Дякуємо за відвідування Nature.com. Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS. Для найкращого досвіду рекомендуємо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відображатимемо сайт без стилів та JavaScript.
Люпин вузьколистий (NLL, Lupinus angustifolius L.) – це бобова рослина, що використовується для виробництва продуктів харчування та покращення ґрунту. Глобальне поширення NLL як культури привабило багато патогенних грибів, включаючи антракноз люпину, який викликає руйнівне захворювання антракноз. Два алелі, Lanr1 та AnMan, що надають підвищеної стійкості, були використані в селекції NLL, але основні молекулярні механізми залишаються невідомими. У цьому дослідженні маркери Lanr1 та AnMan були використані для скринінгу європейських зразків NLL. Тестування вакцини в контрольованому середовищі підтвердило ефективність обох стійких донорів. Диференціальне профілювання експресії генів було проведено на репрезентативних стійких та сприйнятливих лініях. Стійкість до антракнозу була пов'язана з надмірною експресією термінів онтології генів «GO:0006952 Захисна реакція», «GO:0055114 Окисно-відновний процес» та «GO:0015979 Фотосинтез». Крім того, лінія Lanr1(83A:476) продемонструвала значне швидке перепрограмування транскриптома після інокуляції, тоді як інші лінії показали затримку цієї відповіді приблизно на 42 години. Захисні реакції пов'язані з генами TIR-NBS, CC-NBS-LRR та NBS-LRR, 10 білками, що беруть участь у патогенезі, білками переносу ліпідів, ендоглюкан-1,3-β-глюкозидазою, білками клітинної стінки, багатими на гліцин, та генами реактивного шляху кисню. Ранні реакції на 83A:476, включаючи ретельне пригнічення генів, пов'язаних з фотосинтезом, збіглися з успішним захистом під час вегетативної фази росту грибкової біології, що свідчить про те, що ефектор запускає імунітет. Реакція Манделупа сповільнюється, як і загальне горизонтальне гальмування.
Вузьколистий люпин (NLL, Lupinus angustifolius L.) – це високобілковий злак, що походить із західного Середземномор'я1,2. Наразі його вирощують як харчову культуру для тварин і людей. Він також вважається сидератом у системах сівозміни завдяки фіксації азоту симбіотичними азотфіксуючими бактеріями та загальному покращенню структури ґрунту. NLL зазнав швидкого процесу одомашнення протягом останнього століття і досі перебуває під високим тиском селекції3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. З широким поширенням культивування NLL, послідовне розмноження патогенних грибів освоїло нові сільськогосподарські ніші та спричинило нові хвороби, що знищують врожай. Найбільш примітною подією для фермерів та селекціонерів люпину була поява антракнозу, спричиненого патогенним грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Найбільш примітною подією для фермерів та селекціонерів люпину була поява антракнозу, спричиненого патогенним грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Найбільш важливим для фермерів і селекціонерів люпину було виявлення антракнозу, викликаного патогенним грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Найбільш помітною для фермерів та селекціонерів люпину була поява антракнозу, спричиненого патогенним грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Бондар) Ніренберг, Фейлер і Хагедорн13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Бондар)嵵Волосий。1 Найбільш поразливим для фермерів і селекціонерів люпину є прояв антракнозу, викликаного патогенним грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Найбільш вражаючим для фермерів та селекціонерів люпину є поява антракнозу, спричиненого патогенним грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Найдавніші повідомлення про хворобу надійшли з Бразилії та Сполучених Штатів, типові симптоми з'явилися відповідно у 1912 та 1929 роках. Однак приблизно через 30 років збудник був позначений як Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld у цільовій морфології. & Г. Шренк. & Г. Шренк, .та Г. Шренк. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。та Г. Шленк, .Попереднє фенотипування хвороби, проведене в середині 20-го століття, показало певну стійкість у зразків NLL та жовтого люпину (L. luteus L.), але всі протестовані зразки білого люпину (L. albus L.) були дуже сприйнятливими15,16. Дослідження показали, що розвиток антракнозу пов'язаний зі збільшенням кількості опадів (вологості повітря) та температури (в діапазоні 12-28°C), що призводить до порушення стійкості за вищих температур17, 18. Фактично, час, необхідний для проростання конідій та початку захворювання, був у чотири рази коротшим при 24°C (4 години), ніж при 12°C (16 годин) в умовах високої вологості19. Таким чином, триваюче глобальне потепління призвело до поширення антракнозу. Однак хвороба спостерігалася у Франції (1982) та Україні (1983) як передвісник неминучої загрози, але, очевидно, на той час була проігнорована люпиновою промисловістю20,21. Через кілька років ця руйнівна хвороба поширилася по всьому світу, а також вразила основні країни-виробники люпину, такі як Австралія, Польща та Німеччина22,23,24. Після спалаху антракнозу в середині 1990-х років, ретельний скринінг призвів до виявлення кількох стійких донорів у зразках NLL19. Стійкість NLL до антракнозу контролюється двома окремими домінантними алелями, виявленими в різних джерелах зародкової плазми: Lanr1 у сортах Tanjil та Wonga та AnMan у сорті Mandalay25,26. Ці алелі доповнюють молекулярні маркери, що підтримують відбір стійкої зародкової плазми в селекційних програмах25,26,27,28,29,30. Стійку лінію схрещування 83A:476, що несе алель Lanr1, схрестили зі сприйнятливою дикою лінією P27255 для отримання популяції RIL, що сегрегує за стійкістю до антракнозу, що дозволило віднести локус Lanr1 до хромосоми NLL-1131, 32, 33. Вирівнювання маркерів карти зчеплення від фланкуючих локусів стійкості до антракнозу з геномним каркасом, NLL виявило розташування всіх трьох алелів на одній хромосомі (NLL-11), але в різних позиціях29,34,35. Однак, через невелику кількість RIL та велику генетичну відстань між маркерами та відповідними алелями, неможливо зробити достовірні висновки щодо їхніх основних генів. З іншого боку, використання зворотної генетики у люпинів є складним через їх дуже низький регенераційний потенціал, що робить генетичні маніпуляції громіздкими37.
Розробка одомашненої зародкової плазми, що несе бажаний алель у гомозиготному стані, такої як 83A:476 (Lanr1) та Mandelup (AnMan), відкрила шлях до вивчення стійкості до антракнозу в умовах наявності протилежних комбінацій алелів у диких популяціях. Можливості молекулярних механізмів. Порівняння захисних реакцій, що генеруються специфічними генотипами. Це дослідження оцінювало ранню транскриптомну відповідь NLL на вакцинацію C. lupini. Спочатку було проведено скринінг європейської панелі зародкової плазми NLL, що містить 215 ліній, за допомогою молекулярних маркерів, що позначають алелі Lanr1 та AnMan. Потім було проведено фенотипування антракнозу на 50 лініях NLL, попередньо відібраних за молекулярними маркерами, у контрольованих умовах. На основі цих експериментів було відібрано чотири лінії, що відрізняються стійкістю до антракнозу та алельним складом Lanr1/AnMan, для диференціального профілювання експресії генів захисту за допомогою двох взаємодоповнюючих підходів: високопродуктивного секвенування РНК та кількісного визначення ПЛР у реальному часі.
Скринінг набору зародкової плазми NLL (N = 215) з маркерами Lanr1 (Anseq3 та Anseq4) та AnMan (Anseq4) і AnMan (AnManM1) показав, що лише одна лінія (95726, поблизу Salamanca-b) ампліфікує алель «резистентності» для всіх маркерів, тоді як «наявність «сприйнятливих» алелів» виявила частку всіх маркерів у 158 (~73,5%) лініях. Тринадцять ліній продукували два «резистентні» алелі маркера Lanr1, а 8 ліній продукували «резистентні» алелі маркера Lanr1. Алель «резистентності» маркера AnMan (Додаткова таблиця S1). Дві лінії були гетерозиготними для маркера Anseq3 та одна гетерозиготна для маркера AnManM1. 42 лінії (19,5%) несли протилежні фази алелів Anseq3 та Anseq4, що вказує на високу частоту рекомбінації між цими двома локусами. Фенотипи антракнозу в контрольованих умовах (Додаткова таблиця S2) виявили мінливість стійкості тестованих генотипів, що відображалося на тяжкості антракнозу. Різниця в середніх балах коливалася від 1,8 (помірно стійкий) до 6,9 (сприйнятливий), а різниця у вазі рослин коливалася від 0,62 (сприйнятливий) до 4,45 г (стійкий). Спостерігалася значна кореляція між значеннями, що спостерігалися у двох повторностях експерименту (0,51 для оцінки тяжкості захворювання, P = 0,00017 та 0,61 для маси рослини, P < 0,0001), а також між цими двома параметрами (−0,59 та −0,77, P < 0,0001). Спостерігалася значна кореляція між значеннями, що спостерігалися у двох повторностях експерименту (0,51 для показника тяжкості захворювання, P = 0,00017 та 0,61 для маси рослини, P < 0,0001), а також між цими двома параметрами (−0,59 та −0,77, P < 0,0001). Виявлена ​​достовірна кореляція між значеннями, спостережуваними у двох повторах експерименту (0,51 для балів тяжкості хвороби, P = 0,00017 і 0,61 для маси рослин, P < 0,0001), а також між цими двома параметрами (-0,59 і -0,77, R < 0,0001) 0,0001). Було виявлено значну кореляцію між значеннями, що спостерігалися у двох повтореннях експерименту (0,51 для балів тяжкості захворювання, P = 0,00017 та 0,61 для маси рослини, P < 0,0001), а також між цими двома параметрами (-0,59 та -0,77, P < 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分为0,51，P = 0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间，(- 0,59 和- 0,77，P < 0,0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0,59 和– 0,59 和– 0,59 和– 0,59 和-0,77，P <0,0001). Спостерігалася значуща кореляція між значеннями, що спостерігаються в двох повторах (оцінка тяжкості захворювання 0,51, P = 0,00017 і маса рослини 0,61, P <0,0001), і між цими двома параметрами (-0,59 і -0,0001) 0,77, P <0,0001. Спостерігалася значна кореляція між значеннями, що спостерігалися у дублікаті (оцінка тяжкості захворювання 0,51, P = 0,00017 та маса рослини 0,61, P < 0,0001), а між цими двома параметрами (-0,59 та -0,0001) 0,77, P < 0,0001. ).Типові симптоми, що спостерігаються у сприйнятливих рослин, включають вигин та скручування стебла, що нагадує структуру «пастушого лука», а потім овальні ураження з помаранчевими/рожевими спорозоїтами (Додатковий рис. 1). Австралійські зразки, що несуть гени Lanr1 (83A:476 та Tanjil) та AnMan (Mandelup), є помірно стійкими, 0,0331 та 0,0036). Деякі лінії, які також несуть «стійкі» алелі Lanr1 та/або AnMan, демонструють симптоми хвороби.
Цікаво, що кілька ліній NLL, у яких не було жодного «резистентного» маркерного алеля, виявили високий рівень стійкості до антракнозу (порівнянний або вищий, ніж для генотипів Lanr1 або AnMan), такі як Boregine (значення P < 0,0001 для обох параметрів), Bojar (значення P < 0,0001 для оцінки та 0,001 для маси рослини) та популяція B-549/79b (значення P < 0,0001 для оцінки та незначне для маси). Цікаво, що кілька ліній NLL, у яких не було жодного «резистентного» маркерного алеля, виявили високий рівень стійкості до антракнозу (порівнянний або вищий, ніж для генотипів Lanr1 або AnMan), такі як Boregine (значення P < 0,0001 для обох параметрів), Bojar (значення P < 0,0001 для оцінки та 0,001 для маси рослини) та популяція B-549/79b (значення P < 0,0001 для оцінки та незначне для маси). Цікаво, що кілька ліній NLL, позбавлених якого-небудь «резистентного» маркерного аллеля, показали високий рівень стійкості до антракнозу (составний або більш високий, ніж для генотипов Lanr1 або AnMan), таких як Boregine (значення P <0,0001 для обох параметрів), Bojar (значення P < 0,0001 для оцінок і 0,001 для маси рослин) і популяції. B-549/79b (значення P <0,0001 для оцінки та незначимо для маси). Цікаво, що кілька ліній NLL, у яких відсутній будь-який «резистентний» маркерний алель, показали високий рівень стійкості до антракнозу (порівнянний або вищий, ніж для генотипів Lanr1 або AnMan), такі як Boregine (значення P < 0,0001 для обох параметрів), Bojar (значення P < 0,0001 для оцінки та 0,001 для маси рослини) та популяція B-549/79b (значення P < 0,0001 для оцінки та незначне для маси).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分为0,0001，植物重量为0,001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）。 Цікаво, що деякі системи NLL, які не мають жодних «антигенних» маркерів, демонструють високу горизонтальну стійкість (еквівалентну генам Lanr1 або AnMan або вищу), такі як Boregine (обидва параметри P < 0,0001), Bojar (значення P < 0,0001, вага рослини 0,001) та штам B-549/79b (значення P < 0,0001, вага не суттєва). Цікаво, що деякі лінії NLL, позбавлені будь-яких маркерних алелей «резистентності», показали високі рівні стійкості до антракнозу (рівні або вище, ніж у генотипов Lanr1 або AnMan), такі як Boregine (значення P для обох параметрів <0,0001), Bojar (значення P <0,0001, маса рослини 0,001) і популяції. B-549/79b (оцінка P-значення <0,0001, маса незначна). Цікаво, що деякі лінії NLL, у яких відсутні будь-які алелі маркерів «резистентності», демонстрували високий рівень стійкості до антракнозу (порівнянний або вищий, ніж у генотипів Lanr1 або AnMan), такі як Boregine (значення P для обох параметрів <0,0001), Bojar (P-значення <0,0001, маса рослини 0,001) та популяція B-549/79b (P-значення <0,0001, вага незначна).Це явище свідчить про можливість нового генетичного джерела стійкості, пояснюючи спостережувану відсутність кореляції між маркерними генотипами та фенотипами хвороби (значення P від ​​~0,42 до ~0,98). Таким чином, тест Колмогорова-Смірнова показав, що дані щодо стійкості до антракнозу були приблизно нормально розподілені для балів (значення P 0,25 та 0,11) та маси рослин (значення P 0,47 та 0,55), що свідчить про мою гіпотезу про те, що задіяно більше алелів, ніж Lanr1 та AnMan.
На основі результатів скринінгу на стійкість до антракнозу було обрано 4 лінії для аналізу транскриптомів: 83A:476, Boregine, Mandelup та Population 22660. Ці лінії були повторно протестовані на стійкість до сибірської виразки в експериментах з інокуляції методом секвенування РНК, за умови, що вони були такими ж, як у попередньому тесті. Значення балів були такими: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) та популяція 22660 (6,11 ± 1,29).
Протокол Illumina NovaSeq 6000 досяг середнього значення 40,5 пар Mread на зразок (від 29,7 до 54,4 Mread) (Додаткова таблиця S3). Показники вирівнювання в референсній послідовності коливалися від 75,5% до 88,6%. Середня кореляція даних кількості зчитувань між експериментальними варіантами та біологічними повторностями коливалася від 0,812 до 0,997 (середнє значення 0,959). З 35 170 проаналізованих генів 2917 не виявили експресії, а інші 4785 генів експресувалися на незначному рівні (базове середнє значення < 5). З 35 170 проаналізованих генів 2917 не виявили експресії, а інші 4785 генів експресувалися на незначному рівні (базове середнє значення < 5). З 35 170 проаналізованих генів 2917 не виявили експресії, а інші 4785 генів експресувалися на незначному рівні (базове середнє <5). З 35 170 проаналізованих генів 2917 не демонстрували експресії, а решта 4785 генів експресувалися на незначному рівні (базове середнє значення <5).在分析的35,170 个基因中, 2917 个没有表达, 其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。.35 170 З 35 170 проаналізованих генів 2917 не експресувалися, а інші 4785 генів мали незначну експресію (базове середнє значення <5). З 35 170 проаналізованих генів 2917 не експресувалися, а решта 4785 генів мали незначну експресію (базове середнє значення <5).Таким чином, кількість генів, які вважалися експресованими (базове середнє значення ≥ 5) під час експерименту, становила 27 468 (78,1%) (Додаткова таблиця S4).
З першої точки часу всі лінії NLL реагували на інокуляцію C. lupini (штам Col-08) перепрограмуванням транскриптома (Таблиця 1), проте між лініями спостерігалися значні відмінності. Так, лінія резистентності 83A:476 (що несе ген Lanr1) продемонструвала значне перепрограмування транскриптома в першу точку часу (6 hpi) зі збільшенням кількості ізольованих up- та down-генів у 31-69 разів порівняно з іншими точками часу в цю точку часу. Крім того, цей пік був короткочасним, оскільки експресія лише кількох генів залишалася значно зміненою в другу точку часу (12 hpi). Цікаво, що Boregine, який також показав високий рівень резистентності в тесті щеплення, не зазнав такого масового транскрипційного перепрограмування під час експерименту. Однак кількість диференційно експресованих генів (DEG) була однаковою для Boregine та 83A:476 при 12 HPI. Як у Манделупа, так і в популяції 22660 спостерігалися піки DEG в останній момент часу (48 л/с), що вказує на відносну затримку захисних реакцій.
Оскільки 83A:476 зазнала масового репрограмування транскриптома у відповідь на C. lupini на 6 HPI порівняно з усіма іншими лініями, ~91% DEG, що спостерігалися в цей момент часу, були специфічними для лінії (рис. 1). Однак спостерігалося деяке перекриття в ранніх відповідях між досліджуваними лініями, оскільки 68,5%, 50,9% та 52,6% DEG у Boregine, Mandelup та популяції 22660 відповідно перекривалися з тими, що були виявлені в 83A:476 у певні моменти часу. Однак ці DEG становили лише невелику частку (0,97–1,70%) усіх DEG, виявлених наразі за допомогою 83A:476. Крім того, 11 диференційно розподілених клітин (DEG) з усіх ліній були когерентними на цей час (Додаткові таблиці S4-S6), включаючи спільні компоненти захисних реакцій рослин: білок переносу ліпідів (TanjilG_32225), фермент ендоглюкан-1,3-β-глюкозид (TanjilG_23384), два стрес-індуковані білки, такі як SAM22 (TanjilG_31528 та TanjilG_31531), основний латексний білок (TanjilG_32352) та два багаті на гліцин структурні білки клітинної стінки (TanjilG_19701 та TanjilG_19702). Також спостерігалося відносно високе перекриття у транскриптомних відповідях між 83A:476 та Boregine на 24 HPI (загалом 16-38% DEG) та між Mandelup та популяцією 22660 на 48 HPI (загалом 14-20% DEG).
Діаграма Венна, що показує кількість диференційно експресованих генів (DEG) у лініях вузьколистого люпину (NLL), інокульованих Colletotrichum lupini (штам Col-08, отриманий з люпинових полів у Веженіце, Польща, 1999). Проаналізовані лінії NLL були: 83A:476 (стійка, з алелем Lanr1), Boregine (стійка, генетичний фон невідомий), Mandelup (помірно стійка, з алелем AnMan) та популяція 22660 (дуже сприйнятлива). Абревіатура hpi означає години після вакцинації. Нульові значення видалено для спрощення графіка.
Набір генів з надмірною експресією через 6 годин після інфікування було проаналізовано на наявність канонічних доменів гена R (Додаткова таблиця S7). Це дослідження виявило транскриптомну індукцію класичних генів стійкості до хвороб лише з доменами NBS-LRR у позиції 83A:476. Цей набір складався з одного гена TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), п'яти генів CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 та tanjilg_16162), чотирьох NBS-LR (Tanjilg_16162), чотирьох NBS-LRRE (tanjilg_16162), а також чотирьох NBS-Lrr (tanjilg_16162) та чотирьох NBS-LRR (TANJILG_16162). Всі ці гени мають канонічні домени, розташовані в консервативних послідовностях. Окрім генів домену NBS-LRR, кілька RLL-кіназ були активовані через 6 годин після інфікування, а саме: одна у Boregine (TanjilG_19877), дві у Mandelup (TanjilG_07141 та TanjilG_19877) та у популяції 22660 (TanjilG_09014 та TanjilG_10361) та дві у 83A 27:476.
Гени зі значно зміненою експресією у відповідь на інокуляцію C. lupini (штам Col-08) були піддані аналізу збагачення Gene Ontology (GO) (Додаткова таблиця S8). Найчастіше надмірно представленим терміном біологічного процесу був «захисна реакція GO:0006952», який з'являвся у 6 з 16 (час × лінія) комбінацій з високою значущістю (значення P < 0,001) (рис. 2). Найчастіше надмірно представленим терміном біологічного процесу був «захисна реакція GO:0006952», який з'являвся у 6 з 16 (час × лінія) комбінацій з високою значущістю (значення P < 0,001) (рис. 2). Найбільш часто чрезмерно представленим терміном біологічного процесу був «GO: 0006952 захисний відповідь», який виявився в 6 з 16 (час × лінія) комбінації з високою значущістю (значення P <0,001) (рис. 2). Найчастіше надмірно представленим терміном біологічного процесу був «захисна реакція GO:0006952», який з'являвся у 6 з 16 комбінацій (час × лінія) з високою значущістю (значення P < 0,001) (рис. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”,，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 Найбільш репрезентативним терміном біологічного процесу є «захисна реакція GO:0006952», який з'являється у 6 з 16 комбінацій (时间×线) з високою значущістю (значення P < 0,001) (图2). Найбільш часто надмірно представленим терміном біологічного процесу був «GO: 0006952 Defense Response», який виявився в 6 з 16 комбінацій (час × лінія) з високою значимістю (значення P <0,001) (рис. 2). Найчастіше надмірно представленим терміном біологічного процесу був «GO:0006952 Захисна реакція», який з'являвся у 6 з 16 комбінацій (час × лінія) з високою значущістю (значення P < 0,001) (рис. 2).Цей термін був надмірно представлений у двох часових точках у 83A: 476 та Boregine (6 та 24 дні після інфікування) та в одному часовому точці у Mandelup та популяції 22660 (12 та 6 днів після інфікування відповідно). Це очікуваний результат, який підкреслює протигрибкову реакцію стійких ліній. Крім того, 83A:476 реагував на C. lupini швидкою індукцією генів, пов'язаних з окислювальним вибухом, представленим терміном «окисно-відновний процес GO:0055114», що вказує на специфічну захисну реакцію, тоді як Boregine виявив специфічні захисні реакції, пов'язані з терміном «GO». :0006950 Реакція на стрес». Популяція 22660 активувала горизонтальну реакцію резистентності, що включає вторинні метаболіти, що підкреслює надмірну кількість термінів «GO:0016104 Процес біосинтезу тритерпенів» та «GO:0006722 Процес метаболізму тритерпенів» (обидва терміни належать до одного набору генів). Враховуючи результати аналізу збагачення GO-термінів, стабільність реакції Манделупа була між Boregine та Популяцією 22660. Крім того, рання реакція 83A:476 (6 hpi) та затримка реакції Манделупа та Популяція 22660 включають термін GO:0015979 «фотосинтез» та інші пов'язані біологічні процеси.
Терміни онтології генів біопроцесів, відібрані в анотації диференційно експресованих генів під час транскриптомних відповідей вузьколистого люпину (NLL), інокульованого люпином сибірської виразки (штам Col-08, отриманий з люпинових полів у Веженіце, Польща, у 1999 році), значно перебільшені. Проаналізовані лінії NLL були: 83A:476 (стійка, з гомозиготним алелем Lanr1), Boregine (стійка, невідомий генетичний фон), Mandelup (помірно стійка, з гомозиготним алелем AnMan) та популяція 22660 (сприйнятлива).
Оскільки це дослідження мало на меті ідентифікувати гени, що сприяють стійкості до антракнозу, гени, віднесені до термінів GO «GO: 0006952 Захисні реакції» та «GO: 0055114 Окисно-відновні процеси», були проаналізовані з пороговими значеннями, починаючи з середніх значень базового рівня ≥ 30 з принаймні однією лінією. × точка в часі, що поєднує статистично значущі значення log2 (кратна зміна). Кількість генів, що відповідають цим критеріям, становила 65 для GO:0006952 та 524 для GO:0055114.
83A:476 виявив два піки DEG, позначені терміном GO:0006952, перший на рівні 6 генів на дюйм (64 гени, регуляція вгору та вниз), а другий на рівні 24 генів на дюйм (15 генів, лише регуляція вгору). Boregine також показав, що GO:0006952 досяг піку в той самий момент часу, але з меншим DEG (11 та 8) та переважною активацією. Mandeloop показав два піки GO:0006952 на 12 та 48 HPI, обидва несли по 12 генів (перший з активуючими генами, а другий лише з супресивними генами), тоді як популяція 22660 на 6 HPI (13 генів) мала більше переважання піку збільшення регуляції. Слід зазначити, що 96,4% DEG GO:0006952 у цих піках мали однаковий тип відповіді (вгору або вниз), що вказує на значне перекриття захисних реакцій, незважаючи на відмінності в кількості задіяних генів. Найбільша група послідовностей, пов'язаних з терміном GO:0006952, кодує білок 22, пов'язаний зі стресом та повідомленнями (SAM22-like), який належить до клади білків PR-10 класу 10 та латексного білка (MLP-like protein) (рис. 3). Дві групи відрізнялися характером експресії та напрямком реакції. Гени, що кодують білки, подібні до SAM22, демонстрували послідовну та значну індукцію на ранніх етапах часу (6 або 12 годин на день) і загалом не реагували на кінець експерименту (48 годин на день), тоді як білки, подібні до MLP, демонстрували координацію на 6 годин на день. 83A:476 та Mandelup на 48 годин на день/дюйм, майже всі інші точки даних не реагували. Крім того, відмінності в профілях експресії генів білків, подібних до SAM22, слідували за спостережуваною мінливістю стійкості до антракнозу, оскільки більш стійкі лінії мали більше часових точок, що значно індукували ці гени, ніж більш сприйнятливі гени. Інший ген PR-10, подібний до LlR18A/B, показав дуже схожий патерн експресії з геном білка, подібного до SAM22.
Були визначені основні компоненти терміна біологічного процесу «GO:0006952 Defense Response» та патерни експресії генів-кандидатів алелів Lanr1 та AnMan. Шкала Log2 представляє значення log2 (кратність зміни) між інокульованими (Colletotrichum lupini, штам Col-08, отриманий з люпинових полів, Віжениця, Польща, 1999) та контрольними (фіктивно інокульованими) рослинами в один і той самий момент часу. Були проаналізовані такі лінії вузьколистого люпину: 83A:476 (стійка, що несе гомозиготний алель Lanr1), Boregine (стійка, генетичний фон невідомий), Mandelup (помірно стійка, що несе гомозиготний алель AnMan) та Популяція 22660 (сприйнятлива).
Крім того, були оцінені профілі експресії генів-кандидатів РНК-секвенування Lanr1 (TanjilG_05042) та AnMan (TanjilG_12861) (рис. 3). Ген TanjilG_05042 показав значну відповідь (активацію) лише при 83A:476 у першій часовій точці (6 hpi), тоді як TanjilG_12861 був значущим у Mandeloop лише у двох часових точках: 6 hpi (знижена регуляція) та 24 hpi (6 hpi). З.). регульованим) ).
Найбільш надмірно експресованими генами в терміні GO:0055114 «окисно-відновний процес» були гени, що кодують білки цитохрому P450 та пероксидазу (рис. 4). Для зразків, виділених з 83A:476 при 6 HPI, максимальні або мінімальні значення log2 (кратна зміна) (для 86,6% генів) зазвичай спостерігалися між інокульованими та контрольними рослинами, що свідчить про високу реакцію цього генотипу на інокуляцію статі. 83A:476 показав найзначніший GO:0055114 DEG при 6 hpi (503 гени), тоді як решта ліній - при 48 hpi (Boregine, 31 ген; Mandelup, 85 генів; та Population 22660, 78 генів)). У більшості генів родини GO:0055114 спостерігалися два типи реакцій на вакцинацію (активація та інгібування). Цікаво, що до 97,6% диференційованих генів (DEG) були ідентифіковані для терміна GO: 0055114 у Mandelupe при 48 к.с. Ці спостереження свідчать про те, що, незважаючи на значно менший масштаб (тобто кількість мутованих редокс-генів, 85 проти 503), картина затримки транскриптомних відповідей mandelup на антракнозу подібна до ранньої відповіді 83A:476. У Boregine та популяції 22660 ця конвергенція нижча і становить 51,6% та 75,6% відповідно.
Було виявлено закономірності експресії основних компонентів терміну біологічного процесу «GO:0055114 Redox process». Шкала Log2 представляє значення log2 (кратність зміни) між інокульованими (Colletotrichum lupini, штам Col-08, отриманий з люпинових полів, Віжениця, Польща, 1999) та контрольними (фіктивно інокульованими) рослинами в один і той самий момент часу. Були проаналізовані такі лінії вузьколистого люпину: 83A:476 (стійка, що несе гомозиготний алель Lanr1), Boregine (стійка, генетичний фон невідомий), Mandelup (помірно стійка, що несе гомозиготний алель AnMan) та Популяція 22660 (сприйнятлива).
83A:476 Транскриптомні відповіді на інокуляцію C. lupini (штам Col-08) також включали скоординоване заглушення генів, що відносяться до терміна GO:0015979 «фотосинтез» та інших пов'язаних біологічних процесів (рис. 5). Цей набір DEG GO:0015979 містив 105 генів, які були значно пригнічені через 6 годин після інфікування (hpi) у 83A:476. У цій підгрупі 37 генів також були знижені у Mandelup через 48 годин після інфікування (HPI) та 35 у той самий момент часу у популяції 22660, включаючи 19 DEG, спільних для обох генотипів. Жоден DEG, пов'язаний з терміном GO: 0015979, не був суттєво активований у жодній комбінації (лінія x час).
Було виявлено закономірності експресії основних компонентів терміну біологічного процесу «GO:0015979 Фотосинтез». Шкала Log2 представляє значення log2 (кратність зміни) між інокульованими (Colletotrichum lupini, штам Col-08, отриманий з люпинових полів, Віжениця, Польща, 1999) та контрольними (фіктивно інокульованими) рослинами в один і той самий момент часу. Були проаналізовані такі лінії вузьколистого люпину: 83A:476 (стійка, що несе гомозиготний алель Lanr1), Boregine (стійка, генетичний фон невідомий), Mandelup (помірно стійка, що несе гомозиготний алель AnMan) та Популяція 22660 (сприйнятлива).
На основі результатів диференціального аналізу експресії та, ймовірно, участі в захисних реакціях проти патогенних грибів, цей набір із семи генів був обраний для кількісного визначення профілів експресії за допомогою ПЛР у реальному часі (Додаткова таблиця S9).
Передбачуваний ген білка TanjilG_10657 був значно індукований у всіх досліджуваних лініях та часових точках порівняно з контрольними (мімічними) рослинами (Додаткові таблиці S10, S11). Крім того, профіль експресії TanjilG_10657 демонстрував зростаючу тенденцію протягом експерименту для всіх ліній. Популяція 22660 показала найвищу чутливість TanjilG_10657 до інокуляції зі 114-кратною активацією та найвищим відносним рівнем експресії (4,4 ± 0,4) через 24 години після інфікування (рис. 6a). Ген білка PR10 LlR18A TanjilG_27015 також показав активацію на всіх лініях та часових точках, зі статистично значущим результатом у більшості точок даних (рис. 6b). Подібно до TanjilG_10657, найвищий відносний рівень експресії TanjilG_27015 спостерігався в інокульованій популяції 22660 через 24 години після інфікування (19,5 ± 2,4). Ген кислої ендохітинази TanjilG_04706 був значно підвищений у всіх лініях та в усі часові точки, окрім Boregine 6 hpi (рис. 6c). Він був сильно індукований у першу часову точку (6 HPI) при 83A:476 (у 10,5 раза) та помірно підвищений в інших лініях (у 6,6-7,5 раза). Під час експерименту експресія TanjilG_04706 залишалася на подібних рівнях у 83A:476 та Boregine, тоді як у Mandelup та популяції 22660 вона значно збільшилася, досягнувши відносно високих значень (5,9 ± 1,5 та 6,2 ± 1,5 відповідно). Ген ендоглюкан-1,3-β-глюкозидазоподібного гена TanjilG_23384 показав високу активацію в перші дві часові точки (6 та 12 hpi) у всіх лініях, окрім популяції 22660 (рис. 6d). Найвищі відносні рівні експресії TanjilG_23384 спостерігалися у другу часову точку (12 HPI) у Mandelup (2,7 ± 0,3) та 83A:476 (1,5 ± 0,1). При 24 HPI експресія TanjilG_23384 була відносно низькою у всіх досліджуваних лініях (від 0,04 ± 0,009 до 0,44 ± 0,12).
Профілі експресії вибраних генів (ag), виявлені за допомогою кількісної ПЛР. Числа 6, 12 та 24 позначають години після вакцинації. Гени LanDExH7 та LanTUB6 використовували для нормалізації, а LanTUB6 – для міжсерійного калібрування. Смуги похибки представляють стандартне відхилення на основі трьох біологічних повторностей, кожна з яких є середнім значенням трьох технічних повторностей. Статистична значущість відмінностей у рівнях експресії між інокульованими (Colletotrichum lupini, штам Col-08, отриманий у 1999 році з поля люпину у Вежениці, Польща) та контрольними (модельно-інокульованими) рослинами позначена вище у точках даних (*значення P < 0,05, **значення P ≤ 0,01, ***значення P ≤ 0,001). Статистична значущість відмінностей у рівнях експресії між інокульованими (Colletotrichum lupini, штам Col-08, отриманий у 1999 році з поля люпину у Вежениці, Польща) та контрольними (модельно-інокульованими) рослинами позначена вище у точках даних (*значення P < 0,05, **значення P ≤ 0,01, ***значення P ≤ 0,001). Статистична значущість різниці в рівнях експресії між інокулірованими (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, отриманий у 1999 р. з поля люпина у Верженіце, Польща) і контрольними (ложно інокулірованими) рослинами, позначеними над точками даних (*значення P < 0,05, **значення P ≤ 0,01, ***значення P ≤ 0,001). Статистично значущі відмінності в рівнях експресії між інокульованими (Colletotrichum lupini, штам Col-08, отриманий у 1999 році з люпинового поля у Веженіце, Польща) та контрольними (фіктивно інокульованими) рослинами зазначені над точками даних (*P-значення < 0,05, **P-значення ≤ 0,01, ***P-значення ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Статистично значущі відмінності в рівнях експресії між інокулірованими (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, отриманий з поля люпини у Верженіце, Польща, в 1999 р.) і контрольними (ложно інокулірованими) рослинами, позначеними над точками даних (* значення P < 0,05, ** P-значення ≤ 0,01, ***P-значення ≤ 0,001). Статистично значущі відмінності в рівнях експресії між інокульованими (Colletotrichum lupini, штам Col-08, отриманий з люпинових полів у Верженіце, Польща, у 1999 році) та контрольними (фіктивно інокульованими) рослинами зазначені над точками даних (*P-значення < 0,05, **P-значення ≤ 0,01, ***P-значення ≤ 0,001).Проаналізовані лінії NLL були: 83A:476 (стійка, несуча гомозиготний алель Lanr1), Mandelup (помірно стійка, несуча гомозиготний алель AnMan), Boregine (стійка, невідомий генетичний фон) та популяція 22660 (сприйнятлива).
Ген-кандидат TanjilG_05042 у локусі Lanr1 показав помітно відмінний патерн експресії від профілів, отриманих з досліджень РНК-секвенування (рис. 6e). Значна активація цього гена спостерігалася в популяціях Mandelup та 22660 (до 39,7 та 11,7 разів відповідно), що призвело до відносно високих рівнів експресії (до 1,4 ± 0,14 та 7,2 ± 1,3 відповідно). 83A:476 також виявила деяке підвищення регуляції гена TanjilG_05042 (до 3,8 разів), однак досягнуті відносні рівні експресії (0,044 ± 0,002) були більш ніж у 30 разів нижчими, ніж ті, що спостерігалися в популяціях Mandelup та 22660. Проаналізовані за допомогою кПЛР виявили значні відмінності в рівнях експресії між генотипами у контрольних варіантах (контрольних), досягнувши 58-кратної різниці між популяціями 22660 та 83A:476, а також між популяціями 22660 та 22660. Двократна різниця була досягнута між Boregine та Mandalup.
Ген-кандидат у локусі AnMan, TanjilG_12861, був активований у відповідь на вакцинацію у штамів 83A:476 та Mandelup, був нейтральним у популяції 22660 та зниженим у Boregine (рис. 6f). Відносна експресія гена TanjilG_12861 була найвищою у інокульованому штамі 83A:476 (0,14±0,01). Ген білка теплового шоку класу I TanjilG_05080 HSP17.4 з молекулярною масою 17,4 кДа показав нижчі рівні відносної експресії у всіх досліджуваних штамах та часових точках (рис. 6g). Найвище значення спостерігалося на 24 HPI у популяції 22660 (0,14 ± 0,02, восьмикратне збільшення у відповідь на вакцинацію).
Порівняння профілів експресії генів (рис. 7) виявило високу кореляцію між TanjilG_10657 та чотирма іншими генами: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) та TanjilG_04706 (r = 0,79). Такі результати можуть свідчити про корегуляцію цих генів під час захисних реакцій. Гени TanjilG_12861 та TanjilG_23384 показали різні профілі експресії з нижчими значеннями коефіцієнта кореляції Пірсона (від 0,08 до 0,43 та від -0,19 до 0,28 відповідно) порівняно з іншими генами.
Кореляції між профілями експресії генів були виявлені за допомогою кількісної ПЛР. Були проаналізовані такі лінії вузьколистого люпину: 83A:476 (стійка, з гомозиготним алелем Lanr1), Mandelup (помірно стійка, з гомозиготним алелем AnMan), Boregine (стійка, генетичний фон невідомий) та Популяція 22660 (сприйнятлива). Були розраховані три часові точки (6, 12 та 24 години після інокуляції), включаючи інокульовані (Colletotrichum lupini, штам Col-08, отриманий з люпинових полів у Веженіце, Польща, у 1999 році) та контрольні (фіктивно інокульовані) рослини. Шкала показує значення коефіцієнта кореляції Пірсона.
На основі даних, отриманих при потужності 6 кінських сил на дюйм, було проведено WGCNA на 9981 DEG, ідентифікованих шляхом порівняння інокульованих та контрольних рослин, щоб зосередитися на ранніх захисних реакціях (Додаткова таблиця S12). Було виявлено двадцять два генні модулі (кластери) з корельованими (позитивними або негативними) профілями експресії між генотипами та експериментальними варіантами. У середньому рівні експресії генів спадали в порядку 83A:476 > Mandelup > Boregine > Популяція 22660 (однак в обох варіантах ця тенденція була сильнішою у контрольних рослин). У середньому рівні експресії генів спадали в порядку 83A:476 > Mandelup > Boregine > Популяція 22660 (однак в обох варіантах ця тенденція була сильнішою у контрольних рослин). У середньому рівні експресії генів знижувалися в порядку 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (в обох варіантах, однак, ця тенденція була сильнішою в контрольних рослинах). У середньому рівні експресії генів знижувалися в порядку 83A:476 > Mandelup > Boregine > Популяція 22660 (однак в обох варіантах ця тенденція була сильнішою у контрольних рослин).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Населення 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> населення 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种在 在 植物 中 更). У середньому рівні експресії генів знизилися в рядку 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (однак в обох варіантах ця тенденція була сильнішою в контрольних рослинах). У середньому рівні експресії генів знизилися в серії 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (проте, в обох варіантах ця тенденція була сильнішою у контрольних рослин).Вакцинація призвела до підвищення регуляції експресії генів, особливо в модулях 18, 19, 14, 6 та 1 (у порядку спадання ефекту), негативної регуляції (наприклад, модулі 9 та 20) або нейтрального ефекту (наприклад, модулі 11, 22, 8 та 13). Аналіз збагачення GO-термінів (Додаткова таблиця S13) виявив «GO: 0006952 Захисні реакції» для інокульованого модуля (18) з максимальною активацією, включаючи гени, проаналізовані за допомогою кПЛР (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 та TanjilG_27015), а також багато модулів фотосинтезу, що найбільше пригнічуються інокулятом (9). Концентратор модуля 18 (рис. 8) був ідентифікований як ген TanjilG_26536, що кодує білок PR-10-подібний LlR18B, а концентратор модуля 9 був ідентифікований як ген TanjilG_28955, що кодує білок фотосистеми II PsbQ. Кандидатний ген стійкості до антракнозу Lanr1, TanjilG_05042, був знайдений у модулі 22 (рис. 9) і пов'язаний з термінами «GO:0044260 Клітинні макромолекулярні метаболічні процеси» та «GO:0006355 Регуляція транскрипції, шаблони ДНК», що містять хаб TanjilG_01212. Ген кодує транскрипційний фактор теплового стресу A-4a (HSFA4a).
Зважений мережевий аналіз коекспресії генів модулів з надмірно представленими термінами біологічних процесів «GO: 0006952 Defense responses». Лігування було спрощено, щоб виділити чотири гени, проаналізовані за допомогою кПЛР (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 та TanjilG_27015).
Зважений мережевий аналіз коекспресії генів модуля з надмірно представленим терміном біологічного процесу «GO: 0006355: Регуляція транскрипції, шаблони ДНК» та з кандидатним геном стійкості до антракнозу Lanr1 TanjilG_05042. Лігування було спрощено для виділення гена TanjilG_05042 та центрального гена TanjilG_01212.
Скринінг на стійкість до антракнозу, зібраний в Австралії, показав, що більшість ранніх випущених сортів були сприйнятливими; Kalya, Coromup та Mandelup були описані як помірно стійкі, тоді як Wonga, Tanjil та 83A:476 були описані як високостійкі26,27,31. мали той самий алель стійкості, позначений як Lanr1, а Coromup та Mandelup мали інший алель, позначений як AnMan10, 26, 39, тоді як Kalya передала інший алель, Lanr2. Скринінг на стійкість до антракнозу в Німеччині призвів до ідентифікації стійкої лінії Bo7212 з алелем-кандидатом, відмінним від Lanr1, позначеним як LanrBo36.
Наше дослідження виявило дуже низьку частоту (близько 6%) алеля Lanr1 у тестованій зародковій плазмі. Це спостереження узгоджується з результатами скринінгу східноєвропейської зародкової плазми з використанням маркерів Anseq3 та Anseq4, які показали, що алель Lanr1 присутній лише у двох білоруських лініях. Це свідчить про те, що алель Lanr1 ще не широко використовується місцевими селекційними програмами, на відміну від Австралії, де він є одним з ключових алелів для маркер-асистованої селекції. Це може бути пов'язано з нижчим рівнем стійкості, що забезпечується алелем Lanr1, у європейських польових умовах порівняно з австралійським звітом. Крім того, дослідження антракнозу в районах з високою кількістю опадів в Австралії показали, що реакції стійкості, опосередковані алелем Lanr1, можуть бути неефективними за погодних умов, що сприяють росту та швидкому розвитку патогена19,42. Фактично, у цьому дослідженні деякі симптоми антракнозу також спостерігалися у генотипів, що несуть алель Lanr1, що свідчить про те, що стійкість може зникнути за оптимальних умов для розвитку C. lupini. Крім того, можливі хибнопозитивні інтерпретації наявності маркерів Anseq3 та Anseq4, які знаходяться приблизно на відстані 1 сМ від локусу Lanr1, [28,30,43].
Наше дослідження показало, що 83A:476, який несе алель Lanr1, реагував на інокуляцію C. lupini масштабним репрограмуванням транскриптома в першу аналізовану часову точку (6 хвилин після інфікування), тоді як у Mandelup, який несе алель AnMan, транскриптомні відповіді спостерігалися набагато пізніше (від 24 до 48 хвилин після інфікування). Ці часові варіації захисних реакцій пов'язані з відмінностями в симптомах захворювання, що підкреслює важливість раннього розпізнавання патогена для успішної відповіді на резистентність. Щоб інфікувати тканини рослини, спори сибірської виразки повинні пройти кілька стадій розвитку на поверхні хазяїна, включаючи проростання, поділ клітин та формування апресорію. Придаток - це інфекційна структура, яка прикріплюється до поверхні хазяїна та сприяє проникненню в тканини хазяїна. Таким чином, спори C. gloeosporioides в екстракті гороху показали перший поділ ядра після 75-90 хвилин інкубації, формування росткової трубки через 90-120 хвилин та пригнічення через 4 години 45. Манговий C. gloeosporioides продемонстрував понад 40% проростання конідій після 3 годин інкубації та близько 20% утворення апресорів через 4 години. Ген CAP20, пов'язаний з вірулентністю, CAP20 C. gloeosporioides продемонстрував транскрипційну активність у конідіях, що утворюють епіфіти, після 3,5 годин інкубації у поверхневому воску авокадо з високими концентраціями білка CAP20 через 4 години 46 хвилин. Аналогічно, активність генів біосинтезу меланіну у C. trifolii була індукована протягом 2-годинної інкубації з подальшим утворенням апресорію через 1 годину. Дослідження тканин листя показали, що полуниця, інокульована C. acutatum, має перше пригнічення через 8 годин після інфікування, тоді як помідори, інокульовані C. coccodes, мають перше пригнічення через 4 години після інфікування48,49. це значною мірою відповідає часовій шкалі інфекційного процесу Colletotrichum spp. Швидкі захисні реакції на 83A:476 свідчать про залученість генів стійкості рослин та ефекторно-активованого імунітету (ETI) у цій лінії, тоді як затримки реакцій Манделупа підтверджують гіпотезу мікроасоційованого молекулярного імунітету (MTI) 50. Ранні реакції на 83A: 476 та Манделупа. Часткове перекриття між генами з підвищеною або зниженою регуляцією у затримці реакції також підтверджує цю концепцію, оскільки ETI часто вважається прискореною та посиленою реакцією MTI, яка завершується запрограмованою загибеллю клітин у місці інфекції, відомою як анафілактичний шок 51,52.
Більшість генів, що відносяться до надмірно представленого терміну Gene Ontology GO:0006952 «Захисна реакція», є 11 гомологами білка 22, індукованого стресом, що викликає голодування (подібного до SAM22), та сімома основними латексними білкоподібними білками (MLP), подібними до 31, 34, 43 та 423, показали подібність послідовностей. SAM22-подібні гени продемонстрували значну активацію, яка тривала довше, демонструючи підвищений рівень стійкості до антракнозу (83A:476 та Boregine). Однак MLP-подібні гени були знижені лише в лініях, що несуть кандидатний алель стійкості (83A:476/Lanr1 через 6 годин після інфікування та Mandelup/AnMan через 24 години після інфікування). Слід зазначити, що всі ідентифіковані SAM22-подібні гомологи походять з кластера генів довжиною приблизно 105 кб, тоді як MLP-подібні гени походять з окремих областей геному. Координована активація таких SAM22-подібних генів також була виявлена ​​в нашому попередньому дослідженні стійкості NLL до інокуляції Diaporthetoxica, що свідчить про їхню участь у горизонтальних компонентах захисної реакції. Цей висновок також підтверджується повідомленнями про позитивну реакцію SAM22-подібних генів на пошкодження або лікування саліциловою кислотою, індукторами грибків або перекисом водню.
Показано, що MLP-подібні гени реагують на різні абіотичні та біотичні стреси, включаючи бактеріальні, вірусні та патогенні грибкові інфекції у багатьох видах рослин55. Напрямки реакції на певні взаємодії між рослинами та патогенами варіювалися від сильного зростання (тобто під час зараження бавовни Verticillium dahliae) до значного зниження (тобто після зараження яблуні Alternaria spp.)56,57. Значне зниження регуляції MLP-подібного гена 423 спостерігалося під час захисту авокадо від інфекції F. niger та під час зараження яблуні Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola та Alternaria alternata є патотипами яблуні58,59. Крім того, калуси яблуні, що надмірно експресують MLP-подібний ген 423, мали нижчу експресію генів, пов'язаних з резистентністю, та були більш схильні до грибкової інфекції59. Після Fusarium oxysporum f, MLP-подібний ген 423 також був пригнічений у стійкій зародковій плазмі звичайної квасолі. cn. Інфекція квасолі 60.
Іншими членами родини PR-10, ідентифікованими в нашому дослідженні РНК-секвенування, були гени LlR18A та LlR18B у відповідь на підвищену регуляцію, а також ген білка переносу ліпідів DIR1 з підвищеною (1 ген) або зниженою регуляцією (3 гени). Крім того, WGCNA виділяє ген LlR18B як центр у цьому модулі, який є дуже чутливим до вакцинації та несе кілька генів захисної відповіді. Гени LlR18A та LlR18B були індуковані в листках жовтого люпину у відповідь на патогенні бактерії, а також у стеблах NLL після інокуляції D. toxica, тоді як рисовий гомолог цих генів, RSOsPR10, був швидко індукований грибковою інфекцією, ймовірно, залученою до сигнального шляху жасмонової кислоти 53,61, 62. Ген DIR1 кодує неспецифічні білки транспорту ліпідів, необхідні для виникнення системної набутої резистентності (SAR). З розвитком захисних реакцій білок DIR1 транспортується з вогнища інфекції через флоему, індукуючи SAR у віддалених органах. Цікаво, що ген DIR1 TanjilG_02313 був значно індукований у першу часову точку в лініях 84A:476 та популяції 22660, але стійкість до антракнозу успішно розвинулася лише в лінії 84A:476. Це може свідчити про деяку субфункціоналізацію гена DIR1 при NLL, оскільки решта три гомологи реагували на інокуляцію лише в лінії 83A:476 через 6 годин після інфікування, і ця відповідь була спрямована вниз.
У нашому дослідженні найпоширенішими компонентами, що відповідають біологічному процесу під назвою «GO:0055114 Redox process», були білок цитохрому P450, пероксидаза, лінолево-кислотна 9S-/13S-ліпоксигеназа та оксидаза 1-аміноциклопропан-1-карбонової кислоти. Крім того, наша WGCNA визначає гомолог HSFA4a як вузол, що несе модулі, такі як кандидатний ген стійкості Lanr1 TanjilG_05042. HSFA4a є компонентом редокс-залежної регуляції ядерної транскрипції у рослин.
Білки цитохрому P450 – це оксидоредуктази, що каталізують реакції гідроксилювання, залежні від NADPH та/або O2, у первинному та вторинному метаболізмі, включаючи метаболізм ксенобіотиків, а також гормонів, жирних кислот, стеролів, компонентів клітинної стінки, біополімерів та біосинтез захисних сполук 69. У нашому дослідженні мінливість функції цитохрому P450 у рослин зменшилася з -10,6 log2 (кратна зміна) до 5,7 через велику кількість змінених гомологів (37) та відмінності в моделях реакції між конкретними генами, що відображає перегляд у бік збільшення. Використання лише даних РНК-секвенування для з'ясування передбачуваної біологічної функції генів NLL у такій великій надродині білків було б дуже спекулятивним. Однак варто зазначити, що деякі гени цитохрому P450 пов'язані з підвищеною стійкістю до патогенних грибів або бактерій, включаючи внесок в алергічні реакції 69,70,71.
Пероксидази III класу – це багатофункціональні рослинні ферменти, що беруть участь у широкому спектрі метаболічних процесів під час росту та розвитку рослин, а також у відповідь на стресові фактори навколишнього середовища, такі як засоленість, посуха, висока інтенсивність світла та атака патогенів72. Пероксидази беруть участь у взаємодії кількох видів рослин з сибірською язичкою (Anthracis), включаючи Stylosanthes humilis та C. gloeosporioides, Lens culinaris та C. truncatum, Phaseolus vulgaris та C. lindemuthianum, Cucumis sativus та C. lagenarium73,74,75,76. Реакція дуже швидка, іноді навіть при 4 HPI, до того, як грибок проникає в тканини рослини73. Ген пероксидази також реагував на інокуляцію D. toxica NLL. Окрім своїх типових функцій регуляції оксидативного вибуху або усунення оксидативного стресу, пероксидази можуть перешкоджати росту патогенів, створюючи фізичні бар'єри на основі посилення клітинної стінки під час лігніфікації, субодиниць або зшивання специфічних сполук. Цю функцію можна in silico пояснити геном TanjilG_03329, що кодує ймовірну лігнін-утворюючу аніонпероксидазу, рівень якої в нашому дослідженні був значно підвищений у стійкій лінії 83A:476 при 6 HPI, але не в інших штамах та часових точках, які не реагували.
9S-/13S-ліпоксигеназа лінолевої кислоти є першим кроком в окислювальному шляху біосинтезу ліпідів78. Продукти цього шляху мають численні функції в захисті рослин, включаючи зміцнення клітинної стінки шляхом утворення відкладень калози та пектину, а також регуляцію оксидативного стресу шляхом продукування активних форм кисню79,80,81,82,83. У цьому дослідженні експресія лінолевої кислоти 9S-/13S-ліпоксигенази була змінена у всіх штамах, але у сприйнятливій популяції 22660 переважала підвищена регуляція в різні моменти часу, тоді як у штамах, що несуть резистентний Lanr1 та алель AnMan, це підкреслює диверсифікацію оксиліпінового шару в захисних реакціях сибірської виразки між цими генотипами.
Гомолог 1-аміноциклопропан-1-карбоксилатоксидази (ACO) був значно підвищений (9 генів) або знижений (2 гени) при інокуляції люпином. За двома винятками, всі ці реакції відбувалися при швидкості 6 год. у 83A:476. Ферментативна реакція, опосередкована білками ACO, є етапом, що лімітує швидкість утворення етилену, і тому є високорегульованою84. Етилен – це рослинний гормон, який відіграє різноманітну роль у регулюванні розвитку рослин та реакції на абіотичні та біотичні стресові умови. Індукція транскрипції ACO та активація сигнального шляху етилену беруть участь у підвищенні стійкості рису до гемібіотрофного грибка oryzae oryzae шляхом регулювання виробництва активних форм кисню та фітоалексинів. Дуже схожий процес інфекції листя, виявлений між M. oryzae та C. lupini88,89, на тлі значного підвищення регуляції гомологів ACO у лінії 83A:476, про що повідомлялося в цьому дослідженні, зміщує можливість надання стійкості до етилену антракнози NLL як центрального сигнального етапу в молекулярних шляхах.
У цьому дослідженні спостерігалося масштабне пригнічення багатьох генів, пов'язаних з фотосинтезом, через 6 годин після народження у популяції 83A:476 та через 48 годин після народження у популяції Манделуп та 22660. Ступінь та прогресування цих змін пропорційні рівню. У цьому експерименті спостерігалася стійкість до антракнозу. Нещодавно було зареєстровано сильне та раннє пригнічення транскриптів, пов'язаних з фотосинтезом, у кількох моделях взаємодії рослин і патогенів, включаючи патогенні бактерії та гриби. Поспішність (від 2 годин після народження в деяких взаємодіях) та глобальне пригнічення генів, пов'язаних з фотосинтезом, у відповідь на інфекцію можуть запускати імунітет рослин, заснований на розгортанні активних форм кисню та їх взаємодії зі шляхом саліцилової кислоти для опосередкування алергічних реакцій 90,94.
На завершення, механізми захисної реакції, запропоновані для найстійкішої лінії (83A:476), включають швидке розпізнавання патогена геном R (ймовірно, TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) та опосередковану алергічною реакцією сигналізацію саліцилової кислоти та етилену, після чого встановлюється довгострокова SAR-дія. Дія підтримується білком DIR-1. Слід зазначити, що біотрофний період для інфекції C. lupini дуже короткий (приблизно 2 дні), після чого відбувається некротичний ріст95. Перехід між цими стадіями може бути пов'язаний з некрозом та експресією етилен-індукованих білків, які діють як тригери реакцій гіперчутливості у рослин-господарів. Таким чином, часовий проміжок для успішного захоплення C. lupini на біотрофній стадії дуже вузький. Перепрограмування генів, пов'язаних з окисно-відновними процесами та фотосинтезом, що спостерігається в 83A:476 через 6 годин після початку процесу, узгоджується з прогресуванням грибкових гіф та віщує розвиток успішної захисної реакції на біотрофній стадії. Транскриптомні відповіді Mandelup та популяції 22660 можуть бути занадто затриманими для захоплення грибка до переходу до некротичного росту, проте Mandelup може бути ефективнішим, ніж популяція 22660, оскільки відносно швидка регуляція білка PR-10 сприяє горизонтальній резистентності.
ETI, зумовлений канонічним геном R, ймовірно, є поширеним механізмом стійкості квасолі до антракнозу. Таким чином, у модельної бобової рослини Medicago truncatula стійкість до антракнозу забезпечується геном RCT1, членом класу генів R рослини TIR-NBS-LRR97. Цей ген також забезпечує стійкість до антракнозу широкого спектру дії у люцерни при перенесенні на сприйнятливі рослини. У звичайної квасолі (P. vulgaris) на сьогоднішній день ідентифіковано понад два десятки генів стійкості до антракнозу. Деякі з цих генів знаходяться в регіонах, де відсутні будь-які канонічні гени R, проте багато інших розташовані на краях хромосом, що несуть кластер генів NBS-LRR, включаючи TIR-NBS-LRRs99. Дослідження SSR у всьому геномі також підтвердило зв'язок гена NBS-LRR з стійкістю до антракнозу у звичайної квасолі. Канонічний ген R також був виявлений у геномному регіоні, що несе основний локус стійкості до антракнозу у білого люпину 101.
Наша робота показує, що негайна реакція резистентності, активована на ранній стадії інфекції рослин (бажано не пізніше 12 годин після народження), ефективно захищає вузьколистий люпин від антракнозу, спричиненого патогенним грибом Collelotrichum lupini. Використовуючи високопродуктивне секвенування, ми продемонстрували диференціальні профілі експресії генів резистентності до антракнозу у рослин NLL, опосередкованих генами резистентності Lanr1 та AnMan. Успішний захист передбачає ретельне проектування генів білків, що беруть участь в окисно-відновних процесах, фотосинтезі та патогенезі, протягом кількох годин після першого контакту рослини з патогеном. Подібні захисні реакції, але відкладені в часі, набагато менш ефективні в захисті рослин від хвороб. Резистентність до сибірської виразки, опосередкована геном Lanr1, нагадує типову швидку відповідь гена R (ефектор-тригерований імунітет), тоді як ген AnMan, найімовірніше, забезпечує горизонтальну відповідь (імунітет, ініційований мікробно-асоційованим молекулярним патерном), забезпечуючи помірний рівень стійкості.
215 ліній NLL, що використовувалися для скринінгу на маркери антракнозу, складалися з 74 сортів, 60 ліній, отриманих шляхом схрещування або селекції, 5 мутантів та 76 диких або оригінальних зародкових плазм. Лінії походили з 17 країн, головним чином з Польщі (58), Іспанії (47), Німеччини (27), Австралії (26), Росії (19), Білорусі (7), Італії (5) та інших ліній з 10 країн. Набір також включає референтні стійкі лінії: 83A:476, Tanjil, Wonga з алелем Lanr1 та Mandelup з алелем AnMan. Лінії були отримані з Європейської бази даних генетичних ресурсів люпину, що підтримується Poznań Plant Breeding Ltd., Вятрова, Польща (Додаткова таблиця S1).
Рослини вирощували в контрольованих умовах (фотоперіод 16 годин, температура 25°C вдень та 18°C ​​вночі). Було проаналізовано дві біологічні повторності. ДНК виділяли з тритижневого листя за допомогою набору DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Хільден, Німеччина) згідно з протоколом. Якість та концентрацію виділеної ДНК оцінювали спектрофотометричними методами (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Волтем, Массачусетс, США). Було проаналізовано маркер AnManM1, що позначає ген стійкості до антракнозу AnMan (похідний від сорту Mandelup), та маркери Anseq3 та Anseq4, що фланкують ген Lanr1 (похідний від сорту Tanjil) 11,26,28. Гомозиготи за алелем стійкості оцінювали як «1», сприйнятливі – як «0», а гетерозиготи – як 0,5.
На основі результатів скринінгу на маркери AnManM1, AnSeq3 та AnSeq4, а також наявності насіння для остаточних подальших експериментів, було відібрано 50 ліній NLL для фенотипування стійкості до антракнозу. Аналіз проводили у двох екземплярах у теплиці з комп'ютерним керуванням та 14-годинним фотоперіодом, з температурним діапазоном 22°C вдень та 19°C вночі. Насіння дряпали (зрізаючи насіннєву оболонку з протилежного боку зародка гострим лезом) перед посівом, щоб запобігти спокою насіння через занадто тверду насіннєву оболонку та забезпечити рівномірне проростання. Рослини вирощували в горщиках (11 × 11 × 21 см) зі стерильним ґрунтом (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Варшава, Польща). Інокуляцію проводили штамом Colletotrichum lupini Col-08, вирощеним у 1999 році зі стебел вузьколистого люпину, вирощеного на полі у Вержениці, Великопольща (52° 27′ 42″ пн. ш. 17° 04′ 05″ сх. д.). Отриману площу. Ізоляти культивували у середовищі SNA при температурі 20°C під чорним світлом протягом 21 дня для індукції спороутворення. Через чотири тижні після посіву, коли рослини досягли стадії 4-6 листків, проводили інокуляцію шляхом обприскування суспензією конідій у концентрації 0,5 x 10⁶ конідій на мл. Після інокуляції рослини витримували в темряві протягом 24 годин при вологості близько 98% та температурі 25°C для сприяння проростанню конідій та процесу інфекції. Потім рослини вирощували за 14-годинного фотоперіоду при температурі 22°C вдень/19°C вночі та вологості 70%. Оцінку захворювання було встановлено через 22 дні після інокуляції та вона коливалася від 0 (імунітет) до 9 (дуже сприйнятливий) залежно від наявності або відсутності некротичних уражень на стеблах та листках. Крім того, після оцінки вимірювали вагу рослин. Зв'язки між маркерними генотипами та фенотипами захворювання розраховували як точкові двопослідовні кореляції (відсутність гетерозиготних маркерів у наборі ліній для аналізу фенотипу стійкості до антракнозу).