Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рақмет. Сіз пайдаланып отырған браузер нұсқасында CSS қолдауы шектеулі. Ең жақсы тәжірибе алу үшін жаңартылған браузерді пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer бағдарламасында үйлесімділік режимін өшіріңіз). Сонымен қатар, үздіксіз қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильдерсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Адам ішегінің морфогенезі 3D эпителий микроархитектурасы мен кеңістіктік ұйымының крипто-виллаларының ерекшеліктерін белгілейді. Бұл бірегей құрылым базальды криптадағы бағаналы жасуша нишасын экзогендік микробтық антигендерден және олардың метаболиттерінен қорғау арқылы ішек гомеостазын сақтау үшін қажет. Сонымен қатар, ішек виллалары мен бөлінетін шырыш ішек шырышты қабығының бетінде қорғаныс тосқауылы бар функционалды түрде дифференциалданған эпителий жасушаларын ұсынады. Сондықтан, 3D эпителий құрылымдарын қайта жасау in vitro ішек модельдерін құру үшін өте маңызды. Атап айтқанда, органикалық миметикалық ішек-чип физиологиялық функциялары мен биомеханикасын жақсарта отырып, ішек эпителийінің өздігінен 3D морфогенезін тудыруы мүмкін. Мұнда біз микрофлюидті чипте де, Трансвелл ендірілген гибридті чипте де ішекте ішек морфогенезін сенімді түрде индукциялау үшін қайталанатын хаттаманы ұсынамыз. Біз құрылғыны жасаудың, Caco-2 немесе ішек органоидты эпителий жасушаларын дәстүрлі жағдайларда, сондай-ақ микрофлюидті платформада өсірудің, 3D морфогенезді индукциялаудың және бірнеше бейнелеу әдістерін қолдана отырып, қалыптасқан 3D эпителийлерін сипаттаудың егжей-тегжейлі әдістерін сипаттаймыз. Бұл хаттама 5 күн бойы базолатеральды сұйықтық ағынын басқару арқылы ішектің функционалды микроархитектурасын қалпына келтіруге қол жеткізеді. Біздің in vitro морфогенез әдісіміз физиологиялық тұрғыдан маңызды ығысу кернеуін және механикалық қозғалысты қолданады және күрделі жасушалық инженерияны немесе манипуляцияны қажет етпейді, бұл басқа қолданыстағы әдістерден асып түсуі мүмкін. Біз ұсынған хаттама биомедициналық зерттеулер қауымдастығы үшін кең ауқымды салдарға әкелуі мүмкін деп болжаймыз, бұл биомедициналық, клиникалық және фармацевтикалық қолдану үшін in vitro 3D ішек эпителий қабаттарын қалпына келтіру әдісін ұсынады.
Тәжірибелер көрсеткендей, gut-on-a-chip1,2,3,4,5 немесе екі қабатты микрофлюидтік құрылғыларда6,7 өсірілген ішек эпителийінің Caco-2 жасушалары негізгі механизмді нақты түсінбестен in vitro жағдайында өздігінен 3D морфогенезге ұшырауы мүмкін. Жақында жүргізілген зерттеуімізде біз базолатеральды түрде бөлінетін морфоген антагонистерін өсіру құрылғыларынан алып тастау in vitro жағдайында 3D эпителий морфогенезін индукциялау үшін қажет және жеткілікті екенін анықтадық, бұл Caco-2 және пациенттерден алынған ішек органоидтарымен дәлелденді. Эпителий жасушалары тексерілді. Бұл зерттеуде біз күшті Wnt антагонисті Dickkopf-1 (DKK-1) жасуша өндірісі мен концентрациясының таралуына, Трансвелл кірістірулерін қамтитын, «Гибридті чип» деп аталатын, gut-on-a-chip және модификацияланған микрофлюидтік құрылғыларда ерекше назар аудардық. Біз экзогенді Wnt антагонисттерін (мысалы, DKK-1, Wnt репрессоры 1, бөлінетін бұйраланған ақуыз 1 немесе Soggy-1) чиптегі ішекке қосу морфогенезді тежейтінін немесе алдын ала құрылымдалған 3D эпителий қабатын бұзатынын көрсетеміз, бұл өсіру кезіндегі антагонистік стресстің in vitro ішек морфогенезіне жауапты екенін көрсетеді. Сондықтан, эпителий интерфейсінде сенімді морфогенезге қол жеткізудің практикалық тәсілі - базолярлық бөлімдегі Wnt антагонистерінің деңгейін белсенді шаю (мысалы, gut-on-a-chip немесе гибридті-on-a-chip платформаларында) немесе диффузия арқылы алып тастау немесе минималды түрде ұстап тұру. Базолярлық орта (мысалы, Трансвелл кірістірулерінен ұңғымалардағы үлкен базолярлық резервуарларға).
Бұл хаттамада біз ішек эпителий жасушаларын полидиметилсилоксан (PDMS) негізіндегі кеуекті мембраналарда (6A, 7A, 8, 9 қадамдар) немесе Transwell кірістірулерінің полиэфир мембраналарында (6B, 7B, 8, 9 қадамдар) өсіру және in vitro 3D морфогенезін индукциялау үшін ішек-чип микроқұрылғыларын және Transwell кірістіретін гибридті чиптерді (1-5 қадамдар) жасаудың егжей-тегжейлі әдісін ұсынамыз (10 қадам). Сондай-ақ, біз бірнеше бейнелеу әдістерін қолдану арқылы тінге тән гистогенез бен тегі тәуелді жасушалық дифференциацияны көрсететін жасушалық және молекулалық ерекшеліктерді анықтадық (11-24 қадамдар). Біз Caco-2 немесе ішек органоидтары сияқты адамның ішек эпителий жасушаларын пайдаланып, морфогенезді екі өсіру форматында индукциялаймыз, техникалық мәліметтері кеуекті мембраналардың беткі модификациясын, 2D моноқабаттарды жасауды және ішек биохимиялық және биомеханикалық микроортаны көбейтуді қамтиды. in vitro. 2D эпителий моноқабаттарынан 3D морфогенезін индукциялау үшін біз морфоген антагонистерін алып тастадық. ортаны дақылдың базолярлық бөліміне ағызып, екі өсірілген форманы да. Соңында, біз морфогенге тәуелді эпителийдің өсуін, бойлық иесі-микробиом бірлескен дақылдарын, патогендік инфекцияны, қабыну жарақатын, эпителий тосқауылының дисфункциясын және пробиотикке негізделген терапияны модельдеу үшін пайдаланылуы мүмкін қалпына келетін 3D эпителий қабатының пайдалылығын көрсетеміз. Мысал. Әсер етулер.
Біздің хаттамамыз негізгі (мысалы, ішек шырышты қабығының биологиясы, бағаналы жасуша биологиясы және даму биологиясы) және қолданбалы зерттеулер (мысалы, клиникаға дейінгі дәрілік заттарды тестілеу, ауруларды модельдеу, тіндерді инженериялау және гастроэнтерология) саласындағы кең ауқымды ғалымдар үшін пайдалы болуы мүмкін. Ішек эпителийінің in vitro 3D морфогенезін тудыратын хаттамамыздың қайталанымдылығы мен сенімділігіне байланысты біз техникалық стратегиямызды ішектің дамуы, регенерациясы немесе гомеостаз кезінде жасушалық сигнал беру динамикасын зерттейтін аудиторияға таратуға болады деп болжаймыз. Сонымен қатар, біздің хаттамамыз Норовирус 8, Ауыр жедел респираторлық синдром коронавирусы 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 немесе Vibrio cholerae сияқты әртүрлі жұқпалы агенттер әсерінен болатын инфекцияны анықтау үшін пайдалы. Ауру патологиясы мен патогенезі бойынша аудиториялар да пайдалы. Чиптегі ішек микрофизиология жүйесін пайдалану бойлық бірлескен дақылдандыруға 10 және кейіннен асқазан-ішек жолындағы (АІЖ) 11 иесінің қорғанысын, иммундық реакцияларды және патогенге байланысты зақымдануды қалпына келтіруді бағалауға мүмкіндік береді. Ағып жатқан ішек синдромымен, целиакия ауруымен, Крон ауруымен, ойық жаралы колитпен, пухитпен немесе тітіркенген ішек синдромымен байланысты басқа АІЖ бұзылыстарын пациенттің 3D ішек эпителий қабаттарын пайдаланып 3D ішек эпителий қабаттары дайындалған кезде модельдеуге болады, бұл ауруларға вилла атрофиясы, криптаның қысқаруы, шырышты қабықтың зақымдануы немесе эпителий тосқауылының бұзылуы жатады. Биопсия немесе бағаналы жасушалардан алынған ішек органоидтары12,13. Ауру ортасының күрделілігінің жоғарырақ моделін жақсырақ модельдеу үшін оқырмандар 3D ішек вилла-крипта микроархитектураларын қамтитын модельдерге пациенттің перифериялық қанының мононуклеарлы жасушалары (ПҚМЖ) сияқты ауруға қатысты жасуша түрлерін қосуды қарастыруы мүмкін. тінге тән иммундық жасушалар, 5.
3D эпителий микроқұрылымын секциялау процесінсіз бекітуге және визуализациялауға болатындықтан, кеңістіктік транскриптомика және жоғары ажыратымдылықтағы немесе аса ажыратымдылықтағы бейнелеумен жұмыс істейтін көрермендер эпителий қуыстарындағы гендер мен ақуыздардың кеңістіктік-уақыттық динамикасын картаға түсіруге қызығушылық танытуы мүмкін. Технологияға қызығушылық танытады. Микробтық немесе иммундық тітіркендіргіштерге жауап. Сонымен қатар, ішек гомеостазын үйлестіретін бойлық хост-микробиом айқастығы 10, 14 3D ішек шырышты қабатында әртүрлі микробтық түрлерді, микробтық қауымдастықтарды немесе нәжіс микробиотасын, әсіресе чиптегі ішекте бірлесіп өсіру арқылы орнатылуы мүмкін. платформада. Бұл тәсіл, әсіресе, шырышты қабық иммунологиясын, гастроэнтерологияны, адам микробиомасын, культуромиканы және клиникалық микробиологияны зерттейтін аудитория үшін бұрын өсірілмеген ішек микробиотасын зертханада өсіруге тырысатын аудитория үшін тартымды. Егер біздің in vitro морфогенез хаттамасын масштабталатын культура форматтарына, мысалы, базолярлық бөлімдерді үздіксіз толтыратын 24, 96 немесе 384 ұңғыма пластиналарындағы көпұшықты кірістірулерге бейімдеуге болатын болса, хаттаманы тамақ өнеркәсібі үшін фармацевтикалық, биомедициналық немесе жоғары өнімді скринингтік немесе валидация платформаларын әзірлейтіндерге де таратуға болады. Принциптің дәлелі ретінде біз жақында 24 ұңғымалы пластина форматына масштабталатын мультиплексті жоғары өнімді морфогенез жүйесінің орындылығын көрсеттік. Сонымен қатар, чиптегі бірнеше орган өнімдері коммерцияландырылды16,17,18. Сондықтан, біздің in vitro морфогенез әдісімізді валидациялауды жеделдетуге және көптеген зерттеу зертханалары, өнеркәсіп немесе үкімет және реттеуші органдар дәрі-дәрмектерді сынау үшін in vitro ішек морфогенезінің жасушалық қайта бағдарламалауын түсіну үшін қабылдауға болады. немесе биотерапиялық дәрілік заттардың сіңуі мен тасымалдануы ішек морфогенезі процесінің қайталануын бағалау үшін 3D ішек суррогаттарын немесе арнайы немесе коммерциялық орган-чиптегі модельдерді пайдалану арқылы бағаланды.
Ішек эпителийінің морфогенезін зерттеу үшін адамға қатысты шектеулі эксперименттік модельдер қолданылды, бұл негізінен in vitro 3D морфогенезін индукциялау үшін іске асырылатын хаттамалардың болмауына байланысты. Шын мәнінде, ішек морфогенезі туралы қазіргі білімнің көп бөлігі жануарларды зерттеуге негізделген (мысалы, зебра балығы20, тышқандар21 немесе тауықтар22). Дегенмен, олар еңбекті және шығындарды көп қажет етеді, этикалық тұрғыдан күмәнді болуы мүмкін және ең бастысы, адамның даму процестерін дәл анықтамайды. Бұл модельдердің көп жақты масштабталатын түрде сынақтан өткізу мүмкіндігі де өте шектеулі. Сондықтан, in vitro 3D тін құрылымдарын қалпына келтіру хаттамамыз in vivo жануарлар модельдерінен, сондай-ақ басқа да дәстүрлі статикалық 2D жасуша дақылдарының модельдерінен асып түседі. Бұрын сипатталғандай, 3D эпителий құрылымдарын пайдалану бізге әртүрлі шырышты немесе иммундық тітіркендіргіштерге жауап ретінде криптовиллалар осінде дифференциалданған жасушалардың кеңістіктік локализациясын зерттеуге мүмкіндік берді. 3D эпителий қабаттары микробтық жасушалардың кеңістіктік нишаларды қалыптастыру үшін қалай бәсекелесетінін және иесінің факторларына (мысалы, ішкі және сыртқы шырышты қабаттар, секреция) жауап ретінде экологиялық эволюцияны зерттеуге мүмкіндік бере алады. IgA және микробқа қарсы пептидтер). Сонымен қатар, 3D эпителий морфологиясы ішек микробиотасы өз қауымдастықтарын қалай құратынын және базальды крипталардағы жасушалық ұйым мен бағаналы жасуша нишаларын қалыптастыратын микробтық метаболиттерді (мысалы, қысқа тізбекті май қышқылдары) синергетикалық түрде қалай өндіретінін түсінуге мүмкіндік береді. Бұл ерекшеліктерді тек 3D эпителий қабаттары in vitro қалыптасқан кезде ғана көрсетуге болады.
Біздің 3D ішек эпителий құрылымдарын жасау әдісімізден басқа, бірнеше in vitro әдістері бар. Ішек органоидты дақылы - бұл белгілі бір морфогендік жағдайларда ішек бағаналы жасушаларын өсіруге негізделген заманауи тін инженериясының әдісі23,24,25. Дегенмен, тасымалдау талдауы немесе иесі-микробиом бірлескен дақылдары үшін 3D органоидты модельдерді пайдалану көбінесе қиындық тудырады, себебі ішек қуысы органоидтың ішінде орналасқан және сондықтан микробтық жасушалар немесе экзогенді антигендер сияқты люмендік компоненттерді енгізу шектеулі. Органоидты люмендерге қол жеткізуді микроинжекторды қолдану арқылы жақсартуға болады26,27, бірақ бұл әдіс инвазивті және көп еңбекті қажет етеді және орындау үшін арнайы білімді қажет етеді. Сонымен қатар, статикалық жағдайларда гидрогельді тіректерінде сақталатын дәстүрлі органоидты дақылдар белсенді in vivo биомеханикасын дәл көрсетпейді.
Бірнеше зерттеу топтары қолданатын басқа тәсілдер гель бетінде оқшауланған адам ішек жасушаларын өсіру арқылы ішек эпителий құрылымын имитациялау үшін алдын ала құрылымдалған 3D гидрогельді каркастарды пайдаланады. 3D басып шығарылған, микрофрезерленген немесе литографиялық түрде жасалған қалыптарды пайдаланып гидрогельді каркастарды жасаңыз. Бұл әдіс оқшауланған эпителий жасушаларының in vitro физиологиялық тұрғыдан маңызды морфогендік градиенттерімен өздігінен ұйымдастырылған орналасуын көрсетеді, каркасқа стромальды жасушаларды қосу арқылы жоғары аспект қатынасы бар эпителий құрылымын және строма-эпителий айқастығын орнатады. Дегенмен, алдын ала құрылымдалған каркастардың табиғаты өздігінен морфогенетикалық процестің өзін көрсетуіне кедергі келтіруі мүмкін. Бұл модельдер сонымен қатар динамикалық люминальды немесе интерстициалды ағынды қамтамасыз етпейді, ішек жасушалары морфогенезден өтуі және физиологиялық функцияны алуы үшін қажет сұйықтықтың ығысу кернеуі жоқ. Жақында жүргізілген тағы бір зерттеуде микрофлюидті платформадағы гидрогельді каркастарды және лазерлік ою әдістерін қолдана отырып, ішек эпителий құрылымдарын үлгілеуді қолданды. Тышқанның ішек органоидтары ішек түтікшелік құрылымдарын қалыптастыру үшін оюланған үлгілерді ұстанады, ал люминальды сұйықтық ағыны болуы мүмкін. микрофлюидика модулін пайдаланып қайта сипатталған. Дегенмен, бұл модель өздігінен жүретін морфогенетикалық процестерді көрсетпейді және ішек механобиологиялық қозғалыстарын қамтымайды. Сол топтың 3D басып шығару әдістері өздігінен жүретін морфогенетикалық процестері бар миниатюралық ішек түтікшелерін жасауға мүмкіндік берді. Түтік ішіндегі әртүрлі ішек сегменттерінің күрделі жасалуына қарамастан, бұл модельде люменальды сұйықтық ағыны және механикалық деформация да жоқ. Сонымен қатар, модельдің жұмыс істеу қабілеті шектеулі болуы мүмкін, әсіресе биобасып шығару процесі аяқталғаннан кейін, эксперименттік жағдайларды бұзғаннан кейін немесе жасушааралық өзара әрекеттесулерді бұзғаннан кейін. Оның орнына, біздің ұсынылған хаттама ішектің өздігінен жүретін морфогенезін, физиологиялық тұрғыдан маңызды ығысу кернеуін, ішек қозғалғыштығын имитациялайтын биомеханиканы, тәуелсіз апикальды және базолярлық бөлімдердің қолжетімділігін және модульдік күрделі биологиялық микроортаны қайта жасауды қамтамасыз етеді. Сондықтан, біздің in vitro 3D морфогенез хаттамасы қолданыстағы әдістердің қиындықтарын жеңу үшін қосымша тәсілді ұсынуы мүмкін.
Біздің хаттама толығымен 3D эпителий морфогенезіне бағытталған, дақылда тек эпителий жасушалары ғана болады және мезенхималық жасушалар, эндотелий жасушалары және иммундық жасушалар сияқты қоршаған жасушалардың басқа түрлері болмайды. Бұрын сипатталғандай, хаттамамыздың негізі енгізілген ортаның базолатеральды жағында бөлінетін морфоген ингибиторларын алып тастау арқылы эпителий морфогенезін индукциялау болып табылады. Біздің ішек-чиптегі және гибрид-чиптегі берік модульдік қасиетіміз толқынды 3D эпителий қабатын қайта жасауға мүмкіндік берсе де, эпителий-мезенхималық өзара әрекеттесулер 33,34, жасушадан тыс матрица (ECM) тұндыру 35 және біздің модельде базальды крипталардағы бағаналы жасуша нишаларын жеткізетін криптовиллалар сияқты қосымша биологиялық күрделіліктер әлі де қарастырылуы керек. Мезенхимадағы стромальды жасушалар (мысалы, фибробласттар) ECM ақуыздарын өндіруде және in vivo ішек морфогенезін реттеуде маңызды рөл атқарады 35,37,38. Біздің модельге мезенхималық жасушаларды қосу морфогенетикалық процесті және жасушаны күшейтті бекіту тиімділігі. Эндотелий қабаты (яғни, капиллярлар немесе лимфа тамырлары) ішек микроортасында молекулалық тасымалдауды реттеуде39 және иммундық жасушаларды тартуда40 маңызды рөл атқарады. Сонымен қатар, тін модельдері көп мүшелі өзара әрекеттесуді көрсету үшін жасалған кезде тін модельдері арасында байланыстырылуы мүмкін тамыр компоненттері алғышарт болып табылады. Сондықтан, эндотелий жасушаларын мүше деңгейіндегі ажыратымдылықпен дәлірек физиологиялық ерекшеліктерді модельдеу үшін қосу қажет болуы мүмкін. Пациенттен алынған иммундық жасушалар ішек ауруын имитациялау аясында туа біткен иммундық реакцияларды, антиген презентациясын, туа біткен бейімделгіш иммундық айқастарды және тінге тән иммунитетті көрсету үшін де маңызды.
Гибридті чиптерді пайдалану ішек-чипке қарағанда қарапайым, себебі құрылғыны орнату қарапайым және Transwell кірістірулерін пайдалану ішек эпителийін масштабтауға мүмкіндік береді. Дегенмен, полиэфир мембраналары бар коммерциялық қолжетімді Transwell кірістірулері серпімді емес және перистальтикалық қозғалыстарды модельдей алмайды. Сонымен қатар, гибридті чипке орналастырылған Transwell кірістіруінің апикальды бөлімі апикальды жағында ығысу кернеуі болмай, қозғалмайтын күйінде қалды. Әрине, апикальды бөлімдегі статикалық қасиеттер гибридті чиптерде ұзақ мерзімді бактериялық бірлескен өсіруге сирек мүмкіндік береді. Гибридті чиптерді пайдаланған кезде Transwell кірістірулерінде 3D морфогенезді сенімді түрде индукциялай алсақ та, физиологиялық тұрғыдан маңызды биомеханика мен апикальды сұйықтық ағынының жетіспеушілігі гибридті чип платформаларының әлеуетті қолданбалар үшін мүмкіндігін шектеуі мүмкін.
Адамның криптовилла осінің толық көлемді реконструкциясы чиптегі ішек және чиптегі гибридті дақылдардағы толық көлемді реконструкциялары толық анықталмаған. Морфогенез эпителий моноқабатынан басталатындықтан, 3D микроархитектуралары міндетті түрде in vivo крипталарға морфологиялық ұқсастық бермейді. Микроинженерлік 3D эпителийдегі базальды крипто доменінің жанындағы көбейетін жасуша популяциясын сипаттағанымызбен, крипта және вилла аймақтары анық бөлінбеген. Чиптегі жоғарғы арналардың жоғарырақ болуы микроинженерлік эпителийдің биіктігінің артуына әкелсе де, максималды биіктік әлі де ~300–400 мкм-мен шектелген. Аш және тоқ ішектердегі адам ішек крипталарының нақты тереңдігі сәйкесінше ~135 мкм және ~400 мкм, ал аш ішек виллаларының биіктігі ~600 мкм41.
Бейнелеу тұрғысынан алғанда, 3D микроархитектураларының in situ супер ажыратымдылықтағы бейнелеуі чиптегі ішекпен шектелуі мүмкін, себебі объектив линзасынан эпителий қабатына дейінгі қажетті жұмыс қашықтығы бірнеше миллиметр шамасында. Бұл мәселені шешу үшін алыстағы объектив қажет болуы мүмкін. Сонымен қатар, бейнелеу үлгісін дайындау үшін жұқа кесінділер жасау PDMS жоғары серпімділігіне байланысты қиын. Сонымен қатар, чиптегі ішектің қабат-қабат микрофабрикациясы әр қабат арасында тұрақты адгезияны қажет ететіндіктен, эпителий қабатының беткі құрылымын зерттеу үшін жоғарғы қабатты ашу немесе алу өте қиын. Мысалы, сканерлеуші ​​электронды микроскопты (SEM) пайдалану арқылы.
PDMS гидрофобтылығы гидрофобты ұсақ молекулалармен байланысты микрофлюидтік зерттеулерде шектеуші фактор болып табылады, себебі PDMS мұндай гидрофобты молекулаларды арнайы емес түрде адсорбциялай алады. PDMS-ке баламаларды басқа полимерлі материалдармен қарастыруға болады. Балама ретінде, гидрофобты молекулалардың адсорбциясын азайту үшін PDMS беткі модификациясын (мысалы, липофильді материалдармен 42 немесе поли(этиленгликоль) 43 жабу) қарастыруға болады.
Соңында, біздің әдісіміз жоғары өнімді скрининг немесе «барлығына бірдей» пайдаланушыға ыңғайлы эксперименттік платформаны қамтамасыз ету тұрғысынан жақсы сипатталмаған. Қазіргі хаттама әрбір микроқұрылғыға шприц сорғысын қажет етеді, ол CO2 инкубаторында орын алады және ауқымды эксперименттердің алдын алады. Бұл шектеуді инновациялық дақыл форматтарының масштабталуы арқылы айтарлықтай жақсартуға болады (мысалы, базальды ортаны үздіксіз толықтыруға және алып тастауға мүмкіндік беретін 24 ұңғылы, 96 ұңғылы немесе 384 ұңғылы кеуекті кірістірулер).
Адам ішек эпителийінің in vitro 3D морфогенезін индукциялау үшін біз екі параллель микроарналар мен арасында серпімді кеуекті мембрана бар микрофлюидті чипті ішек құрылғысын қолдандық, бұл люмен-капиллярлық интерфейсті жасайды. Сондай-ақ, біз Transwell кірістірулерінде өсірілген поляризацияланған эпителий қабаттарының астында үздіксіз базолярлық ағынды қамтамасыз ететін бір арналы микрофлюидті құрылғыны (гибридті чип) пайдалануды көрсетеміз. Екі платформада да әртүрлі адам ішек эпителий жасушаларының морфогенезін базолярлық бөлімнен морфоген антагонистерін алып тастау үшін ағынды бағыттау манипуляциясын қолдану арқылы көрсетуге болады. Барлық эксперименттік процедура (1-сурет) бес бөліктен тұрады: (i) ішек чипін немесе Transwell кірістірілетін гибридті чипті микрофабрикациялау (1-5 қадамдар; 1-қорап), (ii) ішек эпителий жасушаларын (Caco-2 жасушалары) немесе адам ішек органоидтарын дайындау; 2-5 жәшіктер), (iii) ішек эпителий жасушаларын ішек чиптеріне немесе гибридті чиптерге өсіру (6-9 қадамдар), (iv) 3D эпителий микроқұрылымын сипаттау үшін in vitro 3D морфогенезін индукциялау (10-қадам) және (v)). Соңында, эпителий морфогенезін кеңістіктік, уақытша, шартты немесе процедуралық бақылаулармен салыстыру арқылы in vitro морфогенезінің тиімділігін растау үшін тиісті бақылау тобы (төменде толығырақ талқыланады) жасалды.
Біз екі түрлі өсіру платформасын қолдандық: түзу арналары бар немесе сызықты емес иілген арналары бар чиптегі ішек немесе 1-қосымшада сипатталғандай жасалған микрофлюидтік құрылғыдағы Transwell (TW) ендірмелері бар гибридті чиптер және 1-5 қадам. «Құрылғыны жасау» бір чипті немесе гибридті чипті жасаудың негізгі қадамдарын көрсетеді. «Адам ішегінің эпителий жасушаларын өсіру» осы хаттамада қолданылатын жасуша көзін (Caco-2 немесе адам ішек органоидтары) және өсіру процедурасын түсіндіреді. «In vitro морфогенез» Caco-2 немесе органоидтардан алынған эпителий жасушаларының ішек чипінде немесе гибридті чиптің Transwell ендірмесінде өсірілетін, содан кейін 3D морфогенезді индукциялау және сипатталған эпителий құрылымын қалыптастырудың жалпы қадамдарын көрсетеді. Бағдарлама қадамының нөмірі немесе қорап нөмірі әрбір көрсеткінің астында көрсетіледі. Қолданбада құрылған ішек эпителий қабаттарының қалай пайдаланылуы мүмкін екендігі туралы мысалдар келтірілген, мысалы, жасуша дифференциациясын сипаттауда, ішек физиологиясын зерттеуде, иесі-микробиом экожүйелерін құруда және ауруларды модельдеуде. «Жасуша» бөліміндегі иммунофлуоресценция кескіндері. «Дифференциация» ішек чипінде пайда болған 3D Caco-2 эпителий қабатында экспрессияланған ядроларды, F-актинді және MUC2-ні көрсетеді. MUC2 сигнализациясы бокал тәрізді жасушаларда және шырышты қабық беттерінен бөлінетін шырышта болады. Ішек физиологиясындағы флуоресцентті кескіндер флуоресцентті бидай ұрығы агглютининін пайдаланып сиал қышқылы мен N-ацетилглюкозамин қалдықтарын бояу арқылы пайда болған шырышты көрсетеді. «Қожа-микроб бірлескен дақылдары» ішіндегі екі қабаттасатын кескін чиптегі ішектегі қожайын-микробиом бірлескен дақылдарын көрсетеді. Сол жақ панельде микроинженерлік 3D Caco-2 эпителий жасушаларымен жасыл флуоресцентті ақуызды (GFP) экспрессиялайтын E. coli бірлескен дақылы көрсетілген. Оң жақ панельде 3D Caco-2 эпителий жасушаларымен бірлесіп өсірілген GFP E. coli локализациясы, содан кейін F-актинмен (қызыл) және ядролармен (көк) иммунофлуоресценциялық бояу көрсетілген. Ауруды модельдеу бактериялық антигендермен (мысалы, липополисахаридпен) физиологиялық қиындықтар кезінде ішек қабыну чиптеріндегі сау және ағып жатқан ішекті көрсетеді. LPS) және иммундық жасушалар (мысалы, PBMC; жасыл). Caco-2 жасушалары 3D эпителий қабатын қалыптастыру үшін өсірілді. Масштаб жолағы, 50 мкм. Төменгі қатардағы суреттер: «Жасушалардың дифференциациясы» сілтемеден рұқсатпен бейімделген.2. Oxford University Press; 5-сілтемеден рұқсатпен көшірілген. NAS; «Хост-микроб бірлескен өсіру» 3-сілтемеден рұқсатпен бейімделген. NAS; «Ауруларды модельдеу» сілтемеден рұқсатпен бейімделген.5. NAS.
Чиптегі ішек және гибридті чиптер жұмсақ литография1,44 арқылы кремний қалыптарынан бөлшектелген және SU-8 өрнегімен безендірілген PDMS көшірмелерін пайдаланып жасалды. Әрбір чиптегі микроарналардың дизайны ығысу кернеуі және гидродинамикалық қысым1,4,12 сияқты гидродинамиканы ескере отырып анықталады. Екі қатар орналасқан параллель түзу микроарналардан тұратын бастапқы чиптегі ішек дизайны (кеңейтілген деректер 1a сурет) сұйықтықтың болу уақытының ұлғаюын, сызықты емес ағын үлгілерін және өсірілген жасушалардың көп осьті деформациясын тудыру үшін екі қисық микроарнаны қамтитын күрделі чиптегі ішек (кеңейтілген деректер 1b сурет) болып дамыды (2a–f сурет). 12. Ішектің күрделі биомеханикасын қайта жасау қажет болған кезде, күрделі чиптегі ішек таңдауға болады. Біз иілген ішек-чиптің түпнұсқамен салыстырғанда эпителийдің өсуінің ұқсас дәрежесімен ұқсас уақыт аралығында 3D морфогенезін күшті түрде индукциялайтынын көрсеттік. Өсірілген жасуша түріне қарамастан, ішек-чип. Сондықтан, 3D морфогенезін индукциялау үшін сызықтық және күрделі чиптегі ішек конструкциялары бір-бірін алмастырады. SU-8 үлгілері бар кремний қалыптарында қатайтылған PDMS репликалары бөлшектеуден кейін теріс ерекшеліктер берді (2a-сурет). Ішекті чипте жасау үшін дайындалған жоғарғы PDMS қабаты кеуекті PDMS пленкасына дәйекті түрде жалғанып, содан кейін корона өңдегішті пайдаланып қайтымсыз байланыс арқылы төменгі PDMS қабатымен тураланды (2b–f-сурет). Гибридті чиптерді жасау үшін қатайтылған PDMS репликалары Transwell кірістірулерін орналастыра алатын бір арналы микрофлюидтік құрылғылар жасау үшін шыны слайдтарға жалғанған (2h-сурет және кеңейтілген деректер 2-сурет). Байланыстыру процесі PDMS репликасы мен шыны беттерін оттегі плазмасымен немесе корона өңдеуімен өңдеу арқылы жүзеге асырылады. Силикон түтігіне бекітілген микрофабрикативті құрылғыны стерилизациялағаннан кейін, құрылғыны орнату ішек эпителийінің 3D морфогенезін орындауға дайын болды (2g-сурет).
a, SU-8 өрнектелген кремний қалыптарынан PDMS бөлшектерін дайындаудың схемалық иллюстрациясы. Қатқыламаған PDMS ерітіндісі кремний қалыпына құйылды (сол жақта), 60 °C температурада қатайтылды (ортасында) және демонтаждалды (оң жақта). Демонтаждалған PDMS бөліктерге кесіліп, әрі қарай пайдалану үшін тазартылды.b, PDMS жоғарғы қабатын дайындау үшін пайдаланылған кремний қалыпының фотосуреті.c, PDMS кеуекті мембранасын жасау үшін пайдаланылған кремний қалыпының фотосуреті.d, Жоғарғы және төменгі PDMS компоненттерінің және жиналған чиптегі ішек құрылғысының фотосуреттер сериясы.e, Жоғарғы, мембраналық және төменгі PDMS компоненттерінің туралану схемасы. Әрбір қабат плазмалық немесе тәждік өңдеу арқылы қайтымсыз байланысады.f, Қабаттасқан иілген микроарналар мен вакуумдық камералары бар дайындалған ішек-чип құрылғысының схемасы.g, Микрофлюидті жасуша дақылы үшін чиптегі ішекті орнату. Силикон түтігімен және шприцпен жиналған чиптегі дайындалған ішек қақпаққа орналастырылды. Чип құрылғысы қақпаққа орналастырылды Өңдеуге арналған 150 мм Петри ыдысы. Байланыстырғыш силикон түтігін жабу үшін қолданылады.h, Гибридті чиптерді жасаудың және гибридті чиптерді пайдаланып 3D морфогенездің визуалды суреттері. Ішек эпителий жасушаларының 2D моноқабаттарын өсіру үшін тәуелсіз дайындалған Трансвелл кірістірулері ішектің 3D морфогенезін индукциялау үшін гибридті чипке енгізілді. Орта Трансвелл кірістіруінде орнатылған жасуша қабатының астындағы микроканалдар арқылы перфузияланады. Масштаб жолағы, 1 см.h Сілтемеден рұқсатпен қайта басылған.4. Elsevier.
Бұл хаттамада Caco-2 жасуша желісі және ішек органоидтары эпителий көздері ретінде пайдаланылды (3a-сурет). Екі жасуша түрі де бір-бірінен тәуелсіз өсірілді (2-қорап және 5-қорап) және чиптегі ішек немесе Трансвелл кірістірулерінің ECM жабынды микроканалдарын себу үшін пайдаланылды. Жасушалар біріктірілген кезде (колбаларда >95% жабын), Т-колбалардағы әдеттегідей өсірілген Caco-2 жасушалары (10 және 50 өткелдер арасында) трипсинизация сұйықтығы арқылы диссоциацияланған жасуша суспензияларын дайындау үшін жиналады (2-қорап). Ішек биопсиясынан немесе хирургиялық резекциядан алынған адамның ішек органоидтары құрылымдық микроортаны қолдау үшін 24 ұңғылы пластиналардағы Matrigel каркас күмбездерінде өсірілді. 3-қорапта сипатталғандай дайындалған маңызды морфогендер (мысалы, Wnt, R-спондин және Noggin) және өсу факторлары бар орта органоидтар диаметрі ~500 мкм-ге дейін өскенше күнара толықтырылып отырды. Толық өскен органоидтар жиналып, диссоциацияланады. ішекке немесе чиптегі Трансвелл қондырмаларына себу үшін жеке жасушаларға (5-қорап). Бұрын хабарлағанымыздай, оны ауру түріне12,13 (мысалы, ойық жаралы колит, Крон ауруы, тоқ ішек обыры немесе қалыпты донор), зақымдану орнына (мысалы, зақымдану немесе зақымдалмаған аймақ) және жолдағы асқазан-ішек жолының орналасуына (мысалы, он екі елі ішек, аш ішек, мықын ішек, соқыр ішек, тоқ ішек немесе тік ішек) байланысты ажыратуға болады. Біз 5-қорапта аш ішек органоидтарына қарағанда әдетте морфогендердің жоғары концентрациясын қажет ететін тоқ ішек органоидтарын (колоидтарды) өсіруге арналған оңтайландырылған хаттаманы ұсынамыз.
a, Ішек чипінде ішек морфогенезін индукциялауға арналған жұмыс процесі. Бұл хаттамада 3D морфогенезді көрсету үшін Caco-2 адам ішек эпителийі және ішек органоидтары қолданылады. Бөлінген эпителий жасушалары дайындалған ішек-чип құрылғысына (чип дайындау) себілді. Жасушалар 0-ші күні (D0) PDMS кеуекті мембранасына себілгеннен (себілгеннен) және бекітілгеннен (бекітілгеннен) кейін, апикальды (AP) ағын басталады және алғашқы 2 күн бойы сақталады (ағын, AP, D0-D2). Толық 2D моноқабат пайда болған кезде циклдік созылу қозғалыстарымен (созылу, ағын, AP және BL) бірге базолярлық (BL) ағын да басталады. Ішектің 3D морфогенезі микрофлюидті дақылдың 5 күнінен кейін өздігінен пайда болды (морфогенез, D5). Фазалық контраст кескіндері әрбір тәжірибелік қадамда немесе уақыт нүктесінде Caco-2 жасушаларының типтік морфологиясын көрсетеді (бағаналық график, 100 мкм). Ішек морфогенезінің сәйкес каскадтарын көрсететін төрт схемалық диаграмма (жоғарғы жағы) оң жақта). Схемада үзік-үзік көрсеткілер сұйықтық ағынының бағытын көрсетеді.b, қалыптасқан 3D Caco-2 эпителийінің беткі топологиясын көрсететін SEM кескіні (сол жақта). Үлкейтілген аймақты белгілейтін кірістіру (ақ үзік-үзік қорап) 3D Caco-2 қабатындағы қалпына келтірілген микробүршіктерді көрсетеді (оң жақта).c, қалыптасқан Caco-2 3D, клаудин (ZO-1, қызыл) және F-актин (жасыл) және ядролар (көк) деп белгіленген үздіксіз щеткалы шекара мембраналарының көлденең фронтальды көрінісі. Ішек чиптеріндегі эпителий жасушаларының иммунофлуоресценциялық конфокальды визуализациясы. Ортаңғы схемаға бағытталған көрсеткілер әрбір конфокальды көрініс үшін фокальды жазықтықтың орналасқан жерін көрсетеді.d, 3, 7, 9, 11 және 13 күндері фазалық контрастты микроскопия арқылы алынған чипте өсірілген органоидтардағы морфологиялық өзгерістердің уақыттық ағымы.Кірістірілген (жоғарғы оң жақта) берілген кескіннің жоғары үлкейтілуін көрсетеді.e, 7-ші күні түсірілген кесіндіде ішекте орналасқан органоидты 3D эпителийдің DIC фотомикрографиясы.f, Эпителий қабатындағы бағаналы жасушалардың (LGR5; қызыл күрең), бокал тәрізді жасушалардың (MUC2; жасыл), F-актиннің (сұр) және ядролардың (көгілдір) маркерлерін көрсететін қабаттасқан иммунофлуоресценциялық кескіндер, тиісінше 3 күн (сол жақта) және 13 күндік (ортада) органоидтардың ішек чиптерінде өсірілген. Сондай-ақ, MUC2 сигнализациясынсыз LGR5 сигнализациясын көрсететін кеңейтілген деректер 3-суретті қараңыз. Өсірудің 13-ші күнінде плазмалық мембрананы CellMask бояуымен (оң жақта) бояу арқылы чипте ішекте орналасқан 3D органоидты эпителийдің эпителий микроқұрылымын (оң жақта) көрсететін флуоресценциялық кескіндер. Басқаша көрсетілмесе, масштаб жолағы 50 мкм.b Сілтемеден рұқсатпен қайта басылған.2. Oxford University Press; c Сілтемеден рұқсатпен бейімделген.2. Oxford University Press; e және f сілтемеден рұқсатпен бейімделген.12 Creative Commons лицензиясы бойынша CC BY 4.0.
Чиптегі ішекте PDMS кеуекті мембранасының гидрофобты бетін ЭКМ жабынын сәтті алу үшін өзгерту қажет. Бұл хаттамада біз PDMS мембраналарының гидрофобтылығын өзгерту үшін екі түрлі әдісті қолданамыз. Caco-2 жасушаларын өсіру үшін тек УК/озонмен өңдеу арқылы беттік белсендіру PDMS бетінің гидрофобтылығын азайту, ЭКМ жабынын жабу және Caco-2 жасушаларын PDMS мембранасына бекіту үшін жеткілікті болды. Дегенмен, органоидты эпителийдің микрофлюидті дақылы PDMS микроарналарына полиэтиленимин (PEI) және глутаральдегидті дәйекті қолдану арқылы ЭКМ ақуыздарын тиімді тұндыру үшін химиялық негіздегі беттік функционализацияны қажет етеді. Беттік модификациядан кейін ЭКМ ақуыздары функционалданған PDMS бетін жабу үшін тұндырып, содан кейін оқшауланған органоидты эпителийге енгізілді. Жасушалар бекітілгеннен кейін, микрофлюидті жасуша дақылы жасушалар толық моноқабат түзгенше тек ортаны жоғарғы микроарнаға перфузиялаудан басталады, ал төменгі микроарна статикалық жағдайларды сақтайды. Беттік белсендіру және ЭКМ жабыны үшін бұл оңтайландырылған әдіс органоидты эпителийдің бекітілуін индукциялауға мүмкіндік береді. PDMS бетіндегі 3D морфогенез.
Трансвелл дақылдары жасушаларды себу алдында ECM жабынын қажет етеді; дегенмен, Трансвелл дақылдары кеуекті кірістірулердің бетін белсендіру үшін күрделі алдын ала өңдеу қадамдарын қажет етпейді. Трансвелл кірістірулерінде Caco-2 жасушаларын өсіру үшін кеуекті кірістірулердегі ECM жабыны диссоциацияланған Caco-2 жасушаларының бекітілуін (<1 сағат) және тығыз түйіспелі тосқауылдың пайда болуын (<1-2 күн) жеделдетеді. Трансвелл кірістірулеріндегі органоидтарды өсіру үшін оқшауланған органоидтар ECM жабыны бар кірістірулерге себіледі, мембрана бетіне бекітіледі (<3 сағат) және органоидтар тосқауыл тұтастығы бар толық моноқабат құрғанша сақталады. Трансвелл дақылдары гибридті чиптерді пайдаланбай 24 ұяшықты пластиналарда орындалады.
In vitro 3D морфогенезін қалыптасқан эпителий қабатының базолярлық аспектісіне сұйықтық ағынын қолдану арқылы бастауға болады. Чиптегі ішекте эпителий морфогенезі орта жоғарғы және төменгі микроканалдарға перфузияланған кезде басталды (3a-сурет). Бұрын сипатталғандай, бағытта бөлінетін морфоген ингибиторларын үздіксіз жою үшін төменгі (базолярлық) бөлімге сұйықтық ағынын енгізу өте маңызды. Кеуекті мембраналармен байланысқан жасушаларға жеткілікті қоректік заттар мен сарысу беру және люменальды ығысу кернеуін тудыру үшін біз әдетте чиптегі ішекте қос ағынды қолданамыз. Гибридті чиптерде эпителий моноқабаттары бар Transwell кірістірулері гибридті чиптерге енгізілді. Содан кейін орта микроканал арқылы кеуекті Transwell кірістіруінің базолярлық жағының астына енгізілді. Ішек морфогенезі екі дақыл платформасында да базолярлық ағын басталғаннан кейін 3-5 күннен кейін пайда болды.
Микроинженерияланған 3D эпителий қабаттарының морфологиялық ерекшеліктерін фазалық контрастты микроскопия, дифференциалды интерференциялық контрастты (DIC) микроскопия, SEM немесе иммунофлуоресценциялық конфокальды микроскопияны қоса алғанда, әртүрлі бейнелеу әдістерін қолдану арқылы талдауға болады (3 және 4-суреттер). 3D эпителий қабаттарының пішіні мен шығыңқылығын бақылау үшін фазалық контрастты немесе DIC бейнелеуді өсіру кезінде кез келген уақытта оңай орындауға болады. PDMS және полиэфир пленкаларының оптикалық мөлдірлігіне байланысты, чиптегі ішек және гибридті чип платформалары құрылғыны кесу немесе бөлшектеу қажеттілігінсіз нақты уақыт режимінде in situ бейнелеуді қамтамасыз ете алады. Иммунофлуоресценциялық бейнелеуді орындаған кезде (1, 3c, f және 4b, c суреттер), жасушалар әдетте 4% (салмақ/көлем) параформальдегидпен (PFA), содан кейін Triton X-100 және 2% (салмақ/көлем)) ірі қара малдың сарысу альбуминімен (BSA) бекітіледі. Жасуша түріне байланысты әртүрлі бекіткіштер, өткізгіштік және блоктаушы агенттер қолданылуы мүмкін. пайдаланылады. Тұқымға тәуелді жасуша немесе аймақ маркерлеріне бағытталған бастапқы антиденелер чипте in situ иммобилизацияланған жасушаларды ерекшелеу үшін қолданылады, содан кейін екінші реттік антиденелер ядроға (мысалы, 4′,6-диамидино-2-фенилен) индол, DAPI) немесе F-актинге (мысалы, флуоресцентті түрде белгіленген фаллоидин) бағытталған контраст бояуымен бірге қолданылады. Флуоресценцияға негізделген тірі бейнелеу шырыштың өндірілуін (1-сурет, «Жасуша дифференциациясы» және «Ішек физиологиясы»), микробтық жасушалардың кездейсоқ колонизациясын (1-сурет, «Хост-микроб бірлескен өсіру»), иммундық жасушалардың тартылуын (1-сурет, «Ауруды модельдеу») немесе 3D эпителий морфологиясының контурларын (3c,f және 4b,c суреттер) анықтау үшін in situ режимінде де жүргізілуі мүмкін. Сілтемеде сипатталғандай, жоғарғы қабатты төменгі микроканалды қабаттан бөлу үшін чиптегі ішекті өзгерткен кезде. 2-суретте көрсетілгендей, 3D эпителий морфологиясы, сондай-ақ апикальды щетка шекарасындағы микробүрлер SEM арқылы көрнекі түрде көруге болады (3b-сурет). Дифференциация маркерлерінің экспрессиясын сандық ПТР5 немесе бір жасушалы РНҚ секвенирлеу арқылы бағалауға болады. Бұл жағдайда ішек чиптерінде немесе гибридті чиптерде өсірілген эпителий жасушаларының 3D қабаттары трипсинизация арқылы жиналады, содан кейін молекулалық немесе генетикалық талдау үшін қолданылады.
a, Гибридті чипте ішек морфогенезін индукциялауға арналған жұмыс процесі. Бұл хаттамада гибридті чип платформасында 3D морфогенезді көрсету үшін Caco-2 және ішек органоидтары қолданылады. Диссоциацияланған эпителий жасушалары дайындалған Transwell кірістірулеріне себілді (TW дайындығы; төмендегі суретті қараңыз). Transwell кірістірулерінде жасушалар себіліп (себіліп), полиэфир мембраналарына бекітілгеннен кейін, барлық жасушалар статикалық жағдайларда өсірілді (TW дақылы). 7 күннен кейін эпителий жасушаларының 2D моноқабатын қамтитын бір Transwell кірістіру гибридті чипке базолярлық ағынды (Flow, BL) енгізу үшін біріктірілді, бұл сайып келгенде 3D эпителий қабатының пайда болуына әкелді (морфогенез). Әрбір тәжірибелік қадамда немесе уақыт нүктесінде қалыпты донордан (C103 сызығы) көтерілетін тоқ ішектен алынған адам ағзасының эпителий жасушаларының морфологиялық ерекшеліктерін көрсететін фазалық контрастты микрографтар. Жоғарғы қабаттардағы схемалар әрбір қадам үшін тәжірибелік конфигурацияны көрсетеді.b, Гибридті чиптер (сол жақ схема) әртүрлі Z нүктелерінде түсірілген жоғарыдан төмен конфокальды микроскопия көріністерімен органоидты эпителий жасушаларының 3D морфогенезіне әкелуі мүмкін. позициялар (жоғарғы, ортаңғы және төменгі; оң жақ схеманы және сәйкес нүктелі сызықтарды қараңыз). айқын морфологиялық сипаттамаларды көрсетті. F-актин (көгілдір), ядро ​​(сұр).c, статикалық Трансвеллде (TW; ақ нүктелі қораптың ішіндегі кірістіру) өсірілген органоидтардан алынған эпителий жасушаларының флуоресценциялық конфокальды микрографтары (3D бұрышты көрініс) және гибридті чипте (ең үлкен толық кадр), сәйкесінше 2D және 3D морфологиясын салыстырады. Екі өлшемді тік көлденең кесілген көріністер (жоғарғы оң жақ бұрышта кірістіру; «XZ») сонымен қатар 2D және 3D ерекшеліктерін көрсетеді. Масштаб жолағы, 100 мкм.c Сілтемеден рұқсатпен қайта басылған.4. Elsevier.
Бақылау жасушаларын дәстүрлі статикалық өсіру жағдайларында бірдей жасушаларды (Caco-2 немесе ішек органоидты эпителий жасушалары) екі өлшемді моноқабаттарға өсіру арқылы дайындауға болады. Микроканалдардың көлемдік сыйымдылығының шектеулі болуына байланысты қоректік заттардың азаюы мүмкін (яғни, бастапқы ішек чипі дизайнындағы жоғарғы каналда ~4 мкл). Сондықтан, базолярлық ағынды қолданар алдында және кейін эпителий морфологиясын да салыстыруға болады.
Жұмсақ литография процесі таза бөлмеде жүргізілуі керек. Чиптегі (жоғарғы және төменгі қабаттар мен мембраналар) және гибридті чиптердегі әрбір қабат үшін микроарналардың биіктігі әртүрлі болғандықтан, әртүрлі фотомаскалар қолданылды және бөлек кремний пластиналарында жасалды. Чиптегі ішектің жоғарғы және төменгі микроарналарының мақсатты биіктіктері сәйкесінше 500 мкм және 200 мкм құрайды. Гибридті чиптің арнаның мақсатты биіктігі 200 мкм.
Ацетоны бар ыдысқа 3 дюймдік кремний пластинасын салыңыз. Тәрелкені 30 секунд бойы ақырын айналдырыңыз, содан кейін пластинаны ауада кептіріңіз. Тәрелкені IPA бар тәрелкеге ​​салыңыз, содан кейін тазалау үшін тәрелкені 30 секунд айналдырыңыз.
Кремний пластинасының бетінен органикалық қалдықтарды барынша жою үшін пиранья ерітіндісін (сутегі асқын тотығы мен концентрлі күкірт қышқылының қоспасы, 1:3 (көлем/көлем)) қосымша ретінде пайдалануға болады.
Пиранья ерітіндісі өте коррозиялық және жылу шығарады. Қосымша қауіпсіздік шаралары қажет. Қалдықтарды жою үшін ерітіндінің суығанын күтіп, таза, құрғақ қалдық контейнеріне салыңыз. Қосымша контейнерлерді пайдаланыңыз және қалдық контейнерлерін дұрыс белгілеңіз. Толығырақ процедуралар үшін мекеменің қауіпсіздік нұсқауларын орындаңыз.
Вафлилерді 200°C қыздырылған плитаға 10 минутқа қою арқылы сусыздандырыңыз. Сусыздандырғаннан кейін, вафли суыту үшін ауада бес рет шайқалды.
Тазаланған кремний пластинасының ортасына шамамен 10 г фоторезист SU-8 2100 құйыңыз. Фоторезистті пластинаға біркелкі жағу үшін пинцетті пайдаланыңыз. Фоторезисттің жабысқақтығын азайту және жағуды жеңілдету үшін пластинаны 65°C қыздыру табағына кейде қойыңыз. Пластинаны тікелей қыздыру табағына қоймаңыз.
SU-8 пластинаға айналдыру жабынын іске қосу арқылы біркелкі таратылды. SU-8 кіріс айналымын 5-10 секундқа бағдарламалап, 500 айн/мин жылдамдықпен 100 айн/с үдеумен тараңыз. Негізгі айналымды 1500 айн/мин жылдамдықпен 200 мкм қалыңдықтағы өрнекке орнатыңыз немесе 1200 айн/мин жылдамдықпен 30 секунд жылдамдықпен 300 айн/с үдеумен 250 мкм қалыңдыққа қол жеткізіңіз (чиптегі ішектің жоғарғы қабаты үшін 500 мкм биіктік жасаңыз; төмендегі «Маңызды қадамдарды» қараңыз).
Негізгі айналдыру жылдамдығын кремний пластинасындағы SU-8 үлгісінің мақсатты қалыңдығына сәйкес реттеуге болады.
Чиптегі ішектің жоғарғы қабаты үшін биіктігі 500 мкм болатын SU-8 үлгілерін жасау үшін, осы қораптың айналдыру жабыны мен жұмсақ пісіру қадамдары (7 және 8 қадамдар) 250 мкм екі қабат алу үшін дәйекті түрде қайталанды (9-қадамды қараңыз). SU-8 қалың қабаты, оны осы қораптың 12-қадамында ультракүлгін сәулелену арқылы қабаттап, біріктіруге болады, бұл биіктігі 500 мкм болатын қабат жасайды.
SU-8 қапталған вафлилерді жұмсақ пісіру үшін, вафлилерді 65 °C температурада 5 минут бойы қыздырылған табаққа абайлап салыңыз, содан кейін параметрді 95 °C-қа ауыстырып, тағы 40 минут инкубациялаңыз.
Жоғарғы микроарнадағы SU-8 үлгісінің биіктігін 500 мкм ету үшін, қалыңдығы 250 мкм болатын екі SU-8 қабатын жасау үшін 7 және 8 қадамдарды қайталаңыз.
УК маскасын туралау құралын пайдаланып, пластинаның экспозиция уақытын есептеу үшін өндірушінің нұсқауларына сәйкес шам сынағын өткізіңіз. (экспозиция уақыты, мс) = (экспозиция дозасы, мДж/см2)/(шам қуаты, мВт/см2).
Экспозиция уақытын анықтағаннан кейін, фотомасканы УК маска туралағышының маска ұстағышына қойып, фотомасканы SU-8 жабыны бар пластинаға қойыңыз.
УК дисперсиясын азайту үшін фотомасканың басылған бетін кремний пластинасының SU-8 жабыны бар жағына тікелей қойыңыз.
SU-8 жабыны бар пластина мен фотомасканы алдын ала белгіленген экспозиция уақыты үшін 260 мДж/см2 ультракүлгін сәулеге тігінен қойыңыз (осы қораптың 10-қадамын қараңыз).
УК сәулесінің әсерінен кейін, SU-8 жабыны бар кремний пластиналары әрбір қыздыру табағында 65°C температурада 5 минут және 95°C температурада 15 минут бойы пісіріліп, биіктігі 200 мкм болатын үлгілер жасалды. Биіктігі 500 мкм болатын үлгілер жасау үшін пісіруден кейінгі уақытты 95°C температурада 30 минутқа дейін ұзартыңыз.
Әзірлеуші ​​шыны ыдысқа құйылады, ал пісірілген вафли ыдысқа салынады. SU-8 әзірлеушісінің көлемі шыны пластинаның өлшеміне байланысты өзгеруі мүмкін. Ашық емес SU-8-ді толығымен алып тастау үшін жеткілікті SU-8 әзірлеушісін пайдаланыңыз. Мысалы, 1 л сыйымдылығы бар диаметрі 150 мм шыны ыдысты пайдаланған кезде, шамамен 300 мл SU-8 әзірлеушісін пайдаланыңыз. Қалыпты 25 минут бойы анда-санда ақырын айналдыра отырып, әзірлеңіз.
Дайындалған қалыпқа шамамен 10 мл жаңа әзірлеуші ​​ерітіндісін қосып, содан кейін ерітіндіні пипеткамен бүрку арқылы IPA қосыңыз.
Пластинаны плазмалық тазартқышқа салып, оттегі плазмасына (атмосфералық газ, мақсатты қысым 1 × 10−5 Торр, қуаты 125 Вт) 1,5 минутқа қойыңыз.
Вафлиді ішінде шыны сырғытпасы бар вакуумдық эксикаторға салыңыз. Вафлилер мен сырғытпаларды қатар қоюға болады. Егер вакуумдық эксикатор пластинамен бірнеше қабатқа бөлінген болса, сырғытпаларды төменгі камераға, ал пластиналарды жоғарғы камераға салыңыз. Шыны сырғытпаға 100 мкл трихлор (1H, 1H, 2H, 2H-перфтороктил)силан ерітіндісін тамызып, силанизациялау үшін вакуум қолданыңыз.
Мұздатылған Caco-2 жасушалары бар құтыны 37°C су моншасында ерітіңіз, содан кейін еріген жасушаларды 15 мл 37°C алдын ала қыздырылған Caco-2 ортасы бар T75 колбасына салыңыз.
Caco-2 жасушаларын шамамен 90% қосылыс кезінде өткізу үшін алдымен Caco-2 ортасын, PBS және 0,25% трипсин/1 мМ ЭДТА-ны 37°C су моншасында жылытыңыз.
Ортаны вакуумдық аспирация арқылы сорып алыңыз. Вакуумдық аспирацияны қайталап, жаңа PBS қосу арқылы жасушаларды 5 мл жылы PBS-пен екі рет жуыңыз.