از بازدید شما از Nature.com متشکریم. نسخه مرورگری که استفاده می‌کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین تجربه، توصیه می‌کنیم از یک مرورگر به‌روز استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). در عین حال، برای اطمینان از ادامه پشتیبانی، سایت را بدون استایل‌ها و جاوا اسکریپت رندر خواهیم کرد.
آنگوستیفولیوس لوپین (NLL، Lupinus angustifolius L.) گیاهی از خانواده حبوبات است که برای تولید مواد غذایی و بهبود خاک استفاده می‌شود. گسترش جهانی NLL به عنوان یک محصول، قارچ‌های بیماری‌زای زیادی از جمله آنتراکنوز لوپین را که باعث بیماری ویرانگر آنتراکنوز می‌شود، جذب کرده است. دو آلل، Lanr1 و AnMan، که مقاومت بیشتری ایجاد می‌کنند، در اصلاح نژاد NLL مورد استفاده قرار گرفته‌اند، اما مکانیسم‌های مولکولی اساسی آنها هنوز ناشناخته است. در این مطالعه، از نشانگرهای Lanr1 و AnMan برای غربالگری نمونه‌های NLL اروپایی استفاده شد. آزمایش واکسن در یک محیط کنترل‌شده، اثربخشی هر دو دهنده مقاوم را تأیید کرد. پروفایل بیان ژن افتراقی بر روی لاین‌های مقاوم و حساس نماینده انجام شد. مقاومت به آنتراکنوز با بیان بیش از حد اصطلاحات هستی‌شناسی ژن "GO:0006952 Defense Response"، "GO:0055114 Redox Process" و "GO:0015979 Photosynthesis" مرتبط بود. علاوه بر این، لاین Lanr1(83A:476) پس از تلقیح، برنامه‌ریزی مجدد رونوشت قابل توجهی را به سرعت نشان داد، در حالی که سایر لاین‌ها حدود 42 ساعت تأخیر در این پاسخ نشان دادند. پاسخ‌های دفاعی با ژن‌های TIR-NBS، CC-NBS-LRR و NBS-LRR، 10 پروتئین دخیل در بیماری‌زایی، پروتئین‌های انتقال لیپید، اندوگلوکان-1،3-β-گلوکوزیداز، پروتئین‌های دیواره سلولی غنی از گلیسین و ژن‌های مسیر واکنشی اکسیژن مرتبط هستند. پاسخ‌های اولیه به 83A:476، از جمله سرکوب دقیق ژن‌های مرتبط با فتوسنتز، همزمان با محافظت موفقیت‌آمیز در طول مرحله رشد رویشی زیست‌شناسی قارچ بود، که نشان می‌دهد یک عامل مؤثر باعث ایجاد ایمنی می‌شود. واکنش ماندلوپ و همچنین کشش افقی کلی کند می‌شود.
لوپین باریک برگ (NLL، Lupinus angustifolius L.) یک غله با پروتئین بالا است که منشأ آن منطقه غربی مدیترانه است1،2. در حال حاضر به عنوان یک محصول غذایی برای حیوانات و انسان کشت می‌شود. همچنین به دلیل تثبیت نیتروژن توسط باکتری‌های تثبیت‌کننده نیتروژن همزیست و بهبود کلی ساختار خاک، در سیستم‌های تناوب زراعی به عنوان کود سبز در نظر گرفته می‌شود. NLL در قرن گذشته روند اهلی‌سازی سریعی را پشت سر گذاشته و هنوز تحت فشار بالای اصلاح نژاد است3،4،5،6،7،8،9،10،11،12. با کشت گسترده NLL، توالی قارچ‌های بیماری‌زا، جایگاه‌های جدید کشاورزی را ایجاد کرده و باعث بیماری‌های جدید نابودکننده محصولات کشاورزی شده است. قابل توجه‌ترین مورد برای کشاورزان و پرورش‌دهندگان لوپین، ظهور آنتراکنوز بود که توسط قارچ بیماری‌زای Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 ایجاد می‌شد. قابل توجه‌ترین مورد برای کشاورزان و پرورش‌دهندگان لوپین، ظهور آنتراکنوز بود که توسط قارچ بیماری‌زای Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 ایجاد می‌شد. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление antraknoza, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & هاگدورن۱۳. قابل توجه‌ترین نکته برای کشاورزان و پرورش‌دهندگان لوپین، ظهور آنتراکنوز ناشی از قارچ بیماری‌زای Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 بود.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是猱lleumi珗t (بوندار) نیرنبرگ، فیلر و هاگدورن 13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是猱lleumi珗t (Bondar)嵵Haired.1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, فایلر و هاگدورن ۱۳. چیزی که بیش از همه کشاورزان و پرورش‌دهندگان لوپین را شگفت‌زده می‌کند، ظهور آنتراکنوز ناشی از قارچ بیماری‌زای Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 است.اولین گزارش‌های این بیماری از برزیل و ایالات متحده بود که علائم معمول آن به ترتیب در سال‌های ۱۹۱۲ و ۱۹۲۹ ظاهر شد. با این حال، پس از حدود ۳۰ سال، عامل بیماری‌زا به عنوان Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz شناسایی شد. و ساک، تلومورف Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. و ساک، تلومورف Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. و ساک، تلومورف Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. و ساک، گلومرلا سینگولاتا (استونمن) اسپالد در مورفولوژی هدفمند. و اچ. شرنک،. و اچ. شرنک،.و اچ. شرنک. & H.施伦克،. & H.施伦克،.و اچ. اشلنک،.فنوتیپ‌بندی اولیه بیماری که در اواسط قرن بیستم انجام شد، مقداری مقاومت در گونه‌های NLL و لوپین زرد (L. luteus L.) نشان داد، اما تمام گونه‌های لوپین سفید (L. albus L.) مورد آزمایش بسیار حساس بودند15،16. مطالعات نشان داده‌اند که توسعه آنتراکنوز با افزایش بارندگی (رطوبت هوا) و دما (در محدوده 12 تا 28 درجه سانتیگراد) مرتبط است که منجر به نقض مقاومت در دماهای بالاتر می‌شود17، 18. در واقع، زمان لازم برای جوانه زدن کنیدی‌ها و شروع بیماری، در دمای 24 درجه سانتیگراد (4 ساعت) چهار برابر کوتاه‌تر از دمای 12 درجه سانتیگراد (16 ساعت) در شرایط رطوبت بالا بود19. بنابراین، گرمایش جهانی مداوم منجر به شیوع آنتراکنوز شده است. با این حال، این بیماری در فرانسه (1982) و اوکراین (1983) به عنوان منادی یک تهدید قریب‌الوقوع مشاهده شد، اما ظاهراً در آن زمان توسط صنعت لوپین نادیده گرفته شد20،21. چند سال بعد، این بیماری ویرانگر در سراسر جهان گسترش یافت و کشورهای اصلی تولیدکننده لوپین مانند استرالیا، لهستان و آلمان را نیز تحت تأثیر قرار داد22،23،24. پس از شیوع آنتراکنوز در اواسط دهه 1990، غربالگری گسترده منجر به شناسایی چندین دهنده مقاوم در نمونه‌های NLL19 شد. مقاومت NLL در برابر آنتراکنوز توسط دو آلل غالب جداگانه که در منابع ژرم‌پلاسم مختلف یافت می‌شوند، کنترل می‌شود: Lanr1 در رقم Tanjil و Wonga و AnMan در رقم Mandalay 25، 26. این آلل‌ها مکمل نشانگرهای مولکولی هستند که از انتخاب ژرم‌پلاسم مقاوم در برنامه‌های اصلاح نژاد پشتیبانی می‌کنند25،26،27،28،29،30. لاین اصلاح نژاد مقاوم 83A:476 حامل آلل Lanr1 با لاین وحشی حساس P27255 تلاقی داده شد تا جمعیت RIL جدا شده برای مقاومت به آنتراکنوز به دست آید، که امکان انتساب جایگاه Lanr1 به کروموزوم NLL-1131، 32، 33 را فراهم کرد. هم‌ترازی نشانگرهای نقشه پیوستگی از جایگاه‌های مقاومت جانبی به آنتراکنوز با یک چارچوب ژنومی، NLL محل هر سه آلل را روی یک کروموزوم (NLL-11) اما در موقعیت‌های مختلف آشکار کرد29،34،35. با این حال، به دلیل تعداد کم RILها و فاصله ژنتیکی زیاد بین نشانگرها و آلل‌های مربوطه، نمی‌توان هیچ نتیجه‌گیری قابل اعتمادی در مورد ژن‌های زیربنایی آنها به دست آورد. از سوی دیگر، استفاده از ژنتیک معکوس در لوپین‌ها به دلیل پتانسیل بازسازی بسیار پایین آنها دشوار است، که دستکاری ژنتیکی را دشوار می‌کند37.
توسعه ژرم پلاسم اهلی شده حامل آلل مورد نظر در حالت هموزیگوت، مانند 83A:476 (Lanr1) و Mandelup (AnMan)، دریچه‌ای را برای مطالعه مقاومت به آنتراکنوز در مواجهه با وجود ترکیبات متضاد آلل‌ها در جمعیت‌های وحشی گشوده است. امکان مکانیسم‌های مولکولی. پاسخ‌های دفاعی ایجاد شده توسط ژنوتیپ‌های خاص را مقایسه کنید. این مطالعه پاسخ اولیه رونوشت NLL به واکسیناسیون C. lupini را ارزیابی کرد. ابتدا، یک پنل ژرم پلاسم NLL اروپایی حاوی 215 لاین با استفاده از نشانگرهای مولکولی که آلل‌های Lanr1 و AnMan را نشان می‌دهند، غربالگری شد. سپس فنوتیپ آنتراکنوز بر روی 50 لاین NLL که قبلاً برای نشانگرهای مولکولی انتخاب شده بودند، تحت شرایط کنترل شده انجام شد. بر اساس این آزمایش‌ها، چهار لاین که در مقاومت به آنتراکنوز و ترکیب آللی Lanr1/AnMan متفاوت بودند، برای پروفایل بیان ژن دفاعی افتراقی با استفاده از دو رویکرد مکمل انتخاب شدند: توالی‌یابی RNA با توان عملیاتی بالا و کمی‌سازی PCR در زمان واقعی.
غربالگری مجموعه‌ای از ژرم‌پلاسم NLL (N = 215) با نشانگرهای Lanr1 (Anseq3 و Anseq4) و AnMan (Anseq4) و AnMan (AnManM1) نشان داد که تنها یک لاین (95726، نزدیک سالامانکا-ب) آلل "مقاومت" را برای همه نشانگرها تقویت می‌کند، در حالی که "وجود آلل‌های "مستعد" نسبت همه نشانگرها را در 158 لاین (~73.5٪) نشان داد. سیزده لاین دو آلل "مقاوم" از نشانگر Lanr1 و 8 لاین آلل‌های "مقاوم" از نشانگر Lanr1 تولید کردند. آلل "مقاومت" نشانگر AnMan (جدول تکمیلی S1). دو لاین برای نشانگر Anseq3 هتروزیگوت و یک لاین برای نشانگر AnManM1 هتروزیگوت بودند. ۴۲ لاین (۱۹.۵٪) فازهای مخالف آلل‌های Anseq3 و Anseq4 را حمل می‌کردند که نشان‌دهنده فراوانی بالای نوترکیبی بین این دو جایگاه ژنی است. فنوتیپ‌های آنتراکنوز تحت شرایط کنترل‌شده (جدول تکمیلی S2) نشان‌دهنده تنوع در مقاومت ژنوتیپ‌های مورد آزمایش بود که در شدت آنتراکنوز منعکس شد. تفاوت در میانگین نمرات از ۱.۸ (نسبتاً مقاوم) تا ۶.۹ (حساس) و تفاوت وزن گیاه از ۰.۶۲ (حساس) تا ۴.۴۵ گرم (مقاوم) متغیر بود. همبستگی معنی‌داری بین مقادیر مشاهده‌شده در دو تکرار آزمایش (0.51 برای نمرات شدت بیماری، P = 0.00017 و 0.61 برای وزن بوته، P < 0.0001) و همچنین بین این دو پارامتر (-0.59 و -0.77، P < 0.0001) وجود داشت. همبستگی معنی‌داری بین مقادیر مشاهده‌شده در دو تکرار آزمایش (0.51 برای نمرات شدت بیماری، P = 0.00017 و 0.61 برای وزن بوته، P < 0.0001) و همچنین بین این دو پارامتر (-0.59 و -0.77، P < 0.0001) وجود داشت. Vыyavlena 0,00017 و 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а تاкже между этими двумя параметри (-0,59 و -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). همبستگی معنی‌داری بین مقادیر مشاهده‌شده در دو تکرار آزمایش (0.51 برای نمرات شدت بیماری، P = 0.00017 و 0.61 برای وزن بوته، P < 0.0001) و همچنین بین این دو پارامتر (- 0.59 و -0.77، P < 0.0001) 0.0001 مشاهده شد.在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分严0. 0.00017，植物重量为0.61，P <0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P 0.0001在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程庈 严重 度分为 0.51، p = 0.00017، 植物 为 为 0.61 ， p <0.0001） 以及0.59 - 0.59 - 0.59 - 0.77، P <0.0001). Nablюдалась значительная корреляция между значениями، نویسندگان در دوش دوباره (نشان دادن به 0,51، P = 0,00017 و massa رشد 0,61، P <0,0001)، و между этими двумя параметри (-0,59 و -0,0001) 0,77، P <0,0001. همبستگی معنی‌داری بین مقادیر مشاهده‌شده در تکرار (نمره شدت بیماری 0.51، P = 0.00017 و وزن بوته 0.61، P < 0.0001) و بین این دو پارامتر (-0.59 و -0.0001) 0.77، P < 0.0001 وجود داشت. ).علائم معمول مشاهده شده در گیاهان حساس شامل پیچ خوردگی و تاب خوردن ساقه شبیه به ساختار "کمان چوپان" و به دنبال آن ضایعات بیضی شکل با اسپوروزوئیت های نارنجی/صورتی است (شکل تکمیلی 1). گونه های استرالیایی حامل ژن های Lanr1 (83A:476 و Tanjil) و AnMan (Mandelup) نسبتاً مقاوم هستند، 0.0331 و 0.0036). برخی از لاین هایی که آلل های "مقاوم" Lanr1 و/یا AnMan را نیز حمل می کنند، علائم بیماری را نشان می دهند.
جالب توجه است که چند لاین NLL که فاقد هرگونه آلل نشانگر «مقاوم» بودند، سطح بالایی از مقاومت به آنتراکنوز (قابل مقایسه یا بالاتر از ژنوتیپ‌های Lanr1 یا AnMan) را نشان دادند، مانند Boregine (مقدار P < 0.0001 برای هر دو پارامتر)، Bojar (مقدار P < 0.0001 برای امتیاز و 0.001 برای وزن گیاه) و جمعیت B-549/79b (مقدار P < 0.0001 برای امتیاز و غیرمعنی‌دار برای وزن). جالب توجه است که چند لاین NLL که فاقد هرگونه آلل نشانگر «مقاوم» بودند، سطح بالایی از مقاومت به آنتراکنوز (قابل مقایسه یا بالاتر از ژنوتیپ‌های Lanr1 یا AnMan) را نشان دادند، مانند Boregine (مقدار P < 0.0001 برای هر دو پارامتر)، Bojar (مقدار P < 0.0001 برای امتیاز و 0.001 برای وزن گیاه) و جمعیت B-549/79b (مقدار P < 0.0001 برای امتیاز و غیرمعنی‌دار برای وزن). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного алеля, показали высокий уровень устойчивости к antraknozu (сопоставимый или более высокий، чем для генотипов Lanr1 یا AnMan)، تاکیх کاک Boregine (معنای P <0,0001 برای تغییر پارامترها)، Bojar (معنای P < 0,0001) для оценки и 0,001 для массы растения) و محبوبیت B-549/79b (معنای P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). جالب توجه است که چندین لاین NLL که فاقد هرگونه آلل نشانگر «مقاوم» بودند، سطح بالایی از مقاومت در برابر آنتراکنوز (قابل مقایسه یا بالاتر از ژنوتیپ‌های Lanr1 یا AnMan) را نشان دادند، مانند Boregine (مقدار P < 0.0001 برای هر دو پارامتر)، Bojar (مقدار P < 0.0001 برای ارزیابی و 0.001 برای وزن گیاه) و جمعیت B-549/79b (مقدار P < 0.0001 برای ارزیابی و برای وزن معنی‌دار نبود).有趣的是，一些缺乏任何"抗性"标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭抗性或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值<0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重阾为 جالب است که برخی از سیستم‌های NLL که هیچ نشانگر «آنتی‌ژنی» ندارند، مقاومت افقی بالایی (معادل ژن‌های Lanr1 یا AnMan یا بالاتر) نشان می‌دهند، مانند Boregine (هر دو پارامتر P < 0.0001)، Bojar (مقدار P < 0.0001، وزن گیاه 0.001) و سویه B-549/79b (مقدار P < 0.0001، وزن معنی‌دار نیست). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уровни устойчивости к antraknozu (sravnimыe یا بیشتر، чем у генотипов Lanr1 یا AnMan)، такие как Boregine (معنای P для обоих پارامترهای <0,0001)، Bojar (معنای P <0,0001، масса رشد 0,001) и محبوبیت B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). جالب توجه است که برخی از لاین‌های NLL که فاقد هرگونه آلل نشانگر «مقاومت» بودند، سطوح بالایی از مقاومت به آنتراکنوز (قابل مقایسه یا بالاتر از ژنوتیپ‌های Lanr1 یا AnMan) را نشان دادند، مانند Boregine (مقدار P برای هر دو پارامتر <0.0001)، Bojar (مقدار P <0.0001، وزن گیاه 0.001) و جمعیت B-549/79b (مقدار P <0.0001، وزن معنی‌دار نبود).این پدیده احتمال وجود یک منبع ژنتیکی جدید برای مقاومت را نشان می‌دهد و عدم همبستگی مشاهده شده بین ژنوتیپ‌های نشانگر و فنوتیپ‌های بیماری (مقادیر P از ~0.42 تا ~0.98) را توضیح می‌دهد. بنابراین، آزمون کولموگروف-اسمیرنوف نشان داد که داده‌های مربوط به مقاومت به آنتراکنوز تقریباً برای نمرات (مقادیر P 0.25 و 0.11) و توده گیاه (مقادیر P 0.47 و 0.55) توزیع نرمالی دارند، که نشان می‌دهد من فرض می‌کنم که آلل‌های بیشتری نسبت به Lanr1 و AnMan درگیر هستند.
بر اساس نتایج غربالگری مقاومت به سیاه‌زخم، ۴ لاین برای آنالیز رونوشت‌برداری انتخاب شدند: ۸۳A:۴۷۶، Boregine، Mandelup و Population ۲۲۶۶۰. این لاین‌ها برای مقاومت به سیاه‌زخم در آزمایش‌های تلقیح با توالی‌یابی RNA دوباره آزمایش شدند، مشروط بر اینکه مشابه آزمایش قبلی باشند. مقادیر امتیاز به شرح زیر بود: Boregin (۱.۷۱ ± ۱.۳۹)، ۸۳A: ۴۷۶ (۲.۰۹ ± ۱.۳۸)، Mandelup (۳.۸۲ ± ۱.۴۲) و جمعیت ۲۲۶۶۰ (۶.۱۱ ± ۱.۲۹).
پروتکل Illumina NovaSeq 6000 به طور متوسط ​​به 40.5 جفت Mread در هر نمونه (29.7 تا 54.4 Mread) دست یافت (جدول تکمیلی S3). نمرات هم‌ترازی در توالی مرجع از 75.5٪ تا 88.6٪ متغیر بود. میانگین همبستگی داده‌های شمارش خوانش بین متغیرهای تجربی بین تکرارهای بیولوژیکی از 0.812 تا 0.997 (میانگین 0.959) متغیر بود. از بین ۳۵۱۷۰ ژن مورد تجزیه و تحلیل، ۲۹۱۷ ژن هیچ بیانی نشان ندادند و ۴۷۸۵ ژن دیگر در سطح ناچیزی بیان شدند (میانگین پایه < ۵). از بین ۳۵۱۷۰ ژن مورد تجزیه و تحلیل، ۲۹۱۷ ژن هیچ بیانی نشان ندادند و ۴۷۸۵ ژن دیگر در سطح ناچیزی بیان شدند (میانگین پایه < ۵). از 35 170 proanalyzirovannыh genov 2917 not proyavlyali эkspressii, a ostalьnыe 4785 genov экспрессировались на незначительном уровне (базовое) سوردنی <5). از ۳۵۱۷۰ ژن مورد تجزیه و تحلیل، ۲۹۱۷ ژن هیچ بیانی نشان ندادند و ۴۷۸۵ ژن باقی مانده در سطح ناچیزی بیان شدند (میانگین پایه <۵).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。۳۵,۱۷۰ از 35 170 proanalyzirovannыh genov 2917 ne эkspresssirovalisь, а ostalьnыe 4785 genov namely neignitalьnuyu эkspressiyu (bazovoe среднее значение <5). از 35170 ژن مورد تجزیه و تحلیل، 2917 ژن بیان نشده بودند و 4785 ژن باقیمانده بیان ناچیزی داشتند (میانگین پایه <5).بنابراین، تعداد ژن‌های بیان‌شده (میانگین پایه ≥ ۵) در طول آزمایش ۲۷۴۶۸ (۷۸.۱٪) بود (جدول تکمیلی S4).
از نقطه زمانی اول، تمام لاین‌های NLL با برنامه‌ریزی مجدد ترانسکریپتوم به تلقیح C. lupini (سویه Col-08) پاسخ دادند (جدول 1)، با این حال، تفاوت‌های معنی‌داری بین لاین‌ها مشاهده شد. بنابراین، لاین مقاوم 83A:476 (حامل ژن Lanr1) در نقطه زمانی اول (6 ساعت پس از تلقیح) برنامه‌ریزی مجدد ترانسکریپتوم قابل توجهی را با افزایش 31 تا 69 برابری در تعداد ژن‌های بالا و پایین جدا شده در مقایسه با سایر نقاط زمانی در این نقطه زمانی نشان داد. علاوه بر این، این پیک کوتاه مدت بود، زیرا بیان تنها چند ژن در نقطه زمانی دوم (12 ساعت پس از تلقیح) به طور قابل توجهی تغییر یافته باقی ماند. جالب توجه است که Boregine، که در آزمایش پیوند نیز سطح بالایی از مقاومت را نشان داد، در طول آزمایش چنین برنامه‌ریزی مجدد رونویسی گسترده‌ای را متحمل نشد. با این حال، تعداد ژن‌های با بیان متفاوت (DEG) برای Boregine و 83A:476 در 12 ساعت پس از تلقیح یکسان بود. هم ماندلوپ و هم جمعیت ۲۲۶۶۰ در آخرین نقطه زمانی (۴۸ لیتر بر ثانیه) پیک‌های DEG را نشان دادند که نشان‌دهنده تأخیر نسبی در پاسخ‌های دفاعی است.
از آنجا که 83A:476 در پاسخ به C. lupini در 6 HPI در مقایسه با سایر لاین‌ها، تحت برنامه‌ریزی مجدد رونویسی گسترده‌ای قرار گرفت، تقریباً 91٪ از DEGهای مشاهده شده در این نقطه زمانی، مختص به رده بودند (شکل 1). با این حال، در پاسخ‌های اولیه بین لاین‌های مورد مطالعه، همپوشانی وجود داشت، به طوری که 68.5٪، 50.9٪ و 52.6٪ DEG در Boregine، Mandelup و جمعیت 22660 به ترتیب با موارد یافت شده در 83A:476 در نقاط زمانی خاصی همپوشانی داشتند. با این حال، این DEGها تنها بخش کوچکی (0.97-1.70٪) از کل DEGهای شناسایی شده در حال حاضر با استفاده از 83A:476 را تشکیل می‌دهند. علاوه بر این، 11 DEG از همه لاین‌ها در این زمان منسجم بودند (جداول تکمیلی S4-S6)، از جمله اجزای مشترک پاسخ‌های دفاعی گیاه: پروتئین انتقال لیپید (TanjilG_32225)، آنزیم اندوگلوکان-1،3-β-گلوکوزید (TanjilG_23384)، دو پروتئین القا شونده توسط تنش مانند SAM22 (TanjilG_31528 و TanjilG_31531)، پروتئین لاتکس بازی (TanjilG_32352) و دو پروتئین دیواره سلولی ساختاری غنی از گلیسین (TanjilG_19701 و TanjilG_19702). همچنین همپوشانی نسبتاً بالایی در پاسخ‌های رونویسی بین 83A:476 و Boregine در 24 HPI (در مجموع 16-38٪ DEG) و بین Mandelup و Population 22660 در 48 HPI (در مجموع 14-20٪ DEG) وجود داشت.
نمودار ون که تعداد ژن‌های با بیان افتراقی (DEG) را در لاین‌های لوپین برگ باریک (NLL) تلقیح شده با Colletotrichum lupini (سویه Col-08 که از مزارع لوپین در ویرژنیتسه، لهستان، ۱۹۹۹ به دست آمده است) نشان می‌دهد. لاین‌های NLL مورد تجزیه و تحلیل عبارت بودند از: 83A:476 (مقاوم، حامل آلل Lanr1)، Boregine (مقاوم، زمینه ژنتیکی ناشناخته)، Mandelup (نسبتاً مقاوم، حامل آلل AnMan) و جمعیت ۲۲۶۶۰ (بسیار حساس). مخفف hpi به معنای ساعت‌ها پس از واکسیناسیون است. مقادیر صفر برای ساده‌سازی نمودار حذف شده‌اند.
مجموعه ژن‌های بیش‌بیان‌شده در 6 ساعت پس از بیان، برای وجود دامنه‌های ژنی R متعارف مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت (جدول تکمیلی S7). این مطالعه القای ترانسکریپتوم ژن‌های مقاومت به بیماری کلاسیک را تنها با دامنه‌های NBS-LRR در 83A:476 نشان داد. این مجموعه شامل یک ژن TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042)، پنج ژن CC-NBS-LRR (tanjilg_06165، tanjilg_06162، tanjilg_22773، tanjilg_22640 و tanjilg_16162) و چهار NBS-LR، Tanjilg_16162) و چهار NBS-LRRE (tanjilg_16162) و همچنین چهار NBS-Lrr (tanjilg_16162) و چهار NBS-LRR (TANJILG_16162) بود. همه این ژن‌ها دارای دامنه‌های متعارف هستند که در توالی‌های حفاظت‌شده مرتب شده‌اند. علاوه بر ژن‌های دامنه NBS-LRR، چندین کیناز RLL در 6 ساعت پس از لقاح فعال شدند، یعنی یکی در Boregine (TanjilG_19877)، دو تا در Mandelup (TanjilG_07141 و TanjilG_19877) و در جمعیت 22660 (TanjilG_09014 و TanjilG_10361) و دو تا در 83A 27:476.
ژن‌هایی که بیان آنها در پاسخ به تلقیح با C. lupini (سویه Col-08) به طور قابل توجهی تغییر یافته بود، تحت آنالیز غنی‌سازی هستی‌شناسی ژن (GO) قرار گرفتند (جدول تکمیلی S8). عبارت فرآیند بیولوژیکی که بیش از حد معمول نمایش داده شده بود، «پاسخ دفاعی GO:0006952» بود که در 6 ترکیب از 16 ترکیب (زمان × خط) با اهمیت بالا (مقدار P < 0.001) ظاهر شد (شکل 2). عبارت فرآیند بیولوژیکی که بیش از حد معمول نمایش داده شده بود، «پاسخ دفاعی GO:0006952» بود که در 6 ترکیب از 16 ترکیب (زمان × خط) با اهمیت بالا (مقدار P < 0.001) ظاهر شد (شکل 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся در 6 از 16 (време × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). عبارت فرآیند زیستی که بیش از حد مورد توجه قرار گرفته بود، «پاسخ دفاعی GO:0006952» بود که در 6 ترکیب از 16 ترکیب (زمان × دودمان) با اهمیت بالا (مقدار P < 0.001) ظاهر شد (شکل 2).最常被过度代表的生物过程术语是"GO:0006952 防御反应"，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 بارزترین عبارت فرآیند بیولوژیکی، «پاسخ دفاعی GO:0006952» است که در 6 ترکیب از 16 ترکیب (时间×线) با اهمیت بالا (مقدار P < 0.001) (图2) ظاهر می‌شود. GO: 0006952 Defence Response, который появлялся во 6 из 16 ترکیب (време ×) линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). عبارت فرآیند بیولوژیکی که بیش از حد معمول نمایش داده شده بود، «GO:0006952 Defense Response» بود که در 6 ترکیب از 16 ترکیب (زمان × خط) با اهمیت بالا (مقدار P < 0.001) ظاهر شد (شکل 2).این اصطلاح در دو نقطه زمانی در 83A: 476 و Boregine (6 و 24 hpi) و در یک نقطه زمانی در Mandelup و Population 22660 (به ترتیب 12 و 6 hpi) بیش از حد بیان شده بود. این یک نتیجه مورد انتظار است که پاسخ ضد قارچی لاین‌های مقاوم را برجسته می‌کند. علاوه بر این، 83A:476 با القای سریع ژن‌های مرتبط با انفجار اکسیداتیو که با اصطلاح "GO:0055114 redox process" نشان داده می‌شود، به C. lupini پاسخ داد، که نشان دهنده یک پاسخ دفاعی خاص است، در حالی که Boregine پاسخ‌های دفاعی خاصی را نشان داد که مربوط به اصطلاح "GO" است. جمعیت ۲۲۶۶۰ پاسخ مقاومت افقی شامل متابولیت‌های ثانویه را فعال کرد که نشان‌دهنده تعداد بیش از حد اصطلاحات «GO:0016104 فرآیند بیوسنتز تری‌ترپن» و «GO:0006722 فرآیند متابولیسم تری‌ترپن» (هر دو اصطلاح متعلق به یک مجموعه ژن هستند) است. با در نظر گرفتن نتایج تجزیه و تحلیل غنی‌سازی اصطلاح GO، پایداری واکنش ماندلوپ بین Boregine و جمعیت ۲۲۶۶۰ بود. علاوه بر این، واکنش اولیه ۸۳A:476 (6 hpi) و واکنش تأخیری ماندلوپ و جمعیت ۲۲۶۶۰ شامل اصطلاح GO:0015979 «فتوسنتز» و سایر فرآیندهای بیولوژیکی مرتبط هستند.
اصطلاحات هستی‌شناسی ژن زیست‌فرآیندی انتخاب‌شده در حاشیه‌نویسی ژن‌های با بیان متفاوت در طول پاسخ‌های رونویسی لوپین برگ باریک (NLL) تلقیح‌شده با لوپین سیاه‌زخم (سویه Col-08 به‌دست‌آمده از مزارع لوپین در ویرژنیتسه، لهستان، در سال ۱۹۹۹) بسیار اغراق‌آمیز هستند. لاین‌های NLL مورد تجزیه و تحلیل عبارت بودند از: 83A:476 (مقاوم، حامل آلل هموزیگوت Lanr1)، Boregine (مقاوم، زمینه ژنتیکی ناشناخته)، Mandelup (نسبتاً مقاوم، حامل آلل هموزیگوت AnMan) و جمعیت ۲۲۶۶۰ (حساس).
از آنجا که این مطالعه با هدف شناسایی ژن‌هایی که در مقاومت به آنتراکنوز نقش دارند، انجام شد، ژن‌های اختصاص داده شده به اصطلاحات GO «GO: 0006952 پاسخ‌های دفاعی» و «GO: 0055114 فرآیندهای ردوکس» با استفاده از برش‌هایی از میانگین پایه ≥ 30 با حداقل یک خط مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. × نقطه در زمان با ترکیب مقادیر آماری معنی‌دار log2 (تغییر برابر). تعداد ژن‌هایی که این معیارها را داشتند برای GO:0006952، 65 و برای GO:0055114، 524 بود.
83A:476 دو پیک DEG را نشان داد که با عبارت GO:0006952 حاشیه‌نویسی شده بودند، اولی در 6 ژن در هر اینچ (64 ژن، تنظیم افزایشی و کاهشی) و دومی در 24 ژن در هر اینچ (15 ژن، فقط تنظیم افزایشی). بورگین همچنین نشان داد که GO:0006952 در همان نقطه زمانی به اوج خود رسید، اما با DEG کمتر (11 و 8) و فعال‌سازی ترجیحی. ماندلوپ دو پیک GO:0006952 را در 12 و 48 HPI نشان داد که هر دو حامل 12 ژن بودند (اولی با ژن‌های فعال‌کننده و دومی فقط با ژن‌های سرکوب‌کننده)، در حالی که جمعیت 22660 در 6 HPI (13 ژن) غلبه بیشتری بر تنظیم پیک افزایشی داشتند. لازم به ذکر است که 96.4٪ از GO:0006952 DEG در این پیک‌ها نوع پاسخ یکسانی (افزایشی یا کاهشی) داشتند که نشان‌دهنده همپوشانی قابل توجه در پاسخ‌های دفاعی علیرغم تفاوت در تعداد ژن‌های درگیر است. بزرگترین گروه توالی‌های مرتبط با عبارت GO:0006952، پروتئین پیام مرتبط با استرس گرسنگی 22 (شبیه SAM22) را کدگذاری می‌کند که متعلق به کلاد پروتئین مرتبط با بیماری‌زایی کلاس 10 (PR-10) و پروتئین هسته (شبیه MLP) است (شکل 3). این دو گروه از نظر ماهیت بیان و جهت پاسخ متفاوت بودند. ژن‌های کدکننده پروتئین‌های مشابه SAM22، القای ثابت و قابل توجهی را در نقاط زمانی اولیه (6 یا 12 hpi) نشان دادند و عموماً در پایان آزمایش (48 hpi) بی‌پاسخ بودند، در حالی که پروتئین‌های مشابه MLP در 6 hpi هماهنگی نشان دادند. hpi. 83A:476 و Mandelup در 48 hp/in تقریباً تمام نقاط داده دیگر بی‌پاسخ بودند. علاوه بر این، تفاوت در پروفایل‌های بیان ژن‌های پروتئینی شبیه SAM22، از تنوع مشاهده‌شده در مقاومت به آنتراکنوز پیروی کرد، زیرا لاین‌های مقاوم‌تر، نقاط زمانی بیشتری داشتند که به‌طور قابل‌توجهی این ژن‌ها را نسبت به ژن‌های حساس‌تر القا می‌کردند. ژن PR-10 شبیه LlR18A/B دیگری، الگوی بیان بسیار مشابهی با ژن پروتئینی شبیه SAM22 نشان داد.
اجزای اصلی فرآیند بیولوژیکی با اصطلاح "GO:0006952 Defense Response" و الگوهای بیان ژن‌های کاندید آلل‌های Lanr1 و AnMan شناسایی شدند. مقیاس Log2 نشان دهنده مقادیر log2 (تغییر برابر) بین گیاهان تلقیح شده (Colletotrichum lupini، سویه Col-08، به دست آمده از مزارع لوپین، ویزنیکا، لهستان، 1999) و کنترل (تلقیح ساختگی) در همان نقطه زمانی است. لاین‌های باریک برگ لوپین زیر مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند: 83A:476 (مقاوم، حامل آلل هموزیگوت Lanr1)، Boregine (مقاوم، زمینه ژنتیکی ناشناخته)، Mandelup (نسبتاً مقاوم، حامل آلل هموزیگوت AnMan) و جمعیت 22660 (حساس).
علاوه بر این، پروفایل‌های بیان ژن‌های کاندید RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) و AnMan (TanjilG_12861) ارزیابی شدند (شکل 3). ژن TanjilG_05042 تنها در اولین نقطه زمانی (6 hpi) پاسخ معنی‌داری (فعال‌سازی) در 83A:476 نشان داد، در حالی که TanjilG_12861 در Mandeloop تنها در دو نقطه زمانی معنی‌دار بود: 6 hpi (تنظیم کاهشی) و 24 hpi (6 hpi). با.). قابل تنظیم)).
ژن‌هایی که بیشترین افزایش بیان را در اصطلاح «فرآیند اکسایش-کاهش» GO:0055114 داشتند، ژن‌های کدکننده پروتئین‌های سیتوکروم P450 و پراکسیداز بودند (شکل 4). برای نمونه‌های جدا شده از 83A:476 در 6 HPI، حداکثر یا حداقل مقادیر log2 (تغییر برابر) (برای 86.6٪ از ژن‌ها) عموماً بین گیاهان تلقیح شده و کنترل مشاهده شد که نشان‌دهنده پاسخ بالای این ژنوتیپ به تلقیح جنسی است. 83A:476 مهم‌ترین GO:0055114 DEG را در 6 hpi (503 ژن) نشان داد، در حالی که بقیه لاین‌ها در 48 hpi (Boregine، 31 ژن؛ Mandelup، 85 ژن؛ و Population 22660، 78 ژن)). در اکثر ژن‌های خانواده GO:0055114، دو نوع پاسخ به واکسیناسیون (فعال‌سازی و مهار) مشاهده شد. جالب توجه است که تا 97.6٪ از DEG های شناسایی شده برای عبارت GO: 0055114 در ماندلوپه در 48 اسب بخار. این مشاهدات نشان می‌دهد که با وجود مقیاس بسیار کوچکتر (یعنی تعداد ژن‌های ردوکس جهش یافته، 85 در مقابل 503)، الگوی پاسخ‌های ترانسکریپتومی تأخیری ماندلوپ به آنتراکنوز مشابه پاسخ اولیه 83A:476 است. در Boregine و Population 22660، این همگرایی به ترتیب با 51.6٪ و 75.6٪ کمتر است.
الگوهای بیان اجزای اصلی عبارت فرآیند بیولوژیکی "GO:0055114 فرآیند اکسایش-کاهش" آشکار شد. مقیاس Log2 نشان دهنده مقادیر log2 (تغییر برابر) بین گیاهان تلقیح شده (Colletotrichum lupini، سویه Col-08، به دست آمده از مزارع لوپین، ویزنیکا، لهستان، 1999) و کنترل (تلقیح ساختگی) در همان نقطه زمانی است. لاین‌های باریک برگ لوپین زیر مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند: 83A:476 (مقاوم، حامل آلل هموزیگوت Lanr1)، Boregine (مقاوم، زمینه ژنتیکی ناشناخته)، Mandelup (نسبتاً مقاوم، حامل آلل هموزیگوت AnMan) و جمعیت 22660 (حساس).
پاسخ‌های رونویسی 83A:476 به تلقیح با C. lupini (سویه Col-08) همچنین شامل خاموش‌سازی هماهنگ ژن‌های منتسب به اصطلاح GO:0015979 "فتوسنتز" و سایر فرآیندهای بیولوژیکی مرتبط بود (شکل 5). این مجموعه DEG مربوط به GO:0015979 شامل 105 ژن بود که به طور قابل توجهی در 6 ساعت پس از تلقیح در 83A:476 سرکوب شدند. در این زیرمجموعه، 37 ژن نیز در Mandelup در 48 ساعت پس از تلقیح و 35 ژن در همان نقطه زمانی در جمعیت 22660 کاهش بیان یافتند، از جمله 19 DEG مشترک برای هر دو ژنوتیپ. هیچ DEG مربوط به اصطلاح GO:0015979 در هیچ ترکیبی (خط × زمان) به طور قابل توجهی فعال نشد.
الگوهای بیان اجزای اصلی عبارت فرآیند بیولوژیکی "GO:0015979 فتوسنتز" آشکار شد. مقیاس Log2 نشان دهنده مقادیر log2 (تغییر برابر) بین گیاهان تلقیح شده (Colletotrichum lupini، سویه Col-08، به دست آمده از مزارع لوپین، ویزنیکا، لهستان، 1999) و کنترل (تلقیح ساختگی) در همان نقطه زمانی است. لاین‌های باریک برگ لوپین زیر مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند: 83A:476 (مقاوم، حامل آلل هموزیگوت Lanr1)، Boregine (مقاوم، زمینه ژنتیکی ناشناخته)، Mandelup (نسبتاً مقاوم، حامل آلل هموزیگوت AnMan) و جمعیت 22660 (حساس).
بر اساس نتایج تجزیه و تحلیل بیان افتراقی و احتمالاً دخیل در پاسخ‌های دفاعی علیه قارچ‌های بیماری‌زا، این مجموعه از هفت ژن برای تعیین کمیت پروفایل‌های بیان با استفاده از PCR در زمان واقعی انتخاب شدند (جدول تکمیلی S9).
ژن پروتئین فرضی TanjilG_10657 در تمام لاین‌ها و نقاط زمانی مورد مطالعه در مقایسه با گیاهان کنترل (تقلیدکننده) به طور قابل توجهی القا شد (جداول تکمیلی S10، S11). علاوه بر این، پروفایل بیان TanjilG_10657 روند افزایشی را در طول آزمایش برای همه لاین‌ها نشان داد. جمعیت 22660 بالاترین حساسیت TanjilG_10657 را به تلقیح با فعال‌سازی 114 برابری و بالاترین سطح بیان نسبی (4.4 ± 0.4) در 24 HPI نشان داد (شکل 6a). ژن پروتئین PR10 LlR18A TanjilG_27015 نیز در تمام لاین‌ها و نقاط زمانی فعال شد، که در بیشتر نقاط داده از نظر آماری معنادار بود (شکل 6b). مشابه TanjilG_10657، بالاترین سطح بیان نسبی TanjilG_27015 در جمعیت تلقیح شده 22660 در 24 HPI (19.5 ± 2.4) مشاهده شد. ژن اندوکیتیناز اسیدی TanjilG_04706 در تمام لاین‌ها و در تمام نقاط زمانی به جز Boregine 6 hpi به طور قابل توجهی افزایش یافت (شکل 6c). این ژن در اولین نقطه زمانی (6 HPI) در 83A:476 (به میزان 10.5 برابر) به شدت القا شد و در سایر لاین‌ها به طور متوسط ​​افزایش یافت (به میزان 6.6-7.5 برابر). در طول آزمایش، بیان TanjilG_04706 در 83A:476 و Boregine در سطوح مشابه باقی ماند، در حالی که در Mandelup و Population 22660 به طور قابل توجهی افزایش یافت و به مقادیر نسبتاً بالایی رسید (به ترتیب 5.9 ± 1.5 و 6.2 ± 1.5). ژن شبه اندوگلوکان-1،3-β-گلوکوزیداز TanjilG_23384 در دو نقطه زمانی اول (6 و 12 ساعت پس از تلقیح) در همه لاین‌ها به جز جمعیت 22660 (شکل 6d) فعال‌سازی بالایی را نشان داد. بالاترین سطح بیان نسبی TanjilG_23384 در نقطه زمانی دوم (12 ساعت پس از تلقیح) در Mandelup (2.7 ± 0.3) و 83A:476 (1.5 ± 0.1) مشاهده شد. در 24 ساعت پس از تلقیح، بیان TanjilG_23384 در همه لاین‌های مورد مطالعه نسبتاً پایین بود (از 0.04 ± 0.009 تا 0.44 ± 0.12).
پروفایل‌های بیان ژن‌های انتخاب‌شده (ag) که توسط PCR کمی آشکار شده‌اند. اعداد ۶، ۱۲ و ۲۴ نشان‌دهنده ساعات پس از واکسیناسیون هستند. ژن‌های LanDExH7 و LanTUB6 برای نرمال‌سازی و LanTUB6 برای کالیبراسیون بین سری‌ها استفاده شدند. میله‌های خطا نشان‌دهنده انحراف معیار بر اساس سه تکرار بیولوژیکی هستند که هر کدام میانگین سه تکرار فنی هستند. معنی‌دار بودن آماری تفاوت‌ها در سطوح بیان بین گیاهان تلقیح‌شده (Colletotrichum lupini، سویه Col-08، به‌دست‌آمده در سال ۱۹۹۹ از مزرعه لوپین در ویرزنیکا، لهستان) و کنترل (تلقیح‌شده مصنوعی) در بالای نقاط داده مشخص شده‌اند (*مقدار P < 0.05، **مقدار P ≤ 0.01، ***مقدار P ≤ 0.001). معنی‌دار بودن آماری تفاوت‌ها در سطوح بیان بین گیاهان تلقیح‌شده (Colletotrichum lupini، سویه Col-08، به‌دست‌آمده در سال ۱۹۹۹ از مزرعه لوپین در ویرزنیکا، لهستان) و کنترل (تلقیح‌شده مصنوعی) در بالای نقاط داده مشخص شده‌اند (*مقدار P < 0.05، **مقدار P ≤ 0.01، ***مقدار P ≤ 0.001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, poluchen در 1999 г. с поля люпина в ورژنیце، پولیش) و کنترلьными (ложно инокулированными) растениями отмечена над نقطهми данных (*значение P < 0,05, ** معنی P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). تفاوت‌های آماری معنی‌داری در سطوح بیان بین گیاهان تلقیح‌شده (Colletotrichum lupini، سویه Col-08، به‌دست‌آمده در سال ۱۹۹۹ از یک مزرعه لوپین در ویرژنیتسه، لهستان) و کنترل (تلقیح‌شده ساختگی) در بالای نقاط داده ذکر شده است (*مقدار P < 0.05، **مقدار P ≤ 0.01، ***مقدار P ≤ 0.001).接种 (Colletotrichum). lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数水平差异的统计学显着性标记在敼数0.05، **P ≤ 0.01، ***P 值≤ 0.001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对煎）之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05، **P ≤ 0.01، 0.01، ***P. Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, shtamm Col-08, poluchennый со полей люпина в Верженице, پولیش، در 1999 ه.) و کنترلьными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точкими данных (* معنی P < 0.05، ** P-значение ≤ 0.01، ***P-значение ≤ 0,001). تفاوت‌های آماری معنی‌داری در سطوح بیان بین گیاهان تلقیح‌شده (Colletotrichum lupini، سویه Col-08، به‌دست‌آمده از مزارع لوپین در Verzhenice، لهستان، در سال ۱۹۹۹) و کنترل (تلقیح‌شده ساختگی) در بالای نقاط داده ذکر شده است (*مقدار P < 0.05، **مقدار P ≤ 0.01، ***مقدار P ≤ 0.001).لاین‌های NLL مورد بررسی عبارت بودند از: 83A:476 (مقاوم، حامل آلل هموزیگوت Lanr1)، Mandelup (نسبتاً مقاوم، حامل آلل هموزیگوت AnMan)، Boregine (مقاوم، پیشینه ژنتیکی ناشناخته) و جمعیت 22660 (حساس).
ژن کاندید TanjilG_05042 در جایگاه Lanr1 الگوی بیان کاملاً متفاوتی را نسبت به پروفایل‌های به‌دست‌آمده از مطالعات RNA-seq نشان داد (شکل 6e). فعال‌سازی قابل توجه این ژن در Mandelup و جمعیت 22660 مشاهده شد (به ترتیب تا 39.7 و 11.7 برابر)، که منجر به سطوح بیان نسبتاً بالایی شد (به ترتیب تا 1.4 ± 0.14 و 7.2 ± 1.3). 83A:476 همچنین افزایش بیان ژن TanjilG_05042 (تا 3.8 برابر) را نشان داد، با این حال، سطوح بیان نسبی به‌دست‌آمده (0.044 ± 0.002) بیش از 30 برابر کمتر از مقادیر مشاهده‌شده در Mandelup و جمعیت 22660 بود. تجزیه و تحلیل qPCR تفاوت‌های معنی‌داری را در سطوح بیان بین ژنوتیپ‌ها در گونه‌های واکسینه شده ساختگی (کنترل) نشان داد، که به اختلاف ۵۸ برابری بین جمعیت‌های ۲۲۶۶۰ و ۸۳A:۴۷۶ و همچنین بین جمعیت‌های ۲۲۶۶۰ و ۲۲۶۶۰ رسید. اختلاف دو برابری بین Boregine و Mandalup حاصل شد.
ژن کاندید در جایگاه ژنی AnMan، TanjilG_12861، در پاسخ به واکسیناسیون در جمعیت‌های 83A:476 و Mandelup فعال شد، در جمعیت 22660 خنثی بود و در Boregine کاهش بیان داشت (شکل 6f). بیان نسبی ژن TanjilG_12861 در جمعیت 83A:476 تلقیح شده بالاترین بود (0.14±0.01). ژن پروتئین شوک حرارتی کلاس I با وزن 17.4 کیلو دالتون، TanjilG_05080 HSP17.4، سطوح بیان نسبی پایین‌تری را در تمام سویه‌ها و نقاط زمانی مورد مطالعه نشان داد (شکل 6g). بالاترین مقدار در 24 HPI در جمعیت 22660 مشاهده شد (0.14 ± 0.02، افزایش هشت برابری در پاسخ به واکسیناسیون).
مقایسه پروفایل‌های بیان ژن (شکل 7) همبستگی بالایی را بین TanjilG_10657 و چهار ژن دیگر نشان داد: TanjilG_27015 (r = 0.89)، TanjilG_05080 (r = 0.85)، TanjilG_05042 (r = 0.80) و TanjilG_04706 (r = 0.79). چنین نتایجی ممکن است نشان‌دهنده تنظیم همزمان این ژن‌ها در طول پاسخ‌های دفاعی باشد. ژن‌های TanjilG_12861 و TanjilG_23384 پروفایل‌های بیان متفاوتی با مقادیر ضریب همبستگی پیرسون پایین‌تر (به ترتیب از 0.08 تا 0.43 و -0.19 تا 0.28) در مقایسه با سایر ژن‌ها نشان دادند.
همبستگی بین پروفایل‌های بیان ژن با استفاده از PCR کمی شناسایی شد. لاین‌های باریک برگ لوپین زیر مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند: 83A:476 (مقاوم، حامل آلل هموزیگوت Lanr1)، Mandelup (نسبتاً مقاوم، حامل آلل هموزیگوت AnMan)، Boregine (مقاوم، زمینه ژنتیکی ناشناخته) و Population 22660 (حساس). سه نقطه زمانی (6، 12 و 24 ساعت پس از تلقیح) محاسبه شد، شامل گیاهان تلقیح شده (Colletotrichum lupini، سویه Col-08، که از مزارع لوپین در Wierzhenice، لهستان، در سال 1999 به دست آمد) و کنترل (تلقیح ساختگی). مقیاس، مقدار ضریب همبستگی پیرسون را نشان می‌دهد.
بر اساس داده‌های به‌دست‌آمده در 6 اسب بخار در هر اینچ، WGCNA روی 9981 DEG شناسایی‌شده با مقایسه گیاهان تلقیح‌شده و کنترل انجام شد تا بر پاسخ‌های دفاعی اولیه تمرکز شود (جدول تکمیلی S12). بیست و دو ماژول ژنی (خوشه) با پروفایل‌های بیان (مثبت یا منفی) مرتبط بین ژنوتیپ‌ها و گونه‌های آزمایشی یافت شد. به طور متوسط، سطح بیان ژن به ترتیب ۸۳A:۴۷۶ > Mandelup > Boregine > Population ۲۲۶۶۰ نزولی بود (با این حال، در هر دو نوع، این روند در گیاهان کنترل قوی‌تر بود). به طور متوسط، سطح بیان ژن به ترتیب ۸۳A:۴۷۶ > Mandelup > Boregine > Population ۲۲۶۶۰ نزولی بود (با این حال، در هر دو نوع، این روند در گیاهان کنترل قوی‌تر بود). در среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > جمعیت 22660 کنترلьных растений). به طور متوسط، سطح بیان ژن به ترتیب ۸۳A:۴۷۶ > Mandelup > Boregine > Population ۲۲۶۶۰ کاهش یافت (با این حال، در هر دو گونه، این روند در گیاهان کنترل قوی‌تر بود).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > جمعیت 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> جمعیت 22660 的 顺序 下降 （， 下降 （， 在在 在 植物 中 更）............... در 22660 جمعیت راستینی). به طور متوسط، سطح بیان ژن در سری 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 کاهش یافت (با این حال، در هر دو نوع، این روند در گیاهان کنترل قوی‌تر بود).واکسیناسیون منجر به افزایش بیان ژن، به ویژه در ماژول‌های 18، 19، 14، 6 و 1 (به ترتیب نزولی اثر)، تنظیم منفی (مثلاً ماژول‌های 9 و 20) یا با اثرات خنثی (مثلاً ماژول‌های 11، 22، 8 و 13) شد. تجزیه و تحلیل غنی‌سازی عبارت GO (جدول تکمیلی S13) پاسخ‌های محافظتی "GO: 0006952" را برای ماژول تلقیح شده (18) با حداکثر فعال‌سازی، از جمله ژن‌های تجزیه و تحلیل شده توسط qPCR (TanjilG_04706، TanjilG_23384، TanjilG_10657 و TanjilG_27015) و همچنین بسیاری از ماژول‌های فتوسنتز Inoculate که بیشترین سرکوب را داشتند (9) نشان داد. متمرکزکننده ماژول ۱۸ (شکل ۸) به عنوان ژن TanjilG_26536 که پروتئین LlR18B شبیه PR-10 را کد می‌کند، و متمرکزکننده ماژول ۹ به عنوان ژن TanjilG_28955 که پروتئین فتوسیستم II PsbQ را کد می‌کند، شناسایی شدند. یک ژن مقاومت به آنتراکنوز Lanr1، TanjilG_05042، در ماژول ۲۲ (شکل ۹) یافت شد و با اصطلاحات "GO:0044260 فرآیندهای متابولیک ماکرومولکولی سلولی" و "GO:0006355 تنظیم رونویسی، الگوسازی DNA" که حامل هاب TanjilG_01212 است، مرتبط است. این ژن فاکتور رونویسی استرس گرمایی A-4a (HSFA4a) را کد می‌کند.
تحلیل شبکه وزن‌دار بیان همزمان ژن ماژول‌ها با اصطلاحات فرآیند بیولوژیکی بیش از حد بازنمایی شده "GO: 0006952 پاسخ‌های دفاعی". اتصال ساده‌سازی شد تا چهار ژن مورد تجزیه و تحلیل توسط qPCR (TanjilG_04706، TanjilG_23384، TanjilG_10657 و TanjilG_27015) برجسته شوند.
تحلیل شبکه وزن‌دار بیان همزمان ژن یک ماژول با عبارت فرآیند بیولوژیکی بیش‌بیان‌شده "GO: 0006355: تنظیم رونویسی، الگوسازی DNA" و حامل یک ژن مقاومت به آنتراکنوز کاندیدا Lanr1 TanjilG_05042. اتصال برای جداسازی ژن TanjilG_05042 و ژن مرکزی TanjilG_01212 ساده‌سازی شد.
غربالگری مقاومت به آنتراکنوز جمع‌آوری‌شده در استرالیا نشان داد که بیشتر ارقام اولیه منتشر شده حساس بودند؛ Kalya، Coromup و Mandelup به عنوان ارقام با مقاومت متوسط ​​​​توصیف شده‌اند، در حالی که Wonga، Tanjil و 83A:476 به عنوان ارقام با مقاومت بالا توصیف شده‌اند. 26،27،31. آلل مقاومت یکسانی با نام Lanr1 داشتند و Coromup و Mandelup آلل متفاوتی با نام AnMan10، 26، 39 داشتند، در حالی که Kalya آلل متفاوتی را منتقل کرد. Lanr2. غربالگری مقاومت به آنتراکنوز در آلمان منجر به شناسایی یک لاین مقاوم Bo7212 با آلل کاندید غیر از Lanr1 شد که LanrBo36 نامگذاری شد.
مطالعه ما فراوانی بسیار پایینی (حدود 6%) از آلل Lanr1 را در ژرم‌پلاسم مورد آزمایش نشان داد. این مشاهده با نتایج غربالگری ژرم‌پلاسم اروپای شرقی با استفاده از نشانگرهای Anseq3 و Anseq4 مطابقت دارد، که نشان داد آلل Lanr1 فقط در دو لاین بلاروسی وجود دارد. این نشان می‌دهد که آلل Lanr1 هنوز به طور گسترده توسط برنامه‌های اصلاح نژادی محلی استفاده نمی‌شود، برخلاف استرالیا، جایی که یکی از آلل‌های کلیدی برای اصلاح نژاد به کمک نشانگر است. این ممکن است به دلیل سطح پایین‌تر مقاومت ارائه شده توسط آلل Lanr1 در شرایط مزرعه اروپا در مقایسه با گزارش استرالیا باشد. علاوه بر این، مطالعات آنتراکنوز در مناطق پرباران در استرالیا نشان داده است که پاسخ‌های مقاومتی ناشی از آلل Lanr1 ممکن است در شرایط آب و هوایی که به نفع رشد و توسعه سریع پاتوژن است، مؤثر نباشد19،42. در واقع، در مطالعه حاضر، برخی از علائم آنتراکنوز نیز در ژنوتیپ‌های حامل آلل Lanr1 مشاهده شد، که نشان می‌دهد مقاومت ممکن است در شرایط بهینه برای توسعه C. lupini از بین برود. علاوه بر این، تفسیرهای مثبت کاذب از وجود نشانگرهای Anseq3 و Anseq4 که تقریباً 1 سانتی‌مورگان از جایگاه Lanr1 فاصله دارند، امکان‌پذیر است [28،30،43].
مطالعه ما نشان داد که 83A:476، حامل آلل Lanr1، در اولین نقطه زمانی مورد تجزیه و تحلیل (6 ساعت پس از تلقیح)، با برنامه‌ریزی مجدد رونویسی در مقیاس بزرگ به تلقیح C. lupini پاسخ داد، در حالی که در Mandelup، حامل آلل AnMan، پاسخ‌های رونویسی بسیار دیرتر مشاهده شد (از 24 تا 48 ساعت پس از تلقیح). این تغییرات زمانی در پاسخ‌های دفاعی با تفاوت در علائم بیماری مرتبط هستند و اهمیت تشخیص زودهنگام پاتوژن را برای پاسخ موفقیت‌آمیز به مقاومت برجسته می‌کنند. برای آلوده کردن بافت گیاه، هاگ‌های سیاه‌زخم باید چندین مرحله رشدی را روی سطح میزبان، از جمله جوانه‌زنی، تقسیم سلولی و تشکیل آپرسوریوم، طی کنند. زائده یک ساختار عفونی است که به سطح میزبان متصل می‌شود و نفوذ به بافت‌های میزبان را تسهیل می‌کند. بنابراین، هاگ‌های C. gloeosporioides در عصاره نخود فرنگی اولین تقسیم هسته را پس از 75-90 دقیقه انکوباسیون، تشکیل لوله زایا پس از 90-120 دقیقه و سرکوب پس از 4 ساعت نشان دادند. C. gloeosporioides انبه بیش از 40٪ جوانه‌زنی کنیدی پس از 3 ساعت انکوباسیون و حدود 20٪ تشکیل مهارکننده‌ها پس از 4 ساعت نشان داد. ژن CAP20 مرتبط با حدت C. gloeosporioides پس از 3.5 ساعت انکوباسیون در موم سطح آووکادو با غلظت بالای پروتئین CAP20 پس از 4 ساعت و 46 دقیقه، فعالیت رونویسی در کنیدی‌های تشکیل‌دهنده اپی‌فیت را نشان داد. به طور مشابه، فعالیت ژن‌های بیوسنتز ملانین در C. trifolii در طول انکوباسیون 2 ساعته القا شد و به دنبال آن پس از 1 ساعت، آپرسوریوم تشکیل شد. مطالعات بافت‌های برگ نشان داده است که توت‌فرنگی‌های تلقیح‌شده با C. acutatum اولین سرکوب را در 8 ساعت پس از تلقیح دارند، در حالی که گوجه‌فرنگی‌های تلقیح‌شده با C. coccodes اولین سرکوب را در 4 ساعت پس از تلقیح دارند. 48،49. این امر تا حد زیادی با مقیاس زمانی فرآیند عفونی گونه‌های Colletotrichum مطابقت دارد. پاسخ‌های دفاعی سریع به 83A:476 نشان‌دهنده دخالت ژن‌های مقاومت گیاهی و ایمنی ناشی از عامل (ETI) در این رده است، در حالی که پاسخ‌های تأخیری ماندلوپ از فرضیه ایمنی ناشی از الگوی مولکولی مرتبط با ریز (MTI) 50 پشتیبانی می‌کند. پاسخ‌های اولیه به 83A:476 و ماندلوپ. همپوشانی جزئی بین ژن‌های تنظیم‌شده به سمت بالا یا پایین در پاسخ تأخیری نیز از این مفهوم پشتیبانی می‌کند، زیرا ETI اغلب به عنوان یک پاسخ MTI تسریع‌شده و تقویت‌شده در نظر گرفته می‌شود که به مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلولی در محل عفونت، که به عنوان شوک آنافیلاکتیک شناخته می‌شود، منجر می‌شود. 51،52.
بیشتر ژن‌های منتسب به اصطلاح بیش از حد بازنمایی شده‌ی Gene Ontology GO:0006952 «پاسخ دفاعی»، 11 همولوگ پروتئین پیام روزه‌داری القا شده توسط استرس 22 (مشابه SAM22) و هفت پروتئین شبه پروتئین لاتکس اصلی (MLPs) 31، 34، 43 و 423 هستند که شباهت توالی نشان دادند. ژن‌های شبیه SAM22 فعال‌سازی قابل توجهی را نشان دادند که مدت زمان بیشتری دوام داشت و نشان‌دهنده افزایش سطح مقاومت به سیاه‌زخم (83A:476 و Boregine) بود. با این حال، ژن‌های شبیه MLP فقط در لاین‌های حامل آلل مقاومت کاندید (83A:476/Lanr1 در 6 hpi و Mandelup/AnMan در 24 hpi) کاهش بیان داشتند. لازم به ذکر است که همه همولوگ‌های شبیه SAM22 شناسایی شده از یک خوشه ژنی به طول تقریبی 105 کیلوبایت سرچشمه می‌گیرند، در حالی که ژن‌های شبیه MLP از مناطق جداگانه‌ای از ژنوم سرچشمه می‌گیرند. فعال‌سازی هماهنگ چنین ژن‌های شبیه SAM22 در مطالعه قبلی ما در مورد مقاومت NLL در برابر تلقیح Diaporthetoxica نیز مشاهده شد، که نشان می‌دهد آنها در اجزای افقی پاسخ دفاعی نقش دارند. این نتیجه‌گیری همچنین توسط گزارش‌هایی از پاسخ مثبت ژن‌های شبیه SAM22 به آسیب یا درمان با اسید سالیسیلیک، القاکننده‌های قارچی یا پراکسید هیدروژن پشتیبانی می‌شود.
نشان داده شده است که ژن‌های شبه MLP به تنش‌های مختلف غیرزیستی و زیستی، از جمله عفونت‌های باکتریایی، ویروسی و قارچی بیماری‌زا در بسیاری از گونه‌های گیاهی پاسخ می‌دهند55. جهت پاسخ به تعاملات خاص بین گیاهان و عوامل بیماری‌زا از افزایش شدید (مثلاً در طول آلودگی پنبه به Verticillium dahliae) تا کاهش قابل توجه (مثلاً پس از آلودگی درخت سیب به Alternaria spp.) متغیر است56،57. کاهش قابل توجه ژن 423 شبه MLP در طول دفاع آووکادو در برابر عفونت F. niger و در طول آلودگی درخت سیب مشاهده شده است. Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola و Alternaria alternata پاتوتیپ‌های سیب هستند58،59. علاوه بر این، کالوس‌های سیب که ژن 423 شبه MLP را بیش از حد بیان می‌کنند، بیان ژن‌های مرتبط با مقاومت کمتری داشتند و بیشتر مستعد ابتلا به عفونت قارچی بودند59. پس از Fusarium oxysporum f، ژن 423 شبه MLP نیز در ژرم‌پلاسم مقاوم لوبیای معمولی سرکوب شد. cn. عفونت باقلا ۶۰.
سایر اعضای خانواده PR-10 که در مطالعه RNA-seq ما شناسایی شدند، ژن‌های LlR18A و LlR18B در پاسخ به افزایش بیان، و همچنین ژن افزایش بیان (1 ژن) یا کاهش بیان (3 ژن) برای پروتئین انتقال لیپید DIR1 بودند. علاوه بر این، WGCNA ژن LlR18B را به عنوان یک مرکز در این ماژول برجسته می‌کند که به واکسیناسیون بسیار حساس است و چندین ژن پاسخ محافظتی را حمل می‌کند. ژن‌های LlR18A و LlR18B در برگ‌های زرد لوپین در پاسخ به باکتری‌های بیماری‌زا و همچنین در ساقه‌های NLL پس از تلقیح D. toxica القا شدند، در حالی که همولوگ برنج این ژن‌ها، RSOsPR10، به سرعت توسط یک عفونت قارچی که احتمالاً در مسیر سیگنالینگ اسید جاسمونیک دخیل است، القا شد53،61، 62. ژن DIR1 پروتئین‌های انتقال لیپید غیر اختصاصی را که برای شروع مقاومت اکتسابی سیستمیک (SAR) مورد نیاز هستند، کدگذاری می‌کند. با ایجاد واکنش‌های محافظتی، پروتئین DIR1 از کانون عفونت از طریق آوند آبکش منتقل می‌شود تا SAR را در اندام‌های دور القا کند. جالب توجه است که ژن TanjilG_02313 DIR1 در اولین نقطه زمانی در لاین‌های 84A:476 و Population 22660 به طور قابل توجهی القا شد، اما مقاومت به آنتراکنوز فقط در لاین 84A:476 با موفقیت ایجاد شد. این ممکن است نشان‌دهنده نوعی زیرعملکردی شدن ژن DIR1 در NLL باشد، زیرا سه همولوگ باقی‌مانده فقط در لاین 83A:476 در 6 ساعت پس از تلقیح پاسخ دادند و این پاسخ به سمت پایین هدایت شد.
در مطالعه ما، رایج‌ترین اجزای مربوط به فرآیند بیولوژیکی به نام "GO:0055114 Redox process" پروتئین سیتوکروم P450، پراکسیداز، اسید لینولئیک 9S-/13S-لیپوکسیژناز و 1-آمینو سیکلوپروپان-1-کربوکسیلیک اسید اکسیداز بودند. علاوه بر این، WGCNA ما همولوگ HSFA4a را به عنوان یک هاب حامل ماژول‌هایی مانند کاندیدای ژن مقاومت Lanr1، TanjilG_05042، تعریف می‌کند. HSFA4a جزئی از تنظیم وابسته به ردوکس رونویسی هسته‌ای در گیاهان است.
پروتئین‌های سیتوکروم P450 اکسیدوردوکتازهایی هستند که واکنش‌های هیدروکسیلاسیون وابسته به NADPH و/یا O2 را در متابولیسم اولیه و ثانویه، از جمله متابولیسم مواد بیگانه‌زیست و همچنین هورمون‌ها، اسیدهای چرب، استرول‌ها، اجزای دیواره سلولی، بیوپلیمرها و بیوسنتز ترکیبات محافظ، کاتالیز می‌کنند. 69. در مطالعه ما، تغییرپذیری در عملکرد سیتوکروم P450 گیاهی از -10.6 log2 (تغییر برابر) به 5.7 کاهش یافت که به دلیل تعداد زیادی از همولوگ‌های تغییر یافته (37) و تفاوت در الگوهای پاسخ بین ژن‌های خاص بود، که نشان دهنده یک بازنگری رو به بالا است. . استفاده صرف از داده‌های RNA-seq برای روشن کردن عملکرد بیولوژیکی فرضی ژن‌های NLL در چنین ابرخانواده پروتئینی بزرگی بسیار حدسی خواهد بود. با این حال، شایان ذکر است که برخی از ژن‌های سیتوکروم P450 با افزایش مقاومت در برابر قارچ‌ها یا باکتری‌های بیماری‌زا، از جمله سهم در واکنش‌های آلرژیک، مرتبط هستند. 69،70،71.
پراکسیدازهای کلاس III آنزیم‌های گیاهی چندمنظوره‌ای هستند که در طیف وسیعی از فرآیندهای متابولیکی در طول رشد و نمو گیاه و همچنین در پاسخ به تنش‌های محیطی مانند شوری، خشکی، شدت نور بالا و حمله پاتوژن نقش دارند72. پراکسیدازها در تعامل چندین گونه گیاهی با آنتراسیس، از جمله Stylosanthes humilis و C. gloeosporioides، Lens culinaris و C. truncatum، Phaseolus vulgaris و C. lindemuthianum، Cucumis sativus و C. lagenarium73،74،75،76، نقش دارند. پاسخ بسیار سریع است، گاهی اوقات حتی در 4 HPI، قبل از اینکه قارچ به بافت گیاه نفوذ کند73. ژن پراکسیداز همچنین به تلقیح D. toxica NLL پاسخ داد. پراکسیدازها علاوه بر عملکردهای معمول خود برای تنظیم انفجار اکسیداتیو یا از بین بردن استرس اکسیداتیو، می‌توانند با ایجاد موانع فیزیکی بر اساس تقویت دیواره سلولی در طول لیگنینی شدن، زیر واحد یا پیوند عرضی ترکیبات خاص، در رشد پاتوژن اختلال ایجاد کنند. این عملکرد را می‌توان به صورت in silico به ژن TanjilG_03329 که یک آنیون پراکسیداز تشکیل‌دهنده لیگنین فرضی را کد می‌کند، نسبت داد که در مطالعه ما در لاین مقاوم 83A:476 در 6 HPI به طور قابل توجهی افزایش بیان داشت، اما در سایر سویه‌ها و نقاط زمانی که پاسخ ندادند، افزایش بیان مشاهده نشد.
9S-/13S-لیپوکسیژناز اسید لینولئیک اولین گام در مسیر اکسیداتیو بیوسنتز لیپید است78. محصولات این مسیر عملکردهای متعددی در دفاع گیاه دارند، از جمله تقویت دیواره سلولی از طریق تشکیل رسوبات کالوز و پکتین، و تنظیم استرس اکسیداتیو از طریق تولید گونه‌های فعال اکسیژن79،80،81،82،83. در مطالعه حاضر، بیان 9S-/13S-لیپوکسیژناز اسید لینولئیک در همه سویه‌ها تغییر کرد، اما در جمعیت حساس 22660، افزایش بیان در نقاط زمانی مختلف غالب بود، در حالی که در سویه‌های حامل Lanr1 مقاوم و آلل AnMan، بر تنوع لایه اکسی لیپین در واکنش‌های محافظتی سیاه زخم بین این ژنوتیپ‌ها تأکید دارد.
همولوگ 1-آمینو سیکلوپروپان-1-کربوکسیلات اکسیداز (ACO) هنگام تلقیح با لوپین به طور قابل توجهی افزایش بیان (9 ژن) یا کاهش بیان (2 ژن) داشت. به جز دو مورد استثنا، همه این پاسخ‌ها در 6 اسب بخار در 83A:476 رخ داد. واکنش آنزیمی که توسط پروتئین‌های ACO واسطه‌گری می‌شود، مرحله محدودکننده سرعت در تولید اتیلن است و بنابراین به شدت تنظیم می‌شود84. اتیلن یک هورمون گیاهی است که نقش‌های متنوعی در تنظیم رشد گیاه و پاسخ به شرایط تنش غیرزیستی و زیستی ایفا می‌کند. القای رونویسی ACO و فعال‌سازی مسیر سیگنالینگ اتیلن با تنظیم تولید گونه‌های فعال اکسیژن و فیتوالکسین‌ها در افزایش مقاومت برنج در برابر قارچ همی‌بیوتروفیک oryzae oryzae نقش دارد. یک فرآیند آلودگی برگ بسیار مشابه که بین M. oryzae و C. lupini88،89 یافت شده است، در مقابل افزایش قابل توجه همولوگ‌های ACO در لاین 83A:476 که در این مطالعه گزارش شده است، احتمال ایجاد مقاومت در برابر آنتراکنوز NLL اتیلن را به یک مرحله مرکزی سیگنالینگ در مسیرهای مولکولی تغییر می‌دهد.
در مطالعه حاضر، سرکوب گسترده بسیاری از ژن‌های مرتبط با فتوسنتز در 6 ساعت پس از جوانه‌زنی در 83A:476 و در 48 ساعت پس از جوانه‌زنی در Mandeloop و جمعیت 22660 مشاهده شد. میزان و پیشرفت این تغییرات متناسب با سطح آن است. مقاومت به آنتراکنوز در این آزمایش مشاهده شد. اخیراً، سرکوب قوی و زودهنگام رونوشت‌های مرتبط با فتوسنتز در چندین مدل از تعاملات گیاه-پاتوژن، از جمله باکتری‌ها و قارچ‌های بیماری‌زا، گزارش شده است. شتاب (از 2 ساعت پس از جوانه‌زنی در برخی تعاملات) و سرکوب سراسری ژن‌های مرتبط با فتوسنتز در پاسخ به عفونت می‌تواند ایمنی گیاه را بر اساس استقرار گونه‌های فعال اکسیژن و تعامل آنها با مسیر اسید سالیسیلیک برای ایجاد واکنش‌های آلرژیک تحریک کند. 90،94
در نتیجه، مکانیسم‌های پاسخ دفاعی پیشنهاد شده برای مقاوم‌ترین دودمان (83A:476) شامل تشخیص سریع پاتوژن توسط ژن R (احتمالاً TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) و سیگنالینگ اسید سالیسیلیک و اتیلن با واسطه پاسخ آلرژیک و به دنبال آن ایجاد SAR دوربرد است. عمل توسط پروتئین DIR-1 پشتیبانی می‌شود. لازم به ذکر است که دوره بیوتروفیک برای عفونت C. lupini بسیار کوتاه است (تقریباً 2 روز) و به دنبال آن رشد نکروتیک95 رخ می‌دهد. گذار بین این مراحل ممکن است با نکروز و بیان پروتئین‌های القا شده توسط اتیلن که به عنوان محرک واکنش‌های حساسیت بیش از حد در گیاهان میزبان عمل می‌کنند، مرتبط باشد. بنابراین، بازه زمانی برای شکار موفقیت‌آمیز C. lupini در مرحله بیوتروفیک بسیار محدود است. برنامه‌ریزی مجدد ژن‌های مرتبط با ردوکس و فتوسنتز که در 83A:476 در 6 ساعت پس از کشت مشاهده شد، با پیشرفت هیف‌های قارچی سازگار است و از ایجاد یک پاسخ محافظتی موفق در مرحله بیوتروفیک خبر می‌دهد. پاسخ‌های رونویسی ماندلوپ و جمعیت ۲۲۶۶۰ ممکن است برای گرفتن قارچ قبل از تغییر به رشد نکروتیک بسیار تأخیر داشته باشند، با این حال، ماندلوپ ممکن است مؤثرتر از جمعیت ۲۲۶۶۰ باشد زیرا تنظیم نسبتاً سریع پروتئین PR-10 باعث مقاومت افقی می‌شود.
به نظر می‌رسد ETI که توسط ژن R متعارف هدایت می‌شود، مکانیسم رایجی برای مقاومت لوبیا در برابر آنتراکنوز باشد. بنابراین، در مدل حبوبات Medicago truncatula، مقاومت در برابر آنتراکنوز توسط ژن RCT1، عضوی از کلاس ژن R گیاهی TIR-NBS-LRR97، ایجاد می‌شود. این ژن همچنین در صورت انتقال به گیاهان حساس، مقاومت آنتراکنوز با طیف گسترده را در یونجه ایجاد می‌کند. در لوبیای معمولی (P. vulgaris)، تاکنون بیش از دو دوجین ژن مقاومت به آنتراکنوز شناسایی شده است. برخی از این ژن‌ها در مناطقی یافت می‌شوند که فاقد هرگونه ژن R متعارف هستند، با این حال بسیاری دیگر در لبه‌های کروموزوم‌های حامل خوشه ژنی NBS-LRR، از جمله TIR-NBS-LRRs99، قرار دارند. مطالعه SSR در سطح ژنوم نیز ارتباط ژن NBS-LRR با مقاومت به آنتراکنوز در لوبیای معمولی را تأیید کرد. ژن R متعارف همچنین در ناحیه ژنومی حامل جایگاه اصلی مقاومت به آنتراکنوز در لوپین سفید ۱۰۱ یافت شد.
کار ما نشان می‌دهد که یک واکنش مقاومت فوری، که در مراحل اولیه عفونت گیاه (ترجیحاً نه دیرتر از ۱۲ ساعت پس از آلودگی) فعال می‌شود، به طور مؤثر از لوپین برگ باریک در برابر آنتراکنوز ناشی از قارچ بیماری‌زای Collelotrichum lupini محافظت می‌کند. با استفاده از توالی‌یابی با توان عملیاتی بالا، ما پروفایل‌های بیان افتراقی ژن‌های مقاومت به آنتراکنوز را در گیاهان NLL که توسط ژن‌های مقاومت Lanr1 و AnMan واسطه‌گری می‌شوند، نشان دادیم. دفاع موفقیت‌آمیز شامل طراحی دقیق ژن‌ها برای پروتئین‌های دخیل در ردوکس، فتوسنتز و بیماری‌زایی در عرض چند ساعت پس از اولین تماس گیاه با یک پاتوژن است. واکنش‌های محافظتی مشابه، اما با تأخیر زمانی، در محافظت از گیاهان در برابر بیماری‌ها بسیار کمتر مؤثر هستند. مقاومت به سیاه‌زخم که توسط ژن Lanr1 واسطه‌گری می‌شود، شبیه پاسخ سریع معمول ژن R (ایمنی ناشی از عامل مؤثر) است، در حالی که ژن AnMan به احتمال زیاد یک پاسخ افقی (ایمنی ناشی از یک الگوی مولکولی مرتبط با میکروب) ارائه می‌دهد و سطح متوسطی از پایداری را فراهم می‌کند.
215 لاین NLL مورد استفاده برای غربالگری نشانگرهای آنتراکنوز شامل 74 رقم، 60 لاین حاصل از تلاقی یا اصلاح نژاد، 5 جهش‌یافته و 76 ژرم‌پلاسم وحشی یا اصلی بود. این لاین‌ها از 17 کشور، عمدتاً از لهستان (58)، اسپانیا (47)، آلمان (27)، استرالیا (26)، روسیه (19)، بلاروس (7)، ایتالیا (5) و سایر لاین‌ها از 10 کشور تهیه شده بودند. این مجموعه همچنین شامل لاین‌های مقاوم مرجع است: 83A:476، Tanjil، Wonga حامل آلل Lanr1 و Mandelup حامل آلل AnMan. این لاین‌ها از پایگاه داده منابع ژنتیکی لوپین اروپا که توسط Poznań Plant Breeding Ltd.، Wiatrowo، لهستان نگهداری می‌شود، به دست آمده‌اند (جدول تکمیلی S1).
گیاهان تحت شرایط کنترل‌شده (دوره نوری ۱۶ ساعت، دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد در طول روز و ۱۸ درجه سانتی‌گراد در شب) کشت داده شدند. دو تکرار بیولوژیکی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. DNA از برگ‌های سه هفته‌ای با استفاده از کیت DNeasy Plant Mini (کیاژن، هیلدن، آلمان) طبق پروتکل جدا شد. کیفیت و غلظت DNA جدا شده با روش‌های اسپکتروفتومتری (نانودراپ ۲۰۰۰؛ ترمو فیشر ساینتیفیک، والتهام، ماساچوست، ایالات متحده آمریکا) ارزیابی شد. نشانگر AnManM1 که ژن مقاومت به آنتراکنوز AnMan (مشتق شده از رقم ماندلوپ) را نشان می‌دهد و نشانگرهای Anseq3 و Anseq4 که در کنار ژن Lanr1 (مشتق شده از رقم تانجیل) قرار دارند، در ۱۱، ۲۶، ۲۸ تجزیه و تحلیل شدند. هموزیگوت‌ها برای آلل مقاوم به عنوان "۱"، حساس به عنوان "۰" و هتروزیگوت‌ها به عنوان ۰.۵ امتیازدهی شدند.
بر اساس نتایج غربالگری نشانگرهای AnManM1، AnSeq3 و AnSeq4 و در دسترس بودن بذرها برای آزمایش‌های تکمیلی نهایی، 50 لاین NLL برای فنوتیپ‌بندی مقاومت به آنتراکنوز انتخاب شدند. تجزیه و تحلیل به صورت تکراری در یک گلخانه کنترل‌شده با کامپیوتر با دوره نوری 14 ساعته با محدوده دمایی 22 درجه سانتیگراد در طول روز و 19 درجه سانتیگراد در شب انجام شد. قبل از کاشت، بذرها خراشیده می‌شوند (پوسته بذر در طرف مقابل جنین با یک تیغه تیز بریده می‌شود) تا از خواب بذر به دلیل سخت بودن بیش از حد پوسته بذر جلوگیری شود و جوانه‌زنی یکنواخت تضمین شود. گیاهان در گلدان‌هایی (11 × 11 × 21 سانتی‌متر) با خاک استریل (TS-1 REC 085 Medium Basic، Klasmann-Deilmann Polska، ورشو، لهستان) کشت شدند. تلقیح با سویه Colletotrichum lupini Col-08 انجام شد که در سال ۱۹۹۹ از ساقه گیاهان باریک برگ لوپین که در مزرعه‌ای در Verzhenitsa، لهستان بزرگ (۵۲° ۲۷′ ۴۲″ شمالی ۱۷° ۰۴′ ۰۵″ شرقی) کشت شده بودند، رشد کرد. یک منطقه را انتخاب کنید. جدایه‌ها در محیط کشت SNA در دمای ۲۰ درجه سانتیگراد و زیر نور سیاه به مدت ۲۱ روز کشت داده شدند تا اسپورزایی القا شود. چهار هفته پس از کاشت، هنگامی که گیاهان به مرحله ۴-۶ برگی رسیدند، تلقیح با اسپری کردن سوسپانسیون کنیدی‌ها با غلظت ۰.۵ × ۱۰۶ کنیدی در هر میلی‌لیتر انجام شد. پس از تلقیح، گیاهان به مدت ۲۴ ساعت در تاریکی با رطوبت حدود ۹۸٪ و دمای ۲۵ درجه سانتیگراد نگهداری شدند تا جوانه‌زنی کنیدی‌ها و فرآیند آلودگی تسهیل شود. سپس گیاهان تحت یک دوره نوری ۱۴ ساعته در دمای ۲۲ درجه سانتیگراد در روز/۱۹ درجه سانتیگراد در شب و رطوبت ۷۰٪ کشت داده شدند. امتیاز بیماری ۲۲ روز پس از تلقیح تعیین شد و بسته به وجود یا عدم وجود ضایعات نکروتیک روی ساقه‌ها و برگ‌ها، از ۰ (ایمن) تا ۹ (بسیار حساس) متغیر بود. علاوه بر این، پس از امتیازدهی، وزن گیاهان اندازه‌گیری شد. روابط بین ژنوتیپ‌های نشانگر و فنوتیپ‌های بیماری به صورت همبستگی‌های نقطه‌ای دو توالی (عدم وجود نشانگرهای هتروزیگوت در مجموعه خطوط برای تجزیه و تحلیل فنوتیپ مقاومت به آنتراکنوز) محاسبه شد.