Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümü CSS için sınırlı desteğe sahiptir. En iyi deneyim için, güncel bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da uyumluluk modunu kapatmanızı) öneririz. Bu arada, desteğin devamını sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan görüntüleyeceğiz.
İnsan bağırsak morfojenezinde, 3 boyutlu epitel mikro mimarisi ve mekansal organizasyonun kript-villus özellikleri oluşturulur. Bu eşsiz yapı, bazal kriptteki kök hücre nişini dış kaynaklı mikrobiyal antijenlerden ve metabolitlerinden koruyarak bağırsak homeostazını sürdürmek için gereklidir. Ek olarak, bağırsak villusları ve salgılanan mukus, bağırsak mukozal yüzeyinde koruyucu bir bariyer ile fonksiyonel olarak farklılaşmış epitel hücreleri sunar. Bu nedenle, 3 boyutlu epitel yapılarının yeniden oluşturulması, in vitro bağırsak modellerinin oluşturulması için çok önemlidir. Özellikle, organik taklitçi bağırsak-çip üzerinde, gelişmiş fizyolojik fonksiyonlar ve biyomekaniklerle bağırsak epitelinin spontan 3 boyutlu morfojenezini indükleyebilir. Burada, mikroakışkan bir çip üzerinde ve Transwell gömülü hibrit bir çipte bağırsak morfojenezini sağlam bir şekilde indüklemek için tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz. Cihaz üretimi, Caco-2 veya bağırsak organoid epitel hücrelerinin geleneksel ortamlarda ve mikroakışkan bir platformda kültürlenmesi için ayrıntılı yöntemler açıklıyoruz. 3 boyutlu morfojenezin indüksiyonu ve çoklu görüntüleme yöntemleri kullanılarak oluşturulmuş 3 boyutlu epitelin karakterizasyonu. Bu protokol, 5 gün boyunca bazal sıvı akışını kontrol ederek fonksiyonel bağırsak mikro mimarisinin rejenerasyonunu sağlar. İn vitro morfojenez yöntemimiz, fizyolojik olarak ilgili kayma gerilimi ve mekanik hareketi kullanır ve karmaşık hücre mühendisliği veya manipülasyonu gerektirmez; bu da diğer mevcut tekniklerden daha iyi performans gösterebilir. Önerilen protokolümüzün, biyomedikal, klinik ve farmasötik uygulamalar için in vitro 3 boyutlu bağırsak epitel tabakalarını yeniden oluşturma yöntemi sağlayarak biyomedikal araştırma topluluğu için geniş kapsamlı sonuçlar doğurabileceğini öngörüyoruz.
Deneyler, bağırsak-çip üzerinde1,2,3,4,5 veya çift katmanlı mikroakışkan cihazlarda6,7 kültürlenen bağırsak epitel hücreleri Caco-2'nin, altta yatan mekanizmanın net bir şekilde anlaşılması olmaksızın, in vitro ortamda kendiliğinden 3 boyutlu morfojenez geçirebildiğini göstermektedir. Son çalışmamızda, Caco-2 ve hasta kaynaklı bağırsak organoidlerinde gösterildiği gibi, in vitro ortamda 3 boyutlu epitel morfojenezini indüklemek için kültür cihazlarından bazal olarak salgılanan morfojen antagonistlerinin uzaklaştırılmasının gerekli ve yeterli olduğunu bulduk. Epitel hücreleri doğrulandı. Bu çalışmada, özellikle "Hibrit Çip" olarak adlandırılan, Transwell ek parçaları içeren bağırsak-çip ve modifiye mikroakışkan cihazlarda güçlü bir Wnt antagonisti olan Dickkopf-1'in (DKK-1) hücre üretimi ve konsantrasyon dağılımına odaklandık. Çip üzerindeki bağırsağa ekzojen Wnt antagonistlerinin (DKK-1, Wnt baskılayıcı 1, salgılanan frizzled-ilişkili protein 1 veya Soggy-1 gibi) eklenmesinin, morfojenezin inhibisyonuna veya önceden yapılandırılmış 3 boyutlu epitel tabakasının bozulmasına neden olduğunu gösterdik; bu da kültür sırasında antagonistik stresin in vitro bağırsak morfojenezinden sorumlu olduğunu düşündürmektedir. Bu nedenle, epitel arayüzünde sağlam bir morfojenez elde etmek için pratik bir yaklaşım, aktif yıkama (örneğin, bağırsak-çip veya hibrit-çip platformlarında) veya difüzyon yoluyla bazal bölmedeki Wnt antagonistlerinin seviyelerini ortadan kaldırmak veya minimum düzeyde tutmaktır. Bazal ortam (örneğin, Transwell, kuyulardaki büyük bazal rezervuarlara yerleştirilen bir cihazdır.
Bu protokolde, bağırsak epitel hücrelerini polidimetilsiloksan (PDMS) bazlı gözenekli membranlar (adım 6A, 7A, 8, 9) veya Transwell insertlerinin polyester membranları (adım 6B, 7B, 8, 9) üzerinde kültüre etmek ve in vitro 3 boyutlu morfojenez indüklemek (adım 10) için bağırsak-çip üzerinde mikrocihazlar ve Transwell'e yerleştirilebilir hibrit çipler (adım 1-5) üretmek için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz. Ayrıca, çoklu görüntüleme yöntemleri uygulayarak dokuya özgü histogenez ve soy hattına bağlı hücresel farklılaşmayı gösteren hücresel ve moleküler özellikleri belirledik (adım 11-24). Gözenekli membranların yüzey modifikasyonu, 2 boyutlu tek tabakaların oluşturulması ve bağırsak biyokimyasal ve biyomekanik mikroortamının in vitro olarak yeniden üretilmesi de dahil olmak üzere teknik ayrıntılarla iki kültür formatında Caco-2 veya bağırsak organoidleri gibi insan bağırsak epitel hücreleri kullanarak morfojenez indükledik. 2 boyutlu epitel hücre tabakalarından 3 boyutlu morfojenez elde etmek için, kültürün bazal bölmesine ortam akıtarak her iki kültür formunda da morfojen antagonistlerini uzaklaştırdık. Son olarak, morfojene bağımlı epitel büyümesini, uzunlamasına konak-mikrobiyom ortak kültürlerini, patojen enfeksiyonunu, inflamatuar hasarı, epitel bariyer disfonksiyonunu ve probiyotik bazlı tedavileri modellemek için kullanılabilen, yenilenebilir bir 3 boyutlu epitel tabakasının faydasını gösteren bir örnek sunuyoruz.
Protokolümüz, temel (örneğin, bağırsak mukozal biyolojisi, kök hücre biyolojisi ve gelişim biyolojisi) ve uygulamalı araştırmalarda (örneğin, preklinik ilaç testleri, hastalık modellemesi, doku mühendisliği ve gastroenteroloji) geniş bir yelpazedeki bilim insanı için faydalı olabilir. Protokolümüzün in vitro olarak bağırsak epitelinin 3 boyutlu morfojenezini indüklemedeki tekrarlanabilirliği ve sağlamlığı nedeniyle, teknik stratejimizin bağırsak gelişimi, rejenerasyonu veya homeostazı sırasında hücre sinyallemesinin dinamiklerini inceleyen kitlelere yaygınlaştırılabileceğini öngörüyoruz. Ayrıca, protokolümüz Norovirüs 8, Şiddetli Akut Solunum Sendromu Koronavirüs 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 veya Vibrio cholerae gibi çeşitli enfeksiyon ajanları altında enfeksiyonu incelemek için de kullanışlıdır. Hastalık patolojisi ve patogeneziyle ilgili kitleler de faydalıdır. Çip üzerinde bağırsak mikrofizyolojisi sisteminin kullanımı, uzunlamasına ortak kültürleme 10 ve ardından gastrointestinal (GI) sistemde konak savunması, bağışıklık tepkileri ve patojenle ilişkili hasar onarımının değerlendirilmesine olanak sağlayabilir 11. Sızıntılı bağırsak sendromu, çölyak hastalığı, Crohn hastalığı, ülseratif kolit, poşit veya irritabl bağırsak sendromu ile ilişkili diğer GI bozuklukları, hastanın 3 boyutlu bağırsak epitel tabakaları kullanılarak 3 boyutlu bağırsak epitel tabakaları hazırlandığında simüle edilebilir; bu hastalıklar arasında villöz atrofi, kript kısalması, mukoza hasarı veya bozulmuş epitel bariyeri bulunur. Biyopsi veya kök hücre kaynaklı bağırsak organoidleri 12,13. Hastalık ortamının daha yüksek karmaşıklığını daha iyi modellemek için, okuyucular 3 boyutlu bağırsak villus-kript mikro mimarileri içeren modellere hasta periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) gibi hastalıkla ilgili hücre tiplerini eklemeyi düşünebilirler. Dokuya özgü bağışıklık hücreleri, 5.
3 boyutlu epitel mikro yapısı, kesit alma işlemine gerek kalmadan sabitlenebildiği ve görselleştirilebildiği için, uzamsal transkriptomik ve yüksek çözünürlüklü veya süper çözünürlüklü görüntüleme üzerinde çalışan izleyiciler, epitel nişlerindeki genlerin ve proteinlerin uzamsal-zamansal dinamiklerinin haritalandırılmasıyla ilgilenebilirler. Teknolojiye ilgi duyanlar. Mikrobiyal veya immün uyarıcılara yanıt. Ayrıca, bağırsak homeostazını koordine eden uzunlamasına konak-mikrobiyom etkileşimi 10, 14, özellikle bağırsak-çip üzerinde olmak üzere, çeşitli mikrobiyal türlerin, mikrobiyal toplulukların veya dışkı mikrobiyotasının birlikte kültürlenmesiyle 3 boyutlu bağırsak mukozal tabakasında kurulabilir. Bu yaklaşım, özellikle mukozal immünoloji, gastroenteroloji, insan mikrobiyomu, kültüromik ve klinik mikrobiyoloji alanlarında çalışan ve laboratuvarda daha önce kültürlenmemiş bağırsak mikrobiyotasını yetiştirmeyi amaçlayan kitleler için oldukça caziptir. İn vitro morfogenez protokolümüz, bazal bölmeleri sürekli olarak yenileyen 24, 96 veya 384 kuyucuklu plakalardaki çoklu kuyucuk ekleri gibi ölçeklenebilir kültür formatlarına uyarlanabilirse, protokol ayrıca ilaç, biyomedikal veya gıda endüstrisi için yüksek verimli tarama veya doğrulama platformları geliştiren kişilere de yaygınlaştırılabilir. Bir ilke kanıtı olarak, yakın zamanda 24 kuyucuklu plaka formatına ölçeklenebilir çoklu yüksek verimli bir morfogenez sisteminin uygulanabilirliğini gösterdik. Ayrıca, çok sayıda organ-on-a-chip ürünü ticarileştirilmiştir16,17,18. Bu nedenle, in vitro morfogenez yöntemimizin doğrulanması hızlandırılabilir ve birçok araştırma laboratuvarı, endüstri veya hükümet ve düzenleyici kurum tarafından hücrelerin yeniden programlanmasını anlamak için potansiyel olarak benimsenebilir. İlaç veya biyoterapötiklerin test edilmesi için transkriptomik düzeyde in vitro bağırsak morfojenezinin incelenmesi. İlaç adaylarının emilimi ve taşınması, bağırsak morfojenez sürecinin tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için 3 boyutlu bağırsak modelleri veya özel veya ticari organ-çip modelleri kullanılarak değerlendirildi.
Bağırsak epitel morfojenezini incelemek için kullanılan insanla ilgili deneysel modellerin sayısı sınırlıdır; bunun temel nedeni, in vitro 3 boyutlu morfojenez indüklemek için uygulanabilir protokollerin eksikliğidir. Aslında, bağırsak morfojenezine ilişkin mevcut bilgilerin çoğu hayvan çalışmaları (örneğin, zebra balığı20, fare21 veya tavuk22) üzerine kuruludur. Bununla birlikte, bu çalışmalar emek ve maliyet açısından yoğundur, etik açıdan sorgulanabilir ve en önemlisi, insan gelişim süreçlerini tam olarak belirlemezler. Bu modeller ayrıca çok yönlü ölçeklenebilir bir şekilde test edilebilme yetenekleri açısından da çok sınırlıdır. Bu nedenle, in vitro 3 boyutlu doku yapılarını yeniden oluşturma protokolümüz, in vivo hayvan modellerinin yanı sıra diğer geleneksel statik 2 boyutlu hücre kültürü modellerinden de daha iyi performans göstermektedir. Daha önce açıklandığı gibi, 3 boyutlu epitel yapıları kullanmak, çeşitli mukozal veya immün uyarıcılara yanıt olarak kript-villus eksenindeki farklılaşmış hücrelerin uzamsal lokalizasyonunu incelememizi sağlamıştır. 3 boyutlu epitel katmanları, mikrobiyal hücrelerin nasıl rekabet ettiğini incelemek için bir alan sağlayabilir. Konakçı faktörlerine (örneğin, iç ve dış mukus katmanları, IgA ve antimikrobiyal peptitlerin salgılanması) yanıt olarak mekansal nişler ve ekolojik evrim. Ayrıca, 3 boyutlu epitel morfolojisi, bağırsak mikrobiyotasının topluluklarını nasıl yapılandırdığını ve bazal kriptlerdeki hücresel organizasyonu ve kök hücre nişlerini şekillendiren mikrobiyal metabolitleri (örneğin, kısa zincirli yağ asitleri) sinerjik olarak nasıl ürettiğini anlamamızı sağlar. Bu özellikler ancak 3 boyutlu epitel katmanları in vitro olarak oluşturulduğunda gösterilebilir.
3 boyutlu bağırsak epitel yapıları oluşturma yöntemimize ek olarak, çeşitli in vitro yöntemler de mevcuttur. Bağırsak organoid kültürü, bağırsak kök hücrelerinin belirli morfogen koşulları altında kültivasyonuna dayanan son teknoloji bir doku mühendisliği tekniğidir23,24,25. Bununla birlikte, 3 boyutlu organoid modellerinin taşıma analizi veya konak-mikrobiyom ortak kültürleri için kullanımı genellikle zordur çünkü bağırsak lümeni organoidin içinde kapalıdır ve bu nedenle mikrobiyal hücreler veya eksojen antijenler gibi lümen bileşenlerinin girişi sınırlıdır. Organoid lümenlerine erişim bir mikroenjektör kullanılarak iyileştirilebilir26,27 ancak bu yöntem invaziv ve emek yoğun olup, uygulanması için özel bilgi gerektirir. Ayrıca, statik koşullar altında hidrojel iskelelerde tutulan geleneksel organoid kültürleri, aktif in vivo biyomekaniğini doğru bir şekilde yansıtmaz.
Çeşitli araştırma grupları tarafından kullanılan diğer yaklaşımlar, izole edilmiş insan bağırsak hücrelerini jel yüzeyinde kültürleyerek bağırsak epitel yapısını taklit etmek için önceden yapılandırılmış 3 boyutlu hidrojel iskeletler kullanmaktadır. Hidrojel iskeletler, 3 boyutlu baskı, mikro frezeleme veya litografik olarak üretilmiş kalıplar kullanılarak üretilir. Bu yöntem, izole edilmiş epitel hücrelerinin fizyolojik olarak ilgili morfogen gradyanlarıyla in vitro olarak kendi kendine organize olmuş düzenini gösterir ve iskelete stromal hücreler dahil edilerek yüksek en boy oranlı bir epitel yapısı ve stroma-epitel etkileşimi oluşturur. Bununla birlikte, önceden yapılandırılmış iskeletlerin doğası, spontan morfogenetik sürecin kendisinin gösterilmesini engelleyebilir. Bu modeller ayrıca, bağırsak hücrelerinin morfogenez geçirmesi ve fizyolojik işlev kazanması için ihtiyaç duyduğu akışkan kayma geriliminden yoksun oldukları için dinamik lümen veya interstisyel akış sağlamazlar. Yakın zamanda yapılan bir başka çalışma, mikroakışkan bir platformda hidrojel iskeletler kullandı ve lazerle oyma teknikleri kullanarak bağırsak epitel yapılarını desenlendirdi. Fare bağırsak organoidleri oyulmuş desenleri takip eder. Bağırsak tüp yapıları oluşturmak için, mikroakışkan bir modül kullanılarak lümen içi sıvı akışı yeniden oluşturulabilir. Bununla birlikte, bu model ne kendiliğinden morfogenetik süreçler sergiler ne de bağırsak mekanobiyolojik hareketlerini içerir. Aynı grubun 3D baskı teknikleri, kendiliğinden morfogenetik süreçlere sahip minyatür bağırsak tüpleri oluşturmayı başardı. Tüp içindeki farklı bağırsak segmentlerinin karmaşık üretimine rağmen, bu modelde de lümen içi sıvı akışı ve mekanik deformasyon eksiktir. Ek olarak, modelin çalışabilirliği, özellikle biyobaskı işlemi tamamlandıktan sonra, deneysel koşulları veya hücreler arası etkileşimleri bozarak sınırlı olabilir. Bunun yerine, önerilen protokolümüz, kendiliğinden bağırsak morfogenezi, fizyolojik olarak ilgili kayma gerilimi, bağırsak hareketliliğini taklit eden biyomekanik, bağımsız apikal ve bazal bölmelerin erişilebilirliği ve modülerliğin karmaşık biyolojik mikro ortamlarının yeniden oluşturulmasını sağlar. Bu nedenle, in vitro 3D morfogenez protokolümüz, mevcut yöntemlerin zorluklarının üstesinden gelmek için tamamlayıcı bir yaklaşım sağlayabilir.
Protokolümüz tamamen 3 boyutlu epitel morfojenezine odaklanmıştır; kültürde sadece epitel hücreleri bulunur ve mezenkimal hücreler, endotel hücreleri ve immün hücreler gibi diğer çevre hücre tipleri bulunmaz. Daha önce açıklandığı gibi, protokolümüzün özü, tanıtılan ortamın bazal tarafında salgılanan morfojen inhibitörlerinin uzaklaştırılmasıyla epitel morfojenezinin indüklenmesidir. Bağırsak-çip ve hibrit-çip modellerimizin sağlam modülerliği, dalgalı 3 boyutlu epitel tabakasını yeniden oluşturmamıza olanak sağlarken, epitel-mezenkimal etkileşimler33,34, hücre dışı matris (ECM) birikimi35 ve modelimizde, bazal kriptlerde kök hücre nişleri taşıyan kript-villus özellikleri gibi ek biyolojik karmaşıklıklar daha fazla incelenmeyi beklemektedir. Mezenkimdeki stromal hücreler (örneğin, fibroblastlar), ECM proteinlerinin üretiminde ve bağırsak morfojenezinin düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. vivo35,37,38. Modelimize mezenkimal hücrelerin eklenmesi, morfogenetik süreci ve hücre bağlanma verimliliğini artırdı. Endotel tabakası (yani kılcal damarlar veya lenfatikler), bağırsak mikroortamında moleküler taşınmanın39 ve immün hücre alımının40 düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Ayrıca, doku modelleri çoklu organ etkileşimlerini göstermek üzere tasarlandığında, doku modelleri arasında bağlantı kurulabilen vasküler bileşenler bir ön koşuldur. Bu nedenle, organ düzeyinde çözünürlükle daha doğru fizyolojik özellikleri modellemek için endotel hücrelerinin dahil edilmesi gerekebilir. Hastadan elde edilen immün hücreler, bağırsak hastalığını taklit etme bağlamında doğuştan gelen immün yanıtları, antijen sunumunu, doğuştan gelen adaptif immün çapraz etkileşimi ve dokuya özgü bağışıklığı göstermek için de gereklidir.
Hibrit çiplerin kullanımı, cihaz kurulumunun daha basit olması ve Transwell ek parçalarının kullanımı sayesinde bağırsak epitelinin ölçeklenebilir kültürlenmesine olanak sağlaması nedeniyle, "çip üzerinde bağırsak" yaklaşımına göre daha kolaydır. Bununla birlikte, polyester membranlı ticari olarak temin edilebilen Transwell ek parçaları elastik değildir ve peristaltik benzeri hareketleri simüle edemez. Ayrıca, hibrit çipe yerleştirilen Transwell ek parçasının apikal bölmesi, apikal tarafta herhangi bir kayma gerilimi olmaksızın sabit kalmıştır. Açıkça, apikal bölmedeki statik özellikler, hibrit çiplerde uzun süreli bakteri ortak kültürünü nadiren mümkün kılar. Hibrit çipler kullanıldığında Transwell ek parçalarında 3 boyutlu morfojenezin güçlü bir şekilde indüklenmesi mümkün olsa da, fizyolojik olarak ilgili biyomekanik ve apikal sıvı akışının eksikliği, hibrit çip platformlarının potansiyel uygulamalar için uygulanabilirliğini sınırlayabilir.
Bağırsak-çip ve hibrit-çip kültürlerinde insan kript-villus ekseninin tam ölçekli rekonstrüksiyonları henüz tam olarak oluşturulmamıştır. Morfogenez bir epitel tek tabakasından başladığı için, 3 boyutlu mikro mimariler, in vivo kriptlere morfolojik benzerlik sağlamayabilir. Mikro mühendislik ürünü 3 boyutlu epitelde bazal kript alanı yakınındaki çoğalan hücre popülasyonunu karakterize etmemize rağmen, kript ve villus bölgeleri net bir şekilde sınırlandırılmamıştır. Çip üzerindeki daha yüksek üst kanallar, mikro mühendislik ürünü epitelin yüksekliğini artırsa da, maksimum yükseklik hala ~300-400 µm ile sınırlıdır. İnce ve kalın bağırsaklardaki insan bağırsak kriptlerinin gerçek derinliği sırasıyla ~135 µm ve ~400 µm'dir ve ince bağırsak villuslarının yüksekliği ~600 µm'dir41.
Görüntüleme açısından bakıldığında, 3 boyutlu mikro mimarilerin yerinde süper çözünürlüklü görüntülenmesi, objektif lensten epitel tabakasına olan gerekli çalışma mesafesinin birkaç milimetre mertebesinde olması nedeniyle, çip üzerindeki bağırsakla sınırlı olabilir. Bu sorunun üstesinden gelmek için uzak bir objektif gerekebilir. Ayrıca, PDMS'nin yüksek elastikiyeti nedeniyle görüntüleme numunesi hazırlığı için ince kesitler yapmak zordur. Dahası, çip üzerindeki bağırsağın katman katman mikrofabrikasyonu her katman arasında kalıcı yapışmayı içerdiğinden, epitel tabakasının yüzey yapısını incelemek için üst katmanı açmak veya çıkarmak son derece zordur. Örneğin, taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak.
PDMS'nin hidrofobikliği, hidrofobik küçük moleküllerle ilgili mikroakışkan tabanlı çalışmalarda sınırlayıcı bir faktör olmuştur, çünkü PDMS bu tür hidrofobik molekülleri spesifik olmayan bir şekilde adsorbe edebilir. PDMS'ye alternatif olarak diğer polimerik malzemeler düşünülebilir. Alternatif olarak, hidrofobik moleküllerin adsorpsiyonunu en aza indirmek için PDMS'nin yüzey modifikasyonu (örneğin, lipofilik malzemeler 42 veya poli(etilen glikol) 43 ile kaplama) düşünülebilir.
Son olarak, yöntemimiz yüksek verimli tarama veya "herkese uygun" kullanıcı dostu bir deneysel platform sağlama açısından yeterince karakterize edilmemiştir. Mevcut protokol, mikrocihaz başına bir şırınga pompası gerektirir; bu da CO2 inkübatöründe yer kaplar ve büyük ölçekli deneyleri engeller. Bu sınırlama, yenilikçi kültür formatlarının (örneğin, bazal ortamın sürekli yenilenmesine ve çıkarılmasına olanak tanıyan 24 kuyucuklu, 96 kuyucuklu veya 384 kuyucuklu gözenekli insertler) ölçeklenebilirliği ile önemli ölçüde iyileştirilebilir.
İnsan bağırsak epitelinin in vitro 3 boyutlu morfojenezini indüklemek için, lümen-kılcal damar arayüzü oluşturmak üzere iki paralel mikrokanal ve aralarında elastik gözenekli bir membran içeren bir mikroakışkan çip bağırsak cihazı kullandık. Ayrıca, Transwell insertleri üzerinde yetiştirilen polarize epitel katmanlarının altında sürekli bazal akış sağlayan tek kanallı bir mikroakışkan cihazın (hibrit çip) kullanımını da gösterdik. Her iki platformda da, morfojen antagonistlerini bazal bölmeden uzaklaştırmak için akışın yönlü manipülasyonu uygulanarak çeşitli insan bağırsak epitel hücrelerinin morfojenezini göstermek mümkündür. Tüm deneysel prosedür (Şekil 1) beş bölümden oluşmaktadır: (i) bağırsak çipinin veya Transwell yerleştirilebilir hibrit çipin mikrofabrikasyonu (adım 1-5; Kutu 1), (ii) bağırsak epitel hücrelerinin (Caco-2 hücreleri) veya insan bağırsak organoidlerinin hazırlanması; (iii) bağırsak çipleri veya hibrit çipler üzerinde bağırsak epitel hücrelerinin kültürü (6-9. adımlar), (iv) in vitro 3 boyutlu morfojenezin indüklenmesi (10. adım) ve (v) 3 boyutlu epitel mikro yapısının karakterize edilmesi (11-24. adımlar). Son olarak, in vitro morfojenezin etkinliğini doğrulamak için epitel morfojenezini uzamsal, zamansal, koşullu veya prosedürel kontrollerle karşılaştırarak uygun bir kontrol grubu (aşağıda daha ayrıntılı olarak tartışılacaktır) tasarlanmıştır.
İki farklı kültür platformu kullandık: düz kanallı veya doğrusal olmayan kıvrımlı kanallı bağırsak-çip veya Kutu 1'de ve 1-5. adımlarda açıklandığı gibi üretilen mikroakışkan bir cihazda Transwell (TW) ek parçaları içeren hibrit çipler. "Cihaz Üretimi", tek bir çip veya hibrit bir çipin yapımındaki ana adımları göstermektedir. "İnsan Bağırsak Epitel Hücrelerinin Kültürü", bu protokolde kullanılan hücre kaynağını (Caco-2 veya insan bağırsak organoidleri) ve kültür prosedürünü açıklamaktadır. "İn vitro Morfogenez", Caco-2 veya organoid kaynaklı epitel hücrelerinin bir bağırsak çipinde veya hibrit bir çipin Transwell ek parçalarında kültüre edilmesinin ardından 3 boyutlu morfogenezin indüklenmesi ve karakterize edilmiş bir epitel yapısının oluşturulmasının genel adımlarını göstermektedir. Her okun altında program adım numarası veya kutu numarası gösterilmektedir. Uygulama, örneğin hücre farklılaşması karakterizasyonunda, bağırsak fizyolojisi çalışmalarında, konak-mikrobiyomunun oluşturulmasında, oluşturulmuş bağırsak epitel katmanlarının nasıl kullanılabileceğine dair örnekler sunmaktadır. Ekosistemler ve hastalık modellemesi. “Hücre Farklılaşması” bölümündeki immünofloresan görüntüler, bağırsak çipinde oluşturulan 3 boyutlu Caco-2 epitel tabakasında çekirdekleri, F-aktini ve MUC2'yi göstermektedir. MUC2 sinyallemesi, goblet hücrelerinde ve mukoza yüzeylerinden salgılanan mukusta mevcuttur. Bağırsak Fizyolojisi bölümündeki floresan görüntüler, floresan buğday tohumu aglutinin kullanılarak siyalik asit ve N-asetilglukozamin kalıntıları için boyama yapılarak üretilen mukusu göstermektedir. “Konak-Mikrop Ortak Kültürleri” bölümündeki üst üste binen iki görüntü, bir çip üzerindeki bağırsakta temsili konak-mikrobiyom ortak kültürlerini göstermektedir. Sol panel, yeşil floresan protein (GFP) ifade eden E. coli'nin mikro mühendislik ürünü 3 boyutlu Caco-2 epitel hücreleriyle ortak kültürünü göstermektedir. Sağ panel, 3 boyutlu Caco-2 epitel hücreleriyle ortak kültüre alınan GFP E. coli'nin lokalizasyonunu ve ardından immünofloresan boyamayı göstermektedir. F-aktin (kırmızı) ve çekirdekler (mavi) ile. Hastalık modellemesi, bakteriyel antijenler (örneğin, lipopolisakkarit, LPS) ve bağışıklık hücreleri (örneğin, PBMC; yeşil) ile fizyolojik zorlama altında bağırsak iltihabı çiplerinde sağlıklı ve sızıntılı bağırsak arasındaki farkı göstermektedir. 3 boyutlu bir epitel tabakası oluşturmak için Caco-2 hücreleri kültüre edilmiştir. Ölçek çubuğu, 50 µm. Alt satırdaki görüntüler: “Hücrelerin farklılaşması” referans 2'den izin alınarak uyarlanmıştır. Oxford University Press; Ref. 5'ten izin alınarak yeniden üretilmiştir. NAS; “Konak-Mikrop Ortak Kültürü” referans 3'ten izin alınarak uyarlanmıştır. NAS; “Hastalık Modellemesi” referans 5'ten izin alınarak uyarlanmıştır. NAS.
Hem bağırsak-çip hem de hibrit çipler, silikon kalıplardan yumuşak litografi1,44 ile çıkarılan ve SU-8 ile desenlenen PDMS replikaları kullanılarak üretilmiştir. Her çipteki mikrokanalların tasarımı, kayma gerilimi ve hidrodinamik basınç1,4,12 gibi hidrodinamik faktörler dikkate alınarak belirlenir. İki yan yana paralel düz mikrokanaldan oluşan orijinal bağırsak-çip tasarımı (Genişletilmiş Veri Şekil 1a), kültürlenmiş hücrelerin artan sıvı kalış süresini, doğrusal olmayan akış modellerini ve çok eksenli deformasyonunu indüklemek için bir çift kavisli mikrokanal içeren karmaşık bir bağırsak-çipe (Genişletilmiş Veri Şekil 1b) dönüşmüştür (Şekil 2a–f) 12. Daha karmaşık bağırsak biyomekaniğinin yeniden oluşturulması gerektiğinde, karmaşık bağırsak-çip tasarımları seçilebilir. Kıvrımlı Bağırsak-Çip'in de benzer bir zaman diliminde ve benzer bir derecede 3D morfojenezini güçlü bir şekilde indüklediğini gösterdik. Kültürlenen hücre tipinden bağımsız olarak, orijinal Bağırsak Çipi ile karşılaştırıldığında epitelyal büyüme gözlemlenmiştir. Bu nedenle, 3 boyutlu morfojenez indüklemek için, doğrusal ve karmaşık çip üzerindeki bağırsak tasarımları birbirinin yerine kullanılabilir. SU-8 desenleriyle silikon kalıplar üzerinde kürlenmiş PDMS replikaları, kalıptan çıkarıldıktan sonra negatif özellikler sağlamıştır (Şekil 2a). Çip üzerinde bağırsak üretmek için, hazırlanan üst PDMS katmanı, gözenekli bir PDMS filmine sırayla bağlanmış ve daha sonra bir korona işlemcisi kullanılarak geri dönüşümsüz bağlama yoluyla alt PDMS katmanıyla hizalanmıştır (Şekil 2b-f). Hibrit çipler üretmek için, kürlenmiş PDMS replikaları, Transwell ek parçalarını barındırabilen tek kanallı mikroakışkan cihazlar oluşturmak üzere cam slaytlara bağlanmıştır (Şekil 2h ve Genişletilmiş Veri Şekil 2). Bağlama işlemi, PDMS replikasının ve camın yüzeylerinin oksijen plazması veya korona işlemi ile işlenmesiyle gerçekleştirilir. Silikon tüpe bağlı mikrofabrikasyon cihazının sterilizasyonundan sonra, cihaz kurulumu kullanıma hazır hale gelmiştir. Bağırsak epitelyumunun 3 boyutlu morfojenezisi (Şekil 2g).
a, SU-8 desenli silikon kalıplardan PDMS parçalarının hazırlanmasının şematik gösterimi. Kürlenmemiş PDMS çözeltisi bir silikon kalıba döküldü (sol), 60 °C'de kürlendi (orta) ve kalıptan çıkarıldı (sağ). Kalıptan çıkarılan PDMS parçalara ayrıldı ve daha sonraki kullanım için temizlendi. b, PDMS üst katmanını hazırlamak için kullanılan silikon kalıbın fotoğrafı. c, PDMS gözenekli membranı üretmek için kullanılan silikon kalıbın fotoğrafı. d, Üst ve alt PDMS bileşenlerinin ve monte edilmiş çip üzerindeki bağırsak cihazının bir dizi fotoğrafı. e, Üst, membran ve alt PDMS bileşenlerinin hizalanmasının şeması. Her katman plazma veya korona işlemiyle geri dönüşümsüz olarak bağlanmıştır. f, Üst üste bindirilmiş kıvrımlı mikrokanallar ve vakum odaları ile üretilmiş çip üzerindeki bağırsak cihazının şeması. g, Mikroakışkan hücre kültürü için çip üzerindeki bağırsak kurulumu. Silikon tüp ve şırınga ile monte edilmiş çip üzerindeki bağırsak, bir Örtücü cam. Çip cihazı, işleme için 150 mm'lik bir Petri kabının kapağına yerleştirildi. Bağlayıcı, silikon tüpü kapatmak için kullanıldı. h, Hibrit çip üretiminin ve hibrit çipler kullanılarak 3 boyutlu morfojenezin görsel anlık görüntüleri. Bağırsak epitel hücrelerinin 2 boyutlu tek tabakalarını kültürlemek için bağımsız olarak hazırlanan Transwell ek parçaları, bağırsak 3 boyutlu morfojenezini indüklemek için hibrit çipe yerleştirildi. Ortam, Transwell ek parçasında oluşturulan hücre tabakasının altındaki mikro kanallardan geçirildi. Ölçek çubuğu, 1 cm. h. Referans 4'ten izin alınarak yeniden basılmıştır. Elsevier.
Bu protokolde, epitel kaynakları olarak Caco-2 hücre hattı ve bağırsak organoidleri kullanılmıştır (Şekil 3a). Her iki hücre tipi de bağımsız olarak kültüre edilmiş (Kutu 2 ve Kutu 5) ve çip üzerindeki bağırsak veya Transwell insertlerinin ECM kaplı mikrokanallarına tohum olarak ekilmiştir. Hücreler konfluent hale geldiğinde (>%95 kaplama), T-şişelerinde rutin olarak kültüre edilen Caco-2 hücreleri (10 ile 50. pasajlar arasında) tripsinleme sıvısı ile ayrıştırılmış hücre süspansiyonları hazırlamak için hasat edilmiştir (Kutu 2). Bağırsak biyopsilerinden veya cerrahi rezeksiyonlardan elde edilen insan bağırsak organoidleri, yapısal mikroortamı desteklemek için 24 kuyucuklu plaklarda Matrigel iskele kubbelerinde kültüre edilmiştir. Kutu 3'te açıklandığı gibi hazırlanan temel morfogenler (Wnt, R-spondin ve Noggin gibi) ve büyüme faktörleri içeren ortam, organoidler ~500 µm'ye ulaşana kadar iki günde bir takviye edilmiştir. Çapı 10 cm'dir. Tamamen gelişmiş organoidler hasat edilir ve bir çip üzerindeki bağırsak veya Transwell insertlerine ekilmek üzere tek hücrelere ayrıştırılır (Kutu 5). Daha önce bildirdiğimiz gibi, hastalık tipine12,13 (örneğin ülseratif kolit, Crohn hastalığı, kolorektal kanser veya normal donör), lezyon bölgesine (örneğin lezyonlu veya lezyonsuz alan) ve sindirim sistemindeki konumuna (örneğin duodenum, jejunum, ileum, çekum, kolon veya rektum) göre farklılaştırılabilir. Kutu 5'te, ince bağırsak organoidlerinden tipik olarak daha yüksek konsantrasyonlarda morfogen gerektiren kolon organoidlerinin (koloidlerin) kültürü için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.
a, Bağırsak çipinde bağırsak morfojenezinin indüksiyonu için iş akışı. Bu protokolde 3 boyutlu morfojenezin gösterilmesi için Caco-2 insan bağırsak epiteli ve bağırsak organoidleri kullanılmıştır. İzole edilen epitel hücreleri, hazırlanan bağırsak-çip cihazına ekilmiştir (çip hazırlığı). Hücreler 0. günde (D0) PDMS gözenekli membrana ekildikten (ekildi) ve bağlandıktan (bağlandı) sonra, apikal (AP) akış başlatılır ve ilk 2 gün boyunca sürdürülür (akış, AP, D0-D2). Tam bir 2 boyutlu tek tabaka oluştuğunda, döngüsel germe hareketleriyle birlikte bazal (BL) akış da başlatılır (germe, akış, AP ve BL). Bağırsak 3 boyutlu morfojenez, mikroakışkan kültürün 5. gününden sonra kendiliğinden meydana gelmiştir (morfojenez, D5). Faz kontrast görüntüleri, her deneysel adımda veya zaman noktasında Caco-2 hücrelerinin temsili morfolojisini göstermektedir (çubuk grafik, 100 µm). a, Bağırsak morfojenezinin karşılık gelen basamaklarını gösteren şematik diyagramlar (sağ üst). Şemadaki kesikli oklar sıvı akışının yönünü göstermektedir. b, Oluşturulan 3D Caco-2 epitelinin yüzey topolojisini gösteren SEM görüntüsü (sol). Büyütülmüş alanı vurgulayan ek görüntü (beyaz kesikli kutu), 3D Caco-2 katmanında yenilenmiş mikrovillüleri göstermektedir (sağ). c, Oluşturulan Caco-2 3D'nin yatay ön görünümü, F-aktin (yeşil) ve çekirdekler (mavi) ile etiketlenmiş sürekli fırça kenarı zarları. Bağırsak çiplerindeki epitel hücrelerinin immünofloresan konfokal görüntülemesi. Orta şemaya işaret eden oklar, her konfokal görünüm için odak düzleminin konumunu göstermektedir. d, 3, 7, 9, 11 ve 13. günlerde faz kontrast mikroskopi ile elde edilen çip üzerinde kültürlenen organoidlerdeki morfolojik değişikliklerin zaman seyri. Ek görüntü (sağ üst) Sağlanan görüntünün yüksek büyütmesini gösterir.e, 7. günde alınan dilimde bağırsakta oluşturulan organoid 3D epitelyumun DIC fotomikrografı.f, Sırasıyla 3 gün boyunca bağırsak çiplerinde yetiştirilen kök hücreler (LGR5; magenta), goblet hücreleri (MUC2; yeşil), F-aktin (gri) ve çekirdekler (siyan) için işaretleyicileri gösteren üst üste bindirilmiş immünofloresans görüntüleri (Solda) ve epitel tabakasındaki 13 günlük (ortada) organoidler. Ayrıca, MUC2 sinyallemesi olmadan LGR5 sinyallemesini vurgulayan Genişletilmiş Veri Şekil 3'e bakınız. Kültürün 13. gününde plazma zarının CellMask boyası ile boyanmasıyla bir çip üzerinde oluşturulan 3D organoid epitelyumun epitel mikro yapısını (sağda) gösteren floresans görüntüleri. Ölçek çubuğu aksi belirtilmedikçe 50 μm'dir.b Referans 2'den izin alınarak yeniden basılmıştır. Oxford University Press; c Referans 2'den izin alınarak uyarlanmıştır. Oxford University Press; e ve f, referans yoluyla izin alınarak uyarlanmıştır.12 Creative Commons CC BY 4.0 Lisansı altında.
Çip üzerindeki bağırsakta, başarılı bir ECM kaplaması için PDMS gözenekli membranın hidrofobik yüzeyinin değiştirilmesi gereklidir. Bu protokolde, PDMS membranların hidrofobikliğini değiştirmek için iki farklı yöntem uyguluyoruz. Caco-2 hücrelerinin kültürü için, sadece UV/ozon işlemi ile yüzey aktivasyonu, PDMS yüzeyinin hidrofobikliğini azaltmak, ECM'yi kaplamak ve Caco-2 hücrelerini PDMS membrana bağlamak için yeterliydi. Bununla birlikte, organoid epitelin mikroakışkan kültürü, PDMS mikrokanallarına sırasıyla polietilenimin (PEI) ve glutaraldehit uygulayarak ECM proteinlerinin verimli bir şekilde biriktirilmesini sağlamak için kimyasal bazlı yüzey fonksiyonelleştirmesi gerektirir. Yüzey modifikasyonundan sonra, ECM proteinleri fonksiyonelleştirilmiş PDMS yüzeyini kaplayacak şekilde biriktirildi ve daha sonra izole edilmiş organoid epitele yerleştirildi. Hücreler bağlandıktan sonra, mikroakışkan hücre kültürü, hücreler tam bir tek tabaka oluşturana kadar sadece ortamın üst mikrokanala akıtılmasıyla başlar, alt mikrokanal ise statik kalır. Bu optimize edilmiş yüzey aktivasyonu ve ECM kaplama yöntemi, organoid epitelyumun PDMS yüzeyine tutunmasını ve 3 boyutlu morfojenezin oluşmasını sağlar.
Transwell kültürleri, hücre ekiminden önce ECM kaplaması gerektirir; ancak Transwell kültürleri, gözenekli insertlerin yüzeyini aktive etmek için karmaşık ön işlem adımları gerektirmez. Transwell insertlerinde Caco-2 hücrelerinin yetiştirilmesi için, gözenekli insertler üzerindeki ECM kaplaması, ayrıştırılmış Caco-2 hücrelerinin yapışmasını (<1 saat) ve sıkı bağlantı bariyeri oluşumunu (<1-2 gün) hızlandırır. Transwell insertlerinde organoid kültürü için, izole edilmiş organoidler ECM kaplı insertlere ekilir, membran yüzeyine yapışır (<3 saat) ve organoidler bariyer bütünlüğüne sahip tam bir tek tabaka oluşturana kadar muhafaza edilir. Transwell kültürleri, hibrit çipler kullanılmadan 24 kuyucuklu plakalarda gerçekleştirilir.
İn vitro 3 boyutlu morfojenez, yerleşik bir epitel tabakasının bazalateral tarafına sıvı akışı uygulanarak başlatılabilir. Çip üzerindeki bağırsakta, epitel morfojenez, ortam üst ve alt mikrokanallara perfüze edildiğinde başladı (Şekil 3a). Daha önce açıklandığı gibi, yönlü salgılanan morfojen inhibitörlerinin sürekli olarak uzaklaştırılması için alt (bazalateral) bölmeye sıvı akışı sağlamak çok önemlidir. Gözenekli membranlara bağlı hücrelere yeterli besin ve serum sağlamak ve lümenel kayma gerilimi oluşturmak için, çip üzerindeki bağırsakta genellikle çift akış uygularız. Hibrit çiplerde, epitel monokatmanları içeren Transwell insertleri hibrit çiplere yerleştirildi. Daha sonra, ortam, mikrokanal yoluyla gözenekli Transwell insertinin bazalateral tarafının altına uygulandı. Bağırsak morfojenez, her iki kültür platformunda da bazalateral akışın başlatılmasından 3-5 gün sonra meydana geldi.
Mikro mühendislik ürünü 3 boyutlu epitel tabakalarının morfolojik özellikleri, faz kontrast mikroskopi, diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi, SEM veya immünofloresan konfokal mikroskopi dahil olmak üzere çeşitli görüntüleme yöntemleri uygulanarak analiz edilebilir (Şekil 3 ve 4). Faz kontrast veya DIC görüntüleme, 3 boyutlu epitel tabakalarının şeklini ve çıkıntılarını izlemek için kültür sırasında herhangi bir zamanda kolayca gerçekleştirilebilir. PDMS ve polyester filmlerin optik şeffaflığı nedeniyle, hem bağırsak-çip üzerinde hem de hibrit çip platformları, cihazın kesilmesi veya sökülmesine gerek kalmadan gerçek zamanlı yerinde görüntüleme sağlayabilir. İmmünofloresans görüntüleme yapılırken (Şekil 1, 3c, f ve 4b, c), hücreler tipik olarak sırasıyla %4 (ağırlık/hacim) paraformaldehit (PFA), ardından Triton X-100 ve %2 (ağırlık/hacim) sığır serum albümini (BSA) ile sabitlenir. Hücre tipine bağlı olarak, farklı Sabitleyiciler, geçirgenleştiriciler ve bloke edici maddeler kullanılabilir. Hücre veya bölge belirteçlerini hedefleyen birincil antikorlar, çip üzerinde yerinde hareketsiz hale getirilmiş hücreleri vurgulamak için kullanılır; ardından çekirdeği (örneğin, 4′,6-diamidino-2-fenilen) indol, DAPI) veya F-aktini (örneğin, floresan etiketli falloidin) hedefleyen bir karşı boya ile birlikte ikincil antikorlar kullanılır. Floresans tabanlı canlı görüntüleme, mukus üretimini (Şekil 1, “Hücre farklılaşması” ve “Bağırsak fizyolojisi”), mikrobiyal hücrelerin rastgele kolonizasyonunu (Şekil 1, “Konak-mikrop ortak kültürü”), bağışıklık hücrelerinin toplanmasını (Şekil 1, “Hastalık Modellemesi”) veya 3 boyutlu epitel morfolojisinin konturlarını (Şekil 3c,f ve 4b,c) tespit etmek için yerinde de gerçekleştirilebilir. Çip üzerindeki bağırsağı, üst katmanı alt katmandan ayırmak için modifiye ederken Referansta açıklandığı gibi mikrokanal tabakası. Şekil 2'de gösterildiği gibi, 3 boyutlu epitel morfolojisi ve apikal fırça kenarındaki mikrovillüler SEM ile görüntülenebilir (Şekil 3b). Farklılaşma belirteçlerinin ifadesi, kantitatif PCR5 veya tek hücreli RNA dizilemesi yapılarak değerlendirilebilir. Bu durumda, bağırsak çiplerinde veya hibrit çiplerde yetiştirilen 3 boyutlu epitel hücre tabakaları tripsinleme yoluyla hasat edilir ve daha sonra moleküler veya genetik analiz için kullanılır.
a, Hibrit çipte bağırsak morfojenezinin indüksiyonu için iş akışı. Bu protokolde, hibrit çip platformunda 3 boyutlu morfojenezin gösterilmesi için Caco-2 ve bağırsak organoidleri kullanılmıştır. Ayrıştırılmış epitel hücreleri, hazırlanmış Transwell insertlerine ekilmiştir (TW hazırlığı; aşağıdaki şekle bakınız). Hücreler ekildikten (ekildi) ve Transwell insertlerindeki polyester membranlara yapıştıktan sonra, tüm hücreler statik koşullar altında kültüre edilmiştir (TW kültürü). 7 gün sonra, 2 boyutlu epitel hücre tabakası içeren tek bir Transwell inserti, bazal akış (Akış, BL) oluşturmak için hibrit bir çipe entegre edilmiştir; bu da nihayetinde 3 boyutlu bir epitel tabakasının (morfojenez) oluşmasına yol açmıştır. Her deneysel adımda veya zaman noktasında normal donörden (C103 hattı) elde edilen insan organ epitel hücrelerinin morfolojik özelliklerini gösteren faz kontrast mikrografları. Üst katmanlardaki şemalar, her adım için deneysel konfigürasyonu göstermektedir. b, Hibrit çipler (sol şema) Farklı Z pozisyonlarında (üst, orta ve alt; sağdaki şemaya ve ilgili noktalı çizgilere bakınız) alınan yukarıdan aşağıya konfokal mikroskopi görüntüleriyle organoid epitel hücrelerinin 3 boyutlu morfojenezine yol açtı. Belirgin morfolojik özellikler gösterdi. F-aktin (siyan), çekirdek (gri).c, Statik Transwell'de (TW; beyaz kesikli kutu içindeki ek) ve hibrit çipte (en büyük tam çekim) kültürlenen organoid kaynaklı epitel hücrelerinin 2 boyutlu ve 3 boyutlu morfolojisini karşılaştıran floresan konfokal mikrografları (3 boyutlu açılı görünüm). Bir çift 2 boyutlu dikey kesit görüntüsü (sağ üst köşedeki ek; "XZ") ayrıca 2 boyutlu ve 3 boyutlu özellikleri göstermektedir. Ölçek çubuğu, 100 µm.c. 4 numaralı referanstan izin alınarak yeniden basılmıştır. Elsevier.
Kontroller, aynı hücrelerin (Caco-2 veya bağırsak organoid epitel hücreleri) geleneksel statik kültür koşulları altında iki boyutlu tek tabakalar halinde kültüre edilmesiyle hazırlanabilir. Özellikle, mikrokanalların sınırlı hacim kapasitesi (yani orijinal bağırsak çip tasarımındaki üst kanalda ~4 µL) nedeniyle besin tükenmesi meydana gelebilir. Bu nedenle, bazal akış uygulamasından önce ve sonra epitel morfolojisi de karşılaştırılabilir.
Yumuşak litografi işlemi temiz bir odada gerçekleştirilmelidir. Çip üzerindeki her katman (üst ve alt katmanlar ve membranlar) ve hibrit çipler için, mikrokanalların yükseklikleri farklı olduğundan, farklı fotomaskeler kullanıldı ve ayrı silikon levhalar üzerine üretildi. Çip üzerindeki bağırsak mikrokanallarının üst ve alt hedef yükseklikleri sırasıyla 500 µm ve 200 µm'dir. Hibrit çipin kanal hedef yüksekliği 200 µm'dir.
3 inçlik silikon plakayı aseton dolu bir kaba koyun. Tabağı 30 saniye boyunca hafifçe döndürün, ardından plakayı havada kurutun. Plakayı IPA dolu bir tabağa aktarın, ardından temizlemek için tabağı 30 saniye döndürün.
Silikon levha yüzeyinden organik kalıntıların uzaklaştırılmasını en üst düzeye çıkarmak için isteğe bağlı olarak piranha çözeltisi (hidrojen peroksit ve konsantre sülfürik asit karışımı, 1:3 (hacim/hacim)) kullanılabilir.
Piranha çözeltisi son derece aşındırıcıdır ve ısı üretir. Ek güvenlik önlemleri gereklidir. Atık bertarafı için, çözeltinin soğumasını bekleyin ve temiz, kuru bir atık kabına aktarın. İkincil kaplar kullanın ve atık kaplarını uygun şekilde etiketleyin. Daha ayrıntılı prosedürler için lütfen tesisin güvenlik yönergelerini izleyin.
Yonga levhalarını 200 °C'lik bir ısıtma plakasına 10 dakika süreyle yerleştirerek susuzlaştırın. Susuzlaştırma işleminden sonra, soğuması için levha havada beş kez çalkalayın.
Temizlenmiş silikon levhanın ortasına yaklaşık 10 g SU-8 2100 fotorezist dökün. Fotorezisti levha üzerine eşit şekilde yaymak için cımbız kullanın. Fotorezistin yapışkanlığını azaltmak ve yayılmasını kolaylaştırmak için levhayı ara sıra 65°C'lik bir ısıtma plakasına yerleştirin. Levhayı doğrudan ısıtma plakasına koymayın.
SU-8, spin kaplama yöntemiyle gofret üzerine eşit olarak dağıtıldı. SU-8'in 5-10 saniye boyunca 500 rpm'de 100 rpm/sn ivmeyle ilerlemesi için gelen dönüşünü programlayın. Ana dönüşü 200 µm kalınlıkta desenleme için 1500 rpm'ye ayarlayın veya 250 µm kalınlık elde edin (çip üzerindeki bağırsak üst katmanı için 500 µm yükseklik elde etmek için; aşağıdaki "Kritik adımlar" bölümüne bakın) 300 rpm/sn ivmeyle 30 saniye boyunca 1200 rpm'de ayarlayın.
Ana döndürme hızı, silikon levha üzerindeki SU-8 deseninin hedef kalınlığına göre ayarlanabilir.
Çip üzerindeki bağırsak üst katmanı için 500 µm yüksekliğinde SU-8 desenleri oluşturmak amacıyla, bu Kutu'nun (7. ve 8. adımlar) döndürerek kaplama ve yumuşak fırınlama adımları, 250 µm kalınlığında iki SU-8 katmanı üretmek için sırayla tekrarlandı (bkz. 9. adım). Bu katmanlar, bu kutunun 12. adımında UV ışınlamasıyla üst üste bindirilerek 500 µm yüksekliğinde bir katman oluşturulabilir.
SU-8 kaplı gofretleri, dikkatlice 65 °C'lik bir ısıtma plakasına yerleştirerek 5 dakika boyunca hafifçe pişirin, ardından ayarı 95 °C'ye yükseltin ve 40 dakika daha bekletin.
Üst mikrokanalda SU-8 deseninin 500 μm yüksekliğe ulaşması için, 250 μm kalınlığında iki SU-8 katmanı oluşturmak üzere 7. ve 8. adımları tekrarlayın.
UV Maske Hizalama Cihazını kullanarak, üreticinin talimatlarına göre bir lamba testi gerçekleştirin ve plakanın pozlama süresini hesaplayın. (Pozlama süresi, ms) = (pozlama dozu, mJ/cm2) / (lamba gücü, mW/cm2).
Pozlama süresini belirledikten sonra, fotomaskeyi UV maske hizalayıcısının maske tutucusuna yerleştirin ve fotomaskeyi SU-8 kaplı gofretin üzerine koyun.
UV dağılımını en aza indirmek için fotomaskenin baskılı yüzeyini doğrudan silikon levhanın SU-8 kaplı tarafına yerleştirin.
SU-8 kaplı gofret ve fotomaskeyi, önceden belirlenmiş pozlama süresi boyunca (bu kutunun 10. adımına bakın) dikey olarak 260 mJ/cm2 UV ışığına maruz bırakın.
UV ışınlamasından sonra, SU-8 kaplı silikon levhalar, 200 µm yüksekliğinde desenler oluşturmak için her bir ısıtma plakasında 65°C'de 5 dakika ve 95°C'de 15 dakika süreyle fırınlandı. 95°C'deki fırınlama sonrası süreyi 30 dakikaya uzatarak 500 µm yüksekliğinde desenler oluşturabilirsiniz.
Geliştirici cam bir kaba dökülür ve pişirilmiş gofret kaba yerleştirilir. SU-8 geliştiricinin hacmi, cam plakanın boyutuna bağlı olarak değişebilir. Pozlanmamış SU-8'i tamamen çıkarmak için yeterli miktarda SU-8 geliştirici kullandığınızdan emin olun. Örneğin, 1 L kapasiteli 150 mm çaplı bir cam kap kullanırken, yaklaşık 300 mL SU-8 geliştirici kullanın. Kalıbı ara sıra hafifçe döndürerek 25 dakika boyunca geliştirin.
Geliştirilen kalıbı yaklaşık 10 ml taze geliştirici ile durulayın, ardından pipet kullanarak çözeltiyi püskürterek IPA ekleyin.
Yonga levhasını plazma temizleyiciye yerleştirin ve 1,5 dakika boyunca oksijen plazmasına (atmosferik gaz, hedef basınç 1 × 10−5 Torr, güç 125 W) maruz bırakın.
Yonga levhasını içine cam bir slayt yerleştirilmiş vakumlu kurutucuya koyun. Yonga levhaları ve slaytlar yan yana yerleştirilebilir. Vakumlu kurutucu bir plaka ile birkaç katmana bölünmüşse, slaytları alt bölmeye, yonga levhalarını üst bölmeye yerleştirin. Bir cam slayt üzerine 100 μL trikloro(1H, 1H, 2H, 2H-perflorooktil)silan çözeltisi damlatın ve silanizasyon için vakum uygulayın.
Dondurulmuş Caco-2 hücreleri içeren bir şişeyi 37°C'lik su banyosunda çözün, ardından çözülmüş hücreleri 15 mL 37°C'ye önceden ısıtılmış Caco-2 ortamı içeren bir T75 şişesine aktarın.
Yaklaşık %90 yoğunluğa ulaşmış Caco-2 hücrelerini pasajlamak için öncelikle Caco-2 ortamını, PBS'yi ve %0,25 tripsin/1 mM EDTA'yı 37°C'lik su banyosunda ısıtın.
Ortamı vakum aspirasyonu ile aspire edin. Hücreleri, vakum aspirasyonunu tekrarlayarak ve taze PBS ekleyerek 5 mL ılık PBS ile iki kez yıkayın.