 celmu, kas 1999. gadā audzēts no šaurlapu lupīnu augu kātiem, kas audzēti Veržeņicas laukā, Lielpolijā (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Iegūt apgabalu. Izolāti tika kultivēti SNA barotnē 20° C temperatūrā melnā gaismā 21 dienu, lai ierosinātu sporulāciju. Četras nedēļas pēc sēšanas, kad augi bija sasnieguši 4-6 lapu stadiju, inokulācija tika veikta, apsmidzinot ar konidiju suspensiju ar koncentrāciju 0,5 x 106 konidiju uz ml. Pēc inokulācijas augus 24 stundas turēja tumsā aptuveni 98% mitrumā un 25°C temperatūrā, lai veicinātu konidiju dīgšanu un inficēšanās procesu. Pēc tam augus audzēja 14 stundu fotoperiodā 22°C dienā/19°C naktī un 70% mitruma apstākļos. Slimības vērtējums tika noteikts 22 dienas pēc inokulācijas, un tas svārstījās no 0 (imūns) līdz 9 (ļoti uzņēmīgs) atkarībā no nekrotisku bojājumu klātbūtnes vai neesamības uz kātiem un lapām. Turklāt pēc vērtēšanas tika mērīts augu svars. Korelācijas starp marķieru genotipiem un slimības fenotipiem tika aprēķinātas kā divu punktu secības korelācijas (heterozigotu marķieru neesamība antraknozes rezistences fenotipa analīzes līniju kopā).